KR100890992B1

KR100890992B1 - 중간엽 줄기세포에서 신경세포로의 분화 유도 방법

Info

Publication number: KR100890992B1
Application number: KR1020070006014A
Authority: KR
Inventors: 장미숙; 조정선
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2007-01-19
Filing date: 2007-01-19
Publication date: 2009-03-27
Also published as: KR20080068351A

Abstract

본 발명은 조성물이 최적화된 배지에서 배양함으로써 골수 내에 존재하는 중간엽 줄기세포를 성숙한 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 최적화된 배지에서 배양함으로써 골수내에 존재하는 중간엽 줄기세포를 성숙한 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 전-유도 방법 및 부틸 하이드록시아니솔, 포스콜린 및 VPA를 포함하는 신경유도배지(neuronal induction media, NIM)를 사용하는 방법으로 중간엽 줄기세포를 신경세포 또는 운동신경세포로 효과적으로 분화시켜, 신경 질환의 치료를 위한 세포 치료제로 사용할 수 있다.

중간엽 줄기세포, 신경세포로의 분화, 운동신경세포

Description

중간엽 줄기세포에서 신경세포로의 분화 유도 방법{Method of inducing differentiation of mesenchymal stem cells into neurons}

도 1은 중간엽 줄기세포에 NIM(neuronal induction media)을 처리한 시간에 따른 형태적 변화정도를 나타낸 도이고,

도 2는 중간엽 줄기세포에 NIM(neuronal induction media)을 처리한 시간에 따른 신경세포 표지 발현 정도를 나타낸 도이고,

도 3은 미처리 대조군과 NIM 처리군의 유전자 발현의 차이를 나타낸 도이고, 및;

도 4는 NIM 시간별(0, 3, 6, 9 및 24시간)로 신경세포 표지 단백질 마커의 발현을 면역형광법으로 확인한 그림이고,

빨간색: nestin 초록색: NF-M 파란색: DAPI

도 5는 NIM 시간별(2, 4, 6 및 8 시간)로 신경세포 표지 단백질 마커의 발현을 면역형광법으로 확인한 그림이고,

빨간색: NF-M 초록색: nestin

도 6은 Zhao 등의 방법에 의해 신경세포 분화의 재현한 결과 신경세포로 제대로 분화되지 않음을 확인한 현미경 사진이고,

도 7은 Zhao 등의 방법으로 처리한 중간엽 줄기세포의 미처리 대조군과의 유전자 발현의 차이를 나타낸 도이고,

도 8은 Zhao 등의 방법과 Bertani 등의 방법의 조합하여 실험한 결과 Zhao 등의 방법에 비해 신경세포 분화가 재현되었음을 나타내는 현미경 사진이고,

도 9는 Zhao 등의 방법과 Bertani 등의 방법의 조합에 의한 방법으로 처리한 중간엽 줄기세포의 미처리 대조군과의 유전자 발현의 차이를 나타낸 도이다.

본 발명은 조성물이 최적화된 배지에서 배양함으로써 골수 내에 존재하는 중간엽 줄기세포를 성숙한 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 최적화된 배지에서 배양함으로써 골수내에 존재하는 중간엽 줄기세포를 성숙한 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)란 조직을 구성하는 각 세포로 분화되기 전단계의 세포로서, 미분화 상태에서 무한 증식이 가능한 자가증식능과 특정 분화 자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재적 가능성인 다분화능을 가진 세포를 말한다. 즉, 배양을 계속하여도 자가증식 능력이 떨어지지 않고 유지되며, 여러 종류의 세포로 분화가 가능해야 한다.

줄기세포는 분화 가능성에 따라 크게 배아 줄기세포(embryonic stem cell; ES cell)와 성체 줄기세포(adult stem cells)로 나뉜다. 정자와 난자가 만나 수정된 후 발생과정이 일어나고 형태형성을 하게 되는데 이때 세포는 증식, 이동, 분화 과정을 겪게 된다. 배아 줄기세포는 수정란이 형성된 후 자궁내막에 착상하기 전의 매우 초기 단계인 포배기(blastocyst) 배아 중 태아로 발생할 세포괴(inner cell mass; ICM)로부터 분리해낸 줄기세포로서, 내배엽, 외배엽 및 중배엽의 3개의 배엽(embryonic germ layer)에 의해 생성되는 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력이 있는(pluripotent) 세포이다.

반면, 성체 줄기세포는 발생과정이 끝난 성인 또는 배아 발생 과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계에 태반에서 얻어지는, 각 장기에 특이적인 줄기세포로서, 그 분화능이 일반적으로 그 조직을 구성하는 세포로만 한정되게(multipotent) 된다. 이러한 성체 줄기세포는 성인이 된 후에도 대부분의 장기에 남아 정상적으로 혹은 병리적으로 발생하는 세포의 손실을 보충하는 역할을 한다. 대표적인 성체 줄기세포로는 골수(bone marrow)에 존재하는 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cell)와 혈구 세포 이외의 결합조직(connective tissue) 세포로 분화되는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)가 있다. 조혈 줄기세포는 적혈구, 백혈구 등 각종 혈구 세포로 분화되고, 중간엽 줄기세포는 골아세포(osteoblast), 연골아세포(chondroblast), 지방 세포(adipocyte) 및 근아세포(myoblast) 등으로 분화된다.

최근에는 인간으로부터의 배아 줄기세포 분리가 성공한 이후, 그 임상적 적 용에 관심이 고조되고 있다. 줄기세포의 적용분야로서 가장 주목받고 있는 것은 세포 대체 요법(cell replacement therapy)을 위한 완벽한 세포 공급원으로서의 이용이다. 난치병으로 알려진 파킨슨씨병, 알쯔하이머와 같은 신경퇴행성 질환, 척추 손상에 의한 사지마비, 백혈병, 중풍, 소아당뇨병, 심근경색, 간경화 등의 질환은 조직을 구성하는 세포의 파괴 및 영구적 기능 장애에 의해 초래되는데, 이들 질환에 의해 파괴되어 부족한 세포를 외부로부터 공급해주는 세포 대체 요법이 효과적인 치료법으로 제시되고 있다.

그러나, 세포 대체 요법의 놀라운 효과에도, 이를 실제 임상에 적용하는 데에는 많은 한계가 있다. 즉, 분화가 완전히 진행된 세포를 공급자의 조직으로부터 분리하여 환자에게 이식하는 전통적인 방법은 환자에게 공급할 충분한 세포를 얻는데 어려움이 있다. 이러한 세포 공급의 문제를 해결하기 위해 배아 줄기세포를 분리하여 특정 조직의 세포로 분화시켜 사용하거나, 성체 줄기세포를 분리하고 이를 배양하여 증식시킨 다음 분화를 유도하여 세포 대체 요법에 사용할 수 있다.

그러나 배아 줄기세포의 경우는 미분화 상태의 자가 재생산 능력이 뛰어나서 생체내에 세포치료를 위해 이식한 경우, 오히려 미분화 상태의 세포가 증식하는 암 (teratoma)이 발생할 수 있고, 배아 줄기세포로부터 필요로 하는 특정 세포로 분화되는 효율이 낮기 때문에 환자에게 이식할 경우 혼합된 다른 세포로 인한 부작용의 위험성이 있어, 더욱 안전한 임상 적용을 위해서는 정교한 분화발생법에 대한 연구가 요구되고 있다.

한편, 세포 대체 요법을 위해 성체 줄기세포를 이용하는 경우에 있어서는, 장기간 배양시 세포 증식 능력이 감소하거나 분화 잠재력이 변형되어 원치 않는 세포로의 분화가 일어나기도 하는 등의 문제가 있다. 더욱이 파킨슨씨병과 같은 퇴행성 뇌신경 질환(neurodegenerative disease)의 경우 신경세포의 이식이 필요한데, 신경 줄기세포(neural stem cell)를 환자로부터 직접 얻는 것이 어렵기 때문에 이식에 필요한 신경세포는 주로 태아의 뇌조직으로부터 분리한 신경 줄기세포를 배양하여 신경세포로 분화 및 증식시킴으로써 얻어진다. 이때 한 사람의 환자를 치료하기 위해서는 대략 두 명 정도의 태아의 뇌가 필요하므로, 윤리적인 문제 및 원활한 공급에 있어 문제가 있을 뿐만 아니라 대부분의 신경 줄기세포가 신경 세포로 분화되기보다는 성상교세포(astrocyte)로 분화되기 쉽고, 면역 거부 반응을 일으키는 등의 문제점이 있다.

따라서, 골수에 존재하는 중간엽 줄기세포로부터 신경세포를 분화시켜 사용할 수 있다면 세포 공급 문제를 해결할 수 있을 뿐만 아니라 자가 골수를 이용하므로 면역 거부 반응을 포함한 치료상의 문제점도 해결할 수 있는 이점을 갖는다. 이전까지 한 종류의 줄기세포는 특정 계통에 속하는 조직 세포들만으로 분화되는 것으로 여겨져 왔다. 중간엽 줄기세포의 경우에는, 혈청과 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor), 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor), TGF-β(transforming growth factor-β) 또는 EGF 등을 포함한 여러 가지 성장인자들의 존재 하에서 생체외 군집(in vitro conolies)을 형성할 수 있으며(Kuznetsov et al., Br. J. Haematol . 97:561, 1997; van den Bos C et al., Human Cell 10:45, 1997), 대략 초기 부착 세포의 1/3 정도가 다분화능력을 지니고 있어 골아세포, 연골아세포, 지방세포 등의 결합조직 세포로 분화할 수 있다고 보고되어 있다(Pittenger MF et al., Science 284:143, 1999). 또한, 페라리 등은 골수가 새로운 근육을 형성할 수 있는 근형성 전구세포(myogenic precursor cell)의 원천이라고 보고하였다(Ferrari G et al., Science 279:1528, 1998).

또한, 최근 일련의 연구들은 이처럼 결합조직으로만 분화되는 것으로 여겨져 왔던 중간엽 줄기세포가 신경 계통 세포들로 분화될 수 있음을 보고하고 있다. 예를 들어 산체스 등(Sanchez-Ramos et al., Exp. Neurology 164:247-256, 2000)은 레티논산(retinoic acid)과 BDNF(brain-derived neurotrophic factor)을 첨가하여 배양하였을 때 골수 중간엽 줄기세포로부터 신경세포 및 성상교세포가 분화됨을 보고하고 있고, 데일 우드베리 등(Dale Woodbury et al., J. Neuro. Res. 61:364-370, 2000)은 β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol) 또는 DMSO(dimethyl sulfoxide)와 같은 항산화 물질이 골수 중간엽 줄기세포를 신경세포로 분화시킬 수 있음을 보고한 바 있다.

그러나, 중간엽 줄기세포로부터 신경세포를 분화시켜 사용하는 것엔 아직 여러 가지 한계가 있다. 우선, 성장인자는 세포 내로 신호를 전달하기 위해서 세포에서 발현하는 특정 성장인자 수용기(receptor)에 결합하여야 하나, 아직 중간엽 줄기세포에서 이러한 성장인자 수용기가 발현된다는 보고가 없다. 따라서 수용기의 발현의 여부 및 정도가 확실하지 않기 때문에, 수용기를 활성화할 수 있는 성장인자의 농도가 확실하지 않다. 또한, 성장인자는 생리적인 환경(37℃)에서 수용기에 결합하지 않는 한, 여러 효소에 의해 빠르게 가수분해되므로, 성장인자를 배지 에 첨가 후 그 작용에는 많은 변이가 있다. 그리하여 과학자들은 한편으로 성장인자 등을 배제하고, DMSO와 BHA 같은 항산화 물질을 포함하는 유도 배지를 통해 중간엽 줄기세포로부터 신경세포를 분화시키고자 하였다. 그러나, 그 결과는 아직까지 미흡한 수준이다. 즉, 다양한 화합물을 포함한 DMEM 배지로 분화를 유도시킬 수 있었으나(Bertani N et al., J Cell Sci, 118, 3925-3936, 2005; Woodbury D et al., J Neurosci Res, 69, 908-917; Guillermo M-E et al., 21, 437-448, 2003), 그 결과의 재현성이 낮을 뿐만 아니라, 신경세포로의 분화의 표지가 발현되지 않았다(Bertani N, J Cell Sci, 118, 3925-3936). Zhao 등(Zhao et al., Exp Neurol, 190, 396-406, 2004)은 2회에 걸친 전-유도 방식을 도입하여 안정적인 신경세포 분화를 시도하였다. 그리하여, 이전의 시도에 비해 분화의 정도가 좋아졌으나, 분화 유도시간이 24시간으로 길고, 신경세포로의 분화의 표지가 성숙신경세포로 분화되었다고 보기에 충분한 정도로 발현되지 않았다.

이에 본 발명자들은 2회에 걸친 전-유도 방식을 도입하고, 유도 배지를 최적화한 결과, 성숙신경세포 분화표지의 발현을 관찰하여, 재현성있게 중간엽 줄기세포로부터 신경세포를 분화시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 최적화된 유도 배지 및 배양방법을 이용하여 중간엽 줄기세포로부터 신경세포로의 재현성 높은 분화를 이루어 세포치료에 이용할 수 있는 신경세포를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

1) 중간엽 줄기세포의 전-유도를 2회에 나누어 수행하는 단계;

2) 단계 1의 전-유도된 중간엽 줄기세포를 부틸 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA), 포스콜린 및 밸프로산(valproic acid, VPA)을 포함하는 신경유도 배지로 2 내지 8 시간 동안 유도하는 단계로 이루어진 신경세포 분화 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 전-유도된 중간엽 줄기세포를 신경세포로 분화하도록 유도하는 부틸 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA), 포스콜린 및 밸프로산(valproic acid, VPA)을 포함하는 신경유도 배지를 제공한다.

상기의 중간엽 줄기세포는 바람직하게는 인간의 골수로부터 분리하여 사용할 수 있는데, 골수에서 단핵세포를 분리한 후 이들을 1 내지 2주간 배양하면 분화되기 쉬운 조혈 줄기세포는 모두 분화되어 성숙한 혈구 세포들을 만들기 때문에 남아 있는 무한 증식 세포인 줄기세포만을 분리하는 방법에 의해서 손쉽게 중간엽 줄기세포만을 얻을 수 있다. 아울러, 골수에서 분리한 단핵세포에서 중간엽 줄기세포를 분리해내지 않고, 중간엽 줄기세포를 포함하는 단핵세포들 전체를 본 발명의 방법에 따라 배양하여도 신경세포의 대량 생산이라는 동일한 효과를 얻을 수 있다.

상기에서, 중간엽 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법은 β-머캅토에탄올의 농도를 높여가면서 2회에 나누어 단계 1의 전-유도를 수행하고, 100 내지 200 μM의 BHA, 9 내지 11 ㎛ 포스콜린 및 1.5 내지 2.5 mM VPA를 포함하는 신경유도 배지에서 단계 2의 유도를 수행하는 방법이 바람직하다. 상기의 전-유도 방법은 첫 번째 전-유도에 비해 두 번째 전-유도시 β-머캅토에탄올의 농도가 1.5 내지 2배 증가하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 2배 증가한다. 또한, 두 번째 전-유도 시간은 첫 번째 전-유도 시간의 1/4 내지 1/8로 단축시키는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1/8로 단축시키는 것이 바람직하다. 또한, 상기의 단계 2의 신경유도 배지는 더욱 바람직하게는 200 μM의 BHA, 10 ㎛ 포스콜린 및 2 mM VPA를 포함하고, 유도 시간은 2 내지 8 시간이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 3 내지 5 시간이다(도 1 및 2 참조). RT-PCR에서는 NIM 4시간 처리군에서 표지 유전자의 발현이 가장 높게 나타났으나, 개개의 세포에서 특정 단백질 발현을 관찰할 수 있는 면역형광염색 실험을 한 결과, NF-M 단백질 발현이 NIM 6시간 처리군에서 더 많은 세포에서 나타났다(도 5 참조).

상기의 부틸 하이드록시아니솔(BHA)은 2-tert-butyl-4-hydroxyanisole과 3-tert-butyl-4-hydroxyanisole, 두 이성체의 유기 화합물로, 산화방지제의 특성을 지니고 있다. BHA는 nuclear factor-kB 활성과 같은 활성산소에 의해 조절되는 세포내 신호경로를 억제하는 것으로 알려졌다(Sasada T et al., J. Clin. Invest., 97, 2268-2276, 1997). 또한 상기의 물질과 같은 산화방지제는 신경보호를 강화한다고 알려져 있다(Poeggeler B et al., J. neurochem, 95, 962-973, 2005). 포스콜린(Forskolin, 7 beta-acetoxy-8, 13-epoxy-1 alpha, 6 beta, 9 alpha-trihydroxy-labd-14-ene-11-one)은 아데닐사이클라제(adenylcyclase)를 활성화하고 순환 AMP의 양을 증가시킴으로 세포 수용체를 자극한다. cAMP는 중요한 신호 전달체로서 호르몬에 대한 세포의 적절한 반응에 필요하고, 세포 생존과 분화에 필요한 단백질 전사를 활성화시키는 기전에도 중요한 역할을 한다. 또한 밸프로산(VPA)은 직접적으로 histone deacetylase(HDAC)의 활성을 억제할 수 있으며, VPA에 의해 억제된 HDAC는 세포성장을 억제하고 다양한 종양 세포주의 분화를 증가시키는 것으로 알려졌다. VPA의 분화 효과는 세포 밖 신호-조절 효소(extracellular signal-regulated kinase, ERK) 경로와 같은 신호 전달 경로의 활성화와, 세포사멸 촉진인자들의 억제를 통하여 신경 보호 역할을 유도한다고 알려졌다[Hsieh J et al., PNAS, 101, 16659-16664, 2004]. 또한, ERK가 증식과 분화 세포 생존에 관련이 있다고 보고되었다(Joneson T et al., J Biol Chem, 273, 7743-7748, 1998; Christerson LB et al., Cell Motil Cytoskeleton, 43, 186-198, 1999; Stariha RL & Kim SU, Microsc Res Tech, 52, 680-688, 2001; Vaudry D et al., J Neurochem, 83, 1272-1284, 2002).

참고로 보통 세포를 급속하게 냉동시킬 때 사용하는 DMSO의 농도가 10%인데 반해, 본 발명에서는 2% DMSO를 사용하였으며, 또한 6시간 동안만 처리하였으므로, 세포에 대한 독성은 없을 것으로 사료되었다. 또한, 본 발명은 사람 골수로부터 줄기세포를 얻은 후, in vitro 상에서 신경세포로 효율적으로 분화시키는 배지를 발명한 것이므로, 인체에 이 배지를 직접 사용할 이유가 없다. 즉, 상기의 배지를 사용하여 분화시킨 세포만 따로 분리하여 치료 목적으로 인체에 주입하는 것이다.

본 발명자들은 중간엽 줄기세포에서 신경세포로의 분화를 수행했던 이전의 연구(Zhao et al., Exp Neurol, 190, 396-406, 2004; Bertani N et al., J Cell Sci, 118, 3925-3936, 2005; Woodbury D et al., J Neurosci Res, 69, 908-917; Guillermo M-E et al., 21, 437-448, 2003)를 재현해 보았다. 그 결과, 신경세포로의 분화의 재현성이 매우 낮았으며, 신경세포로의 분화된 것을 확인할 수 있는 표지의 발현이 없었고, 그 유도시간이 본 발명의 방법에 비해 오래 걸리는 것을 확인하였다(도 7 참조). 또한, 신경세포의 분화 정도가 충분하지는 못하였다(도 6 참조). 이에 본 발명자들은 신경세포유도에 필요한 불필요한 화합물의 양을 줄이는 방향으로 재현성이 높은 신경세포 분화 방법을 개발하였고, 신경세포 분화의 표지(neurofilament 150 kDa, NF-M; neurofilament 68 kDa, NF-L)뿐만 아니라 신경세포 중에서 운동신경세포로 분화된 표지(Islet 1)의 발현을 RT-PCR의 방법으로 확인하였다(도 3 참조). 그리고, 세포면역형광화학법(immunofluorescencecyto chemistry method)으로 본 발명에 의해 분화된 신경세포에서 NF-M 단백질의 발현을 확인할 수가 있었다(도 4 참조). 또한, Zhao 등의 방법과 Bertani 등의 방법을 조합함으로써 Zhao 등의 방법에 비해 신경세포로의 분화와 재현성이 향상되고, 분화된 신경세포의 표지가 발현된 것을 관찰할 수 있었다(도 9 참조).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용을 제한하지는 않는다.

<실험예 1> 본 발명의 방법에 의한 신경세포 분화의 재현

<1-1> 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cell; hMSC)의 배양

저온 보관된 중간엽세포(Poietics Normal Human Mesenchymal Stem Cells)는 Cambrex, USA)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 상기 중간엽세포는 기본 배지와 성장 보충제로 구성된 MSC 성장 배지(MSCGM-500 ㎖ 중간엽 세포 성장 보충제, 10 ㎖ 200 mM L-glutamine, 0.5 ㎖ 페니실린-스트렙토마이신 혼합물, Cambrex, USA)로 2 계대를 배양한 후, 10% FBS(Gibco, USA)와 100 ng/㎖ 페니실린, 100 U/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 DMEM(Gibco, USA) 배지로 37℃, 5% CO₂의 배양기에서 배양하였다. 배양기에서 3일 동안 배양한 후, 배지를 제거하고 인산완충용액(phosphate-buffered saline, PBS)으로 세척하여 남아있는 여분의 배지를 제거하였다. 0.1% 트립신/EDTA(Gibco, USA)으로 세포를 떼어내고 새로운 배지로 1:3으로 희석하여 계대 배양하였다.

<1-2> hMSC의 신경분화 유도

중간엽세포는 계대 배양하는 동안 DMEM 배지에 10% FBS와 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 일반 배지에서 배양하였다. 신경분화를 위해 1 mM β-머캅토에탄올(Sigma, USA)이 포함된 일반 배지로 24 시간 동안 키운 후, 2 mM β-머캅토에탄올이 포함된 일반 배지로 바꿔주고 3 시간 동안 배양하여 전-유도를 수행하였다. 전-유도 후에 10% FBS 대신에 N2 보충제(N2 supplements; Gibco, USA)가 포함된 DMEM에 2% DMSO(Sigma, USA), 200 μM 부틸 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, Sigma, USA), 10 μM 포스콜린(Sigma, USA), 2 mM 밸프로산(Sigma, USA) 및 10 mM 염화칼륨(Sigma, USA)을 넣은 신경유도배지(neuronal induction media; NIM)로 바꿔주어 적절한 시간(0, 2, 4, 8 시간)동안 배양하였고, 형태 변화를 현미경으로 관찰하였다.

상기의 방법으로 처리한 실험군의 형태 변화를 관찰한 결과, NIM을 처리한 배지에서 키운 세포가 시간이 지남에 따라 신경세포 유사 형태로 변하는 것을 관찰할 수 있었다(도 1)

<1-3> RT-PCR을 통한 신경분화 표지의 확인

미처리 대조군 중간엽 줄기세포와 실험예 <1-2>의 방법으로 NIM을 처리한 중간엽 줄기세포로부터 트리졸 용액(Invitrogen, USA)을 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA 2 ㎍를 MMLV 역전사효소(MMLV reverse transcriptase, MMLV RTase; Promega, USA)를 이용하여 역전사(reverse transcription, RT)를 수행하였다. 더욱 상세하게는, 0.5 ㎍ 올리고(dT) 프라이머, 2.5 mM dNTPs, 5× MMLV 완충용액, RNase 억제제, MMLV RTase를 이용하여 50 ㎕ 부피로, 진행하였다. 그 후 PCR 증폭을 위해 5분간 94℃에서 RNA의 2차 구조를 풀어준 후, 94℃에서 45초, 55-65 °C에서 45초, 72℃에서 45초를 35cycle 돌리고, 74°C에서 7분간 신장시키는 과정을 PCR 증폭기(Bio-Rad, USA)를 이용하여 실험을 진행하였다.

상기의 반응 후 생성된 RT-산물(3-5 ㎕)과 특이 프라이머 쌍(표 1)을 이용 하여 PCR을 수행하였다. PCR 음성 대조군으로는 RT 산물 대신에 물을 이용하였고, PCR의 정확도와 동일한 배분을 위해 Taq 중합효소, 2.5 mM dNTPs, 특이 프라이머 쌍과 10X 완충용액이 포함된 마스터 믹스를 만들어서 각 반응 튜브에 나눠담고, 주형으로 상기 RT-산물 혹은 물을 첨가하여 PCR을 수행하였다. 더욱 상세하게는, 주형 DNA 혹은 물을 95℃에서 5분 동안 변성해주고, 95℃ 45초, 65°C 45초, 72℃ 45초의 조건으로 35 회전을 돌린 후, 72℃에서 5분 동안 신장시켜준 뒤, 4℃에서 쿨링(cooling)의 순서로 수행하였다. 상기의 반응 완료 후 생성된 PCR 산물을 1.5% 아가로스 젤 상에서 전기영동 하고, 트랜스일루미네이터를 이용하여 밴드의 크기를 확인하였다.

표 1: PCR의 프라이머쌍

이름		시퀀스	산물 크기
인간 Nestin	정방향	CTCTGACCTGTCAGAAGAAT (서열번호 1)	316bp
	역방향	GACGCTGACACTTACAGAAT (서열번호 2)
인간 b-tubulin III(TuJ1)	정방향	ATGAGGGAGATCGTGCACA (서열번호 3)	267bp
	역방향	CCCCTGAGCGGACACTGT (서열번호 4)
인간 NF-M	정방향	TGGGAAATGGCTCGTCATTTG (서열번호 5)	333bp
	역방향	CTTCATGGAAACGGCCAATTC (서열번호 6)
인간 NF-L	정방향	TCCTACTACACCAGCCATGTC (서열번호 7)	285bp
	역방향	TCCCCAGCACCTTCAACTTTC (서열번호 8)
인간 beta-actin	정방향	CCACGAAACTACCTTCAACTCC (서열번호 9)	285bp
	역방향	TCATACTCCTGCTGCTTGCTGATCC (서열번호 10)

그 결과, NIM에 의해 hMCS 내에서 유도시간에 따라 NF-M과 NF-L의 성숙 신경 표지(mature neuronal marker)의 발현량에 차이가 있음을 확인하였다. 즉, 미처리 대조군에서는 NF-M과 NF-L의 발현이 거의 없었으나, hMSC를 NIM으로 시간대 별로 처리한 결과, 상기 두 유전자의 발현이 점점 증가하다가 6시간이 되면 감소하는 결과를 나타내었다(도 2). 즉, 4 시간 동안 NIM을 처리함으로써 신경세포 분화를 유도하였을 때, 성숙신경표지의 발현량이 가장 높았으므로, 4 시간 동안 발현을 유도하는 것이 효율적인 것으로 나타났다. 또한, NIM 처리군이 미처리 대조군과 초기 신경 표지의 발현량이 유사한 결과를 보여주었지만, 성숙 신경 표지(NF-M, NF-L)와 운동 신경 표지(Islet-1)의 발현량이 확연히 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 3). 즉, 본 발명의 유도 방법에 의해 중간엽 줄기세포가 신경세포로의 분화에 그치지 않고, 운동신경 세포로 분화될 수 있는 가능성을 보여주었다.

<1-4> 세포면역형광화학법에 의한 신경분화 표지의 확인

먼저 커버 슬립(Fisher Scientific, USA)에 PDL(Sigma, USA)을 20μg/ml의 농도로 하루동안 코팅한 후, 라미닌(Sigma, USA)을 10μg/ml의 농도로 3시간 동안 재코팅하고 증류수로 5번 세척해주었다. 키우고 있던 중간엽 줄기세포를 0.1% 트립신/EDTA로 용기에서 떼어낸 후 위에서 만들어진 PDL-라미닌 코팅 커버 슬립에 심어서 하루 동안 10% FBS가 포함된 DMEM (1000mg/l glucose 함유, WelGENE, Korea) 배지에서 배양하였다. 미처리 대조군 중간엽 줄기세포나 실험예 <1-2>의 방법으로 NIM을 처리한 세포를 4%(v/v) 파라포름알데히드를 실온에서 30분 동안 처리하고 1× PBS로 3번 세척하였다. 이어서, 0.2% 트리톤X100를 10분 동안 처리하여 투과하고 1× PBS로 3번 세척하였다. 그리고 비특이 결합을 막기 위해, 5% 염소 혈장이 포함된 차단 완충용액을 1시간 동안 처리하였다. 다음으로 4℃에서 차단 완충용액 (5% 염소 혈장이 포함된 1× PBS)으로 희석한 일차 항체(표 2)와 상기의 중간엽 줄기세포를 밤새 붙여주었고, 1× PBS로 3번 세척한 후 차단 완충용액에 1:500으로 희석한 FITC(fluorescein isothiocyanate) 결합- 혹은 Cy3 결합- 항-마우스나 항-래빗(Jackson Immunoresearch, USA) 이차 항체를 어두운 상온에서 1시간 동안 붙여주었다. 마지막으로 PBS에 1:2,500으로 희석한 DAPI(Santa Cruz, USA)로 10분 동안 핵을 염색하였고, 1× PBS로 3번 세척한 후, FluoView^TM 공초점현미경(FluoView^TM Confocal Microscope, Olympus, Japan)으로 사진을 찍어서 조직학적 분석을 수행하였다.

그 결과, 0h 에서는 줄기세포 마커인 네스틴(nestin)이 발현되다가 NIM을 처리한 시간이 증가함에 따라 그 발현정도가 감소되었다. 신경세포 마커인 NeuN, MAP-2, NF-M(neurofilament 150kDa)의 발현정도를 보면 NIM을 처리한 시간이 지날수록 점점 그 발현정도가 증가하는 것을 볼 수 있을 뿐만 아니라, 세포의 형태가 NIM에 의해 뉴런-유사 세포(neuron-like cell)로 분화된 것을 더욱 확실하게 관찰할 수 있었다(도 4).

NIM 시간별(2, 4, 6 및 8 시간)로 신경세포 표지 단백질 마커의 발현을 면역형광법으로 확인한 결과에서는 NIM 6시간 군에서 NF-M 단백질 발현이 증가한 반면, nestin 단백질이 감소함을 확인할 수 있었다(도 5).

표 2: 일차 항체의 희석비율

이름	희석비율	숙주
Nestin	1:300	마우스
NF-M	1:400	래빗
NeuN	1:500	마우스
MAP2	1:200	마우스

<비교예 1> Zhao 등의 방법에 의한 신경세포 분화의 재현

<1-1> hMSC의 신경분화 유도

본 발명자들은 Zhao 등(Zhao et al., Exp Neurol, 190, 396-406, 2004)의 방법에 따라, hMSC의 신경분화 유도를 수행하였다. 실험예 <1-1>의 방법으로 수득한 중간엽세포는 계대 배양하는 동안 DMEM/F-12 배지에 10% FBS와 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 일반 배지에서 배양한 후, 신경분화를 위해 일반 배지에 1 mM β-머캅토에탄올(Sigma, USA)을 넣은 배지로 24 시간 동안 키웠다. 이어서 2 mM β-머캅토에탄올을 넣은 일반 배지로 교체하며 3 시간 동안 배양하여 전-유도를 수행한 후, 10% FBS 대신에 N2 보충제(N2 supplements; Gibco, USA)가 포함된 DMEM에 2% DMSO(Sigma, USA)와 200 μM 부틸 하이드록시아니솔(Sigma, USA)을 넣은 신경유도배지(neuronal induction media; NIM)로 교체하여 1 내지 2 시간 동안 배양하고, 형태적 변화를 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 형태학적으로 신경세포로 분화한 모습을 관찰할 수 없어 그 재현성 또한 높지 않았다(도 6).

<1-2> RT-PCR을 통한 신경분화 표지의 확인

미처리 대조군 중간엽 줄기세포와 비교예 <1-1>의 방법으로 NIM을 처리한 중간엽 줄기세포로부터 RNA를 수득하는 방법과 역전사와 PCR 반응 후, 전기영동과 트랜스일루미네이터를 이용한 밴드 크기의 확인은 실험예 <1-3>과 동일하였다.

상기의 방법으로 분석한 결과, 비교예 <1-1>의 방법으로 중간엽 세포로부터 신경세포 분화 시 신경세포 표지의 증가가 나타나지 않았다(도 7). 즉, 본 발명의 유도 방법에 비해 그 효과가 낮았다.

<비교예 2> Zhao 등의 방법과 Bertani 등의 방법의 조합에 의한 신경세포 분화의 재현

<2-1> hMSC의 신경분화 유도

본 발명자들은 Zhao 등(Zhao et al., Exp Neurol, 190, 396-406, 2004)의 방법과 Bertani 등(Bertani N et al., J Cell Sci, 118, 3925-3936, 2005)의 방법의 조합에 따라, hMSC의 신경분화 유도를 수행하였다. 실험예 <1-1>의 방법으로 수득한 중간엽세포는 계대 배양하는 동안 DMEM 배지에 10% FBS와 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 일반 배지에서 배양한 후, 신경분화를 위해 일반 배지에 1 mM β-머캅토에탄올(Sigma, USA)을 넣은 배지로 24 시간 동안 키웠다. 이어서 2 mM β-머캅토에탄올을 넣은 일반 배지로 교체하며 3 시간 동안 배양하여 전-유도를 수행한 후, 10% FBS 대신에 N2 보충제(N2 supplements; Gibco, USA)가 포함된 DMEM에 2% DMSO(Sigma, USA), 200 μM 부틸 하이드록시아니솔(Sigma, USA), 10 μM 포스콜린(Sigma, USA), 2 mM 밸프로산(Sigma, USA), 10 mM 염화칼륨(Sigma, USA)을 넣은 신경유도배지(neuronal induction media; NIM)로 바꿔주어 적절한 시간(0, 3, 6, 9 시간, 1일)동안 배양하였다.

그 결과, Zhao 등의 방법에 비해 신경세포로의 분화 및 재현성이 개선된 것을 나타냈다(도 9). 또한, 형태학적으로 신경세포로 분화한 모습을 관찰할 수 있었다 (도 8).

<2-2> RT-PCR을 통한 신경분화 표지의 확인

미처리 대조군 중간엽 줄기세포와 비교예 <2-1>의 방법으로 NIM을 처리한 중간엽 줄기세포로부터 RNA를 수득하는 방법과 역전사와 PCR 반응 후, 전기영동과 트랜스일루미네이터를 이용한 밴드 크기의 확인은 실험예 <1-3>과 동일하였다.

상기의 방법으로 분석한 결과, 비교예 <2-1>의 방법으로 중간엽 세포로부터 신경세포 분화 시 신경세포 표지의 발현이 나타났고 Zhao 등의 방법에 비해 신경 분화에 더욱 적합한 조건으로 나타났다(도 9).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 2회에 나눈 전-유도 방법과 부틸 하이드록시아니솔, 포스콜린 및 VPA를 포함하는 신경유도배지(neuronal induction media, NIM)을 사용하는 방법으로 중간엽 줄기세포를 신경세포 또는 운동세포로 효과적으로 분화시킴으로써, 신경 질환의 치료를 위한 신경세포 또는 운동신경세포를 제공할 수 있다.

<110> Seoul national university industry foundation <120> Method of inducing differentiation of mesenchymal stem cells into nerve cells <130> 6p-11-20 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> human Nestin forward primer <400> 1 ctctgacctg tcagaagaat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> human Nestin reverse primer <400> 2 gacgctgaca cttacagaat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> human b-tubulin III(TuJ1) forward primer <400> 3 atgagggaga tcgtgcacat 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> human b-tubulin III(TuJ1) reverse primer <400> 4 cccctgagcg gacactgt 18 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> human NF-M forward primer <400> 5 tgggaaatgg ctcgtcattt g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> human NF-M reverse primer <400> 6 cttcatggaa acggccaatt c 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> human NF-L forward primer <400> 7 tcctactaca ccagccatgt c 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> human NF-L reverse primer <400> 8 tccccagcac cttcaacttt c 21 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> human beta-actin forward primer <400> 9 ccacgaaact accttcaact cc 22 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> human beta-actin reverse primer <400> 10 tcatactcct gctgcttgct gatcc 25

Claims

1) 중간엽 줄기세포에 β-머캅토에탄올로 처리하는 1차 전-유도(pre-induction) 및 상기 1차 전-유도 중간엽 줄기세포에 β-머캅토에탄올을 다시 처리하는 2차 전-유도를 수행하는 단계;

2) 단계 1의 2차 전-유도 처리한 중간엽 줄기세포를 부틸 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA), 포스콜린 및 밸프로산(valproic acid, VPA)을 포함하는 신경유도 배지로 2 내지 8 시간 동안 유도하는 단계를 포함하는 신경세포 분화 방법.

제 1항에 있어서, 전-유도는 1차 전-유도에 비해 2차 전-유도시 β-머캅토에탄올의 농도가 1.5 내지 2배 증가하는 것을 특징으로 하는 신경세포 분화 방법.

제 1항에 있어서, 2차 전-유도는 1차 전-유도 시간의 1/4 내지 1/8 로 줄어드는 것을 특징으로 하는 신경세포 분화 방법.

제 1항에 있어서, 2차 전-유도는 1차 전-유도 시간의 1/8 로 줄어드는 것을 특징으로 하는 신경세포 분화 방법.

제 1항에 있어서, 신경유도 배지는 100 내지 200 μM의 BHA, 9 내지 11 μM 포스콜린 및 1.5 내지 2.5 mM VPA를 포함하는 것을 특징으로 하는 신경세포 분화 방법.

제 1항에 있어서, 단계 2는 신경유도 배지로 3 내지 5 시간 동안 유도하는 것을 특징으로 하는 신경세포 분화 방법.

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