JP2023525297A - 幹細胞をドーパミン作動性前駆細胞に分化させるための方法 - Google Patents

幹細胞をドーパミン作動性前駆細胞に分化させるための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、幹細胞を腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞及び中脳ドーパミン作動性ニューロンに分化させるための方法、並びにその組成物、キット及び使用に関する。【選択図】図１－１

Description

本発明は、幹細胞を腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞及び中脳ドーパミン作動性ニューロンに分化させる方法、並びにその組成物、キット及び使用に関する。
パーキンソン病、アルツハイマー病、及びハンチントン病等の神経変性疾患は、神経集団の進行性変性及び／又は死をもたらす不治の衰弱状態である。パーキンソン病（ＰＤ）は、中脳の一部である黒質緻密部（ＳＮｐｃ）におけるドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンの進行性喪失と関連しているため、主に運動系に影響を与え、動作緩慢、固縮、及び安静時振戦を引き起こす。
細胞移植による神経変性疾患の治療は、１９８０年代後半の臨床試験で開始され、胎児脳由来のドーパミンニューロン前駆細胞がパーキンソン病に罹患する個体に移植された。これらの治験は、移植された細胞が失われたドーパミン神経伝達を回復し、運動障害を逆転させることができることを示した（Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ，Ａ．＆Ｌｉｎｄｖａｌｌ，Ｏ．Ｊ．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｓ．Ｄｉｓ．７，Ｓ２１－Ｓ３１（２０１７））。しかしながら、胎児組織の使用には、利用可能性の低さ、変動性の高さ、及び多数の倫理的懸念等、多くの問題が伴う。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）誘導、及び２００７年の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の発見に続いて、胎児組織に取って代わる可能性があるヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の新しいスケーラブルな供給源が利用可能となった。
多能性幹細胞の中脳ドーパミン作動性（ｍＤＡ）ニューロンへの分化を制御しようとする広範な開発が行われている（Ｋｉｒｋｅｂｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１，７０３－７１４（２０１２），Ｋｒｉｋｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４８０，５４７－５５１（２０１１）、及びＭａｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．＆Ｉｏａｎｎｉｄｉｓ，Ｊ．Ｐ．Ａ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．８，３６６－３７４（２０１９））。移植されたｈＰＳＣ由来調製物は、動物ＰＤモデルで機能的有効性を示し、同種ＥＳＣ又は自己ｉＰＳＣを出発材料として使用する臨床試験が開始されているか、又は近い将来に予定されている（Ｂａｒｋｅｒ，Ｒ．Ａ，Ｐａｒｍａｒ，Ｍ．，Ｓｔｕｄｅｒ，Ｌ．＆Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２１，５６９－５７３（２０１７））。
これらの進歩にもかかわらず、新しいｈＰＳＣ株が使用される際の一貫性を高め、バッチ間の調整を最小限に抑えるために、分化プロトコルのロバスト性を強化する継続的な必要性が存在する（Ｎｏｌｂｒａｎｔ，Ｓ．，Ｈｅｕｅｒ，Ａ．，Ｐａｒｍａｒ，Ｍ．＆Ｋｉｒｋｅｂｙ，Ａ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１２，１９６２－１９７９（２０１７）。これは、患者固有の自己ｉＰＳＣ株又は多数のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が一致するドナーｉＰＳＣが日常的な診療に考慮される場合に特に重要であるが、免疫学的観点から同種ＥＳＣ株よりも免疫学的に適合するｉＰＳＣが好ましいため、当然の経緯である（Ｗａｎｇ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｃｏｖ．１，１－１１（２０１５）及びＭｏｒｉｚａｎｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８，１－１２（２０１７））。
培養においてｈＰＳＣ由来の機能的ヒトニューロンを生成するために必要な長い時間は、別の課題及び費用負担をもたらし、疾患モデリング又はハイスループットな創薬におけるｈＰＳＣ由来細胞の日常的な適用の妨げとなる（Ｑｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５，１５４－１６３（２０１７））。ｍＤＡニューロンを生成するためのプロトコルは、所望の細胞型の収率に関して徐々に改善されてきたが、培養において成熟したｍＤＡニューロンを得るための時間は、最初のｈＰＳＣベースのプロトコルが２００４年に記載されて以来、本質的に一定のままであった（Ｍａｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．＆Ｉｏａｎｎｉｄｉｓ，Ｊ．Ｐ．Ａ．（２０１９））。培養において必要とされる電気生理学的特性を示す成熟したヒトｍＤＡニューロンを生成するには、６０日以上かかる（典型的にかかる）ことが報告されており（Ｎｉｃｌｉｓ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．６，９３７－９４８（２０１７）及びＲｉｅｓｓｌａｎｄ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２５，５１４－５３０．ｅ８（２０１９））、これは、細胞が機能的状態に達するのに必要な最小時間を反映している可能性がある。しかしながら、単一細胞解析では、ｈＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンは、インビボ対応物と比較して動態が遅く、発生の進行が厳密に制御されていないことが示唆されており（Ｌａ Ｍａｎｎｏ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６７，５６６－５８０．ｅ１９（２０１６））、現在の方法が、分化のタイミングに関して最適化されていない可能性が浮き彫りになっている。
現在のｍＤＡニューロンのプロトコルは、ＷＮＴシグナル伝達、又はＷＮＴ及びＦＧＦシグナル伝達の時限的活性化を利用して、中脳（ＭＢ）と後脳（ＨＢ）との間の境界で峡部オーガナイザーによって生成されるＷＮＴ１及びＦＧＦ８のパターン形成活性を模倣することによってＭＢの特徴を特定する（Ｔａｏ，Ｙ．＆Ｚｈａｎｇ，Ｓ．－Ｃ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １９，５７３－５８６（２０１６））。グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１は、ＷＮＴ経路を活性化するために適用されるが、ＣＨＩＲ９９０２１による前後方向の（ＡＰ）アイデンティティの特異化は、非常に濃度の影響を受けやすい（Ｌｕ，Ｊ；Ｚｈｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４，８９－９５（２０１５））。これは一貫性に影響を与え、個々のｈＰＳＣ株の非常に慎重な滴定を伴う。また、ラットＰＤモデルにおける大規模な設定のＣＨＩＲ９９０２１ベースの移植実験の評価により、実験間の有意な変動性、及び不良な移植結果の不良が移植前の調製における間脳遺伝子の発現と相関していることが明らかになり、ＣＨＩＲ９９０２１の最適化滴定後でも細胞の不正確な領域特異化が示唆された（Ｋｉｒｋｅｂｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０，１３５－１４８（２０１７））。
したがって、幹細胞からｍＤＡニューロンをより効率的に誘導するための別の方法が必要である。
このような背景に対して、本発明者らは驚くべきことに、高収率のヒトｍＤＡニューロンを、ロバストかつ迅速に誘導するための、レチノイン酸（ＲＡ）に基づく新規方法を発見した。ｈＰＳＣをドーパミン作動性ニューロンに分化させる他の方法は、時間がかかり、可変であり、個々のｈＰＳＣ系統に対して大規模なプロトコル調整を必要とする（また生物学的に無関係な表現型を生成する）可能性があるが、それとは異なり、本発明は、幹細胞を腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞にロバストに分化させることを可能にし、次いで、それを移植に使用することができるか、又は全体を通して適切な中脳表現型を保持しながら、高い速度及び前例のないスケーラビリティを備えた成熟した信頼のおける中脳ドーパミン作動性ニューロンに更に分化させることもできる。
一態様では、本発明は、幹細胞を腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞に分化させる方法であって、複数の幹細胞を有効量の少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と接触させることと、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む細胞集団への幹細胞の分化を引き起こすのに十分な条件下で幹細胞を培養することと、を含む、方法を提供する。
「幹細胞」には、胚組織及び成体組織に見られる、自己再生する能力及び異なる細胞型に分化する能力を有する細胞が含まれる。幹細胞は、様々な細胞系統を生成するそれらの能力に応じて、全能性、多能性、複能性、又は単能性に分類される。本発明に関連して、好ましい幹細胞は後述される。
本方法の「複数の幹細胞」は、少なくとも又は約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３個の細胞、又はその中で導出可能な任意の範囲を含み得る。複数の出発幹細胞は、少なくとも又は約１０、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８細胞／ｍＬ、又はその中で導出可能な任意の範囲の播種密度を有し得る。一実施形態において、複数の幹細胞は、６０，０００～８０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種される。
「分化する」及び「分化」という用語には、多能性幹（ＰＳ）細胞又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞等の、特殊化されていない又はあまり特殊化されていない（コミットされていない）幹細胞が、神経系細胞等の特定の目的及び機能を有する特殊化された細胞（最終分化細胞）の表現型の特徴を獲得するプロセスが含まれる。幹細胞の分化は、定義された分化状態の細胞に関連する細胞マーカー又は形態学的特徴の分析を含む、当技術分野で周知の方法によって決定することができる。
したがって、「幹細胞を分化させること」は、本発明に関連して、トランスクリプトーム及び／又は表現型等の、幹細胞とは異なる特徴を有する細胞を産生するように幹細胞を誘導することを含む（すなわち、例えば、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）等のタンパク質、又はフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）及びＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）等の一連のタンパク質の発現の変化）。
「中脳（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ）」としても知られる「中脳（ｍｉｄｂｒａｉｎ）（ＭＢ）」という用語には、前脳（ＦＢ）（前側）と後脳（ＨＢ）（後側）との間の発生中の脊椎動物の脳の領域が含まれる。中脳は、蓋、被蓋、及び黒質（ＳＮ）を含み、多くの分子的及び機能的に異なるタイプのニューロンで構成されている。中脳は、運動、特に目の動き、並びに聴覚及び視覚の処理において重要な機能を果たす。
本明細書で使用される場合、「背側」及び「腹側」という用語は、動物の体において解剖学における方向の表現として使用され、本明細書では、背側は体の「後端」を指し、腹側は「前端」を指す。「背腹軸（ｄｏｒｓｏｖｅｎｔｒａｌ ａｘｉｓ）」、「背腹軸（ｄｏｒｓｏ－ｖｅｎｔｒａｌ ａｘｉｓ）」又は「Ｄ－Ｖ軸」という用語は、これらの点を結ぶことによって得られる仮想線を指す。本明細書で使用される場合、「前側」、「後側」、「吻側」及び「尾側」という用語は、動物の体において解剖学における方向の表現として使用され、前側は身体の「頭端」を指し、後は前側の正反対（「尾端」）を指す。「前側」及び「吻側」という用語は互換的に使用され、「後側」及び「尾側」という用語は互換的に使用される。「前後軸（ａｎｔｅｒｏｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ａｘｉｓ）」、「前後軸（ａｎｔｅｒｉｏｒ－ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ａｘｉｓ）」、「前後軸（ａｎｔｅｒｏ－ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ａｘｉｓ）」又は「Ａ－Ｐ軸」という用語は、これら２点を結ぶ仮想線を指す。
「ドーパミン作動性」（ＤＡ）ニューロンには、神経伝達物質ドーパミン（ＤＡ）を合成する中枢神経系内のニューロンの集合体が含まれる。中脳ドーパミン作動性ニューロン（ｍＤＡ）は、発生学的に、（ｉ）パーキンソン病で主に影響を受ける黒質緻密部（Ａ９群）、（ｉｉ）腹側被蓋野（Ａ１０群）、及び（ｉｉｉ）赤核後部（Ａ８群）の３つの異なる核に分割される。ＳＮｐｃ及びＶＴＡ ＤＡニューロンは、ドーパミン合成の律速段階を触媒する酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の染色によって識別される、哺乳類脳の９つの主要なＤＡニューロン群のうちの２つを表す。
ｍＤＡニューロンの独自の特徴は、ＭＢの腹側正中線にあるニューロンではない底板（ＦＰ）細胞に由来することであり、前駆細胞がニューロンに分化する前にニューロンの潜在能力を獲得する必要がある。
「前駆細胞」には、部分的に分化した細胞が含まれる。「前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）」及び「前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。前駆細胞は、様々な神経サブタイプに分化する能力を有し、特に、本明細書に記載されるもの等の適切な因子を培養すると、様々なドーパミン作動性ニューロンのサブタイプに分化する。本発明に関連して、前駆細胞は、神経前駆細胞、特に腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞であり、Ａ９又はＡ１０ニューロン等のＤＡニューロンに分化するようにプライミングされる。
神経幹細胞（ＮＳＣ）の非幹細胞子孫が神経前駆細胞と称されることは理解されるであろう。神経前駆細胞は、増殖し、１つより多くの神経細胞型に分化する能力を有する。神経前駆細胞の際立った特徴は、幹細胞とは異なり、限られた増殖能力を有し、自己再生を示さないことである。
胎児の発生中に、発生中の中脳の腹側神経管でＤＡニューロンの前駆細胞が形成される。いわゆる床板領域からの前駆細胞は、ＬＭＸ１Ａ、ＦＯＸＡ２、及びＯＴＸ２を含む転写因子の発現を特徴とする。これらの細胞は、ＤＡ ＳＮｐｃニューロン（Ａ９群）及びＤＡ ＶＴＡニューロン（Ａ１０群）を生じる。これらの前駆細胞は、本明細書で使用される場合「腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞」と称される。腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞は、ＮＫＸ２．１、ＢＡＲＨＬ１、ＢＡＲＨＬ２、ＰＩＴＸ２、ＮＫＸ２．２、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＨＯＸ２Ａ、及びＮＫＸ６．１を単独で又は組み合わせて発現せず、代わりに、腹側ＨＢの視床下ニューロン、ＧＡＢＡ作動性中脳ニューロン、能運動ニューロン（ＭＮ）及びセロトニン作動性ニューロン（５ＨＴＮ）を生じる前駆細胞を定義する。腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞は、成熟した機能的ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンに分化する能力を有する。
腹側中脳前駆細胞は、ＬＭＸ１Ａ、ＦＯＸＡ２、及びＯＴＸ２も発現する間脳視床下ニューロン前駆細胞と区別することができる。しかしながら、間脳視床下ニューロン前駆細胞は、ＢＡＲＨＬ１、ＢＡＲＨＬ２、ＰＩＴＸ２、及びＮＫＸ２．１も発現し、腹側中脳前駆細胞と区別される。
本発明者らは、これらの正確にパターン化された前駆細胞が、成体ラットへの移植時に成熟した機能的な中脳ＤＡニューロンを生じることを示した（実施例、並びに図５ａ～図５ｃ及び図１１ｂ（補足図５ｂ）を参照）。
細胞を化合物（例えば、１つ以上の阻害剤、活性化剤、及び／又は誘導剤）と「接触させること」には、「接触された」細胞を生成する（得る）ために、細胞と物理的に近接した化合物を提供すること、換言すると、単数又は複数の細胞が化合物に到達できる場所に化合物を提供することが含まれる接触は、任意の好適な方法を使用して達成され得る。例えば、接触は、所望の濃度を達成するために、例えば細胞培養に関連して、化合物を濃縮形態で細胞又は細胞集団に添加することによって達成することができる。接触はまた、調合された培養培地の成分として化合物を含めることによっても達成され得る。
「有効量」には、所望の生理学的効果及び／又は治療効果を達成するのに十分な量が含まれる。幹細胞を腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞に分化させる方法に関連して、物質の有効量は、神経幹細胞に対する中脳アイデンティティを特定できる物質の任意の量、及び／又は中脳アイデンティティを有するドーパミン作動性ニューロンに対する多能性幹細胞の運命を指示するのに十分な量である。「有効量」を決定する方法は、当業者に周知であり、典型的には、所望の効果が達成されるまで、物質の用量を滴定することを含む。
「神経幹細胞（ＮＳＣ）」には、増殖及び自己再生することができ、中枢神経系の主要な３つの細胞タイプであるニューロン、アストロサイト、及びオリゴデンドロサイトに最終的に分化する子孫細胞を生成することができる複能性細胞が含まれる。対照的に、神経前駆細胞は、より制限された発生能及び限定された増殖能を有する。更に、それらは、より制限された種類の細胞型（すなわち、神経成分の１つのカテゴリーのみを生じるようにコミットされた系統に既になっている細胞、例えば、グリア細胞対ニューロン）にのみ分化することができる。
「活性化剤」には、分子又は経路のシグナル伝達機能、例えばＲＡシグナル伝達等の活性化を増加、誘導、刺激、活性化、促進、又は増強する化合物が含まれる。活性化剤は、活性化される経路を、活性化剤の添加なし又は添加前の経路の活性と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれ以上改善又は増加させ得る。
本明細書で使用される「レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤」という用語は、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達を増強することができるか又はそれに代わることができる任意の化合物又は分子を含むことが理解される。そのような活性化剤は、レチノイン酸の下流若しくは上流のシグナル伝達に関与するか、又はシグナル伝達経路の小分子アゴニストである可能性がある。レチノイン酸誘導体又はそのアゴニストを含む、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤の非限定的なリストが本明細書に提供される。
レチノイン酸及びその誘導体、特に、９－ｃｉｓ－レチノイン酸（９ｃＲＡ）、１３－ｃｉｓ－レチノイン酸（１３ｃＲＡ）、及びオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）は、ビタミンＡ（レチノール）に由来する構造的に単純な脂質分子の群であり、多数の遺伝子をトランス活性化し、全ての脊椎動物においてインビボ及びインビトロの両方で細胞の成長、分化、及び恒常性に多面発現効果を発揮する。それらは、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）及びレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）の２つのクラスの核内受容体に結合することにより、標的遺伝子の発現を調節する。ＡＴＲＡ及び１３ｃＲＡは、ＲＡＲにのみ効率的に結合することができるが、９ｃＲＡは、核内受容体ＲＡＲ及びＲＸＲの両方のリガンドである。レチノイン酸の効果を模倣することができる任意の分子が、本発明において企図される。当業者は、分子がレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤であるかどうかを、例えば、免疫細胞化学、ｑＰＣＲ、免疫ブロット法、ＲＮＡ－ｓｅｑ、又は当技術分野で既知の他の生化学的技術によるＲＡ発現の標的遺伝子の分析によって決定することができる。標的遺伝子には、ＣＹＰ２６Ａ１、ＲＡＲＡ、ＲＡＲＢ、ＭＥＩＳ２、ＨＯＸＡ１、ＣＲＡＢＰ１、ＣＲＡＢＰ２が含まれ得る。
一実施形態において、少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤の有効量は、約１０～８００ｎＭの培養培地中の最終濃度を提供するのに十分な量である。特定の実施形態において、少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤の有効量は、約１００～８００ｎＭの培養培地中の最終濃度を提供するのに十分な量である。特定の実施形態において、少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤の有効量は、約２００～８００ｎＭの培養培地中の最終濃度を提供するのに十分な量である。特定の実施形態において、少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤の有効量は、約２００～５００ｎＭの培養培地中の最終濃度を提供するのに十分な量である。特定の実施形態において、少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤の有効量は、約２００～４００ｎＭの培養培地中の最終濃度を提供するのに十分な量である。特定の実施形態において、少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤の有効量は、約３００ｎＭの培養培地中の最終濃度を提供するのに十分な量である。活性化剤は、その性質に応じて、異なる濃度範囲で機能し得る。例えば、効力の低い因子は、μＭ濃度でのみ効果を示す場合がある。逆に、図９ｃ（補足図３ｃ）に例示されるように、ＣＹＰ２６酵素によって分解することができないＲＡ類似体ＥＣ２３は、低濃度（１０ｎＭ）で幹細胞にｖＭＢアイデンティティを課すことができる。
「少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤の有効量」は、ＲＡシグナル伝達の活性化剤のアイデンティティに応じて変化し得ることが理解されよう。例えば、ＲＡシグナル伝達の活性化剤がＡＴＲＡである場合、レチノイン酸の有効量は、約１００～８００ｎＭの培養培地中の最終濃度を提供するのに十分な量であり得る。特定の実施形態において、ＡＴＲＡの有効量は、約２００～５００ｎＭの培養培地中の最終濃度を提供するのに十分な量であり得る。特定の実施形態において、ＡＴＲＡの有効量は、約２００～４００ｎＭの培養培地中の最終濃度を提供するのに十分な量であり得る。特定の実施形態において、ＡＴＲＡの有効量は、約３００ｎＭの培養培地中の最終濃度を提供するのに十分な量であり得る。
ＲＡシグナル伝達の活性化剤がＡＴＲＡ以外の分子である場合、その分子の有効量は、有効量のＡＴＲＡと同じ効果を生じる（すなわち、中脳アイデンティティを特定する）量（例えば、直前の段落に記載されている有効量のうちのいずれか）であることが理解されよう。例えば、ＲＡシグナル伝達の活性化剤が１３－ｃｉｓ－ＲＡである場合、１３－ｃｉｓ－ＲＡの有効量は、有効量のＡＴＲＡと同じ効果を生じる（すなわち、中脳アイデンティティを特定する）１３－ｃｉｓ－ＲＡの量（例えば、直前の段落に記載されている有効量のうちのいずれか）である。本発明者らが実施例で実証したように、細胞を５００ｎＭのＡＴＲＡ類似体（９－ｃｉｓ ＲＡ、１３－ｃｉｓ ＲＡ及び生体異物ＲＡ類似体タザロテン酸（ＴＡ））に４８時間曝露すると、ＬＭＸ１Ａ＋／ＮＫＸ２．１－ｖＭＢアイデンティティが課されることによりＡＴＲＡのパターン形成活性が模倣された（図３ｈ及び図９ｂ（補足図３ｂ））。
ＡＴＲＡ、９－ｃｉｓ ＲＡ、１３－ｃｉｓ ＲＡ、及びタザロテン酸（ＴＡ）とは異なり、合成ＲＡ類似体ＥＣ２３は、ＣＹＰ２６媒介性の酸化に耐性があるため、より安定している（Ｌｏｐｅｚ－Ｒｅａｌ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｎａｔ．２２４，３９２－４１１（２０１４））。したがって、細胞が２００ｎＭのＥＣ２３に曝露されたとき、細胞は後脳アイデンティティを獲得した。滴定実験は、ＥＣ２３が多能性幹細胞を腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞に分化させることができることを示したが、これには約２０倍の濃度低下と、わずか２４時間の細胞の処理が必要なだけであった（図９ｃ（補足図３ｃ））。したがって、当業者は、幹細胞を腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞に分化させるのに必要なＲＡシグナル伝達の任意の所与の活性化剤の有効量を決定するために、本明細書に記載の、又は当技術分野で別様に既知の滴定実験を実施することができる。
本明細書で使用される場合、「集団」という用語は細胞群を指す。特定の実施形態において、上記細胞群は、少なくとも又は約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３等の少なくとも２つの細胞を含み得る。
集団は、神経細胞の集団又は未分化多能性幹細胞の集団等の、１つの細胞型を含む純粋な集団であり得る。あるいは、集団は、例えば混合細胞集団等の、１つより多くの細胞型を含んでもよい。
「腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む細胞集団への幹細胞の分化を引き起こすのに十分な条件下で幹細胞を培養すること」には、少なくとも１つのＲＡシグナル伝達の活性化剤の存在下で、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞に分化できる条件下で幹細胞を培養するという意味が含まれる。任意の好適な条件を使用することができる。例えば、幹細胞は、細胞が少なくとも１つのＲＡシグナル伝達の活性化剤の存在下にあるとき、複数の幹細胞の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞への分化を誘導する１つ以上の薬剤及び／又は環境条件に曝露され得る。細胞の生存を促進するために必要な条件も含まれる。そのような条件は、幹細胞培養の技術において周知であり、当業者は、所与の幹細胞型に適切な条件を選択できることが理解されよう。
このような培養条件は、神経管の前後（ＡＰ）軸及び背腹（ＤＶ）軸に沿ってＮＳＣの固有の領域アイデンティティを課す段階的パターン形成シグナルを模倣するものを含み得る。例えば、そのような条件は、幹細胞に腹側領域特異化を課すことができる薬剤を含み得る。これは、ヘッジホッグ経路シグナル伝達を活性化する１つ以上の薬剤によって達成され得る。
神経管の前後（ＡＰ）軸及び背腹（ＤＶ）軸に沿ってＮＳＣの固有の領域アイデンティティを課す段階的パターン形成シグナルに応答して、神経管の様々な位置で異なるタイプのニューロンが生成される。神経発生及びｈＰＳＣ培養において、ＮＳＣは、パターン形成シグナルが存在しない場合、デフォルトで皮質前脳（ＦＢ）アイデンティティを獲得する。ＷＮＴ、ＦＧＦ、及びレチノイン酸（ＲＡ）は、ＮＳＣの後部中脳（ＭＢ）、後脳（ＨＢ）、又は脊髄（ＳＣ）の特徴をより強く課すことに関与する３つの主要なシグナル伝達経路である。段階的なソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）とＢＭＰシグナル伝達は、順番に、神経管のＤＶ軸に沿ってＮＳＣの異なるアイデンティティを課す。転写因子ＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ、ＯＴＸ２、及びＦＯＸＡ２の共発現によって定義されるｍＤＡニューロン前駆細胞は、発生中のＭＢの腹側正中線に局在する。現在のｈＰＳＣベースのｍＤＡニューロンのプロトコルは技術的に関連しており、ＷＮＴシグナル伝達の時限的活性化、又はＷＮＴとＦＧＦシグナル伝達の組み合わせを利用して、ＭＢの特徴及びＳＨＨシグナル伝達を特定し、ＮＳＣの腹側ｍＤＡニューロン前駆細胞アイデンティティを誘導する。これらのプロトコルにおけるＷＮＴ及びＦＧＦの応用は、ＭＢとＨＢとの境界に確立された二次オーガナイザーセンターである峡部によるＷＮＴ１及びＦＧＦ８シグナル伝達を模倣しようとする試みに適用される。
ＨＢ及び脊髄のパターン形成におけるＲＡシグナル伝達の役割は十分に確立されており、ＲＡシグナル伝達は、体性運動ニューロン等の、神経管に尾側起源を有するニューロンの産生のためのｈＰＳＣベースのプロトコルで一般的に使用されている。発生中の胚では、ＲＡシグナル伝達の後方から前方への勾配がＨＢの吻側部分に到達すると考えられるが、ＭＢ又はＦＢになる運命にあるより吻側の領域には到達しない。ＲＡの強力な尾側化の影響のために、ＲＡシグナル伝達は、ｍＤＡニューロンを含む吻側に由来するニューロンの産生とは適合しないと考えられている。実際、多くの現在の最先端のｈＰＳＣベースのｍＤＡニューロンのプロトコルは、したがって、それぞれの分化手順において、ＲＡ、又はＲＡの前駆体であるビタミンＡを積極的に排除している（Ｋｉｒｋｅｂｙ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｎｏｌｂｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｍｏｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｊｏｖａｎｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｌｅｈｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
好ましい実施形態において、少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤は、神経幹細胞に対する腹側中脳アイデンティティを特定するのに有効である。
例えば、少なくとも１つの活性化剤は、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む細胞集団への幹細胞の分化を引き起こすのに十分な条件下にある場合、神経幹細胞に対する腹側中脳アイデンティティを特定するのに有効である。
本明細書で使用される用語「腹側中脳アイデンティティ」には、神経前駆細胞が、中脳に特異的なマーカーをインビトロで発現し、脳の他の領域の前駆細胞（すなわち、前脳又は後脳）に特異的なマーカーを発現しないことが含まれる。腹側中脳前駆細胞は、ＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２を発現し、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＢＡＲＨＬ１、ＢＡＲＨＬ２、ＰＩＴＸ２、ＮＫＸ６．１、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＦＯＸＧ１、ＥＭＸ２、ＰＡＸ６、ＳＩＸ３、ＳＩＸ６、ＬＨＸ２、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ４を発現しない。
一実施形態において、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む細胞集団中の細胞の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％が、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞のマーカーに対して陽性である。
本明細書で使用される「マーカー」という用語は、目的の細胞において差次的に発現される核酸又はポリペプチド分子を指す。本発明に関連して、差次的発現は、未分化細胞と比較して、陽性マーカーのレベルの増加及び陰性マーカーのレベルの低下を意味する。目的の細胞を特定する及び他の細胞と区別することができるように、マーカー核酸又はポリペプチドの検出可能なレベルは、他の細胞と比較して目的の細胞において十分に高い又は低い。マーカー発現を観察及び定量化するための様々な方法が当技術分野で既知であり、免疫細胞化学及び免疫組織化学（実施例を参照）並びに免疫ブロット法、ｑＰＣＲ及びＲＮＡ配列決定が挙げられる。
本明細書で使用される場合、特定のマーカーが細胞内で検出される場合、細胞は、特定のマーカー「に対して陽性」であるか、又は、「陽性」である。逆に、特定のマーカーが細胞内で検出されない場合、細胞は特定のマーカー「に対して陰性」、又は「陰性」である。マーカーに関連する「＋」又は「－」記号の使用は、本明細書において、上記マーカーに対して陽性又は陰性であると理解されることを意味する（例えば、ＬＭＸ１Ａ＋細胞はマーカーＬＭＸ１Ａに対して陽性である）。
特定の実施形態において、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞は、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）及びＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）を発現する。
「ＦＯＸＡ２」は、ヒトにおいてＦＯＸＡ２遺伝子によってコードされるタンパク質である。フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２は、ＤＮＡ結合タンパク質のフォークヘッドクラスのメンバーである。ＦＯＸＡ２は、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ９Ｙ２６１によって示されるようなタンパク質配列を含み得る。ＦＯＸＡ２という用語は、任意のＦＯＸＡ２核酸分子又はポリペプチドを包含し、その断片又は変異体も含むことができる。当業者は、ＦＯＸＡ２を検出する方法を知っている。そのような方法は、実施例にも記載されている。
ＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）は、ヒトにおいてＬＭＸ１Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＬＭＸ１は、インスリンプロモーターのＡ／Ｔリッチ配列に結合し、インスリンの転写を刺激するＬＩＭホメオボックス転写因子である。ＬＭＸ１Ａは、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ８ＴＥ１２によって示されるようなタンパク質配列を含み得る。ＬＭＸ１Ａという用語は、任意のＬＭＸ１Ａ核酸分子又はポリペプチドを包含し、その断片又は変異体も含むことができる。当業者は、ＬＭＸ１Ａを検出する方法を知っている。そのような方法は、実施例にも記載されている。
好ましい実施形態において、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞は更に、ＬＩＭホメオボックス転写因子１β（ＬＭＸ１Ｂ）及びオルソデンティクルホメオボックス２（Ｏｒｔｈｏｄｅｎｔｉｃｌｅ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２，ＯＴＸ２）を発現する。
ＬＩＭホメオボックス転写因子１ベータ（ＬＭＸ１Ｂ）は、ヒトにおいてＬＭＸ１Ｂ遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＬＭＸ１Ｂは、脊椎動物の四肢の背腹パターン形成において中心的な役割を果たすＬＩＭホメオボックス転写因子である。ＬＭＸ１Ｂは、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号０６０６６３によって示されるようなタンパク質配列を含み得る。ＬＭＸ１Ｂという用語は、任意のＬＭＸ１Ｂ核酸分子又はポリペプチドを包含し、その断片又は変異体も含むことができる。当業者は、ＬＭＸ１Ｂを検出する方法を知っている。そのような方法は、実施例にも記載されている。
オルソデンティクルホメオボックス２（ＯＴＸ２）は、ヒトにおいてＯＴＸ２遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＯＴＸ２は、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ３２２４３によって示されるようなタンパク質配列を含み得る。ＯＴＸ２という用語は、任意のＯＴＸ２核酸分子又はポリペプチドを包含し、その断片又は変異体も含むことができる。当業者は、ＯＴＸ２ Ｂを検出する方法を知っている。そのような方法は、実施例にも記載されている。
神経幹細胞のＬＭＸ１Ａ＋／ＬＭＸ１Ｂ＋／ＦＯＸＡ２＋／ＯＴＸ２＋アイデンティティは、長い間、ｍＤＡニューロンを生成するｖＭＢ前駆細胞に特異的な分子の特徴であると考えられていたが、このアイデンティティは、視床下核ニューロン（ＳＴＮ）を生じる尾側間脳の腹側前駆細胞によっても共有されることが後に示された。（図２ｄ）。ＢＡＲＨＬ１、ＢＡＲＨＬ２、ＰＩＴＸ２、及びＮＫＸ２．１は、ＳＴＮ系統によって選択的に発現されるため、間脳性ＳＴＮ前駆細胞と腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞とを区別するために使用することができる。
腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞は、ＦＯＸＧ１、ＥＭＸ２、ＰＡＸ６、ＳＩＸ３、ＳＩＸ６を含む、ＦＢアイデンティティを示すマーカーを発現しないことが理解されよう。
腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞は、ＮＫＸ２．２、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＢ４を含む、ＨＢアイデンティティを示すマーカーを発現しないことが理解されよう。
特定の実施形態において、細胞集団は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む。
一実施形態において、細胞の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％が、ＦｏｘＡ２及び／又はＬｍｘ１に対して陽性の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞である。いくつかの実施形態において、細胞集団は、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の、ＦｏｘＡ２及び／又はＬｍｘ１に陽性の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞（例えば、約９０％～９８％又は９５％～９９％の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞）を含む。
換言すると、細胞集団は、ＦｏｘＡ２及び／又はＬｍｘ１に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％陽性である。これは、免疫細胞化学に続いて細胞集団中の陽性細胞の割合を計数する等、当技術分野で既知の方法を使用して定量化することができる。
特定の実施形態において、細胞集団は、上記細胞集団を少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と最初に接触させてから、少なくとも７日後、例えば約９～１６日後、例えば約１４日後に、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む。
換言すると、細胞集団は、少なくとも７ＤＤＣ後、例えば約９～１６ＤＤＣ後、例えば約１４ＤＤＣ後に、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む。
特定の実施形態において、細胞集団は、上記細胞集団を少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と最初に接触させてから、７～１６日後、例えば、約７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後、１４日後、又は約１５日後に、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む。一実施形態において、細胞集団は、上記細胞集団を少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と最初に接触させてから約１４日後に、少なくとも約８０％の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む。
本明細書に記載されるように、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞は、ＲＡへの最初の曝露後７日以内にｈＰＳＣから誘導された（すなわち７ＤＤＣに、後述の定義を参照）。これらの７ＤＤＣ細胞は、ＦＯＸＡ２及びＬＭＸ１Ａを共発現する。添付の実施例に見られるように、１４日以内には（すなわち、１４ＤＤＣまでには）、ｈＰＳＣに由来する細胞集団の約８０％が、免疫細胞化学によって決定されるように、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ及びＯＴＸ２並びにｖＭＢマーカーであるＣＯＲＩＮを共発現する腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞である（図２ｇ）。
好ましい実施形態において、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む集団は、約７～１６ＤＤＣ以内、例えば約８ＤＤＣ以内、例えば約９ＤＤＣ以内、例えば約１０ＤＤＣ以内、例えば約１１ＤＤＣ以内、ＤＤＣ以内、例えば約１２ＤＤＣ以内、例えば約１３ＤＤＣ以内、例えば約１４ＤＤＣ以内、例えば約１５ＤＤＣ以内に得ることができる。
したがって、時限ＲＡパルス及びソニックヘッジホッグシグナル伝達（ＳＨＨ）の小分子活性化剤に曝露されたｈＰＳＣ由来ＮＳＣの大部分は、ＬＭＸ１Ａ＋／ＬＭＸ１Ｂ＋／ＦＯＸＡ２＋／ＯＴＸ２＋を発現し、かつ腹側中脳（ｖＭＢ）アイデンティティを有し、隣接する間脳領域、ＨＢ領域、又は外側ＭＢ領域アイデンティティを発現する細胞の混入はほとんど見られない。
特定の実施形態において、方法はインビトロ法である。
「インビトロ」には、体外の環境が含まれる。インビトロ環境には、試験管及び細胞培養が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、複数の幹細胞が、多能性幹細胞、複能性幹細胞、成体幹細胞（ＡＳＣ）等の非胚性幹細胞を含む群から選択され、複数の幹細胞は、ヒト（任意選択的に、ヒトは神経障害の症状を有する患者である）、げっ歯類、又は霊長類に由来する。
腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を産生するために使用される複数の幹細胞は、胚性及び非胚性の供給源、例えばｈＥＳＣ及び非胚性ｈｉＰＳＣ、体性幹細胞、疾患幹細胞、すなわち、パーキンソン病患者から単離された多能性細胞及び遺伝子操作由来幹細胞、癌幹細胞、ヒト又は哺乳動物の多能性細胞等を含む様々な供給源から得ることができる。
好ましい実施形態において、複数の幹細胞は多能性幹細胞である。一実施形態において、複数の幹細胞は、ヒト、霊長類、ブタ、イヌ、又はげっ歯類に由来する多能性幹細胞である。更に好ましい実施形態において、複数の幹細胞はヒト多能性幹細胞である。
「多能性幹細胞」には、内胚葉、中胚葉、外胚葉の３つ全ての胚葉の細胞を生じることが可能な細胞が含まれる。理論的には、多能性幹細胞は体のあらゆる細胞に分化できるが、多能性の実験的決定は、典型的には、多能性細胞が各胚葉のいくつかの細胞型に分化することに基づいている。多能性幹細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚性幹（ＥＳ）細胞であり得る。他の実施形態において、多能性幹細胞は、細胞再プログラミングとして当技術分野で既知の方法により成体体細胞の脱分化を誘導することによって得られる人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞であってもよい（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ．，Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ．Ｃｅｌｌ．２００６；１２６（４）：６６３－６７６）。特定の実施形態において、多能性幹細胞は、体細胞核移植（ＮＴ－ＥＳＣ）によって誘導された胚性幹細胞である。
複能性幹細胞は、所与の器官又は組織の全ての細胞型に、及びその器官又は組織の細胞のみに分化できる体性幹細胞である。複能性幹細胞の一例は、神経幹細胞である。
特定の実施形態において、複数の幹細胞は、マウス多能性幹細胞、マウスＥＳＣ、マウスｉＰＳ細胞、マウス神経幹細胞、化学的に誘導された幹細胞、霊長類多能性幹細胞、霊長類ＥＳＣ、霊長類ｉＰＳ細胞、霊長類神経幹細胞、化学的に誘導された霊長類幹細胞、ブタＥＳＣ、ブタｉＰＳ細胞、ブタ神経幹細胞、化学的に誘導されたブタ幹細胞、イヌ多能性幹細胞、イヌＥＳＣ、イヌｉＰＳ細胞、イヌ神経幹細胞、化学的に誘導されたイヌ幹細胞、ラット多能性幹細胞、ラットＥＳＣ、ラットｉＰＳ細胞、ラット神経幹細胞、化学的に誘導されたラット幹細胞、ヒト多能性幹細胞、ヒト成体幹細胞、ヒトＥＳＣ、ヒトｉＰＳ細胞、化学的に誘導されたヒト幹細胞、ＮＴ－ＥＳＣ、ヒト羊膜幹細胞、ヒトＥＳＣ由来の臍帯血幹細胞、ヒト神経幹細胞、ヒトＥＳＣ由来の長期神経幹細胞、ヒトｉＰＳ細胞由来の長期神経幹細胞、及びＮＴ－ＥＳＣ由来の長期神経幹細胞を含む群から選択され、任意選択的に、ヒトは、パーキンソン病（ＰＤ）の症状を有する患者である。
胚性幹（ＥＳ）細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性細胞である。ヒトＥＳ細胞を得るための方法、並びにアカゲザル及びコモンマーモセットＥＳ細胞を単離するための方法も既知である（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９５及びＴｈｏｍｓｏｎ，ａｎｄ Ｍａｒｓｈａｌｌ，１９９８）。１つの特定の実施形態において、上記ヒトＥＳＣは、他者によって、胚を破壊することなく、以前に誘導されている。例えば、そのような細胞は、８細胞胚盤胞からの細胞の抽出によって誘導された場合がある（Ｃｈｕｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，Ｆｅｂ ７；２（２）：１ １３－７）。当業者は、胚を破壊することなくＥＳＣを誘導するための他の方法を認識している。
ＥＳ細胞の別の供給源は、確立されたＥＳ細胞株である。様々なマウス細胞株及びヒトＥＳ細胞株が既知であり（例えば、ヒトＷ Ａ－０９細胞株の細胞）、それらの増殖及び伝播の条件が定義されている。本明細書で使用される場合、「ＥＳ細胞株」という用語には、多能性の特性を発現し、最大で数日間、数ヶ月間～数年間の分化を行わずに細胞の増殖及び伝播を可能にするインビトロ条件下で培養することができる胚性幹細胞のクローン集団の意味が含まれる。異なるＥＳ細胞株は、互いに独立して確立され、遺伝子型によって異なり、発生シグナル伝達分子に対する異なる応答性等の表現型によってもある程度異なる。そのようなＥＳ細胞株は全て本発明で使用できることが理解されよう。
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、ＥＳ細胞の特徴を有しながら、分化した体細胞の再プログラミングによって得られる細胞である。ｉＰＳＣは、インビトロで自己再生し、内胚葉、中胚葉、外胚葉の３つ全ての胚葉の細胞に分化することができる。ｉＰＳ細胞は、当技術分野で既知の様々な方法によって得られており、ＥＳ細胞とは異なり、ｉＰＳＣは特定の胚性遺伝子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＫＬＦ４導入遺伝子等）の導入によって人工的に形成される。マウスｉＰＳＣは２００６年に報告され（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ）、ヒトｉＰＳＣは２００７年後半に報告された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．ａｎｄ Ｙｕ ｅｔ ａｌ．）。
ｉＰＳ細胞は、哺乳動物細胞、例えば、マウス、ヒト、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、ハムスター、イヌ、モルモット、又は非ヒト霊長類細胞であり得る。例えば、体細胞の再プログラミングは、患者固有又は疾患固有の多能性幹細胞を生成する機会を提供する。ｉＰＳ細胞は、形態、増殖、遺伝子発現、奇形腫形成においてＥＳ細胞と区別できない。ヒトｉＰＳ細胞はまた、増殖可能であり、形態及び増殖においてヒト胚性幹（ＥＳ）細胞と区別できない。
間葉系細胞は、ｉＰＳ細胞の作製に有用であり、任意の好適な供給源から得ることができ、任意の特定の間葉系細胞型であり得る。例えば、最終的な目標が患者に移植するための治療用細胞を生成することである場合、その患者の間葉系細胞を使用してｉＰＳ細胞を生成することが望ましい。好適な間葉系細胞型には、線維芽細胞（皮膚線維芽細胞等）、造血細胞、肝細胞、平滑筋細胞、及び内皮細胞が含まれる。好適な実施形態において、本方法で使用されるｉＰＳ細胞は、ＰＤ患者に由来する。
体細胞核移植（ＮＴ－ＥＳＣ）によって誘導される胚性幹細胞は、体細胞核移植によって調製される多能性幹細胞であり、ドナー核が、例えばＴａｃｈｉｂａｎａ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｃｅｌｌ；１５３（６）：１ ２２８－３８に記載されるように、紡錘体のない卵母細胞に移植される。
本明細書で使用される場合、「体性（成体）幹細胞」という用語は、自己再生及び分化の両方の能力が限定された、多くの器官及び分化組織に見られる比較的稀な未分化細胞を指す。例として、全ての赤血球及び白血球並びに血小板を生じる造血幹細胞が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「臍帯血幹細胞」という用語は、体内の血液細胞の全てを少なくとも産生する能力を有する（造血性）、出生時に臍帯から回収された幹細胞を指す。
多能性幹細胞を細胞培養及び分化させる方法は、当技術分野の標準的な文献を参照して実施することができる。好適な技術は、Ｌｅｍｋｅ，Ｋｒｉｓｔｅｎ Ａ．，Ａｌｉｒｅｚａ Ａｇｈａｙｅｅ，ａｎｄ Ｒａｎｄｏｌｐｈ Ｓ．Ａｓｈｔｏｎ．“Ｄｅｒｉｖｉｎｇ，ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ，ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＣＮＳ ｔｉｓｓｕｅｓ ｕｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．”Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４７（２０１７）：３６－４２に記載されている。
当業者は、限定されないが、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、及びＭＥＭ等の基礎培地の任意の改変等の、神経幹細胞増殖に好適な細胞培養培地を認識している。当業者は、多くの異なる目的のために基礎培地を改変できることを認識している。好適な培地の非限定的な例として、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地及びＮＳＣ（商標）、ＬｏｎｚａのＰＮＧＭ（商標）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの神経幹細胞基礎培地、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＫｎｏｃｋｏｕｔ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（「ＫＳＲ」）培地、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（登録商標）／Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（登録商標）（「Ｅ８／Ｅ６」）培地、並びにＳｔｅｍＣｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＳｔｅｍｄｉｆｆ（商標）が挙げられる。
複数の異なる細胞培養培地に到達するために、分化因子及び／又はパターン形成因子の添加によって改変される、異なる細胞培養培地が示されていることが理解されよう。
１つの特定の実施形態において、細胞培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２及びＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を含む。好ましい実施形態において、細胞培養培地は、Ｎ２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ番号：１７５０２０４８）及びＢ２７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）（ビタミンＡ含有）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号：２１１０３０４９）を含む細胞培養培地である（Ｙｉｎｇ，Ｑｉ－Ｌｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｉｎ ａｄｈｅｒｅｎｔ ｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅ．”Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１．２（２００３）：１８３－１８６を参照）。
一実施形態において、細胞培養培地は、Ｎ２、Ｂ２７（ビタミンＡ含有）、β－メルカプトエタノール、及びＬ－グルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）等）を含む群から選択される１つ以上の可溶性因子を補充した細胞培養培地である。１つの特定の実施形態において、上記細胞培養培地は、少なくともＮ２及びＢ２７（ビタミンＡ含有）で補充される。一実施形態において、「Ｎ２Ｂ２７培地」と称されるこの培地は、好ましくは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２：Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（１：１）、０．５×Ｎ２及び０．５×Ｂ２７（ビタミンＡ含有）、１×非必須アミノ酸、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ、並びに５５μＭ β－メルカプトエタノールを含む。
いくつかの実施形態において、分化のための培養条件は、細胞を実質的に単一の細胞培養物に解離することを含み得る。添付の実施例に見られるように、細胞は播種前、並びに９ＤＤＣ及び２３ＤＤＣに解離した。解離は、細胞をより小さな群又は単一細胞懸濁液に解離することができる、現在既知であるか又は今後開発される任意の方法の使用を包含する。例示的な実施形態において、細胞は、添付の実施例に記載されるように、プロテアーゼ処理、又はピペッティングのような機械的処理、又は幹細胞継代ツール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用することによって解離され得る。例えば、プロテアーゼは、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、コラゲナーゼ、トリプシン－ＥＤＴＡ、ディスパーゼ、又はそれらの組み合わせであり得る。あるいは、クエン酸ナトリウム、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、又はそれらの組み合わせ等のキレート剤を使用して、細胞を解離してもよい。本質的に単一の細胞培養は、増殖することが所望される細胞が互いに解離し、そのため、細胞の大部分が単一細胞であるか、又は会合した状態のままの最大２つの細胞（ダブレット）である細胞培養であり得る。
特定の態様では、単一細胞培養は、添付の実施例に記載されるように、ＲＯＣＫ阻害剤又はミオシンＩＩ阻害剤等の、解離後のクローニング効率及び細胞生存を増加させるのに有効な小分子の存在下にあってもよい。
特定の実施形態において、細胞は、添付の実施例に記載されるように、固体又は半固体基質（接着又は単層培養）に付着している間に培養することができる。様々なマトリックス成分が当技術分野で既知であり、ヒト多能性幹細胞の培養、維持、又は分化に使用することができる。例えば、細胞接着のための基質には、コラーゲン、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ポリ－Ｌ－オルニチン、ラミニン、ビトロネクチン、及びフィブロネクチン、並びにＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）又はＧｅｌｔｒｅｘ等のそれらの混合物、並びに溶解細胞が含まれ、これらは、添付の実施例に記載されるように、多能性細胞増殖のための固体支持体を提供する手段として培養表面をコーティングするために使用され得る。
細胞を培地に浮遊させて増殖させることもできる（懸濁培養）。
特定の実施形態において、多能性幹細胞の培養及び分化のために非静的培養を使用することができる。非静的培養は、例えば、プラットフォーム又は培養容器、特に大容量回転バイオリアクタを、振動、回転、又は撹拌することによって、細胞を制御された移動速度に維持する任意の培養であり得る。撹拌は、栄養素及び細胞廃棄物の循環を改善することができ、より均一な環境を提供することによって細胞凝集を制御するためにも使用され得る。例えば、回転速度は、少なくとも又は最大で約２５ｒｐｍ、３０ｒｐｍ、３５ｒｐｍ、４０ｒｐｍ、４５ｒｐｍ、５０ｒｐｍ、７５ｒｐｍ、１００ｒｐｍ、又はその中で導出可能な任意の範囲に設定することができる。
腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む細胞集団への幹細胞の分化を引き起こすのに十分な条件下で幹細胞を培養することは、典型的には、幹細胞を、様々な時点で様々な期間添加される１つ以上の因子と接触させることを含むことが理解されよう。好都合には、これらの時点及び期間は、「分化条件の日数（ＤＤＣ）」の命名法を参照して記載される。例えば、１ＤＤＣは、これらの細胞が１日間分化培養されているという事実を指し、２ＤＤＣは、これらの細胞が２日間分化培養されているという事実を指す。このように、１ＤＤＣは１日目に対応し、２ＤＤＣは２日目に対応する等、分化培養における時点の参照として使用することができる。同様に、曝露の持続時間及び時点も、ＤＤＣを参照して説明することができる。例えば、細胞は、３ＤＤＣから５ＤＤＣまでの２日間、特定の因子に曝露され得る。添付の実施例に記載されるように、分化プロトコルは、細胞が播種される０日目（すなわち０ＤＤＣ）に開始される。１４日後（１４ＤＤＣ）には、細胞を移植のために調製することができる（図４ｏを参照）。
一実施形態において、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む細胞集団への幹細胞の分化を引き起こすのに十分な条件下で幹細胞を培養することは、幹細胞を少なくとも１つのヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達の活性化剤と接触させることを含む。
ヘッジホッグ（ＨＨ又はＨｈ）シグナル伝達は、四肢の指の成長及び脳の組織化等の、脊椎動物の器官形成の調節において重要な役割を果たすことが知られている。脊椎動物のヘッジホッグタンパク質ファミリーは、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、インディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）、及びデザートヘッジホッグ（ＤＨＨ）で構成され、多くの機能的特徴を共有し、共通の経路を介してシグナルを伝達する。例えば、ＣＮＳの発生中に、ＳＨＨは、拡散して濃度勾配を形成する分子であるモルフォゲンとして作用し、その濃度に応じて発生中の神経系の細胞に様々な影響を及ぼす。簡単に述べると、Ｈｈは、Ｈｈシグナルを細胞に伝達するパッチド（Ｐｔｃ）及びスムーズンド（Ｓｍｏ）の２つの成分を含むＨｈ受容体複合体と相互作用することによってシグナルを伝達する。Ｐｔｃは、細胞膜のＳｍｏに結合することによりＨｈシグナル伝達を抑制すると考えられている。Ｈｈリガンドの存在下では、この抑制が緩和され、Ｓｍｏがシグナルを伝達することができる。脊椎動物では、ジンクフィンガータンパク質Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、及びＧｌｉ３がＨｈシグナル伝達の下流メディエーターであり、Ｈｈ依存的に標的遺伝子の転写応答を制御することに関与している。
当業者は、「Ｈｈシグナル伝達の活性化剤」という用語が、Ｈｈシグナル伝達を増強する若しくはそれに代わる因子、又はその誘導体若しくはアゴニストを含むことを理解するであろう。そのような因子は、Ｈｈの下流のシグナル伝達に関与するか、又は小分子アゴニストであり得る。
一実施形態において、少なくとも１つのヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達の活性化剤は、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、インディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）、デザートヘッジホッグ（ＤＨＨ）、プルモルファミン、スムーズンドアゴニスト（ＳＡＧ）、例えばＳＡＧ１．３（Ｈｈ－１．３）、Ｈｈ－１．２、Ｈｈ－１．４、Ｈｈ－１．５、及びそれらの組み合わせを含む群から選択される。
好ましい実施形態において、Ｈｈシグナル伝達の活性化剤はＳＡＧ１．３である。そのような活性化剤は、例えば、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから市販されている。
特定の実施形態において、少なくとも１つのＨｈシグナル伝達の活性化剤は、少なくとも約４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、若しくは１０日又はそれ以上、例えば約４～１０日間、又は約５～９日間、又は約６～９日間、細胞と接触させられる。特定の実施形態において、少なくとも１つのＨｈシグナル伝達の活性化剤は、最大約４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、若しくは１０日間又はそれ以上にわたって細胞と接触させられる。特定の実施形態において、少なくとも１つのＨｈシグナル伝達の活性化剤は、約８～９日間細胞と接触させられる。特定の実施形態において、少なくとも１つのＨｈシグナル伝達の活性化剤は、０～９ＤＤＣの約９日間、細胞と接触させられる。
添付の実施例及び図８ｃ（補足図２ｃ）から分かるように、ＤＤＣ０日目又はＤＤＣ１日目の少なくとも１つのヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達の活性化剤への幹細胞の最初の曝露は、ＮＳＣに対するｖＭＢアイデンティティの効果的な誘導をもたらした。したがって、特定の実施形態において、少なくとも１つのＨｈシグナル伝達の活性化剤は、ＤＤＣ１日目からＤＤＣ９日目までの約８日間、細胞に接触させられる。別の実施形態において、少なくとも１つのＨｈシグナル伝達の活性化剤は、ＤＤＣ０日目からＤＤＣ９日目までの約９日間、細胞に接触させられる。
特定の実施形態において、少なくとも１つのＨｈシグナル伝達の活性化剤は、０日目から９日目まで、幹細胞を含む細胞培養培地に毎日又は隔日で添加される。特定の実施形態において、少なくとも１つのＨｈシグナル伝達の活性化剤は、１日目から９日目まで、幹細胞を含む細胞培養培地に毎日又は隔日で添加される。特定の実施形態において、少なくとも１つのＨｈシグナル伝達の活性化剤は、ＤＤＣ０日目、２日目、４日目、６日目、８日目に添加される。特定の実施形態において、少なくとも１つのＨｈシグナル伝達の活性化剤は、ＤＤＣ１日目、３日目、５日目、７日目、９日目に添加される。
特定の実施形態において、少なくとも１つのＨｈシグナル伝達の活性化剤は、約５０～１０００ｎＭ、又は約１００～９５０ｎＭ、又は約１５０～９００ｎＭ、又は約２００～８５０ｎＭ、又は約２５０～８００ｎＭ、又は約３００～７５０ｎＭ、又は約３５０～７００ｎＭ、又は約４００～６５０ｎＭ、又は約４５０～６００ｎＭ、又は約５００～５５０ｎＭ、及びそれらの間の値の濃度で細胞に接触させられる。特定の実施形態において、１つ以上のＨｈシグナル伝達の活性化剤は、約４００、４５０、５００、５５０、又は６００ｎＭの濃度で細胞と接触させられる。特定の実施形態において、少なくとも１つのＨｈシグナル伝達の活性化剤は、約３００ｎＭの濃度で細胞と接触させられる。
添付の実施例に見られるように、図８ｄ（補足図２Ｄ）に示される滴定データは、少なくとも１つのＨｈシグナル伝達の活性化剤が５０ｎＭ～１０００ｎＭの濃度で使用された場合、幹細胞に対するｖＭＢアイデンティティの効果的な誘導が可能であることを示している。
特定の非限定的な実施形態において、細胞は、少なくとも１つのＨｈシグナル伝達の活性化剤、例えば、約３００ｎＭの濃度のＳＡＧ１．３と、約９日間（すなわち０～９ＤＤＣ）接触させられる。
代替的な特定の非限定的な実施形態において、細胞は、少なくとも１つのＨｈシグナル伝達の活性化剤、例えば、約３００ｎＭの濃度のＳＡＧ１．３と、約８日間（すなわち１～９ＤＤＣ）接触させられる。
好ましい実施形態において、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む細胞集団への幹細胞の分化を引き起こすのに十分な条件下で幹細胞を培養することは、幹細胞を、少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤、及び少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の阻害剤と接触させることを含む。
本明細書で使用される場合、「ＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤」は、単に「ＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌ阻害剤」と称されてもよい。同様に、「ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤」は、本明細書では単に「ＢＭＰ阻害剤」と称されてもよい。
「阻害剤」には、分子又は経路のシグナル伝達機能を妨げる（例えば、低減させる、減少させる、抑制する、排除する、又は遮断する）任意の化合物又は分子（例えば、小分子、ペプチド、ペプチド模倣体、天然化合物、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマー、又は抗体）が含まれる。阻害剤は、特定のタンパク質シグナル伝達分子、特定のシグナル伝達分子に関与する任意の分子の任意の活性を変化させる任意の化合物又は分子であり得る。
例えば、ＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤は、ＳＭＡＤシグナル伝達に直接接触すること、ＳＭＡＤ ｍＲＮＡに接触すること、ＳＭＡＤの構造変化を引き起こすこと、ＳＭＡＤタンパク質レベルを低下させること、又はＳＭＡＤのシグナル伝達パートナー（例えば、本明細書に記載されるものを含む）との相互作用を妨害すること、及びＳＭＡＤ標的遺伝子（例えば、本明細書に記載されるもの）の発現に影響を及ぼすことによって作用し得る。阻害剤は、阻害剤の添加なし又は添加前の経路の活性と比較した場合、阻害される経路を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又はそれ以上低下又は低減し得る。
ＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤には、上流のシグナル伝達分子を妨害することによって、生物活性、例えばＳＭＡＤ生物活性を間接的に調節する分子も含む（例えば、細胞外ドメイン内では、シグナル伝達分子及び効果の例として以下が挙げられる：骨形成タンパク質を捕捉するノギンは、ＡＬＫ受容体１、２、３、及び６の活性化を阻害し、したがって下流のＳＭＡＤ活性化を妨げる。同様に、コーディン、ケルベロス、フォリスタチンも、ＳＭＡＤシグナル伝達の細胞外活性化剤を同様に捕捉する。膜貫通タンパク質であるＢａｍｂｉもまた、細胞外のＴＧＦβシグナル伝達分子を捕捉するための偽受容体として作用する）。上流又は下流のタンパク質を遮断する抗体は、タンパク質シグナル伝達の細胞外活性化剤を中和するためにも使用され得る。阻害剤は、指定されたシグナル伝達分子の上流で分子に結合して影響を及ぼし、順次、指定された分子の阻害を引き起こすことによって誘導される阻害に加えて、競合阻害（別の既知の結合化合物の結合を排除又は低減するように活性部位に結合する）及びアロステリック阻害（タンパク質の立体構造を変化させるようにタンパク質に結合して、そのタンパク質の活性部位への化合物の結合を妨げる）に関しても記載されている。阻害剤は、シグナル伝達標的と実際に接触することによってシグナル伝達標的又はシグナル伝達標的経路を阻害する「直接阻害剤」であり得る。
特定の実施形態において、本発明は、幹細胞を腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞に分化させる方法であって、ヒト幹細胞の集団又は複数の集団を、１つ以上のＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤（すなわち、第１のＳＭＡＤ阻害剤）及び１つ以上のＢＭＰシグナル伝達の阻害剤（すなわち、２番目のＳＭＡＤ阻害剤）と接触させることを含む、方法を提供する。
ＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達及びＢＭＰシグナル伝達の阻害は、「ＳＭＡＤシグナル伝達の二重阻害」又は「二重ＳＭＡＤ阻害」又は「ｄＳＭＡＤｉ」と称される。二重ＳＭＡＤ阻害は、ｈＰＳＣからある種類の神経系統細胞を誘導するための迅速かつ非常に効果的な方法として以前に使用されていた（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２７，（２００９））。
哺乳動物のＳＭＡＤタンパク質ファミリーは、ＴＧＦβスーパーファミリーの細胞内シグナル伝達メディエーターとして機能する８つのメンバーからなるファミリーである。Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３は、ＴＧＦβ及びアクチビン／インヒビンのシグナル伝達を媒介し、ＢＭＰシグナル伝達は、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、及びＳｍａｄ８によって媒介される。
ＴＧＦシグナル伝達が、胚形成、細胞分化及びアポトーシス、並びに他の機能に関与することは、当技術分野で既知である。ＴＧＦスーパーファミリーリガンド、例えばＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ及び／又はＮＯＤＡＬは、例えば、ＴＧＦＢＲ２、ＡＣＶＲ２Ａ、及び／又はＡＣＶＲ２Ｂを含む２つのＩ型受容体キナーゼ（ＡＬＫ５とも称される）、並びに例えば、ＴＧＦＢＲ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、及び／又はＡＣＶＲ１Ｃを含む２つのＩＩ型受容体キナーゼからなるヘテロ四量体受容体複合体に結合する。この結合は、例えばＳＭＡＤ２及び／又はＳＭＡＤ３を含むＲ－ＳＭＡＤ、並びに例えばＳＭＡＤ４を含むＣｏ－ＳＭＡＤからなる四量体複合体のリン酸化及び活性化を誘導する。ＲＳＭＡＤ／ＣｏＳＭＡＤ複合体は、核内に蓄積し、そこで転写因子として作用し、標的遺伝子発現の調節に関与する。
当業者は、用語「ＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤」が、このシグナル伝達経路の一部を形成する分子のいずれか１つの阻害剤を指すことを理解するであろう。例えば、阻害剤は、ＡＣＶＲ２Ａ及び／若しくはＡＣＶＲ１Ｂ（ＡＬＫ４）受容体のアンタゴニスト、又はＴＧＦβＩＩ型受容体キナーゼ及び／若しくはＡＬＫ５受容体のアンタゴニストであり得る。ＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達経路のそのような阻害剤は、当技術分野で既知であり、市販されている。
好ましい実施形態において、少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２及びＳＢ５０５１２４を含む群から選択される。
本発明は、ＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達阻害剤がＴＧＦβＩ型受容体の阻害剤であることを企図する。一実施形態において、ＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達阻害剤は、ＡＬＫ５を阻害し、また、キナーゼドメインにおいてＡＬＫ５と非常に高度に関連しているアクチビンＩ型受容体ＡＬＫ４及び／又はＮｏｄａｌＩ型受容体ＡＬＫ７も阻害する。
ＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達阻害剤の例示的な非限定的な例として、ＳＢ４３１５４２（ＣＡＳ番号：３０１８３６－４１－９）、ＳＢ－５０５１２４（ＣＡＳ番号：６９４４３３－５９－５）、Ａ－８３－０１、ＧＷ６６０４、ＩＮ－Ｉ １３０、Ｋｉ２６８９４、ＬＹ２１５７２９９、ＬＹ３６４９４７（ＨＴＳ－４６６２８４）、ＬＹ５５０４１０、ＬＹ５ ７３６３６、ＬＹ５８０２７６、ＮＰＣ－３０３４５、ＳＤ－０９３、Ｓｍｌ６、ＳＭ３０５、ＳＸ－００７、Ａｎｔｐ－Ｓｍ２Ａ、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ２１０９７６１、及びＲ ２６８７１２、Ｄ ４４７６、ＩＴＤ １、並びにＲｅｐＳｏｘが挙げられる。ＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤の非限定的な例は、Ｃｈａｍｂｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２７，（２００９）にも開示されており、これらの阻害剤は参照により組み込まれる。特定の実施形態において、少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２及びその誘導体である。例えば、ＳＢ４３１５４２は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈから得ることができる。
特定の実施形態において、少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤は、少なくとも約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、若しくは１０日間又はそれ以上、細胞と接触させられる。特定の実施形態において、少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤は、少なくとも約３日間及び９日間、細胞と接触させられる。特定の実施形態において、少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤は、少なくとも約４日間及び８日間、細胞と接触させられる。特定の実施形態において、少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤は、少なくとも約５日間及び７日間、細胞と接触させられる。特定の実施形態において、少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤は、ＤＤＣ０日目からＤＤＣ７日目までの約７日間、細胞と接触させられる。
特定の実施形態において、少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤は、０日目から１０日目まで、幹細胞を含む細胞培養培地に毎日又は隔日で添加される。特定の実施形態において、少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤は、０日目、２日目、４日目、６日目に添加される。一実施形態において、培地は隔日で、すなわち１日おきに交換され、新鮮な阻害剤が添加される。
特定の実施形態において、少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤は、約１～５０μΜ、又は約１～２０μΜ、又は約２～１５μΜ、又は約３～１０μΜ、又は約５～１０μΜ、及びそれらの間の値の濃度で細胞と接触させられる。特定の実施形態において、少なくとも１つのＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤は、約５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、又は１０μＭの濃度で細胞と接触させられる。特定の実施形態において、少なくとも１つのＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤は、約５μＭの濃度で細胞と接触させられる。
特定の非限定的な実施形態において、細胞は、少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤（すなわち、第１のＳＭＡＤ阻害剤）、例えば、約５～１０μＭの濃度のＳＢ４３１５４２と、約７日間（すなわちＤＤＣ０日目～ＤＤＣ７日目）接触させられる。
ＢＭＰシグナル伝達経路は当技術分野で既知である（Ｊｉｗａｎｇ Ｚｈａｎｇａ，Ｌｉｎｈｅｎｇ Ｌｉａ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ２８４，Ｉｓｓｕｅ １，（２００５），Ｐａｇｅｓ１－１１）。
端的に述べると、ＢＭＰは、受容体によって媒介される細胞内シグナル伝達を介して機能し、その後、標的遺伝子の転写に影響を及ぼす。このプロセスには、Ｉ型及びＩＩ型と称される２種類の受容体が必要である。ＩＩ型ＢＭＰ受容体（Ｂｍｐｒｌｌ）は１つのみ存在するが、Ｉ受容体は、Ａｌｋ２、Ａｌｋ３（Ｂｍｐｒ１ ａ）、及びＡｌｋ６（Ｂｍｐｒ１ ｂ）の３つが存在する。ＢＭＰシグナル伝達は、少なくとも２つのシグナル伝達経路で起こり得る。古典的ＢＭＰ経路は、受容体Ｉによって媒介されるＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、又はＳｍａｄ８（Ｒ－Ｓｍａｄ）のリン酸化によって媒介される。２つのリン酸化されたＲ－Ｓｍａｄは、共通のＳｍａｄ４（ｃｏ－Ｓｍａｄ）とヘテロ三量体複合体の共凝集体を形成する。Ｓｍａｄヘテロ三量体複合体は、核内に移動することができ、他の転写因子と協力して標的遺伝子の発現を調節することができる。ＢＭＰシグナルの並行経路は、ＴＧＦβ１活性化チロシンキナーゼ１（ＴＡＫ１、ＭＡＰＫＫＫ）及びマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）によって媒介され、ＢＭＰ経路とＷｎｔ経路との間のクロストークも伴う。
一実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤は、古典的ＢＭＰシグナル伝達阻害剤である。ＢＭＰシグナル伝達阻害剤の非限定的な例として、ＤＭＨ１（ＣＡＳ １２０６７１１－１６－１）；ＤＭＨ２；ＬＤＮ－１９３１８９（ＣＡＳ番号：１０６２３６８－２４－４）；ＬＤＮ－２１４１１７；コーディン；グレムリン；ベントロピン；フォリスタチン；ノギン；Ｋ０２２８８；及びドルソモルフィン（ＣＡＳ番号：８６６４０５－６４－３）が挙げられる。ＤＭＨ－１は、例えばＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈから得ることができる。
好ましい実施形態において、少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は、ＤＭＨ－１、ＬＤＮ－１９３１８９、及びノギンを含む群から選択される。
特定の実施形態において、少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は、少なくとも約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、若しくは１０日又はそれ以上にわたって細胞と接触させられる。特定の実施形態において、少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は、少なくとも約３日間及び９日間、細胞と接触させられる。特定の実施形態において、少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は、少なくとも約４日間及び８日間、細胞と接触させられる。特定の実施形態において、少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は、少なくとも約５日間及び７日間、細胞と接触させられる。特定の実施形態において、少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は、ＤＤＣ０日目からＤＤＣ７日目までの約７日間、細胞と接触させられる。
特定の実施形態において、少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は、０日目から１０日目まで、幹細胞を含む細胞培養培地に毎日又は隔日で添加される。特定の実施形態において、少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は、０日目、２日目、４日目、及び６日目に添加される。一実施形態において、培地は隔日で、すなわち１日おきに交換され、新鮮な阻害剤が添加される。
特定の実施形態において、少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は、約０．０１μＭ～約５０μＭ、又は約１～２５μＭ、又は約１～１５μＭ、又は約１～１０μＭ、又は約１～５μＭ、又は約２～４μＭ、及びそれらの間の値の濃度で細胞と接触させられる。特定の実施形態において、少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は、約２．５μＭの濃度で細胞に接触させられる。
特定の非限定的な実施形態において、細胞は、少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達の阻害剤（すなわち、第２のＳＭＡＤ阻害剤）、例えば、約２５０ｎＭの濃度のＤＭＨ１と、約７日間（すなわち、ＤＤＣ０日目～ＤＤＣ７日目）接触させられる。
ＳＭＡＤの二重阻害は、ノギン、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ－１９３１８９、ＤＭＨ－１、ドルソモルフィン、又はＴＧＦβ、ＢＭＰ、及びアクチビン／Ｎｏｄａｌシグナル伝達を遮断する他の分子を含む、上記のような様々な化合物で達成することができる。好ましい実施形態は、０．１μＭ～２５０μＭ、又はより好ましくは１～２５μＭの濃度でのＳＢ４３１５４２及び２．５μＭのＤＭＨ－１、又は最も好ましくは５μＭのＳＢ４３１５４２及び２．５μＭのＤＭＨ－１の使用を含む。
特定の非限定的な実施形態において、細胞は、少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤（すなわち、第１のＳＭＡＤ阻害剤）、例えば、約５μＭの濃度のＳＢ４３１５４２と約７日間（すなわち、ＤＤＣ０日目～ＤＤＣ７日目）；少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達の阻害剤（すなわち、第２のＳＭＡＤ阻害剤）、例えば、約２５０ｎＭの濃度のＤＭＨ１と約７日間（すなわち、ＤＤＣ０日目からＤＤＣ７日目まで）；及び少なくとも１つのＨｈシグナル伝達の活性化剤、例えば、約３００ｎＭの濃度のＳＡＧ１．３と、約９日間（すなわちＤＤＣ０日目からＤＤＣ９日目まで）又は約８日間（ＤＤＣ１日目からＤＤＣ９日目まで）接触させられる。
好ましい実施形態において、幹細胞は、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と、約１～４日間、任意選択的に約１～３日間接触させられる。
本明細書で使用される「１～４日」には、レチノイン酸の活性化剤が、約２４～９６時間の間、幹細胞と接触させられることが含まれる。本明細書で使用される「１～３日」には、２４～７２時間が含まれる。更なる実施形態において、幹細胞は、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と約１．５～３日間、すなわち約３６～７２時間接触させられる。
添付の実施例に示されるように、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤がＥＣ２３である場合、ＥＣ２３は、幹細胞と約１日（すなわち約２４時間）接触した後、多能性幹細胞を腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞に分化させることができた（すなわち、０～１ＤＤＣ、又は１～２ＤＤＣ、又は２～３ＤＤＣ、又は３～４ＤＤＣ）。レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤がＡＴＲＡである場合、ＡＴＲＡは、幹細胞と０ＤＤＣから２ＤＤＣまでの約２日間（すなわち、約４８時間）接触した後、多能性幹細胞を腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞に分化させることができた。
好ましい実施形態において、少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤は、複数の幹細胞と約１～４日間、任意選択的に約１～３日間接触した後、有効量で存在しない。
一実施形態において、複数の幹細胞を複数の幹細胞と約１～４日間、任意選択的に約１～３日間接触させた後、幹細胞を有効量の少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤の非存在下で少なくとも次の７日間培養する。
添付の実施例に記載されるように、少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤は「パルス」として送達されるため、パルス後に培養培地から除去される。
一実施形態において、幹細胞は、少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と同時に、少なくとも１つのヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達の活性化剤、少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤、及び少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の阻害剤と接触させられる。
添付の実施例及び図４ｏから分かるように、少なくとも１つのヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達の活性化剤（すなわちＳＡＧ）及び少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤、並びに少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の阻害剤（すなわち、二重ＳＭＡＤ阻害）及び少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤への幹細胞の曝露は、ＮＳＣに対するｖＭＢアイデンティティの効果的な誘導をもたらした。
別の実施形態において、幹細胞は、少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と接触させられる前に、少なくとも１つのヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達の活性化剤、少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤、及び少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の阻害剤と接触させられる。
添付の実施例及び図８ｂ（補足図２ｂ）から分かるように、０日目から２日目ＤＤＣまでの次の４８時間の少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤への幹細胞の最初の曝露は、ＮＳＣに対するｖＭＢアイデンティティの効果的な誘導をもたらした。したがって、一実施形態において、少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤は、０～２ＤＤＣの約２日間、又は１～３ＤＤＣの約２日間、又は２～４ＤＤＣの約２日間、細胞に接触させられる。換言すると、ＲＡパルスは０～２ＤＤＣに開始される。
添付の実施例及び図８ｃ（補足図２ｃ）から分かるように、ＤＤＣ０日目又はＤＤＣ１日目の少なくとも１つのヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達の活性化剤への幹細胞の最初の曝露は、ＮＳＣに対するｖＭＢアイデンティティの効果的な誘導をもたらした。
本発明者らは、驚くべきことに、ＬＭＸ１Ａ／Ｂ＋／ＦＯＸＡ２＋／ＯＴＸ２腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞のＲＡに基づく特異化において、又は成熟ｍＤＡニューロンの産生において、ＷＮＴアゴニストもＦＧＦも必要とされないことを見出した。添付の実施例に記載されるように、（ｄＳＭＡＤｉ）は、ｈＰＳＣが代替の体細胞又は胚外運命の選択肢を選択するのを防ぐことによって、一般的な神経運命を促進するように展開される。少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤は、多能性からＮＳＣ状態へのスイッチ様移行を促進し、同時にＭＢ様アイデンティティをＮＳＣに課す。少なくとも１つのヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達の活性化剤は、細胞を腹側化し、ｍＤＡニューロン前駆細胞に特徴的なＬＭＸ１Ａ＋／ＦＯＸＡ２＋／ＯＴＸ２＋ｖＭＢアイデンティティを誘導するために適用される。
本発明者らは、ＷＮＴではなくＲＡで処理された幹細胞が、尾側中脳アイデンティティではなく、ＬＭＸ１Ａ／Ｂ＋／ＦＯＸＡ２＋／ＯＴＸ２＋ＥＮ１－の発現を特徴とする、より吻側の腹側中脳アイデンティティを獲得することを見出した。
一実施形態において、方法は、尾側中脳のマーカーであるＥＮＧＲＡＩＬＥＤ－１（ＥＮ１）の発現を誘導するために、複数の幹細胞を少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と最初に接触させた後に、ＷＮＴシグナル伝達の活性化剤を順次添加することを含む。これにより、尾側化した腹側中脳前駆細胞（ＬＭＸ１Ａ／Ｂ＋／ＦＯＸＡ２＋／ＯＴＸ２＋ＥＮ１＋）が生じる。したがって、幹細胞に対する腹側中脳アイデンティティを特定するために、本発明の方法においてＷｎｔが使用されないことは理解されるであろう。
添付の実施例に記載されるように、本発明者らは驚くべきことに、Ｗｎｔシグナル伝達アゴニストＣＨＩＲ９９０２１で処理されたＲＡ誘導中脳前駆細胞においてＥＮ１発現が上方制御されることを見出した。本発明者らは、ＥＮ１＋ＬＭＸ１Ａ＋ＦＯＸＡ２＋ＯＴＸ＋前駆細胞の生成のためのＣＨＩＲ９９０３１の最適濃度が、０．６μＭ～１０μＭ、例えば２．５μＭ～１０μＭであることを見出した。一実施形態において、ＣＨＩＲ９９０２１は、本発明の方法において５μＭの濃度で使用される。
ＥＮ１（ＥＮＧＲＡＩＬＥＤ－１）は、尾側中脳及び後脳前部の発生を調節するホメオボックス遺伝子である。ＥＮ１の段階的発現は、ＭＢとＨＢとの境界に局在する峡部オーガナイザーによって発現されるＷＮＴ１によるシグナル伝達に依存する。
添付の実施例に示されるように、４～９ＤＤＣに複数の幹細胞をｗｉｎｇｌｅｓｓ（ＷＮＴ）シグナル伝達ＣＨＩＲ９９０２１の活性化剤と接触させた（図６）。特定の非限定的な実施形態において、細胞は、ＷＮＴシグナル伝達の活性化剤と約４～６日間、好ましくは約５日間接触させられる。更なる実施形態において、細胞は、４～９ＤＤＣにＷＮＴシグナル伝達の活性化剤と接触させられる。
一実施形態において、複数の幹細胞が、少なくとも１つのＲＡシグナル伝達の活性化剤と接触させられた後に、該幹細胞が、ｗｉｎｇｌｅｓｓ（ＷＮＴ）シグナル伝達の活性化剤と接触させられる。好ましくは、幹細胞が少なくとも１つのＲＡシグナル伝達の活性化剤と接触させられてから約２４時間後、例えば、幹細胞が少なくとも１つのＲＡシグナル伝達の活性化剤と接触させられてから約３６時間後、例えば約４８時間後、例えば約６０時間後、例えば約７２時間後、例えば約８４時間後、例えば約９６時間後に、複数の幹細胞がｗｉｎｇｌｅｓｓ（ＷＮＴ）シグナル伝達の活性化剤と接触させられる。
したがって、方法は、複数の幹細胞を、少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤及びｗｉｎｇｌｅｓｓ（ＷＮＴ）シグナル伝達の活性化剤と連続的に接触させることを含み得、好ましくは、幹細胞は、ｗｉｎｇｌｅｓｓ（ＷＮＴ）シグナル伝達の活性化剤の前に、少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と連続的に接触させられる。
一実施形態において、方法は、複数の幹細胞を、少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と同時に、ｗｉｎｇｌｅｓｓ（ＷＮＴ）シグナル伝達の活性化剤に接触させることを含まない。
シグナル伝達経路に関する「ＷＮＴ」又は「ｗｉｎｇｌｅｓｓ」には、βカテニンの有無にかかわらず媒介される、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ及びＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体等のＷｎｔファミリーリガンド及びＷｎｔファミリー受容体から構成されるシグナル経路が含まれる。本明細書に記載される目的のために、好ましいＷＮＴシグナル伝達経路には、βカテニンによる媒介、すなわち古典的ＷＮＴシグナル伝達が含まれる。
例えば、ＷＮＴシグナル伝達の活性化剤は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤であり得る。阻害剤ＧＳＫ３阻害剤の非限定的な例として、ＣＨＩＲ９９０２、ＮＰ０３１１１２、ＴＷＳｌ１９、ＳＢ２１６７６３、ＣＨＩＲ－９８０１４、ＡＺＤ２８５８、ＡＺＤ１０８０、ＳＢ４１５２８６、ＬＹ２０９０３１４及び１が挙げられる。特定の態様では、ＷＮＴシグナル伝達の活性化剤は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈから入手可能なＣＨＩＲ９９０２１であり得る。特定の態様では、ＷＮＴシグナル伝達の活性化剤は、０．６～１０μＭで使用され得る。
一実施形態において、方法は、複数の幹細胞を、少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と同時に、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーシグナル伝達の活性化剤と接触させることを含まない。
一実施形態において、ＦＧＦシグナル伝達の活性化剤は、２１ｋＤａの予測分子量を有するタンパク質を生じる線維芽細胞増殖因子８遺伝子産物のスプライスバリアントＦＧＦ８ａである。
好ましい実施形態において、少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤は、ＲＡＲαアゴニスト、ＲＡＲβアゴニスト、ＲＡＲγアゴニスト、及びＲＸＲアゴニストを含む群から選択される。
「類似体」には、対象化合物と同様の物理的、化学的、生化学的、又は薬理学的特性を有する化合物が含まれる。
ＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγ及び／又はＲＸＲ「アゴニスト」には、ＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγ及び／又はＲＸＲシグナル伝達を強化、誘導又は増強する任意の化合物／分子が含まれる。そのような化合物／分子は、レチノイン酸の下流のシグナル伝達に関与し得るか、又は小分子アゴニストであり得る。化合物／分子がシグナル伝達経路の活性を誘導又は増強することが可能であるかどうかを試験する方法は、当業者に既知である。
ＲＡＲαアゴニストの非限定的な例；ＲＡＲβアゴニスト；ＲＡＲγアゴニスト；ＲＸＲアゴニストには、ＣＤ ３２５４、ドコサヘキサエン酸、フルオロベキサロテン、ＬＧ １００２６８、ＳＲ １１２３７、ＡＣ ２６１０６６、ＡＣ ５５６４９、アダパレン、ＡＭ ５８０、ＡＭ ８０、ＢＭＳ ７５３、ＢＭＳ ９６１、ＣＤ １５３０、ＣＤ ２３１４、ＣＤ ４３７、Ｃｈ ５５、ＴＴＮＰＢが含まれる。好ましい実施形態において、アゴニストは選択的アゴニストである（例えば、アゴニストがＲＡＲβよりもＲＡＲαに対してより高い選択性を示す場合、アゴニストは選択的であると言われる。
好ましい実施形態において、少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤は、レチノイン酸、オールトランスレチノイン酸、ＡＭ ５８０；ＴＴＮＰＢ；Ｃｈ ５５；ＣＤ４３７；ＢＭＳ ９６１；ＢＭＳ ７５３；ＡＭ ８０；ＣＤ ２３１４；ＡＣ ２６１０６６；ＡＣ ５５６４９；ＣＤ １５３０；アダパレン；タザロテン酸；タザロテン；ＥＣ １９；ＥＣ２３；又はその機能的類似体、異性体、代謝産物、若しくは誘導体を含む群から選択される：
９－ｃｉｓ－レチノイン酸（９ｃＲＡ）がオールトランス－レチノイン酸（ＡＴＲＡ）の異性体であることは理解されるであろう。
遺伝子のＣＹＰ２６ファミリー（ＣＹＰ２６Ａ１、ＣＹＰ２６Ｂ１、ＣＹＰ２６Ｃ１）は、酸化によってＲＡを代謝するシトクロムｐ４５０ファミリーの酵素をコードする（Ｔｈａｔｃｈｅｒ，Ｊ．Ｅ．＆Ｉｓｏｈｅｒｒａｎｅｎ，Ｎ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．５，８７５－８６（２００９））。ＣＹＰ２６Ａ１は、最も吻側の神経外胚葉によって発現され、神経発生の初期段階でＨＢアイデンティティの吻側への拡張を防ぐのに寄与する（参考文献２２）。また、ＨＢのＡＰパターン形成では、ＣＹＰ２６タンパク質による誘導を介した自己強化型分解によるＲＡシグナル伝達の負のフィードバック制御は、ＲＡ勾配を形成し、ＲＡレベルの変動を緩和するために重要である（Ｗｈｉｔｅ，Ｒ．Ｊ．＆Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ，Ｔ．Ｆ．Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２３７，２７７５－２７９０（２００８）ａｎｄ Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ，Ｔ．Ｆ．，Ｎｉｅ，Ｑ．＆Ｌａｎｄｅｒ，Ａ．Ｄ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．２２，５６２－５６９（２０１２））。
理論に拘束されるものではないが、本発明者らは、タザロテン酸；タザロテン並びに内因性レチノイド９－ｃｉｓと１３－ｃｉｓ及びＡＴＲＡは、ＣＹＰ２６によって分解されると仮説を立てる。ＥＣ２３等の他の合成レチノイドは、ＣＹＰ２６酵素によって分解されない。
添付の実施例から分かるように、本発明者らが４つの分解性ＲＡ類似体（オールトランス、９－ｃｉｓ、１３－ｃｉｓ ＲＡタザロテン酸）を試験したところ、４８時間の処理後（すなわち０～２ＤＤＣ）に、全てがＬＭＸ１Ａ＋／ＮＫＸ２．１として特徴付けられる腹側中脳ドーパミン作動性（ｖＭＢ）前駆細胞を誘導することができた。図９ｂ（補足図３ｂ）。このｖＭＢ誘導応答は、ＣＹＰ２６活性が遮断されたときに失われた。非分解性ＥＣ２３は４８時間の処理ではｖＭＢ前駆細胞を誘導することはできなかったが、より低いＥＣ２３濃度での１日処理（すなわち０～１ＤＤＣ）でＬＭＸ１Ａ＋／ＮＫＸ２．１－前駆細胞を誘導することができた。上述のように、当業者は、本発明の方法に必要なレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤の有効量を決定するために、滴定等の既知の技術を使用することができる。
したがって、ＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγ、及び／又はＲＸＲ受容体のいずれかを活性化することによって機能し、ＣＹＰ２６分解に供されるレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤、及びそれらの非分解性類似体も、本明細書に含まれる。
一実施形態において、少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤は、ＣＹＰ２６酵素によって分解可能である。
好ましい実施形態において、少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤は、レチノイン酸、並びに９－ｃｉｓ ＲＡ及び１３－ｃｉｓ ＲＡ等のオールトランスレチノイン酸、並びにタザロテン酸を含む群から選択される。
ＲＡには、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、９－ｃｉｓレチノイン酸（９ｃＲＡ）、１３－ｃｉｓレチノイン酸（１３ｃＲＡ）の３つの立体異性体があり、レチノイン酸受容体に対して異なる結合親和性を示す。ＡＴＲＡ及び１３ｃＲＡは、ＲＡＲにのみ効率的に結合することができるが、９ｃＲＡは、核内受容体ＲＡＲ及びＲＸＲの両方のリガンドである。オールトランスレチノイン酸及びレチノイン酸は、本明細書において互換的に使用される。
タザロテンの活性代謝物であるタザロテン酸は、ＲＡＲα、ＲＡＲβ、及びＲＡＲγに結合するレチノイド受容体（ＲＡＲ）の強力かつ選択的なアゴニストである。タザロテン酸は、ＲＡＲβ及びＲＡＲγを比較的選択的に活性化する。タザロテン酸は、ヒトレチノイン酸ヒドロキシラーゼＣＹＰ２６Ａ１及びＣＹＰ２６Ｂ１の最初の異物基質である。
９－ｃｉｓ－レチノイン酸（９ｃＲＡ）は、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）の異性体であり、どちらも一般的な前駆体であるビタミンＡから合成される脂質分子である。９ｃＲＡは、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）及びレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）の強力なアゴニストである。神経栄養機能を有し、神経分化を促進し、脳卒中の治療に治療可能性を有し得る。それはまた、サイトカインの分泌及びリンパ球の増殖も調節する。９ｃＲＡは、ドーパミン細胞の生存に有利に働き、パーキンソン病等の神経変性疾患における神経保護を誘導する。抗炎症機能を誘発し、マスト細胞を刺激し、インターロイキン４及び５の発現レベルを抑制する。９ｃＲＡは、難治性がんの治療のための臨床試験の第ＩＩ相にある。
１３－ｃｉｓ－レチノイン酸（１３ｃＲＡ）は、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）の異性体であり、抗炎症作用及び抗腫瘍作用を有する。ＲＡの作用は、ＲＡＲ－β及びＲＡＲ－α受容体によって媒介される。ＲＡは、サイトカイン刺激マウスメサンギウム細胞におけるｉＮＯＳの発現及び活性を減弱させる。それは、ミトコンドリアの膜透過性遷移を誘導し、膨張及び膜電位の低下として観察され、アポトーシス経路を介してシトクロムｃ関与機構の放出を刺激する。これらの活性は、ＥＧＴＡ及びシクロスポリンＡによって逆転される。ＲＡはまた、転写の増加を介してＭＭＰ－１タンパク質の発現を部分的に増加させる。
特定の非限定的な実施形態において、細胞は、少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤（すなわち、第１のＳＭＡＤ阻害剤）、例えば、約５μＭの濃度のＳＢ４３１５４２と、約７日間（すなわち、０日目～７日目ＤＤＣ）；少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達の阻害剤（すなわち、第２のＳＭＡＤ阻害剤）、例えば、約２５０ｎＭの濃度のＤＭＨ１と、約７日間（すなわち、０から７ＤＤＣまで）；少なくとも１つのＨｈシグナル伝達の活性化剤、例えば、約３００ｎＭの濃度のＳＡＧ１．３と、約９日間（すなわち、０から９ＤＤＣまで）、又は約８日間（すなわち、１から９ＤＤＣまで）；少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤、例えば、約２０ｎＭの濃度のＥＣ２３と、約１日間（すなわち、０～１ＤＤＣ、又は１～２ＤＤＣ、又は２～３ＤＤＣ、又は３～４ＤＤＣに）接触させられる。
特定の非限定的な実施形態において、細胞は、少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤（すなわち、第１のＳＭＡＤ阻害剤）、例えば、約５μＭの濃度のＳＢ４３１５４２と、約７日間（すなわち、０～７ＤＤＣ）；少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達の阻害剤（すなわち、第２のＳＭＡＤ阻害剤）、例えば、約２５０ｎＭの濃度のＤＭＨ１と、約７日間（すなわち、０から７ＤＤＣまで）；少なくとも１つのＨｈシグナル伝達の活性化剤、例えば、約３００ｎＭの濃度のＳＡＧ１．３と、約９日間（すなわち、０から９ＤＤＣまで）、又は約８日間（すなわち、１から９ＤＤＣまで）；少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤、例えば、約３００ｎＭのＡＴＲＡと、約２日間（すなわち、０～２ＤＤＣ、又は１～３ＤＤＣ、又は２～４ＤＤＣ）、接触させられる。
一実施形態において、細胞は、細胞中のＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ、ＦＯＸＡ２、及びＯＴＸ２のうちの１つ以上の検出可能な発現レベルを増加させるのに有効な濃度及び時間、本明細書に記載の活性化剤及び阻害剤と接触させられる。
好ましい実施形態において、少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤は、外因性供給源に由来する。
「外因性供給源」には、少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤が、生物（幹細胞）又は系から導入されるか、又はその外部で生成されることが含まれる。換言すると、少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤は、内因性供給源に由来しない、すなわち生物（幹細胞）又は系内で生成又は合成されない。
好ましい実施形態において、上記幹細胞の分化を引き起こし、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む細胞集団を生成するのに十分な条件下での幹細胞の培養は、二次元及び／又は三次元細胞培養で行われる。
一実施形態において、細胞は、二次元（２Ｄ）細胞培養で培養され得る。このタイプの細胞培養は、当業者に周知である。二次元細胞培養では、ペトリ皿、フラスコ、マルチウェルプレート等の平らなプラスチック皿で細胞を増殖させる。生物学的に誘導されたマトリックス（例えば、フィブリン、コラーゲン及び本明細書に記載）及び合成ヒドロゲル（例えば、ＰＡＡ、ＰＥＧ）を使用して、２Ｄ細胞培養を容易にすることができる。
「三次元細胞培養」又は「３Ｄ細胞培養」とは、細胞が人工的に作製された環境で増殖され、そこで細胞が三次元全てにおいて増殖すること又はその周囲と相互作用することを許容されることが含まれる。３Ｄ細胞培養の条件は当技術分野で既知である。例えば、細胞培養の三次元特性を達成するために、細胞はマトリックス又は足場で増殖又は分化される。原則として、三次元細胞培養に使用することができる好適なマトリックス又は足場は、当業者に既知である。したがって、そのようなマトリックス又は足場は、任意のマトリックス又は足場であり得る。例えば、マトリックス又は足場は、天然分子又は合成ポリマーのいずれかを含む細胞外マトリックスであり得る。
好ましい実施形態において、細胞集団は、治療有効量の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む。
「治療有効量」とは、治療時に有益な又は所望の臨床結果に影響を及ぼすのに十分な量を含む。有効量は１回以上の用量で投与することができる。治療に関して、有効量とは、パーキンソン病等の神経変性疾患の進行を緩和、改善、安定化、逆転若しくは遅らせる、又はパーキンソン病等の神経変性疾患の病理学的結果を別様に軽減するのに十分な量である。有効量は、一般に、医師によって個別的に決定され、当業者の技術の範囲内である。有効量を達成するための適切な投与量を決定する際には、通常、いくつかの要因が考慮される。これらの要因には、対象の年齢、性別及び体重、治療される状態、状態の重症度、並びに投与される細胞の形態及び有効濃度が含まれる。
一実施形態において、方法は、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む集団を中脳ドーパミン作動性ニューロンに分化させることを更に含む。
添付の実施例に記載されるように、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞は、７～９日（７～９ＤＤＣ）以内にｈＰＳＣから誘導された。これらの７日目の細胞は、ＦＯＸＡ２及びＬＭＸ１Ａを共発現する。これらの９日目の細胞は、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、及びＯＴＸ２を共発現し、後期前駆細胞段階でもこれらのマーカーの発現を維持する。ｖＭＢ ＤＡ前駆細胞が有糸分裂後のニューロンに分化するにつれて、それらは汎ニューロンマーカーＴｕｊ１を発現し始め、その後、ＤＡニューロン伝達物質の制御因子であるＮＵＲＲ１を発現し始める。添付の実施例に記載されるように、本発明者らは、免疫細胞化学分析を用いて、神経新生の早期開始を示すＴｕＪ１＋ニューロンの存在を１２ＤＤＣに観察した。１４ＤＤＣ以内には、ｈＰＳＣに由来する細胞集団の約８０％が、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ、及びＯＴＸ２を発現する腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞である。
ＦＯＸＡ２及びＬＭＸ１Ａを共発現する腹側中脳前駆細胞は、追加の小分子と接触して、３０ＤＤＣまでにＴＨ、ＦＯＸＡ２、及びＬＭＸ１Ａに対して陽性の成熟した中脳ドーパミン作動性ニューロンへの更なる分化を誘導することができる。
一実施形態において、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む集団を中脳ドーパミン作動性ニューロンに分化させることは、ｖＭＢ前駆細胞を、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、アスコルビン酸（ＡＡ）、及びＤＡＰＴ（（２Ｓ）－Ｎ－［（３，５－ジフルオロフェニル）アセチル］－Ｌ－アラニル－２－フェニル］グリシン１，１－ジメチルエチルエステルとしても知られる）等のガンマセクレターゼ阻害剤を含むがこれらに限定されないＤＡニューロン系統特異的活性剤及び／又は阻害剤と更に接触させることを含む。本明細書では、このプロセスは「最終分化」と称される。
一実施形態において、ＤＡニューロン系統特異的活性化剤及び／又は阻害剤は、「最終分化培地」（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ａ３６５３４０１）と称される、Ｂ２７ Ｐｌｕｓ補充物を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｐｌｕｓ培地（「Ｂ２７＋培地」とも称される）内に含まれる。ニューロンは、当業者に既知の培養中にニューロンを支持するのに好適な任意の培地に維持されることが理解されよう。
一実施形態において、腹側中脳前駆細胞は、約１～５０ｎｇ／ｍＬ、又は約５～４０ｎｇ／ｍＬ、又は約５～３０ｎｇ／ｍＬ、又は約１０～２０ｎｇ／ｍＬの濃度のＢＤＮＦと接触させられる。特定の実施形態において、細胞は、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度のＢＤＮＦと接触させられる。
一実施形態において、腹側中脳前駆細胞は、約１～５０ｎｇ／ｍＬ、又は約５～４０ｎｇ／ｍＬ、又は約５～３０ｎｇ／ｍＬ、又は約１０～２０ｎｇ／ｍＬの濃度のＧＤＮＦと接触させられる。特定の実施形態において、細胞は、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度のＢＤＮＦと接触させられる。
一実施形態において、腹側中脳前駆細胞は、約５０～５００μＭ、又は約１００～４００μＭ、又は約１５０～３００μＭ、又は約１８０～２５０μＭの濃度のＡＡと接触させられる。特定の実施形態において、細胞は、約２００μＭの濃度のＡＡと接触させられる。
一実施形態において、腹側中脳前駆細胞は、約１～１００μＭ、又は約５～５０μＭ、又は約１０～２０μＭの濃度のＤＡＰＴと接触させられる。特定の実施形態において、細胞は、約１０μＭの濃度のＡＡと接触させられる。
一実施形態において、最終分化の前に、１６日目～２５日目（すなわち、１６～２５ＤＤＣ）に腹側中脳前駆細胞を再び播種して、高すぎる培養物の密度及び細胞の剥離を回避した。
特定の非限定的な実施形態において、ドーパミン作動性ニューロンへの最終インビトロ分化のために、腹側中脳前駆細胞を２３又は２４ＤＤＣに解離し、ＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＧＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、アスコルビン酸（０．２ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ）、並びに任意選択的に１０μＭ ＤＡＰＴ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を補充したＢ２７＋培地中のコーティング表面に、所望の成熟段階に達するまで播種した。
一実施形態において、腹側中脳前駆細胞は、例えば、少なくとも約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１４日間又はそれ以上、例えば、腹側中脳前駆細胞から成熟したドーパミン作動性ニューロンへの最終分化全体を通して、ＤＡニューロン系統特異的活性化剤及び／又は阻害剤と接触させられる。一実施形態において、腹側中脳前駆細胞は、最終分化全体を通して、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、及びＡＡと接触させられる。一実施形態において、ガンマセクレターゼ阻害剤（ＤＡＰＴ等）は、腹側中脳前駆細胞と約７日間のみ接触させられる。
中脳ドーパミン作動性ニューロンの発生起源は、ＰＡＸ６＋神経上皮前駆細胞に由来するのではなく、ＦＯＸＡ２＋／ＬＭＸ１Ａ＋腹側中脳前駆細胞に由来するため、他のニューロンとは異なることが分かっている。
「中脳ドーパミン作動性ニューロン」又は「中脳ドーパミンニューロン」とは、培養において特徴的なニューロン形態を少なくとも部分的にとり、１つ以上の中脳ドーパミン作動性ニューロンマーカー（例えば、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ））を発現し、ドーパミンを産生及び／若しくは放出し、かつ／又は中脳ドーパミンニューロンに典型的な電気生理学的特性を獲得する、特殊化された細胞を指す。任意選択的に、中脳ドーパミン作動性ニューロンは更に、核内受容体関連１（ＮＵＲＲ１）、ペアードライクホメオドメイン３（Ｐａｉｒｅｄ Ｌｉｋｅ Ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ ３, ＰＩＴＸ３）、ＧＩＲＫ２、小胞モノアミン輸送体（ＶＭＡＴ２）、及びシナプトフィジンのうちの１つ以上を発現する。「中脳ドーパミン作動性ニューロン」という用語は、互換的に使用され得る。
インビトロでのｍＤＡニューロンの機能的成熟は、ドーパミン（ＤＡ）の産生と放出、及びドーパミンニューロンが自発活動電位、誘発活動電位、並びに電位依存性Ｎａ＋及びＫ＋電流を獲得する時間を決定することによってモニターすることができる。本発明の方法によって誘導されたドーパミンニューロンは、４０ＤＤＣに記録され得る自発活動電位と誘発活動電位の両方を示す（図４ｎを参照）。理論に拘束されるものではないが、これらのデータは、ＲＡに基づく分化が、培養４０日以内（すなわち４０日目ＤＤＣ）に成熟した機能的特徴を示すｍＤＡニューロンの生成をもたらすことを示唆している。添付の実施例に示されるように、ドーパミン作動性ニューロンは、成熟ニューロンマーカーであるシナプトフィジン及びモノアミン作動性マーカーである小胞モノアミン輸送体（ＶＭＡＴ２）も発現した。細胞のサブセットは、中脳ドーパミンニューロンのＡ９様及びＡ１０様サブタイプの両方の存在を示すＧＩＲＫ２又はＣＡＬＢＩＮＤＩＮを発現した。ニューロンは、培養３０～４０日目（ＤＤＣ３０～４０日）に神経突起の伸長及び複雑さの有意な増加を示した。
好ましい実施形態において、中脳ドーパミン作動性ニューロンは、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）、ＬＩＭホメオボックス転写因子１β（ＬＭＸ１Ｂ）、オルソデンティクルホメオボックス２（ＯＴＸ２）、核内受容体関連１（ＮＵＲＲ１）；ペアードライクホメオドメイン３（ＰＩＴＸ３）、ＧＩＲＫ２、小胞モノアミン輸送体（ＶＭＡＴ２）、シナプトフィジン、及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）のうちの１つ以上を発現する。
「１３１１１チューブリン」としても知られる「Ｔｕｊ１」には、ヒトにおいてＴＵＢＢ３遺伝子によってコードされるタンパク質が含まれる。タンパク質１３１１１チューブリン（ＴｕＪ１）は、新しく生成された未熟な有糸分裂後ニューロン及び分化したニューロンに存在する。ヒトＴｕｊは、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ１３５０９に示されるような配列を含むことができる。Ｔｕｊ１という用語は、任意のＴｕｊ１核酸分子又はポリペプチドを包含し、その断片又は変異体も含み得る。当業者は、Ｔｕｊ１を検出する方法を知っており、そのような方法は添付の実施例にも記載されている。
「ＮＵＲＲ１」は、ヒトにおいてＮＲ４Ａ２遺伝子によってコードされるタンパク質であり、３１の細胞内転写因子の核内受容体ファミリーのメンバーである。ＮＵＲＲ１は、脳のドーパミン作動系の維持において重要な役割を果たす。ヒトＮＵＲＲ１は、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ４３３５４によって示されるようなタンパク質配列を含み得る。ＮＵＲＲ１という用語は、任意のＮＵＲＲ１核酸分子又はポリペプチドを包含し、その断片又は変異体も含み得る。当業者は、ＮＵＲＲ１を検出する方法を知っている。そのような方法は、添付の実施例にも記載されている。
「ＧＩＲＫ２」（図５ｇ参照）は、Ａ９型ＤＡニューロンに富むマーカーである。
「Ｐｉｔｘ３」もまた、特異的ｍＤＡニューロンマーカーであり、ｍＤＡニューロン及びその有糸分裂後の前駆体に排他的発現を有する。ｍＤＡニューロン分化の最終段階は、Ｐｉｔｘ３＋細胞及びＴｈ＋細胞が腹側に移動するにつれて進行する。ヒトＰｉｔｘ３は、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｏ７５３６４によって示されるようなタンパク質配列を含み得る。Ｐｉｔｘ３という用語は、任意のＰｉｔｘ３核酸分子又はポリペプチドを包含し、その断片又は変異体も含み得る。当業者は、Ｐｉｔｘ３を検出する方法を知っている。そのような方法は、添付の実施例にも記載されている。
「ＴＨ」は、チロシンヒドロキシラーゼ／チロシン３－モノオキシゲナーゼ／チロシナーゼを指し、ヒトにおいてＴＨ遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＴＨは、アミノ酸Ｌ－チロシンのＬ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ－ＤＯＰＡ）への変換を触媒する酵素である。ヒトＴＨは、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０７１０１のタンパク質配列を含み得る。ＴＨという用語は、任意のＴＨ核酸分子又はポリペプチドを包含し、その断片又は変異体も含み得る。当業者はＴＨを検出する方法を知っている。そのような方法は、添付の実施例にも記載されている。
好ましい実施形態において、分化した中脳ドーパミン作動性ニューロンを含む集団は、複数の幹細胞を少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と最初に接触させてから約３０～４０日以内に得ることができる。
上述のように、本発明の方法によって誘導された分化したドーパミンニューロンは、４０ＤＤＣに記録することができる自発活動電位と誘発活動電位の両方を示す（図４ｎを参照）。理論に拘束されるものではないが、これらのデータは、ＲＡに基づく分化が、培養４０日以内（すなわち４０ＤＤＣ）に成熟した機能的特徴を示すｍＤＡニューロンの生成をもたらすことを示唆している。
一実施形態において、細胞は、ＤＡニューロンのマーカー、例えば、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）、ＬＩＭホメオボックス転写因子１β（ＬＭＸ１Ｂ）、オルソデンティクルホメオボックス２（ＯＴＸ２）、核内受容体関連１（ＮＵＲＲ１）；ペアードライクホメオドメイン３（ＰＩＴＸ３）、ＧＩＲＫ２、小胞モノアミン輸送体（ＶＭＡＴ２）、シナプトフィジン、及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）のうちの１つ以上の検出可能な発現レベルを増加させるのに有効な濃度及び時間で、本明細書に記載のＤＡニューロン系統特異的活性化剤及び／又は阻害剤と接触させられる。
添付の実施例に示されるように、ＴＨ＋ドーパミン作動性ニューロンは、３０～３５ＤＤＣに、ｍＤＡニューロンマーカーＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ、ＦＯＸＡ２、ＮＵＲＲ１、及びＯＴＸ２を発現した（図４ｅ）。
好ましい実施形態において、分化した中脳ドーパミン作動性ニューロンを含む集団は、約３０～４０ＤＤＣ以内、例えば約３１ＤＤＣ以内、例えば約３２ＤＤＣ以内、例えば約３３ＤＤＣ以内、例えば約３４ＤＤＣ以内、例えば約３５ＤＤＣ以内、例えば約３６ＤＤＣ以内、例えば約３７ＤＤＣ以内、例えば約３８ＤＤＣ以内、例えば約３９ＤＤＣ以内、例えば約４０ＤＤＣ以内に得ることができる。
好ましい実施形態において、複数の幹細胞を少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と最初に接触させてから約３０～４０日以内に、全細胞集団は、少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、又は少なくとも８０％の中脳ドーパミン作動性ニューロンを含む。
好ましい実施形態において、全細胞集団は、少なくとも６５％の中脳ドーパミン作動性ニューロン、例えば、少なくとも６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、又は例えば少なくとも８０％の中脳ドーパミン作動性ニューロンを含む。
好ましい実施形態において、複数の幹細胞を少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と最初に接触させてから約３０～４０日以内に、神経細胞集団は、少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％又は少なくとも９０％の中脳ドーパミン作動性ニューロンを含む。
好ましい実施形態において、神経細胞集団は、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％の中脳ドーパミン作動性ニューロン、例えば、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、例えば少なくとも９０％の中脳ドーパミン作動性ニューロンを含む。
「全細胞集団」には、核マーカーＤＡＰＩに対して陽性である集団内の全ての細胞が含まれる。「神経細胞集団」には、細胞集団内の全てのニューロン、例えば、神経細胞マーカーＨｕＣＤに対して陽性である集団内の全ての細胞が含まれる。添付の実施例に示されるように、全ニューロンの約８０％が、３５ＤＤＣにはＴＨ＋（すなわち、中脳ドーパミン作動性ニューロン）であり、これは全ＤＡＰＩ＋細胞の約６５％に相当する（図４ｉ、図４ｊ）。
一態様では、本発明は、候補薬物をスクリーニングする方法であって、（ａ）本発明の方法によって得ることができるか、若しくは得られる腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞の集団を提供すること、又は本発明の方法によって得ることができるか、若しくは得られる分化した中脳ドーパミン作動性ニューロンの集団を提供することと、（ｂ）集団を候補薬物と接触させることと、（ｃ）細胞集団に対する候補薬物の効果を決定することと、を含む、方法を提供する。
一態様では、本発明は、候補薬物をスクリーニングする方法であって、（ａ）本発明の方法によって得ることができるか、若しくは得られる腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞の集団を提供することと、（ｂ）集団を候補薬物と接触させることと、（ｃ）細胞集団に対する候補薬物の効果を決定することと、を含む、方法を提供する。
本発明の方法によって生成されるｖＭＢ前駆体は、培養中のニューロンの分化及び成熟を促進及び／又は増強する因子（小分子薬物、ペプチド、及びポリヌクレオチド等）又は環境条件（培養条件又は操作等）をスクリーニングするために使用することができる。
いくつかの用途において、ｖＭＢは、神経系統に沿った前駆細胞の成熟を促進する因子、又は長期培養におけるそのような細胞の増殖及び維持を促進する因子をスクリーニングするために使用することができる。例えば、候補の神経成熟因子又は成長因子は、それらをｖＭＢと接触させ、次いで、細胞の更なる培養及び使用のための望ましい基準に従って、結果として生じる任意の表現型の変化を決定することによって試験される。
一態様では、本発明は、候補薬物をスクリーニングする方法であって、（ａ）本発明の方法によって得ることができるか、若しくは得られる分化した中脳ドーパミン作動性ニューロンの集団を提供することと、（ｂ）集団を候補薬物と接触させることと、（ｃ）細胞集団に対する候補薬物の効果を決定することと、を含む、方法を提供する。
いくつかの用途において、分化したｍＤＡは、ｍＤＡニューロンの生存を支持及び／又は増強する分子を同定するために使用することができ、したがってパーキンソン病等の神経変性疾患の治療に有用であり得る。
本発明の特定のスクリーニング用途は、薬物研究における医薬化合物の試験に関する。特定の実施形態において、本明細書に記載の方法によって生成される細胞は、標準的な薬物スクリーニング及び毒性アッセイのための試験細胞として使用され得る（例えば、機能の特異化を同定、確認、及び試験するため、又は特定の疾患を治療するための治療分子の送達を試験するため）。候補医薬化合物の活性の評価は、一般に、本発明の特定の態様で提供される腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞の集団、又は中脳ドーパミン作動性ニューロンの集団を候補化合物と組み合わせ、形態、マーカー表現型、又は化合物に起因する細胞の代謝活性を決定し（未処理細胞又は不活性（対照）化合物で処理した細胞と比較）、次いで化合物の効果と観察された変化とを相関させることを含む。スクリーニングは、化合物がｖＭＢドーパミン作動性前駆細胞、若しくはドーパミン作動性ニューロンに対して薬理学的効果を有するように設計されているために、又は他の場所で効果を有するように設計された化合物が意図しない神経の副作用を有する可能性があるために行われる。理解されるように、可能な薬物間相互作用効果を検出するために、２つ以上の薬物を組み合わせて（同時に又は連続的に細胞と組み合わせることによって）試験することができる。
いくつかの用途において、化合物は潜在的な神経毒性について最初にスクリーニングされる。細胞毒性は、第一に、細胞の生存率、生存期間、形態に対する効果によって、又は当技術分野で既知の他の技術によって決定することができる。化合物が毒性を引き起こすことなく細胞機能（神経伝達等）に影響を及ぼすかどうかを判断するために、より詳細な分析が行われる。
一態様では、本発明は、以下の濃縮された集団を提供する方法を提供する：
ｉ．腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞（方法は、複数の幹細胞を有効量の少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と接触させることと、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む細胞集団への幹細胞の分化を引き起こすのに十分な条件下で幹細胞を培養することと、を含む）；また
ｉｉ．中脳ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロン（方法は、（ｉ）で定義された方法を含み、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む集団を中脳ドーパミン作動性ニューロンに分化させることを更に含む）。
本明細書で使用される場合、「濃縮された集団」という用語は、培養皿中の細胞の集団等、比較集団よりも高いパーセンテージ又は量でマーカーを発現する細胞の集団を指し、例えば、幹細胞を少なくとも１つのＲＡシグナル伝達の活性化剤及び少なくとも１つのＨｈシグナル伝達の活性化剤（例えばＳＡＧ）と接触させると、免疫細胞化学によって示されるように、１７ＤＤＣ及び２１ＤＤＣに、幹細胞を少なくとも１つのＷＮＴシグナル伝達の活性化剤及び少なくとも１つのＨｈシグナル伝達の活性化剤（例えばＳＡＧ）と接触させた場合と比較して、中脳ドーパミン作動性ニューロンの濃縮された集団が生じる（図４ｃ）。
他の例では、濃縮された集団は、ＦＯＸＡ２＋及びＬＭＸ１Ａ＋濃縮集団、Ａ９濃縮集団等の、１つ以上のマーカーを発現する細胞を、所望のマーカーを発現しない細胞から選別又は分離することから得られる集団である。本発明の方法によって生成される細胞集団は、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞又は中脳ドーパミン作動性ニューロンの少なくとも１つのマーカーについて選別できることが理解されよう。
一実施形態において、中脳ドーパミン作動性ニューロンの濃縮された集団において、細胞の少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％が、中脳ドーパミン作動性ニューロンのマーカーに対して陽性である。一実施形態において、中脳ドーパミン作動性ニューロンの濃縮された集団は、少なくとも１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、又は１×１０６個の中脳ドーパミン作動性ニューロンを含む。
一実施形態において、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞の濃縮された集団において、細胞の少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％が、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞のマーカーに対して陽性である。更なる態様では、実施形態の方法によって生成される中脳ＤＡニューロンの濃縮された集団は、少なくとも１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、又は１×１０６個の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む。
一態様では、本発明は、本明細書に開示される方法のいずれかによって得られるか、又は得ることができる治療有効量の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む神経細胞集団を提供し、任意選択的に、細胞集団の少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、又は少なくとも８０％が、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞である。
好ましい実施形態において、神経細胞集団の少なくとも約８０％が、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）、ＬＩＭホメオボックス転写因子１β（ＬＭＸ１Ｂ）及びオルソデンティクルホメオボックス２（ＯＴＸ２）を発現する。
本明細書に記載されるように、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞は、ＲＡへの最初の曝露後７日以内（すなわち、ＤＤＣ７日目）にｈＰＳＣから得られた。これらの７ＤＤＣの細胞は、ＦＯＸＡ２及びＬＭＸ１Ａを共発現する。添付の実施例に見られるように、１４ＤＤＣには、ｈＰＳＣに由来する細胞集団の約８０％が、免疫細胞化学によって決定されるように、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ及びＯＴＸ２並びにｖＭＢマーカーであるＣＯＲＩＮを共発現する腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞である（図２ｇ）。したがって、これは腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞が豊富な細胞集団であることが理解されよう。
一態様では、本発明は、本明細書に開示される方法のいずれかによって得られるか、又は得ることができる治療有効量の中脳ドーパミン作動性ニューロンを含む分化した細胞集団を提供し、任意選択的に、全細胞の少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％％、例えば少なくとも７５％、又は少なくとも８０％が、中脳ドーパミン作動性ニューロンである。
添付の実施例に示されるように、全ニューロンの約８０％が３５ＤＤＣにはＴＨ＋（すなわち、中脳ドーパミン作動性ニューロン）であり、これは全ＤＡＰＩ＋細胞の約６５％に相当する（図４ｉ、図４ｊ）。したがって、これは中脳ドーパミン作動性ニューロンが豊富な細胞集団であることが理解されよう。
一態様では、本発明は、幹細胞を腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞に分化させるための少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤の使用を提供する。
好ましい実施形態において、幹細胞を腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞に分化させることは、本明細書に記載される通りである。
一態様では、本発明は、治療有効量の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む、単離された細胞集団を提供する。
一態様では、本発明は、本明細書に記載の方法によって得られるか、又は得ることができる治療有効量の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む、単離された細胞集団を提供する。
一態様では、本発明は、治療有効量の中脳ドーパミン作動性ニューロンを含む、単離された細胞集団を提供する。
一態様では、本発明は、本明細書に記載の方法によって得られるか、又は得ることができる治療有効量の中脳ドーパミン作動性ニューロンを含む、単離された細胞集団を提供する。
「単離された」とは、ある物質について言及する場合、天然ではそれに付随する他の物質から部分的又は完全に除去された物質が含まれる。したがって、細胞集団に関して、「単離された」という用語は、インビボで付随する他の細胞集団を実質的に含まない細胞を指す。
一実施形態において、上記単離された集団は、哺乳動物、霊長類、ヒト、及びパーキンソン病（ＰＤ）の症状を有する患者からなる群から選択される細胞集団に由来する。
更なる実施形態において、単離された細胞集団は、生存可能な腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞、又は中脳ドーパミン作動性ニューロン、又はそれらの混合物を含む安定な凍結溶液中に提供される。いくつかの実施形態において、安定な凍結溶液中の単離された細胞集団は、ＦｏｘＡ２及び／又はＬｍｘ１ａの発現に対して陽性である少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の細胞からなる。更なる態様では、実施形態の集団は、１回の凍結解凍サイクル後に、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％の生存可能なｖＭＢを含む。
安定な凍結溶液は、細胞培養培地、プロテアーゼ若しくはプロテアーゼカクテル、安定剤（例えば、ＤＭＳＯ又はグリセロール）、増殖因子、緩衝液、又は細胞外マトリックス成分のうちの１つ以上を含む。更なる実施形態において、密封されたバイアルが提供される。
好ましい実施形態において、細胞集団の少なくとも約８０％が、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）、ＬＩＭホメオボックス転写因子１β（ＬＭＸ１Ｂ）及びオルソデンティクルホメオボックス２（ＯＴＸ２）を発現する。
一態様では、本発明は、医療に使用するための、本明細書の任意の態様若しくは実施形態に記載される、かつ／又は本明細書に記載の方法のいずれかによって得られるか、若しくは得ることができる、治療有効量の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む細胞集団を含む医薬組成物を提供する。
好ましい実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤及び／又は賦形剤を更に含む。
本明細書に記載されるように幹細胞を腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞に分化させた後、一実施形態において、細胞を移植のために調製することができる。細胞は、細胞培養培地（例えば、イーグル最小必須培地）、リン酸緩衝生理食塩水、又は人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）等の生理学的に許容される担体に懸濁され得る。移植される細胞懸濁液の量は、移植部位、治療目標、及び溶液中の細胞密度によって異なる（Ｎｏｌｂｒａｎｔ，Ｓａｒａ，ｅｔ ａｌ．“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｐｕｒｉｔｙ ｈｕｍａｎ ｖｅｎｔｒａｌ ｍｉｄｂｒａｉｎ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．”Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １２．９（２０１７）：１９６２）。
薬学的に許容される担体及び希釈剤には、生理食塩水、緩衝水溶液、溶媒及び／又は分散媒が含まれる。このような担体及び希釈剤の使用は、当技術分野で周知である。溶液は、無菌かつ液体であることが好ましい。好適には、溶液は、製造及び保管条件下で安定であり、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、又はチメロサールの使用により、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用に対して保存される。本発明の溶液は、本明細書に記載の細胞を薬学的に許容される担体又は希釈剤、及び必要に応じて他の成分に組み込むことによって調製することができる。
本開示の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞及び上記細胞を含む医薬組成物は、無菌の液体調製物、例えば、等張水溶液、懸濁液、エマルジョン、分散液、又は粘性組成物として好都合に提供され得、選択されたｐＨに緩衝することができる。液体調製物は通常、ゲル、他の粘性組成物、及び固体組成物よりも調製が容易である。更に、液体組成物は、特に注射によって、投与するのに幾分より好都合である。一方、粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触時間を提供するように、適切な粘度範囲内で調合することができる。液体又は粘性組成物は担体を含むことができ、担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）及びそれらの好適な混合物を含む、溶媒又は分散媒であり得る。滅菌注射液は、本開示の主題の組成物、例えば、本開示の幹細胞由来の前駆体を含む組成物を、必要に応じて、様々な量の他の成分とともに、必要とされる量の適切な溶媒に組み込むことによって調製することができる。そのような組成物は、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロース等の好適な担体、希釈剤、又は賦形剤と混合されていてもよい。組成物は凍結乾燥させてもよい。組成物は、投与経路及び所望される調製物に応じて、湿潤剤、分散剤、又は乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化又は増粘性添加剤、保存剤、香味剤、着色料等の補助物質を含むことができる。
抗菌防腐剤、酸化防止剤、キレート剤、緩衝剤を含む、組成物の安定性及び無菌性を高める様々な添加剤を添加することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等によって確実にすることができる。注射可能な医薬形態の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばミョウバンモノステアレート及びゼラチンの使用によってもたらすことができる。しかしながら、本開示の主題によれば、使用される任意のビヒクル、希釈剤、又は添加剤は、本開示の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞と適合しなければならない。
組成物の粘度は、必要に応じて、薬学的に許容される増粘剤を使用して選択されたレベルに維持することができる。メチルセルロースは、容易にかつ経済的に入手可能であり、取り扱いが容易であるため、使用することができる。他の好適な増粘剤には、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマー等が含まれる。増粘剤の濃度は、選択された薬剤に依存し得る。重要な点は、選択された粘度を達成する量を使用することである。好適な担体及び他の添加剤の選択は、正確な投与経路、及び特定の剤形、例えば液体剤形の性質（例えば、組成物が溶液、懸濁液、ゲル又は別の液体形態、例えば徐放性形態若しくは液体充填形態に調合されるかどうか）に依存する。
組成物の成分は、化学的に不活性であるように選択されるべきであり、本開示の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞の生存率又は有効性に影響を及ぼさないことが理解されよう。
好ましい実施形態において、医薬組成物は移植のために調合される。
一態様では、本発明は、インビトロで複数の幹細胞を腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞又は中脳ドーパミン作動性ニューロンに分化させるためのキットであって、
－少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤、
－少なくとも１つのソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の活性化剤、
－少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤、及び／又は
－少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の阻害剤を含む、キットを提供する。
一実施形態において、キットは、細胞接着のための１つ以上の基質を更に含む。細胞接着のための非限定的な基質には、コラーゲン、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ポリ－Ｌ－オルニチン、ラミニン、ビトロネクチン、及びフィブロネクチン、並びにＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）又はＧｅｌｔｒｅｘ等のそれらの混合物、及び細胞膜調製物が含まれる。
一実施形態において、キットは、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞又は中脳ドーパミン作動性ニューロンの複数のマーカーを更に含む。
一態様では、本発明は、本明細書に記載の方法のいずれかによって得られるか、又は得ることができる治療有効量の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞と、１つ以上のドーパミン作動性ニューロン系統特異的活性化剤及び／又は阻害剤とを含むキットを提供する。
更なる実施形態において、必要な１つ以上のＤＡニューロン系統特異的活性化剤及び／又は阻害剤は、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞の中脳ドーパミン作動性ニューロンへの最終分化に好適である。そのような成分は上記に記載されており、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、アスコルビン酸（ＡＡ）、アスコルビン酸（ＡＡ）、及びＤＡＰＴ（（２Ｓ）－Ｎ－［（３，５－ジフルオロフェニル）アセチル］－Ｌ－アラニル－２－フェニル］グリシン１，１－ジメチルエチルエステルとしても知られる）が挙げられるが、これらに限定されない。最終分化に好適な必要な１つ以上の特異的活性化剤及び／又は阻害剤は、Ｂ２７＋培地内に含まれてもよいか、又は別々に提供されてもよい。
一実施形態において、キットは、本開示の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞の集団又はそれを含む組成物を、神経変性疾患、又は中脳ドーパミン作動性ニューロンの喪失を特徴とする疾患及び／若しくは状態に罹患している対象に投与するための説明書を含む。
一態様では、本発明は、医療に使用するための、本明細書の任意の態様若しくは実施形態に記載される、かつ／又は本明細書に記載の方法のいずれかによって得られるか、若しくは得ることができる、治療有効量の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む細胞集団を提供する。
一態様では、本発明は、対象における神経変性並びに／又は対象における中脳ドーパミン作動性ニューロンの喪失を特徴とする疾患及び／若しくは状態の治療又は予防に使用するための、本明細書の任意の態様若しくは実施形態に記載される、かつ／又は本明細書に記載の方法のいずれかによって得られるか、若しくは得ることができる、治療有効量の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む細胞集団を提供する。
一態様では、本発明は、対象における神経変性及び／又は対象における中脳ドーパミン作動性ニューロンの喪失を特徴とする疾患及び／又は状態を治療又は予防するための方法であって、本明細書の任意の態様若しくは実施形態に記載される、かつ／又は本明細書に記載の任意の方法によって得られるか、若しくは得ることができる、治療有効量の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む細胞集団を、対象における神経変性並びに／又は対象における中脳ドーパミン作動性ニューロンの喪失を特徴とする疾患及び／若しくは状態を治療又は予防するのに有効な量で対象に投与することを含む、方法を提供する。
一態様では、本発明は、対象における神経変性並びに／又は対象における中脳ドーパミン作動性ニューロンの喪失を特徴とする疾患及び／若しくは状態を治療又は予防するための薬物の製造のための、本明細書の任意の態様若しくは実施形態に記載される、かつ／又は本明細書に記載の方法のいずれかによって得られるか、若しくは得ることができる、治療有効量の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む細胞集団の使用を提供する。
「対象における神経変性」には、対象における神経変性プロセスの結果としての神経機能の進行性喪失が含まれる。神経変性は、腹側中脳の黒質におけるＤＡニューロンの選択的喪失によって引き起こされ得る。また、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、及び多発性硬化症を含むがこれらに限定されない神経変性疾患によって引き起こされる神経変性も含まれる。
「中脳ドーパミン作動性ニューロンの喪失を特徴とする疾患及び／又は状態」には、対象におけるドーパミンニューロンの喪失によって引き起こされる症状を示す任意の疾患及び／又は状態が含まれる。ＳＮｐｃにおけるニューロンの喪失は、現在、ミトコンドリアの損傷、エネルギー障害、酸化ストレス、興奮毒性、タンパク質のミスフォールディングとその凝集、タンパク質クリアランス経路の障害、細胞自律機構、及び／又はプリオン様タンパク質感染によって引き起こされると考えられている。上記のように、ＤＡ産生ニューロンの領域は被蓋に由来し、黒質緻密部（ＳＮｃ、Ａ９群）、及び腹側被蓋野（ＶＴＡ、Ａ１０群）と称される。当業者は、ＳＮｃの中脳ドーパミン作動性（ｍＤＡ）ニューロンが、複数の脳機能の制御において重要な役割を果たすことを認識している。それらの軸索は、皮質の背外側線条体内に吻側で上行し、そこで神経伝達物質であるドーパミンを放出する。ＳＮｃのｍＤＡニューロンは、黒質のドーパミン作動性ニューロンの進行性喪失を特徴とする進行性神経変性疾患であるパーキンソン病（ＰＤ）において選択的に変性を受ける。ｍＤＡニューロンの喪失は、生理学的条件下で自発的な体の動きを制御する線条体のＤＡの欠乏をもたらす。中脳ドーパミン作動性ニューロンの喪失を同定する方法は、当技術分野で既知であり、電気生理学、誘発ドーパミン放出の測定、及び行動分析が含まれる。
一実施形態において、対象における中脳ドーパミン作動性ニューロンの喪失を特徴とする疾患及び／又は状態には、パーキンソン病、パーキンソニズム症候群、アルツハイマー病、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症、ビンスワンガー病、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、重症筋無力症及びピック病を含むがこれらに限定されない神経変性疾患が含まれる。一実施形態において、神経変性疾患は、運動を制御する脳の一部である大脳基底核におけるドーパミンの不足に関連する疾患を指すパーキンソニズム疾患である。
パーキンソン病は、感覚、睡眠、及び情緒障害を伴うことが多い。「パーキンソニズム」又は「パーキンソン症候群」は、主な運動症状である。
パーキンソニズム症候群の非限定的な例として、パーキンソニズムの他のより稀な原因の中でも、レビー小体型認知症、特発性パーキンソン病（ＰＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、及び血管性パーキンソニズム（ＶａＰ）が挙げられる。
一実施形態において、神経変性疾患はパーキンソン病（ＰＤ）である。現在、ＰＤは、原発性又は続発性の２つのサブタイプに分類されている。原発性パーキンソニズムには、疾患の遺伝的及び特発性の形態が含まれ、続発性パーキンソニズムには、薬物、感染症、毒素、血管欠陥、脳外傷若しくは脳腫瘍又は代謝機能障害によって誘発される形態が含まれる。
パーキンソン病の一次的運動症状には、例えば、安静時振戦（手、腕、脚、顎、頭、舌、唇、顎の震えがＰＤで観察される主要な運動症状である）、固縮、動作緩慢（ゆっくりとした動き）、姿勢不安定性又はバランスと協調運動障害が含まれるが、これらに限定されない。二次的運動症状には、猫背の姿勢、前屈みになる傾向、ジストニア、疲労、微細運動及び粗大運動の協調障害、腕の振りの減少、アカシジア、けいれん、流涎、嚥下及び咀嚼の困難、並びに性機能障害が含まれる。ＰＤ患者において頻繁に観察される非運動症状には、うつ病、不眠症、及び認知機能障害が含まれる。
ＰＤは、例えば、国際パーキンソン病・運動障害疾患学会（ＭＤＳ）のパーキンソン病の臨床診断基準（ＭＤＳ－ＰＤ基準）によって定義された診断基準を用いて、熟練臨床医によって診断され得る。
「治療する」又は「治療」とは、対象における疾患の任意の治療を含み、疾患を阻害すること、例えば生着不全を予防すること、及び／又は疾患を軽減すること、例えば１つ以上の症状の退行を引き起こすことを含む。例えば、治療は、安静時振戦、固縮、動作緩慢（ゆっくりとした動き）、及び姿勢不安定性又はバランスと協調運動障害を含む群から選択される１つ以上の神経学的症状の軽減を伴い得る。
一般に、所与の治療の有効性は、当業者によって決定され得る。しかしながら、治療は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載の細胞集団を用いた治療後に、例えば振戦の徴候又は症状のいずれか１つ又は全てが有益な様式で変化するか、他の臨床的に許容される症状が、例えば少なくとも１０％改善される又は更には回復される場合に、「有効な治療」とみなされる。有効性はまた、入院、医療介入の必要性（すなわち、疾患の進行の停止）、又は生着不全の発生率によって評価されるように、個体が悪化しないことによって測定することもできる。これらの指標を測定する方法は、当業者に既知であり、かつ／又は本明細書に記載されている。本発明に関連して、有効性は、パーキンソン病の動物モデルにおいて、例えば、ステップ試験及びシリンダー試験等の行動試験を実施することによって評価することができる。治療の有効性は、例えば、安静時振戦、固縮、動作緩慢（ゆっくりとした動き）、及び姿勢不安定性又はバランスと協調運動障害を含む神経学的症状等の、ＤＡニューロン生着／移植の物理的指標を評価することによって決定することができる。
「予防する」又は「予防」とは、一般に、対象における障害若しくは状態の発生を低減する又は減少させること、又は障害若しくは状態の１つ以上の症状の発症を遅らせることを含む。本発明に関連して、予防には、変性を予防すること、すなわち細胞の喪失を低減すること、又は細胞機能、例えばドーパミン作動性ニューロンの場合はドーパミンの放出の障害を減少させることが含まれ得る。予防には、ドーパミン作動性前駆細胞の喪失及び／又は黒質のニューロンの喪失に由来する神経学的状態の重症度の軽減又は低減も含まれる。
対象は、脊椎動物、より好ましくは哺乳動物であり得る。哺乳動物には、ブタ、霊長類、イヌ、ウマ、及びげっ歯類を含む家畜が含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、マウス、ラット等であり得る。したがって、一実施形態において、対象は脊椎動物である。好ましくは、対象はヒト対象である。対象は、パーキンソン病等の神経変性疾患に罹患している対象であり得る。具体的には、対象は、家族性パーキンソン病に関連するＬＲＲＫ２－Ｇ２０１９Ｓ突然変異を有する対象であり得る。対象はまた、パーキンソン病等の神経変性疾患を罹患していない対象であってもよい。
腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞又はドーパミン作動性ニューロンは、対象に局所的又は全身的に投与することができる。投与方法は、当技術分野で既知である。対象が自身の細胞に由来する細胞を受け取る場合、これは自己移植と称され、そのような移植は拒絶反応をもたらす可能性が低い。
幹細胞又は分化細胞を、対象、特にヒト対象に投与する例示的な方法には、対象の標的部位（例えば、線条体及び／又は黒質）への細胞の注射又は移植が含まれる。ｖＭＢ前駆細胞及び／又はＤＡニューロンは、対象への細胞の注射又は移植によって導入を容易にする送達デバイスに挿入され得る。そのような送達デバイスには、チューブ、例えば、レシピエント対象の体内に細胞及び流体を注入するためのカテーテルが含まれる。好ましい実施形態において、チューブは、針、例えば注射器を追加的に有し、それを通して本発明の細胞を対象の所望の位置に導入することができる。ｖＭＢ前駆体は、そのような送達デバイス、例えば注射器に、異なる形態で挿入され得る。例えば、細胞を溶液に懸濁するか、あるいはそのような送達デバイスに含まれる場合は支持マトリックスに埋め込むことができる。
ｖＭＢ前駆体を組み込むか埋め込むことができる支持マトリックスには、レシピエントと互換性があり、レシピエントに害のない生成物に分解するマトリックスが含まれる。支持マトリックスは、天然（例えば、コラーゲン等）及び／又は合成の生分解性マトリックスであり得る。合成の生分解性マトリックスには、ポリ無水物、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の合成ポリマーが含まれる。
添付の実施例に見られるように、右半球の黒質線条体のドーパミン作動性経路の完全な損傷のために、６－ヒドロキシドーパミン（６－ＯＨＤＡ）を内側前脳束内に片側注射することによってパーキンソンをラットに誘発した。ｈＰＳＣ由来のｖＭＢ前駆細胞を分化１４日目（１４ＤＤＣ）に単離し、Ａｃｃｕｔａｓｅを含む単一細胞懸濁液に解離し、（ＨＢＳＳ緩衝液＋ＤＮａｓｅ）等の生理学的緩衝液に再懸濁して、１μｌ当たり３７，５００～７５，０００細胞の濃度とし、宿主ラット線条体の６－ＯＨＤＡ損傷側に移植した。
好ましい実施形態において、対象は、少なくとも１つの神経学的症状を呈し、神経学的症状は、安静時振戦、固縮、動作緩慢（ゆっくりとした動き）、及び姿勢不安定及び／又はバランスと協調運動障害を含む群から選択される。
好ましい実施形態において、対象は、上記神経学的症状のうちの少なくとも１つの軽減を示す。
好ましい実施形態において、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む集団は、細胞集団のインビボ生着を可能にする条件下で、対象への移植によって投与される。
一態様では、本明細書に記載の方法は、対象におけるｖＭＢ前駆細胞又はＤＡニューロンの生着を増強する方法を提供する。一実施形態において、対象は哺乳動物であり得る。別の実施形態において、哺乳動物はヒトであり得るが、本発明は全ての哺乳動物に関して有効である。
移植は、同種（すなわち、同じ種の遺伝的に異なるメンバー間）、自己（すなわち、生物自身の細胞又は組織の移植）、同系（すなわち、同じ種の遺伝的に同一のメンバー間（例えば、一卵性双生児））、又は異種（すなわち、異なる種のメンバー間）であり得る。
本発明の任意の態様又は実施形態に記載の細胞を、神経変性疾患を有する患者の脳に移植すると、失われた、非機能性、及び／又は機能不全のＤＡニューロンが置換される。疾患の少なくとも１つの副作用又は症状の少なくとも部分的な軽減又は緩和が存在するように、失われた及び／又は機能不全のＤＡニューロンを置換するのに好適な量で、神経変性疾患を有する対象に細胞が導入される。細胞は、細胞の少なくとも一部が生存可能である対象の所望の位置への細胞の送達をもたらす任意の適切な経路によって対象に投与され得る。
少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約２０％、更により好ましくは少なくとも約３０％、更により好ましくは少なくとも約４０％、最も好ましくは少なくとも約５０％、又はそれ以上の細胞が対象への移植後に生存していることが好ましい。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間（例えば、２４時間）から数日程度の短さから、数週間から数ヶ月程度の長さまであり得る。対象に細胞を送達するために使用することができる、当業者に既知の任意の移植方法が使用され得ることが理解されるであろう（Ｐａｒｍａｒ，Ｍａｌｉｎ．“Ｔｏｗａｒｄｓ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４５．１（２０１８）：ｄｅｖ１５６１１７）。
一態様では、本発明は、本明細書の任意の態様若しくは実施形態に記載される、かつ／又は本明細書に記載の方法のいずれかによって得られるか、若しくは得ることができる、治療有効量の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む細胞集団を、それを必要とする対象への移植に使用するために提供する。
一態様では、本発明は、本明細書の任意の態様若しくは実施形態に記載される、かつ／又は本明細書に記載の方法のいずれかによって得られるか、若しくは得ることができる、治療有効量の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む細胞集団を、それを必要とする対象に移植するための方法を提供する。
一態様では、本発明は、本明細書の任意の態様若しくは実施形態に記載される、かつ／又は本明細書に記載の方法のいずれかによって得られるか、若しくは得ることができる、治療有効量の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む細胞集団の、それを必要とする対象に移植するための薬物の製造のための使用を提供する。
好ましい実施形態において、対象は、パーキンソン病、パーキンソニズム症候群、アルツハイマー病、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症、ビンスワンガー病、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、重症筋無力症及びピック病を含む群から選択される神経変性疾患を有する、又はそのリスクがある。
一実施形態において、パーキンソン病は、孤発性パーキンソン病、例えばＬＲＲＫ２－Ｇ２０１９Ｓ変異を含む家族性パーキンソン病、及び／又は常染色体劣性早期発症型パーキンソン病である。
一態様では、本発明は、添付の説明、実施例、及び図面を参照して、本明細書に実質的に記載されている、分化方法、使用のための集団、集団の使用、治療方法、又はキットを提供する。
次に、以下の図面及び実施例を参照して本発明を更に説明する。
２日間のＲＡパルスは、ＭＢ様アイデンティを発現するＮＳＣの迅速な誘導をもたらす。（ａ）ｄＳＭＡＤｉ及びＲＡによる処理のタイムラインを含むｈＰＳＣ分化の概略図。（ｂ）多能性マーカーＯＣＴ４並びに神経細胞マーカーＳＯＸ１及びＰＡＸ６について、二重ＳＭＡＤ阻害剤（ｄＳＭＡＤｉ）で、又は２日間のＲＡパルス（ＲＡ２Ｄ）を用いてｄＳＭＡＤｉで分化させたＥＳＣ及び３日間培養物の免疫細胞化学。（ｃ）示される分化条件の日数（ＤＤＣ）に、ｄＳＭＡＤｉ又はＲＡ２Ｄパルスを用いたｄＳＭＡＤｉにおけるＳＯＸ１及びＯＣＴ４の単一細胞発現の密度プロット。 （ｄ）神経前駆細胞マーカーＮＥＳ及びＳＯＸ１の免疫細胞化学、並びに示される条件で分化させた７ＤＤＣ培養物の明視野（ＢＦ）画像。（ｅ）ＥＳＣと比較した、２ＤＤＣのｄＳＭＡＤｉ＋ＲＡ２Ｄパルス培養物における多能性又は神経外胚葉運命に関連する遺伝子の発現の変化。（ｆ）ｄＳＭＡＤｉ条件で増殖させ、示される濃度のＲＡで２日間処理した、ＥＳＣのＯＣＴ４及びＳＯＸ１、並びに３ＤＤＣ培養物のウエスタンブロット。（ｇ）示される分化条件で増殖させたＥＳＣ及び３ＤＤＣ培養物のＯＣＴ４及びＳＯＸ１のウエスタンブロット。 （ｈ）ｄＳＭＡＤｉ条件で分化させ、示されるようにＲＡパルスで処理した９ＤＤＣ培養物における、前脳（ＦＯＸＧ１）、前脳及び中脳（ＯＴＸ２）、後脳（ＨＯＸＡ２）、並びに尾側後脳（ＨＯＸＢ４）領域を同定するマーカーの免疫細胞化学。（ｉ）ＮＳＣの領域アイデンティティに対するＲＡパルス持続時間の影響の概要。Ａ．Ｕ．、任意単位。ＦＢ、前脳。ＭＢ、中脳。ＨＢ、後脳。 ＲＡ及びＳＨＨシグナル伝達を用いた腹側中脳アイデンティティを有するＮＳＣの特異化。（ａ）ＲＡ及びＳＨＨシグナル伝達の活性化剤（ＳＡＧ）による処理のタイムラインを含むｈＰＳＣ分化の概略図（上）。図１ａに示すように、全ての培養物をｄＳＭＡＤｉ条件で分化させた。ｄＳＭＡＤｉ＋ＳＡＧ条件で分化させ、１日間、２日間又は４日間ＲＡでパルスした培養物における９ＤＤＣの示されるマーカーの免疫細胞化学（下）。（ｂ）ｄＳＭＡＤｉ＋ＳＡＧ条件で分化させ、示される時間ＲＡで処理した９ＤＤＣ培養物における、示される遺伝子の相対的な遺伝子発現（ＦＰＫＭ）。（ｃ）ｄＳＭＡＤｉ＋ＳＡＧ条件で分化させ、示される時間ＲＡで処理した９ＤＤＣ培養物の差次的発現遺伝子のヒートマップ及び階層的クラスタリング。 （ｄ）間脳（Ｄｉ）、中脳（ＭＢ）、及び後脳（ＨＢ）の位置で異なる腹側前駆細胞を定義する遺伝子発現プロファイルの概略図。（ｅ）ｄＳＭＡＤｉ＋ＳＡＧ＋ＲＡ２Ｄ条件で分化させた培養物における１４ＤＤＣの示される領域の前駆細胞に関連する遺伝子の発現。（ｆ）ｄＳＭＡＤｉ＋ＳＡＧ条件（対照）で分化させ、ＲＡ又はＣＨＩＲ９９０２１で処理した２ＤＤＣ培養物におけるβカテニンの免疫細胞化学（左）及びβカテニン核内レベルの箱ひげ図（右）。箱ひげ図、ひげは、５パーセンタイル及び９５パーセンタイルを定義する。アスタリスク、スチューデントのｔ検定。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 （ｇ）ｄＳＭＡＤｉ＋ＳＡＧ＋ＲＡ２Ｄ条件で分化させた１４ＤＤＣの培養物中の示されるマーカーの免疫細胞化学。 ＲＡ－ＣＹＰ２６制御ループは、ＲＡを介したロバストなパターン形成応答の中心である。（ａ～ｃ）ｄＳＭＡＤｉ＋ＳＡＧ条件で分化させた９ＤＤＣ培養物における、腹側前脳（ＮＫＸ２．１＋ＬＭＸ１Ａ＋）、中脳（ＮＫＸ２．１－ＬＭＸ１Ａ＋）又は後脳（ＮＫＸ２．２＋）を定義するマーカーの発現に対するＲＡ（ａ）又はＣＨＩＲ９９２２１（ｂ）濃度の変化の影響、並びに対応するＮＫＸ２．１＋ＬＭＸ１Ａ＋及びＮＫＸ２．１－ＬＭＸ１Ａ＋集団の定量化（ｃ）。（ｄ）ｄＳＭＡＤｉ条件で分化させた１ＤＤＣ培養物におけるＣＹＰ２６Ａ１発現に対するＲＡ濃度（５０、１００、３００、５００、及び１，０００ｎＭのＲＡ）の影響。（ｅ）ｄＳＭＡＤｉで分化させ、ＲＡなしで、又は３００、５００、若しくは１，０００ｎＭのＲＡで２日間パルスした培養物におけるＣＹＰ２６Ａ１の時間的発現プロファイル。 （ｆ）ＳＡＧ及び示されるＲＡ条件で分化させた培養物における９ＤＤＣのＮＫＸ２．１、ＬＭＸ１Ａ及びＰＨＯＸ２Ｂの発現に対する５００ｎＭの阻害剤Ｒ１１５８６６によるＣＹＰ２６活性の阻害の影響。（ｇ）ＲＡ１Ｄ＋ＳＡＧ条件で、異なる濃度のＣＹＰ２６阻害剤Ｒ１１５８６６の存在下で分化させた９ＤＤＣ培養物における示される遺伝子の相対的な遺伝子発現。（ｈ、ｉ）ｄＳＭＡＤｉに加えて示される条件で、かつ５００ｎＭの阻害剤Ｒ１１５８６６の存在下又は非存在下で分化させた培養物中における、９ＤＤＣのＮＫＸ２．１、ＬＭＸ１Ａ及びＰＨＯＸ２Ｂの免疫細胞化学。（ｊ）ＲＡとＣＹＰ２６Ａ１との間の調節相互作用の概略図。（ｃ～ｅ）値、平均値±標準偏差。 インビトロ培養における機能的ドーパミン作動性ニューロンの高速生成。（ａ～ｍ）ｄＳＭＡＤｉ＋ＲＡ２Ｄ＋ＳＡＧ（ａ、ｂ、ｅ～ｍ）又はｄＳＭＡＤｉ＋ＳＡＧにおける、示されるＲＡ、ＣＨＩＲ９９０２１又はＣＨＩＲ９９０２１＋ＦＧＦ８条件（ｃ、ｄ）の培養物の分析。（ａ）１４～２１ＤＤＣ培養物の底板アイデンティティ及び神経新生に関連する遺伝子の発現レベルの変化。（ｂ）１４及び２１ＤＤＣ培養物におけるＬＭＸ１Ａ及びＳＨＨの免疫細胞化学。（ｃ）示される条件で分化させた培養物における、１７ＤＤＣのニューロンマーカーＨｕＣＤ及び２１ＤＤＣのドーパミン作動性ニューロンマーカーＴＨの免疫細胞化学。（ｄ）示される条件での１４、１７、及び２１ＤＤＣの分化培養物におけるＨｕＣＤ＋ニューロンの定量化。 （ｅ～ｇ）３３ＤＤＣ（ｅ、ｆ）及び４５ＤＤＣ（ｇ）の示されたマーカーの免疫細胞化学。 （ｈ）３０及び４０ＤＤＣのＴＨ＋ニューロンにおける神経突起の長さと複雑さの定量化のバイオリン図。ｎ＝４０；分枝の数は、平均±ＳＥＭとして表される。（ｉ）３５～４０ＤＤＣ培養物における示されるマーカーの免疫細胞化学。（ｊ）３５ＤＤ培養物におけるドーパミン作動性（ＴＨ＋）、ＧＡＢＡ作動性（ＧＡＢＡ＋）、運動（ＰＲＰＨ＋）及びセロトニン作動性（５－ＨＴ＋）ニューロンの定量化。（ｋ）４２ＤＤＣ培養物の上清中のノルアドレナリン（ＮＡ）、ドーパミン（ＤＡ）、及びセロトニン（５－ＨＴ）のＨＰＬＣ検出。（ｌ）対照中又はＫＣＬ誘導ドーパミン放出後、及び全細胞溶解物における、４２ＤＤＣ培養物の培地中ドーパミンレベルの定量化。値、平均±Ｓ．Ｄ．、アスタリスク、スチューデントのｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．００１。 （ｍ）自発活動電位（上）及び４０又は４５ＤＤＣ培養物の細胞から単離された自発活動電位（下）を示す細胞付着記録。（ｎ）４０ＤＤＣのＴＨのビオシチン標識ニューロン（上）及び４０ＤＤＣニューロンで誘発されたスパイク列の免疫細胞化学（下）。（ｏ）ドーパミン作動性ニューロンの分化中の分化条件及びプロセスタイムラインの概略図。 ＲＡによって特定されるｖＭＢ調製物は、ＰＤのラットモデルへの移植後、機能的パミン作動性ニューロンに分化し、運動障害を回復する。（ａ～ｈ）ｖＭＢ調製物（１５０．０００個の細胞）を線条体に移植してから７ヶ月後の片側６－ＯＨＤＡ損傷ラットの免疫組織学的分析。（ａ）線条体及び黒質（ＳＮ）におけるＴＨ発現。線条体全体のＴＨ免疫反応性と、損傷側（右）のＳＮにおけるＴＨ発現の欠如に留意されたい。（ｂ～ｇ）移植片における示されるマーカーの免疫組織化学。 （ｈ）１分当たり５回以上の同側回転のベースラインアンフェタミン誘発性回転スコア≧を有するラットにおける１分当たりの正味回転数の定量化（ｎ＝５）。（ｉ）全ての移植動物（ｎ＝９）の移植前（実線）及び移植後（破線）のアンフェタミン投与後の経時的な回転挙動（ｎ＝９）。（ｊ）損傷後及び移植後７ヶ月の反対側の足の使用の優位性。 ＲＡとＣＨＩＲ９９０２１の連続処理により、尾側中脳アイデンティティの特異化がもたらされる。（ａ）（ａ）１４ＤＤＣの腹側ＭＢ前駆細胞アイデンティティの免疫細胞化学分析。ＲＡ２Ｄ＋ＳＡＧ条件で分化させた細胞は、中脳マーカーＬＭＸ１Ａ及びＯＴＸ２を発現するが、尾側中脳マーカーＥＮ１は発現しない。ＲＡ２Ｄ＋ＳＡＧ条件で分化させた細胞を４～９ＤＤＣに５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１で更に処理すると、ＬＭＸ１Ａ＋ＯＴＸ２＋細胞でＥＮ１が誘導される。ＤＡＰＩ染色で可視化した細胞の核。（ｂ）示される条件で分化させた４０ＤＤＣ培養物におけるドーパミン作動性ニューロンマーカーＴＨ及び尾側中脳マーカーＥＮ１発現の免疫細胞化学。５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（４～９ＤＤＣ）で処理された多くのＴＨニューロンは、尾側中脳マーカーＥＮ１を発現する。 （補足図１）：（ａ）多能性マーカーＯＣＴ４並びにニューロンマーカーＳＯＸ１及びＰＡＸ６について、ｄＳＭＡＤｉ又はｄＳＭＡＤｉ＋ＲＡ２Ｄで分化させた４日間及び２日間培養物の免疫細胞化学。黄色の矢印（左側のパネル）は、ＯＣＴ４＋／ＳＯＸ１＋細胞を示す。ｄＳＭＡＤｉ又はｄＳＭＡＤｉ＋ＲＡ２Ｄで分化させた３ＤＤＣ培養物のＰＡＸ６核内レベル（右）の箱ひげ図。ひげは、５パーセンタイル及び９５パーセンタイルを定義する。 （ｂ）ｄＳＭＡＤｉ＋ＲＡ２Ｄ条件で２日間分化させた神経外胚葉、内胚葉、及び中胚葉系統に関連する遺伝子の発現。（ｃ）示される条件で分化させた３ＤＤＣ培養物のＯＣＴ４及びＳＯＸ１のウエスタンブロット。（ｄ）ｄＳＭＡＤｉ条件で分化させ、示されるＲＡパルスで処理した９ＤＤＣ培養物における前脳（ＦＯＸＧ１、ＳＩＸ３）、前脳及び中脳（ＯＴＸ２）領域を同定するマーカーのＱ－ＰＣＲ。 （補足図２）：（ａ）ｄＳＭＡＤｉ＋ＳＡＧ条件で分化させ、０ＤＤＣから０日間（ＲＡ０Ｄ）、１日間（ＲＡ１Ｄ）、２日間（ＲＡ２Ｄ）、又は４日間（ＲＡ４Ｄ）、ＲＡでパルスした９ＤＤＣ培養物の主成分分析。（ｂ）９ＤＤＣ培養物におけるＮＫＸ２．１、ＬＭＸ１Ａ及びＰＨＯＸ２Ｂ又はＮＫＸ２．２及びＰＨＯＸ２Ｂの免疫細胞化学。細胞は、ｄＳＭＡＤｉ＋ＳＡＧ条件のみ（ＲＡ＋ＳＡＧなし）で、又は分化中の異なる時点で適用される２日間のＲＡパルス（ＲＡ２Ｄ＋ＳＡＧ）とともに分化させた（０～２、１～３、２～４、３～５又は４～６分化条件の日数（ＤＤＣ））。 （ｃ）培養物へのＳＡＧの添加のタイムラインを含むｈＥＳＣ分化（ｄＳＭＡＤｉ条件）の概略図（上）。０日目、１日目、又は２日目からＳＡＧで処理した９ＤＤＣ培養物における、ＬＭＸ１Ａ、ＮＫＸ２．２、及びＦＯＸＡ２の免疫蛍光（中央）及びＬＭＸ１Ａ、ＮＫＸ２．２、及びＦＯＸＡ２のウエスタンブロット（下）。（ｄ）ｄＳＭＡＤｉ条件で分化させ、０日目から異なる濃度のＳＡＧで処理した９ＤＤＣ培養物における、ＬＭＸ１Ａ及びＦＯＸＡ２の免疫蛍光（上）及びＬＭＸ１Ａ、ＦＯＸＡ２及びＰＡＸ３のウエスタンブロット（下）。 （ｅ，ｆ）ｄＳＭＡＤｉ＋ＲＡ２Ｄ＋ＳＡＧ０ＤＤＣにおけるｈＥＳＣ系統９８０及び４０１、並びにｈｉＰＳＣ系統ＳＭ５５及びＳＭ５６の分化、９日間分化培養物における、前駆細胞マーカーＬＭＸ１Ａ、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、Ｎｋｘ２．１及びＮＫＸ６．１（ｅ）、並びに３０ＤＤＣ培養物におけるＴＨ、ＦＯＸＡ２、及びＭＡＰ２（ｆ）の免疫細胞化学。 （補足図３）：（ａ）阻害剤Ｒ１１５８６６の存在下又は非存在下で、ｄＳＭＡＤｉ＋ＳＡＧ０ＤＤＣ条件で分化させ、ＲＡで１日間又はＥＣ２３で２日間パルスした９ＤＤＣ培養物におけるＮＫＸ２．１、ＬＭＸ１Ａ及びＰＨＯＸ２Ｂの発現分析。（ｂ）ｄＳＭＡＤｉ＋ＳＡＧ０ＤＤＣ条件で分化させ、様々な濃度（１０、１００、５００、及び１０００ｎＭ）のオールトランスＲＡ類似体であるタザロテニック（ＴＡ）、１３－ｃｉｓ－ＲＡ及び９－ｃｉｓ－ＲＡで２日間パルスした９ＤＤＣ培養物におけるＮＫＸ２．１、ＬＭＸ１Ａ及びＰＨＯＸ２Ｂの発現分析。（ｃ）ｄＳＭＡＤｉ＋ＳＡＧ０ＤＤＣ条件で分化させ、示される濃度のＥＣ２３で１日又は２日間パルスした９ＤＤＣ培養物におけるＮＫＸ２．１、ＬＭＸ１Ａ、及びＰＨＯＸ２Ｂの発現分析。 （補足図４）：（ａ）ｄＳＭＡＤｉ＋ＲＡ２Ｄ＋ＳＡＧ条件で分化させた培養物における９～２１ＤＤＣの底板遺伝子の発現レベルを示すＲＮＡ－ｓｅｑデータ。（ｂ）ｄＳＭＡＤｉ＋ＲＡ２Ｄ＋ＳＡＧ条件で分化させた１２ＤＤＣ培養物におけるニューロンマーカーＴｕｊ１の免疫細胞化学。ＤＡＰＩで可視化した核。（ｃ）４０ＤＤＣ培養物におけるＴＨ、ＥＮ１、及びＧＡＢＡの免疫細胞化学。（ｄ）ナトリウム電流を示した細胞の平均ナトリウム電流（ひげは全てのデータポイントの範囲を網羅し、赤いプラスは外れ値である、ｎ＝５７細胞）。円グラフは、ナトリウム電流（黄色）を示すパッチを適用した細胞の割合と、活性を示さない細胞の割合を示す。 （補足図５）：（ａ）６－ＯＨＤＡ損傷ラットにおける移植アッセイ及び分析のタイムラインの概略図。（ｂ）全ての移植ラットの移植片におけるヒトマーカー（ＨｕＮｕ）及びドーパミン作動性ニューロンマーカー（ＴＨ）の発現の免疫組織学的分析。 （ｃ）周囲の背外側線条体（ｄｌＳＴＲ）を神経支配する移植片由来ＴＨ＋ニューロンのＤＡＢ染色。
実施例１：ヒト多能性幹細胞から移植可能なドーパミンニューロンを迅速かつロバストに誘導するための、レチノイン酸に基づく新規方法。
細胞置換療法、及びパーキンソン病（ＰＤ）の疾患モデリングのためにヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の中脳ドーパミン（ｍＤＡ）ニューロンへの分化を指示することにおいて著しい進歩が遂げられてきたが、ロバスト性、効率性、及び分化手順の速度を向上させるという継続的なインセンティブが存在する。本研究では、高収率のヒトｍＤＡニューロンを、ロバストかつ迅速に誘導するための、レチノイン酸（ＲＡ）に基づく新規方法の概要を説明する。ＲＡ曝露の持続時間は、ｈＰＳＣから中脳アイデンティティを発現する神経幹細胞へのスイッチ様変換の重要な決定要因である。中脳運命を特定するために一般的に使用されるＧＳＫ３β阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１とは異なり、ＲＡに対する細胞のパターン形成応答は、ＲＡレベルの変化に対して非常に寛容である。ＲＡとＳＨＨシグナル伝達とを組み合わせた活性化は、神経新生を早期にかつ高速で開始するｍＤＡニューロン前駆細胞を誘導し、機能的特徴を示すｍＤＡニューロンが培養４０日以内に得られる。ＰＤの動物モデルに移植すると、ＲＡによって特定される前駆細胞は、運動障害を軽減する機能的なＤＡニューロンに成熟した。本研究では、インビトロでの疾患モデリング及び創薬を促進し、ＰＤの細胞置換療法に使用する細胞を生成するための代替経路を提供し得る、ヒトｍＤＡニューロンを生成するための新しいアプローチを提供する。
導入
胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の形態のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、神経変性疾患におけるハイスループットな創薬、疾患モデリング、又は細胞置換療法に利用することができる特定のサブタイプのニューロンを産生するためのスケーラブルな細胞供給源を提供する１，２。この分野は急速に進歩しているが、インビトロでの幹細胞分化を介して機能的ヒトニューロンを生成するのに必要とされる長い時間は、実験的研究及び一部の生物医学的応用に課題を提供する３。腹側中脳（ｖＭＢ）の中脳ドーパミン（ｍＤＡ）ニューロンは、パーキンソン病（ＰＤ）での選択的変性、及び細胞置換療法によって、失われたドーパミン神経伝達を回復し、運動障害を逆転させる可能性があるため、特に研究の対象となっている４。
ｈＰＳＣからｍＤＡニューロンを誘導するためのプロトコルは徐々に改善されてきており、現在、前臨床移植実験での広範な評価の後、同種ＥＳＣ又は自己ｉＰＳＣを出発物質として使用する臨床試験の段階に達している２。これらの研究及び試験では、細胞は、未熟な前駆体として移植され、インビボで数ヶ月かけて最終的に分化し、機能的に成熟する。したがって、成熟した機能的ＤＡニューロンは、移植後に生成することができるが、インビトロ培養でもヒトｍＤＡニューロンの分化及び成熟に時間が掛かるため、インビトロでの疾患モデリング又は創薬のための細胞プラットフォームの確立に課題をもたらす。培養におけるｍＤＡニューロンの収率は増加したが、成熟したｍＤＡニューロンを得るのに必要な時間は、最初のｈＰＳＣベースのプロトコルが２００４年に記載されて以来、本質的に一定のままであった５。培養において成熟した電気生理学的特性を示すヒトｍＤＡニューロンを生成するには約６０日かかるが６，７、これは、細胞が成熟した機能的特徴を獲得するために必要な最小時間を反映し得る。しかしながら、単一細胞解析では、ｈＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンは、それらのインビボ対応物と比較して動態が遅く、発生の進行が厳密に制御されていないことが示唆されており８、現在の方法が分化のタイミングに関してまだ完全に最適化されていない可能性が浮き彫りになっている。
株間の一貫性を高め、バッチ間のばらつきを最小限に抑えるために、分化手順のロバスト性を更に高める継続的な必要性も存在している９。これは、疾患モデリング若しくは創薬の取り組みにおいて複数のｉＰＳＣ株を扱う場合、又は、免疫学的観点から同種ＥＳＣ株よりも好ましい可能性がある患者固有の自己ｉＰＳＣ株若しくは多数のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が一致するドナーｉＰＳＣの臨床用途を考慮した場合に、特に重要である１０，１１。ｍＤＡニューロンのインビトロ誘導は多段階プロセスであり、発生シグナル伝達経路の時限的活性化及び／又は非活性化を用いてｈＰＳＣのｖＭＢ領域アイデンティティを有する前駆細胞への分化を指示し、培養中又はＰＤの動物モデルへの移植後に機能的に成熟したｍＤＡニューロンに分化させることができる。１，１２，１３二重ＳＭＡＤ阻害（ｄＳＭＡＤｉ）と称される方法によるＢＭＰ及びＴＧＦβシグナル伝達の阻害は、ｈＰＳＣが代替の体細胞又は胚外運命の選択肢を選択するのを防ぐことによって、一般的な神経運命を促進するように展開される１４。パターン形成信号が存在しない場合、ＮＳＣはデフォルトで皮質前脳（ＦＢ）運命を獲得する。現在のｍＤＡニューロンのプロトコルは、ＷＮＴシグナル伝達、又はＷＮＴ及びＦＧＦシグナル伝達の時限的活性化を利用して、中脳（ＭＢ）と後脳（ＨＢ）との間の境界で峡部オーガナイザーによって生成されるＷＮＴ１及びＦＧＦ８ｂのパターン形成活性を模倣することによってＭＢの特徴を特定する１５。ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達は、次に、細胞を腹側化し、ｍＤＡニューロン前駆細胞に特徴的なＬＭＸ１Ａ＋／ＦＯＸＡ２＋／ＯＴＸ２＋ｖＭＢアイデンティティを誘導するために適用される１２，１３。グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１は、ＷＮＴ経路を活性化するために適用される。ＣＨＩＲ９９０２１による前後方向（ＡＰ）のアイデンティティの特異化は非常に正確であり、パターン形成効果は濃度の影響を受けやすく、ＣＨＩＲ９９０２１の増加が徐々により尾側の運命をもたらすことを意味する１６。異なる細胞株は、適用される濃度に対して異なる反応を示し、個々のｈＰＳＣ株のために慎重な滴定を必要とする９。そのため、中脳運命を特定するために正確なＣＨＩＲ９９０２１濃度への依存を回避する分化パラダイムの開発は、潜在的にロバスト性を高め、バッチ間の調整の必要性を減らすことができる。更に、ｍＤＡニューロンを生成するタスクは達成され得るが、高濃度のＣＨＩＲ９９０２１は、ＧＳＫ３βに加えて様々なキナーゼを阻害し１７、ＣＨＩＲ９９０２１の使用を回避する分化戦略を検討する別の動機を提供する１８。
峡部オーガナイザーは、吻側神経板の脳領域への領域化が開始された後に確立される二次シグナル伝達中枢である１９。したがって、初期の脳のパターン形成には、ＷＮＴ１及びＦＧＦ８ｂの上流で動作するシグナルが関与している必要があり、いくつかの観察結果は、ビタミンＡ誘導体であるレチノイン酸（ＲＡ）がこのプロセスに寄与し得ることを示唆している。ＨＢ及び脊髄のパターン形成におけるＲＡの役割は十分に確立されており１５、一般に、ＲＡシグナル伝達は、ＣＮＳのより吻側に由来するニューロンの誘導とは適合しないと考えられている。したがって、ＲＡ又はビタミンＡは、多くのｈＰＳＣベースのｍＤＡニューロンのプロトコルで積極的に排除されている９。しかしながら、驚くべきことに、本研究では、ＳＨＨシグナル伝達の活性化と組み合わせた４８時間のＲＡパルスが、インビトロで機能的ｍＤＡニューロンに迅速に分化し、ＰＤのラットモデルへの移植後に生着して運動障害を回復する、ｈＰＳＣ由来のｖＭＢ前駆細胞を特定するのに十分であることを示す。
結果
４８時間のＲＡパルスは、ｈＰＳＣから中脳様アイデンティティを発現するＮＳＣへの迅速な変換を促進する
ｄＳＭＡＤｉに応答して神経運命をとるように指示されたｈＥＳＣに対するＲＡの活性を調査するために１４、分化の最初の１日間、２日間、３日間、又は４日間、培養物を２００ｎＭオールトランスＲＡで処理し（ＲＡ１Ｄ、ＲＡ２Ｄ、ＲＡ３Ｄ、ＲＡ４Ｄ）（図１ａ）、免疫ブロット法、定量的免疫細胞化学、ｑＰＣＲ、又はＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）により、様々な段階で細胞の運命及びアイデンティティをモニターした。以前の研究と一致して１４、多能性マーカーＯＣＴ４、並びに神経特異的マーカーＳＯＸ１及びＰＡＸ６の分析により、ｄＳＭＡＤｉのみの条件で増殖させた細胞は、ＯＣＴ４＋／ＳＯＸ１－／ＰＡＸ６－多能性状態からＯＣＴ４－／ＳＯＸ１＋／ＰＡＸ６＋ナイーブなＮＳＣ状態へと徐々に移行したことが明らかになった。定量的免疫細胞化学によって明らかになったように、ＯＣＴ４は徐々に下方制御され、分化条件の５日目（ＤＤＣ）までに検出不能なレベルに近づいた（図１ｃ）。低レベルでのＳＯＸ１及びＰＡＸ６の誘導は３ＤＤＣに起こった（図１ｂ）。３～４ＤＤＣにＯＣＴ４及びＳＯＸ１が細胞によって共発現され（図１ｂ、図１ｃ；図７ａ（補足図１ａ））、ｄＳＭＡＤｉ処理に応答したｈＰＳＣのＮＳＣへの変換が、多能性遺伝子と神経特異的遺伝子の発現が重複する長期の時間枠を包含することが示される。対照的に、ｄＳＭＡＤｉ及び２００ｎＭ ＲＡで２日以上処理した培養物（ｄＳＭＡＤｉ＋ＲＡ２Ｄ，３Ｄ）（図１ａ）では、２ＤＤＣにＳＯＸ１及びＰＡＸ６の誘導が観察され（図７ａ（補足図１ａ））、ＯＣＴ４の発現は、３ＤＤＣまでに本質的に消滅していた（図１ｂ、図１ｃ、図１ｆ；図７ａ（補足図１ａ））。３～４ＤＤＣの核におけるＳＯＸ１及びＰＡＸ６の発現レベルも、ｄＳＭＡＤｉのみの培養物と比較してｄＳＭＡＤｉ＋ＲＡ２Ｄ培養物で著しく高かった（図１ｂ、図１ｃ；図７ａ（補足図１ａ））。７ＤＤＣまでに、ＳＯＸ１及び神経マーカーＮＥＳＴＩＮは、ｄＳＭＡＤｉのみの培養物及びｄＳＭＡＤｉ＋ＲＡ２Ｄ培養物において同様のレベルで発現した（図１ｄ）。２ＤＤＣのｄＳＭＡＤｉ＋ＲＡ２Ｄ培養物のＲＮＡ－ｓｅｑ分析により、多能性遺伝子の全体的な下方制御及び神経系統特異的遺伝子の上方制御が示唆された（図１ｅ）。内胚葉又は中胚葉系統マーカーは発現しなかった（図７ｂ（補足図１ｂ））。ｄＳＭＡＤｉ＋ＲＡ２Ｄ条件では、５０～５００ｎＭのＲＡの濃度範囲内で、ＯＣＴ４の素早い抑制及びＳＯＸ１の迅速な上方制御が達成された（図１ｇ）。細胞を２００ｎＭ ＲＡで１日処理しても（ｄＳＭＡＤｉ＋ＲＡ１Ｄ）、迅速なＯＣＴ４抑制又はＳＯＸ１の迅速な上方制御を促進するのに十分ではなく（図１ｆ）、ＲＡのみで細胞を処理しても（ｄＳＭＡＤｉなし）同様であった（図７ｃ）（補足図１ｃ））。したがって、ｄＳＭＡＤｉ処理と４８時間以上のＲＡへのｈＰＳＣの曝露とを組み合わせることで、多能性からＮＳＣ状態への迅速かつスイッチ様移行が促進される。
様々な時間枠でＲＡに曝露されたｈＰＳＣ由来ＮＳＣの領域アイデンティティを決定するために、転写因子（その発現が単独で又は組み合わさってＦＢ、ＭＢ、又はＨＢの領域アイデンティティを区別する）の発現について９ＤＤＣに培養物を分析した。ｄＳＭＡＤｉ処理は、以下の全ての実験に含まれており、実験の設定を説明する際に更には強調されない。予想通り、ＲＡに曝露されていないｈＰＳＣ培養物（ＲＡ０Ｄ）において、ＮＳＣは、ＦＯＸＧ１＋／ＯＴＸ２＋／ＨＯＸＡ２－ＦＢ様アイデンティティを獲得した（図１ｈ）。ＦＯＸＧ１＋細胞の数は多少減少したものの、同様のＦＢ様特徴がＲＡ１Ｄ培養物に観察された（図１ｈ；図７ｄ（補足図１ｄ））。興味深いことに、ＲＡ２Ｄ培養物において、ＦＢマーカーが抑制され、代わりにＮＳＣがＦＯＸＧ１－／ＯＴＸ２＋／ＨＯＸＡ２－ＭＢ様特徴を発現した（図１ｈ；図７ｄ（補足図１ｄ））。ＲＡ３Ｄ及びＲＡ４Ｄ培養物において、ＮＳＣは、ＦＯＸＧ１－／ＯＴＸ２－／ＨＯＸＡ２＋／ＨＯＸＢ４－吻側ＨＢ及びＦＯＸＧ１－／ＯＴＸ２－／ＨＯＸＡ２＋／ＨＯＸＢ４＋尾側ＨＢアイデンティティをそれぞれ獲得した（図１ｈ）。これらのデータは、４８時間のＲＡパルスがＦＢ運命を抑制し、ｈＰＳＣ由来ＮＳＣにＭＢ様アイデンティティを課すことを示唆している（図１ｉ）。
ＲＡとＳＨＨシグナル伝達の活性化とを組み合わせることにより、ｈＰＳＣ由来ＮＳＣに腹側中脳アイデンティティを課す
次に、ＤＤＣ０～９にスムーズンドアゴニストＳＡＧ２５で培養物を処理することにより、Ｓｈｈシグナル伝達を活性化してＮＳＣに腹側アイデンティティを課し、様々な時間枠でＲＡに曝露された細胞の運命を免疫細胞化学又はバルクＲＮＡ－ｓｅｑによって分析した（図２ａ）。９ＤＤＣに、ＳＡＧのみ又はＲＡ１Ｄ＋ＳＡＧ条件で生成されたＮＳＣは、ＦＢ特異的マーカーＦＯＸＧ１、ＳＩＸ３、ＳＩＸ６、及びＬＨＸ２（図２ｂ）と、腹側終脳及び間脳の選択マーカーである腹側マーカーＮＫＸ２．１（図２ａ、ｂ）とを発現した２６，２７。ＲＡ２Ｄ＋ＳＡＧ培養物において、ＦＢマーカーが抑制され、ＮＳＣは、ｖＭＢのｍＤＡニューロン前駆細胞に特徴的なＬＭＸ１Ａ＋／ＬＭＸ１Ｂ＋／ＦＯＸＡ２＋／ＯＴＸ２＋アイデンティティをとった（図２ａ、ｂ、ｄ）。ＲＡ３Ｄ＋ＳＡＧ又はＲＡ４Ｄ＋ＳＡＧ培養物において、細胞は、ＨＯＸ遺伝子と、ＨＢ２８の頭蓋運動ニューロン（ＭＮ）前駆細胞に典型的な腹側マーカーＮＫＸ２．２、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＮＫＸ６．１、及びＮＫＸ６．２とを発現した（図２ａ、図２ｂ、図２ｄ；データは示さず）。ＲＮＡ－ｓｅｑトランスクリプトームデータの主成分分析及び階層的クラスタリング分析は、様々な時間枠でＲＡに曝露された細胞間で差次的発現遺伝子の明確な分離と広範な転写変化を示した（図２ｃ；図８ａ（補足図２ａ））。まとめると、これらのデータは以下を示している：第１に、ＲＡ曝露持続期間の増加は、ｈＰＳＣ由来ＮＳＣに徐々により尾側領域の脳アイデンティティ（ＦＢ－＞ＭＢ－＞ＨＢ）を課す（図１ｉ）、第２に、ＳＨＨ経路の活性化と組み合わせた場合、４８時間のＲＡによる処理は、ＬＭＸ１Ａ＋／ＦＯＸＡ２＋／ＯＴＸ２＋ｖＭＢ様アイデンティティをＮＳＣに課すのに十分であると考えられる（図８ｅ（補足図２ｅ））。ｖＭＢＮＳＣアイデンティティの効果的な誘導には、４８時間のＲＡパルスを０～２ＤＤＣに開始する必要があり（図８ｂ（補足図２ｂ））、ＳＡＧ処理は５０ｎＭ以上の濃度で≧０又は１ＤＤＣに開始する必要があった（図８ｃ、図８ｄ（補足図２ｃ、ｄ））。
ＮＣＳのＬＭＸ１Ａ＋／ＬＭＸ１Ｂ＋／ＦＯＸＡ２＋／ＯＴＸ２＋アイデンティティは、長い間、ｍＤＡニューロンを生成するｖＭＢ前駆細胞に特異的な分子的特徴であると考えられていたが、このアイデンティティは、視床下核（ＳＴＮ）ニューロンを生じる尾側間脳の腹側前駆細胞によっても共有されていることが後に示された。２９，２７（図２ｄ）。ＢＡＲＨＬ１、ＢＡＲＨＬ２、ＰＩＴＸ２、及びＮＫＸ２．１は、ＳＴＮ系統によって選択的に発現されるため、間脳性ＳＴＮ前駆細胞とｖＭＢ前駆細胞とを区別するために使用することができる２７。１４ＤＤＣのＲＡ２Ｄ＋ＳＡＧ培養物の分析は、ＬＭＸ１Ａ＋細胞の大部分が、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、及びＬＭＸ１Ｂ、並びにｖＭＢマーカーであるＣＯＲＩＮを共発現することを示した３０（図２ｇ）。この段階で、細胞のサブセットが有糸分裂後ｍＤＡニューロンの初期マーカーであるＮＵＲＲ１の発現を開始した（図２ｇ）３１。ＲＮＡ－ｓｅｑデータにより、ＢＡＲＨＬ１、ＢＡＲＨＬ２、ＰＩＴＸ２、及びＮＫＸ２．１のごくわずかな発現（図２ｅ）、並びにＮＫＸ２．１、ＰＩＴＸ２又はＢＡＲＨＬ１を共発現する稀なＬＭＸ１Ａ＋又はＬＭＸ１Ｂ＋ＮＳＣ（図２ｇ）が明らかになった。ＮＫＸ２．２、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＨＯＸ２Ａ、及びＮＫＸ６．１の単独での又は組み合わせた発現は、腹側ＨＢ２８，３２の頭蓋運動ニューロン（ＭＮｓ）及びセロトニン作動性ニューロン、又はＭＢのｍＤＡニューロンの外側に由来する眼球運動ニューロン３３及びＧＡＢＡ作動性ニューロン３４を生じる前駆細胞を定義する（図２ｄ）。ＲＮＡ－ｓｅｑデータは、ＲＡ２Ｄ＋ＳＡＧ培養物中のこれらのマーカーの発現が低いことを明らかにし（図２ｅ）、免疫細胞化学によって決定されるように、１４ＤＤＣにはＮＫＸ２．２、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＮＫＸ６．１を発現する細胞はほとんどなかった（図２ｇ）。したがって、４８時間のＲＡパルス及びＳＡＧに曝露されたｈＰＳＣ由来ＮＳＣの大多数は、ＬＭＸ１Ａ＋／ＬＭＸ１Ｂ＋／ＦＯＸＡ２＋／ＯＴＸ２＋ｖＭＢアイデンティティを発現し、隣接する間脳領域、ＨＢ領域、又は外側ＭＢ領域アイデンティティを発現する細胞の混入はほとんど見られない。同様の結果が、２つのｈＥＳＣ系統及び２つのｈｉＰＳＣ系統で達成された（図８ｅ（補足図２ｅ））。
峡部オーガナイザーから発せられるＷＮＴ１及びＦＧＦ８シグナル伝達は、ＥＮ１及びＥＮ２の段階的発現を尾側ＭＢ及び吻側ＨＢに課す３５，３６。ＷＮＴ１、ＥＮ１、ＥＮ２、又はＦＧＦ８は、１４ＤＤＣに非常に低いレベル又は検出不能なレベルで発現した（図２ｅ）。また、峡部マーカーＰＡＸ２、ＰＡＸ５、及びＰＡＸ８は、無視できるレベルで発現した（図２ｅ）。ＣＨＩＲ９９０２１による古典的ＷＮＴシグナル伝達の活性化は、βカテニンの核への転座に関連しており１２，１８（図２ｆ）、ＲＡ処理に応答して核内にβカテニンが蓄積することはなかった（図２ｆ）。総合すると、これは、ＲＡ及びＳＡＧによって特定されたＬＭＸ１Ａ＋／ＦＯＸＡ２＋／ＯＴＸ２＋ＮＳＣが、吻側ＭＢを連想させるアイデンティティを獲得し、ｖＭＢ運命の特異化が、ｈＰＳＣ培養物におけるＷＮＴ１発現又は峡部オーガナイザー様細胞の誘導とは無関係に発生することを示している。
ＣＹＰ２６Ａ１を介した自己強化型ＲＡ分解は、ロバストなｖＭＢパターン形成応答を提供する。
ＲＡの濃度変化に対する分化手順の感度を決定するために、ＲＡ２Ｄ＋ＳＡＧ条件で細胞を培養し、ＲＡの濃度を１００～８００ｎＭの範囲で変化させ、９ＤＤＣにＮＳＣのアイデンティティを分析した。２００～４００ｎＭ ＲＡに曝露された培養物において、大多数のＮＳＣがＬＭＸ１Ａ＋／ＮＫＸ２．１－ｖＭＢアイデンティティを発現し、間脳性ＬＭＸ１Ａ＋／ＮＫＸ２．１＋アイデンティティ又はＮＫＸ２．２を発現する細胞はほとんどなかった（図３ａ、ｃ）。ＲＡ濃度を１００ｎＭに低下させるか、又は８００ｎＭ ＲＡに上昇させると、ＬＭＸ１Ａ＋／ＮＫＸ２．１－ＮＳＣが生成されたが、数はより少なかった（図３ｃ）。したがって、ｖＭＢアイデンティティの効果的な誘導は、比較的広い範囲のＲＡ濃度内で達成される。ＣＨＩＲ９９２２１を使用してｖＭＢアイデンティティを特定したとき９，２９、ＮＳＣは、１μＭ ＣＨＩＲ９９２２１に応答してＬＭＸ１Ａ＋／ＮＫＸ２．１－アイデンティティを達成したが、ＮＳＣの領域アイデンティティは、濃度を０．８及び０．６μＭに低下させると間脳性ＬＭＸ１Ａ＋／ＮＫＸ２．１＋特徴にシフトし、一方で、濃度を１．２及び１．４μＭに上昇させると、細胞は徐々にＮＫＸ２．２＋／ＬＭＸ１Ａ－推定ＨＢアイデンティティをとった（図３ｂ、ｃ）。これらのデータは、ＲＡによるＬＭＸ１Ａ＋／ＮＫＸ２．１－ＮＳＣの特異化がＣＨＩＲ９９０２１と比較して濃度の影響を受けにくいことを示しており、絶対的なＲＡレベルではなく、ＲＡ曝露の時間枠がｖＭＢ特異化の重要なパラメータであることを示唆している。
ＣＹＰ２６ファミリーの遺伝子（ＣＹＰ２６Ａ１、ＣＹＰ２６Ｂ１、ＣＹＰ２６Ｃ１）は、酸化によってＲＡを代謝するシトクロムｐ４５０ファミリーの酵素をコードする３７。ＣＹＰ２６Ａ１は、最も吻側の神経外胚葉によって発現され、神経発生の初期段階でＨＢアイデンティティの吻側への拡張を防ぐのに寄与する２１。また、ＨＢのＡＰパターン形成では、ＣＹＰ２６タンパク質の誘導を介した自己強化型分解によるＲＡシグナル伝達の負のフィードバック制御は、ＲＡ勾配を形成し、ＲＡレベルの変動を緩和するために重要である３８，３９。ｈＰＳＣ培養物において、ＣＹＰ２６Ａ１のＲＡ濃度依存的活性化及び適応的な時間的発現が見られた（図３ｄ、図３ｅ）。ＲＡ入力の変化がＣＹＰ２６Ａ１によるＲＡターンオーバーの速度における一致する変化によって緩和され得るため、これはＲＡに対する細胞のロバストなパターン形成応答に妥当な機構原理を提供する。これを調査するために、０～３ＤＤＣに選択的アンタゴニストＲ１１５８６６４０でＣＹＰ２６活性を阻害した後、９ＤＤＣにＲＡ処理したｈＰＳＣの運命を調べた。５００ｎＭ Ｒ１１５８６６で処理したＲＡ１Ｄ＋ＳＡＧ又はＲＡ２Ｄ＋ＳＡＧ培養物において、細胞は、それぞれＮＫＸ２．１＋ＦＢアイデンティティ又はＬＭＸ１Ａ＋／ＮＫＸ２．１－ｖＭＢアイデンティティの代わりに、ＰＨＯＸ２Ｂ＋ＨＢアイデンティティを獲得した（図３ｆ）。ＨＯＸＡ２及びＨＯＸＢ４がこれらの実験で誘導され、ＣＹＰ２６機能が無傷のままである場合、４日間のＲＡ曝露後に獲得された領域アイデンティティに対応する尾側ＨＢアイデンティティが示唆される（図３ｇ；データは示さず）（図１ｈ）。Ｒ１１５８６６の濃度を１００ｎＭに低下させると、ＦＢ運命は抑制されたが、培養物にはＬＭＸ１Ａ＋／ＮＫＸ２．１－ｖＭＢ細胞とＰＨＯＸ２Ｂ＋ＨＢ細胞との混合物が含まれており（図３ｇ；図９ａ（補足図３ａ））、恐らくは、ＣＹＰ２６Ａ１の部分的な阻害が中間の尾側化効果をもたらすことを反映している。重要なことに、Ｒ１１５８６６及びＳＡＧのみによる細胞の処理は、ＮＫＸ２．１＋ＦＢ運命を抑制せず（図３ｆ）、Ｒ１１５８６６の強い尾側化効果がＲＡ依存性であることを立証している。
オールトランスＲＡと同様に、９－ｃｉｓ ＲＡ、１３－ｃｉｓ ＲＡ、及び生体異物ＲＡ類似体であるタザロテン酸（ＴＡ）は、ＣＹＰ２６によって媒介される酸化の基質である４１，４２。細胞を５００ｎＭのこれらの類似体に４８時間曝露すると、ＬＭＸ１Ａ＋／ＮＫＸ２．１－ｖＭＢアイデンティティが課されることによりオールトランスＲＡのパターン形成活性が模倣され（図３ｈ；図９ｂ（補足図３ｂ））、ＣＹＰ２６活性の阻害は、ＰＨＯＸ２Ｂ＋ＨＢアイデンティティへのシフトをもたらした（図３ｈ）。合成ＲＡ類似体であるＥＣ２３は、ＣＹＰ２６媒介性の酸化に耐性があると予測されており４３、オールトランスＲＡを２００ｎＭのＥＣ２３で置き換えた場合、ＥＣ２３１Ｄ＋ＳＡＧ又はＥＣ２３２Ｄ＋ＳＡＧ条件で増殖させた細胞は、ＣＹＰ２６の阻害の有無にかかわらずＰＨＯＸ２Ｂ＋ＨＢアイデンティティをとった（図３ｉ；図９ａ（補足図３ａ））。滴定実験は、ＥＣ２３がＬＭＸ１Ａ＋／ＮＫＸ２．１－ｖＭＢ細胞を誘導できることを示したが、これには２０倍の濃度低下と、わずか２４時間の細胞の処理が必要なだけであった（図９ｃ（補足図３ｃ））。総合すると、これらのデータは、時限的なＲＡ曝露に応答したＡＰパターン形成出力が、対応するｈＰＳＣにおけるＣＹＰ２６Ａ１のＲＡ濃度依存的活性化に決定的に依存していることを立証し、パターン形成プロセスにおけるＲＡ入力の変化に対するロバスト性及び耐性を説明する機構原理を提供する（図３ｊ）。
インビトロで成熟した機能的特性を示すｍＤＡニューロンの迅速な誘導
ｍＤＡニューロンの独自の特徴は、それらが最初はＭＢの腹側正中線にある非ニューロン床板（ＦＰ）細胞に由来し、前駆細胞が、ニューロンに分化する前にニューロンの潜在能力を獲得する必要があるということである３０，４４。これらの状態を区別するマーカーはほとんど存在しないが、経時的なＳＨＨの下方制御及び前神経ｂＨＬＨタンパク質の上方制御は、この移行と相関している４４。９、１２、１４、及び２１ＤＤＣに単離されたＲＡ２Ｄ＋ＳＡＧ処理細胞のＲＮＡ－ｓｅｑ分析は、汎ＦＰマーカーであるＳＨＨ、ＣＯＲＩＮ、ＡＲＸ、ＶＴＮ、ＦＥＲＤ３Ｌ、ＳＬＩＴ２、ＳＵＬＦ２、及びＡＬＣＡＭの発現が、約１２ＤＤＣにピークに達し、その後減少したことを示し（図４ａ；図１０ａ（補足図４ａ））、免疫細胞化学分析により、２１ＤＤＣと比較して１４ＤＤＣにＳＨＨ発現がより高いことが確認された（図４ｂ）。逆に、前神経ｂＨＬＨタンパク質をコードするＮＥＵＲＯＧ２、ＮＥＵＲＯＤ４、及びＡＳＣＬ１は、ｍＤＡニューロンマーカーＮＲ４Ａ２（ＮＵＲＲ１）及びＴＨ、並びに汎ニューロンマーカーＤＣＸ、ＴＵＢＢ３、ＳＴＭＮ２、及びＤＬＫ１と同様に、２１ＤＤＣに上方制御された（図４ａ）。免疫細胞化学分析により、神経新生の早期開始を示すＤＤＣ１２のＴｕＪ１＋ニューロンの存在が明らかになり（図１０ｂ（補足図４ｂ））、ＤＤＣ１４～２１間にＨｕＣＤ＋ニューロンの漸進的な蓄積が見られた（図４ｃ、ｄ）。２１ＤＤＣのＲＡ２Ｄ＋ＳＡＧ培養物では、ＤＡＰＩ＋細胞の約３０％がＨｕＣＤ＋ニューロンを占め（図４ｄ）、これらの多くがＴＨの発現を開始していた（図４ｃ）。代わりにＣＨＩＲ９９０２１＋ＳＡＧを使用してＬＭＸ１Ａ＋／ＮＫＸ２．１－ｖＭＢ前駆細胞を特定すると（図３ｂ）、細胞は約ＤＤＣ１７に神経新生を開始したが（図４ｃ、ｄ）、これは以前の研究と一致している９，１３。２１ＤＤＣには、ＨｕＣＤ＋ニューロンが全細胞の約１０％を構成し、ＴＨを発現するニューロンはほとんどなかった（図４ｃ、図４ｄ）。ＣＨＩＲ９２２１１＋ＳＡＧ処理培養物を、９～１６ＤＤＣにＦＧＦ８ｂ処理で補完した場合、同様の結果が得られた９，２９（図４ｃ）。これは、ＲＡ及びＳＡＧに応答して特定されたｖＭＢ前駆細胞が、早期に神経新生を開始し、速いペースでニューロンを生成することを示しており、集団レベルの細胞がＦＰ状態から神経原性状態への早期かつ比較的同期された変換を受けることが示される。
ＴＨ＋ニューロンは、３０～４５ＤＤＣに、ＲＡ２Ｄ＋ＳＡＧ培養物において、ＴＨ＋軸索突起の漸進的な成長を伴う、徐々により高度なニューロン形態を獲得した（図４ｅ、図４ｇ、図４ｈ；図８ｆ（補足図２ｆ））。ＴＨ＋ニューロンは、３０～３５ＤＤＣに、ｍＤＡニューロンマーカーＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ、ＦＯＸＡ２、ＮＵＲＲ１、及びＯＴＸ２を発現した（図４ｅ）。ＴＨ＋ニューロンのごく一部が、４０ＤＤＣにＥＮ１の発現を開始した（図１０ｃ（補足図４ｃ））にもかかわらず、ＲＡは初期前駆段階でＥＮ１を誘導しなかった（図２ｅ）。ＴＨ＋ニューロンは、成熟ニューロンマーカーＳＹＮＡＰＴＯＰＨＹＳＩＮ及びモノアミン作動性マーカーＶＭＡＴ２も発現した（図４ｆ）。細胞のサブセットは、ｍＤＡニューロンのＡ９様サブタイプ及びＡ１０様サブタイプの両方の存在を示すＧＩＲＫ２又はＣＡＬＢＩＮＤＩＮを発現した４５（図４ｆ）。３５ＤＤＣには、約８０％のニューロンがＴＨ＋を発現し、これは全ＤＡＰＩ＋細胞の約６５％に相当するものであった（図４ｉ、図４ｊ）。約１０％のニューロンがＧＡＢＡを発現し（図４ｉ、図４ｊ）、これらの一部はＴＨを共発現した（図１０ｃ（補足図４ｃ））。５－ＨＴ又はＭＮマーカーＰＥＲＩＰＨＥＲＩＮを発現するまれなニューロンのみが検出された（図４ｉ、ｊ）。４２ＤＤＣの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析により、ニューロンは、ドーパミン（図４ｋ、ｌ）を生成及び放出するが、セロトニン（５－ＨＴ）又はノルアドレナリン（ＮＡ）（図４ｋ）を生成及び放出しないことが立証された。これにより、発生中の脳幹のｍＤＡニューロンに近接して生成されるニューロンサブタイプの混入がほとんどないｍＤＡニューロンの高収率が明らかになる。３５～４０ＤＤＣにＫｉ６７又はリン酸化ヒストンＨ３を発現した細胞はほとんどなく、細胞の長期培養後の有糸分裂活性が低いことが示された（図４ｉ）。インビトロでのｍＤＡニューロンの機能的成熟は、ｈＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンが自発活動電位、誘発活動電位、並びに電位依存性Ｎａ＋及びＫ＋電流を獲得する時間を決定することによってモニターすることができ、これらの特色は、現在の最先端のプロトコル７を使用したＦＡＣＳ濃縮ｍＤＡニューロンの６０日間の培養（２５＋３６日：選別前／選別後）後に達成されると以前に報告された。ＲＡ２Ｄ＋ＳＡＧで処理したｈＰＳＣ培養物では、３５ＤＤＣの電圧依存性Ｎａ＋及びＫ＋電流は低かったが、３８ＤＤＣには顕著に増加し、その後はほぼ一定レベルのままであった（図１０ｄ（補足図４ｄ））。自発活動電位（図４ｍ）と誘発活動電位（図４ｎ）の両方を示すニューロンは、４０ＤＤＣに記録することができた。これらのデータは、ＲＡに基づく分化が、培養４０日後に成熟した機能的特徴を示すｍＤＡニューロンの生成をもたらすことを示唆している（図４ｏ）。
ＰＤのラットモデルへの移植後、ＲＡによって特定される細胞が生着し、運動障害を逆転させる
ＲＡ２Ｄ＋ＳＡＧに応答して特定されたｖＭＢ前駆細胞のインビボ性能を決定するために、ＰＤの長期６－ヒドロキシドーパミン（６－ＯＨＤＡ）損傷ラットモデルにｖＭＢ調製物を移植した４６。１４ＤＤＣにｖＭＢ前駆細胞を単離し（図４ｏ）、以前に記載されたように２９（図１１ａ（補足図５ａ））、内側前脳束に事前の片側６－ＯＨＤＡ損傷を有する無胸腺（ヌード）ラットの線条体に移植した。移植の７ヶ月後、免疫組織化学分析により、９匹のラット全てが多数のＴＨ＋ニューロン（移植片当たり４３００±４７個のＴＨ＋ニューロン、図５ａ）を有する生存移植片を有していた事を示し、ヒトマーカーＨｕＮｕで共標識した（図５ｂ－ｃ；図１１ｂ（補足図５ｂ））。移植されたＴＨ＋ニューロンは、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ／Ｂ、ＰＩＴＸ３、及びＮＵＲＲ１を共発現し（図５ｄ～図５ｆ）、インビボでｍＤＡ表現型をとったことが示される。これらのサブセットは、Ａ９－ＤＡニューロンに富むマーカーであるＧＩＲＫ２も発現した（図５ｇ）。Ａ９アイデンティティは、周囲の背外側線条体を神経支配するＴＨ＋線維によって更に支持された（図１１ｃ（補足図５ｃ））。ＴＨ＋ニューロンの機能は、完全な機能回復を示すアンフェタミン誘発性回転及び足使用評価を用いて評価した（図５ｈ～ｊ）。総合すると、これらの結果は、ＲＡ２Ｄ＋ＳＡＧに応答して特定されたｈＰＳＣ由来のｖＭＢ前駆細胞が成功裏に生着し、機能的なｍＤＡニューロンに分化し、ＰＤの動物モデルにおいて、ＣＨＩＲ９９０２１ベースのパターン形成を介して生成された細胞と同じレベル及び程度まで運動障害を回復することを示している１３，２９。
考察
幹細胞研究の中心的な目的は、所望の細胞を一貫して高収率で産生する、単純かつロバストな分化技術の開発である５０。本研究では、ＲＡを利用してｈＰＳＣ由来ＮＳＣのＭＢ様特徴を特定する、ヒトｍＤＡニューロンの高収率誘導のためのロバストかつ高速な方法の概要を説明する。このアプローチは、ＷＮＴシグナル伝達から切り離されており、尾側化のレベルが濃度ではなく因子の送達期間によって設定されるため、一般的に使用されるＣＨＩＲ９９０２１によるパターン形成とは概念的に異なる。意外なことに、最初の４８時間のＲＡパルスが、多能性からＮＳＣ状態へのスイッチ様移行を促進し、同時にＭＢ様アイデンティティをＮＳＣに課すことを示す。ＳＨＨ経路の活性化と組み合わせると、ｖＭＢ前駆細胞が誘導され、インビトロで機能的なｍＤＡニューロンに迅速に分化することができ、ＰＤのラットモデルに移植された後、他のプロトコルで報告されているものと同様のレベルにドーパミン神経伝達を回復し、運動障害を緩和することができる１３，２９，５１，５２。
ＲＡ曝露の持続時間は、ｖＭＢ特異化の中心的なパラメータであり、細胞のパターン形成応答は、ＲＡ濃度の変化に対して著しく寛容であるが、これは自己強化型減衰と称されるフィードバック機構に起因するものであり得３９、それによってＲＡは、ＣＹＰ２６Ａ１の濃度依存的活性化による自身のターンオーバー速度を調製する。したがって、ＲＡが内因性の負のフィードバック調節を受ける天然の非タンパク質リガンドであるという事実は、分化手順にロバスト性を伝え、正確に定義された濃度で供給されなければならないパターン形成剤と比較して、バッチ変動及び取り扱い、並びにＰＳＣ株間の変動に対する感度を低下させる。これにより、バッチ間及び株間の調整の必要性が減少し、それによって、複数の患者由来のｉＰＳＣ株が使用される分化２，５３、及び多数の細胞が必要とされる場合のスケールアップの取り組みも大幅に促進される。これと一致して、通常であればパターン形成剤の再滴定を必要とする分化手順を一切調整することなく、４つの異なるｈＰＳＣ系統で同様の結果が得られた９。ＣＨＩＲ９９０２１は、ＧＳＫ３β１８の阻害を介してβカテニンの分解を防止するため、ＡＸＩＮ２５４によるＷＮＴ経路の負のフィードバック調節を短絡させると予測されることは注目に値し、このことは、ＣＨＩＲ９９０２１濃度に対するｖＭＢアイデンティティの感度を説明し得る。要約すると、ここで説明したように、正確な濃度ではなく時限的曝露を介して動作するパターン形成因子を使用すると、疾患モデリング、ハイスループット創薬、及び細胞置換療法のための定義された神経細胞サブタイプのロバストな特異化の新しい可能性が開かれる。
材料及び方法
ヒトＰＳＣの培養
ヒトＥＳＣ（ＨＳ９８０及び４０１、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｔ）及びｉＰＳＣ（ＳＭ５５、ＳＭ５６）を、ｉＰＳ－Ｂｒｅｗ ＸＦ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）中の組換えヒトビトロネクチン（ＶＴＮ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でコーティングされたプレートに維持した。細胞をＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）で継代し、播種後最初の２４時間、ＲＯＣＫ阻害剤を最終濃度１０μＭで培地に添加した。全ての細胞株は、マイコプラズマ汚染について陰性であった。
ヒトＰＳＣの分化
８０～９０％コンフルエントなＰＳＣ培養物をＰＢＳで２回すすぎ、ＥＤＴＡ（ＰＢＳ中０．５ｍＭ）で５～７分間処理し、ＰＢＳ中の単一細胞懸濁液に再懸濁した。細胞を４００ｇで遠心沈殿させ、５μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及び２．５μＭ ＤＭＨ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）（二重ＳＭＡＤ阻害）、並びに１０μＭ ＲＯＣＫ阻害剤（播種後最初の４８時間）を含むＮ２Ｂ２７培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２：Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（１：１）、０．５×Ｎ２及び０．５×Ｂ２７（＋ビタミンＡ）補充物、１×非必須アミノ酸、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ、５５μＭ β－メルカプトエタノール（全てＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に再懸濁した。細胞を、ＶＴＮ（２μｇ／ｃｍ２）及びフィブロネクチン（ＦＮ）（２μｇ／ｃｍ２）（Ｓｉｇｍａ）でコーティングされた表面に、ＲＡ及びＲＡ類似体に基づく実験では６０，０００～８０，０００細胞／ｃｍ２の密度で、ＣＨＩＲ９９０２１実験では２０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。ＳＡＧ１．３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＣＨＩＲ９９０２１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、オールトランスＲＡ、９－ｃｉｓ ＲＡ、１３－ｃｉｓ ＲＡ、タザロテン酸、Ｒ１１５８６６（全てＳｉｇｍａ）、ＥＣ２３（Ａｍｓｂｉｏ）を、結果の項目に記載される濃度及び時点で使用した。ｍＤＡニューロンの分化（図４の概略図を参照）のために、９ＤＤＣに、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｐａｓｓａｇｉｎｇ Ｔｏｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して神経前駆細胞を機械的に解離し、ＶＴＮ及びＦＮでコーティングされた表面上の１０μＭ ＲＯＣＫ阻害剤（解離後最初の４８時間）を含むＮ２Ｂ２７培地に１：３の比率で播種した。ドーパミン作動性ニューロンの最終インビトロ分化のために、細胞を２３又は２４ＤＤＣにＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で解離し、ＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＧＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、アスコルビン酸（０．２ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ）、１０μＭ ＲＯＣＫ阻害剤（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）（解離後最初の４８時間）、並びに１０μＭ ＤＡＰＴ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を補充したＢ２７＋培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中のＶＴＮ＋ＦＮ＋ラミニン（各２μｇ／ｃｍ２）（Ｓｉｇｍａ）でコーティングされた表面に播種した。電気生理学及び神経伝達物質含有量分析のために、ＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＧＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、アスコルビン酸（０．２ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ）及び１０μＭ ＲＯＣＫ阻害剤（解離後最初の４８時間）を補充したＢ２７ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、実験の少なくとも５日前に細胞を増殖させた。培地はルーチン的に２～３日ごとに交換した。
免疫細胞化学及び免疫組織化学
ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで細胞を１２分間室温（ＲＴ）で固定し、ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を含むＰＢＳ）で３回すすぎ、ブロッキング溶液（ＰＢＳ中の３％ＦＣＳ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００）で１時間、ＲＴでブロックした。次いで、細胞を一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートし、続いてフルオロフォア結合二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。一次抗体とフルオロフォア結合二次抗体の両方をブロッキング溶液に希釈した。使用した一次抗体は、補足表１に記載される。適切なＡｌｅｘａ（４８８、５５５、６４７）結合二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用した。
免疫組織化学は以前に記載されたように行われ２９、使用した一次抗体は補足表１に記載される。
Figure 2023525297000002
遺伝子発現解析
Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ Ｐｌｕｓキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、全ＲＮＡを単離した。Ｍａｘｉｍａ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｃＤＮＡを調製した。Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムのサーマルサイクラーで定量的リアルタイムＰＣＲを行った。遺伝子発現の解析は、２－ΔΔＣｔ法を用いて行われ、相対的な遺伝子発現をＧＡＰＤＨ転写レベルに対して正規化した。プライマーは、補足表２に記載される。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＲＮＡシーケンシングでは、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ ６０００ Ｐｉｃｏチップ上でＲＮＡの完全性を決定した。ライブラリーの構築には、Ｐｏｌｙ－Ａ選択を備えたＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡキットを使用した。クラスタリングは「ｃＢｏｔ」によって行われ、「Ｓ１」モードのフローセルで「ＮｏｖａＳｅｑＸｐ」ワークフローを使用して、２×５１設定のＮｏｖａＳｅｑ６０００ （ＮｏｖａＳｅｑ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ １．６．０／ＲＴＡ ｖ３．４．４）でサンプルの配列決定を行った。Ｂｃｌ からＦａｓｔＱへの変換は、ＣＡＳＡＶＡソフトウェアスイートのｂｃｌ２ｆａｓｔｑ＿ｖ２．１９．１．４０３を使用して行った。読み取り値をヒトゲノムアセンブリにマッピングし、Ｔｏｐｈａｔ（ｖ２．０．４）を使用してＧＲＣｍ３８を構築した。遺伝子レベルの存在量は、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ（ｖ ２．１．１）５５を使用してＦＰＫＭとして推定した。更に、ＲパッケージｌｉｍｍａのＲＮＡ－Ｓｅｑ固有の関数セットを用いて、読み取りカウントデータを処理した。差次的発現は、関数ｖｏｏｍ、ｌｍＦｉｔ、ｅＢａｙｅｓ、及びｔｏｐＴａｂｌｅを使用して推定した。分散の推定値は、全てのサンプルを複製として扱い（ｄｅｓｉｇｎ＝ＮＵＬＬ）、更に正規化せずに（ｎｏｒｍａｌｉｚｅ．ｍｅｔｈｏｄ＝“ｎｏｎｅ”）、カウントからライブラリーサイズ（ｌｉｂ．ｓｉｚｅ＝ＮＵＬＬ）を取得することによって取得した。得られた差次的発現の倍率変化値は、ｐ値を伴っていた。次いで、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法５６によって誤検出率（ＦＤＲ）を計算することにより、後者を複数の試験用に調整した。
ヒートマップのプロット及びＰＣＡの視覚化は、「ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｖｉｎｅｔ．ｏｒｇ」５７のオンラインツールを使用して、Ｒパッケージｈｅａｔｍａｐｌｙ及び関数ｐｒｉｎｃｏｍｐの標準パラメータ設定をバックエンドとして用いて行った。
Figure 2023525297000003
ウエスタンブロット
プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で補完されたＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）に細胞を溶解し、氷上で３０分間振盪しながらインキュベートした。溶解物を遠心分離（２００００ｇ、４℃で２０分間）により清澄化し、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイによりタンパク質濃度を決定した。タンパク質溶解物を、２．５％２－メルカプトエタノールを含むＬＤＳ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に再懸濁し、９５℃で５分間変性させた。４～１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）のレーン当たり１５～３０μｇのタンパク質を負荷し、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ）に移した。膜をブロッキング溶液（０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳＴ）及び５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ）中で１時間、ＲＴでインキュベートした後、一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。室温のＴＢＳＴで３回洗浄した後、膜をＨＲＰ結合二次抗体とともにＲＴで１時間インキュベートした。ＨＲＰの検出は化学発光基質であるＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ基質によって行い、シグナルはＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で検出した。免疫ブロット法のための一次抗体は、補足表１に記載される。
ＨＰＬＣ
４２ＤＤＣ培養物中のノルアドレナリン（ＮＡ）、ドーパミン（ＤＡ）、及びセロトニン（５－ＨＴ）の濃度は、電気化学検出を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定した。
ｄＳＭＡＤｉ＋ＲＡ２Ｄ条件で分化させた４２ＤＤＣの培養物を、生理溶液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ；２．５ｍＭ ＫＣｌ；１ｍＭ ＭｇＣｌ２；１．８ｍＭ ＣａＣｌ２；ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）でｐＨ７．４に緩衝）又は高Ｋ＋溶液（５６ｍＭ Ｋ＋を含む生理溶液であり、Ｎａ＋イオンの濃度は、同じ総浸透圧を維持するように比例的に減少させた）中でインキュベートした。２０分後、インキュベーション溶液を回収し、神経伝達物質含有量の分析に使用した。細胞の神経伝達物質の含有量を決定するために、細胞をＨ２Ｏに溶解した。インキュベーション溶液及び細胞溶解物を０．１Ｍ過塩素酸で除タンパクし、氷上で１５分間インキュベーションした後、前述のように、サンプルを２００００ｇで１５分間二重遠心分離した５８。タンパク質濃度はＢＣＡ法で決定した。次いで、ＨＴＥＣ５００（Ｅｉｃｏｍ、Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）と、２０μｌループを備え、＋４℃で動作する、ＣＭＡ／２００冷却マイクロサンプラー（ＣＭＡ Ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）とからなるＨＰＬＣシステムでサンプルを分析した。グラッシーカーボン作用電極の電位は、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して＋４５０ｍＶであった。分離は、２００×２．０ｍｍ Ｅｉｃｏｍｐａｋ ＣＡＸカラム（Ｅｉｃｏｍ）で達成された。移動相は、メタノールと、４０ｍＭ塩化カリウムおびよ０．１３ｍＭ ＥＤＴＡ－２Ｎａを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）（３０：７０、ｖ／ｖ）との混合物であった。クロマトグラムは、コンピュータ化されたデータ取得システムＣｌａｒｉｔｙ（ＤａｔａＡｐｅｘ、Ｔｈｅ Ｃｚｅｃｈ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ）を使用して記録及び統合された。
電気生理学
３５～６０日齢のニューロンを含むスライド（ｎ＝２２スライド、ｎ＝４実験）を、電気生理学培地（Ｎｅｕｒａｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｅｌｅｃｔｒｏ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の記録チャンバーに入れた。記録のために、６０倍の対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を備えたＤＩＣ顕微鏡（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃａ、Ｕｃｋｆｉｅｌｄ，ＵＫ）を使用してニューロンを可視化した。Ｆｌａｍｉｎｇ／Ｂｒｏｗｎ型マイクロピペットプラーＰ－８７（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ、ＵＳＡ）で引っ張られたパッチピペット（電圧クランプ記録では抵抗３～５ＭΩ、電流クランプ記録では抵抗５～１０ＭΩ）に、電圧クランプ記録用の１５４ｍＭ ＮａＣｌ溶液、又は電流クランプ記録用の８ｍＭビオシチンを含む１２０ｍＭ ＫＣｌ溶液のいずれかを充填した。シグナルは、Ａｘｏｎ ＭｕｌｔｉＣａｌｍｐ ７００Ｂ増幅器で記録され、Ａｘｏｎ Ｄｉｇｉｄａｔａ １５５０Ｂデジタイザー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて２０ｋＨｚでデジタル化された。アクセス抵抗及びピペット静電容量が補正された。セルアタッチ状態での電圧クランプの記録を、低２Ｈｚ／高１ｋＨｚでバンドパスフィルター処理し、過分極後を示す事象を自発活動電位と見なした。スパイクパターンを評価するために、電流クランプモードで記録されたニューロンを－６０ｍＶの膜電位に保持した。閾値に近い電流ステップを適用して基電流を決定し、次いで、基電流に比例する１秒の電流ステップを適用した。ナトリウム電流の存在は、－６０ｍＶの保持から１０ｍＶの間隔でパルスを印加することにより、電圧クランプモードで決定した。電気特性は、カスタム作成されたＭａｔｌａｂ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ、Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，ＵＳＡ）スクリプトを使用して抽出した。記録後、スライドを固定し、上記のように染色して画像化した。ビオシチンは、ストレプトアビジンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で可視化した。
移植片の配置と行動解析
全ての動物手順は、欧州連合指令（２０１０／６３／ＥＵ）に従って行われ、実験動物の使用に関する地元の倫理委員会及びスウェーデン農務省（Ｊｏｒｄｂｒｕｋｓｖｅｒｋｅｔ）によって承認された。成体雌無胸腺「ヌード」ラットをＨａｒｌａｎ／Ｅｎｖｉｇｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｓｄ：ＲＨ－Ｆｏｘｎ１ｒｎｕ）から購入し、以前に記載されたように２９、１２時間の明／暗サイクル下で餌と水を自由に摂取できるように飼育した。
６－ヒドロキシドーパミン（６－ＯＨＤＡ）の片側注射による黒質線条体経路の全ての外科的処置及び損傷は、記載されているように行われた２９。損傷の重症度は、６－ＯＨＤＡ注射の４週間後に、自動化システム（Ｏｍｎｉｔｅｃｈ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）を使用して９０分間にわたって記録されたアンフェタミン誘発性回転によって測定した２９。アンフェタミン誘発性回転は、２．５ｍｇ／ｋｇ塩酸アンフェタミン（Ｓｉｇｍａ）の腹腔内注射によって誘発した。４週間後（６－ＯＨＤＡ損傷の８週間後）、以前に記載されたように２９、分化の１４日目に、１５０，０００細胞の用量のｈＥＳＣ由来ｖＭＢ前駆細胞を動物の線条体に移植し、移植の７ヶ月後にアンフェタミン誘発性回転を評価した。
６－ＯＨＤＡ損傷の４週間後及び移植の７ヶ月後に、自発的な足の使用の非対称性を、以前に記載されたようにガラスシリンダー内での探索行動として評価した２９。足の使用の優位性を、反対側のシリンダーへの接触として、合計のパーセントとして表した（左／（左＋右）×１００％）。
動物は、行動解析後に灌流され、免疫組織化学のために処理された。
統計分析
特に明記しない限り、値は平均±ＳＤとして示され、図中のアスタリスクは２つの群間のスチューデントのｔ検定からの有意性を示す。回転及びシリンダー行動解析では、ボンフェローニ補正による一元配置ＡＮＯＶＡ及びペアサンプルを用いたスチューデントのｔ検定が、それぞれ使用された。全ての数値について、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ＝非有意である。
実施例２―ＲＡ及びＣＨＩＲ９９０２１を用いた連続処理により、尾側中脳アイデンティティの特異化がもたらされる
中脳ドーパミンニューロンは、いくつかの異なるサブタイプを構成し、我々のＲＡベースのプロトコルは、ＰＤの動物モデルにおける運動障害を逆転させるのに十分な治療用Ａ９サブタイプのドーパミン作動性ニューロンを生成する。中脳ドーパミンニューロンサブタイプの特異化の根底にある機構は十分に解明されないままであるが、中脳の正中側面軸及び吻尾軸に沿った腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞のサブパターン形成が関与している可能性が高い（Ｂｒｉｇｎａｎｉ，Ｓ，ａｎｄ Ｐａｓｔｅｒｋａｍｐ，Ｒ．Ｊ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．１１，１－１８（２０１７））。中脳と後脳の境界で峡部オーガナイザーから発せられるＷＮＴ１シグナル伝達は、ホメオドメインタンパク質ＥＮ１及びＥＮ２の尾側ＨＩＧＨから吻側ＬＯＷへの発現勾配を誘導することにより、中脳前駆細胞の極性を吻尾軸に沿って確立する（Ｗｕｒｓｔ，Ｗ．ａｎｄ Ｂａｌｌｙ－Ｃｕｉｆ，Ｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２，９９－１０８（２００１））。ＲＡ２Ｄ＋ＳＡＧによって特定された腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞は、１４ＤＤＣに前駆細胞の吻側中脳特徴を示すＬＭＸ１Ａ＋／ＯＴＸ２＋／ＥＮ１アイデンティティを獲得し（図６Ａ）、４０ＤＤＣには、ＴＨ＋ドーパミンニューロンのごく一部がＥＮ１を発現した（図６Ｂ）。ＲＡ２Ｄ＋ＳＡＧ条件で増殖させた細胞を、４～９ＤＤＣに、５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（ＷＮＴシグナル伝達を活性化するために使用されるＧＳＫ３βキナーゼ阻害剤）の処理で補完すると、１４ＤＤＣにはＬＭＸ１Ａ＋／ＯＴＸ２＋細胞の大部分もＥＮ１を発現し（図６Ａ）、４０ＤＤＣにはＴＨ＋ドーパミンニューロンの大部分がＥＮ１を発現した（図６Ｂ）。これは、ＲＡ及びＣＨＩＲ９９０２１を用いたｈＰＳＣの分化の逐次的処理を適用して、腹側中脳ドーパミン前駆細胞のより尾側のＬＭＸ１Ａ＋／ＯＴＸ２＋／ＥＮ１＋アイデンティティを課すことができることを示しており、基本のＲＡ２Ｄプロトコルに対する微調整が、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を異なる領域アイデンティティへとサブパターン形成することができ、インビトロで又はインビボの移植後に生成されるドーパミン作動性ニューロンのＡ９サブタイプの相対的な割合に影響を与える可能性があることを示唆している。
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１５．Ｔａｏ，Ｙ．＆Ｚｈａｎｇ，Ｓ．－Ｃ．Ｎｅｕｒａｌ Ｓｕｂｔｙｐｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １９，５７３－５８６（２０１６）．
１６．Ｌｕ，Ｊ；Ｚｈｏｎｇ，Ｘ；Ｌｉｕ，Ｈ；Ｈａｏ，Ｌ；Ｔｚｕ－Ｌｉｎｇ Ｈｕａｎｇ，Ｃ；Ａｍｉｎ Ｓｈｅｒａｆａｔ，Ｍ；Ｊｏｎｅｓ，Ｊ；Ａｙａｌａ，Ｍ；Ｌｉ，Ｌ；＆Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４，８９－９５（２０１５）．
１７．Ｂａｉｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ａ ｆｕｒｔｈｅｒ ｕｐｄａｔｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４０８，２９７－３１５（２００７）．
１８．Ｔｏｌｅｄｏ，Ｅ．Ｍ．，Ｇｙｌｌｂｏｒｇ，Ｄ．＆Ａｒｅｎａｓ，Ｅ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＷＮＴ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐｒｏｇｒａｍｓ ｉｎｔｏ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７４，４７１６－４７２４（２０１７）．
１９．Ｇｉｂｂｓ，Ｈ．Ｃ．，Ｃｈａｎｇ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ａ．，Ｈｗａｎｇ，Ｗ．，Ｙｅｈ，Ａ．Ｔ．＆Ｌｅｋｖｅｎ，Ａ．Ｃ．Ｍｉｄｂｒａｉｎ－Ｈｉｎｄｂｒａｉｎ Ｂｏｕｎｄａｒｙ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ａｔ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｎｔ ａｎｄ Ｆｇｆ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．１１，１－１７（２０１７）．
２５．Ｆｒａｎｋ－Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｎｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．１，１－１９（２００２）．
２６．Ｅｒｉｃｓｏｎ，Ｊ．，Ｍｕｈｒ，Ｊ．，Ｊｅｓｓｅｌｌ，Ｔ．Ｍ．＆Ｅｄｌｕｎｄ，Ｔ．Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ：Ａ ｃｏｍｍｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｆｏｒ ｖｅｎｔｒａｌ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ａｌｏｎｇ ｔｈｅ ｒｏｓｔｒｏｃａｕｄａｌ ａｘｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３９，８０９－８１６（１９９５）．
２７．Ｋｅｅ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａ Ｃｌｏｓｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ Ｄｏｐａｍｉｎｅ ａｎｄ Ｓｕｂｔｈａｌａｍｉｃ Ｎｕｃｌｅｕｓ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｌｉｎｅａｇｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０，２９－４０（２０１７）．
２８．Ｐａｔｔｙｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｔｅｍｐｏｒａｌ ａｎｄ ｓｐａｔｉａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ａｎｄ ｓｅｒｏｔｏｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｐｏｏｌ ｏｆ ＣＮＳ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１７，７２９－３７（２００３）．
２９．Ｋｉｒｋｅｂｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｍａｒｋｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｇｒａｆｔ Ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈＥＳＣ－Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０，１３５－１４８（２０１７）．
３０．Ｏｎｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｆｌｏｏｒ ｐｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ ａｌｏｎｇ ａｎ ａｎｔｅｒｏｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｌｏｃａｔｉｏｎ：Ｍｉｄｂｒａｉｎ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ｏｒｉｇｉｎａｔｅ ｆｒｏｍ ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ ｆｌｏｏｒ ｐｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３４，３２１３－３２２５（２００７）．
３１．Ｚｅｔｔｅｒｓｔｒｏｍ，Ｒ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎ ａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｎｕｒｒ１－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６，２４８－５０（１９９７）．
３２．Ｄｉａｓ，Ｊ．Ｍ．，Ａｌｅｋｓｅｅｎｋｏ，Ｚ．，Ａｐｐｌｅｑｕｉｓｔ，Ｊ．Ｍ．＆Ｅｒｉｃｓｏｎ，Ｊ．Ｔｇｆβ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ＣＮＳ．Ｎｅｕｒｏｎ ８４，９２７－３９（２０１４）．
３３．Ｄｅｎｇ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｒｏｌｅｓ ｏｆ Ｌｍｘ１ａ，Ｌｍｘ１ｂ ａｎｄ Ｐｈｏｘ２ａ ｉｎ ｖｅｎｔｒａｌ ｍｉｄｂｒａｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３８，３３９９－３４０８（２０１１）．
３４．Ｋａｌａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｇａｔａ２ ｉｓ ａ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｓｔ－ｍｉｔｏｔｉｃ ｓｅｌｅｃｔｏｒ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｍｉｄｂｒａｉｎ ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３６，２５３－２６２（２００９）．
３５．Ｌｉｕ，Ａ．＆Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．Ｅａｒｌｙ ａｎｔｅｒｉｏｒ／ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｄｂｒａｉｎ ａｎｄ ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４，８６９－９６（２００１）．
３６．Ｈｙｎｅｓ，Ｍ．＆Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ａ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ａｎｄ ｓｅｒｏｔｏｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ＣＮＳ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．９，２６－３６（１９９９）．
３７．Ｔｈａｔｃｈｅｒ，Ｊ．Ｅ．＆Ｉｓｏｈｅｒｒａｎｅｎ，Ｎ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＣＹＰ２６ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｃｌｅａｒａｎｃｅ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．５，８７５－８６（２００９）．
３８．Ｗｈｉｔｅ，Ｒ．Ｊ．＆Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ，Ｔ．Ｆ．Ｈｏｗ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ：Ｃｙｐ２６ｓ ｉｎ ｈｉｎｄｂｒａｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２３７，２７７５－２７９０（２００８）．
３９．Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ，Ｔ．Ｆ．，Ｎｉｅ，Ｑ．＆Ｌａｎｄｅｒ，Ａ．Ｄ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｉｎ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．２２，５６２－５６９（２０１２）．
４０．Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｒ．Ｅ．，Ｐｕｔｚｋｅ，Ａ．Ｐ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｊ．Ｐ．，Ｍａｒｇａｒｅｔｈａ，Ｌ．＆Ｍｏｅｎｓ，Ｃ．Ｂ．Ｃｙｐ２６ ｅｎｚｙｍｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｐａｔｔｅｒｎ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｈｉｎｄｂｒａｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３４，１７７－１８７（２００７）．
４１．Ｆｏｔｉ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｚａｒｏｔｅｎｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ＣＹＰ２６Ａ１ ａｎｄ ＣＹＰ２６Ｂ１．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３５７，２８１－２９２（２０１６）．
４２．Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０，Ｐ４５０ＲＡＩ－２，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ａｌｌ－ｔｒａｎｓ－ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７，６４０３－８（２０００）．
４３．Ｌｏｐｅｚ－Ｒｅａｌ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｈｏｔｏｓｔａｂｌｅ ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｎｏｖｅｌ ｌｉｍｂ ａｎｄ ｆａｃｉａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｃｈｉｃｋ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｊ．Ａｎａｔ．２２４，３９２－４１１（２０１４）．
４４．Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｍｉｄｂｒａｉｎ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｃｅｌｌ １２４，３９３－４０５（２００６）．
４５．Ｒｅｙｅｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＧＩＲＫ２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ ａｎｄ ｖｅｎｔｒａｌ ｔｅｇｍｅｎｔａｌ ａｒｅａ．Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５２０，２５９１－２６０７（２０１２）．
４６．Ｇｒｅａｌｉｓｈ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ＥＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｓｈｏｗ ｓｉｍｉｌａｒ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｃｙ ｔｏ ｆｅｔａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｗｈｅｎ ｇｒａｆｔｅｄ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １５，６５３－６６５（２０１４）．
４７．Ｍａｒｋｌｕｎｄ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｔａｉｌｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．２３，５－１５（２０１４）．
４８．Ｖａｄｏｄａｒｉａ，Ｋ．Ｃ．，Ｓｔｅｒｎ，Ｓ．，Ｍａｒｃｈｅｔｔｏ，Ｍ．Ｃ．＆Ｇａｇｅ，Ｆ．Ｈ．Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ｉｎ ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ：ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｐａｔｉｅｎｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．３７１，１６１－１７０（２０１８）．
４９．Ｏｋａｔｙ，Ｂ．Ｗ．，Ｃｏｍｍｏｎｓ，Ｋ．Ｇ．＆Ｄｙｍｅｃｋｉ，Ｓ．Ｍ．Ｅｍｂｒａｃｉｎｇ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ５－ＨＴ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０，３９７－４２４（２０１９）．
５０．Ｚｅｌｔｎｅｒ，Ｎ．＆Ｓｔｕｄｅｒ，Ｌ．Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｈｕｒｄｌｅｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｒｏｍｉｓｅ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３７，１０２－１０（２０１５）．
５１．Ｃｈｅｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｇｒａｆｔｅｄ Ｈｕｍａｎ ＰＳＣ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １８，８１７－２６（２０１６）．
５２．Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｉＰＳ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｐｒｉｍａｔｅ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｄｅｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５４８，５９２－５９６（２０１７）．
５３．Ｔａｙｌｏｒ，Ｃ．Ｊ．，Ｐｅａｃｏｃｋ，Ｓ．，Ｃｈａｕｄｈｒｙ，Ａ．Ｎ．，Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｊ．Ａ．＆Ｂｏｌｔｏｎ，Ｅ．Ｍ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ａｎ ｉＰＳＣ ｂａｎｋ ｆｏｒ ＨＬＡ－ｍａｔｃｈｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｋｎｏｗｎ ｄｏｎｏｒ ａｎｄ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｈｌａ ｔｙｐｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １１，１４７－１５２（２０１２）．
５４．Ｊｈｏ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｗｎｔ／ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ／Ｔｃｆ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｘｉｎ２，ａ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２２，１１７２－８３（２００２）．
５５．Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ＲＮＡ－Ｓｅｑ ｒｅｖｅａｌｓ ｕｎａｎｎｏｔａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ａｎｄ ｉｓｏｆｏｒｍ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８，５１１－５（２０１０）．
５６．Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ，Ｙ．＆Ｈｏｃｈｂｅｒｇ，Ｙ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ Ｆａｌｓｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｏｗｅｒｆｕｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｊ．Ｒ．Ｓｔａｔ．Ｓｏｃ．Ｓｅｒ．Ｂ ５７，２８９－３００（１９９５）．
５７．Ｊｅｇｇａｒｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．ＥｖｉＮｅｔ：Ａ ｗｅｂ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｎｅｔｗｏｒｋ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｓｅｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４６，Ｗ１６３－Ｗ１７０（２０１８）．
５８．Ｙａｎｇ，Ｌ．＆Ｂｅａｌ，Ｍ．Ｆ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ ＨＰＬＣ－ＥＣＤ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７９３，４０１－１５（２０１１）．
５９．Ｂｒｉｇｎａｎｉ，Ｓ，ａｎｄ Ｐａｓｔｅｒｋａｍｐ，Ｒ．Ｊ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．１１，１－１８（２０１７）．
６０．Ｗｕｒｓｔ，Ｗ．ａｎｄ Ｂａｌｌｙ－Ｃｕｉｆ，Ｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２，９９－１０８（２００１）．

Claims (53)

  1. 幹細胞を腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞に分化させる方法であって、複数の幹細胞を有効量の少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と接触させることと、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む細胞集団への前記幹細胞の分化を引き起こすのに十分な条件下で前記幹細胞を培養することと、を含む、方法。
  2. 前記少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤が、神経幹細胞に対して腹側中脳アイデンティティを特定するのに有効である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞が、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）及びＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）を発現する、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
  4. 前記細胞集団が、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記細胞集団が、前記細胞集団を前記少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と最初に接触させてから、少なくとも７日後、例えば９～１６日後、例えば約１４日後に、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記方法が、インビトロ法である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記複数の幹細胞が、多能性幹細胞、複能性幹細胞、成体幹細胞（ＡＳＣ）等の非胚性幹細胞を含む群から選択され、前記複数の幹細胞が、ヒト（任意選択的に、前記ヒトは神経障害の症状を有する患者である）、げっ歯類、又は霊長類に由来する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む細胞集団への前記幹細胞の分化を引き起こすのに十分な条件下で前記幹細胞を培養することが、前記幹細胞を少なくとも１つのヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達の活性化剤と接触させることを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記少なくとも１つの前記ヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達の活性化剤が、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、インディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）、デザートヘッジホッグ（ＤＨＨ）、プルモルファミン、スムーズンドアゴニスト（ＳＡＧ）、例えば、ＳＡＧ １．３（Ｈｈ－１．３）、Ｈｈ－１．２、Ｈｈ－１．４、Ｈｈ－１．５、及びそれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む細胞集団への前記幹細胞の分化を引き起こすのに十分な条件下で前記幹細胞を培養することが、前記幹細胞を少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤、及び少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の阻害剤と接触させることを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤が、ＳＢ ４３１５４２及びＳＢ－５０５１２４を含む群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達の阻害剤が、ＤＭＨ－１、ＬＤＮ－１９３１８９、及びノギンを含む群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記幹細胞が、前記レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と約１～４日間、任意選択的に約１～３日間接触させられる、請求項１～１２のいずれか一項のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤が、前記複数の幹細胞と約１～４日間、任意選択的に約１～３日間接触した後、有効量で存在しない、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記幹細胞が、前記少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と同時に、前記少なくとも１つのヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達の活性化剤、前記少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤、及び前記少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の阻害剤と接触させられる、請求項８～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記幹細胞が、前記少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と接触させられる前に、前記少なくとも１つのヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達の活性化剤、前記少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤、及び前記少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の阻害剤と接触させられる、請求項８～１４のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記方法が、前記複数の幹細胞を、前記少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と同時にｗｉｎｇｌｅｓｓ（Ｗｎｔ）シグナル伝達の活性化剤と接触させることを含まない、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記方法が、前記複数の幹細胞を、前記少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と同時に線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーシグナル伝達の活性化剤と接触させることを含まない、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤が、レチノイン酸類似体、ＲＡＲαアゴニスト、ＲＡＲβアゴニスト、ＲＡＲγアゴニスト、及びＲＸＲアゴニストを含む群から選択される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤が、レチノイン酸、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）；ＡＭ ５８０；ＴＴＮＰＢ；Ｃｈ ５５；ＣＤ４３７；ＢＭＳ ９６１；ＢＭＳ ７５３；ＡＭ ８０；ＣＤ ２３１４；ＡＣ ２６１０６６；ＡＣ ５５６４９；ＣＤ １５３０；アダパレン；タザロテン酸；タザロテン；ＥＣ １９；ＥＣ２３；又はその機能的類似体、異性体、代謝産物、若しくは誘導体を含む群から選択される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤が、レチノイン酸、並びに９－ｃｉｓ ＲＡ及び１３－ｃｉｓ ＲＡ等のオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、並びにタザロテン酸を含む群から選択される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤が、外因性供給源に由来する、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記幹細胞の分化を引き起こすのに十分な条件下で前記幹細胞を培養して、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む細胞集団を生成することが、二次元及び／又は三次元細胞培養で行われる、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記細胞集団が、治療有効量の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む集団を、中脳ドーパミン作動性ニューロンに分化させることを更に含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記中脳ドーパミン作動性ニューロンが、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）、ＬＩＭホメオボックス転写因子１β（ＬＭＸ１Ｂ）、オルソデンティクルホメオボックス２（ＯＴＸ２）、核内受容体関連１（ＮＵＲＲ１）；ペアードライクホメオドメイン３（ＰＩＴＸ３）、ＧＩＲＫ２、小胞モノアミン輸送体（ＶＭＡＴ２）、シナプトフィジン、及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）のうちの１つ以上を発現する、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記分化した中脳ドーパミン作動性ニューロンを含む前記集団が、前記複数の幹細胞を前記少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と最初に接触させてから約３０～４０日以内に得ることができる、請求項２５又は２６に記載の方法。
  28. 前記複数の幹細胞を前記少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤と最初に接触させてから約３０～４０日以内に、全神経細胞集団が、少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の中脳ドーパミン作動性ニューロンを含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 候補薬物をスクリーニングする方法であって、（ａ）請求項１～２４のいずれか一項によって得ることができるか、若しくは得られる腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞の集団を提供すること、又は請求項２５～２８のいずれか一項によって得ることができるか、若しくは得られる分化した中脳ドーパミン作動性ニューロンの集団を提供することと、（ｂ）前記集団を前記候補薬物と接触させることと、（ｃ）前記細胞集団に対する前記候補薬物の効果を決定することと、を含む、方法。
  30. 以下の濃縮された集団を提供するための方法：
    ｉ．腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞（前記方法が、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法を実施することを含む）、又は
    ｉｉ．分化した中脳ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロン（前記方法が、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の方法を実施することを含む）。
  31. 請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法によって得られるか、又は得ることができる治療有効量の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む神経細胞集団であって、任意選択的に、前記細胞集団の少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％％、例えば少なくとも７５％、又は少なくとも８０％が、腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞である、神経細胞集団。
  32. 前記細胞集団の少なくとも約８０％が、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）、ＬＩＭホメオボックス転写因子１β（ＬＭＸ１Ｂ）及びオルソデンティクルホメオボックス２（ＯＴＸ２）を発現する、請求項３１に記載の神経細胞集団。
  33. 請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法によって得られるか、又は得ることができる治療有効量の中脳ドーパミン作動性ニューロンを含む分化した細胞集団であって、任意選択的に、全細胞の少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％％、例えば少なくとも７５％、又は少なくとも８０％が、中脳ドーパミン作動性ニューロンである、分化した細胞集団。
  34. 幹細胞を腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞に分化させるための、少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤の、使用。
  35. 幹細胞を腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞に分化させることが、請求項１～２４のいずれか一項に記載される通りである、請求項３４に記載の使用。
  36. 治療有効量の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む、単離された細胞集団。
  37. 前記細胞集団の少なくとも約８０％が、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）、ＬＩＭホメオボックス転写因子１β（ＬＭＸ１Ｂ）及びオルソデンティクルホメオボックス２（ＯＴＸ２）を発現する、請求項３６に記載の単離された細胞集団。
  38. 医療に使用するための、請求項３６に記載の、かつ／又は請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法によって得られるか、若しくは得ることができる、治療有効量の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む細胞集団を含む、医薬組成物。
  39. 薬学的に許容される担体、希釈剤及び／又は賦形剤を更に含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
  40. 移植のために調合される、請求項３８又は３９に記載の医薬組成物。
  41. インビトロで複数の幹細胞を腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞又は中脳ドーパミン作動性ニューロンに分化させるためのキットであって、
    －少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の活性化剤、
    －少なくとも１つのソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の活性化剤、
    －少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤、及び／又は
    －少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の阻害剤を含む、キット。
  42. 腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞又は中脳ドーパミン作動性ニューロンの複数のマーカーを更に含む、請求項４１に記載のキット。
  43. 請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法によって得られるか、又は得ることができる治療有効量の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞と、１つ以上のドーパミン作動性ニューロン系統特異的活性化剤及び／又は阻害剤と、を含む、キット。
  44. 医療に使用するための、請求項３６に記載の、かつ／又は請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法によって得られるか、若しくは得ることができる、治療有効量の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む、細胞集団。
  45. 対象における神経変性並びに／又は対象における中脳ドーパミン作動性ニューロンの喪失を特徴とする疾患及び／若しくは状態の治療又は予防に使用するための、請求項３６に記載の、かつ／又は請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法によって得られるか、若しくは得ることができる、治療有効量の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む、細胞集団。
  46. 対象における神経変性並びに／又は対象における中脳ドーパミン作動性ニューロンの喪失を特徴とする疾患及び／若しくは状態を治療又は予防するための方法であって、請求項３６に記載の、かつ／又は請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法によって得られるか、若しくは得ることができる、治療有効量の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む細胞集団を、前記対象における前記神経変性並びに／又は対象における前記中脳ドーパミン作動性ニューロンの喪失を特徴とする疾患及び／若しくは状態を治療又は予防するのに有効な量で前記対象に投与することを含む、方法。
  47. 対象における神経変性並びに／又は対象における中脳ドーパミン作動性ニューロンの喪失を特徴とする疾患及び／若しくは状態を治療又は予防するための薬物の製造のための、請求項３６に記載の、かつ／又は請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法によって得られるか、若しくは得ることができる、治療有効量の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む細胞集団の、使用。
  48. 前記対象が、少なくとも１つの神経学的症状を示し、前記神経学的症状が、安静時振戦、固縮、動作緩慢（ゆっくりとした動き）、並びに姿勢不安定性及び／又はバランスと協調運動障害を含む群から選択される、請求項４４及び４５のいずれか一項に記載の使用のための細胞集団、請求項４６のいずれか一項に記載の方法、又は請求項４７のいずれか一項に記載の使用。
  49. 前記対象が前記神経学的症状のうちの少なくとも１つの軽減を示す、請求項４８に記載の使用のための細胞集団、方法、又は使用。
  50. 前記腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む集団が、前記細胞集団のインビボ生着を可能にする条件下で、対象への移植によって投与される、請求項４４、４５、４８及び４９のいずれか一項に記載の使用のための細胞集団、請求項４６、４８及び４９のいずれか一項に記載の方法、又は請求項４７、４８及び５１のいずれか一項に記載の使用。
  51. 請求項３６に記載の、かつ／又は請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法によって得られるか、若しくは得ることができる、治療有効量の腹側中脳ドーパミン作動性前駆細胞を含む、細胞集団であって、それを必要とする対象への移植に使用するための、細胞集団。
  52. 前記対象が、パーキンソン病、パーキンソニズム症候群、アルツハイマー病、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症、ビンスワンガー病、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、重症筋無力症及びピック病を含む群から選択される神経変性疾患を有する、又はそのリスクがある、請求項４４、４５、４８～５１のいずれか一項に記載の使用のための細胞集団、請求項４６及び４８～５０のいずれか一項に記載の方法、又は請求項４７～５０のいずれか一項に記載の使用。
  53. 添付の明細書、実施例、及び図面を参照して、実質的に特許請求の範囲に記載される、分化の方法、使用のための集団、集団の使用、治療の方法、又はキット。
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