KR102625865B1 - 만능 세포를 분화시키는 방법 - Google Patents

만능 세포를 분화시키는 방법 Download PDF

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로렌 이. 리틀
웬 보 왕
나다니엘 에이. 엘리엇
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후지필름 셀룰러 다이내믹스, 인코포레이티드
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Abstract

일부 양태에서, 단일-SMAD 억제, 즉 단 하나의 SMAD 억제제를 사용한 SMAD 신호전달의 억제를 이용하여 만능 세포를 중뇌 도파민성 (DA) 신경 세포로 분화시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 단일-SMAD 억제는 만능 세포를 중뇌 DA 신경세포로 분화시키기 위한 뼈 형태형성 단백질 (BMP)에 대한 하나의 억제제를 이용한다.

Description

만능 세포를 분화시키는 방법{METHODS FOR DIFFERENTIATING PLURIPOTENT CELLS}
본 출원은 2016년 8월 16일에 출원된 미국 가특허출원 62/375,590호에 대한 이익을 주장하며, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 의약 분야에 관한 것이다. 본 발명은, 보다 구체적으로는 만능 세포로부터 도파민성 신경세포를 생성하는 방법에 관한 것이다.
다수의 전문화된 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력을 보유하고 있는 세포 집단은 세포 계열 특이적으로 분화된 다양한 세포 집단을 만드는데 유용하다. 이러한 세포 계열 특이적으로 분화된 세포 집단은 특정 세포 집단의 기능 상실로 인한 질환을 앓고 있는 환자의 세포 대체 요법에 사용할 수 있다. 직접적인 치료적 이용 가치 이외에도, 세포 계열 특이적으로 분화된 세포는 해당 기능의 세부적인 사항을 식별, 확인 및 시험하기 위한 시험관내 스크리닝 분석 또는 세포 계열 특이적 질환을 치료하기 위한 치료용 분자의 전달 시험 등 다양한 목적의 연구 수단으로도 유용하다.
예를 들어, 파킨슨병의 경우에는, 중뇌 도파민성 (DA) 신경 세포가 손상된 결과, 질환의 증상이 나타나게 된다. 따라서, 만능 세포로부터 DA 신경세포를 생산하는 방법에 대한 필요성이 대두되고 있는데, 이는 이러한 세포가 치료적으로도 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 질환 모델에서, 예를 들어 파킨슨병의 새로운 치료제를 발견하기 위한 질환 모델에서도 사용할 수 있기 때문이다.
만능 세포로부터 중뇌 DA 신경세포를 생산하기 위하여 다양한 노력들이 전개되어 왔다. 예를 들어, 만능 세포로부터 중뇌 DA 신경세포를 생산하기 위한 방법들은 예컨대, WO2013/067362호에 기술된 바와 같이, 통상적으로 BMP 신호전달의 억제제인 LDN-193189 (ALK 1/2/3/6을 억제하고, SMAD 1/5/8을 차단함) 및 TGF-베타 신호전달의 억제제인 SB-431542 (ALK 4/5/7을 억제하고, SMAD 2/3을 차단함)를 모두 이용하는 것이 필요하다. 이러한 방법들은 데카펜타플레직에 대한 작은 모체 (Small Mothers Against Decapentaplegic, SMAD) 신호전달에 대한 두 억제제의 조합을 이용하기 때문에, 상기 방법들을 흔히 "이중 SMAD 억제" 또는 "이중 SMADi"로 지칭한다. 단 하나의 SMAD 억제제를 이용하여 유도성 만능 줄기 (iPS) 세포로부터 중뇌 도파민성 (mDA) 신경 세포를 생산하는 방법을 고안할 수 있다면 바람직하겠지만, 이러한 노력들은 지금까지는 실패하였다. 분명히, 단 하나의 SMAD 억제제를 이용하여 iPS 세포로부터 mDA 신경세포를 생산하는 방법이 필요한 실정이다.
본 발명은, 일부 양태에서, 단일-SMAD 억제 (단일-SMADi)를 이용하여 만능 세포로부터 신경 세포를 생산하는 방법을 제공함으로써 선행 기술의 한계를 극복한다. 단일-SMADi 방법의 이용은 2개 이상의 SMAD 억제제를 이용하는 SMAD 신호전달의 억제가 필요한 방법에 비해 이점을 제공할 수 있다. 하기 실시예에 기술된 바와 같이, 만능 세포, 예컨대 인간 유도성 만능 세포 (iPS 세포)로부터 도파민성 신경세포와 같은 신경 세포주를 생산하는 방법이 제공된다. 본원에 나타낸 바와 같이, 이러한 방법들에는 하기를 비롯한 수개의 양태들을 포함시킬 수 있다: (i) Wnt 작용제 (예컨대, CHIR99021)의 첨가에 있어서 2일 또는 3일까지 시차를 두는 단계, (ii) CHIR 농도를 재최적화하는 단계 (예컨대, 약 0.5 - 3.0 μM, 0.7 - 3 μM, 1 - 2.5 μM, 1.25 - 2.25 μM, 약 1.25 μM 초과 내지 약 2 μM, 또는 약 1.55, 1.65, 1.75 μM 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위를 이용), 및/또는 (iii) 3-5일째에 분화 배지에 MEK 억제제 (예컨대, PD0325901)를 포함시키는 단계. 상기 방법은 예컨대, 상기 양태 (i 및 ii), (ii 및 iii), (i 및 iii) 또는 (i, ii 및 iii)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포를 TGF-β 억제제, 예컨대 SB431542에는 노출시키지 말고 BMP 억제제 (예컨대, 돌소몰핀 또는 LDN-193189)에 노출시켜, 상기 세포의 중뇌 DA 신경세포 또는 FOXA2+/LMX1A+ 세포로의 분화를 촉진시킨다. 하기 실시예에 나타낸 것과 같이, 이러한 방법은 단 하나의 SMAD 억제제만을 포함하는 (예컨대, 돌소몰핀만을 포함하거나 또는 LDN-193189만을 포함하는) 배지를 사용하여 iPS 세포주로부터 고효율성 mDA 전구세포를 형성하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 한 양태는 포크헤드 박스(forkhead box) 단백질 A2 (FOXA2) 및 LIM 호메오박스(homeobox) 전사 인자 1 (LMX1) (FOXA2+/LMX1+ 세포) 모두를 발현하는 인간 세포를 포함하는 세포 조성물의 시험관내 제조 방법으로서, 상기 방법이 신호전달 조절제인 (a) 데카펜타플레직에 대한 작은 모체 (SMAD) 신호전달에 대한 하나의 억제제, (b) 소닉 헤지호그 (Sonic hedgehog, SHH) 신호전달에 대한 적어도 하나의 활성화제, 및 (c) 날개 퇴화 (Wnt) 신호전달에 대한 적어도 하나의 활성화제의 존재 하에 인간 만능 세포를 배양하는 단계; 및 상기 세포를 상기 조절제의 존재 하에 상기 FOXA2+/LMX1+ 세포를 포함하는 세포 조성물을 제공하기에 충분한 시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 상기 LMX1은 LIM 호메오박스 전사 인자 1 알파 (LMX1A)이다. 일부 실시양태에서, SMAD 신호전달의 억제제는 BMP 억제제, 예컨대 LDN-193189 (예컨대, 약 0.2 μM 내지 약 4 μM, 보다 바람직하게는 0.2 μM 초과 내지 약 4 μM, 약 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4μM 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위의 농도), 돌소몰핀, DMH-1 또는 노긴이다. 하기 실시예에 나타낸 것과 같이, 증가된 농도 (예컨대, 0.2 μM 대비 2 μM)의 LDN-193189는 iPS 세포의 FOXA2+/LMX1+ 세포 또는 도파민성 신경세포로의 개선된 분화를 유도하였다. 일부 실시양태에서, 상기 BMP 억제제는 LDN-193189이다. 상기 SMAD 신호전달 억제제는 TGFβ 억제제 (TGFβ 신호전달 경로 억제제), 예를 들어, SB431542 (예컨대, 약 5-100, 20-60, 30-50 μM 또는 약 40 μM의 농도로 존재하는 SB431542)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 만능 세포를 배양 1-15, 1-16 또는 1-17일째에 SMAD의 억제제를 사용하여 배양한다. 상기 만능 세포를 실질적으로 연속하여, 또는 15, 16 또는 17일 동안 매일 SMAD의 억제제를 사용하여 배양한다. SMAD의 억제제는 약 50-2000, 50-500, 500-2500 또는 500-2000 nM 또는 약 180-240 nM의 농도로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 상기 만능 세포를 MEK 억제제와 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 상기 MEK 억제제는 PD0325901일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 PD0325901은 약 0.25-2.5 μM 또는 약 0.5-1.5 μM의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 상기 MEK 억제제는, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 약 1-3일 동안 또는 1-3, 2-4, 3-5일째 또는 1, 2, 3, 4 또는 5일째에 상기 만능 세포와 접촉시킨다 (예컨대, 상기 접촉은 분화 2일 또는 3일째에 시작해서 약 72시간 동안 수행될 수 있음). 상기 MEK 억제제는 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 약 48 내지 약 72시간, 24-96시간 또는 24-48시간 상기 만능 세포와 접촉시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 MEK 억제제는, SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 약 1-2일에서 시작하여 약 3-4일 동안 매일 또는 실질적으로 연속하여 상기 만능 세포와 접촉시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 MEK 억제제는, 1일째에 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 2-5일, 3-6일 또는 3-5일째에 상기 만능 세포와 접촉시킨다. Wnt 신호전달의 활성화제는 GSK3 억제제, 예컨대, CHIR99021일 수 있다. 상기 CHIR99021은 약 0.5-3 μM의 농도, 또는 약 1.25 μM 초과 내지 약 2 μM (예컨대, 약 1.5-2.0 μM, 약 1.55-1.75 μM 또는 약 1.55, 1.65, 1.75 μM 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위)의 농도로 존재할 수 있으며; 일부 실시양태에서는, 더 높은 농도, 예컨대, 1일째에 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 9-17일 또는 11-17일째에 4-7 μM 또는 6 μM를 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, Wnt 신호전달의 활성화제는 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 1-3일에 상기 만능 세포와 접촉시킨다. Wnt 신호전달의 활성화제는 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 12-48시간 또는 24-48시간에 상기 만능 세포와 접촉시킬 수 있다. 상기 만능 세포를 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 약 16일 동안 실질적으로 연속하여, 또는 매일 Wnt 신호전달의 활성화제를 사용하여 배양한다. Wnt 신호전달의 활성화제는 1일째에 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 2-17일째에 상기 만능 세포와 접촉시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, SHH 신호전달의 활성화제는 퍼모파민(purmorphamine), C25II Shh 또는 C24II Shh이다. 일부 실시양태에서, C25II Shh는 C24II Shh 대신에 또는 이와 조합하여 사용할 수 있다. 상기 방법은 상기 만능 세포를 SHH 신호전달의 두 활성화제, 예컨대, 퍼모파민 및 C25II Shh와 접촉하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, SHH 신호전달의 적어도 하나의 활성화제는, SMAD 신호전달의 억제제와 접촉을 개시한 날과 동일한 날에 또는 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 24-48시간 이내에 상기 만능 세포와 접촉시킨다. 일부 실시양태에서, SHH 신호전달의 적어도 하나의 활성화제는, 1일째에 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시와 함께 또는 접촉 개시 후 1-7일째에 상기 만능 세포와 접촉시킨다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 상기 만능 세포를 FGF-8과 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 상기 FGF-8은 FGF-8a 또는 FGF-8b일 수 있지만; 바람직하게는, 상기 FGF-8은 FGF-8f가 아니다. 일부 실시양태에서, 상기 FGF-8은 SMAD 신호전달의 억제제와 접촉을 개시한 날과 동일한 날에는 상기 만능 세포와 접촉시키지 않는다. 상기 FGF-8은 1일째에 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 9-17일 또는 11-17일째에 상기 만능 세포와 접촉시킬 수 있다. 상기 FGF-8은 약 25-500 ng/mL, 25-250 ng/mL, 50-150, 50-200 ng/mL 또는 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 225, 250 또는 275 ng/mL 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위의 농도로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, FGF-8을 포함시키면 세포의 생존력을 향상시킬 수 있고 목적하는 마커인 인그레일드(Engrailed)-1 (En-1)의 발현을 촉진시킬 수 있다. 상기 만능 세포는 신경세포 프로모터의 제어 하에 항생제 내성 이식유전자를 포함할 수 있다. 상기 방법은 예컨대, 신경 세포 또는 중뇌 DA 신경세포를 포함하는 세포의 배양물 중에 존재할 수 있는 분할하는 세포를 사멸시키기 위해, 세포를 항생제, 화학요법제, DNA 가교결합제, DNA 합성 억제제 또는 유사분열 억제제와 접촉시켜 상기 만능 세포로부터 유도된 신경 세포 또는 중뇌 DA 신경세포를 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 방법은 상기 만능 세포를 항생제 (예컨대, G418 (게네티신)) 또는 화학요법제 (예컨대, 마이토마이신 C)와 접촉하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 마이토마이신 C는 1일째에 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 27, 28, 28 및/또는 29일째에 상기 만능 세포와 접촉시킨다. 상기 방법은 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 전에 ROCK 억제제를 포함하는 배지 중에서 상기 만능 세포를 배양 또는 항온배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 방법은 상기 만능 세포를 블레비스타틴과 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 블레비스타틴을 분화 5일 및 17일째에 세포와 접촉시킨다.
일부 실시양태에서, 대략 적어도 40%, 적어도 60%, 적어도 80% 또는 적어도 85%의 세포가 분화하여 FOXA2 및 LMX1 (예컨대 LMX1A) 모두를 발현한다. 일부 실시양태에서, 대략 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60% 또는 적어도 70%의 세포가 분화하여 FOXA2 및 타이로신 하이드록실라아제 (TH) 모두를 발현한다. FOXA2 및 LMX1 (예컨대 LMX1A) 또는 FOXA2 및 TH를 발현하는 상기 분화된 세포는, 오르쏘덴티클 호메오박스 2 (OTX2), 핵 수용체 관련 1 단백질 (NURR1), 신경세포 특이적 클래스 III 베타 튜블린 (Tuj1), TTF3, 쌍형 유사(paired-like) 호메오도메인 3 (PITX3), 아케트-스큐트(achaete-scute) 복합체 (ASCL), 조기 B-세포 인자 1 (EBF-1), 조기 B-세포 인자 3 (EBF-3), 트랜스티레틴 (TTR), 시냅신, 도파민 수송체 (DAT), 및 G-단백질 커플링된, 내향 정류식 칼륨 채널(inwardly rectifying potassium channel) (Kir3.2/GIRK2), CD142, DCSM1, CD63 및 CD99으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 마커를 추가로 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 엔도뉴클레아제, 예컨대, Benzonase® 또는 DNase I의 존재 하에 인간 만능 세포를 항온배양하는 단계를 더 포함한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 상기 엔도뉴클레아제는 인간 엔도뉴클레아제이다. 상기 Benzonase® 또는 DNase I은 100 U/mL로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 인간 만능 세포는, 1일째에 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 4-6일 중 적어도 하나의 날에 엔도뉴클레아제 또는 DNase의 존재 하에 항온배양시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 인간 만능 세포는, 1일째에 SMAD 신호전달의 억제제와의 접촉 개시 후 5일째에 엔도뉴클레아제 또는 DNase의 존재 하에 항온배양시킨다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 방법 또는 상기 기술된 바와 같이 생성된 중뇌 도파민성 (DA) 신경 세포의 배양액에 관한 것이다. 상기 배양액은 용기 수단에 포함될 수 있다. 상기 신경 세포는 예컨대, 주사용으로 제형화된 약제학적 제제와 같은 약제학적 제제 중에 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 치료적 유효량의 본 발명의 배양액 또는 상기 기술된 바와 같은 배양액을 포유동물 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 대상체에서 질병을 치료하는 방법에 대한 것이다. 상기 포유동물 대상체는 인간일 수 있다. 상기 질병은 중추 신경계 (CNS) 질환일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 질병은 파킨슨병 (PD) 또는 파킨슨 플러스 증후군 (PPS)이다. 상기 배양액은 완전하게 분화되지 않거나 또는 분화 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25일째 (예컨대, 분화 17-24일)인 도파민성 신경세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 배양액은 히알루론산 기질을 포함한다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 분화의 중간 단계에 있는 세포 (예컨대, 완전하게 분화되지 않은 도파민성 신경세포)를 포유동물 대상체에게 투여하는 것에 있어서 이점들이 관찰되었다.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) 상기 시험 대상 화합물을 본 발명의 방법 또는 상기 기술된 바와 같이 분화된 세포와 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 세포의 작용, 생리기능 또는 생존력을 측정하는 단계를 포함하는 시험 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 측정은 세포의 독성 반응 또는 변형된 전기생리학적 반응에 대한 시험을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 중뇌 도파민성 (DA) 세포이다.
본 발명과 조합하여 사용할 수 있는 추가의 조건과 방법은, 예컨대, U.S. 2015/0265652호, U.S. 2015/0010514호 및 WO2013/067362호에서 찾아볼 수 있으며, 이들 문헌은 전문이 본원에 참고로 포함된다. 본 발명과 조합하여 사용할 수 있는 만능 세포의 신경 또는 중뇌 DA 신경세포로의 분화를 정제하거나 또는 촉진하는 추가의 방법으로는, 예컨대, 문헌 [Kirkeby et al. (2012)], [Kriks, et al. (2011)]; [Chung, et al. (2011)], [Xi et al. (2012)]; [Young et al. (2014)]; [Jaeger et al. (2011)], [Jiang et al. (2012)] 및 US2016/0177260호를 포함한다.
본원에서, "분화 일자"는 배지 중에서 세포를 항온배양한 날짜를 지칭하는 것으로, 여기서 1일째에 분화 배지에 대한 만능 세포의 노출이 개시된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 1일째의 분화 배지는 하나의 SMAD 억제제를 포함한다. 분화 배지 중에서 항온배양 또는 배양 전에, Essential 8TM 기본 배지 및 Essential 8TM 보충제 [미국 매사추세츠주 월섬 소재의 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)사 제조]를 포함하거나 이로써 이루어지고, 임의로 ROCK 억제제 (예컨대, -2일째에 약 0.25-5 μM, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 2, 3, 4 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위의 H1152 포함) 및/또는 블레비스타틴 (예컨대, 약 0.1-20 μM, 보다 바람직하게는 약 1.25-5 μM 또는 약 2.5 μM의 농도)를 첨가하는 배지 중에서, 예컨대, 분화 배지 중에서 항온배양 전에 (즉, 0일, -1일 및/또는 -2일) 세포를 1, 2 또는 3일 동안 항온배양시킬 수 있다.
본원에서, 특정 성분과 관련하여 "본질적으로 없는"이라는 말은 해당 특정 성분을 의도적으로 조성물 내로 전혀 조제하여 넣지 않았고/않았거나 해당 특정 성분이 오염물로서만 존재하거나 미량으로만 존재하는 것을 의미하기 위해 사용된다. 따라서, 조성물의 의도치 않은 임의의 오염으로 야기된 특정 성분의 총량은 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01%이다. 표준 분석 방법으로 특정 성분의 양이 검출될 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
본원 명세서에서, 단수형 관사("a" 또는 "an")는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원 청구항에서, 단수형 관사 ("a" 또는 "an")는 "포함하는" 이라는 단어와 함께 사용되는 경우 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.
청구항에서 "또는" 이라는 용어의 사용은, 그것이 명시적으로 대안만을 언급하지 않는 한 또는 명세서가 대안 및 "및/또는"만을 언급하는 정의를 뒷받침하고 있더라도 그 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본원에서 "또 다른" 이라는 말은 적어도 두번째 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
본 출원 전반에 걸쳐, "약"이라는 용어는 어떠한 값이 해당 값을 측정하는데 사용되는 장치, 방법에 대한 고유의 오차 변이, 또는 해당 연구 대상체들 간에 존재하는 편차를 포함하고 있음을 나타내는데 사용된다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점들은 하기의 상세한 설명을 보면 명백해 질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 본 발명의 바람직한 실시양태를 제시하는 구체적인 실시예는, 상기 상세한 설명으로부터 본 발명의 개념과 범위 내에서 다양한 변화 및 변형을 줄 수 있음이 당업계의 숙련자에게는 명백하기 때문에, 단지 예시로서만 제공되는 것임을 알아야 한다.
본 발명은, 단일-SMAD 억제 (단일-SMADi)를 이용하여 만능 세포로부터 신경 세포를 생산하는 방법을 제공함으로써 2개 이상의 SMAD 억제제를 이용하는 방법에 비해 이점이 있다.
하기의 도면들은 본 명세서의 일부를 구성하며 본 발명의 특정 양태들을 추가로 설명하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 실시양태들에 대한 상세한 설명과 함께 이들 도면들 중 하나 이상을 참조하면 더 잘 이해될 수 있을 것이다.
도 1: FoxA2를 발현하거나 (유세포분석법에 의함) 또는 FoxA2 및 Lmx1을 공동 발현 (ICC에 의함)하는 세포의 전체 비율을 측정함으로써, 공정 17일째에 3개의 서로 다른 iPS 세포주의 중뇌 도파민성 (mDA) 전구세포에 대한 패터닝을 평가하였다.
도 2: 17일 (D17) 및 24일 (D24)째에 도파민성 전구세포 (미성숙 mDA 신경세포)에 의한 마커 발현.
도 3: 공정 17일째에 서로 다른 인간 iPS 세포주로부터 생산된 mDA 전구세포의 패터닝. FoxA2를 발현하거나 또는 FoxA2 및 Lmx1을 공동 발현하는 세포의 전체 비율을 나타냈다.
도 4A-C: 도 4A, 비증식성 세포 선별에 의한 신경세포의 정제. 도 4B, MMC 선별 후 도파민을 분비하는 mDA 신경세포의 기능성. 도 4C, MMC 선별 후, 심지어 장시간의 해동후 배양 후에도 증식성 세포의 생장은 관찰되지 않았다.
도 5: 인간 iPS 세포주로부터 생산된 세포에서의 마커의 발현.
도 6: 저온보존 및 해동 후, 세포주 K (iPS 세포주 21534.101)로부터 제조된 mDA 신경세포의 해동후 특성 분석.
도 7A-B: 단일-SMADi 분화 공정에 대한 교차-iPS 세포주 시험. 건강한 공여체에서 유도된 3개의 iPS 세포주 및 파킨슨병 환자에서 유도된 9개의 iPS 세포주를 최적화된 단일-SMADi 공정을 사용하여 분화시켰다. 모든 iPS 세포주들은 공정 17일까지 12개의 세포주 중 11개의 세포주에서 DA 전구세포로 효율적으로 전환되었다 (>80%의 FoxA2/ Lmx1 공동 발현) (도 7A). 공정 완료시 (37일)까지, 모든 iPS 세포주의 세포들은 높은 수준의 신경 세포 순도 (>90% MAP2+/네스틴-), 중뇌 특화도(specification) (>80% FoxA2+) 및 중뇌 도파민 신경 세포 성숙도 (>40% TH+)를 달성하였다 (도 7B).
도 8: FoxA2/ Lmx1 공동 발현에 대한 유세포분석법. 전구세포 패터닝은, 세포가 17일째에 >80% FoxA2+/Lmx1+이라면 성공적인 것으로 생각된다 (도 8a). 60%의 FoxA2+/Lmx1+ 세포 및 상당수의 FoxA2+/Lmx1-음성 세포 집단이 있는, 기준 이하의 전구세포 패터닝의 예시를 나타내었다 (도 8b).
도 9: iPSC-mDA 신경세포로부터의 도파민 방출. 최적화된 단일-SMADi 프로토콜 ("조건 9")을 이용하여 iPS 세포주 "K"를 분화시켜 공정을 완료(37일)하고 저온보존처리 하였다. iPSC 유도된 전뇌 신경 세포 (iCell Neuron)로부터는 도파민 방출이 검출되지 않았다. 반대로, 최적화된 단일-SMADi 공정을 사용하여 유도된 iPSC-mDA 세포 (DA Therapy Neuron)는 적어도 최적화된 이중-SMAD 공정을 사용하여 유도된 세포 (iCell DopaNeuron)만큼 많이 도파민을 분비하였다.
도 10: iPSC-mDA 신경세포의 전기적 활성. 저온보존된 iPSC-mDA 신경세포를 해동시킨 후 PEI-코팅된 48-웰 다전극 어레이 (MEA) 플레이트 상에 플레이팅하였다. 최적화된 단일-SMADi 프로토콜(DA Therapy)로 제조된 신경 세포는 최적화된 이중-SMADi 프로토콜로 제조된 세포 (iCell Dopa G100)와 비교했을 때, 평균 활성화율 (mFR), 돌발 활성화 (bursting) (두드러진 BPM) 및 연결성을 비롯한 유사한 전기적 활성을 나타냈다 (도 10a). mFR 주파수 및 연결성 돌발 활성화 강도는 시간의 경과에 따라 증가하였으며, 해동후 약 16일까지는 안정한 상태를 유지하였다. 시간에 따른 래스터 그래프(Temporal Raster plot)는 명백한 스파이크간 간격, 높은 돌발 활성화 강도, 및 웰 중의 모든 전극에 걸친 돌발 활성화를 보여주고 있는데, 이는 전기적 활성도가 높다는 것을 입증하는 것이다.
도 11: iPSC-mDA 신경세포의 정량적 유전자 발현 프로파일. 공정 37일째에 최적화된 단일-SMADi 공정을 사용하여 유도된 iPSC-mDA 세포의 4개의 뱃치 (뱃치 1-4) 및 최적화된 이중-SMADi 프로토콜을 사용하여 유도된 iPSC-mDA 세포 (iCell DopaNeuron)의 1개의 뱃치로부터 RNA를 추출하였다. RNA 분리 후, 실시간 정량 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하였으며, 그 결과는 GAPDH 대조군에 대한 상대적인 발현으로 나타냈다. <10-4 인 값을 백그라운드로 간주하였다 (음영처리된 박스). 중뇌 및 mDA 신경세포 마커의 발현은 서로 다른 프로토콜을 사용하여 제조된 뱃치들 간 및 세포들 간에서 유사하였다. 비-중뇌 영역 또는 비-mDA 세포 유형에 대한 마커들은 저조하였으며, 단일-SMADi 및 이중-SMADi 유도된 세포들 간에서도 유사하였다.
도 12: cGMP-적합성 시약으로의 전환. 표준 시약 또는 cGMP-적합성 시약을 사용하는 단일-SMADi 공정을 이용하여 iPSC-mDA 세포를 분화시켜, 동등한 전구세포 패터닝 (17일) 및 mDA 신경세포 순도 (37일)를 유도하였다.
도 13: 인간이 아닌 영장류에서 iPSC-DA 신경세포의 이식. 인간 세포질 (STEM121)의 염색을 통해 모든 동물에서 양호한 인간 세포 이식 및 신경분포를 확인하였다. 도파민 신경 세포 (TH+)가 이식물에서 관찰되었는데, 이는 상기 세포들이 장기간 생존하여 뇌에서 mDA 신경세포 표적 구조를 자극할 수 있는 역량을 지녔다는 것을 입증하는 것이다. 상기 동물에서 종양, 신경 생장 또는 기타 부작용들은 관찰되지 않았다.
도 14: 랫트 PD 모델 시스템에서 iPSC-DA 전구세포 및 신경 세포의 이식. 상기 임의의 동물에서 종양, 신경 생장 또는 기타 부작용들은 관찰되지 않았다. 이 결과는 최적화된 단일-SMADi 분화 공정 (17-24일) 초기에 유도된 세포들이 보다 성숙한 세포에 비해 더욱 잘 이식되어 자극할 수 있다는 생각을 뒷받침한다.
도 15: 2 μM의 LDN-193189를 사용한 향상된 분화. 여러 번의 시험(n=5)으로, 2 μM의 LDN을 사용하는 경우에 분화의 질이 향상된 것으로 나타났다. 해당 프로토콜에서 2 μM의 LDN을 사용한 결과로서, 17일째에 전구세포에서의 더 높은 FoxA2 및 Lmx1 발현 수준 (도 15, 위) 및 공정 37일째에 층판(floor plate) 유도된 더 높은 비율의 신경 세포 (FoxA2+) (도 15, 아래)가 관찰되었다.
일부 양태에서, 본 발명은 만능 세포, 예컨대 유도성 만능 줄기 세포를 신경 전구 세포 또는 신경세포, 예컨대 중뇌 도파민성 세포로 분화하기 위한 조성물 및 방법을 제공함으로써 선행 기술의 한계를 극복한다. 상기 방법은 하나의 SMAD 억제제 ("단일-SMAD 억제")의 존재 하에 만능 세포를 분화시키는 단계를 수반할 수 있다. 이러한 방법은, 2개 이상의 SMAD 억제제의 사용이 필요한 이전의 방법들과 비교했을 때, 하나의 SMAD 억제제를 사용함에 따른 이점들 (예컨대, 비용 감소, 단순화되거나 보다 최소한의 방법 등)로 유익할 수 있다.
I. 정의
"만능성" 또는 "만능"은 하나 이상의 조직 또는 장기를 구성하는 모든 세포, 예를 들어 3개의 배엽층: 내배엽 (위내벽, 소화관, 폐), 중배엽 (근육, 뼈, 혈액, 비뇨 생식기) 또는 외배엽 (표피 조직 및 신경계) 중 어느 하나로 분화할 수 있는 잠재력을 보유하는 줄기 세포 또는 미분화 세포를 지칭한다.
보통 iPS 세포 또는 iPSC로 약칭하는 "유도성 만능 줄기 세포"는 재프로그래밍 인자를 도입하거나 이것과 접촉시킴으로써 비만능 세포, 일반적으로 성체의 체세포 또는 최종 분화된 세포, 예컨대 섬유아세포, 조혈 세포, 근육 세포, 신경 세포, 상피 세포 등으로부터 인공적으로 제조된 만능 줄기 세포 유형을 가리킨다.
"배아 줄기 (ES) 세포"는 초기배에서 유도한 만능 줄기 세포이다.
"부착 배양"은 세포 또는 세포의 응집체를 표면에 부착시키는 배양을 가리킨다.
"부유 배양"은 세포 또는 세포의 응집체를 액체 배지 중에서 현탁된 상태로 증식시키는 배양을 지칭한다.
외부에서 첨가된 성분이 "본질적으로 없는"이라는 말은 해당 배지가 그 안의 세포들 이외의 공급원에서 유래한 특정 성분을 전혀 포함하지 않거나 또는 본질적으로 이들을 포함하지 않는다는 것을 의미한다. 외부에서 첨가된 성장 인자 또는 신호전달 억제제, 예컨대 TGFβ, bFGF, TGFβ 상과(superfamily) 신호전달 억제제 등이 "본질적으로 없는"이라는 말은, 외부에서 첨가된 성분이 최소량 또는 검출불가능한 양으로 존재한다는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어, TGFβ 또는 bFGF가 본질적으로 없는 배지 또는 환경은 5, 4, 3, 2, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.01, 0.001 ng/mL 미만 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위의 양으로 상기 TGFβ 또는 bFGF를 포함할 수 있다. 예를 들어, 신호전달 억제제가 본질적으로 없는 배지 또는 환경은 0.2, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001 μM 미만 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위의 양으로 상기 신호전달 억제제를 포함할 수 있다.
"분화"는 덜 전문화된 한 세포가 보다 전문화된 적어도 새로운 세포 유형의 후대 자손을 형성하는 과정이다.
"응집 촉진 매질"이라는 용어는 해당 작용 기전에 어떠한 방해도 없이 세포의 응집체 형성을 촉진하는 임의의 매질을 의미한다.
"응집체", 즉 배양체라는 용어는 현탁액에서 배양시킨 분화된 세포, 부분적으로 분화된 세포 및/또는 만능 줄기 세포를 포함하는 세포의 동종성 또는 이종성 클러스터를 가리킨다.
"신경세포(뉴런)" 또는 "신경 세포" 또는 "신경 세포 유형" 또는 "신경 계통"은 임의의 신경 계통의 세포를 포함할 수 있으며, 달리 특정하지 않는 한, 제한없이 신경 개체발생의 임의의 단계에서의 세포를 지칭하는데 취할 수도 있다. 예를 들어, 신경세포는 신경세포의 전구 세포, 성숙한 신경세포 및 신경세포 유형, 예컨대 성상세포 모두를 포함할 수 있다.
특정 단백질을 인코딩하는 "유전자," "폴리뉴클레오타이드," "코딩 영역," "서열," "세그먼트" 또는 "단편"은, 적절한 조절 서열의 제어 하에 놓인 경우 시험관내 또는 생체내에서 전사되고 필요하다면 번역도 되어서 유전자 생성물, 예컨대, 폴리펩타이드가 되는 핵산 분자이다. 상기 코딩 영역은 cDNA, 유전체 DNA 또는 RNA 형태로 존재할 수 있다. DNA의 형태로 존재하는 경우, 핵산 분자는 단일 가닥 (즉, 센스 가닥) 또는 이중 가닥일 수 있다. 코딩 영역의 경계는 5' (아미노) 말단의 시작 코돈과 3' (카르복시) 말단의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 유전자는, 이에 제한되지는 않지만, 원핵 또는 진핵 mRNA의 cDNA, 원핵 또는 진핵 DNA의 유전체 DNA 서열, 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있다. 전사 종결 서열은 일반적으로 유전자 서열에 대하여 3' 방향으로 위치할 것이다.
"이식유전자"라는 용어는 인공적 또는 자연적 수단, 예컨대 외인성 핵산에 의해 세포 또는 유기체 내로 도입된 유전자, 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 외인성 핵산은 상이한 유기체 또는 세포로부터 유래할 수 있거나, 또는 상기 유기체 또는 세포 내에서 자연적으로 발생하는 핵산의 하나 이상의 추가의 복제물일 수도 있다. 비제한적인 예로서, 외인성 핵산은 자연 세포에서와는 다른 염색체 위치 내에 존재하거나, 그렇지 않은 경우에는 자연에서 발견되는 것과는 다른 핵산 서열에 의해 측접(flanked)된다.
"프로모터"라는 용어는 본원에서 DNA 조절 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 영역을 지칭하는 통상적인 의미로 사용되며, 여기서, 상기 조절 서열은 RNA 중합효소에 결합하여 다운스트림 (3' 방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 유전자이다.
II. 단일-SMAD 억제에 대한 SMAD 억제제
일부 양태에서, 하나의 BMP 신호전달 억제제 또는 하나의 TGF-β 신호전달 억제제는 만능 세포 (예컨대, iPS 세포, ES 세포)를 신경 세포, 예컨대 중뇌 도파민성 세포로 전환시키는 방법에서 SMAD 신호전달을 억제하는데 사용된다. 예를 들어, 일부 양태에서, 만능 세포는 중뇌 DA 신경세포를 포함하는 신경 세포의 집단으로 전환되는데, 여기서 분화는 하나의 BMP 신호전달 억제제를 포함하는 배지 중에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 상기 BMP 억제제는 LDN-193189, 돌소몰핀 또는 DMH-1이다. BMP 신호전달에 대한 억제제의 비제한적인 예로는, 돌소몰핀, 우성형-음성(dominant-negative) BMP, 절두된 BMP 수용체, 가용성 BMP 수용체, BMP 수용체-Fc 키메라, 노긴, LDN-193189, 폴리스타틴, 초르딘(chordin), 그렘린(gremlin), 세르베루스(cerberus)/DAN 부류의 단백질, 벤트로핀(ventropin), 고용량 액티빈, 및 암니온리스(amnionless)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산, 안티센스, RNAi, siRNA 또는 기타 유전적 방법이 BMP 신호전달을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서, BMP 신호전달 억제제를 간단하게 "BMP 억제제"로도 지칭할 수 있다. 상기 BMP 억제제는 분화 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16일 및/또는 17일째 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위 (예컨대, 1-17, 1-16, 1-15, 2-15일 등)의 일자에 분화 배지 중에 포함시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 BMP 억제제는 분화 1-17일의 모든 일자에 분화 배지 중에 포함된다. 하지만, 특정 시점, 예컨대, 상기 일자 중 1, 2 또는 3일째에 분화 배지로부터 상기 BMP 억제제를 제외시키는 것도 가능할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 BMP 억제제는 임의로 11-17일째에 분화 배지 중에 포함되지 않을 수도 있고, 일부 바람직한 실시양태에서, 상기 BMP 억제제는 1-10일째에 분화 배지 중에 포함되지 않는다.
일부 실시양태에서, 상기 BMP 억제제는 LDN-193189, 돌소몰핀, DMH-1 또는 노긴이다. 예를 들어, 세포를 약 1-2500, 1-2000 또는 1-1,000 nM의 LDN-193189 (예컨대, 약 10 내지 500, 50 내지 500, 50 내지 300, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250 또는 약 2500 nM의 LDN-193189 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위)를 포함하는 배지 중에서 배양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포를 약 0.1 내지 10 μM의 돌소몰핀 (예컨대, 약 0.1 내지 10, 0.5 내지 7.5, 0.75 내지 5, 0.5 내지 3, 1 내지 3, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 1.55, 1.6, 1.65, 1.7, 1.75, 2, 2.25, 2.5, 2.75, 3 또는 약 2 μM의 돌소몰핀 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위)을 포함하는 배지 중에서 배양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포를 약 1 μM의 DMH-1 (예컨대, 약 0.2-8, 0.5-2 또는 약 1 μM의 DMH-1 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위)을 포함하는 배지 중에서 배양할 수 있다. 하기 실시예에 나타낸 것과 같이, LDN-193189, 돌소몰핀 및 DMH-1은 모두 단일-SMAD 억제 방법에서 성공적으로 사용되어, iPS 세포로부터 중뇌 도파민성 신경세포를 생성하였다.
일부 양태에서, TGFβ 억제제는 단일-SMAD 억제제로서 SMAD를 억제하는데 사용되어, 만능 세포, 예컨대 iPS 세포로부터 중뇌 도파민성 신경세포를 생성할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상기 분화 배지는 적어도 제1 TGFβ 신호전달 억제제를 포함한다. TGFβ 신호전달에 대한 억제제의 비제한적인 예로는 A-83-01, GW6604, IN-1130, Κi26894, LY2157299, LY364947 (HTS-466284), A-83-01, LY550410, LY573636, LY580276, NPC-30345, SB-431542, SB-505124, SD-093, Sml6, SM305, SX-007, Antp-Sm2A 및 LY2109761을 포함한다. 예를 들어, 분화 배지 중의 TGFβ 억제제는 SB431542일 수 있다. 일부 양태에서, 세포를 약 0.1 내지 100 μM의 SB431542 (예컨대, 약 1 내지 100, 10 내지 80, 15 내지 60, 20-50 또는 약 40 μM의 SB431542)를 포함하는 배지 중에서 배양한다. 본원에서, TGFβ 수용체 억제제를 비롯한 TGFβ 신호전달 억제제를 간단히 "TGFβ 억제제"로도 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제는 상기 분화 배지 중에 포함시키지 않는다. 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제 (예컨대, SB431542)는 1-3 또는 1, 2, 3 및/또는 4일째에 단일-SMAD 억제제로서 분화 배지 중에 포함시킬 수 있다. 하기 실시예에 나타낸 것과 같이, 일부 실시양태에서, BMP 억제제를 단일-SMAD 억제제로 사용하는데, 그 이유는 이들 화합물이 TGFβ 억제제를 사용했을 때에 비해 만능 세포의 중뇌 DA 신경세포로의 월등한 분화를 유도하는 것으로 관찰되었기 때문이다.
III. MEK 억제제의 도입
일부 양태에서, MEK 억제제를 예컨대, 상기 BMP 억제제 또는 단일-SMAD 억제제와 조합하여 분화 배지 중에 포함시켜, 만능 세포, 예컨대 iPS 세포로부터 중뇌 도파민성 신경세포를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 MEK 억제제는 PD0325901이다. 상기 실시양태에 따라 사용될 수 있는 MEK 억제제의 비제한적인 예로는 PD0325901, 트라메티닙 (GSK1120212), 셀루메티닙 (AZD6244), 피마세르팁 (AS-703026), MEK162, 코비메티닙, PD184352, PD173074, BIX02189, AZD8330 및 PD98059를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상기 방법은 약 0.1 내지 10 μM (예컨대, 약 0.1 내지 5; 0.5 내지 3 또는 0.5 내지 1.5 μM)의 MEK 억제제, 예컨대 PD0325901의 존재 하에 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포를 분화 3, 4, 5 또는 3-5일째에 상기 MEK 억제제 (예컨대, PD0325901)와 접촉시킨다.
따라서, 특정 양태에서, 세포의 분화는 BMP 억제제; 소닉 헤지호그 (SHH) 신호전달의 활성화제; Wnt 신호전달의 활성화제, MEK 억제제 또는 상술한 것들의 조합을 포함하는 배지 중에서 만능 세포의 집단을 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 배지는 외부에서 첨가된 FGF8b를 함유하지 않는다. 일부의 경우, TGFβ 억제제를 BMP 억제제 대신에 사용할 수 있다. 추가의 양태에서, 상기 실시양태의 방법은 DA-특이적 마커를 사용하는 세포의 정제를 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 상기 만능 세포는 신경 세포의 정제를 위해 사용될 수 있는 신경세포 프로모터의 제어 하의 내성 유전자를 포함한다 (예컨대, 항생제에 노출시 항생제 내성 유전자를 발현하는 신경 세포는 생존할 것인 반면, 그렇지 않은 신경 세포는 사멸할 것임).
일부 실시양태에서, 중뇌 DA 신경세포의 집적화된(enriched) 집단은, 만능 세포의 집단을 수득하는 단계; 상기 세포를 MEK 억제제 (예컨대, PD0325901)를 포함하는 배지 중에서 신경 계통 세포 집단으로 분화시키는 단계로서, 상기 배지가 분화 1일째에 외부에서 첨가된 FGF8b를 함유하지 않는 것인 단계; 및 상기 신경 계통 세포 집단의 세포들을 추가로 분화시켜 중뇌 DA 신경세포의 집적화된 집단을 제공하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 본 발명자들은, 1일째에 상기 분화 배지 중에 FGF8 (예컨대, FGF8b)을 포함시키는 것이, 일부의 경우 세포의 중뇌 DA 신경세포로의 분화를 지연시키거나 방해할 수 있음을 관찰하였다. 일부 실시양태에서, FGF8은 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17일 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위의 일자와 같은 분화 중 추후 일자에 분화 배지 중에 임의로 포함시킬 수 있으며, 예컨대, 바람직하게는 만능 세포의 단일 SMAD 억제제와의 접촉은 1일째에 분화 배지 중에서 개시한다.
IV. Wnt 활성화제 또는 GSK 억제제의 도입
일부 양태에서, Wnt 활성화제 (예컨대, GSK3 억제제)를 예컨대, 상기 BMP 억제제 또는 단일-SMAD 억제제와 조합하여 분화 배지 중에 포함시켜, 만능 세포, 예컨대 iPS 세포로부터 중뇌 도파민성 신경세포를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 만능 세포는 중뇌 DA 신경세포를 포함하는 신경 세포의 집단으로 전환되는데, 여기서 분화는 적어도 Wnt 신호전달의 제1 활성화제를 포함하는 배지 중에서 일어난다.
여러가지 다양한 Wnt 활성화제 또는 GSK3 억제제를 본 발명의 다양한 양태에서 사용할 수 있다. 예를 들어, Wnt 신호전달의 활성화제는 글리코겐 신타아제 키나아제 3 (GSK3) 억제제일 수 있다. GSK3 억제제의 비제한적인 예로는 NP031112, TWS119, SB216763, CHIR-98014, AZD2858, AZD1080, SB415286, LY2090314 및 CHIR99021을 포함한다. 일부 실시양태에서, 만능 세포를 SB415286이 아닌 하나의 SMAD 억제제와 접촉시킨다. 일부 실시양태에서, Wnt 신호전달의 활성화제는 CHIR99021이다. 따라서, 일부 양태에서, 실시양태에 따라 사용하기 위한 배양 배지는 약 0.1 내지 약 10 μM의 CHIR99021 (예컨대, 약 0.1 내지 5, 0.5 내지 5, 0.5 내지 3, 약 1.25 초과 내지 2.25, 약 1.25, 1.5, 1.55, 1.65, 1.7, 1.75, 1.8, 1.9, 2.0 또는 약 1.75 μM의 CHIR99021 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위)을 포함한다.
일부 바람직한 실시양태에서, 상기 Wnt 활성화제 (예컨대, GSK3 억제제)는 분화 1일째에 분화 배지 중에 임의로 포함시키지 않을 수도 있다. 일부 실시양태에서, 상기 Wnt 활성화제 또는 GSK 억제제 (예컨대, CHR99021)를 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16일 및/또는 17일 또는 상기 모든 날짜들 또는 이들을 임의로 조합한 날짜에 분화 배지 중에 포함시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상기 Wnt 활성화제 또는 GSK 억제제를 2-17 또는 3-17일에 분화 배지 중에서 포함시킨다.
V. 소닉 헤지호그 활성화제
일부 양태에서, 소닉 헤지호그 (SHH) 신호전달의 활성화제를 예컨대, 상기 BMP 억제제 또는 단일-SMAD 억제제와 조합하여 분화 배지 중에 포함시켜, 만능 세포, 예컨대 iPS 세포로부터 중뇌 도파민성 신경세포를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 소닉 헤지호그 활성화제는 소닉 헤지호그 (Shh) 또는 돌연변이체 Shh이다. 상기 Shh는 예컨대, 인간 또는 마우스 단백질일 수 있거나, 또는 인간 또는 마우스 Shh로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상기 Shh는 돌연변이체 마우스 Shh 단백질, 예컨대 마우스 C25II Shh 또는 인간 C24II Shh이다. 일부 실시양태에서, 상기 분화 배지는 Shh (예컨대, C25II Shh) 및 예컨대, 퍼모파민과 같은 SHH의 소분자 활성화제 모두를 포함한다. 어떤 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 상기 Shh 및/또는 소닉 헤지호그의 활성화제는 신경 층판 분화를 촉진할수 있다.
일부 실시양태에서, 중뇌 DA 신경세포는, 적어도 SHH 신호전달의 제1 활성화제를 포함하는 배지 중에서 만능 세포를 배양시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 상기 만능 세포로부터 생성된다. 예를 들어, SHH 신호전달의 활성화제는 재조합 SHH 폴리펩타이드 (또는 이의 부분) 또는 소분자 활성화제일 수 있다. 특정 양태에서, SHH의 활성화제는 Shh C25II, 퍼모파민 또는 퍼모파민 유사체 (예컨대, 평활화 작용제, 예컨대 SAG-1 또는 3-클로로-N-[(1r,4r)-4-(메틸아미노)사이클로헥실]-N-[3-(피리딘-4-일)벤질]벤조[b]티오펜-2-카복사미드)일 수 있다. 따라서, 특정 양태에서, 실시양태에 따라 사용하기 위한 배양 배지는 약 0.1 내지 10 μM의 퍼모파민 (예컨대, 약 0.1 내지 20, 0.5 내지 10, 0.5 내지 5 또는 약 2 μM의 퍼모파민)을 포함한다. 추가의 양태에서, 배양 배지는 약 1 내지 1,000 ng/ml의 Shh C25II (예컨대, 약 10 내지 1,000, 10 내지 500, 50 내지 500 또는 약 100 ng/ml의 Shh C25II)를 포함한다. 일부 실시양태에서, SHH 신호전달의 활성화제는 Shh C25II 및 퍼모파민을 모두 포함한다. 예를 들어, 세포는 약 0.1 내지 10 μM의 퍼모파민 및 약 1 내지 1,000 ng/ml의 Shh C25II를 포함하는 배지 중에서 배양될 수 있다. 상기 Shh 활성화제(들) (예컨대, Shh C25II 및 퍼모파민)은 1, 2, 3, 4, 5, 6 및/또는 7일째에 분화 배지 중에 포함시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 Shh 활성화제를 1일째에 분화 배지로부터 제외시킨다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 상기 Shh 활성화제(들)은 1-6 또는 2-7일째에 분화 배지 중에 포함시킨다.
따라서, 특정 양태에서, 만능 세포는 B27 보충제, 1-3000 또는 1-1000 nM의 LDN-193189 (또는 0.1 내지 100 μM의 SB431542), 0.1 내지 50 μM의 퍼모파민, 1 내지 1,000 ng/ml의 Shh C25II 및 0.1 내지 10 μM의 CHIR99021을 포함하는 DMEM/F12 배지를 사용하는 부착 배양 시스템으로 1-6일 동안 분화 배지 중에서 배양될 수 있다. 한 양태에서, 상기 배지는 B27 보충제, 200 nM의 LDN-193189 (또는 10 μM의 SB431542), 2 μM의 퍼모파민, 100 ng/ml의 Shh C25II 및 1.25 μM의 CHIR99021을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 MEK 억제제를 1-2일 후에 배지 중에 포함시킨다 (예컨대, 상기 MEK 억제제를 분화 2-4일 또는 2, 3 및/또는 4일째에 포함시킨다).
VI. 만능 줄기 세포의 공급원
만능 줄기 세포의 신경 유도를 위한 본 발명의 방법에 만능 줄기 세포를 사용할 수 있다. 예컨대, 배지 성분의 최적화 및/또는 상기 분화 프로토콜에 의해 생성된 목적하는 중뇌 DA 신경세포의 선별에 의해 신경 분화 효율성을 개선하기 위해 사용될 수 있는 방법 및 조성물이 개시된다.
"만능 줄기 세포" 또는 "만능 세포"라는 용어는 3개의 모든 배엽층, 즉, 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 세포로 될 수 있는 세포를 지칭한다. 이론상, 만능 줄기 세포는 신체의 어떤 세포로도 분화할 수는 있으나, 만능성에 대한 실험적 결정은 일반적으로 각 배엽층의 수개의 세포 유형으로의 분화를 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 유래한 배아 줄기 (ES) 세포이다. 다른 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 체세포를 재프로그래밍하여 유래된 유도성 만능 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 체세포 핵이식에 의해 유도된 배아 줄기 세포이다. 만능 줄기 세포는 건강한 대상체 (예컨대, 건강한 인간) 또는 질병 (예컨대, 신경퇴행성 질환, 파킨슨병 등)이 있는 대상체로부터 수득되거나 유래할 수 있다.
A. 배아 줄기 세포
배아 줄기 (ES) 세포는 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 유래한 만능 세포이다. ES 세포는 발달기 배아의 외부 영양외배엽층을 제거한 후, 성장하지 않는 세포의 배양보조세포(feeder) 층에서 내부 덩어리 세포를 배양함으로써 분리할 수 있다. 조건이 적절하면, 증식성인 미분화 ES 세포의 콜로니가 생성된다. 상기 콜로니를 제거하여 각 세포에 해리시킨 후, 새로운 배양보조세포층 위에 재플레이팅할 수 있다. 상기 재플레이팅한 세포들을 계속 증식시켜, 미분화 ES 세포의 새로운 콜로니를 생성할 수도 있다. 이어서, 상기 새로운 콜로니들을 제거하여 해리, 다시 재플레이팅하여 성장시킬 수 있다. 이러한 미분화 ES 세포의 "계대배양(subculturing 또는 passaging)" 과정을 여러번 반복하여 미분화 ES 세포를 함유하는 세포주를 생성할 수 있다 (미국특허 5,843,780호; 6,200,806호; 7,029,913호). "1차 세포 배양물"은 예컨대 배반포의 내부 세포 덩어리와 같은 조직에서 직접 얻은 세포를 배양한 것이다. "계대배양물"은 상기 1차 세포 배양물로부터 유도된 임의의 배양물이다.
마우스 ES 세포를 수득하기 위한 방법은 널리 알려져 있다. 한 방법에서, 129 마우스 균주의 착상전 배반포를 마우스 항혈청으로 처리하여 영양외배엽을 제거하고, 소태아 혈청을 함유하는 배지 중에서 화학적으로 활성화된 마우스 배아 섬유아세포의 배양보조세포층 위에 내부 세포 덩어리를 배양시킨다. 발달기의 미분화 ES 세포의 콜로니를 소태아 혈청의 존재 하에 마우스 배아 섬유아세포 배양보조세포층 위에 계대배양시켜 ES 세포의 집단을 생성한다. 일부 방법에서, 마우스 ES 세포는 배양보조세포층의 부재 하에 혈청 함유 배양 배지에 사이토카인 백혈병 억제인자 (LIF)를 첨가함으로서 성장시킬 수 있다 (Smith, 2000). 다른 방법에서, 마우스 ES 세포는 뼈형성 단백질 및 LIF의 존재 하에 무혈청 배지 중에서 성장시킬 수 있다 (Ying et al., 2003).
인간 ES 세포는 이전에 기술된 방법들(Thomson et al., 1995; Thomson et al., 1998; Thomson and Marshall, 1998; Reubinoff et al, 2000.)을 사용하여 배반포로부터 수득할 수 있다. 한 방법에서, 5일째의 인간 배반포를 래빗 항-인간 비장 세포 항혈청에 노출시킨 후, 1:5로 희석한 기니피그 혈장액(Guinea pig complement)에 노출시켜 영양외배엽 세포를 용해시킨다. 상기 용해된 영양외배엽 세포를 온전한 내부 세포 덩어리에서 제거한 후, 감마선으로 비활성화시킨 마우스 배아 섬유아세포의 배양보조세포층 위에서 소태아 혈청의 존재 하에 상기 내부 세포 덩어리를 배양한다. 9일 내지 15일 후, 내부 세포 덩어리에서 유래된 세포 응집 덩어리를 화학적으로 해리시키거나 (즉, 트립신에 노출시키거나) 또는 기계적으로 해리시키고, 소태아 혈청과 마우스 배아 섬유아세포의 배양보조세포층을 함유하는 새로운 배지 중에서 재플레이팅할 수 있다. 추가 증식시, 미분화된 형태를 갖는 콜로니들을 마이크로 피펫을 사용하여 선별하고, 세포 덩어리들을 기계적으로 해리시킨 후, 재플레이팅한다 (미국 특허 6,833,269호 참조). ES 유사 형태는 세포질에 대한 핵의 비율이 매우 높고 두드러진 핵소체를 갖는 작은 콜로니를 특징으로 한다. 생성된 ES 세포는 단시간의 트립신 처리에 의해, 또는 마이크로 피펫을 사용한 개별 콜로니의 선발에 의하여 통상적으로 계대배양할 수 있다. 일부 방법에서, 인간 ES 세포는 염기성 섬유아세포 성장 인자의 존재 하에 섬유아세포의 배양보조세포층 상에 ES 세포를 배양함으로써 혈청없이 성장시킬 수 있다 (Amit et al., 2000). 다른 방법으로, 인간 ES 세포는, 세포를 염기성 섬유아세포 성장 인자를 함유하는 "컨디셔닝된" 배지의 존재 하에 단백질 매트릭스, 예컨대 MatrigelTM 또는 라미닌 상에서 배양함으로써 배양보조세포층 없이도 성장시킬 수 있다 (Xu et al., 2001). 상기 배지는 섬유아세포와 함께 배양하여 사전에 미리 컨디셔닝할 수 있다.
붉은털 원숭이와 흔한 마모셋 원숭이의 ES 세포를 분리하는 방법도 잘 알려져 있다 (Thomson, and Marshall, 1998; Thomson et al., 1995; Thomson and Odorico, 2000).
ES 세포의 또 다른 공급원으로는 확립된 ES 세포주를 들 수 있다. 다양한 마우스 세포주 및 인간 ES 세포주들이 공지되어 있고, 이들을 성장시키고 증식시키기 위한 조건들도 확립되어 있다. 예를 들어, 상기 마우스 CGR8 세포주는 마우스 균주 129 배아의 내부 세포 덩어리에서 확립되었으며, CGR8 세포의 배양물은 LIF의 존재 하에 배양보조세포층 없이 성장시킬 수 있다. 추가의 예로서, 인간 ES 세포주 H1, H7, H9, H13 및 H14는 문헌 [Thomson et al. (2000)]에서 확립된 바 있다. 또한, H9 세포주의 서브클론 H9.1 내지 H9.2도 개발되었다. 사실상 당업계에 공지된 임의의 모든 ES 세포주 또는 줄기세포주, 예컨대 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Yu and Thomson, 2008]에 기술된 것들을 본 발명에서 사용할 수 있을 것으로 예상된다.
본 발명의 양태에서 사용하기 위한 ES 세포의 공급원으로는 배반포, 배반포의 내부 세포 덩어리를 배양하여 얻은 세포 또는 확립된 세포주의 배양물에서 얻은 세포를 포함한다. 따라서, 본원에서, "ES 세포"라는 용어는 배반포의 내부 세포 덩어리, 내부 세포 덩어리를 배양하여 얻은 ES 세포, 및 ES 세포주의 배양으로 얻어진 ES 세포를 지칭할 수 있다.
B. 유도성 만능 줄기 세포
유도성 만능 줄기 (iPS) 세포는 ES 세포의 특성을 보유하지만 분화된 체세포의 재프로그래밍에 의해 얻어지는 세포이다. 유도성 만능 줄기 세포는 다양한 방법으로 수득되었다. 한 방법으로, 성인 인간의 피부 섬유아세포를 레트로바이러스 형질도입을 이용하여 전사 인자 Oct4, Sox2, c-Myc 및 Klf4로 형질감염시킨다 (Takahashi et al., 2006, 2007). 상기 형질감염된 세포를 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)로 보충된 배지 중에서 SNL 배양보조세포 (LIF를 생성하는 마우스 세포 섬유아세포주) 상에 플레이팅한다. 약 25일후, 인간 ES 세포 콜로니를 닮은 콜로니가 배양액 중에 나타난다. ES 세포 유사 콜로니들을 선별하여 bFGF의 존재 하에 이들을 배양보조세포 증식시킨다. 일부 바람직한 실시양태에서, 상기 iPS 세포는 인간 iPS 세포이다.
세포 특성에 입각할 때, ES 세포 유사 콜로니의 세포는 유도성 만능 줄기 세포이다. 상기 유도성 만능 줄기 세포는 형태학적으로 인간 ES 세포와 유사하며, 다양한 인간 ES 세포 마커를 발현한다. 또한, 인간 ES 세포의 분화를 유도하는 것으로 알려진 조건 하에 성장시키는 경우, 상기 유도성 만능 줄기 세포는 그에 따라 적절히 분화한다. 예를 들어, 상기 유도성 만능 줄기 세포는 신경세포의 구조 및 신경 마커를 갖는 세포로 분화할 수 있다. 사실상 임의의 모든 iPS 세포 또는 세포주, 예컨대 문헌 [Yu and Thomson, 2008]에 기술된 것들을 본 발명에서 사용할 수 있을 것으로 예상된다.
또 다른 방법으로, 인간 태아 또는 신생아 섬유아세포를 렌티바이러스 형질도입을 이용하여 4개의 유전자 Oct4, Sox2, Nanog 및 Lin28로 형질감염시킨다 (Yu et al., 2007). 감염 후 12-20일째에, 인간 ES 세포 형태를 갖는 콜로니들이 보이게 된다. 상기 콜로니들을 선별하여 증식시킨다. 상기 콜로니들을 구성하고 있는 유도성 만능 줄기 세포는 형태학적으로 인간 ES 세포와 유사하고, 다양한 인간 ES 세포 마커를 발현하며, 마우스에 주입 후에 신경 조직, 연골 및 장 상피를 갖는 기형종을 형성한다.
마우스 세포로부터 유도성 만능 줄기 세포를 제조하는 방법도 공지되어 있다 (Takahashi and Yamanaka, 2006). iPS 세포의 유도는 일반적으로 Sox 부류의 구성원 중 적어도 하나 및 Oct 부류의 구성원 중 적어도 하나를 발현시키거나, 또는 이들에 노출하는 것이 필요하다. Sox 및 Oct는 ES 세포의 동일성을 규정하는 전사 조절 체계의 중심적인 역할을 담당하고 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, Sox는 Sox-1, Sox-2, Sox-3, Sox-15 또는 Sox-18일 수 있고; Oct는 Oct-4일 수 있다. 추가의 인자들은 Nanog, Lin28, Klf4 또는 c-Myc와 같이 재프로그래밍 효율을 증가시킬 수 있고; 구체적인 재프로그래밍 인자의 세트는 Sox-2, Oct-4, Nanog 및 경우에 따라 Lin-28을 포함하는 세트; 또는 Sox-2, Oct4, Klf 및 경우에 따라 c-Myc를 포함하는 세트일 수 있다.
ES 세포와 같이 iPS 세포는 SSEA-1, SSEA-3 및 SSEA-4 [발생학 연구 하이브리도마 은행(Developmental Studies Hybridoma Bank), 메릴랜드 주 베데스다 소재의 미국 국립아동보건 및 인간 발달 연구소(National Institute of Child Health and Human Development)] 및 TRA-1-60 및 TRA-1-81(Andrews et al., 1987)에 대한 항체를 사용하여 면역조직화학법 또는 유세포분석법으로 동정 및 확인할 수 있는 특징적인 항원을 보유한다. 배아 줄기 세포의 만능성은 예를 들어, 8-12주령의 수컷 SCID 마우스의 뒷다리 근육에 약 0.5-10×106 개의 세포를 주사하여 확인할 수 있다. 각 3개의 배엽층 중 적어도 하나의 세포 유형을 나타내는 기형종이 발생한다.
본 발명의 특정 양태에서, 예를 들어, 상술한 바와 같이 Oct 부류의 구성원 및 Sox 부류의 구성원, 예컨대 Oct4 및 Sox2와, Klf 또는 Nanog를 조합하여 포함하는 재프로그래밍 인자를 사용하여 체세포를 재프로그래밍하여 iPS 세포를 제조한다. 상기 체세포는 만능성으로 유도할 수 있는 임의의 체세포, 예컨대 섬유아세포, 케라틴세포, 조혈 세포, 중간엽 세포, 간세포, 위세포 또는 β 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, T 세포도 재프로그래밍을 위한 체세포의 공급원으로 사용될 수 있다 (예컨대, 본원에 참조로 포함되는 WO 2010/141801호 참조).
재프로그래밍 인자는, 하나 이상의 벡터, 예컨대 통합 벡터, 염색체성 비통합 RNA 바이러스 벡터 (본원에 참조로 포함되는, 미국 출원 13/054,022호 참조) 또는 에피솜 벡터, 예컨대 EBV 성분 기반의 시스템 (예컨대, 본원에 참조로 포함되는 WO 2009/149233호; Yu et al., 2009 참조)에 포함되어 있는 발현 카세트로부터 발현시킬 수 있다. 추가의 양태에서, 재프로그래밍 단백질 또는 RNA (예컨대, mRNA 또는 miRNA)를 단백질 또는 RNA 형질감염의 의해 체세포에 직접 도입할 수도 있다 (Yakubov et al., 2010).
C. 체세포 핵이식에 의해 유도된 배아 줄기 세포
만능 줄기 세포는, 공여체의 핵을 방추체가 없는 난모세포로 이식시키는 체세포 핵이식 방법에 의해 제조할 수 있다. 핵이식에 의해 제조된 줄기 세포는 공여체 핵과 유전적으로 동일하다. 한 방법으로, 피부 섬유아세포 유래의 공여체 섬유아세포 핵을 방추체가 없는 제2 감수분열 중기의 성숙한 난모세포의 세포질에 전기세포융합에 의해 도입한다 (Byrne et al., 2007). 상기 융합된 난모세포를 이오노마이신에 노출하여 활성화시킨 후, 배반포 단계까지 항온배양한다. 이후, 선택된 배반포의 내부 세포 덩어리를 배양하여 배아 줄기 세포주를 생성한다. 상기 배아 줄기 세포주는 일반적인 ES 세포의 형태를 나타내고, 다양한 ES 세포 마커를 발현하며, 시험관내 및 생체내 모두에서 여러가지 세포 유형으로 분화할 수 있다. 본원에서, "ES 세포"라는 용어는 수정된 핵을 함유하는 배아로부터 유도된 배아 줄기 세포를 가리킨다. ES 세포는 "체세포 핵이식에 의해 유도된 배아 줄기 세포"로 지칭하는, 핵이식에 의해 제조된 배아 줄기 세포와는 구별된다.
VII. 분화를 위한 배지
본 발명의 특정 양태에 따른 분화 배지는 동물 세포를 배양하는데 사용되는 배지를 그의 기본 배지로 사용하여 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단 하나의 BMP 억제제 또는 하나의 TGF-베타 억제제를 이용하여 만능 세포를 중뇌 도파민성 신경세포로 분화시키는데 분화 배지를 사용한다. 예를 들어, 만능 세포의 분화 (예컨대, 중뇌 도파민성 세포로의 분화)를 촉진하는데 사용되는 분화 배지는, 하나의 BMP 억제제 (예컨대, LDN-193189 또는 돌소몰핀; 예를 들어, 분화 1-17일째); 소닉 헤지호그 (SHH) 신호전달의 활성화제 (예컨대, 퍼모파민, 인간 C25II SHH 또는 마우스 C24II SHH; 예를 들어, 1-6, 2-7 또는 1-7일째); Wnt 신호전달의 활성화제 (예컨대, GSK 억제제, 예를 들어, CHIR99021; 예컨대, 2-17 또는 3-17일째) 및/또는 MEK 억제제 (예컨대, PD0325901; 예를 들어, 2-4 또는 3-5일째)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 TGFβ 억제제 (예컨대, SB-431542; 예를 들어, 1-4일째)를 하나의 BMP 억제제 대신에 사용할 수 있으나; 하기 실시예에 나타낸 것과 같이, 하나의 BMP 억제제의 사용은, 하나의 TGF-β 억제제의 사용과 비교할 때, 세포의 FOXA2+/LMX1A+ 세포로의 월등한 분화를 유도하는 것으로 관찰되었다. 일부 실시양태에서, FGF-8 (예컨대, FGF-8b)은 첫째날에 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9일 또는 10일째에, 또는 이들의 임의의 조합일 (예컨대, 1-8일)에 분화 배지 중에 포함시키지 않으며; 예를 들어, 일부 실시양태에서, FGF-8은 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 및 17일째에 또는 이들의 임의의 조합일에 분화 배지 중에 포함시킨다. 다양한 실시양태에서, 상기 분화 배지는 TGFβ 및 bFGF를 함유할 수 있거나, 또는, 다르게는, 상기 분화 배지는 본질적으로 TGFβ 및 bFGF를 함유하지 않을 수도 있다.
특정 양태에서, 실시양태에 따른 분화의 방법은 다양한 배지 조건을 이용한 세포의 계대배양을 수반하는데, 예를 들어 세포들을
- 하나의 BMP 억제제 (또는 TGFβ 억제제); 소닉 헤지호그 (SHH) 신호전달의 활성화제; 및 Wnt 신호전달의 활성화제를 포함하는 배지 중에서 부착 배양으로 배양하거나;
- 하나의 BMP 억제제 (또는 TGFβ 억제제); SHH 신호전달의 활성화제; 및 Wnt 신호전달의 활성화제를 포함하는 배지 중에서 부유 배양으로 배양하여 세포 응집체를 형성하거나;
- 성숙을 위한 B27 보충제, L-글루타민, BDNF, GDNF, TGFβ, 아스코르빈산, 디부티릴 cAMP 및 DAPT (및 필요에 따라 외부에서 추가된 레티놀 또는 레티노산을 결핍시킴)를 포함하는 신경세포배양용 배지 중에서 부착 배양으로 배양한다.
기본 배지로는 조성이 화학적으로 명백한 임의의 한정 배지, 예컨대 이글 기본 배지 (BME), BGJb, CMRL 1066, 글래스고(Glasgow) MEM, 개량된 MEM 아연 옵션, 이스코브의 변형된 둘베코 배지 (IMDM), 배지 199, 이글 MEM, αMEM, DMEM, 햄(Ham), RPMI 1640 및 피셔 배지, 및 이들의 변이형 또는 조합을 사용할 수 있으며, 여기서 TGFβ 및 bFGF는 포함시키거나 포함시키지 않아도 된다.
추가의 실시양태에서, 상기 세포 분화 환경은 보충제, 예컨대 B-27 보충제, 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄 (ITS) 보충제, L-글루타민, NEAA (비-필수 아미노산), P/S (페니실린/스트렙토마이신), N2 보충제 (5 μg/mL의 인슐린, 100 μg/mL의 트랜스페린, 20 nM의 프로게스테론, 30 nM의 셀레늄, 100 μM의 푸트레신 [보텐슈타인(Bottenstein) 및 사토(Sato), 1979 PNAS USA 76, 514-517) 및/또는 β-머캅토에탄올 (β-ME)도 함유할 수 있다. 피브로넥틴, 라미닌, 헤파린, 헤파린 설페이트, 레티노산을 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가의 인자들을 포함시키거나 포함시키지 않을 수도 있다.
분화 배지에 성장 인자를 첨가하거나 첨가하지 않을 수도 있다. 상기 개괄한 인자들 이외에 또는 이들 대신에, 상피 성장 인자 부류 (EGF)의 구성원, FGF2 및/또는 FGF8을 비롯한 섬유아세포 성장 인자 부류 (FGF)의 구성원, 혈소판 유래 성장 인자 부류 (PDGF)의 구성원, 형질전환 성장 인자 (TGF)/뼈 형성 단백질 (BMP)/성장 및 분화 인자 (GDF) 인자 부류 길항제와 같은 성장 인자들을 공정 중의 다양한 단계에서 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, FGF-8을 본원에 기술된 바와 같은 분화 배지 중에 포함시킨다. 분화 배지에 첨가하거나 첨가하지 않을 수도 있는 기타 인자들로는, 노치 (Notch) 수용체 부류를 통해 신호전달을 활성화 또는 비활성화할 수 있는 분자, 예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 델타 유사 부류 및 지그재그 (Jagged) 부류의 단백질 및 감마 세크레타아제 억제제, 및 노치의 처리 또는 절단에 대한 기타 억제제, 예컨대 DAPT를 포함한다. 기타 성장 인자로는 인슐린 유사 성장 인자 부류 (IGF), 날개 퇴화 관련 (WNT) 인자 부류, 및 헤지호그 인자 부류의 구성원들을 포함할 수 있다.
신경 줄기 세포/전구 세포의 증식과 생존, 및 신경세포의 생존과 분화를 촉진시키기 위해, 응집체 형성 및/또는 분화 배지 중에 추가의 인자들을 첨가할 수 있다. 이러한 신경영양 인자들로는, 이에 제한되지는 않지만, 신경 성장 인자 (NGF), 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF), 신경성장인자-3 (NT-3), 신경성장인자-4/5 (NT-4/5), 인터루킨-6 (IL-6), 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 백혈병 억제 인자 (LIF), 카디오트로핀, 상기 형질전환 성장 인자 (TGF)/뼈 형성 단백질 (BMP)/성장 및 분화 인자 (GDF) 부류의 구성원, 교세포 유래 신경영양 인자 (GDNF) 부류, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 뉴투린, 뉴블라스틴/아르테민 및 페르세핀, 및 간세포 성장 인자를 비롯한 인자들 및 이와 관련된 인자를 포함한다. 최종 분화되어 유사분열 후의 신경세포를 형성하는 신경 배양물도 유사분열 억제제 또는 유사분열 억제제의 혼합물을 포함할 수 있는데, 그러한 분열 억제제로는 이에 한정되지는 않지만, 5-플루오로 2'-데옥시우리딘, 마이토마이신 C 및/또는 사이토신 β-D-아라비노-후라노사이드 (Ara-C)를 포함할 수 있다.
배지는 혈청을 함유하거나 무혈청 배지일 수 있다. 상기 무혈청 배지는 처리되지 않거나 정제되지 않은 혈청이 포함되지 않은 배지를 가리킬 수 있고, 이에 따라 정제된 혈액 유래 성분들 또는 동물 조직에서 유래하는 성분들 (예컨대, 성장 인자)을 갖는 배지를 포함할 수 있다. 이종성인 동물 유래의 성분에 의한 오염을 방지한다는 측면에서, 혈청은 줄기 세포(들)의 것과 동일한 동물로부터 유래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 배지는 한정 배지이고, 상기 배지는 혈청 또는 다른 동물의 조직에서 유래한 성분을 함유하지 않는다 (예컨대, 방사능을 조사한 마우스 섬유아세포 또는 배지는 방사능을 조사한 섬유아세포 배양보조세포로 컨디셔닝시킴).
배지는 혈청에 대한 임의의 대체물을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 혈청에 대한 대체물로는 알부민 (예컨대, 지질이 풍부한 알부민, 알부민 대체물, 예컨대 재조합 알부민, 식물성 전분, 덱스트란 및 단백질 가수분해산물), 트랜스페린 (또는 다른 철 운반체), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량원소, 2-머캅토에탄올, 3'-티올글리세롤 또는 이의 균등물을 적절하게 함유하는 물질을 포함할 수 있다. 혈청에 대한 대체물은, 예를 들어 국제특허공보 WO 98/30679호에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다. 다르게는, 보다 편리하게 임의의 시판중인 물질을 사용할 수 있다. 상기 시판중인 물질로는 녹아웃 혈청 대체물 (KSR) 및 화학적으로 합성된 지질 농축물 (Gibco)을 포함한다.
배지는 지방산 또는 지질, 아미노산 (예컨대 비필수 아미노산), 비타민(들), 성장 인자, 사이토카인, 항산화 물질, 2-머캅토에탄올, 피루브산, 완충제 및 무기 염을 포함할 수도 있다. 2-머캅토에탄올의 농도는, 예를 들어, 약 0.05 내지 1.0 mM, 특히 약 0.1 내지 0.5 또는 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 0.8, 1, 1.5, 2, 2.5, 5, 7.5, 10 mM 또는 상기 임의의 중간 농도값일 수 있지만, 상기 농도는, 줄기 세포(들)을 배양하는데 적절하기만 하다면, 특별히 제한을 두지 않는다.
특정 실시양태에서, 만능 줄기 세포를 응집체가 형성되기 전에 (예컨대, 응집체 형성을 유도하기 위해 하나의 세포 또는 작은 응집체로 해리되기 전에) 배지 중에서 배양하여 신경 유도 및 층판 패터닝을 향상시킨다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 배양보조세포, 배양보조세포 추출물 및/또는 혈청의 부재 하에 배양할 수 있다.
B. 배양 조건
세포를 배양하는데 사용되는 배양 용기는, 줄기 세포를 배양할 수 있는 것이라면 특별히 제한을 두지는 않지만, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 접시, 페트리 접시, 조직 배양용 접시, 멀티 접시, 마이크로 플레이트, 마이크로웰 플레이트, 멀티플레이트, 멀티웰 플레이트, 마이크로 슬라이드, 챔버 슬라이드, 튜브, 트레이, CellSTACK® 챔버, 배양백 및 회전병을 포함할 수 있다. 세포는 배양의 필요에 따라 적어도 또는 약 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 800, 1000, 1500 mL 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위의 부피 중에서 배양될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 배양 용기는 생물학적으로 활성인 환경을 지원하는 임의의 장치 또는 시스템으로 지칭할 수 있는 생물반응기일 수 있다. 상기 생물반응기는 적어도 또는 약 2, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500 리터, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 입방 미터 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위의 부피를 가질 수 있다.
상기 배양 용기 표면은 용도에 따라 세포 접착제를 사용하거나 사용하지 않고 제조할 수 있다. 상기 세포 부착성 배양 용기는, 용기 표면의 세포에 대한 부착성을 향상시키기 위해 세포 부착을 위한 임의의 기질, 예컨대 세포외 기질 (ECM)로 코팅할 수 있다. 세포 부착에 사용되는 기질은 (사용되는 경우) 줄기 세포 또는 배양보조세포를 부착시키기 위한 임의의 물질일 수 있다. 세포를 부착시키기 위한 기질의 비제한적인 예로는 콜라겐, 젤라틴, 폴리-L-리신, 폴리-D-리신, 폴리-L-오르니틴, 라미닌, 비트로넥틴 및 피브로넥틴, 및 이들의 혼합물, 예를 들어, 엥겔브레스-홀름-스왐(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스 육종 세포 (예컨대 MatrigelTM 또는 Geltrex)의 단백질 혼합물 및 용해된 세포막 제제 (Klimanskaya et al., 2005)를 포함한다.
다른 배양 조건들은 적절하게 정의될 수 있다. 예를 들어, 배양 온도는 약 30 내지 40℃, 예를 들어, 적어도 또는 약 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39℃일 수 있지만, 특별히 이들에 제한되지 않는다. CO2 농도는 약 1 내지 10%, 예를 들어, 약 2 내지 7% 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위일 수 있다. 산소 분압은 적어도 또는 약 1, 5, 8, 10, 20% 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위일 수 있다.
특정 양태에서, 부착 배양을 사용할 수 있다. 이 경우, 세포를 배양보조세포의 존재 하에 배양할 수 있다. 배양보조세포를 본 발명의 방법에 사용하는 경우, 태아 섬유아세포와 같은 기질(stromal) 세포를 배양보조세포로 사용할 수 있다 (예를 들어, 하기 참조; Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual (1994); Gene Targeting, A Practical Approach (1993); Martin (1981); Evans et al. (1981); Jainchill et al., (1969); Nakano et al., (1996); Kodama et al. (1982); 및 국제특허공보 01/088100호 및 2005/080554호).
다른 양태에서, 부유 배양을 사용할 수 있다. 부유 배양은 담체 (Fernandes et al., 2007) 또는 겔/생체고분자 캡슐화 (미국 특허 공보 2007/0116680호)를 사용한 부유 배양을 포함할 수 있다. 줄기 세포의 부유 배양은, 줄기 세포를 배양 용기 또는 배지 중의 배양보조세포 (사용하는 경우)에 대하여 접착시키지 않는 조건 하에 배양하는 것을 의미한다. 줄기 세포의 부유 배양은 일반적으로 줄기 세포의 분리 배양 및 줄기 세포의 응집 부유 배양을 포함한다. 줄기 세포의 분리 배양은 부유된 줄기 세포를 배양하는 것을 의미하고, 상기 줄기 세포의 분리 배양은 하나의 세포에 대한 분리 배양 또는 다수의 줄기 세포(예를 들어, 약 2 내지 400 개의 세포)로 구성되어 있는 소세포 응집체에 대한 분리 배양을 포함한다. 전술한 분리 배양을 계속하는 경우, 상기 배양된 분리된 세포들이 줄기 세포의 더 큰 응집체를 형성한 후, 응집 부유 배양을 실시할 수 있다. 상기 응집 부유 배양으로는 배양체 배양 방법 (Keller et al., 1995 참조) 및 SFEB (무혈청 분리 배양체) 방법 (Watanabe et al., 2005; 국제특허공보 2005/123902호)을 들 수 있다.
C. 만능 줄기 세포의 배양
만능 줄기 세포, 예컨대 ES 세포를 제조 및 배양하는 방법은 세포 생물학, 조직 배양, 및 발생학, 예컨대 기형암종 및 배아 줄기 세포의 표준 교본과 총설에서 찾아볼 수 있다: [Guide to Techniques in Mouse Development (1993)]; [Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro (1993)]; [Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy (1998)] (상기 모두 본원에 참조로 포함됨). 조직 배양에 사용되는 표준 방법들은 일반적으로 [Animal Cell Culture (1987)]; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (1987)]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology (1987 & 1995)]에 기술되어 있다.
체세포를 재프로그래밍 인자들에 도입하거나 이들과 접촉시킨 후, 상기 세포들을 만능성 및 미분화 상태를 유지하기에 충분한 배지 중에서 배양할 수 있다. 유도성 만능 줄기 (iPS) 세포의 배양은, 예를 들어 미국특허공보 2007/0238170호, 미국특허공보 2003/0211603호 및 미국특허공보 2008/0171385호 (이들은 본원에 참조로 포함됨)에 기술된 바와 같이, 영장류 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포 또는 iPS 세포를 배양하기 위해 개발된 다양한 배지와 기법들을 사용할 수 있다. 당업계의 숙련자에게 공지되어 있는 바와 같은 만능 줄기 세포를 배양 및 유지하기 위한 그 밖의 방법들도 본 발명에 사용할 수있다.
특정 실시양태에서, 비한정 조건이 사용될 수 있는데; 예를 들어, 만능 세포는 섬유아세포 배양보조세포 또는 줄기 세포를 미분화 상태로 유지하기 위해 섬유아세포 배양보조세포에 노출시킨 배지 상에서 배양될 수 있다. 다르게는, 한정된, 배양보조세포 독립적인 배양 시스템, 예컨대 TeSR 배지 (Ludwig et al., 2006a; Ludwig et al., 2006b) 또는 E8 배지 (Chen et al., 2011; PCT/US2011/046796호)를 사용하여, 만능 세포를 본질적으로 미분화된 상태로 배양 및 유지할 수 있다. 배양보조세포 독립적인 배양 시스템 및 배지를 사용하여 만능 세포를 배양 및 유지할 수 있다. 이러한 접근법으로 마우스 섬유아세포의 "배양보조세포층"을 사용하지 않고도 인간 만능 줄기 세포를 본질적으로 미분화된 상태로 유지할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 필요에 따라 비용을 줄이기 위해 상기 방법들에 다양한 변형을 가할 수 있다.
인간 만능 줄기 세포를 배양, 유지 또는 분화시키는데 다양한 기질 성분들을 사용할 수 있다. 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Ludwig et al. (2006a; 2006b)]에 기술된 바와 같이, 만능 세포 성장을 위한 고체 지지체를 제공하는 수단으로서 배양 표면을 코팅하는데 콜라겐 IV, 피브로넥틴, 라미닌 및 비트로넥틴을 조합하여 사용할 수 있다.
MatrigelTM도 인간 만능 줄기 세포의 세포 배양 및 유지를 위한 기질을 제공하는데 사용될 수 있다. MatrigelTM은 마우스 종양 세포에 의해 분비되는 젤라틴성 단백질 혼합물로서, BD 바이오사이언시즈(Biosciences) (미국 뉴저지주 소재)에서 시판된다. 상기 혼합물은 여러 조직에서 볼 수 있는 복잡한 세포외 환경을 모방하고 있으며, 세포 배양 기질로 세포 생물학자들에 의해 사용되고 있다.
D. 단일 세포 계대배양
만능 줄기 세포 배양의 일부 실시양태에서, 일단 배양 용기가 가득 차게 되면, 임의의 적합한 분리 방법에 의해 콜로니를 응집된 세포 또는 심지어 단일 세포까지 나눈 후, 세포들을 계대배양을 위한 새로운 배양 용기로 옮긴다. 세포 계대배양 또는 분할은 세포가 배양 조건에서 장기간 동안 생존 및 성장할 수 있게 하는 기법이다. 세포는 일반적으로 약 70%-100% 전면생장(confluent)시 계대배양한다.
만능 줄기 세포의 단일 세포 분리 후 단일 세포 계대배양을 본 발명에 사용하면, 분화를 위한 세포 증식, 세포의 선별 및 확립된 분주과정을 촉진하고, 배양 절차의 기계화 및 클론의 증식을 가능하게 할 수 있는 것과 같은 여러 가지 이점이 있다. 예를 들어, 하나의 세포로부터 클론에 의해 유도된 후대 자손 세포는 유전자 구조가 상동성이 있고/있거나 세포 주기가 일치할 수 있어, 이로써 목적한 분화율을 증가시킬 수 있다. 단일 세포 계대배양을 위한 예시적인 방법은 본원에 참조로 포함되는 미국특허 공보 2008/0171385호에 기술되어 있다.
특정 실시양태에서, 만능 줄기 세포를 개별 단일 세포 또는 개별 단일 세포와 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 세포 또는 그 이상을 포함하는 작은 세포 클러스터의 조합으로 분리시킬 수 있다. 상기 분리는 기계적인 힘에 의해, 또는 세포 해리제, 예컨대 킬레이트제, 시트르산나트륨(NaCitrate), 효소, 예를 들면, 트립신, 트립신-EDTA, 아큐타제(Accutase), TrypLE 셀렉트(Select) 등에 의해 수행할 수 있다. 세포의 해리는 화학적 분리 (예컨대, 킬레이트제 또는 효소를 사용) 및/또는 기계적 교반을 이용하여 달성할 수 있다.
만능 줄기 세포의 공급원 및 증식의 필요에 따라, 분리된 세포들을, 개별적으로 또는 작은 클러스터로서, 적어도 또는 약 1:2, 1:4, 1:5, 1:6, 1:8, 1:10, 1:20, 1:40, 1:50, 1:100, 1:150, 1:200 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위와 같은 분할 비율로 새로운 배양 용기에 옮길 수 있다. 부유 배양 세포주의 분할 비율은 배양 세포 현탁액의 부피에 따라 결정할 수 있다. 계대배양 간격은 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20일마다 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위일 수 있다. 예를 들어, 서로 다른 효소적 계대배양 프로토콜에서 달성가능한 분할 비율은 3-7일마다 1:2의 비율, 4-7일마다 1:3의 비율, 약 7일마다 1:5 내지 1:10의 비율, 7일마다 1:50 내지 1:100의 비율일 수 있다. 분할 비율이 높은 경우에는 계대배양 간격을 적어도 12-14일, 또는 과도한 자발적 분화 또는 세포 사멸로 인한 세포 손실이 일어나지 않는 임의의 기간으로 연장할 수 있다.
특정 양태에서, 단일 세포 계대배양은 복제 효율성과 세포의 생존율을 높이는데 효과적인 저분자, 예컨대 상기 기술된 바와 같은 ROCK 억제제 또는 미오신 II 억제제의 존재 하에서 수행할 수 있다. 이러한 ROCK 억제제 또는 미오신 II 억제제, 예컨대, Y-27632, HA-1077, H-1152 또는 블레비스타틴은, 예를 들어, 적어도 또는 약 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 내지 약 100 μM 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위의 유효 농도로 사용할 수 있다.
E. 줄기 세포의 분화
만능 줄기 세포의 신경 분화 효율 (특히, 중뇌 DA 분화 효율)을 개선하기 위해 방법을 제공할 수 있다. 만능 줄기 세포의 분화는, 부착된 콜로니 중에서, 또는 예컨대, 저부착성 환경에서 세포 응집체의 형성 [상기 응집체를 배양체(EB)라 칭함]에 의해서와 같이 다양한 방식으로 유도할 수 있다. EB 내에서의 분자 및 세포 형태형성 신호 및 사건들은 발달중인 배아에 있어서 이러한 세포들의 자연적 개체발생의 여러가지 양태들을 모방하고 있다. 세포를 신경세포 분화로 유도하는 방법은, 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국특허 공보 2012/0276063호에 제시되어 있다. DA 신경세포 분화를 위한 보다 상세하고 구체적인 프로토콜은 본원에 참조로 포함되는 PCT 공보 WO2013/067362호에 제시되어 있다.
배양체 (EB)는 만능 줄기 세포, 예컨대 ES 세포 또는 iPS 세포로부터 유도된 세포의 응집체이며, 마우스 배아 줄기 세포와 함께 수년간 연구되어 왔다. 생체내 분화에 관련된 신호의 일부를 재현하기 위해, 중간 단계로 3차원 응집체 (즉, 배양체)를 생성할 수 있다. 세포 응집이 개시되면, 분화가 개시될 수 있고, 세포는 제한된 범위까지 배아 발생을 재현할 수 있다. 이들은 (태반을 포함하는) 영양외배엽 조직을 형성할 수는 없지만, 생물체 내에 존재하는 사실상 모든 다른 형태의 세포를 발생시킬 수 있다. 본 발명은 응집체 형성 후 신경 분화를 더욱 촉진시킬 수 있다.
세포 응집은 비조직 배양으로 처리된 플레이트 또는 스피너 플라스크에 플레이팅하는 현적(hanging drop)에 의해 실시할 수 있는데, 어떤 방법을 사용하던 간에 세포가 표면에 부착하여 통상적인 콜로니를 형성하는 것을 방지한다. 만능 줄기 세포를 배양하기 위해 응집 형성 전, 응집 형성 동안 또는 응집 형성 후에 ROCK 억제제 또는 미오신 II 억제제를 사용할 수 있다.
세포 배양 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 응집 촉진 배지 중에 만능 줄기 세포를 분주할 수 있다. 예를 들어, 만능 줄기 세포를 단일 콜로니 또는 클론 그룹으로 응집 촉진 배지 중에 분주할 수 있으며, 만능 줄기 세포를 본질적으로 개별 세포로 분주할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포를 당업계에 공지된 기계적 또는 효소적 방법을 사용하여 본질적으로 개별 세포들로 해리시킬 수 있다. 비제한적인 예로서, 만능 줄기 세포를 세포와 배양 표면 간 및 세포들 간의 연결을 끊는 단백질분해 효소에 노출시킬 수 있다. 응집 형성 및 분화를 위한, 만능 줄기 세포를 개별적으로 분리하는데 사용될 수 있는 효소로는, 이에 제한되지는 않지만, TrypLE와 같은 다양한 시판 제제의 트립신, 또는 아큐타제®와 같은 효소들의 혼합물을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 배양 표면에 배양물을 형성하기 위해 만능 세포를 본질적으로 개별 (또는 분산된) 세포로 배지에 첨가 또는 분주할 수 있다.
예를 들어, 분산된 만능 세포를 배양 배지 중에 분주할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 배양 표면은 본질적으로 당업계의 표준 무균 세포 배양법에 적합한 임의의 물질, 예를 들어, 비부착성 표면으로 이루어질 수 있다. 배양 표면은 본원에 기술된 바와 같은 기질 성분을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기질 성분은 배양 표면을 세포 및 배지와 접촉시키기 전에 상기 배양 표면에 도포할 수 있다.
분화를 유도하는데 사용될 수 있는 기질로는 예컨대 콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌, Matrigel 등을 들 수 있다. 또한, 세포를 증식 유도성 성장 인자의 존재 하에 현탁액 중에 방치하여 증식을 재개시키지 않으면서 (즉, 신경구를 해리시키지 않으면서) 분화를 유도할 수도 있다.
일부 실시양태에서, 세포를 배양 배지 중의 고정된 기질 위에서 배양한다. 이후, 증식 유도성 성장 인자를 상기 세포에 투여할 있다. 상기 증식 유도성 성장 인자는 세포를 기질 (예컨대, 폴리오르니틴으로 처리된 플라스틱 또는 유리)에 부착시키고, 편평하게 하여, 서로 다른 세포 형태로 분화되도록 할 수 있다.
V. 비정치(Non-static) 배양
특정 양태에서, 만능 줄기 세포의 배양 및 분화를 위해 비정치 배양을 이용할 수 있다. 비정치 배양은 예를 들어, 진탕식, 회전식 또는 교반식 플랫폼 또는 배양 용기, 특히 대용량 회전식 생물반응기를 사용함으로써 세포의 운동 속도를 일정하게 제어하는 임의의 배양일 수 있다. 일부 실시양태에서, 로커 테이블(rocker table)을 사용할 수 있다. 교반은 영양분 및 세포 노폐물 순환을 개선시킬 수 있고, 보다 균일한 환경을 제공함으로써 세포의 응집을 제어하기 위해서도 사용된다. 예를 들어, 회전 속도는 적어도 또는 최대 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 rpm 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위로 설정할 수 있다. 만능 줄기 세포, 세포 응집체, 분화된 줄기 세포 또는 여기서 유래된 후대 자손 세포의 비정치 배양에서의 배양 기간은 적어도 또는 약 4시간, 8시간, 16시간, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6일 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7주 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위일 수 있다.
VI. 유전자 변형 및 세포의 정제
일부 실시양태에서, 유전자 조작된 만능 세포 (예컨대, 만능 세포 또는 DA 신경세포)를 사용한다. 폴리뉴클레오타이드를 임의의 적절한 인위적 조작 방법에 의해 세포 내로 도입시킨 경우, 또는 해당 세포가 상기 폴리뉴클레오타이드를 물려받은 당초 변형된 세포의 후대 자손인 경우의 세포를 "유전자 변형되거나" 또는 "유전자 이식되었다"라고 한다. 일부 실시양태에서, 세포는 예를 들어, MAP2 프로모터와 같은 신경세포 프로모터의 제어 하에 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 마커 유전자는 항생제 내성 유전자이고, 세포 배양물을 항생제에 노출시키기 때문에, 신경 세포로 분화되지 않은 세포를 사멸시킴으로써 신경 세포를 정제할 수 있다. 예를 들어, MAP2 프로모터의 제어 하에 네오마이신 유전자를 발현하는 세포를 G418에 노출시켜 비신경 세포를 사멸시킬 수 있다. 본 발명에 사용할 수 있는 추가의 방법은 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 14/664,245호(해당 특허에 대한 권리에 대한 포기 없이 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 해당 세포를 유사분열 억제제 또는 화학요법제에 노출시켜 분열하는 세포를 사멸시킴으로써 도파민성 신경세포를 포함하는 세포의 집단을 정제할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법으로 생성된 중뇌 DA 세포를 포함하는 세포의 집단은, 해당 세포를 마이토마이신 C에 접촉시켜 분열하는 세포를 사멸시킴으로써 정제할 수 있다.
VII. 도파민성 신경세포의 이용
본 발명의 특정 양태의 방법 및 조성물에 의해 제공된 DA 신경세포는 다양한 용도로 사용될 수 있다. 이들의 예로는 이에 한정되지 않지만, 몇 가지 예를 들자면, DA 신경세포의 생체내 이식 또는 주입; 세포 독성 화합물, 발암물질, 돌연변이원 성장/조절 인자, 약학적 화합물 등의 시험관내 스크리닝; 신경퇴행 기작에 대한 해명; 약물 및/또는 성장 인자가 작용하는 기작에 대한 연구; 유전자 요법; 및 생물학적 활성 제품의 제조를 포함한다.
A. 시험 화합물 스크리닝
본 발명의 중뇌 DA 신경세포를 사용하여 본원에 제공된 DA 신경세포의 특성에 영향을 주는 인자 (예컨대, 용매, 소분자 약물, 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드) 또는 환경 조건 (예컨대, 배양 조건 또는 조작)에 대하여 스크리닝을 할 수 있다.
일부 용도에서, 줄기 세포 (분화 또는 미분화)를 사용하여 신경 계통을 따라 세포의 성숙을 촉진하거나, 또는 장기간의 배양에 있어서 이러한 세포들의 증식 또는 유지를 촉진하는 인자들을 스크리닝한다. 예를 들어, 신경 성숙 인자 또는 성장 인자에 대한 후보물질을 서로 다른 웰 중의 줄기 세포에 첨가한 후, 세포에 대한 추가의 배양 및 사용에 대한 바람직한 기준에 따라 결과적으로 나타난 임의의 표현형 변화를 살펴봄으로써 상기 후보물질을 시험할 수 있다.
본 발명의 구체적인 스크리닝 용도는 약물 연구에서 약학 화합물을 시험하는 것에 관한 것이다. 표준 시험 방법은 예컨대, 문헌 [In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997]에 제시되어 있다. 실시양태 중 특정 양태에서, 본원에 상술한 방법으로 생성된 세포는, 이전에 단기간의 배양으로 1차 신경세포에 대하여 실시된 바와 같이, (예를 들어, 기능에 대한 세부사항을 식별, 확인 및 시험하기 위해서나, 또는 세포 계통 특이적인 질환을 치료하기 위해 치료 분자의 전달에 대해 시험하기 위해) 표준 약물 스크리닝 및 독성 분석을 위한 시험 세포로 사용할 수 있다. 후보 약학 화합물에 대한 활성 평가는, 일반적으로 본 발명의 특정 양태에 제공된 신경세포를 후보 화합물과 혼합하는 단계, 상기 화합물로 인한 세포에 있어서의 전기생리학, 형태, 마커 표현형 또는 대사 활성의 임의의 모든 변화를 (처리되지 않은 세포 또는 비활성 화합물로 처리된 세포와 비교하여) 측정하는 단계, 및 이후 상기 화합물의 효과를 관찰된 변화를 연관시키는 단계를 수반한다. 상기 스크리닝은, 해당 화합물이 신경세포에 대하여 약리학적 효과를 가지도록 고안되었기 때문에, 또는 어딘가 효과를 갖도록 고안된 화합물이 의도치 않은 부작용을 가질 수 있기 때문에 수행할 수 있다. 있을 수 있는 약물-약물간 상호작용 효과를 검출하기 위해, 2개 이상의 약물을 조합 (세포와 동시에 혼합 또는 연속적으로 혼합)하여 시험할 수도 있다.
일부 용도에서, 화합물을 잠재적인 신경독성에 대하여 초기에 스크리닝한다. 세포독성은 세포 생존력, 생존, 형태 또는 배양액 배지로의 효소의 누출에 대한 영향에 의해 우선적으로 먼저 측정될 수 있다. 보다 상세한 분석을 수행하여 해당 화합물이 독성을 유발하지 않으면서 세포 기능 (예컨대, 신경전달)에 영향을 주는지의 여부를 결정한다.
B. 중추 신경계 질환의 치료
1. 중추 신경계 질환
중추 신경계 (CNS) 질환이 있는 개체에서 신경 세포를 재생시키기 위해 도파민성 신경세포, 예컨대 유사분열후 중뇌 DA 신경세포를 이식할 수 있다. 일부 실시양태에서, CNS 질환을 치료하기 위해 본 발명의 방법에 따라 생성된 중뇌 DA 신경세포를 대상체에게 투여할 수 있다 (예컨대, 파킨슨병을 치료하기 위해 대뇌 또는 중뇌, 예컨대 미상핵, 경막 또는 흑질에 투여함). 이러한 질환으로는, 이에 제한되지는 않지만, 신경퇴행성 질환, 예컨대 파킨슨증을 포함할 수 있다.
본원에서, "파킨슨증(parkinsonism)"이라는 용어는 움직임을 제어하는 대뇌의 한 부분인 기저핵에서 도파민 부족과 연관된 일군의 질환을 일컫는다. 그 증상으로는 떨림, 운동완만증(움직임이 매우 느려짐), 굽은 자세, 자세 불안정 및 경직을 포함한다. 파킨슨증으로 진단되려면 상기 증상들 중 적어도 2개가 있어야 하며, 그 중 하나는 떨림 또는 운동완만증이어야 한다. 가장 일반적인 형태의 파킨슨증은 특발성 또는 고전적 파킨슨병(parkinson's disease)(PD)이나, 진단된 전체 환자 중 상당히 소수인 약 15%는 파킨슨 플러스 증후군 (PPS) 중 하나가 존재할 수 있다. 이러한 증후군은 비정형 파킨슨증으로도 알려져 있으며, 대뇌피질기저핵 변성, 루이소체 치매, 다계통 위축증 및 진행성 핵상마비를 포함한다. 일반적으로, 파킨슨병은 대뇌에서, 주로 흑질이라 불리는 대뇌의 영역에서의 중요한 신경 세포의 기능 부전 및 사멸과 관련이 있다. 이러한 중요한 신경 세포 대다수가 도파민을 생성한다. 이러한 신경 세포가 죽게되면, 도파민의 양이 감소하여 사람이 정상적으로 움직임을 제어할 수 없게 된다. 파킨슨병 환자는 장에도 퇴행중인 도파민 세포를 가지고 있어, 이것이 파킨슨병의 일부인 위장 증상의 중요한 발생 원인일 수 있다. 개개인이 경험하는 구체적인 증상들은 사람마다 각기 다를 수 있다. 파킨슨병의 1차적인 운동 징후로는 손, 팔, 다리, 턱 및 안면의 떨림, 운동완만증 즉 움직임의 느림, 사지와 몸통의 경직 또는 경축, 및 자세 불안정 또는 균형력과 조정력의 손상을 포함한다.
2. 세포 투여 방법
줄기 세포 또는 분화 세포를 대상체에게 국소적으로 또는 전신적으로 투여할 수 있다. 대상체에 DA 신경세포를 투여하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 환자가 자신의 세포로부터 유래된 세포를 투여받는 경우, 이를 자가 이식이라 부르며; 이러한 이식은 거부 반응이 생길 가능성이 낮다.
대상체, 특히 인간 대상체에 줄기 세포 또는 분화 신경 세포를 투여하는 예시적인 방법으로는, 대상체의 목표 부위 (예컨대, 줄무늬체 및/또는 흑질)로 세포를 주사하거나 이식하는 것을 포함한다. 상기 줄기 세포 및/또는 DA 신경세포는, 주사 또는 이식에 의하여 해당 세포를 대상체 내로 용이하게 도입하게 해주는 전달 장치에 삽입할 수도 있다. 이러한 전달 장치로는, 예를 들어, 세포 및 유체를 수용자의 체내로 주입하기 위한 관 (예컨대, 카테터)을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 관은 예컨대 주사기와 같이 추가로 바늘을 구비하여, 이를 통하여 본 발명의 세포를 대상체의 원하는 부위에 도입할 수 있다. 상기 줄기 세포를 이러한 전달 장치, 예컨대, 서로 다른 형태의 주사기에 삽입할 수 있다. 예를 들어, 세포를 용액 중에 현탁시키거나, 세포 응집체 중에 포함시키거나, 또는 다르게는 상기 전달 장치 중에 함유되어 있는 경우에는 지지 기질에 매립시킬 수 있다.
상기 줄기 세포 또는 신경 세포를 도입하거나 매립할 수 있는 지지 기질로는, 수용자에게 거부 반응을 일으키지 않고 해당 수용자에 무해한 산물로 분해되는 기질을 들 수 있다. 상기 지지 기질은 자연적 (예컨대, 히알루론산, 콜라겐 등) 및/또는 합성 생분해성 기질일 수 있다. 사용될 수 있는 합성 생분해성 기질로는 폴리무수물, 폴리오르쏘에스테르 및 폴리락트산과 같은 합성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 도파민성 신경세포 (예컨대, 완전하게 분화되지 않은 도파민성 신경세포)를 히알루론산 기질에 매립하고 이를 대상체에 투여하여 신경퇴행성 질환 (예컨대, 파킨슨병)을 치료한다.
본원에서, "용액"이라는 용어는 본 발명의 세포가 생존가능한 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제로는 식염수, 수성 완충 용액, 용매 및/또는 분산매를 들 수 있다. 이러한 담체 및 희석제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 상기 용액은 무균성이며 용이한 주사기 주입성(Syringeability) 정도의 유체인 것이 바람직하다.
상기 용액은 제조 및 저장 조건 하에 안정하여 세균 및 곰팡이류와 같은 미생물의 오염 작용에 대하여 보존되는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, DA 신경세포 또는 중뇌 DA 신경세포를 함유하는 용액을 BSS PLUS [미국 텍사스주 포트워스 소재의 알콘(Alcon)사 제조]의 멸균 용액으로 환자에게 투여한다. 필요하다면, 투여용 약학 조성물에 보존제 또는 항생제를 포함시킬 수 있다. 본 발명의 용액은 신경 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 중의 본원에 기술된 바와 같은 신경세포 및 필요에 따라 기타 성분들을 도입하여 제조할 수도 있다.
3. 용량 및 투여
한 양태에서, 본원에 기술된 방법은 대상체에서 전구세포 또는 DA 신경세포의 이식을 향상시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 대상체는 포유동물일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 포유동물은 인간일 수 있으나, 본 발명은 모든 포유동물에 대하여 효과적이다.
조성물은 해당 제형에 적절한 방식으로 투여하고, 치료에 유효한 양으로 투여된다. 투여되는 양과 시기는 치료되는 대상체, 활성 성분을 이용함에 있어서 대상체 계의 수용력 및 원하는 치료 효과의 정도에 따라 다르다. 투여될 각 활성 성분의 정확한 필요량은 의사의 판단에 따라 다르며, 각 개인에 따라 특유하다. 그러나, 적절한 용량 범위는 투여 경로에 따라 다르다. 적절한 투여 처방계획도 다양하다.
4. 효능
당업자라면 DA 신경세포 이식을 향상시기키 위해 제공된 치료의 효능을 측정할 수 있다. 그러나, 예를 들어, 좋지 않은 DA 신경세포 이식의 징후 또는 증상 중 어느 하나 또는 모두가 유익한 방식으로 변화하거나, 다른 임상적으로 허용가능한 증상들이 호전되거나, 또는 심지어 예를 들어, 본원에 기술된 세포 집단을 사용하여 치료한 후 적어도 10% 개선되는 경우, 그 치료는 본원에서 사용하는 용어인 "효과적인 치료"로 간주된다. 또한, 효능은 입원, 의료적 개입 (즉, 질병의 진행을 정지시킬) 필요성, 또는 이식 실패의 빈도로 평가했을 때 환자 상태의 악화 실패로도 측정할 수도 있다. 이러한 지표를 측정하는 방법은 당업자에게 알려져 있고/있거나 본원에 기재되어 있다. 치료는 환자 또는 동물 (일부 비제한적인 예로 인간이나 포유동물을 포함함)의 질병에 대한 임의의 치료를 포함하며, 하기를 포함한다: (1) 질병을 억제하는 것, 예컨대, 이식 실패를 방지하는 것; 또는 (2) 질병을 완화시키는 것, 예컨대, 증상의 퇴보를 초래하는 것. 질병의 치료에 대한 유효량이라는 것은, 치료가 필요한 포유동물에 투여하는 경우, 해당 질병에 대한 치료 또는 치료적 효과를 유도하기에 충분한 양을 의미한다. 제제의 효능은 예를 들어, DA 신경세포 이식에 대한 물리적인 지표, 예컨대, 떨림, 운동완만증, 굽은 자세, 균형력과 조정력을 평가함으로써 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이식 또는 신경 작용은, 대사 또는 활성 또는 도파민계 시스템을 측정하기 위한 PET 스캔을 사용하여 (예컨대, 도파민계 시스템의 이미지화를 위한 PET 트레이서를 사용하여) 생체내에서 (예컨대, 인간에서) 측정할 수 있다. 효능은 파킨슨병의 동물 모델에서 예를 들어, 스텝 검사 또는 실린더 검사와 같은 행동기능 검사를 수행하여 평가할 수 있다.
C. 상업적, 치료적 및 연구 목적을 위한 유통
제조, 유통 및 사용의 목적을 위해, 본원에 기술된 신경 세포, 예컨대 중뇌 DA 신경세포는, 정상적으로 등장성 부형제 또는 배양 배지 중의 세포 배양액 또는 현탁액의 형태로 제공될 수 있으며, 필요에 따라서 운송 또는 보관을 용이하게 하기 위해 동결되어 제공된다.
본원에 기술된 신경 세포는, 제조, 유통 또는 사용하는 동안 어느때라도 생존하는 세포의 세트 또는 조합을 포함하는 서로 다른 시약 시스템으로 제공될 수 있다. 세포의 세트는 본 발명에 기재된 2종 이상의 세포 집단의 임의의 조합, 예컨대, 이에 한정되지는 않지만, 프로그래밍 유래 세포 (신경 계통 세포, 이들의 전구체 및 하위 유형)와 미분화된 줄기 세포 또는 다른 미분화된 세포 유형의 조합을 포함할 수 있다. 상기 세트의 세포 집단은 동일한 유전체 또는 이의 유전자 변형된 형태를 공유할 수 있다. 상기 세트의 각 세포 유형은 동일한 단체 또는 사업상 관계를 공유하는 서로 다른 단체들의 관리 하에, 동시에 또는 다른 시기에, 동일한 시설 내에서 또는 서로 다른 장소에서, 함께 또는 별도의 용기로 포장될 수 있다.
VIII. 실시예
하기의 실시예를 들어 본 발명의 바람직한 실시양태를 설명한다. 당업계의 숙련자라면, 하기의 실시예에 기술된 기법들이 본 발명을 잘 수행하기 위해 본 발명자들에 의해 발견된 기법들을 대표하는 것이기 때문에, 발명의 수행에 대한 바람직한 양태를 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 그러나, 당업계의 숙련자라면, 본 명세서의 내용을 고려하여, 개시된 구체적인 실시양태에 있어서 본 발명의 개념과 범위를 벗어나지 않으면서 여러가지 변화를 주어도 그와 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다는 사실을 알 수 있을 것이다.
실시예 1
재료 및 방법
표 1-5에 상술한 다양한 분화 배지 조성과 스케쥴을 사용하여, 소분자 및 성장 인자 유도로 Essential 8 배지 중 VTN-TN 상에서 증식된 인간 유도성 만능 줄기 세포 (iPS) 세포주의 중뇌 신경 분화를 수행하였다. 일반적으로, 상기 iPS 세포를 1일째에 D1 DA 신경세포 유도 배지, 2일째에 D2 신경세포 유도 배지, 3일과 4일째에 D3-D4 DA 유도 배지 중에서 배양하였다. 5일째에, 상기 세포들을 TrypLE로 15분간 해리시켜 DA 급랭(Quench) 배지 중에 수집한 후, 상기 세포를 스피너 플라스크 현탁 배양물에 옮겨 D5 DA 신경세포 응집 형성 배지 중에서 응집체를 형성시켰다.
6일째에, 상기 응집체를 고정시키고 배지의 약 66%를 제거한 후, 상기 응집체에 DA 신경세포 유도 배지를 공급하였다. 7-16일째에, 상기 응집체에 매일 DA 신경세포 응집 유지 배지를 공급하고, 11-16일째에 상기 배지를 교체하였다. 17일째에, 응집체를 TrypLE를 사용하여 단일세포 현탁액으로 해리하고, D17 DA 신경세포 응집 플레이팅 배지 중의 Matrigel 상에 플레이팅하였다. 18, 20, 22일째에, 상기 배지를 DopaNeuron 성숙 배지로 대체하였다. 24일째에, 상기 세포들을 아큐타제를 사용하여 해리시키고 DA 신경세포 성숙 플레이팅 배지 중에서 플레이팅하였다. 다음날, 상기 배지를 DopaNeuron 성숙 배지로 대체하였다.
27일과 29일째에, 상기 배지를 DA 신경세포 성숙 배지 + 마이토마이신 C로 대체하였다. 31일째에, 상기 세포들을 아큐타제를 사용하여 해리시키고 DA 신경세포 성숙 플레이팅 배지 중의 폴리-L-오르니틴 (PLO)/라미닌-코팅된 플라스크 상에 재플레이팅하였다. 다음으로, 32일, 34일 및 36일째에, 상기 세포에 DopaNeuron 성숙 배지를 공급하였다. 37일 또는 38일째에, 상기 세포들을 다시 아큐타제로 해리시키고 분석을 수행하거나 차후 사용을 위해 저온보존하였다.
실시예 2
단일-SMADi를 이용한 효율적인 mDA 전구세포 패터닝
공정 17일째에 FoxA2와 Lmx1을 공동 발현하는 세포의 비율로 측정한 mDA 전구세포의 효율적인 패터닝은, 일반적으로 상기 제조 공정의 종료시에 mDA 신경세포의 고집적화된 집단을 수득하는데 있어서 필요하다. 17일째에 상기 세포들 중 대부분이 mDA 전구세포가 아닌 경우, 수득된 신경 세포들은 다수의 비-중뇌 표현형 신경 세포를 가지게 될 것이거나, 또는 통상 신경세포 탈리(detachment)를 초래하거나, 또는 유사분열 후 신경 세포 정제를 어렵게하거나 불가하게 만드는 증식성 세포의 생장물을 가지게 될 것이다.
iCell DopaNeuron 공정은 대부분 1일째부터 시작하여 첨가한 전구세포 패터닝 인자를 사용하여 최적화하였다. 여기에는 신경화를 위한 인자 (이중-SMADi), 소닉 헤지호그 신호전달을 위한 인자 (Shh, PMN) 및 Wnt 신호전달을 위한 인자 (CHIR)가 포함된다. 그러나, 본 발명자들은 이러한 접근법이 단일-SMAD 억제를 이용한 신경화와 관련하여 시험된 거의 모든 iPS 세포주에는 주효하지 않았음을 밝혀냈다. 효율적인 단일-SMADi mDA 전구세포 패터닝을 위한 조건을 확립하기 위해, 수개의 iPS 세포주들에 대하여 모든 패터닝 인자들의 시기 조절과 용량을 달리하면서 여러번의 최적화 실험을 수행하였다. 도 1에 나타낸 것과 같이, 단일-SMADi mDA 전구세포 패터닝이 사전 최적화된 표준 조건 ("이중/STD")을 이용한 이중-SMADi 패터닝만큼 양호하였던 조건 ("단일/ALT")을 확인하였으며, 상기 패터닝은 표준 조건 ("단일/STD")을 이용한 단일-SMADi mDA 전구세포 패터닝에 비해 현저히 보다 효율적이었다. 대안적인 (ALT) 방법에서는, 상기 Shh/퍼모파민 첨가는 1일에서 2일로 변경하였다. 본 개선방향에서 이용된 변화로는 하기를 포함하였다: (i) Wnt 작용제의 첨가에 있어서 2일 또는 3일까지 시차를 두는 것, (ii) CHIR 농도를 재최적화하는 것 (상기 농도가 처음 첨가하는 시간에 따라 다르기 때문임), 및 (iii) PD03를 첨가하는 시간대(window)를 변경하는 것 (최적 시간대는 언제 CHIR을 첨가하느냐에 따라 달라지기 때문임). 최종적으로 다수의 iPS 세포주에서 고효율의 mDA 전구세포 형성을 유도하는 협소한 조건 세트가 만들어지는 결과가 나타났다. 시험된 iPS 세포주들 중 약 절반이 단일-SMADi 조건을 사용하여 mDA 전구세포를 생성할 수 있었다. 도 2는 최적화된 패터닝 조건을 확립하는데 사용된 기질 최적화 실험의 예를 나타낸 것이다.
도 1에 나타낸 것과 같이, FoxA2를 발현하거나 (유세포분석법에 의함) 또는 FoxA2 및 Lmx1을 공동 발현 (ICC에 의함)하는 세포의 전체 비율을 측정함으로써, 공정 17일째에 3개의 서로 다른 iPS 세포주의 mDA 전구세포에 대한 패터닝을 평가하였다. FoxA2/Lmx1 공동발현은 mDA 전구세포에 대한 가장 정확한 마커이다. 대안적인 패터닝 조건의 사용으로 단일-SMAD 억제와 관련하여 효율적인 mDA 전구세포 패터닝을 나타내었던 반면 ("단일/대안"), 표준 패터닝 조건은 일-SMAD 억제와 관련하여 좋지 않은 mDA 전구세포 패터닝을 보유하였다. 비교를 위해, 이중-SMADi 및 표준 패터닝 조건을 이용한 대조군 분화 ("이중/표준")를 나타내었다.
도 1 데이터는 모든 이중 표준 조건에 대하여 표 1에 기술된 조건들을 사용하여 얻어진 데이터를 나타낸다. 세포주 C 데이터는 단일 대안에 있어서는 표 4 및 단일 표준 조건에 있어서는 표 3에 기술된 조건을 사용하여 수득하였다. 세포주 D와 K는 단일 표준 및 단일 대안에 있어서 표2와 표 5를 따랐는데, 이는 세포주 C의 데이터는 LDN을 시험하여 수득한 반면 다른 세포주들은 돌소몰핀으로 시험하였다는 것을 의미한다.
일단, 단일-SMAD 억제를 이용한 성공적인 분화를 가능케 하였던 대안 패터닝 조건이 확인되면 (조건 1, 즉, 표 4: 대안, 200 nM 에서의 LDN), CHIR의 농도와, Shh 신호전달, Wnt 신호전달 및 MEK 억제를 위한 효율적인 치료 시간대(treatment window)를 포함하는 조건의 기질을 사용하여 상기 방법을 개량하였다. 도 2에 나타낸 것과 같이, 하기 표 6에 나타낸 조건들을 단일-SMAD 억제에 대하여 시험하였다. 표 6은 특정 화합물을 사용한 항온배양 개시일 (예컨대, "D2"는 2일째에 항온배양 개시를 나타냄)과 사용된 CHIR99021의 농도를 나타낸다. 도 2에 나타낸 것은 iPS 세포주 K에 대한 한 기질 실험의 예이다. 조건 3, 5, 7 및 9는 17일까지 가장 높은 비율의 FoxA2+/Lmx1+의 mDA 전구세포를 유도하였으며, 상기 FoxA2+ 집단은 24일째까지 유지되었다. 타이로신 하이드록실라아제 (TH) 발현은 미성숙 mDA 신경세포에서는 저조하였다. 상기 실험들을 CHIR99021 농도로 1.75 μM이 아닌 1.65 μM을 사용하여 반복하였고, 더 낮은 1.65 μM 농도의 CHIR99021을 사용하여도 mDA 전구세포의 생성에 대한 유사한 결과가 수득될 수 있었음이 관찰되었다.
5일째 되는 날에 Benzonase® [엔도뉴클레아제, EMD 밀리포어(Millipore)사 제조]를 100 U/mL의 농도로 항온배양에 포함시키는 변화를 주어 이러한 단일-SMAD 실험을 반복하였다. 5일째에 항온배양에서 Benzonase®의 첨가는 응집 형성에 있어서 과도한 응괴 형성을 감소시키거나 방지하는 것으로 관찰되었다.
"Shh"는 C25II Shh를 가리키며; "PMN"은 퍼모파민을 지칭하며; "PD03"은 PD0325901을 의미하고; "CHIR"은 CHIR99021을 가리키며; "Conc."는 농도이고; "D1", "D2" 및 "D3"은 각각 1일, 2일 및 3일을 지칭한다.
실시예 3
단일-SMAD 억제에 대한 억제제의 결정
단일-SMADi 방법에 있어서 서로 다른 억제제들의 작용에 대하여 하기와 같이 시험하였다. iCell DopaNeuron 공정은 BMP 신호전달의 억제제인 LDN-193189 (ALK 1/2/3/6을 억제하고, SMAD 1/5/8을 차단함) 및 TGF-b 신호전달의 억제제인 SB-431542 (ALK 4/5/7을 억제하고, SMAD 2/3을 차단함)를 사용하여 신경화를 유도한다. 이를 총괄하여 "이중 SMAD 억제" 또는 "이중 SMADi"로 지칭한다. 상기 MDA 공정에서 단 하나의 SMAD 억제제를 사용하여 신경화를 위한 최적의 조건을 확립하기 위해, 상술한 대안 패터닝 조건을 사용하여 다수의 iPS 세포주들에 대해 LDN-193189 및 SB-431542의 다양한 유사체들을 스크리닝하였다. 도 3에 나타낸 것과 같이, LDN-193189가, 서로 다른 iPS 세포주들에 대해 시험하는 경우, 가장 높은 비율의 mDA 전구세포를 유도하는데 있어서 전반적으로 가장 최적인 억제제인 것으로 관찰되었다. 하나의 SMAD 억제제에 대해 나타낸 데이터에 있어서, LDN-193189, 돌소몰핀 및 DMH-1은 1일 내지 17일째에 배지 중에 첨가하였던 반면, SB431542는 1일 내지 4일째에 20 μM로 배지 중에 첨가하였다.
FoxA2를 발현하거나 (유세포분석법에 의함) 또는 FoxA2 및 Lmx1을 공동 발현 (ICC에 의함)하는 세포의 전체 비율을 측정함으로써, 공정 17일째에 mDA 전구세포에 대한 패터닝을 평가하였고, 상기 결과를 도 3에 나타내었다. FoxA2/Lmx1 공동발현은 mDA 전구세포에 대한 가장 정확한 마커인 것으로 관찰되었다. LDN-193189가 다수의 iPS 세포주들에 있어서 mDA 전구세포를 신경화하는데 있어서 가장 효율적인 것으로 관찰되었다. 나타낸 모든 단일-SMADi 시험은 대안 패터닝 조건을 사용하였으며; 표준 패터닝을 사용하는 이중-SMADi 조건을 대조군으로 나타내었다. 또한, SB-431542 유사체인 LY364947 및 A-83-01도 시험하였는데, 이들은 LDN보다 더 나은 결과를 도출하지 못했다.
실시예 4
단일-SMADi에 의해 생성된 도파민성 신경세포의 정제 및 특성 분석
mDA 신경세포의 공정 중 정제: 효율적인 mDA 전구세포 패터닝에 있어서도, 성숙 중인 mDA 신경세포가 세포 사이클(약 25일)을 마친 후 조차도 지속적으로 증식하는 세포 집단이 존재한다. 이러한 원치않는 세포를 제거하기 위해, 상기 mDA 신경세포가 세포 사이클을 마친 직후, DNA 가교결합제인 마이토마이신 C (MMC)를 저용량 (50 내지 500 ng/mL)으로 4일간 (27 - 31일) 첨가하였다. 시그마 또는 토크리스(Tocris)로부터 수득한 MMC를 실험에 사용하였다. 사용된 용량과 지속시간은 유사분열 후 mDA 신경세포에 대하여 악영향이 거의 없거나 전무하였으나, 분열하는 세포를 사멸시켰다. 분열하는 세포에 독성인 여러가지 화합물을 시험하고, MMC 처리의 용량, 지속시간 및 개시일을 변화시켜 상기 접근법을 최적화하였다. 더 짧은 시간 동안에 제공된 더 높은 MMC 용량 (예를 들어, 1시간 동안 5 μg/mL)도 동일한 효과 (분열하는 세포를 사멸시킴)를 달성할 수 있음도 주목해야 한다. 중간 정도의 시간 동안에 제공된 중간 정도의 용량도 유사한 효과를 달성하는데 사용할 수 있었다. 그러나, 4일간에 걸쳐 사용했던 약 100 ng/mL의 낮은 농도의 사용은 분열하는 세포의 제거를 유도하는 것으로 관찰되었으며, 유사분열 후 신경세포에 대한 독성은 관찰되지 않았다.
도 4A에 나타낸 것과 같이, 정제없이, 상당수의 증식성 세포의 집단 (네스틴+)은 37일까지 성장하여, 44%의 유사분열 후 신경 세포 순도 (MAP2+/네스틴-)를 유도하였다 ("선별 없음"). iCell DopaNeuron 산물은 유사분열 후 신경세포의 효율적인 선별 ("G418 약물 선별")을 가능하게 하기 위해 MAP2 프로모터에 의해 유도된 neoR 유전자를 갖는 유전자 작제물을 이용하지만, 이러한 접근법은 일반적으로 임상적 사용에는 적절치 않을 수 있다. 그러나, 유사분열 후 신경세포를 정제하는데 화학요법 약물 MMC를 사용하였더니, 일관되게 >90%의 최종 신경세포 순도를 유도하였다 ("화학요법 약물 선별"). 도 4B에서 볼 수 있듯이, mDA 신경세포의 기능은, 도파민을 분비하는 능력에 의해 입증된 바와 같이, MMC 선별 후에도 유지되었으며, 다른 시험들은 유전적으로 선별된 세포인, 광범위하게 특성 분석된 iCell DopaNeuron과 어떠한 차이점도 드러내지 못했다. 중요한 점은, 장시간의 해동후 배양 후에 조차도 MMC 선별 이후에 증식성 세포의 생장이 없었다는 것이다 (도 4C).
중뇌 도파민성 (mDA) 신경 세포의 최종 순도 및 저온보존: 상술한 방법: 단일-SMAD 억제, 대안 mDA 전구세포 패터닝 및 MMC 정제를 이용하여 다수의 iPS 세포주를 분화시켜 공정을 완료하였다. 결과를 도 5에 나타내었다. 공정 완료(37일)로 진행되었던 성공적인 분화의 예로서 3개의 iPS 세포주 (C, K 및 H)를 나타내었다 (도 5). 상기 iPS 세포주 C, K 및 H는 iPS 세포주이다 (각각 21526.101, 21534.101 및 21531.101임). 대안 LDN에 대해서는 표 4 및 표준 이중 대조군에 대해서는 표 1에서의 접근법을 사용하여 데이터를 수득하였다. 상기 실험들은 단일-SMADi에 있어서 LDN-193189를 이용하였으며, 상기 대안 패터닝 변형 중 하나를 도 2에 나타내었다. 비교를 위해, 이중-SMADi를 이용한 H 세포주의 분화 및 최적화된 표준 패터닝을 나타내었다. 각 경우에서, 높은 수준의 신경 세포 순도가 관찰되었으며 (>90% MAP2+/네스틴-), 본질적으로 모든 신경세포들은 FoxA2를 공동 발현하였다. 본 발명자들은 이 단계에서 MAP2+/FoxA2+ 세포들 중 대다수도 Lmx1을 발현하기 때문에 그것이 mDA 신경세포임을 관찰하였다. 상기 DA 신경세포 표현형은 보다 성숙한 DA 신경세포에 대한 마커인, 대다수의 신경세포 중에 존재하는 타이로신 하이드록실라아제 (TH)의 발현에 의해 확인하였다.
도 6에서 볼 수 있듯이, 세포주 K로부터 제조된 mDA 신경세포를 저온보존시키고 해동후 특성 분석을 위해 해동하였다. 표 6에 나타낸 접근법을 사용하여 도 6에 나타낸 데이터를 수득하였다. 세포 생존력은 해동시 높은 것으로 관찰되었고, 대다수의 생존 세포들을 PLO-라미닌 표면 상에 플레이팅할 수 있었다 (플레이팅 효율, 도 6). 또한, 상기 해동후 세포는 해동후 3일째에 측정했을 때 MAP2+/FoxA2+/TH+의 MDA 신경세포 표현형을 보유하고 있었다. 상기 세포들은 건강한 신경돌기 생장을 나타내었고, 증식성 세포들은 부재하는 것으로 관찰되었다. 이러한 표현형 특성들은 해동후 iCell DopaNeuron에서 보였던 것과 거의 일치하였다.
실시예 5
단일-SMADi 분화 공정의 교차-iPS 세포주 시험
건강한 공여체 (공여체 ID 11378 및 11379)에서 유래한 3개의 iPS 세포주 및 파킨슨병 환자 (공여체 ID 11249, 11250 및 11251)에서 유래한 9개의 iPS 세포주를 최적화된 단일-SMADi 공정 (도 2의 "조건 9")을 사용하여 분화시켰다. 모든 iPS 세포주들은 공정 17일까지 12개의 세포주 중 11개의 세포주에서 DA 전구세포로 효율적으로 전환되었다 (>80%의 FoxA2/ Lmx1 공동 발현) (도 7A). 공정 완료 (37일)시까지, 모든 iPS 세포주의 세포들은 높은 수준의 신경 세포 순도 (>90% MAP2+/네스틴-), 중뇌 특화도 (>80% FoxA2+) 및 중뇌 도파민 신경 세포 성숙도 (>40% TH+)를 달성하였다 (도 7B). 상기 결과는 파킨슨병 환자에서 유래한 것을 비롯한 iPS 세포주에 대한 최적화된 단일 SMADi 분화 프로토콜이 매우 탄탄하다는 것을 입증하는 것이다.
실시예 6
FoxA2/ Lmx1 공동 발현에 대한 유세포분석법
FoxA2/ Lmx1 공동 발현은 성공적인 도파민 신경 세포 전구세포 패터닝에 대한 매우 중요한 판독 정보이므로, 면역세포화학 이미지에 대해 구동시킨 세포 계수 소프트웨어를 사용하여 유도한 결과보다 덜 주관적이고 변동성이 적은 세포내 유세포분석법을 개발하였다. 상기 분석법은 공정 17일 내지 24일에 FoxA2 및 Lmx1를 공동 발현하는 세포의 비율을 정확하게 정량할 수 있으며, 그 결과들은 분석된 ICC 이미지의 개수와 관련이 있다. 전구세포 패터닝은, 세포가 17일째에 >80% FoxA2+/Lmx1+이라면 성공적인 것으로 생각된다 (도 8a). 60%의 FoxA2+/Lmx1+ 세포 및 상당수의 FoxA2+/Lmx1-음성 세포 집단이 있는, 기준 이하의 전구세포 패터닝의 예시를 나타내었다 (도 8b).
실시예 7
iPSC-mDA 신경세포로부터의 도파민 방출
최적화된 단일-SMADi 프로토콜 ("조건 9")을 이용하여 iPS 세포주 "K"를 분화시켜 공정을 완료(37일)하고 저온보존 처리하였다. 세포를 해동시켜 고밀도 (8.8 ×105/cm2)로 플레이팅하였다. 상기 세포에 총 14일 동안 3일마다 DAPT가 없는 성숙 배지를 공급하였다. 분석 당일에, 세포를 세척하고 HBSS (56 mM의 KCl 첨가 또는 무첨가)를 사용하여 30분 항온배양하였다. 경쟁적 도파민 ELISA 키트 [이글 바이오사이언시즈(Eagle Biosciences)사 제조]를 사용하여 방출액 중의 도파민 농도를 측정하였다. iPSC 유도된 전뇌 신경 세포 (iCell Neuron)로부터는 도파민 방출이 검출되지 않았다. 반대로, 최적화된 단일-SMADi 공정을 사용하여 유도된 iPSC-mDA 세포 (DA Therapy Neuron)는 적어도 최적화된 이중-SMAD 공정을 사용하여 유도된 세포 (iCell DopaNeuron)만큼은 도파민을 분비하였다. 따라서, 상기 세포들은 성숙한 도파민 신경세포의 중요한 기능적 속성을 수행할 수 있다. 결과를 도 9에 나타내었다.
실시예 8
iPSC-mDA 신경세포의 전기적 활성
저온보존된 iPSC-mDA 신경세포를 해동시킨 후 PEI-코팅된 48-웰 다전극 어레이 (MEA) 플레이트 상에 플레이팅하였다. 셀룰러 다이내믹스 인터내셔날 출원 프로토콜인 미국 출원 14/830,162호에서의 "마에스트로 다전극 어레이 상의 동시적 신경 활성 측정"에 따라 세포를 배양하였다. 최적화된 단일-SMADi 프로토콜 "조건 9"로 제조된 신경세포 (DA Therapy)는 최적화된 이중-SMADi 프로토콜로 제조된 세포 (iCell Dopa G100)와 비교했을 때, 평균 활성화율 (mFR), 돌발 활성화 (bursting) (두드러진 BPM) 및 연결성을 비롯한 유사한 전기적 활성을 나타냈다 (도 10a, 위 그래프). 평균 활성화율 (mFR), 주파수 및 연결성 돌발 활성화 강도는 시간의 경과에 따라 증가하였으며, 해동후 약 16일까지는 안정한 상태를 유지하였다. 시간에 따른 래스터 그래프는 명백한 스파이크간 간격, 높은 돌발 활성화 강도, 및 웰 중의 모든 전극에 걸친 돌발 활성화를 보여주고 있는데, 이는 전기적 활성도가 높다는 것을 입증하는 것이다. 결과를 도 10에 나타내었다.
실시예 9
iPSC-mDA 신경세포의 정량적 유전자 발현 프로파일
공정 37일째에 최적화된 단일-SMADi 공정을 사용하여 유도된 iPSC-mDA 세포의 4개의 뱃치 (뱃치 1-4) 및 최적화된 이중-SMADi 프로토콜을 사용하여 유도된 iPSC-mDA 세포 (iCell DopaNeuron)의 1개의 뱃치로부터 RNA를 추출하였다. RNA 분리 후, TaqMan 유전자 발현 분석법 [어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사 제조]을 이용하여 실시간 정량 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하였으며, 그 결과는 GAPDH 대조군에 대한 상대적인 발현으로 나타냈다. <10-4 인 값을 백그라운드로 간주하였다 (음영처리된 박스). 중뇌 및 mDA 신경세포 마커의 발현은 서로 다른 프로토콜을 사용하여 제조된 뱃치들 간 및 세포들 간에서 유사하였다. 비-중뇌 영역 또는 비-mDA 세포 유형에 대한 마커들은 저조하였으며, 단일-SMADi 및 이중-SMADi 유도된 세포들 간에서도 유사하였다. 결과를 도 11에 나타내었다.
실시예 10
cGMP-적합성 시약으로의 전환
상기 단일-SMADi iPSC-mDA 분화 프로토콜을 세포 요법을 위한 cGMP-적합성 공정으로 전환시키기 위해, 동물 유래 성분을 함유하고 있거나, 허용불가 수준의 내독소를 함유하고 있거나, 또는 그렇지 않으면 치료제를 위한 cGMP 세포 제조에 적절치 않은 여러 시약들을 대체하는 것이 바람직하거나 필요하였다. 최적화된 단일-SMADi 공정 ("조건 9")을 이용하여 iPSC-mDA 세포를 분화시키고, 더불어 이종성 물질이 없는(xeno-free) 하기의 cGMP 적합성 시약을 사용하였다: 재조합 인간 비트로넥틴, 라미닌, 소닉 헤지호그, FGF-8, GDNF, BDNF 및 TGF-b3; 내독소가 없는 dbcAMP. 상기 공정에서 동물성 성분을 함유하는 것은 B27 및 B27 (-비타민 A)이 유일한 시약이다. 표준 시약 또는 cGMP-적합성 시약과 함께 "조건 9" 공정을 이용한 K 세포주 iPSC 세포 분화는, 동등한 전구세포 패터닝 (17일)과 mDA 신경세포 순도 (37일)를 나타냈다. 결과를 도 12에 나타내었다.
실시예 11
인간이 아닌 영장류에서 iPSC-DA 신경세포의 이식
최적화된 프로토콜 ("조건 9")을 이용하여 iPS 세포주 "K"를 분화시켜 공정을 완료(37일)하고 저온보존 처리하였다. 세포들을 해동하여 MPTP-처리 및 면역억제된 아프리카 녹색 원숭이의 미상핵과 조가비핵에 양측으로 이식 (1회 주입당 1.5 ×106 개의 세포)하였다 (n=3). 3개월 후, 상기 신경세포의 이식과 신경분포를 관상 절편의 조직학에 의해 평가하였다. 인간 세포질 (STEM121)의 염색을 통해 모든 동물에서 양호한 인간 세포 이식 및 신경분포를 확인하였다. 도파민 신경 세포 (TH+)가 이식물에서 관찰되었는데, 이는 상기 세포들이 장기간 생존하여 뇌에서 mDA 신경세포 표적 구조를 자극할 수 있는 역량을 지녔다는 것을 입증하는 것이다. 상기 동물에서 종양, 신경 생장 또는 기타 부작용들은 관찰되지 않았다. 결과를 도 13에 나타내었다.
실시예 12
랫트 파킨슨병 모델 시스템에서 iPSC-DA 전구세포 및 신경 세포의 이식
최적화된 단일-SMADi 프로토콜 ("조건 9")을 이용하여 iPS 세포주 "K"를 분화시키고, 상기 분화 공정의 서로 다른 단계에서 저온보존하였다 (17일, 24일 및 37일). 또한, 최적화된 이중-SMADi 프로토콜을 사용하여 유도된 iPSC-mDA 세포 (iCell Dopa)를 공정 37일째에 저온보존시켰다. 세포들을 해동하여, 6-OHDA-처리했지만 증상이 없는 누드 (RNU) 랫트의 줄무늬체에 양측으로 이식 (1회 주입당 4.5 ×105 개의 세포)하였다 (군당 n=3). 3개월 후, 상기 세포의 이식과 신경분포를 관상 절편의 조직학에 의해 평가하였다. 4개의 모든 군 (인간 NCAM 균주)에서 신경세포 이식과 신경분포가 관찰되었지만, 상기 iPSC-DA 전구세포 (17일)와 미성숙 mDA 신경세포 (24일)는, 상기 보다 성숙한 단일-SMADi 및 이중-SMADi 유도된 mDA 신경세포 (각각 37일 및 37일 iCell Dopa)에 비해 훨씬 더 큰 이식물과 더 큰 신경분포를 나타내었다. 또한, 전구세포와 미성숙 DA 신경세포 이식물 중에서 다수의 DA 신경세포들 (TH+)이 관찰되었다. Ki67 염색을 통해, 37일째 세포의 이식물 중에서 증식성 세포가 거의 없었으며, 17일 및 24일째의 세포의 이식물 중에 Ki67+ 세포가 소수 존재하였음을 알 수 있었다. 상기 임의의 동물에서 종양, 신경 생장 또는 기타 부작용들은 관찰되지 않았다. 상기 결과는 최적화된 단일-SMADi 분화 공정 (17-24일) 초기에 유도된 세포들이 보다 성숙한 세포에 비해 더욱 잘 이식되어 자극할 수 있다는 것을 시사하는 것이다. 결과를 도 14에 나타내었다.
실시예 13
2 μM의 LDN-193189를 사용한 향상된 분화
단일-SMADi 프로토콜 "조건 7" 또는 "조건 9" (상기 기술된 바와 같음)을 이용해, LDN-193189의 표준 농도 (200 nM) 또는 10배 더 높은 농도 (2 μM LDN)를 사용하여 iPS 세포주 "K"를 분화시켰다. 여러 번의 시험(n=5)으로, 2 μM의 LDN을 사용하는 경우에 분화의 질이 향상된 것으로 나타났다. 예를 들어, "조건 7" 프로토콜에 2 μM의 LDN 개선을 추가한 것은, 17일째의 전구세포에서 더 높은 FoxA2 및 Lmx1 발현 수준 (위), 및 공정 37일째에 더 높은 비율의 층판 유도된 신경 세포 (FoxA2+) (아래)를 나타내었다. 이는 2 μM의 LDN이 상기 분화 공정의 견고함을 개선시켰음을 시사하는 것이며, 아마도 그러한 개선은 고농도에서 TGF-β 1형 (ALK4/5/7) 수용체 신호전달을 억제하는 LDN의 역량에 기인할 것이다 (IC50 > 500 nM, Yu et al. 2008). 결과를 도 15에 나타내었다.
* * *
본원에 개시되고 청구된 모든 방법들은 본 명세서의 내용을 고려하여 과도한 실험없이 만들어 수행할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 실시양태의 관점에서 기술되었지만, 본 발명의 당업계의 개념, 의미 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화들을 본원에 기술된 방법들, 상기 방법의 단계들 또는 상기 방법 단계들의 순서에 적용할 수 있다는 사실은 당업계의 숙련자들에게는 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련되어 있는 특정 제제의 경우 이들을 사용하여도 동일하거나 유사한 결과가 달성된다면 본원에 기술된 제제를 대체할 수 있음도 명백할 것이다. 당업계의 숙련자들에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 정의된 본 발명의 의미, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.
참고문헌
하기의 참고문헌들은, 본원에 기술된 내용에 대하여 예시적인 절차이거나 이를 보충하는 기타 상세한 설명을 제공하는 정도로, 본원에 참고로서 상세하게 포함된다.

Claims (68)

  1. FOXA2+/LMX1+ 세포를 포함하는 세포 조성물의 치료학적 유효량을 포함하는, 포유동물 대상체에서 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서,
    상기 세포 조성물은 신호전달 조절제인,
    (a) 데카펜타플레직에 대한 작은 모체 (Small Mothers Against Decapentaplegic, SMAD) 신호전달의 하나의 억제제,
    (b) 소닉 헤지호그 (Sonic hedgehog, SHH) 신호전달의 적어도 하나의 활성화제, 및
    (c) 날개 퇴화(wingless) (Wnt) 신호전달의 적어도 하나의 활성화제
    의 존재 하에 인간 만능 세포(pluripotent cell)를 배양하는 단계; 및
    상기 세포를, 상기 신호전달 조절제의 존재 하에, 상기 FOXA2+/LMX1+ 세포를 포함하는 세포 조성물을 제공하기에 충분한 시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되고, 여기서, 상기 배양은 데카펜타플레직에 대한 작은 모체 (Small Mothers Against Decapentaplegic, SMAD) 신호전달의 제2 억제제의 존재 하에 상기 인간 만능 세포를 배양하는 것을 포함하지 않으며;
    상기 SMAD 신호전달의 하나의 억제제가 LDN-193189, 돌소몰핀(dorsomorphin), 또는 DMH-1이고;
    상기 약제학적 조성물은 상기 대상체의 뇌에 투여되고;
    상기 질환은 파킨슨증인 것인, 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 포유동물 대상체가 인간인 것인, 약제학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 질환이 파킨슨병 (PD) 또는 파킨슨 플러스 증후군 (PPS)인 것인, 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 완전하게 분화되지 않거나 또는 분화 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25일째 또는 17-24일째인 도파민성 신경세포를 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 세포 조성물이 분화 16, 17, 또는 18일째인 도파민성 신경세포를 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 세포 조성물이 분화 17일째인 도파민성 신경세포를 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 히알루론산 기질을 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 SMAD 신호전달의 하나의 억제제가 LDN-193189인 것인, 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 LDN-193189가 0.2 μM 내지 4 μM의 농도로 존재하는 것인, 약제학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 LDN-193189가 1 μM 내지 3 μM의 농도로 존재하는 것인, 약제학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 만능 세포를 배양 1-15일, 1-16일 또는 1-17일 째에 상기 SMAD의 하나의 억제제와 함께 배양하는 것인, 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 만능 세포를 배양 1-17일째에 상기 SMAD의 하나의 억제제와 함께 배양하는 것인, 약제학적 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 만능 세포를 15일, 16일 또는 17일 동안 연속적으로 또는 매일 상기 SMAD의 하나의 억제제와 함께 배양하는 것인, 약제학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 만능 세포를 17일 동안 연속적으로 또는 매일 상기 SMAD의 하나의 억제제와 함께 배양하는 것인, 약제학적 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 SMAD의 하나의 억제제가 50-2000 또는 50-500 nM의 농도로 존재하는 것인, 약제학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 SMAD의 하나의 억제제가 180-240 nM의 농도로 존재하는 것인, 약제학적 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 방법이 상기 만능 세포를 MEK 억제제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 MEK 억제제가 PD0325901인 것인, 약제학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 PD0325901이 0.25-2.5 μM의 농도로 존재하는 것인, 약제학적 조성물.
  20. 제17항에 있어서, 상기 MEK 억제제를, 상기 SMAD 신호전달의 하나의 억제제와의 접촉 개시 후 1-3일 동안, 또는 1-3일, 2-4일, 3-5일 째에, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5일 째에 상기 만능 세포와 접촉시키는 것인, 약제학적 조성물.
  21. 제17항에 있어서, 상기 MEK 억제제를, 상기 SMAD 신호전달의 하나의 억제제와의 접촉 개시 후 24시간 내지 48시간이 지나 상기 만능 세포와 접촉시키는 것인, 약제학적 조성물.
  22. 제17항에 있어서, 상기 MEK 억제제를, 상기 SMAD 신호전달의 하나의 억제제와의 접촉 개시 후 1-2일에서 시작하여 3-4일 동안 매일 또는 연속적으로 상기 만능 세포와 접촉시키는 것인, 약제학적 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 상기 MEK 억제제를, 1일째에 상기 SMAD 신호전달의 하나의 억제제와의 접촉 개시 후 2-5일 또는 3-6일 째에 상기 만능 세포와 접촉시키는 것인, 약제학적 조성물.
  24. 제1항에 있어서, 상기 Wnt 신호전달의 활성화제가 GSK3 억제제인 것인, 약제학적 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 GSK3 억제제가 CHIR99021인 것인, 약제학적 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 CHIR99021이 0.5-3 μM의 농도로 존재하는 것인, 약제학적 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 CHIR99021이 1.25 μM 내지 2 μM의 농도로 존재하는 것인, 약제학적 조성물.
  28. 제25항에 있어서, 상기 CHIR99021이 상기 SMAD 신호전달의 하나의 억제제와의 접촉 개시 후 9-17일째에 4-7 μM의 농도로 존재하는 것인, 약제학적 조성물.
  29. 제1항에 있어서, 상기 Wnt 신호전달의 활성화제를, 상기 SMAD 신호전달의 하나의 억제제와의 접촉 개시 후 1-3일째에 상기 만능 세포와 접촉시키는 것인, 약제학적 조성물.
  30. 제1항에 있어서, 상기 Wnt 신호전달의 활성화제를, 상기 SMAD 신호전달의 하나의 억제제와의 접촉 개시 후 24-48시간 내에 상기 만능 세포와 접촉시키는 것인, 약제학적 조성물.
  31. 제1항에 있어서, 상기 만능 세포를 14일, 15일 또는 16일 동안 연속적으로 또는 매일 Wnt 신호전달의 활성화제와 함께 배양하는 것인, 약제학적 조성물.
  32. 제1항에 있어서, 상기 Wnt 신호전달의 활성화제를, 상기 SMAD 신호전달의 하나의 억제제와의 접촉 개시 후 2-17일째에 상기 만능 세포와 접촉시키는 것인, 약제학적 조성물.
  33. 제1항에 있어서, 상기 SHH 신호전달의 활성화제가 퍼모파민(purmorphamine) 또는 C25II Shh인 것인, 약제학적 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 방법이 상기 만능 세포를 SHH 신호전달의 두 활성화제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 SHH 신호전달의 두 활성화제가 퍼모파민 및 C25II Shh인 것인, 약제학적 조성물.
  36. 제1항에 있어서, 상기 SHH 신호전달의 활성화제의 적어도 하나를, 상기 SMAD 신호전달의 하나의 억제제와 접촉을 개시한 날과 동일한 날에, 또는 상기 SMAD 신호전달의 하나의 억제제와의 접촉 개시 후 24-48시간 이내에 상기 만능 세포와 접촉시키는 것인, 약제학적 조성물.
  37. 제1항에 있어서, SHH 신호전달의 활성화제의 적어도 하나를, 상기 SMAD 신호전달의 하나의 억제제와의 접촉 개시와 함께, 또는 접촉 개시 후 1-7일째에 상기 만능 세포와 접촉시키는 것인, 약제학적 조성물.
  38. 제1항에 있어서, 상기 방법이 상기 만능 세포를 FGF-8과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 FGF-8을, 상기 SMAD 신호전달의 하나의 억제제와 접촉을 개시한 날과 동일한 날에는 상기 만능 세포와 접촉시키지 않는 것인, 약제학적 조성물.
  40. 제38항에 있어서, 상기 FGF-8을, 상기 SMAD 신호전달의 하나의 억제제와의 접촉 개시 후 9-17일 또는 11-17일 째에 상기 만능 세포와 접촉시키는 것인, 약제학적 조성물.
  41. 제38항에 있어서, 상기 FGF-8이 50-200 ng/mL의 농도로 존재하는 것인, 약제학적 조성물.
  42. ◈청구항 42은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈
    제1항에 있어서, 상기 만능 세포가 신경세포 프로모터의 제어 하에 항생제 내성 이식유전자를 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  43. ◈청구항 43은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈
    제1항에 있어서, 상기 방법이 상기 만능 세포를 항생제, 화학요법제, DNA 가교결합제, DNA 합성 억제제 또는 유사분열 억제제와 접촉시켜, 상기 세포로부터 유래된 신경 세포 또는 중뇌 DA 신경세포를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  44. ◈청구항 44은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈
    제1항에 있어서, 상기 방법이 상기 만능 세포를 항생제 또는 화학요법제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  45. ◈청구항 45은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈
    제43항에 있어서, 상기 화학요법제가 마이토마이신 C인 것인, 약제학적 조성물.
  46. ◈청구항 46은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈
    제45항에 있어서, 상기 마이토마이신 C를, 상기 SMAD 신호전달의 하나의 억제제와의 접촉 개시 후 27, 28 및 29일째 중 하나 이상의 날에 상기 만능 세포와 접촉시키는 것인, 약제학적 조성물.
  47. ◈청구항 47은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈
    제43항에 있어서, 상기 항생제가 G418 (게네티신)인 것인, 약제학적 조성물.
  48. 제1항에 있어서, 상기 방법이 상기 SMAD 신호전달의 하나의 억제제와의 접촉 개시 전에, ROCK 억제제를 포함하는 배지 중에서 상기 만능 세포를 배양 또는 항온배양하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  49. 제1항에 있어서, 상기 방법이 상기 만능 세포를 블레비스타틴과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 상기 블레비스타틴을 분화 5일 및 17일째에 상기 세포와 접촉시키는 것인, 약제학적 조성물.
  51. ◈청구항 51은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈
    제1항에 있어서, 세포들의 적어도 40%가 분화하여 FOXA2 및 LMX1을 모두 발현하는 것인, 약제학적 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 세포들의 적어도 60%가 분화하여 FOXA2 및 LMX1을 모두 발현하는 것인, 약제학적 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 세포들의 적어도 80%가 분화하여 FOXA2 및 LMX1을 모두 발현하는 것인, 약제학적 조성물.
  54. 제52항에 있어서, 세포들의 적어도 85%가 분화하여 FOXA2 및 LMX1을 모두 발현하는 것인, 약제학적 조성물.
  55. ◈청구항 55은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈
    제1항에 있어서, 세포들의 적어도 50%가 분화하여 FOXA2 및 타이로신 하이드록실라아제 (TH)를 모두 발현하는 것인, 약제학적 조성물.
  56. 제55항에 있어서, 세포들의 적어도 70%가 분화하여 FOXA2 및 타이로신 하이드록실라아제 (TH)를 모두 발현하는 것인, 약제학적 조성물.
  57. 제1항에 있어서, 상기 만능 세포가 인간 유도성 만능 줄기 (iPS) 세포인 것인, 약제학적 조성물.
  58. 제1항에 있어서, 상기 LMX1이 LIM 호메오박스 전사 인자 1 알파 (LMX1A)인 것인, 약제학적 조성물.
  59. 제51항에 있어서, FOXA2와 LMX1를 발현하는 상기 분화된 세포가, 오르쏘덴티클 호메오박스 2 (OTX2), 핵 수용체 관련 1 단백질 (NURR1), 신경세포 특이적 클래스 III 베타 튜블린 (Tuj1), TTF3, 쌍형 유사(paired-like) 호메오도메인 3 (PITX3), 아케트-스큐트(achaete-scute) 복합체 (ASCL), 조기 B-세포 인자 1 (EBF-1), 조기 B-세포 인자 3 (EBF-3), 트랜스티레틴 (TTR), 시냅신, 도파민 수송체 (DAT), 및 G-단백질 커플링된, 내향 정류식 칼륨 채널(inwardly rectifying potassium channel) (Kir3.2/GIRK2), CD142, DCSM1, CD63 및 CD99으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 마커를 추가로 발현하는 것인, 약제학적 조성물.
  60. 제1항에 있어서, 상기 방법이 DNAse 또는 엔도뉴클레아제의 존재 하에 인간 만능 세포를 항온배양하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  61. 제60항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 DNase I인 것인, 약제학적 조성물.
  62. 제61항에 있어서, 상기 DNase I이 100 U/mL의 농도로 존재하는 것인, 약제학적 조성물.
  63. 제60항에 있어서, 상기 인간 만능 세포를, 상기 SMAD 신호전달의 하나의 억제제와의 접촉 개시 후 4-6일째 중 적어도 하나의 날에 엔도뉴클레아제의 존재 하에 배양시키는 것인, 약제학적 조성물.
  64. 제60항에 있어서, 상기 인간 만능 세포를, 상기 SMAD 신호전달의 하나의 억제제와의 접촉 개시 후 5일째에 엔도뉴클레아제의 존재 하에 배양시키는 것인, 약제학적 조성물.
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