ES2901379T3

ES2901379T3 - Métodos para diferenciar células pluripotentes

Info

Publication number: ES2901379T3
Application number: ES17758363T
Authority: ES
Inventors: Christopher Mcmahon; Lauren Little; Wen Wang; Nathaniel A Elliot
Original assignee: Fujifilm Cellular Dynamics Inc
Current assignee: Fujifilm Cellular Dynamics Inc
Priority date: 2016-08-16
Filing date: 2017-08-16
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2037-08-16
Also published as: AU2021225187A1; AU2017313065B2; EP4328301A3; EP3500664B1; US10590383B2; KR20220088800A; EP4328301A2; CN109844102B; JP7120993B2; KR102625865B1; DK3500664T3; AU2017313065A1; WO2018035214A8; KR20190039434A; EP4001403A1; EP3500664A1; WO2018035214A1; CN117467608A; JP2022078245A; CA3033205A1

Abstract

Un método in vitro para preparar una composición celular que comprende células humanas que expresan tanto la proteína forkhead box A2 (FOXA2) como el factor de transcripción de homeobox LIM 1 (LMX1) (células FOXA2+/LMX1+) que comprende cultivar células pluripotentes humanas en presencia de los siguientes moduladores de señalización: (a) un único inhibidor de la señalización de Small Mothers Against Decapentaplegic (SMAD), en donde el inhibidor de la señalización de SMAD es un inhibidor de BMP o un inhibidor de TGFβ, (b) al menos un activador de la señalización de Sonic hedgehog (SHH), y (c) al menos un activador de la señalización de wingless (Wnt); y cultivar dichas células en presencia de dichos moduladores durante un periodo de tiempo suficiente para proporcionar una composición celular que comprende dichas células FOXA2+/LMX1+.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para diferenciar células pluripotentes

Antecedentes

1. Campo

La presente invención se refiere en general al campo de la biología molecular y la medicina. Más en particular, se refiere a métodos de generar neuronas dopaminérgicas a partir de células pluripotentes.

2. Descripción de la técnica relacionada

Las poblaciones celulares que retienen la capacidad para diferenciarse en numerosos tipos celulares especializados son útiles para desarrollar grandes números de poblaciones celulares diferenciadas específicas de linaje. Estas poblaciones celulares diferenciadas específicas de linaje se contemplan para encontrar uso en terapias de sustitución celular para pacientes con enfermedades que producen pérdida de función de una población celular definida. Además de su valor terapéutico directo, las células diferenciadas específicas de linaje también son herramientas de investigación valiosas para una variedad de fines incluyendo ensayos de cribado in vitro para identificar, confirmar, y ensayar especificación de función o para ensayar la administración de moléculas terapéuticas para tratar enfermedades específicas de linaje celular.

En el caso de la enfermedad de Parkinson, por ejemplo, es la pérdida de neuronas dopaminérgicas (DA) del mesencéfalo lo que produce la aparición de síntomas de la enfermedad. Por tanto, hay necesidad para métodos de producir células neuronales DA a partir de células pluripotentes, ya que tales células se podrían usar tanto terapéuticamente como en modelos de enfermedad, por ejemplo, para identificar nuevos agentes terapéuticos para tratamientos para la enfermedad de Parkinson.

Se han hecho varios esfuerzos para generar neuronas DA del mesencéfalo a partir de células pluripotentes. Por ejemplo, las metodologías para generar neuronas DA del mesencéfalo a partir de células pluripotentes típicamente requieren el uso tanto de LDN-193189, un inhibidor de la señalización de BMP (inhibe A l K 1/2/3/6, bloquea SMAD 1/5/8), como SB-431542, un inhibidor de la señalización de TGF-beta (inhibe ALK 4/5/7, bloquea SMAD 2/3), como se describe, por ejemplo, en el documento WO2013/067362. Puesto que estos métodos utilizan la combinación de dos inhibidores de la señalización de Small Mothers Against Decapetaplegic (SMAD), estos métodos típicamente se denominan “inhibición dual de SMAD” o “dual SMADi”. Aunque puede ser deseable crear un método para la generación de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo (mDA) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPS) usando solo un único inhibidor de SMAD, tales esfuerzos han sido hasta ahora un fracaso. Claramente, existe una necesidad para métodos de generación de neuronas mDA a partir de células iPS usando solo un único inhibidor de SMAD.

El estado de la técnica citado adicional es Kriks et al.,: "Floor plate-derived dopamine neurons from hESCs efficiently engraft in animal models of PD." Nature, vol. 480, no. 7378, 6 de Noviembre 2011, p. 547-551; documento u S 2015/265652 A1; documento WO 2013/067362 A1; y Liu et al.,: "Chemical Modulation of Cell Fate in Stem Cell Therapeutics and Regenerative Medicine", Cell Chemical Biology, Elsevier, Ámsterdam, NL, vol. 23, no. 8, 11 de Agosto 2016, p. 893-916.

Compendio

La presente invención supera las limitaciones en el estado de la técnica al proporcionar, en algunos aspectos, métodos para generar neuronas a partir de células pluripotentes usando inhibición mono-SMAD (mono-SMADi). El uso de métodos de mono-SMADi puede proporcionar ventajas sobre métodos que requieren la inhibición de la señalización de SMAD usando dos o más inhibidores de SMAD. Como se describe en los ejemplos posteriores, se proporcionan métodos para generar líneas de células neurales tal como neuronas dopaminérgicas a partir de células pluripotentes, tal como células pluripotentes inducidas (células iPS) humanas. Como se muestra en el presente documento, se pueden incluir varios aspectos en estos métodos incluyendo: (i) escalonar la adición de un agonista de Wnt (por ejemplo, CHIR99021) al día 2 o día 3, (ii) reoptimizar la concentración de CHIR (por ejemplo, usar desde aproximadamente 0,5-3,0 pM, 0,7-3 pM, 1-2,5 pM, 1,25-2,25 pM, desde más de aproximadamente 1,25 pM hasta aproximadamente 2 pM, o aproximadamente 1,55, 1,65, 1,75 pM, o cualquier intervalo derivable en los mismos), y/o (iii) incluir un inhibidor de MEK (por ejemplo, PD0325901) en el medio de diferenciación los días 3-5. Los métodos pueden incluir, por ejemplo, los aspectos (i y ii), (ii y iii), (i y iii), o (i, ii, y iii) anteriores. En algunas formas de realización, las células se exponen a un inhibidor de b Mp (por ejemplo, dorsomorfina o LDN-193189) y las células no se exponen a un inhibidor de TGF-p tal como SB431542, para fomentar la diferenciación de células a neuronas DA del mesencéfalo o células FOXA2+/LMX1A+. Como se muestra en los ejemplos posteriores, estos métodos se pueden usar para la formación de progenitores mDA muy eficaz a partir de líneas de células iPS con medios que incluyen solo un único inhibidor de SMAD (por ejemplo, dorsomorfina o LDN-193189 solo).

La invención se refiere a las formas de realización como se definen en las reivindicaciones. Un aspecto de la presente divulgación se refiere a un método in vitro para preparar una composición celular que comprende células humanas que expresan tanto la proteína forkhead box A2 (FOXA2) como el factor de transcripción homeobox LIM 1 (LMX1) (células FOXA2+/LMX1+) que comprende cultivar células pluripotentes humanas en presencia de los siguientes moduladores de señalización: (a) un único inhibidor de la señalización de Small Mothers Against Decapentaplegic (SMAD), (b) al menos un activador de la señalización de Sonic hedgehog (SHH), y (c) al menos un activador de la señalización de wingless (Wnt); y cultivar dichas células en presencia de dichos moduladores durante un periodo de tiempo suficiente para proporcionar una composición celular que comprende dichas células FOXA2+/LMX1+. En algunas formas de realización preferidas, el inhibidor de la señalización de SMAD es un inhibidor de BMP tal como, por ejemplo, LDN-193189 (por ejemplo, a una concentración desde aproximadamente 0,2 pM hasta aproximadamente 4 pM, más preferiblemente desde más de 2 pM hasta aproximadamente 4 pM, aproximadamente 1 pM, 2 pM, 3 pM, 4 pM, o cualquier intervalo derivable en los mismos), dorsomorfina, DMH-1 o nogina. Como se muestra en los ejemplos posteriores, concentraciones aumentadas (por ejemplo, 2 pM en comparación con 0,2 pM) de LDN-193189 produjeron diferenciación mejorada de células iPS a células FOXA2+/LMX1+ o neuronas dopaminérgicas. En algunas formas de realización, el inhibidor de BMP es LDN-193189. El inhibidor de la señalización de SMAD puede ser un inhibidor de TGFp (un inhibidor de la ruta de señalización de TGFp) tal como, por ejemplo, SB431542 (por ejemplo, SB431542 presente a una concentración de aproximadamente 5-100, 20-60, 30-50 pM, o aproximadamente 40 pM). En algunas formas de realización, las células pluripotentes se cultivan con el inhibidor de SMAD los días de cultivo 1-15, 1-16, o 1-17. Las células pluripotentes se cultivan con el inhibidor de SMAD sustancialmente de forma continua o de manera diaria durante 15, 16 o 17 días. El inhibidor de SMAD puede estar presente en una concentración de aproximadamente 50-2000, 50-500, 500-2500, o 500-2000 nM, o aproximadamente 180-240 nM. En algunas formas de realización, el método además comprende poner en contacto las células pluripotentes con un inhibidor de MEK. El inhibidor de MEK puede ser PD0325901. En algunas formas de realización, el PD0325901 está presente a una concentración de aproximadamente 0,25-2,5 pM, o aproximadamente 0,5-1,5 pM. En algunas formas de realización, el inhibidor de MEK se pone en contacto con las células pluripotentes durante aproximadamente 1-3 días, o los días 1-3, 2-4, 3-5, o los días 1, 2, 3, 4 o 5 después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD (por ejemplo, el poner en contacto se puede hacer durante aproximadamente 72 horas empezando el día de diferenciación 2 o el día 3). El inhibidor de MEK se puede poner en contacto con las células pluripotentes desde aproximadamente 48 hasta aproximadamente 72 horas, 24-96 horas, o 24-48 horas después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD. En algunas formas de realización, el inhibidor de MEK se pone en contacto con las células pluripotentes de manera diaria o sustancialmente continua durante aproximadamente 3-4 días empezando aproximadamente 1-2 días después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD. En algunas formas de realización, el inhibidor de MEK se pone en contacto con las células pluripotentes los días 2-5, días 3-6, o los días 3-5 después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD el día 1. El activador de la señalización de Wnt puede ser un inhibidor de GSK3 tal como, por ejemplo, CHIR99021. El CHIR99021 puede estar presente a una concentración de aproximadamente 0,5-3 pM o a concentraciones desde más de aproximadamente 1,25 pM a aproximadamente 2 pM (por ejemplo, aproximadamente 1,5-2,0 pM, aproximadamente 1,55-1,75 pM, o aproximadamente 1,55, 1,65, 1,75 pM, o cualquier intervalo derivable en los mismos; y en algunas formas de realización, se pueden usar concentraciones mayores, por ejemplo, 4-7 pM o 6 pM los días 9-17 u 11-17 después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD el día 1). En algunas formas de realización, el activador de la señalización de Wnt se pone en contacto con las células pluripotentes 1-3 días después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD. El activador de la señalización de Wnt se puede poner en contacto con las células pluripotentes 12-48 horas o 24-48 horas después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD. Las células pluripotentes se cultivan con el activador de la señalización de Wnt sustancialmente de forma continua o de manera diaria durante 10, 11, 12, 13, 14, 15 o aproximadamente 16 días. El activador de la señalización de Wnt se puede poner en contacto con las células pluripotentes los días 2-17 después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD el día 1. En algunas formas de realización, el activador de la señalización de SHH es purmorfamina, C25II Shh o C24II Shh. En algunas formas de realización, se puede usar C25II Shh en lugar de o en combinación con C24II Shh. El método puede comprender además poner en contacto las células pluripotentes con dos activadores de la señalización de SHH tal como, por ejemplo, purmorfamina y C25II Shh. En algunas formas de realización, el al menos un activador de la señalización de SHH se pone en contacto con las células pluripotentes el mismo día del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD o a las 24-48 horas después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD. En algunas formas de realización, el al menos un activador de la señalización de SHH se pone en contacto con las células pluripotentes los días 1-7 con o después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD el día 1.

En algunas formas de realización, el método comprende además poner en contacto las células pluripotentes con FGF-8. El FGF-8 puede ser FGF-8a o FGF-8b; preferiblemente, el FGF-8 no es FGF-8f. En algunas formas de realización, el FGF-8 no se pone en contacto con las células pluripotentes el mismo día del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD. El FGF-8 se puede poner en contacto con las células pluripotentes los días 9-17 u 11-17 después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD el día 1. El FGF-8 puede estar presente a una concentración de aproximadamente 25-500 ng/ml, 25-250 ng/ml, 50-150, 50-200 ng/ml, o 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 225, 250 o 275 ng/ml, o cualquier intervalo derivable en los mismos. En algunas formas de realización, incluir FGF-8 puede mejorar la viabilidad de las células y fomentar la expresión del marcador deseado Engrailed-1 (En-1). Las células pluripotentes pueden comprender un transgén de resistencia a antibiótico bajo el control de un promotor neuronal. El método puede además comprender seleccionar células neurales o neuronas DA del mesencéfalo derivadas de las células pluripotentes poniendo en contacto las células con un antibiótico, un quimioterapéutico, un entrecruzador de ADN, un inhibidor de la síntesis de ADN, o un inhibidor mitótico, por ejemplo, para destruir las células en división que puedan estar presentes en un cultivo de células que comprende las células neurales o neuronas DA del mesencéfalo. El método puede además comprender poner en contacto las células pluripotentes con un antibiótico (por ejemplo, G418 (geneticina)) o un quimioterapéutico (por ejemplo, mitomicina C). En algunas formas de realización, la mitomicina C se pone en contacto con las células pluripotentes los días 27, 28, 28, y/o 29 después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD el día 1. El método puede además comprender cultivar o incubar las células pluripotentes en un medio que comprende un inhibidor de ROCK antes del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD. El método puede además comprender poner en contacto las células pluripotentes con blebistatina. Por ejemplo, la blebistatina se pone en contacto con las células el día 5 y el día 17 de la diferenciación.

En algunas formas de realización, aproximadamente al menos el 40 %, al menos el 60 %, al menos el 80 % o al menos el 85 % de las células se diferencian y expresan tanto FOXA2 como LMX1 (tal como LMX1A). En algunas formas de realización, aproximadamente al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, o al menos el 70 % de las células se diferencian y expresan tanto FOXA2 como tirosina hidroxilasa (TH). Las células diferenciadas que expresan FOXA2 y LMX1 (tal como LMX1A), o FOXA2 y TH, pueden además expresar al menos un marcador seleccionado del grupo que consiste en homeobox ortodentículo 2 (OTX2), proteína relacionada con el receptor nuclear 1 (NURR1), beta-tubulina de clase III específica de neuronas (Tuj1), TTF3, homeodominio de tipo apareado 3 (PITX3), complejo achaete-scute (ASCL), factor temprano de células B 1 (EBF1), factor temprano de células B 3 (EBF3), transtiretina (TTR), sinapsina, transportador de dopamina (DAT), y canal de potasio con rectificación hacia dentro acoplado a proteína G (Kir3.2/GIRK2), CD142, DCSM1, CD63 y c D99. En algunas formas de realización, el método comprende además incubar células pluripotentes humanas en presencia de una endonucleasa tal como, por ejemplo, Benzonase® o DNasa I. En algunas formas de realización preferidas, la endonucleasa es una endonucleasa humana. La Benzonase® o DNasa I puede estar presente a 100 U/ml. En algunas formas de realización, las células pluripotentes humanas se incuban en presencia de una endonucleasa o DNasa en al menos uno de los días 4-6 después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD el día 1. En algunas formas de realización, las células pluripotentes humanas se incuban en presencia de una endonucleasa o DNasa el día 5 después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD el día 1.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un cultivo de neuronas dopaminérgicas (DA) del mesencéfalo generadas mediante un método de la presente invención o como se ha descrito anteriormente. El cultivo puede estar comprendido en un medio contendor. Las neuronas pueden estar comprendidas en una preparación farmacéutica tal como, por ejemplo, una preparación farmacéutica formulada para inyección.

Aún otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un método de tratar una enfermedad en un sujeto mamífero que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del cultivo de la presente divulgación o como se ha descrito anteriormente. El sujeto mamífero puede ser un ser humano. La enfermedad puede ser una enfermedad del sistema nervioso central (SNC). En algunas formas de realización, la enfermedad es enfermedad de Parkinson (EP) o un síndrome Parkinson plus (PPS). El cultivo puede comprender neuronas dopaminérgicas que no están completamente diferenciadas o están en el día 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 de diferenciación (por ejemplo, días 17-24 de diferenciación). En algunas formas de realización, el cultivo comprende una matriz de ácido hialurónico. Como se muestra en los ejemplos, se han observado ventajas para administrar células que están en una fase intermedia de diferenciación (por ejemplo, neuronas dopaminérgicas que no están diferenciadas por completo) se administran a un sujeto mamífero.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un método de cribar un compuesto de prueba que comprende: (a) poner en contacto el sujeto de prueba con células diferenciadas por un método de la presente invención o como se ha descrito anteriormente, y (b) medir la función, fisiología, o viabilidad de las células. En algunas formas de realización, dicho medir comprende ensayar una respuesta toxicológica o una respuesta electrofisiológica alterada de las células. En algunas formas de realización, las células son neuronas dopaminérgicas (DA) del mesencéfalo.

Se pueden encontrar condiciones y métodos adicionales que se pueden usar en combinación con la presente invención, por ejemplo, en los documentos US 2015/0265652, u S 2015/0010514, y WO2013/067362. Métodos adicionales para purificar o fomentar la diferenciación de células pluripotentes a neuronales o neuronas DA del mesencéfalo que se pueden usar en combinación con la presente invención incluyen, por ejemplo, Kirkeby et al. (2012), Kriks, et al. (2011); Chung, et al. (2011), Xi et al. (2012); Young et al. (2014); Jaeger et al. (2011), Jiang et al. (2012), y el documento US2016/0177260.

Como se usa en el presente documento, el “día de diferenciación” se refiere al día de incubación de las células en un medio, en donde el inicio de la exposición de las células pluripotentes a un medio de diferenciación el día 1. En algunas formas de realización preferidas, el medio de diferenciación el día 1 incluye un único inhibidor de SMAD. Antes de la incubación o cultivo en un medio de diferenciación, las células se pueden incubar, por ejemplo, durante 1, 2 o 3 días antes de la incubación en el medio de diferenciación (es decir, el día 0, día -1 y/o día -2) en un medio que comprende o consiste en Medio Basal Essential 8™ y Suplemento Essential 8™ (Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA), opcionalmente con la adición de un inhibidor de ROCK (por ejemplo, inclusión de aproximadamente 0,25-5 pM, 0,5, 0,75, 1, 1,25, 1,5, 2, 3, 4, o cualquier intervalo derivable en los mismos de H1152, por ejemplo, el día -2), y/o blebistatina (por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0,1-20 j M, más preferiblemente aproximadamente 1,25-5 j M, o aproximadamente 2,5 j M).

Como se usa en el presente documento, “esencialmente libre”, en términos de un componente especificado, se usa en el presente documento para significar que no se ha formulado a propósito nada del componente especificado en una composición y/o está presente solo como un contaminante o en cantidades mínimas. La cantidad total del componente especificado resultante de cualquier contaminación involuntaria de una composición está por tanto bien por debajo del 0,05 %, preferiblemente por debajo del 0,01 %. Lo más preferido es una composición en la que no se puede detectar ninguna cantidad del componente especificado con métodos analíticos estándar.

Como se usa en el presente documento la especificación, “un” o “una” puede significar uno o más. Como se usa en el presente documento en la(s) reivindicación(es), cuando se usa junto con la palabra “comprender”, las palabras “un” o “una” pueden significar uno o más de uno.

El uso del término “o” en las reivindicaciones se usa para significar “y/o” a menos que explícitamente se indique que se refiere a alternativas solo o las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación apoya una definición que se refiere a solo alternativas y “y/o”. Como se usa en el presente documento “otro” puede significar al menos un segundo o más.

A lo largo de esta solicitud, el término “aproximadamente” se usa para indicar que un valor incluye la variación inherente de error para el dispositivo, el método que se emplea para determinar el valor, o la variación que existe entre los sujetos de estudio.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, se debe entender que la descripción detallada y los ejemplos específicos, mientras indican formas de realización preferidas de la invención, se dan a modo de ilustración solo.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención se puede entender mejor mediante referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de formas de realización específicas presentadas en el presente documento.

Figura 1: El patrón de progenitores dopaminérgicos del mesencéfalo (mDA) de tres líneas de iPSC diferentes se evaluó el día de proceso 17 midiendo la proporción de células totales que expresan FoxA2 (por citometría de flujo) o coexpresan FoxA2 y Lmx1 (por ICC).

Figura 2: Expresión de marcadores por células progenitoras dopaminérgicas (neuronas mDA inmaduras) el día 17 (D17) y el día 24 (D24).

Figura 3 : Patrón de progenitores mDA generados de diferentes líneas de células iPS humanas el día de proceso 17. Se muestra la proporción de células totales que expresan FoxA2, o que coexpresan FoxA2 y Lmx1.

Figuras 4A-C: Figura 4A , purificación de neuronas por selección de células no proliferantes. Figura 4B , la funcionalidad de neuronas mDA para secretar dopamina después de selección por MMC. Figura 4C, no se observó crecimiento de células en proliferación después de selección de MMC, incluso después de cultivo prolongado tras la descongelación.

Figura 5: Expresión de marcadores en células producidas de líneas de células iPS humanas.

Figura 6: Caracterización tras la descongelación de neuronas mDA hechas a partir de la línea K (línea de células iPS 21534.101) después de crioconservación y descongelación.

Figuras 7A-B : Ensayo de líneas iPSC cruzadas de proceso de diferenciación mono-SMADi. Tres líneas iPSC derivadas de donantes sanos y nueve líneas de iPSC derivadas de pacientes con enfermedad de Parkinson se diferenciaron usando el proceso mono-SMADi optimizado. Todas las líneas de iPSC se convirtieron de forma eficaz a células progenitoras DA el día de proceso 17, con >80 % de coexpresión de FoxA2/Lmx1 en 11 de 12 líneas (Fig. 7A). Al terminar el proceso (día 37), las células de todas las líneas de iPSC habían alcanzado un alto nivel de pureza neuronal (>90 % MAP2+/nestina-), especificación de mesencéfalo (>80 % FoxA2+), y maduración de neurona de dopamina del mesencéfalo (>40 % TH+) (Fig. 7B).

Figura 8 : Ensayo de citometría de flujo para coexpresión de FoxA2/Lmx1. El patrón de progenitor se considera exitoso cuando las células son >80 % FoxA2+/Lmx1+ el día 17 (Fig. 8 , arriba). Se muestra un ejemplo de un patrón de progenitor subestándar (Fig. 8 , abajo), con el 60 % de células FoxA2+/Lmx1+ y una población significativa de células FoxA2+/Lmx1 -negativas.

Figura 9 : Liberación de dopamina de neuronas iPSC-mDA. La línea de iPSC “K” se diferenció a terminación del proceso (día 37) usando el protocolo mono-SMADi optimizado (“Condición 9”) y se crioconservó. No se detectó liberación de dopamina de neuronas del prosencéfalo derivadas de iPSC (iCell Neuron). Por el contrario, las células iPSC-mDA derivadas usando el proceso mono-SMADi optimizado (DA Therapy Neurons) secretaron al menos tanta dopamina como las células derivadas usando el proceso dual-SMAD optimizado (iCell DopaNeurons).

Figura 10: Actividad eléctrica de neuronas iPSC-mDA. Se descongelaron neuronas iPSC-mDA crioconservadas y se sembraron en placas de haz de multielectrodo (MEA) de 48 pocillos recubiertas con PEI. Las neuronas hechas con el protocolo mono-SMADi (DA Therapy) demostraron similar actividad eléctrica comparadas con células hechas con el protocolo dual-SMADi optimizado (iCell Dopa G100), incluyendo la tasa de descarga media (mFR), estallido (macro BPM) y conectividad (gráficos superiores). La frecuencia de mFR y la intensidad de estallido de conectividad aumentaron con el tiempo, alcanzando una meseta aproximadamente el día 16 tras la descongelación. Los gráficos de ráster temporales muestran intervalos entre espículas limpios, altas intensidades de estallido, y estallidos a través de todos los electrodos en un pocillo, lo que demuestra un alto grado de actividad eléctrica.

Figura 11: Perfil de expresión génica cuantitativa de neuronas iPSC-mDA. Se extrajo ARN de cuatro lotes de células iPSC-mDA derivadas usando el proceso mono-SMADi optimizado (lote 1-4) y un lote de células iPSC-mDA derivadas usando el protocolo dual-SMADi optimizado (iCell DopaNeurons) el día de proceso 37. Después del aislamiento de ARN, se realizó reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa en tiempo real, con resultados expresados como expresión relativa respecto a control GAPDH. Valores <10'4 se consideran fondo (caja sombreada). La expresión de marcadores neuronales del mesencéfalo y mDA fueron similares entre lotes y entre células hechas usando los diferentes protocolos. Los marcadores para regiones diferentes del mesencéfalo o tipos celulares diferentes de mDA fueron bajos, y también similares entre células derivadas de mono-SMADi y dual-SMADi.

Figura 12: Conversión a reactivos compatibles con cGMP. Se diferenciaron células iPSC-mDA usando el proceso mono-SMADi usando reactivos estándar o reactivos compatibles con cGMP, produjeron patrón de progenitores (día 17) y pureza de neuronas mDA el día 37 equivalentes.

Figura 13: Injerto de neuronas iPSC-DA en primates no humanos. La tinción de citoplasma humano (STEM121) revela buen injerto de células humanas e inervación en todos los animales. Se observaron neuronas de dopamina (TH+) en los injertos, lo que demuestra la capacidad de estas células para sobrevivir a largo plazo e inervar la estructura diana de neuronas mDA en el cerebro. No se observaron tumores, crecimiento neural u otros efectos adversos en estos animales.

Figura 14: Injerto de progenitores y neuronas iPSC-DA en un sistema modelo de EP en rata. No se observaron tumores, crecimiento neural u otros efectos adversos en ninguno de estos animales. Los resultados apoyan la idea de que células extraídas anteriormente en el proceso de diferenciación mono-SMADi optimizado (día 17-24) se pueden injertar e inervar mejor, en comparación con células más maduras.

Figura 15: Diferenciación mejorada usando LDN-1931892 pM. En múltiples experimentos (n = 5) se vieron mejoras en la calidad de las diferenciaciones cuando se usa LDN 2 pM. Se observaron mayores niveles de expresión de FoxA2 y Lmx1 en progenitores del día 17 (Fig. 15, arriba), y un mayor porcentaje de neuronas derivadas de la placa de apoyo (FoxA2+) el día de proceso 37 (Fig. 15, abajo) como resultado de usar LDN 2 pM en el protocolo.

Descripción de formas de realización ilustrativas

En algunos aspectos, la presente invención supera las limitaciones en el estado de la técnica al proporcionar composiciones y métodos para la diferenciación de células pluripotentes, tal como células madre pluripotentes inducidas, a células precursoras neuronales o neuronas, tal como células dopaminérgicas del mesencéfalo. Los métodos pueden implicar diferenciar las células pluripotentes en presencia de un único inhibidor de SMAD (“inhibición mono-SMAD”). Tales métodos pueden beneficiarse de las ventajas de usar un único inhibidor de SMAD (por ejemplo, coste reducido, una metodología simplificada o más mínima, etc.), en comparación con métodos previos que requieren el uso de dos o más inhibidores de SMAD.

I. Definiciones

“Pluripotencia” o “pluripotente” se refiere a una célula madre o célula indiferenciada que tiene el potencial de diferenciarse a todas las células que constituyen uno o más tejidos u órganos, por ejemplo, cualquiera de las tres capas germinales: endodermo (revestimiento interior del estómago, aparato digestivo, los pulmones), mesodermo (músculo, hueso, sangre, urogenital), o ectodermo (tejidos epidérmicos y sistema nervioso).

“Células madre pluripotentes inducidas”, comúnmente abreviadas a células iPS o iPSC, se refiere a un tipo de célula madre pluripotente artificialmente preparada a partir de una célula no pluripotente, típicamente una célula somática adulta, o célula terminalmente diferenciada, tal como fibroblasto, una célula hematopoyética, un miocito, una neurona, una célula epidérmica, o similar, introduciendo o poniendo en contacto con factores de reprogramación.

“Células madre embrionarias (ES)” son células madre pluripotentes que se pueden derivar en embriones tempranos.

“Cultivo adherente” se refiere a un cultivo en el que las células, o agregados de células, están unidos a una superficie.

“Cultivo en suspensión”, se refiere a un cultivo en el que las células, o agregados de células, se multiplican mientras están suspendidas en medio líquido.

“Esencialmente libre” de un componente externamente añadido se refiere a un medio que no tiene, o que tiene esencialmente nada de, el componente especificado de una fuente distinta de las células en el medio. “Esencialmente libre” de factores de crecimiento o inhibidores de señalización externamente añadidos, tal como TGFp, bFGF, inhibidores de señalización de la superfamilia de TGFp, etc., puede significar una cantidad mínima o una cantidad indetectable del componente externamente añadido. Por ejemplo, un medio o entorno esencialmente libre de TGFp o bFGF puede contener menos de 5, 4, 3, 2, 1, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001 ng/ml o cualquier intervalo derivable en los mismos. Por ejemplo, un medio o entorno esencialmente libre de inhibidores de señalización puede contener menos de 0,2, 0,1, 0,09, 0,08, 0,07, 0,06, 0,05, 0,04, 0,03, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001 pM, o cualquier intervalo derivable en los mismos.

“Diferenciación” es un proceso mediante el cual una célula menos especializada forma progenie de al menos un nuevo tipo celular que es más especializado.

El término “medio que fomenta agregados” significa cualquier medio que aumenta la formación de agregados de células sin ninguna restricción respecto al modo de acción.

El término “agregados”, es decir, cuerpos embrioides, se refiere a grupos homogéneos o heterogéneos de células que comprenden células diferenciadas, células parcialmente diferenciadas y/o células madre pluripotentes cultivadas en suspensión.

“Neuronas” o “células neurales” o “tipos de células neurales” o “ linaje neural” puede incluir cualquier célula de linaje neural, y se puede tomar que se refiere a células en cualquier fase de ontogenia neuronal sin ninguna restricción, a menos que se especifique de otra manera. Por ejemplo, neuronas pueden incluir tanto células precursoras de neuronas, neuronas maduras como tipos celulares neurales tal como astrocitos.

Un “gen”, “polinucleótido”, “región codificante”, “secuencia”, “segmento” o “fragmento” que “codifica” una proteína particular, es una molécula de ácido nucleico que se transcribe y opcionalmente también se traduce a un producto génico, por ejemplo, un polipéptido in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. La región codificante puede estar presente en forma de un ADNc, ADN genómico o ARN. Cuando está presente en una forma de ADN, la molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria (es decir, la hebra codificante) o bicatenaria. Los límites de una región codificante se determinan por un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y un codón de terminación de la traducción en el extremo 3' (carboxi). Un gen puede incluir, pero no está limitado a, ADNc de ARNm procariota o eucariota, secuencias de ADN genómico de ADN procariota o eucariota, y secuencias de ADN sintético. Una secuencia de terminación de la transcripción habitualmente estará localizada 3' respecto a la secuencia génica.

El término “transgén”, se refiere a un gen, ácido nucleico, o polinucleótido que se ha introducido en la célula u organismo por medios artificiales o naturales, tal como un ácido nucleico exógeno. Un ácido nucleico exógeno puede ser de un organismo o célula diferente, o puede ser una o más copias adicionales de un ácido nucleico que se produce de forma natural en el organismo o célula. A modo de ejemplo no limitante, un ácido nucleico exógeno está en una localización cromosómica diferente de la de células naturales, o está flanqueado de otra manera por una secuencia de ácido nucleico diferente que la encontrada en la naturaleza.

El término “promotor” se usa en el presente documento en su sentido normal para referirse a una región nucleotídica que comprende una secuencia reguladora de ADN, en donde la secuencia reguladora deriva de un gen que es capaz de unir ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una secuencia codificante posterior (dirección 3').

II. Inhibidores de SMAD para inhibición mono-SMAD

En algunos aspectos, se usa o bien un único inhibidor de la señalización de BMP o un único inhibidor de la señalización de TGF-p para inhibir la señalización de SMAD en métodos para convertir células pluripotentes (por ejemplo, células iPS, células ES) a células neuronales tal como células dopaminérgicas del mesencéfalo. Por ejemplo, en algunos aspectos, las células pluripotentes se convierten a una población de células neuronales que comprenden neuronas dA del mesencéfalo, en donde la diferenciación se produce en un medio que comprende un único inhibidor de la señalización de BMP. En algunas formas de realización, el inhibidor de BMP es LDN-193189, dorsomorfina, o DMH-1. Los ejemplos no limitantes de inhibidores de la señalización de BMP incluyen dorsomorfina, BMP dominante negativo, receptor de BMP truncado, receptores de BMP solubles, quimeras receptor de BMP-Fc, nogina, LDN-193189, folistatina, cordina, gremlina, proteínas de la familia cerberus/DAN, ventropina, activina a alta dosis, y amnionless. En algunas formas de realización, se puede usar un ácido nucleico, antisentido, ARNi, ARNip, u otro método genético para inhibir la señalización de BMP. Como se usa en el presente documento, un inhibidor de la señalización de BMP se puede denominar simplemente como un “inhibidor de BMP”. El inhibidor de BMP se puede incluir en el medio de diferenciación los días 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 y/o día 17 de diferenciación, 0 cualquier intervalo derivable en los mismos (por ejemplo, días 1-17, 1-16, 1-15, 2-15, etc.). En algunas formas de realización, el inhibidor de BMP se incluye en el medio de diferenciación todos de los días 1-17 de diferenciación. No obstante, se anticipa que puede ser posible excluir el inhibidor de BMP del medio de diferenciación en ciertos momentos, por ejemplo, en 1, 2 o 3 de los días anteriores. En algunas formas de realización, el inhibidor de BMP opcionalmente no se incluye en el medio de diferenciación los días 11-17, y en algunas formas de realización preferidas, el inhibidor de BMP se incluye en el medio de diferenciación los días 1-10.

En algunas formas de realización, el inhibidor de BMP es LDN193189, dorsomorfina, DMH-1, o nogina. Por ejemplo, se pueden cultivar células en un medio que comprende LDN193189 aproximadamente 1-2500, 1-2000, o 1-1.000 nM (por ejemplo, LDN193189 desde aproximadamente 10 a 500, 50 a 500, 50 a 300, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, o aproximadamente 2500 nM, o cualquier intervalo derivable en los mismos). En algunas formas de realización, se pueden cultivar las células en un medio que comprende dorsomorfina aproximadamente de 0,1 a 10 pM (por ejemplo, dorsomorfina de aproximadamente 0,1 a 10, de 0,5 a 7,5, de 0,75 a 5, de 0,5 a 3, de 1 a 3, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,25, 1,5, 1,55, 1,6, 1,65, 1,7, 1,75, 2, 2,25, 2,5, 2,75, 3, o aproximadamente 2 pM, o cualquier intervalo derivable en los mismos). En algunas formas de realización, se pueden cultivar las células en un medio que comprende DMH-1 aproximadamente 1 pM (por ejemplo, DMH-1 aproximadamente 0,2-8, 0,5-2, o aproximadamente 1 pM, o cualquier intervalo derivable en los mismos). Como se muestra en los ejemplos posteriores, LDN-193189, dorsomorfina, y DMH-1 también se usaron todos con éxito en métodos de inhibición mono-SMAD para producir neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo a partir de células iPS.

En algunos aspectos, se puede usar un inhibidor de TGFp para inhibir SMAD como un inhibidor mono-SMAD para generar neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo a partir de células pluripotentes tal como células iPS. Por ejemplo, en algunas formas de realización, el medio de diferenciación comprende al menos un primer inhibidor de la señalización de TGFp. Los ejemplos no limitantes de inhibidores de la señalización de TGFp incluyen A-83-01, GW6604, IN-1130, Ki26894, LY2157299, LY364947 (HTS-466284), A83-01, LY550410, LY573636, LY580276, NPC-30345, SB-431542, SB-505124, SD-093, Sm16, SM305, SX-007, Antp-Sm2A, y LY2109761. Por ejemplo, el inhibidor de TGFp en un medio de diferenciación puede ser SB431542. En algunos aspectos, las células se cultivan en un medio que comprende SB431542 aproximadamente de 0,1 a 100 pM (por ejemplo, SB431542 entre aproximadamente 1 a 100, 10 a 85, 15 a 60, 20-50, o aproximadamente 40 pM). Como se usa en el presente documento, un inhibidor de la señalización de TGFp, incluyendo un inhibidor del receptor de TGFp se puede denominar simplemente un “inhibidor de TGFp”. En algunas formas de realización, un inhibidor de TGFp no está incluido en el medio de diferenciación. En algunas formas de realización, un inhibidor de TGFp (por ejemplo, SB431542) se incluye en un medio de diferenciación los días 1-3, o 1, 2, 3, y/o el día 4 como el inhibidor mono-SMAD. Como se muestra en los ejemplos posteriores, en algunas formas de realización, se usa un inhibidor de BMP como el inhibidor mono-SMAD, puesto que se observó que estos compuestos producían diferenciación superior de células pluripotentes a neuronas DA del mesencéfalo, en comparación al uso de un inhibidor de TGFp.

111. Inclusión de un inhibidor de MEK

En algunos aspectos, se incluye un inhibidor de MEK en un medio de diferenciación, por ejemplo, en combinación con el inhibidor de BMP o inhibidor mono-SMAD para producir neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo a partir de células pluripotentes tal como células iPS. En algunas formas de realización, el inhibidor de MEK es PD0328901. Los ejemplos no limitantes de inhibidores de MEK que se podrían usar según las formas de realización incluyen PD0325901, trametinib (GSK1120212), selumetinib (AZD6244), pimasertib (AS-703026), MEK162, cobimetinib, PD184352, PD173074, BIX 02189, AZD8330 y PD98059. Por ejemplo, en algunas formas de realización, el método comprende cultivar las células en presencia del inhibidor de MEK entre aproximadamente 0,1 y 10 pM (por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 y 5; 0,5 y 3 o 0,5 y 1,5 pM), tal como PD0325901. En algunas formas de realización, las células se ponen en contacto con el inhibidor de MEK (por ejemplo, PD0325901) el día 3, 4, 5, o los días 3-5 de la diferenciación.

Por tanto, en ciertos aspectos, la diferenciación de las células comprende cultivar una población de células pluripotentes en un medio que comprende un inhibidor de BMP; un activador de la señalización de Sonic hedgehog (SHH); un activador de la señalización de Wnt, un inhibidor de MEK o una combinación de los anteriores, en donde el medio no contiene FGF8b exógenamente añadido. En algunos casos, se puede usar un inhibidor de TGFp en lugar de un inhibidor de BMP. En aspectos aún adicionales, un método de las formas de realización no comprende purificación de las células usando un marcador específico de DA. En algunos aspectos, las células pluripotentes comprenden un gen de resistencia bajo el control de un promotor neuronal que se puede usar para la purificación de células neuronales (por ejemplo, las células neuronales que expresan un gen de resistencia al antibiótico sobrevivirán la exposición al antibiótico mientras las células no neuronales morirán).

En algunas formas de realización, se puede producir una población enriquecida de neuronas DA del mesencéfalo por un método que comprende: obtener una población de células pluripotentes; diferenciar las células a una población celular de linaje neural en un medio que comprende un inhibidor de MEK (por ejemplo, PD0325901), en donde el medio no contiene FGF8b exógenamente añadido el día 1 de la diferenciación; y diferenciar más las células de la población celular de linaje neural para proporcionar una población enriquecida de neuronas DA del mesencéfalo. Como se describe en el presente documento, los inventores han observado que, en algunos casos, la inclusión de FGF8 (por ejemplo, FGF8b) en el medio de diferenciación el día 1 puede, en algunos casos, impedir o prevenir la diferenciación de las células a neuronas DA del mesencéfalo. En algunas formas de realización, se puede incluir opcionalmente FGF8 en un medio de diferenciación en días posteriores de la diferenciación tal como, por ejemplo, los días 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, o cualquier intervalo derivable en los mismos, por ejemplo, preferiblemente en donde el contacto de las células pluripotentes se inicia con el inhibidor de SMAD único en un medio de diferenciación el día 1.

IV. Inclusión de activador de Wnt o inhibidor de GSK

En algunos aspectos, se incluye un activador de Wnt (por ejemplo, un inhibidor de GSK3) en un medio de diferenciación, por ejemplo, en combinación con el inhibidor de BMP o inhibidor mono-SMAD para generar neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo a partir de células pluripotentes tal como células iPS. En algunas formas de realización, células pluripotentes a una población de células neuronales que comprenden neuronas DA del mesencéfalo, en donde la diferenciación es en un medio que comprende al menos un primer activador de la señalización de Wnt.

Se puede usar una variedad de activadores de Wnt o inhibidores de GSK3 en varios aspectos de la presente invención. Por ejemplo, el activador de la señalización de WNT puede ser un inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK3). Los ejemplos no limitantes de inhibidores de GSK3 incluyen NP031112, TWS119, SB216763, CHIR-98014, AZD2858, AZD1080, SB415286, LY2090314 yCHIR99021. En algunas formas de realización, las células pluripotentes se ponen en contacto con un único inhibidor de SMAD que no es SB415286. En algunas formas de realización, el activador de la señalización de Wnt es CHIR99021. Por tanto, en algunos aspectos, un medio de cultivo para uso según formas de realización comprende CHIR99021 desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 10 pM (por ejemplo, CHIR99021 entre aproximadamente 0,1 a 5, de 0,5 a 5, de 0,5 a 3, desde más de aproximadamente 1,25 a 2,25, aproximadamente 1,25, 1,5, 1,55, 1,65, 1,7, 1,75, 1,8, 1,9, 2,0, o aproximadamente 1,75 pM, o cualquier intervalo derivable en los mismos).

En algunas formas de realización preferidas, el activador de Wnt (por ejemplo, inhibidor de GSK3) opcionalmente no está incluido en el medio de diferenciación el día 1. En algunas formas de realización el activador de Wnt o inhibidor de GSK (por ejemplo, CHIR99021) se incluye en el medio de diferenciación los días 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, y/o día 17, o cualquier combinación o todos estos días. Por ejemplo, en algunas formas de realización, el activador de Wnt o inhibidor de GSK se incluye en el medio de diferenciación los días 2-17 o los días 3-17.

V. Activador de Sonic hedgehog

En algunos aspectos, se incluye un activador de la señalización de Sonic hedgehog (SHH) en un medio de diferenciación, por ejemplo, en combinación con el inhibidor de BMP o inhibidor mono-SMAD para generar neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo a partir de células pluripotentes tal como células iPS. En algunas formas de realización, el activador de Sonic hedgehog es Sonic hedgehog (Shh) o un Shh mutante. El Shh puede ser, por ejemplo, una proteína humana o de ratón o puede derivar de un Shh humano o de ratón. Por ejemplo, en algunas formas de realización, el Shh es una proteína Shh de ratón mutante tal como C25II Shh de ratón o C24II Shh humana. En algunas formas de realización, el medio de diferenciación comprende tanto Shh (por ejemplo, C25II Shh) como un activador de molécula pequeña de SHH tal como, por ejemplo, purmorfamina. Sin querer estar vinculado por ninguna teoría, el Shh y/o el activador de Sonic hedgehog puede fomentar la diferenciación de la placa de apoyo neural.

En algunas formas de realización, se generan neuronas DA del mesencéfalo a partir de células pluripotentes por un método que comprende cultivar las células pluripotentes en un medio que comprende al menos un primer activador de la señalización de SHH. Por ejemplo, el activador de la señalización de SHH puede ser un polipéptido SHH recombinante (o una porción del mismo) o un activador de molécula pequeña. En ciertos aspectos, el activador de SHH puede ser Shh C25II, purmorfamina o un análogo de purmorfamina (por ejemplo, agonista de Smoothened, tal como SAG-1 o 3-cloro-N-[(1r,4r)-4-(metilamino)ciclohexil]-N-[3-(piridin-4-il)bencil]benzo[b]tiofeno-2-carboxamida). Por tanto, en ciertos aspectos, un medio de cultivo para uso según las formas de realización comprende purmorfamina de aproximadamente 0,1 a 10 pM (por ejemplo, purmorfamina entre aproximadamente 0,1 a 20, de 0,5 a 10, de 0,5 a 5 0 aproximadamente 2 pM). En aspectos adicionales, un medio de cultivo comprende Shh C25II de aproximadamente 1 a 1.000 ng/ml (por ejemplo, Shh C25II de aproximadamente 10 a 1.000, de 10 a 500 o aproximadamente 100 ng/ml). En algunas formas de realización, el activador de la señalización de SHH incluye tanto Shh C25II como purmorfamina. Por ejemplo, se pueden cultivar las células en un medio que comprende purmorfamina de aproximadamente 0,1 a 10 pM y Shh C25II de aproximadamente 1 a 1.000 ng/ml. El/los activador(es) de SHH (por ejemplo, Shh C25II y purmorfamina) se pueden incluir en un medio de diferenciación los días 1, 2, 3, 4, 5, 6, y/o 7. En algunas formas de realización, los activadores de SHH se excluyen del medio de diferenciación el día 1. Por ejemplo, en varias formas de realización, el/los activador(es) de SHH se incluyen en el medio de diferenciación los días 1-6 o 2-7.

Por tanto, en ciertos aspectos, se pueden cultivar células pluripotentes en una diferenciación durante 1-6 días en un sistema de cultivo adherente con un medio DMEM/F12 que comprende suplemento B27, LDN-193189 1-3000 o 1 1000 nM (o SB431542 de 0,1 a 100 pM), purmorfamina de 0,1 a 50 pM, Shh C25II de 1 a 1.000 ng/ml y CHIR99021 de 0,1 a 10 pM. En un aspecto, el medio puede comprender suplemento B27, LDN-193189 200 nM (o SB431542 10 pM), purmorfamina 2 pM, Shh C25II 100 ng/ml y CHIR99021 1,25 pM. En algunas formas de realización, el inhibidor de MEK se incluye en el medio después de 1-2 días (por ejemplo, el inhibidor de MEK se incluye los días 2-4, o los días 2,3 y/o 4 de diferenciación).

VI. Fuentes de células madre pluripotentes

Se pueden usar células madre pluripotentes en los presentes métodos para la inducción neural de células madre pluripotentes. Se divulgan métodos y composiciones en el presente documento que se pueden usar, por ejemplo, para mejorar la eficacia de la diferenciación neural optimizando componentes del medio y/o selección de las neuronas DA del mesencéfalo deseadas producidas por el protocolo de diferenciación.

El término “célula madre pluripotente” o “célula pluripotente” se refiere a una célula capaz de dar lugar a células de las tres capas germinales, es decir, endodermo, mesodermo y ectodermo. Aunque en teoría una célula madre pluripotente se puede diferenciar a cualquier célula del cuerpo, la determinación experimental de pluripotencia típicamente se basa en la diferenciación de una célula pluripotente a varios tipos celulares de cada capa germinal. Una célula madre pluripotente es una célula madre embrionaria (ES) que puede derivar de la masa celular interna de un blastocisto. En otras formas de realización, la célula madre pluripotente es una célula madre pluripotente inducida derivada por reprogramación de células somáticas. En algunas formas de realización, la célula madre pluripotente es una célula madre embrionaria no humana derivada por transferencia nuclear de célula somática. La célula madre pluripotente se puede obtener o derivar de un sujeto sano (por ejemplo, un ser humano sano) o un sujeto con una enfermedad (por ejemplo, una enfermedad neurodegenerativa, enfermedad de Parkinson, etc.).

A. Células madre embrionarias

Las células madre embrionarias (ES) son células pluripotentes que pueden derivar de la masa celular interna de un blastocisto. Las células ES se puede aislar eliminando la capa trofectodermo externa de un embrión en desarrollo, después cultivando las células de la masa interna en una capa soporte de células que no crecen. En las condiciones apropiadas, se producen colonias de células ES indiferenciadas, en proliferación. Las colonias se pueden retirar, disociar en células individuales, y después volver a sembrar con una capa de soporte reciente. Las células replaqueadas pueden seguir proliferando, produciendo nuevas colonias de células ES indiferenciadas. Las nuevas colonias se pueden retirar, disociar y replaquear de nuevo y dejar que crezcan. Este proceso de “subcultivar” o “pasar” células ES indiferenciadas se puede repetir un número de veces para producir líneas celulares que contienen células ES indiferenciadas (por ejemplo, como se describe en las patentes en EE UU No. 5.843.780; 6.200.806; 7.029.913). Un “cultivo celular primario” es un cultivo de células directamente obtenidas de un tejido tal como, por ejemplo, la masa celular interna de un blastocisto. Un “subcultivo” es cualquier cultivo derivado del cultivo celular primario.

Los métodos para obtener células ES de ratón se conocen bien. En un método, un blastocisto de preimplantación de la cepa 129 de ratones se trata con antisuero de ratón para eliminar el trofectodermo, y la masa celular interna se cultiva en una capa de células soporte de fibroblastos embrionarios de ratón químicamente inactivados en medio que contiene suero fetal de ternera. Las colonias de células ES indiferenciadas que se desarrollan se subcultivan en capas soporte de fibroblastos embrionarios de ratón en presencia de suero fetal de ternera para producir poblaciones de células ES. En algunos métodos, las células ES de ratón se pueden hacer crecer en ausencia de una capa de soporte añadiendo la citoquina factor inhibidor de leucemia (LIF) al medio de cultivo que contiene suero (Smith, 2000). En otros métodos, las células ES de ratón se pueden hacer crecer en medio sin suero en presencia de proteína morfogenética ósea y LIF (Ying et al., 2003).

Por referencia, las células ES humanas se pueden obtener de blastocistos usando métodos previamente descritos (Thomson et al., 1995; Thomson et al., 1998; Thomson y Marshall, 1998; Reubinoff et al, 2000). En un método, blastocistos humanos del día 5 se exponen a antisuero de conejo anti-célula de bazo humana, y después se exponen a una dilución 1:5 de complemento de cobaya para lisar las células del trofectodermo. Después de eliminar las células del trofectodermo lisadas de la masa celular interna intacta, la masa celular interna se cultiva en una capa soporte de fibroblastos embrionarios de ratón inactivados con radiación gamma en presencia de suero bovino fetal. Después de 9 a 15 días, grumos de células derivadas de la masa celular interna se pueden disociar químicamente (es decir, exponer a tripsina) o mecánicamente y volver a sembrar en medio fresco que contiene suero bovino fetal y una capa soporte de fibroblastos embrionarios de ratón. Tras proliferación adicional, se seleccionan colonias que tienen morfología indiferenciada por micropipeta, se disocian mecánicamente en grumos, y se vuelven a sembrar (véase la patente en EE UU No. 6.833.269). La morfología de tipo ES se caracteriza como colonias compactas con proporción núcleo a citoplasma aparentemente alta y nucleolos prominentes. Las células ES resultantes se pueden pasar rutinariamente por tripsinización breve o por selección de colonias individuales por micropipeta. En algunos métodos, las células ES humanas se pueden hacer crecer sin suero cultivando las células ES en una capa soporte de fibroblastos en presencia de factor de crecimiento de fibroblastos básico (Amit et al., 2000). En otros métodos, las células ES humanas se pueden hacer crecer sin capa de células soporte cultivando las células sobre una matriz de proteína tal como Matrigel™ o laminina en presencia de un medio “acondicionado” que contiene factor de crecimiento de fibroblastos básico (Xu et al., 2001). El medio se puede acondicionar previamente por cocultivo con fibroblastos.

Los métodos para el aislamiento de células ES de mono rhesus y tití común también son conocidos (Thomson y Marshall, 1998; Thomson et al., 1995; Thomson y Odorico, 2000).

Otra fuente de células ES son líneas de células ES establecidas. Se conocen varias líneas de células de ratón y líneas de células ES humanas y las condiciones para su crecimiento y propagación se han definido. Por ejemplo, la línea celular CGR8 de ratón se estableció de la masa celular interna de embriones de la cepa de ratón 129, y se pueden hacer crecer cultivos de células CGR8 en presencia de LIF sin capas soporte. Por referencia solo, como un ejemplo más, se establecieron las líneas de células ES humanas H1, H7, H9, H13, y H14 por Thomson et al., (2000). Además, se han desarrollado los subclones H9.1 y H9.2 de la línea H9.

Por referencia solo, la fuente de células ES incluye un blastocisto, células derivadas de cultivar la masa celular interna de un blastocisto, y células obtenidas de cultivos de líneas celulares establecidas. Por tanto, el término “células ES” se puede referir a células de la masa celular interna de un blastocisto, células ES obtenidas de cultivos de células de la masa interna, y células ES obtenidas de cultivos de líneas de células ES.

B. Células madre pluripotentes inducidas

Las células madre pluripotentes inducidas (iPS) son células que tienen las características de células ES, pero se obtienen por la reprogramación de células somáticas diferenciadas. Las células madre pluripotentes inducidas se han obtenido por varios métodos. En un método, fibroblastos dérmicos humanos adultos se transfectan con los factores de transcripción Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4 usando transducción con retrovirus (Takahashi et al., 2006, 2007). Las células transfectadas se siembran sobre células soporte SNL (una línea celular de fibroblastos de ratón que produce LIF) en un medio suplementado con factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF). Después de aproximadamente 25 días, colonias que se parecen a colonias de células ES humanas aparecen en el cultivo. Las colonias similares de células ES se cogen y expanden sobre células soporte en presencia de bFGF. En algunas formas de realización preferidas, las células iPS son células iPS humanas.

Basado en características celulares, las células de las colonias similares a células ES son células madre pluripotentes inducidas. Las células madre pluripotentes inducidas son morfológicamente similares a células ES humanas, y expresan varios marcadores de células ES humanas. Además, cuando se hacen crecer en condiciones que se sabe producen la diferenciación de células ES humanas, las células madre pluripotentes inducidas se diferencian en consecuencia. Por ejemplo, las células madre pluripotentes inducidas se pueden diferenciar a células que tienen estructuras neuronales y marcadores neuronales. Se anticipa que virtualmente cualquier célula o línea de células iPS se puede usar con la presente invención, incluyendo, por ejemplo, las descritas en Yu y Thomson, 2008.

En otro método, fibroblastos fetales o de recién nacido humanos se transfectan con cuatro genes Oct4, Sox2, Nanog y Lin28 usando transducción con lentivirus (Yu et al., 2007). En los días 12-20 tras la infección, colonias con morfología de células ES humana se hacen visibles. Las colonias se cogen y se expanden. Las células madre pluripotentes inducidas que hacen las colonias son morfológicamente similares a las células ES humanas, expresan varios marcadores de células ES humanas, y forman teratomas que tienen tejido neural, cartílago y epitelio intestinal después de inyección a ratones.

También se conocen métodos para preparar células madre pluripotentes inducidas a partir de células de ratón (Takahashi y Thomson, 2006). La inducción de células iPS típicamente requiere la expresión de o exposición a al menos un miembro de la familia Sox y al menos un miembro de la familia Oct. Se piensa que Sox y Oct son centrales para la jerarquía reguladora transcripcional que especifica la identidad de células ES. Por ejemplo, Sox puede ser Sox-1, Sox-2, Sox-3, Sox-15 o Sox-18; Oct puede ser Oct-4. Factores adicionales pueden aumentar la eficacia de reprogramación, como Nanog, Lin28, Klf4, o c-Myc; conjuntos específicos de factores de reprogramación pueden ser un conjunto que comprende Sox-2, Oct-4, Nanog y, opcionalmente, Lin-28; o que comprende Sox-2, Oct-4, Klf y, opcionalmente, c-Myc.

Las células iPS, como las células ES, tienen antígenos característicos que se pueden identificar o confirmar por inmunohistoquímica o citometría de flujo, usando anticuerpos para SSEA-1, SSEA-3 y SSEA-4 (Developmental Studies Hybridoma Bank, National Institute of Child Health and Human Development, Bethesda Md.), y TRA-1-60 y TRA-1-81 (Andrews et al., 1987). La pluripotencia de células madre embrionarias se puede confirmar, por ejemplo, inyectando aproximadamente 0,5-10 X 106 células en los músculos de la pata trasera de ratones SCID macho de 8 12 semanas de edad. Se desarrollan teratomas que demuestran al menos un tipo celular de cada una de las tres capas germinales.

En ciertos aspectos de la presente invención, las células iPS se hacen de reprogramar células somáticas usando factores de reprogramación que comprenden un miembro de la familia Oct y un miembro de la familia Sox, tal como Oct4 y Sox2 en combinación con Klf o Nanog, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente. La célula somática puede ser cualquier célula somática que se pueda inducir a pluripotencia tal como, por ejemplo, un fibroblasto, un queratinocito, una célula hematopoyética, una célula mesenquimatosa, una célula hepática, una célula de estómago o una célula p. En algunas formas de realización, también se pueden usar células T como fuente de células somáticas para la reprogramación (por ejemplo, véase el documento WO 2010/141801).

Los factores de reprogramación se pueden expresar de casetes de expresión comprendidos en uno o más vectores, tal como un vector de integración, un vector vírico de ARN que no se integra en el cromosoma (véase la solicitud en EE UU No. 13/054.022) o un vector episomal, tal como sistema basado en un elemento EBV (por ejemplo, véase, el documento WO 2009/149233; Yu et al., 2009). En un aspecto adicional, se podrían introducir proteínas o ARN de reprogramación (tal como ARNm o miARN) directamente en células somáticas por transfección de proteína o ARN (Yakubov et al., 2010).

C. Células madre embrionarias no humanas derivadas por transferencia nuclear de células somáticas

Se pueden preparar células madre pluripotentes por medio de transferencia nuclear de célula somática, en la que un núcleo donante se transfiere a un ovocito sin huso. Las células madre producidas por transferencia nuclear son genéticamente idénticas a los núcleos donantes. En un método, se introducen núcleos de fibroblastos donantes de fibroblastos de piel en el citoplasma de ovocitos en metafase II maduros, sin huso por electrofusión (Byrne et al., 2007). Los ovocitos fusionados se activan por exposición a ionomicina, y después se incuban hasta la fase de blastocisto. La masa celular interna de los blastocistos seleccionados se cultiva después para producir líneas de células madre embrionarias. Las líneas de células madre embrionarias pueden mostrar morfología de células ES normal, expresar varios marcadores de células ES, y diferenciarse a múltiples tipos celulares tanto in vitro como in vivo. Como se usa en el presente documento, el término “células ES” se refiere a células madre embrionarias derivadas de embriones que contienen núcleos fertilizados. Las células ES se distinguen de células madre embrionarias producidas por transferencia nuclear, que se denominan “células madre embrionarias derivadas por transferencia nuclear de células somáticas”.

VII. Medio para la diferenciación

Un medio de diferenciación según ciertos aspectos de la presente invención se puede preparar usando un medio que se va a usar para cultivar células animales como su medio basal. En algunas formas de realización, un medio de diferenciación se usa para diferenciar células pluripotentes a neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo usando solo un único inhibidor de BMP o un único inhibidor de TGF-beta. Por ejemplo, un medio de diferenciación usado para fomentar la diferenciación de células pluripotentes (por ejemplo, a células dopaminérgicas del mesencéfalo) puede comprender un único inhibidor de BMP (tal como LDN-193189 o dorsomorfina; por ejemplo, los días 1-17 de diferenciación; un activador de la señalización de Sonic hedgehog (SHH) (tal como purmorfamina, C25II SHH humana o C24II SHH de ratón, por ejemplo, los días 1-6, 2-7, o 1-7); un activador de la señalización de Wnt (tal como un inhibidor de GSK, por ejemplo, CHIR99021; por ejemplo, los días 2-17 o 3-17) y/o un inhibidor de MEK (tal como PD0325901; por ejemplo, los días 2-4 o 3-5). En algunas formas de realización, se puede usar un único inhibidor de TGFp (tal como SB-431542, por ejemplo, los días 1-4) en lugar del único inhibidor de BMP; sin embargo, como se muestra en los ejemplos posteriores, se observó que el uso de un único inhibidor de BMP producía diferenciación superior de células a células FOX2A+/LMX1A+ en comparación al uso de un único inhibidor de TGF-p. En algunas formas de realización, FGF-8 (por ejemplo, FGF-8b) no está incluido en el medio de diferenciación el primer día o los días 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, o cualquier combinación de los mismos (por ejemplo, días 1-8); por ejemplo, en algunas formas de realización FGF-8 se incluye en el medio de diferenciación los días 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 y 17, o cualquier combinación de los mismos. En varias formas de realización, el medio de diferenciación puede contener TGFp y bFGF, o, alternativamente, el medio de diferenciación puede estar esencialmente libre de TGFp y bFGF.

En ciertos aspectos, un método de diferenciación según las formas de realización implica el pase de células a través de una gama de condiciones de medio, por ejemplo, las células se cultivan

- en cultivo adherente en un medio que comprende un único inhibidor de BMP (o un inhibidor de TGFp); un activador de la señalización de Sonic hedgehog (s Hh ); y un activador de la señalización de Wnt;

- en suspensión en un medio que comprende un único inhibidor de BMP (o un inhibidor de TGFp); un activador de la señalización SHH; y un activador de la señalización de Wnt, para formar agregados celulares;

- en cultivo adherente en un medio Neurobasal que comprende suplemento B27, L-glutamina, BDNF, GDNF, TGFp, ácido ascórbico, dibutiril AMPc, y DAPT (y, opcionalmente, carece de retinol o ácido retinoico añadido exógenamente) para la maduración.

Como el medio basal, se puede usar cualquier medio químicamente definido, tal como medio basal de Eagle (BME), BGJb, CMRL 1006, Glasgow MEM, MEM mejorado opción zinc, medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), Medio 199, MEM Eagle, aMEM, DMEM, Ham, RPMI 1640 y Medio de Fisher, variaciones o combinaciones de los mismos, en donde TGFp y bFGF pueden o no estar incluidos.

En formas de realización adicionales, el medio de diferenciación celular también puede contener suplementos tal como suplemento B-27, un suplemento de insulina, transferrina y selenio (ITS), L-glutamina, NEAA (aminoácidos no esenciales), P/S (penicilina/estreptomicina), suplemento N2 (insulina 5 pg/ml, transferrina 100 pg/ml, progesterona 20 nM, selenio 30 mM, putrescina 100 pM (Bottenstein, y Sato, 1979 PNAS USA 76, 514-517) y/o p-mercaptoetanol (p-ME). Se contempla que se puedan o no añadir factores adicionales incluyendo, pero no limitado a, fibronectina, laminina, heparina, sulfato de heparina, ácido retinoico.

Se pueden añadir o no factores de crecimiento a un medio de diferenciación. Además o en lugar de los factores descritos anteriormente, factores de crecimiento tal como miembros de la familia del factor de crecimiento epidérmico (EGF), miembros de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) incluyendo FGF2 y/o FGF8, miembros de la familia del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), antagonistas de la familia del factor de crecimiento transformante (TGF)/proteína morfogenética ósea (BMP)/factor de crecimiento y diferenciación (GDF) se pueden emplear en varias etapas en el proceso. En algunas formas de realización, FGF-8 se incluye en un medio de diferenciación como se describe en el presente documento. Otros factores que se pueden o no añadir al medio de diferenciación incluyen moléculas que pueden activar o inactivar la señalización a través de la familia de receptores Notch, incluyendo, pero no limitado a, proteínas de las familias de tipo Delta y Jagged, así como inhibidores de gamma secretasa y otros inhibidores del procesamiento o corte de Notch tal como dApT. Otros factores de crecimiento pueden incluir miembros de la familia del factor de crecimiento de tipo insulina (IGF), familia de factor relacionado con wingless (WNT), y la familia del factor hedgehog.

Se pueden añadir factores adicionales en un medio de formación de agregados y/o diferenciación para fomentar la proliferación y supervivencia de células madre/progenitores neurales, así como la supervivencia y diferenciación de neuronas. Estos factores neurotróficos incluyen, pero no están limitados a factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), neurotrofina-3 (NT-3), neurotrofina-4/5 (NT-4/5), interleuquina-6 (IL-6), factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor inhibidor de leucemia (LIF), cardiotrofina, miembros de la familia del factor de crecimiento transformante (TGF)/proteína morfogenética ósea (BMP)/factor de crecimiento y diferenciación (GDF), la familia del factor neurotrófico derivado de glía (GDNF) incluyendo, pero no limitado a neurturina, neublastina/artemina, y persefina y factores relacionados con e incluyendo factor de crecimiento de hepatocitos. Los cultivos neurales que están terminalmente diferenciados para formar neuronas posmitóticas también pueden contener un inhibidor mitótico o mezcla de inhibidores mitóticos incluyendo, pero no limitados a 5-fluoro-2'-desoxiuridina, mitomicina C y/o citosina p-D-arabino-furanósido (Ara-C).

El medio puede ser un medio que contiene suero o un medio sin suero. El medio sin suero se puede referir a un medio sin suero no procesado o no purificado y según esto, puede incluir medios con componentes sanguíneos purificados o componentes derivados de tejidos animales (tal como factores de crecimiento). Desde el aspecto de prevenir la contaminación con componentes derivados de animal heterogéneos, el suero puede derivar del mismo animal que las células madre. En algunas formas de realización, el medio es un medio definido, y el medio no contiene suero u otros componentes derivados de tejidos animales (tal como fibroblastos de ratón irradiados o un medio que se ha acondicionado con células soporte de fibroblastos irradiados).

El medio puede contener o puede no contener cualquier alternativa al suero. Las alternativas al suero pueden incluir materiales que apropiadamente contienen albúmina (tal como albúmina rica en lípidos, sustitutos de albúmina tal como albúmina recombinante, almidón vegetal, dextranos e hidrolizados de proteínas), transferrina (u otros transportadores de hierro), ácidos grasos, insulina, precursores de colágeno, oligoelementos, 2-mercaptoetanol, 3'-tiolglicerol, o equivalentes a los mismos. Por ejemplo, una alternativa al suero se puede preparar por el método divulgado en la Publicación Internacional No. 98/30679. Alternativamente, se pueden usar materiales comercialmente disponibles para más conveniencia. Los materiales comercialmente disponibles incluyen suero sustituto Knockout (KSR) y lípido químicamente definido concentrado (Gibco).

El medio también puede contener ácidos grasos o lípidos, aminoácidos (tal como aminoácidos no esenciales), vitamina(s), factores de crecimiento, citoquinas, sustancias antioxidantes, 2-mercaptoetanol, ácido pirúvico, agentes tamponantes, y sales inorgánicas. La concentración de 2-mercaptoetanol puede ser, por ejemplo, aproximadamente de 0,05 a 1,0 mM, y en particular aproximadamente de 0,1 a 0,5, o 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 0,8, 1, 1,5, 2, 2,5, 5, 7,5, 10 mM o cualquier valor intermedio, pero la concentración no está particularmente limitada a los mismos siempre que sea apropiada para cultivar la(s) célula(s) madre.

En ciertas formas de realización, las células madre pluripotentes se cultivan en un medio antes de la formación de agregados para mejorar la inducción neural y patrón de placa de apoyo (por ejemplo, antes de ser disociadas en células individuales o pequeños agregados para inducir la formación de agregados). En ciertas formas de realización de la invención, las células madre se pueden cultivar en ausencia de células de soporte, extracto de células de soporte y/o suero.

B. Condiciones de cultivo

Un recipiente de cultivo usado para cultivar célula(s) puede incluir, pero no está particularmente limitado a: botella, botella para cultivo tisular, botella giratoria, placa, placa de Petri, placa para cultivo celular, multiplaca, microplaca, placa de micropocillos, multiplaca, placa multipocillos, microportaobjetos, portaobjetos con cámara, tubo, bandeja, cámaras CellSTACK®, bolsa de cultivo y botella rodante, siempre que se pueda cultivar células en las mismas. Las células se pueden cultivar en un volumen de al menos o aproximadamente 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 800, 1000, 1500 ml, o cualquier intervalo derivable en los mismos, dependiendo de las necesidades del cultivo. En una cierta forma de realización, el recipiente de cultivo puede ser un biorreactor, que se puede referir a cualquier dispositivo o sistema que soporte un medio biológicamente activo. El biorreactor puede tener un volumen de al menos o aproximadamente 2, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500 litros, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 metros cúbicos, o cualquier intervalo derivable en los mismos.

La superficie del recipiente de cultivo se puede preparar con adhesivo celular o no dependiendo del fin. El recipiente de cultivo adhesivo celular se puede recubrir con cualquier sustrato para adhesión celular tal como matriz extracelular (MEC) para mejorar la adhesividad de la superficie del recipiente a las células. El sustrato usado para la adhesión celular puede ser cualquier material pretendido para unir células madre o células soporte (si se usan). Los sustratos no limitantes para adhesión celular incluyen colágeno, gelatina, poli-L-lisina, poli-D-lisina, poli-L-ornitina, laminina, vitronectina, y fibronectina y mezclas de las mismas, por ejemplo, mezclas de proteínas de células de sarcoma de ratón de Engelbreth-Holm-Swarm (tal como Matrigel® o Geltrex) y preparaciones de membranas celulares lisadas (Klimanskaya et al., 2005).

Otras condiciones de cultivo se pueden definir apropiadamente. Por ejemplo, la temperatura de cultivo puede ser aproximadamente de 30 a 40 °C, por ejemplo, al menos o aproximadamente 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 °C, pero no está particularmente limitada a ellas. La concentración de CO²puede ser aproximadamente del 1 al 10 %, por ejemplo, aproximadamente del 2 al 7 %, o cualquier intervalo derivable en los mismos. La tensión de oxígeno puede ser al menos o aproximadamente el 1, 5, 8, 10, 20 %, o cualquier intervalo derivable en los mismos.

Se puede usar un cultivo de adhesión en ciertos aspectos. En este caso, las células se pueden cultivar en presencia de células soporte. En el caso donde las células soporte se usan en los métodos de la presente invención, se pueden usar células estromales tal como fibroblastos fetales como células soporte (por ejemplo, referencia a; Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual (1994); Gene Targeting, A Practical Approach (1993); Martin (1981); Evans et al. (1981); Jainchill et al., (1969); Nakano et al., (1996); Kodama et al. (1982); y las publicaciones internacionales Nos.

01/088100 y 2005/080554).

En otros aspectos, se puede usar un cultivo en suspensión. Un cultivo en suspensión puede incluir un cultivo en suspensión en soportes (Fernandes et al., 2007) o encapsulación de gel/biopolímero (Publicación de patente en EE UU No. 2007/0116680). El cultivo en suspensión de las células madre significa que las células madre se cultivan en condiciones no adherentes con respecto al recipiente de cultivo o células soporte (si se usan) en un medio. El cultivo en suspensión de células madre en general incluye un cultivo de disociación de células madre y un cultivo en suspensión de agregados de células madre. El cultivo de disociación de células madre significa que se cultivan células madre suspendidas, y el cultivo de disociación de células madre incluye los de células madre individuales o los de pequeños agregados celulares compuestos de una pluralidad de células madre (por ejemplo, aproximadamente de 2 a 400 células). Cuando el cultivo de disociación anteriormente mencionado se sigue, las células disociadas cultivadas forman un agregado mayor de células madre, y después de ello se puede realizar un cultivo en suspensión de agregados. El cultivo en suspensión de agregados incluye un método de cultivo de un embrioide (véase Keller et al., 1995) y un método SFEB (cuerpo embrioide sin suero) (Watanabe et al., 2005); Publicación Internacional No.

2005/123902).

C. Cultivo de células madre pluripotentes

Se pueden encontrar métodos para preparar y cultivar células madre pluripotentes tal como células ES en libros de texto estándar y revisiones en biología celular, cultivo tisular, y embriología, incluyendo teratocarcinomas y células madre embrionarias: Guide to Techniques in Mouse Development (1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro (1993); Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy (1998). Los métodos estándar usados en cultivo tisular en general se describen en Animal Cell Culture (1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (1987); y Current Protocols in Molecular Biology y Short Protocols in Molecular Biology (1987 & 1995).

Después de que las células somáticas se introduzcan en o pongan en contacto con factores de reprogramación, estas células se pueden cultivar en un medio suficiente para mantener la pluripotencia y el estado indiferenciado. El cultivo de células madre pluripotentes inducidas (iPS) puede usar varios medios y técnicas desarrollados para cultivar células madre pluripotentes de primate, células madre embrionarias o células iPS, por ejemplo, como se describe en la publicación de patente en EE UU 2007/0238170 y la publicación de patente en EE UU 2003/0211603, y la publicación de patente en EE UU 2008/0171385. Se aprecia que se pueden usar métodos adicionales para el cultivo y mantenimiento de células madre pluripotentes, como sabría el experto en la materia, con la presente invención.

En ciertas formas de realización, se pueden usar condiciones indefinidas; por ejemplo, se pueden cultivar células pluripotentes sobre células soporte fibroblastos o un medio que se ha expuesto a células soporte fibroblastos con el fin de mantener las células madre en un estado indiferenciado. Alternativamente, las células pluripotentes se pueden cultivar y mantener en un estado esencialmente indiferenciado usando un sistema de cultivo independiente de soporte definido, tal como un medio TeSR (Ludwig et al., 2006a; Ludwig et al., 2006b) o medio E8 (Chen et al., 2011; documento PCT/US2011/046796). Se pueden usar sistemas de cultivo y medios independientes de soporte para cultivar y mantener células pluripotentes. Estos enfoques permiten que células madre pluripotentes humanas permanezcan en un estado esencialmente indiferenciado sin la necesidad de “capas de soporte” de fibroblastos de ratón. Como se describe en el presente documento, se pueden hacer varias modificaciones a estos métodos con el fin de reducir costes según se desee.

Se pueden usar varios componentes de matriz al cultivar, mantener o diferenciar células madre pluripotentes humanas. Por ejemplo, se pueden usar colágeno IV, fibronectina, laminina y vitronectina en combinación para recubrir una superficie de cultivo como un medio de proporcionar un soporte sólido para el crecimiento de células pluripotentes, como se describe en Ludwig et al. (2006a; 2006b).

También se puede usar Matrigel™ para proporcionar un sustrato para cultivo celular y mantenimiento de células madre pluripotentes humanas. Matrigel™ es una mezcla de proteínas gelatinosa secretada por células tumorales de ratón y está comercialmente disponible de BD Biosciences (Nueva Jersey, EE UU). Esta mezcla se parece al medio extracelular complejo encontrado en muchos tejidos y lo usan biólogos celulares como un sustrato para cultivo celular.

D. Pase de células individuales

En algunas formas de realización de cultivo de células madre pluripotentes, una vez un recipiente de cultivo está lleno, la colonia se divide en células agregadas o incluso en células individuales por cualquier método adecuado para la disociación, células que después se colocan en nuevos recipientes de cultivo para pasar. El pase o separación de células es una técnica que permite que las células sobrevivan y crezcan en condiciones de cultivo durante periodos de tiempo extendidos. Las células típicamente se pasarían cuando están aproximadamente al 70 %-100 % confluentes.

Se puede usar disociación de células individuales de células madre pluripotentes seguida por pase de células individuales en los presentes métodos con varias ventajas, como facilitar la expansión celular, separación celular y siembra definida para diferenciación y permitir la automatización de procedimientos de cultivo y expansión clonal. Por ejemplo, las células progenie clonalmente derivadas de una célula individual pueden ser homogéneas en estructura genética y/o estar sincronizadas en el ciclo celular, lo que puede aumentar la diferenciación dirigida. Los métodos ejemplares para pase de células individuales pueden ser como se describe en la publicación de patente en EE UU No.

2008/0171385.

En ciertas formas de realización, las células madre pluripotentes se pueden disociar en células individuales únicas, o una combinación de células individuales únicas y pequeños grupos celulares que comprenden 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 células o más. La disociación se puede lograr por fuerza mecánica, o por un agente de disociación celular, tal como un agente quelante, citrato de sodio (citrato Na), o una enzima, por ejemplo, tripsina, tripsina-EDTA, Accutase, TrypLE Select, o similar. La disociación de células se puede lograr usando separación química (por ejemplo, usando un quelante o enzima) y/o agitación mecánica para disociar las células.

Basado en la fuente de células madre pluripotentes y la necesidad de expansión, las células disociadas se pueden transferir individualmente o en pequeños grupos a nuevos recipientes de cultivo en una proporción de separación de al menos o aproximadamente 1:2, 1:4, 1:5, 1:6, 1:8, 1:10, 1:20, 1:40, 1:50, 1:100, 1:150, 1:200, o cualquier intervalo derivable en las mismas. Las proporciones de separación de líneas celulares en suspensión se pueden hacer en volumen de suspensión de células en cultivo. El intervalo de pase puede ser al menos o aproximadamente cada 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 días o cualquier intervalo derivable en los mismos. Por ejemplo, las proporciones de separación alcanzables para los diferentes protocolos de pase enzimáticos pueden ser 1:2 cada 3-7 días, 1:3 cada 4-7 días, y de 1:5 a 1:10 aproximadamente cada 7 días, de 1:50 a 1:100 cada 7 días. Cuando se usan altas proporciones de separación, el intervalo de pase se puede extender a al menos 12-14 días o cualquier periodo de tiempo sin pérdida de células debido a excesiva diferenciación espontánea o muerte celular.

En ciertos aspectos, el pase de células individuales puede ser en presencia de una molécula pequeña eficaz para aumentar la eficacia de clonación y supervivencia celular, tal como un inhibidor de ROCK o inhibidor de miosina II como se ha descrito anteriormente. Tal inhibidor de ROCK o inhibidor de miosina II, por ejemplo, Y-37632, HA-1077, H-1152, o blebistatina, se puede usar a una concentración eficaz, por ejemplo, al menos o aproximadamente de 0,02, 0,05, 0,1,0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 45, 50 a aproximadamente 100 pM o cualquier intervalo derivable en los mismos.

E. Diferenciación de células madre

Se pueden proporcionar métodos para mejorar la eficacia de diferenciación neural (en particular eficacia de diferenciación DA del mesencéfalo) de células madre pluripotentes. La diferenciación de células madre pluripotentes se puede inducir en una variedad de maneras, tal como en colonias adheridas o por formación de agregados celulares, por ejemplo, en medio de baja adhesión, en donde esos agregados se denominan cuerpos embrioides (EB). Las señales y sucesos morfogénicos moleculares y celulares en los EB imitan muchos aspectos de la ontogenia natural de tales células en un embrión en desarrollo. Se proporcionan métodos para dirigir células a diferenciación neural, por ejemplo, en la publicación en EE UU No. 2012/0276063. Se proporcionan protocolos más detallados y específicos para la diferenciación a neuronas DA en la publicación PCT No. WO2013/067362.

Los cuerpos embrioides (EB) son agregados de células derivadas de células madre pluripotentes, tal como células ES o células iPS, y se han estudiado durante años con células madre embrionarias de ratón. Con el fin de recapitular algunas indicaciones inherentes a la diferenciación in vivo, se pueden generar agregados tridimensionales (es decir, cuerpos embrioides) como una etapa intermedia. Tras el inicio de la agregación celular, la diferenciación se puede iniciar y las células pueden empezar a un nivel limitado a recapitular el desarrollo embrionario. Aunque no pueden formar tejido trofectodérmico (que incluye la placenta), se pueden desarrollar células de virtualmente cualquier otro tipo presentes en el organismo. La presente invención puede fomentar además la diferenciación neural después de la formación de agregados.

La agregación celular se puede establecer por gota colgante, sembrar en placas tratadas o matraces giratorios no de cultivo celular; cualquier método previene que las células se adhieran a una superficie para formar el típico crecimiento en colonia. Se pueden usar inhibidores de ROCK o inhibidores de miosina II antes, durante o después de la formación de agregados para cultivar células madre pluripotentes.

Las células madre pluripotentes se pueden sembrar en medio de fomento de agregados usando cualquier método conocido en la técnica del cultivo celular. Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden sembrar como una colonia individual o grupo clonal en medio de fomento de agregados, y las células madre pluripotentes también se pueden sembrar como células esencialmente individuales. En algunas formas de realización, las células madre pluripotentes se disocian en células esencialmente individuales usando métodos mecánicos o enzimáticos conocidos en la técnica. A modo de ejemplo no limitante, las células madre pluripotentes se pueden exponer a una enzima proteolítica que rompe las conexiones entre las células y la superficie de cultivo y entre las células mismas. Las enzimas que se pueden usar para individualizar células madre pluripotentes para la formación de agregados y diferenciación pueden incluir, pero no están limitadas a, tripsina, en sus varias formulaciones comerciales, tal como TrypLE, o una mezcla de enzimas tal como Accutase®. En ciertas formas de realización, las células pluripotentes se pueden añadir o sembrar como células esencialmente individuales (o dispersadas) a un medio de cultivo para la formación de cultivo en una superficie de cultivo.

Por ejemplo, las células pluripotentes dispersadas se pueden sembrar en un medio de cultivo. En estas formas de realización, una superficie de cultivo puede estar compuesta de esencialmente cualquier material que sea compatible con métodos de cultivo celular asépticos estándar en la técnica, por ejemplo, una superficie no adherente. Una superficie de cultivo puede además comprender una componente de matriz como se describe en el presente documento. En algunas formas de realización, se puede aplicar un componente de matriz a una superficie de cultivo antes de poner en contacto la superficie con las células y el medio.

Los sustratos que se pueden usar para inducir diferenciación tal como colágeno, fibronectina, vitronectina, laminina, matrigel, y similar. La diferenciación también se puede inducir dejando las células en suspensión en presencia de un factor de crecimiento que induce proliferación, sin reiniciar proliferación (es decir, sin disociar las neuroesferas).

En algunas formas de realización, las células se cultivan en un sustrato fijo en un medio de cultivo. Se puede administrar después a las células un factor de crecimiento que induce proliferación. El factor de crecimiento que induce proliferación puede producir que las células se adhieran al sustrato (por ejemplo, plástico o vidrio tratado con poliornitina), se aplanen, y empiecen a diferenciarse a tipos celulares diferentes.

V. Cultivo no estático

En ciertos aspectos, se podría usar cultivo no estático para el cultivo y diferenciación de células madre pluripotentes. El cultivo no estático puede ser cualquier cultivo con células mantenidas a una velocidad de movimiento controlada, usando, por ejemplo, agitación, rotación, o plataformas de agitación o recipientes de cultivo, en particular biorreactores de rotación de gran volumen. En algunas formas de realización, se puede usar un tablero basculante. La agitación puede mejorar la circulación de nutrientes y productos de desecho celulares y también se puede usar para controlar la agregación celular proporcionando un entorno más uniforme. Por ejemplo, la velocidad de rotación se puede ajustar a al menos o como mucho aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 rpm, o cualquier intervalo derivable en los mismos. El periodo de incubación en el cultivo no estático para células madre pluripotentes, agregados celulares, células madre diferenciadas o células progenie derivadas de las mismas, puede ser al menos o aproximadamente 4 horas, 8 horas, 16 horas, o 1,2, 3, 4, 5, 6 días, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 semanas o cualquier intervalo derivable en los mismos.

VI. Alteración genética y purificación de células

En algunas formas de realización, las células pluripotentes (por ejemplo, células pluripotentes o neuronas DA) que se han manipulado genéticamente. Se dice que una célula está “genéticamente alterada” o es “transgénica” cuando un polinucleótido se ha transferido a la célula por cualquier medio adecuado de manipulación artificial, o donde la célula es una progenie de la célula originalmente alterada que ha heredado el polinucleótido. En algunas formas de realización, las células pueden comprender un gen de resistencia a antibiótico, por ejemplo, bajo el control de un promotor neural tal como, por ejemplo, el promotor de MAP2. Por ejemplo, en algunas formas de realización, el gen marcador es un gen de resistencia a antibiótico, y las células neuronales se pueden purificar exponiendo el cultivo celular a un antibiótico, destruyendo así las células que no se han diferenciado a células neuronales. Por ejemplo, las células que expresan un gen de neomicina bajo el control del promotor de MAP2 se pueden exponer a G418 para destruir las células no neuronales. Se describen métodos adicionales que se pueden usar con la presente invención en la solicitud de patente en EE UU No. 14/664.245.

En algunas formas de realización, una población de células que comprende neuronas dopaminérgicas se puede purificar exponiendo las células a un inhibidor mitótico o quimioterapéutico para destruir las células en división. Por ejemplo, en algunas formas de realización, una población de células que comprende células DA del mesencéfalo producidas por métodos de la presente invención se puede purificar poniendo en contacto las células con mitomicina C para destruir las células en división.

VII. Uso de neuronas dopaminérgicas

Las neuronas DA proporcionadas por los métodos y composiciones de ciertos aspectos de la invención se pueden usar en una variedad de aplicaciones. Estas incluyen, pero no están limitadas a trasplante o implantación de las neuronas DA in vivo; cribar compuestos citotóxicos, carcinógenos, mutágenos factores de crecimiento/regulación, compuestos farmacéuticos, etc., in vitro; elucidar el mecanismo de neurodegeneración; estudiar el mecanismo por el que fármacos y/o factores de crecimiento operan; terapia génica; y la producción de productos biológicamente activos, por nombrar solo unos pocos.

A. Cribado de compuestos de prueba

Las neuronas DA del mesencéfalo obtenidas por los métodos de esta invención se pueden usar para cribar factores (tal como solventes, fármacos de molécula pequeña, péptidos y polinucleótidos) o condiciones medioambientales (tal como condiciones de cultivo o manipulación) que afectan las características de neuronas DA proporcionadas en el presente documento.

En algunas aplicaciones, las células madre (diferenciadas o indiferenciadas) se usan para cribar factores que fomentan la maduración de células a lo largo del linaje neural, o fomentan la proliferación y mantenimiento de tales células en cultivo a largo plazo. Por ejemplo, factores de maduración neural o factores de crecimiento candidatos se ensayan añadiéndolos a células madre en diferentes pocillos, y después determinando cualquier cambio fenotípico que se produzca, según criterios deseables para cultivo adicional y uso de las células.

Las aplicaciones de cribado particulares de esta divulgación se refieren al ensayo de compuestos farmacéuticos en investigación de fármacos. Se proporcionan métodos estándar de ensayo, por ejemplo, en In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997). En ciertos aspectos de las formas de realización, las células producidas por los métodos detallados en el presente documento se pueden usar como células de prueba para cribado de fármacos estándar y ensayos de toxicidad (por ejemplo, para identificar, confirmar, y ensayar especificación de función o para ensayar administración de moléculas terapéuticas para tratar enfermedades específicas de linaje celular), como se han realizado previamente en neuronas primarias en cultivo a corto plazo. La evaluación de la actividad de compuestos farmacéuticos candidatos en general implica combinar las neuronas proporcionadas en ciertos aspectos de esta invención con el compuesto candidato, determinando cualquier cambio en la electrofisiología, morfología, fenotipo de marcadores, o actividad metabólica de las células que es atribuible al compuesto (comparado con células sin tratar o células tratadas con un compuesto inerte), y después correlacionar el efecto del compuesto con el cambio observado. El cribado se puede hacer o bien porque el compuesto está diseñado para tener un efecto farmacológico sobre células neuronas, o porque un compuesto diseñado para tener efectos en otro lugar puede tener efectos secundarios neurales no intencionados. Se pueden ensayar dos o más fármacos en combinación (combinando con las células simultánea o secuencialmente), para detectar posibles efectos de interacción fármaco-fármaco.

En algunas aplicaciones, los compuestos se criban inicialmente para potencial neurotoxicidad. La citotoxicidad se puede determinar en primer lugar por el efecto sobre la viabilidad celular, supervivencia, morfología, o liberación de enzimas al medio de cultivo. Se realiza un análisis más detallado para determinar si los compuestos afectan la función celular (tal como neurotransmisión) sin producir toxicidad.

B. Tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central

1. Enfermedad del sistema nervioso central

Se pueden trasplantar neuronas dopaminérgicas, tal como neuronas DA del mesencéfalo posmitóticas, para regenerar células neurales en un individuo que tiene una enfermedad en el sistema nervioso central (SNC). En algunas formas de realización, las neuronas DA del mesencéfalo producidas según métodos de la presente invención se pueden administrar a un sujeto para tratar una enfermedad del SNC (por ejemplo, administradas al cerebro o mesencéfalo, tal como el núcleo caudado, putamen o sustancia negra para tratar la enfermedad de Parkinson). Tales enfermedades pueden incluir, pero no están limitadas a, enfermedades neurodegenerativas, tal como parkinsonismo.

Como se usa en el presente documento, el término “parkinsonismo” se refiere a un grupo de enfermedades que están todas ligadas a una insuficiencia de dopamina en los ganglios basales que es una parte del cerebro que controla el movimiento. Los síntomas incluyen temblor, bradiquinesia (extrema lentitud de movimiento), postura flexionada, inestabilidad postural, y rigidez. Un diagnóstico de parkinsonismo requiere la presencia de al menos dos de estos síntomas, uno de los cuales debe ser temblor o bradiquinesia. La forma más común de parkinsonismo es enfermedad de Parkinson (EP) idiopática, o clásica, pero para una minoría significativa de diagnósticos, aproximadamente el 15 por ciento del total, uno de los síndromes de Parkinson plus (PPS) puede estar presente. Estos síndromes, también conocidos como parkinsonismo atípico, incluyen degeneración corticobasal, demencia con cuerpos de Lewy, atrofia multisistémica, y parálisis supranuclear progresiva. En general, la enfermedad de Parkinson implica el malfuncionamiento y muerte de células nerviosas vitales en el cerebro principalmente en un área del cerebro llamada la sustancia negra. Muchas de estas células nerviosas vitales producen dopamina. Cuando estas neuronas mueren, la cantidad de dopamina disminuye, dejando a una persona incapaz de controlar el movimiento normalmente. Los intestinos también tienen células de dopamina que degeneran en pacientes con enfermedad de Parkinson, y esto puede ser un factor causante importante en los síntomas gastrointestinales que son parte de la enfermedad. Los síntomas particulares que un individuo experimenta pueden variar de persona a persona. Los signos motores primarios de la enfermedad de Parkinson incluyen los siguientes; temblor de las manos, brazos, piernas, mandíbula y cara, bradiquinesia o lentitud de movimiento, rigidez o agarrotamiento de las extremidades y el tronco e inestabilidad postural o equilibrio y coordinación alterados.

2. Métodos para adm inistrar células

Se pueden administrar células madre o células diferenciadas a un sujeto por vía local o sistémica. Los métodos para administrar neuronas DA a un sujeto se conocen en la técnica. Si el paciente recibe células derivadas de sus propias células, esto se llama un trasplante autólogo; tal trasplante tiene poca probabilidad de rechazo.

Los métodos ejemplares de administrar células madre o células neuronales diferenciadas a un sujeto, en particular un sujeto humano, incluyen inyección o trasplante de las células en sitios diana (por ejemplo, cuerpo estriado y/o sustancia negra) en el sujeto. Las células madre y/o neuronas DA se pueden insertar en un dispositivo de administración que facilita la introducción, por inyección o trasplante, de las células al sujeto. Tales dispositivos de administración incluyen tubos, por ejemplo, catéteres, para inyectar células y fluidos en el cuerpo de un sujeto receptor. En una forma de realización preferida, los tubos además tienen una aguja, por ejemplo, una jeringa, mediante la cual las células preparadas por los métodos de la invención se pueden introducir en el sujeto en una localización deseada. Las células madre se pueden insertar en tal dispositivo de administración, por ejemplo, una jeringa, en diferentes formas. Por ejemplo, las células se pueden suspender en una solución, estar en agregados celulares, o alternativamente embebidas en una matriz soporte cuando están contenidas en tal dispositivo de administración.

Las matrices soporte en las que las células madre o neuronas se pueden incorporar o embeber incluyen matrices que son compatibles con el receptor y que se degradan a productos que no son dañinos para el receptor. Las matrices soporte pueden ser naturales (por ejemplo, ácido hialurónico, colágeno, etc.) y/o matrices biodegradables sintéticas. Las matrices biodegradables sintéticas que se pueden usar incluyen polímeros sintéticos tal como polianhídridos, poliortoésteres, y ácido poliláctico. En algunas formas de realización, las neuronas dopaminérgicas (por ejemplo, neuronas dopaminérgicas que no están completamente diferenciadas) están embebidas en una matriz de ácido hialurónico y se administran a un sujeto para tratar una enfermedad neurodegenerativa (por ejemplo, enfermedad de Parkinson).

Como se usa en el presente documento, el término “solución” incluye un soporte o diluyente farmacéuticamente aceptable en el que las células preparadas por los métodos de la invención permanecen viables. Los soportes y diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen, solución salina, soluciones tampones acuosas, solventes y/o medios de dispersión. El uso de tales soportes y diluyentes se conoce en la técnica. La solución es preferiblemente estéril y fluida al nivel que existe fácil jeringabilidad.

Preferiblemente, la solución es estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se conserva frente a la acción contaminante de microorganismos tal como bacterias y hongos. En algunas formas de realización una solución que contiene neuronas DA o neuronas DA del mesencéfalo se administra a un paciente en solución estéril de BSS PLUS (Alcon, Fort Worth, TX). Si se desea, se puede incluir un conservante o antibiótico en la composición farmacéutica para administración. Las soluciones de la divulgación se pueden preparar incorporando neuronas como se ha descrito en el presente documento en un soporte o diluyente farmacéuticamente aceptable y, otros ingredientes, si se desea.

3. Dosis y administración

En un aspecto, los métodos descritos en el presente documento proporcionan un método para aumentar el injerto de células progenitoras o neuronas DA en un sujeto. En una forma de realización, el sujeto puede ser un mamífero. En otra forma de realización, el mamífero puede ser un ser humano, aunque la divulgación es eficaz con respecto a todos los mamíferos.

Las composiciones se administran de una manera compatible con la formulación de dosis, y en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad que se va a administrar y el ritmo dependen del sujeto que se va a tratar, la capacidad del sistema del sujeto de utilizar el principio activo, y el grado de efecto terapéutico deseado. Las cantidades precisas de cada principio activo requeridas para ser administradas dependen del juicio del médico y son particulares para cada individuo. Sin embargo, los intervalos de dosis adecuados dependen de la vía de administración. Las pautas adecuadas para la administración también son variables.

4. Eficacia

El experto en la materia puede determinar la eficacia de un tratamiento determinado para aumentar el injerto de neuronas DA. Sin embargo, un tratamiento se considera “tratamiento eficaz”, como se usa el término en el presente documento, si uno o todos los signos o síntomas de, por ejemplo, mal injerto de neuronas DA están alterados de una manera beneficiosa, otros síntomas clínicamente aceptados se mejoran, o incluso alivian, por ejemplo, en al menos el 10 % después del tratamiento con una población celular como se describe en el presente documento. La eficacia también se puede medir por la incapacidad de un individuo para empeorar evaluado por hospitalización, necesidad de intervenciones médicas (es decir, la evolución de la enfermedad se detiene), o incidencia del fallo del injerto. Los métodos de medir estos indicadores los conocen los expertos en la materia y/o se describen en el presente documento. El tratamiento incluye cualquier tratamiento de una enfermedad en un individuo o un animal (algunos ejemplos no limitantes incluyen un ser humano o un mamífero) e incluye: (1) inhibir la enfermedad, por ejemplo, prevenir el fallo del injerto; o (2) aliviar la enfermedad, por ejemplo, producir regresión de los síntomas. Una cantidad eficaz para el tratamiento de una enfermedad significa una cantidad que, cuando se administra a un mamífero en necesidad de ello, es suficiente para producir un beneficio de tratamiento o terapéutico para esa enfermedad. La eficacia de un agente se puede determinar evaluando indicadores físicos de, por ejemplo, injerto de neuronas DA, tal como, por ejemplo, temblor, bradiquinesia, postura flexionada, equilibrio y coordinación, etc. En algunas formas de realización, el injerto o la función neural se puede medir in vivo (por ejemplo, en seres humanos) usando un escáner PET para medir el metabolismo o actividad o sistemas dopaminérgicos (por ejemplo, usando seguidores PET para imagenología del sistema dopaminérgico). La eficacia se puede evaluar en modelos animales de la enfermedad de Parkinson, por ejemplo, realizando ensayos de comportamiento, tal como ensayos de escalón o ensayos de cilindros.

C. D istribución para fines comerciales, terapéuticos y de investigación

Para fines de fabricación, distribución y uso, las células neurales, tal como neuronas DA del mesencéfalo como se describe en el presente documento se pueden suministrar en forma de un cultivo o suspensión celular en un excipiente isotónico o medio de cultivo, opcionalmente congelado para facilitar el transporte o almacenamiento.

Las células neurales descritas en el presente documento se pueden proporcionar en diferentes sistemas de reactivos, por ejemplo, que comprende un conjunto o combinación de células que existe en cualquier momento durante la fabricación, distribución o uso. Los conjuntos de células pueden comprender cualquier combinación de dos o más poblaciones celulares descritas en esta divulgación, ejemplificadas, pero no limitadas a células derivadas de programación (células de linaje neural, sus precursores y subtipos), en combinación con células madre indiferenciadas u otros tipos de células diferenciadas. Las poblaciones celulares en el conjunto pueden compartir el mismo genoma o una forma genéticamente modificada del mismo. Cada tipo celular en el conjunto se puede embalar juntos, o en envases separados en la misma instalación, o en diferentes localizaciones, al mismo o a diferentes tiempos, bajo el control de la misma entidad o diferentes entidades que comparten una relación comercial.

VIII. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar formas de realización preferidas de la invención. Los expertos en la materia deben apreciar que las técnicas divulgadas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por el inventor que funcionan bien en la práctica de la invención, y por tanto se pueden considerar que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la materia deben, a la luz de la presente divulgación, apreciar que se pueden hacer muchos cambios en las formas de realización específicas que se divulgan y todavía obtener un resultado parecido o similar.

Ejemplo 1

Materiales y métodos

La diferenciación neuronal de mesencéfalo de líneas celulares de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPS) expandidas en VTN-TN en medio Essential 8 se realizó con inducción por molécula pequeña y factor de crecimiento usando una variedad de composiciones de medio de diferenciación y calendarios como se detalla en las tablas 1-5. En general, las células iPS se cultivaron en medio de inducción de neuronas DA D1 el día 1, medio de inducción de neuronas DA D2 el día 2, y medio de inducción de neuronas DA D3-4 el día 3 y 4. El día 5, las células se disociaron con TrypLE durante 15 minutos y se recogieron en medio de extinción DA antes de transferir las células a un cultivo en suspensión en botella de rotación para formar agregados en medio de formación de agregados de neuronas DA D5.

El día 6, los agregados se asentaron, aproximadamente el 66 % del medio se eliminó, y los agregados se alimentaron medio de inducción de neuronas DA. Los días 7-16, los agregados se alimentaron a diario con medio de mantenimiento de agregados de neuronas DA, y el medio se cambió del día 11 al 16. El día 17, los agregados se disociaron a una suspensión de células individuales con TrypLE y se sembraron en Matrigel en medio de siembra de agregados de neuronas DA D17. Los días 18, 20, 22 el medio se cambió con medio de maduración DopaNeuron. El día 24, las células se disociaron usando Accutase y se sembraron en medio de siembra de maduración de neuronas DA. Al día siguiente, el medio se cambió con medio de maduración DopaNeuron.

Los días 27 y 29, el medio se sustituyó con medio de maduración de neuronas DA más mitomicina C. El día 31, las células se disociaron con Accutase y se volvieron a sembrar en botellas recubiertas de poli-L-ornitina (PLO)/laminina en medio de siembra de maduración de neuronas DA. A continuación, los días 32, 34, y 36, las células se alimentaron con medio de maduración DopaNeuron. Los días 37 o 38, las células se disociaron otra vez con Accutase y se sometieron a análisis o se crioconservaron para uso posterior.

Tabla 1: Condiciones de medio de tiempo regular (SB43 10 pM LDN 200 nM)

Tabla 2: Condiciones de medio de tiempo regular (Dorsomorfina 2 pM)

Tabla 3: Condiciones de medio de tiempo regular (LDN 200 nM)

Tabla 4: Condiciones de medio de tiempo alternativo (LDN 200 nM)

Tabla 5 : Condiciones de medio de tiempo alternativo (Dorsomorfina 2 j M)

Tabla 6: Condición 9 (LDN 200 nM)

Ejemplo 2

Patrón eficaz de progenitores mDA usando mono-SMADi

En general se requiere el patrón eficaz de progenitores mDA, medido por el porcentaje de células que coexpresan FoxA2 y Lmx1 el día 17 de proceso, para obtener una población muy enriquecida de neuronas mDA al final del proceso de fabricación. Si la mayoría de las células el día 17 no son progenitores mDA, las neuronas obtenidas tendrán una gran población de neuronas de fenotipo no de mesencéfalo, o tendrán un crecimiento de células proliferativas que típicamente lleva a la separación de las neuronas o dificultades o una incapacidad para purificar las neuronas posmitóticas.

El proceso iCell DopaNeurons se optimizó con la mayoría de los factores de patrón de progenitores añadido empezando el día 1. Esto incluye factores para la neutralización (dual-SMADi), señalización de Sonic hedgehog (Shh, PMN) y señalización de Wnt (CHIR). Sin embargo, los inventores encontraron que este enfoque no funcionaba bien para casi todas las líneas de iPSC ensayadas en el contexto de neutralización usando inhibición mono-SMAD. Se llevaron a cabo un gran número de experimentos de optimización a través de varias líneas de iPSC para definir las condiciones para patrón eficaz de progenitores mDA con mono-SMADi, variando el tiempo y la dosis de todos los factores de patrón. Como se muestra en la figura 1, se encontraron condiciones (“MONO/ALT”) donde el patrón de progenitores mDA con mono-SMADi era tan bueno como el patrón de dual-SMADi usando condiciones estándar previamente optimizadas (“DUAL/STD”), y el patrón era marcadamente más eficaz que el patrón de progenitores mDA de mono-SMADi usando las condiciones estándar (“MONO/STD”). En el método alternativo (ALT), la adición de SHH/purmorfamina se movió del día 1 al día 2. Los cambios utilizados en esta mejora incluían: (i) escalonar la adición del agonista de Wnt (CHIR) al día 2 o día 3, (ii) reoptimizar la concentración de CHIR, ya que esta depende del momento que se añade por primera vez, y (iii) mover la ventana donde se añade PD03, ya que la ventana óptima depende de cuando se añade CHIR. El resultado final era un conjunto estrecho de condiciones que producían formación de progenitores mDA muy eficaz en múltiples líneas de células iPS. Aproximadamente la mitad de las líneas de iPSC ensayadas fueron capaces de generar progenitores mDA usando condiciones de mono-SMADi. La figura 2 muestra un ejemplo de un experimento de optimización de matriz usado para definir las condiciones de patrón optimizadas.

Como se muestra en la figura 1, el patrón de progenitores mDA de tres líneas de iPSC diferentes se evaluó el día 17 de proceso midiendo la proporción de células totales que expresan FoxA2 (por citometría de flujo), o coexpresan FoxA2 y Lmx1 (por ICC). La coexpresión de FoxA2/Lmx1 es el marcador más preciso para células progenitoras mDA. El uso de condiciones de patrón alternativas permite un patrón eficaz de progenitores mDA en el contexto de inhibición mono-SMAD (“Mono/alternativa”), mientras que las condiciones de patrón estándar tienen mal patrón de progenitores mDA en el contexto de inhibición mono-SMAD (“Mono/estándar”). Las diferenciaciones control usando dual-SMADi y condiciones de patrón estándar (“dual/estándar”) se muestran por comparación.

Los datos de la figura 1 representan datos obtenidos de usar las condiciones descritas en la tabla 1 para todas las condiciones dual estándar. Los datos de la línea celular C se obtuvieron usando condiciones descritas en la tabla 4 para condiciones mono alternativas y la tabla 3 para mono estándar. Las líneas celulares D y K siguieron la tabla 2 y la tabla 5 para mono estándar y mono alternativas, lo que significa que los datos de la línea celular C se obtuvieron de ensayar LDN mientras las otras líneas se ensayaron con dorsomorfina.

Una vez se identificó una condición de patrón alternativa que permitía la diferenciación con éxito usando inhibición mono-SMAD (Condición 1, es decir, Tabla 4: alternativa, l Dn a 200 nM), el método se refinó usando una matriz de condiciones, incluyendo la concentración de CHIR, y las ventanas de tratamiento para señalización de Shh, señalización de Wnt, e inhibición de MEK. Como se muestra en la figura 2, se ensayaron las siguientes condiciones para inhibición mono-SMAD, como se muestra en la tabla 6 posteriormente. La tabla 6 muestra el día de inicio para la incubación con un compuesto particular (por ejemplo, “D2” indica inicio de la incubación el día 2) y la concentración de CHIR99021 usada. En la figura 2 se muestra un ejemplo de un experimento de matriz para la línea K de iPSC. Las condiciones 3, 5, 7, y 9 produjeron el mayor porcentaje de células progenitoras mDA FoxA2+/Lmx1+ el día 17, manteniéndose la población de FoxA2+ hasta el día 24. La expresión de tirosina hidroxilasa (TH) es baja en neuronas mDA inmaduras. Estos experimentos se repitieron usando una concentración de CHIR99021 de 1,65 pM en lugar de 1,75 pM, y se observó que se pudieron obtener resultados similares para la generación de células progenitoras mDA usando la menor concentración de 1,65 pM de CHIR99021.

Estos experimentos de mono-SMAD se repitieron, con la modificación que se incluyó benzonase® (endonucleasa, EMD Millipore) en la incubación el día 5 a una concentración de 100 U/ml. Se observó que la inclusión de benzonase® en la incubación el día 5 reducía o prevenía la formación excesiva de grumos en la formación de agregados.

Tabla 6. Condiciones para inhibición mono-SMAD

“Shh” se refiere a C25II Shh; “PMN” se refiere a purmorfamina; “PD03” se refiere a PD0325901; “CHIR” se refiere a CHIR99021; “Conc.” es concentración; “D1”, “D2”, y “D3” se refiere a los días 1, 2 y 3, respectivamente.

Ejemplo 3

Determinación de inhibidores para inhibición mono-SMAD

Se ensayaron diferentes inhibidores para función en métodos de mono-SMADi, como sigue. El proceso iCell DopaNeurons induce la neutralización usando LDN-193189, un inhibidor de la señalización de BMP (inhibe ALK 1/2/3/6, bloquea SMAD 1/5/8), y SB-431542, un inhibidor de la señalización de TGF-b (inhibe ALK 4/5/7, bloquea SMAD 2/3). Juntos, esto se denomina “inhibición dual de SMAD”, o “dual SMADi”. Para definir las condiciones óptimas para la neutralización usando solo un único inhibidor de SMAD en el proceso mDA, se cribaron varios análogos de LDN-193189 y SB-431542 a través de múltiples líneas de células iPS usando las condiciones de patrón alternativas descritas anteriormente. Como se muestra en la figura 3, se observó que LDN-193189 era el inhibidor que era mejor globalmente en inducir el mayor porcentaje de progenitores mDA cuando se ensayó a través de diferentes líneas de iPSC. Para los datos mostrados con un inhibidor de SMAD, LDN-193189, dorsomorfina, y DHM-1, se añadieron al medio durante los días 1 a 17, mientras que SB431542 se añadió a 20 pM al medio los días 1 a 4.

El patrón de progenitores mDA se evaluó el día de proceso 17 midiendo la proporción de células totales que expresan FoxA2 (por citometría de flujo) o coexpresan FoxA2 y Lmx1 (por ICC), y los resultados se muestran en la figura 3. Se observó que la coexpresión de FoxA2/Lmx1 era el marcador más preciso para células progenitoras mDA. Se observó que LDN-193189 era el más eficaz en neutralizar progenitores mDA a través de múltiples líneas de iPSC. Todos los ensayos de mono-SMADi mostrados usaron condiciones de patrón alternativas; las condiciones de dual-SMADi usando el patrón estándar se muestran como controles. También se ensayaron los análogos de SB-431542 LY364947 y A-83-01, que no superaron a LDN.

Ejemplo 4

Purificación y caracterización de neuronas dopaminérgicas generadas por mono-SMADi

Purificación en proceso de neuronas mDA: Incluso con patrón de progenitores mDA eficaz, hay una población de células que sigue proliferando incluso después de que las neuronas mDA en maduración dejen el ciclo celular (aproximadamente el día 25). Para eliminar estas células indeseadas, se añadió el entrecruzador de ADN mitomicina C (MMC) a baja dosis (de 50 a 500 ng/ml) durante cuatro días (días 27-31) inmediatamente después de que las neuronas mDA hubieran dejado el ciclo celular. Se usó MMC obtenida de Sigma o Tocris en los experimentos. La dosis y duración usadas tiene pocos o ningún efecto secundario en las neuronas mDA posmitóticas, pero destruye células en división. Este enfoque se optimizó ensayando varios compuestos tóxicos para células en división, y variando la dosis, duración y fecha de inicio del tratamiento con MMC. También se debe advertir que dosis de m Mc mucho mayores dadas durante tiempos mucho más cortos pueden alcanzar el mismo efecto (destruir células en división), por ejemplo 5 ug/ml durante 1 h. También se podrían usar dosis intermedias dadas durante tiempos intermedios para alcanzar un efecto similar. Sin embargo, el uso de una concentración menor de aproximadamente 100 ng/ml se usó durante cuatro días y se observó que producía la eliminación de células en división sin toxicidad observada para neuronas posmitóticas.

Como se muestra en la figura 4A, sin purificación, una población significativa de células en proliferación (nestina+) ha crecido el día 37, produciendo una pureza de neuronas posmitóticas (MAP2+/nestina-) del 44 % (“Sin selección”). El producto iCell DopaNeurons utiliza una construcción genética con el gen neoR dirigido por el promotor de MAP2 para permitir la selección eficaz de neuronas posmitóticas (“Selección con fármaco G418”), pero este enfoque típicamente puede no ser apropiado para uso clínico. Sin embargo, el uso del fármaco quimioterapéutico MMC se usó para purificar neuronas posmitóticas, produciendo sistemáticamente una pureza de neuronas final de >90 % (“Selección con fármaco quimio”). Como se muestra en la figura 4B, la funcionalidad de las neuronas mDA se retuvo después de la selección con MMC, como se ilustra por la capacidad para secretar dopamina, y otros ensayos no revelaron ninguna diferencia de células genéticamente seleccionadas, las extensamente caracterizadas iCell DopaNeurons. De forma importante, no hay crecimiento de células en proliferación después de la selección con MMC, incluso después de cultivo extendido tras la descongelación (Fig. 4C).

Pureza final y crioconservación de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo (mDA): Múltiples líneas de iPSC se diferenciaron hasta alcanzar la terminación del proceso, usando los métodos descritos: inhibición mono-SMAD, patrón de progenitores mDA alternativo, y purificación con MMC. Los resultados se muestran en la figura 5. Se muestran tres líneas de iPSC (C, K y H) como ejemplos de diferenciaciones con éxito llevadas hasta la terminación del proceso (día 37) (Fig. 5). Las líneas de iPSC C, K y H son líneas de iPSC (21526.101, 21534.101 y 21531.101, respectivamente). Los datos se obtuvieron usando el enfoque en la tabla 4 para LDN alternativo y la tabla 1 para control dual estándar. Estos experimentos utilizaron LDN-193189 para mono-SMADi y una de las variaciones de patrón alternativas mostradas en la figura 2. La diferenciación de la línea H usando dual-SMADi y el patrón estándar optimizado se muestra por comparación. En cada caso, se observó un alto nivel de pureza neuronal (>90 % MAP2+/nestina-), y esencialmente todas las neuronas coexpresaban FoxA2. Los inventores han observado que la gran mayoría de células MAP2+/FoxA2+ en esta fase también expresan Lmx1, y son por tanto neuronas mDA. El fenotipo de la neurona DA se confirmó por la expresión de tirosina hidroxilasa (TH) en la mayoría de las neuronas, un marcador de neuronas DA más maduras.

Como se muestra en la figura 6, las neuronas mDA hechas a partir de la línea K se crioconservaron y descongelaron para caracterización post-descogelación. Los datos mostrados en la figura 6 se obtuvieron usando el enfoque mostrado en la tabla 6. Se observó que la viabilidad celular era alta al descongelar, y la mayoría de las células viables se pudieron sembrar sobre una superficie de PLO-laminina (eficacia de siembra, Fig. 6). Además, las células tras la descongelación retienen el fenotipo de neurona mDA de MAP2+/FoxA2+/TH+, medido 3 días tras la descongelación. Las células mostraron crecimiento de neuritas sanas, y se observó que las células en proliferación estaban ausentes. Estas características fenotípicas coinciden estrechamente con lo que se vio con iCell DopaNeurons tras la descongelación.

Ejemplo 5

Ensayo de línea iPSC cruzada de proceso de diferenciación de mono-SMADi

Tres líneas de iPSC derivadas de donantes sanos (ID de los donantes 11378 y 11379) y nueve líneas de iPSC derivadas de pacientes con enfermedad de Parkinson (ID de los donantes 11249, 11250 y 11251) se diferenciación usando el proceso mono-SMADi optimizado (“Condición 9” de la figura 2). Todas las líneas de iPSC se convirtieron eficazmente a células progenitoras DA el día de proceso 17, con coexpresión de FoxA2/Lmx1 de >80 % en 11 de las 12 líneas (Fig. 7A). A la terminación del proceso (día 37), las células de todas las líneas de iPSC habían alcanzado un alto nivel de pureza neuronal (>90 % MAP2+/nestina-), especificación de mesencéfalo (>80 % FoxA2+), y maduración de neuronas de dopamina del mesencéfalo (>40 % TH+) (Fig. 7B). Estos resultados demuestran la solidez del protocolo de diferenciación de SMADi único optimizado a través de líneas de iPSC, incluyendo las derivadas de pacientes con enfermedad de Parkinson.

Ejemplo 6

Ensayo de citometría de flujo para coexpresión de FoxA2/Lmx1

La coexpresión de FoxA2/Lmx1 es una lectura crítica para el patrón de progenitores de neuronas de dopamina con éxito, y por tanto se desarrolló un ensayo de citometría de flujo intracelular que es menos subjetivo y variable que los resultados derivados usando carrera de software de recuento de células en imágenes de inmunocitoquímica. El ensayo puede cuantificar de forma precisa el porcentaje de células que coexpresan FoxA2 y Lmx1 el día de proceso 17 hasta el día 24, con resultados que se correlacionan con cuentas de imágenes de ICC analizadas. El patrón de progenitores se considera exitoso cuando las células son >80 % FoxA2+/Lmx1+ el día 17 (Fig. 8, arriba). Se muestra un ejemplo de un patrón de progenitores subestándar (Fig. 8, abajo), con el 60 % de células FoxA2+/Lmx1+ y una población significativa de células FoxA2+/Lmx1-negativo.

Ejemplo 7

Liberación de dopamina de neuronas iPSC-mDA

La línea de iPSC “K” se diferenció hasta la terminación del proceso (día 37) usando el protocolo mono-SMADi optimizado (“Condición 9”) y crioconservó. Las células se descongelaron y sembraron a alta densidad (8,8 x 105/cm2). Las células se alimentaron con medio de maduración sin DAPT cada tres días durante un total de 14 días. El día del ensayo, las células se lavaron e incubaron 30 min con HBSS (con o sin KCl 56 mM). La concentración de dopamina en la solución de liberación se determinó usando un kit de ELISA de dopamina competitivo (Eagle Biosciences). No se detectó liberación de dopamina de neuronas del prosencéfalo derivadas de iPSC (iCell Neurons). Por el contrario, las células iPSC-mDA derivadas usando el proceso mono-SMADi optimizado (DA Therapy Neurons) secretaron al menos tanta dopamina como las células derivadas usando el proceso dual-SMADi optimizado (iCell DopaNeurons). Por tanto, las células son capaces de llevar a cabo un atributo funcional clave de neuronas de dopamina maduras. Los resultados se muestran en la figura 9.

Ejemplo 8

Actividad eléctrica de neuronas iPSC-mDA

Se descongelaron neuronas iPSC-mDA crioconservadas y se sembraron en placas de haz de multielectrodo (MEA) de 48 pocillos recubiertas de PEI. Las células se cultivaron según el protocolo de la solicitud internacional de Cellular Dynamics “Medida de la actividad neuronal sincrónica en el haz de multielectrodo Maestro” en la solicitud en EE UU 14/830.162. Las neuronas hechas con el protocolo de mono-SMADi optimizado “Condición 9” (DA Therapy) demostraron actividad eléctrica similar comparada con células hechas con el protocolo dual-SAMDi optimizado (iCell Dopa G100), incluyendo tasa de descarga media (mFR), estallido (macro BPM) y conectividad (Fig. 10, gráficos superiores). La tasa de descarga media (mFR), frecuencia, e intensidad de estallido de conectividad aumentaron con el tiempo, alcanzando una meseta aproximadamente el día 16 tras la descongelación. Los gráficos de ráster temporales mostraron intervalos entre espículas limpios, altas intensidades de estallido, y estallidos a través de todos los electrodos en un pocillo, lo que demuestra un alto grado de actividad eléctrica. Los resultados se muestran en la figura 10.

Ejemplo 9

Perfil de expresión génica cuantitativo de neuronas iPSC-mDA

Se extrajo ARN de cuatro lotes de células iPSC-mDA derivadas usando el proceso mono-SMADi optimizado (lote 1 4) y un lote de células iPSC-mDA derivadas usando el protocolo dual-SMADi optimizado (iCell DopaNeurons) el día de proceso 37. Después del aislamiento del ARN, se realizó reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa en tiempo real usando ensayos de expresión génica TaqMan (Applied Biosystems), con resultados expresados como expresión relativa respecto a control de GAPDH. Valores <10'4 se consideran fondo (caja sombreada). La expresión de marcadores neuronales del mesencéfalo y mDA fueron similares entre lotes y entre células hechas usando los diferentes protocolos. Los marcadores para regiones diferentes del mesencéfalo o tipos celulares no mDA fueron bajos, y también similares entre células derivadas de mono-SMADi y dual-SMADi. Los resultados se muestran en la figura 11.

Ejemplo 10

Conversión a reactivos compatibles con cGMP

Para convertir el protocolo de diferenciación de iPSC-mDA mono-SMADi a un proceso compatible con cGMP para terapia celular, era preferido o necesario sustituir múltiples reactivos que contenían componentes derivados de animales, contenían niveles inaceptables de endotoxina, o eran de otra manera incompatibles con la fabricación de células cGMP para agentes terapéuticos. Las células iPSC-mDA se diferenciaron usando el proceso mono-SMADi optimizado (“Condición 9”), y además se usaron los siguientes reactivos compatibles con cGMP no xenogénicos: vitronectina humana recombinante, laminina, Sonic hedgehog, FGF-8, GDNf , BDNF y TGF-b3; dbcAMP sin endotoxina. B27 y B27 (-Vit A) son los únicos reactivos usados en el proceso que contienen componentes animales. Las células iPSC de la línea K diferenciadas usando el proceso “Condición 9”, con reactivos estándar o reactivos compatibles con cGMP, tenían patrón de progenitores (día 17) y pureza de neuronas mDA el día 37 equivalentes. Los resultados se muestran en la figura 12.

Ejemplo 11

Injerto de neuronas iPSC-DA en primates no humanos

La línea de iPSC “K” se diferenció hasta la terminación del proceso (día 37) usando el protocolo optimizado (“Condición 9”) y se crioconservó. Las células se descongelaron y se trasplantaron bilateralmente al núcleo caudado y putamen (1,5 x 106 células/inyección) de monos verdes africanos (n = 3) tratados con MPTP e inmunosuprimidos. Después de 3 meses, se evaluó el injerto e inervación de las neuronas por histología de secciones frontales. La tinción del citoplasma humano (STEM12) revela buen injerto de células humanas e inervación en todos los animales. Se observaron neuronas de dopamina (TH+) en los injertos, lo que demuestra la capacidad de estas células para sobrevivir a largo plazo e inervar la estructura diana de las neuronas mDA en el cerebro. No se observaron tumores, crecimiento neural u otros efectos adversos en estos animales. Los resultados se muestran en la figura 13.

Ejemplo 12

Injerto de progenitores y neuronas iPSC-DA en un sistema modelo de la enfermedad de Parkinson en rata

La línea de iPSC “K” se diferenció usando el protocolo mono-SMADi optimizado (“Condición 9”) y se crioconservó en diferentes fases del proceso de diferenciación (día 17, día 24, y día 37). Además, células iPSC-mDA derivadas usando el protocolo dual-SMADi optimizado (iCell Dopa) se crioconservaron en el día de proceso 37. Las células se descongelaron y trasplantaron bilateralmente al núcleo estriado (4,5 x 105 células/inyección) de ratas desnudas tratadas con 6-OHDA, pero asintomáticas (RNU) (n = 3 por grupo). Después de 3 meses, se evaluó el injerto e inervación de las células por histología de secciones frontales. Aunque se observó injerto de neuronas e inervación en los cuatro grupos (cepa Human NCAM), las células progenitoras iPSC-DA (día 17) y las neuronas mDA inmaduras (día 24) tuvieron injertos mucho mayores y mayor inervación en comparación con las neuronas mDA derivadas de mono-SMADi y dual-SMADi más maduras (día 37 y día 37 iCell Dopa, respectivamente). Además, se observaron números mucho mayores de neuronas DA (TH+) en los injertos de progenitores y neuronas DA inmaduras. La tinción con Ki67 reveló casi ninguna célula proliferativa en los injertos de las células del día 37, y pocas células Ki67+ en los injertos de las células del día 17 y el día 24. No se observaron tumores, crecimiento neural, u otros efectos adversos en ninguno de estos animales. Estos resultados sugieren que las células extraídas anteriormente en el proceso de diferenciación mono-SMADi optimizado (día 17-24) son más capaces de injertarse e inervar en comparación con células más maduras. Los resultados se muestran en la figura 14.

Ejemplo 13

Diferenciación mejorada usando LDN-1931892 pM

La línea de iPSC “K” se diferenció usando los protocolos mono-SMADi optimizados “Condición 7” o “Condición 9” (como se ha descrito anteriormente), usando o bien la concentración estándar de LDN-193189 (200 nM) o una concentración diez veces mayor (LDN 2 pM). En múltiples experimentos (n = 5), se vieron mejoras en la calidad de las diferenciaciones cuando se usa LDN 2 pM. Por ejemplo, las mejoras de LDN 2 pM al protocolo de la “Condición 7” incluyen mayores niveles de expresión de FoxA2 y Lmx1 en progenitores el día 17 (arriba), y un mayor porcentaje de neuronas derivadas de la placa de apoyo (FoxA2+) el día de proceso 37 (abajo). Esto sugiere que LDN 2 pM mejora la solidez del proceso de diferenciación, tal vez debido a la capacidad de LDN de inhibir la señalización del receptor de TGF-p de tipo 1 (ALK4/5/7) a altas concentraciones (CI⁵⁰> 500 nM, Yu et al. 2008). Los resultados se muestran en la figura 15.

Todos los métodos divulgados y reivindicados en el presente documento se pueden hacer y ejecutar sin experimentación indebida a la luz de la presente divulgación. Mientras las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en términos de formas de realización preferidas, será aparente para los expertos en la materia que se pueden aplicar variaciones a los métodos y en las etapas o en la secuencia de las etapas del método descrito en el presente documento. Más específicamente, será aparente que ciertos agentes que están tanto química como fisiológicamente relacionados se pueden sustituir por los agentes descritos en el presente documento al tiempo que se lograrían resultados iguales o similares.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro para preparar una composición celular que comprende células humanas que expresan tanto la proteína forkhead box A2 (FOXA2) como el factor de transcripción de homeobox LIM 1 (LMX1) (células FOXA2+/LMX1+) que comprende cultivar células pluripotentes humanas en presencia de los siguientes moduladores de señalización:

(a) un único inhibidor de la señalización de Small Mothers Against Decapentaplegic (SMAD), en donde el inhibidor de la señalización de SMAD es un inhibidor de BMP o un inhibidor de TGFp,

(b) al menos un activador de la señalización de Sonic hedgehog (SHH), y

(c) al menos un activador de la señalización de wingless (Wnt);

y cultivar dichas células en presencia de dichos moduladores durante un periodo de tiempo suficiente para proporcionar una composición celular que comprende dichas células FOXA2+/LMX1+.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el activador de la señalización de Wnt es un inhibidor de GSK3.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el inhibidor de BMP es LDN-193189, dorsomorfina, DMH-1, o nogina, preferiblemente en donde el inhibidor de BMP es LDN-193189; o en donde el inhibidor de TGFp es SB431542.

4. El método de la reivindicación 3, en donde el LDN-193189 está presente a una concentración desde aproximadamente 0,2 pM hasta aproximadamente 4 pM, preferiblemente en donde el LDN-193189 está presente a una concentración desde aproximadamente 1 pM hasta aproximadamente 3 pM.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde las células pluripotentes se cultivan con el inhibidor de SMAD en los días de cultivo 1-15, 1-16 o 1-17, en donde las células pluripotentes se cultivan en los días de cultivo 1-17; y/o en donde las células pluripotentes se cultivan con el inhibidor de SMAD sustancialmente de forma continua o de manera diaria durante 15, 16, o 17 días, en particular en donde las células pluripotentes se cultivan con el inhibidor de SMAD sustancialmente de forma continua o de manera diaria durante 17 días.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el inhibidor de SMAD está presente a una concentración de aproximadamente 50-2000 o 50-500 nM, preferiblemente en donde el inhibidor de SMAD está presente a una concentración de aproximadamente 180-240 nM.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el método además comprende poner en contacto las células pluripotentes con un inhibidor de MEK, preferiblemente en donde el inhibidor de MEK es PD0325901, y más preferiblemente donde el PD0325901 está presente a una concentración de aproximadamente 0,25-2,5 pM, y

en particular en donde el inhibidor de MEK se pone en contacto con las células pluripotentes durante aproximadamente 1-3 días, o los días 1-3, 2-4, 3-5, o los días 1,2, 3, 4, o 5, después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD, e incluso más en particular

en donde el inhibidor de MEK se pone en contacto con las células pluripotentes de aproximadamente 24 a aproximadamente 48 horas después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD; en donde el inhibidor de MEK se pone en contacto con las células pluripotentes de forma diaria o sustancialmente de manera continua durante aproximadamente 3-4 días empezando aproximadamente 1-2 días después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD; preferiblemente en donde el inhibidor de MEK se pone en contacto con las células pluripotentes los días 2-5 o los días 3-6 después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD el día 1.

8. El método de la reivindicación 2, en donde el inhibidor de GSK3 es CHIR99021, preferiblemente en donde el CHIR99021 está presente a una concentración de aproximadamente 0,5-3 pM, más preferiblemente en donde el CHIR99021 está presente a una concentración desde más de aproximadamente 1,25 pM hasta aproximadamente 2 pM, o en donde el CHIR99021 está presente a una concentración de aproximadamente 4 7 pM los días 9-17 después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el activador de la señalización de Wnt se pone en contacto con las células pluripotentes 1-3 días después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD, preferiblemente en donde el activador de la señalización de Wnt se pone en contacto con las células pluripotentes a las 24-48 horas después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde las células pluripotentes se cultivan con el activador de la señalización de Wnt sustancialmente de forma continua o de manera diaria durante 14, 15, o aproximadamente 16 días, o en donde el activador de la señalización de Wnt se pone en contacto con las células pluripotentes los días 2-17 después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el activador de la señalización de SHH es purmorfamina o C25II Shh, preferiblemente en donde el método además comprende poner en contacto las células pluripotentes con dos activadores de la señalización SHH, y más preferiblemente en donde los dos activadores de la señalización de SHH son purmorfamina o C25II Shh.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el al menos un activador de la señalización de SHH se pone en contacto con las células pluripotentes el mismo día del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD o a las 24-48 horas después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD, preferiblemente en donde el al menos un activador de la señalización de SHH se pone en contacto con las células pluripotentes los días 1-7 con o después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el método además comprende poner en contacto las células pluripotentes con FGF-8, preferiblemente en donde el FGF-8 no se pone en contacto con las células pluripotentes el mismo día del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD, más preferiblemente en donde el FGF-8 se pone en contacto con las células pluripotentes los días 9-17 u 11-17 después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD, y lo más preferiblemente en donde el FGF-8 está presente a una concentración de aproximadamente 50-200 ng/ml.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde las células pluripotentes comprenden un transgén de resistencia a antibiótico bajo el control de un promotor neuronal.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el método además comprende seleccionar células neurales o neuronas DA del mesencéfalo derivadas de las células pluripotentes poniendo en contacto las células con un antibiótico, un agente quimioterapéutico, un entrecruzador de ADN, un inhibidor de la síntesis de ADN, o un inhibidor mitótico; o en donde el método además comprende poner en contacto las células pluripotentes con un antibiótico o un agente quimioterapéutico, preferiblemente en donde el agente quimioterapéutico es mitomicina C, en donde preferiblemente la mitomicina C se pone en contacto con las células pluripotentes los días 27, 28 y/o 29 después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD; o en donde preferiblemente el antibiótico es G418 (geneticina).

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en donde el método además comprende cultivar o incubar las células pluripotentes en un medio que comprende un inhibidor de ROCK antes del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD; y/o en donde el método además comprende poner en contacto las células pluripotentes con blebistatina, preferiblemente en donde la blebistatina se pone en contacto con las células el día 5 y el día 17 de la diferenciación.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-16,

(i) en donde al menos el 40 % de las células se diferencia y expresa tanto FOXA2 como LMX1; en donde al menos el 60 % de las células se diferencia y expresa tanto FOXA2 como LMX1; en donde al menos el 80 % de las células se diferencia y expresa tanto FOXA2 como LMX1; o en donde al menos el 85 % de las células se diferencia y expresa tanto FOXA2 como LMX1; o (ii) en donde al menos el 50 % de las células se diferencia y expresa tanto FOXA2 como tirosina hidroxilasa (TH); o

en donde al menos el 70 % de las células se diferencia y expresa tanto FOXA2 como tirosina hidroxilasa (TH).

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en donde las células pluripotentes son células madre pluripotentes inducidas (iPS) humanas.

19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en donde el LMX1 es el factor de transcripción homeobox LIM 1 alfa (LMX1A).

20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 17-19, en donde las células diferenciadas que expresan FOXA2 y LMX1, o FOXA2 y TH, expresan además al menos un marcador seleccionado del grupo que consiste en homeobox ortodentículo 2 (OTX2), la proteína relacionada con el factor nuclear 1 (NURR1), la beta-tubulina de clase III específica de neuronas (Tuj1), TTF3, homeodominio 3 de tipo apareado (PITX3), complejo achaetescute (ASCL), factor temprano de células B 1 (EBF-1), factor temprano de células B 3 (EBF-3), transtiretina (TTR), sinapsina, transportador de dopamina (DAT), y canal de potasio con rectificación hacia dentro acoplado a proteína G (Kir3.2/GIRK2), CD142, DCSM1, CD63 y CD99.

21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-20, en donde el método además comprende incubar las células pluripotentes humanas en presencia de una DNasa o una endonucleasa, preferiblemente en donde la endonucleasa es DNasa I o Benzonase®, y más preferiblemente en donde la DNasa I o Benzonase® está presente a una concentración de aproximadamente 100 U/ml.

22. El método de la reivindicación 21, en donde las células pluripotentes humanas se cultivan en presencia de una endonucleasa en al menos uno de los días 4-6 después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD, preferiblemente en donde las células pluripotentes humanas en presencia de una endonucleasa el día 5 después del inicio del contacto con el inhibidor de la señalización de SMAD.