CN114292814A - 一种多能干细胞分化为中脑黒质多巴胺能神经细胞的方法 - Google Patents

一种多能干细胞分化为中脑黒质多巴胺能神经细胞的方法 Download PDF

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Abstract

提供了一种特定的把多能干细胞分化为中脑黑质多巴胺能(A9 mDA)神经细胞的方法。分化形成成熟A9 mDA神经元，可表达中脑黑质多巴胺能神经元的表面分子标记物，包括TH，FOXA2，EN1，LMX1A，NURR1，和GIRK2，而很少表达腹侧被盖区多巴胺能神经元标记物CB。所述A9 mDA神经细胞移植到黑质，其轴突可特异性投射到内源黑质多巴胺能神经元支配的靶脑区‑背侧纹状体；移植的A9 mDA神经元自身表现为内源黑质多巴胺能神经元经典的电生理特性，包括低频的自发放电频率，超极化电流刺激可以诱导出sag；把A9 mDA神经细胞移植到神经退行性疾病个体的黑质或纹状体，可以改善运动功能障碍。

Description

一种多能干细胞分化为中脑黒质多巴胺能神经细胞的方法
技术领域
本发明属于神经干细胞科学领域，更具体地，本发明涉及多能干细胞分化为中脑黑质多巴胺能神经细胞的分化方法。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种长期的中枢神经系统退行性疾病，平均发病年龄60岁，在65岁以上老人中发病率是1.7％。国际流行病学调查显示，2005年中国PD患者约200万，占全球发病人数的一半。预期到2030年，中国将有接近500万PD患者。帕金森病的患者常表现为运动障碍，如静止性震颤、肌张力增高、运动迟缓和姿势不稳等等。帕金森病的病理基础是中脑黒质多巴胺能神经元的退行性变和丢失，造成了纹状体多巴胺能水平显著下降，从而导致了运动功能的障碍。
多巴胺能神经元因能够分泌儿茶酚胺类神经递质多巴胺而得名，在脑内有广泛的分布。多巴胺能神经元以酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)为标志物，TH是多巴胺合成的限速酶，负责催化酪氨酸转变成L-多巴(L-DOPA)。在中脑，多巴胺能神经元主要分布在三个核团：黒质致密区(the substantia nigra pars compacta，SNc)、腹侧被盖区(theventral tegmental area，VTA)和红核后区(the retrorubral field，RrF)。SNc的多巴胺能神经元也被称为A9 mDA神经元，VTA的则称为A10 mDA神经元，RrF的为A8 mDA神经元，A8-10的命名是依据解剖学的定位区分的。A9 mDA神经元和A10 mDA神经元是中脑多巴胺能神经元(midbrain dopaminergic neurons,mDA)中两种重要的亚型，两类神经元除了位置分布的不同，投射环路也各不相同。A9 mDA神经元主要投射到背外侧纹状体，组成中脑黒质纹状体通路，主要调控运动功能，是帕金森氏病中特异性丢失的多巴胺能神经元亚群。A10mDA神经元主要投射到伏隔核、皮层、嗅皮层、杏仁核等，组成中脑边缘皮层通路，参与调控奖赏、情绪等功能。
A9 mDA神经元和A10 mDA神经元在帕金森病中表现出不同的易感性。在帕金森病人脑内，SNc的A9 mDA神经元优先退化，SNc腹侧的细胞较背侧更为敏感，而相邻的VTA中的A10 mDA神经元则相对幸免。细胞内钙结合蛋白calbindin(CALB)被作为A10 mDA神经元的标志物，calbindin是被用来区分PD病人及PD模型动物脑内多巴胺能神经元中具有拮抗能力的神经元，大都是A10 mDA神经元。而另一种蛋白，G-蛋白门控内向整流钾通道 (GIRK)，它通过激活D2或GABA受体，产生一个缓慢的抑制性突触后电位，从而来调控多巴胺能神经元的活性。其中，GIRK2特异地在易感的多巴胺能神经元(大都是A9 mDA神经元)中表达。
临床上尚无治愈帕金森病的有效治疗方案，目前应用的治疗手段只能改善症状，却不能阻止病情的进展。药物治疗是帕金森病最主要的治疗手段，通过补充多巴胺或者增强多巴胺受体功能来达到治疗的效果，左旋多巴 (L-DOPA)制剂仍是最有效的药物，然而药物只在PD早期阶段有效，随着多巴胺能神经元的进一步丢失，药物逐渐失效并出现明显的副作用。脑深部电刺激术也被应用于帕金森病人的治疗。但与药物治疗一样，手术治疗仅能改善症状，并不能根治疾病。而且由于深部脑刺激的副作用，这一治疗手段只适用于部分病人。通过外源移植多巴胺能神经元，进而替代脑内丢失的多巴胺能神经元的功能(干细胞治疗)，是具有前景的治疗方法之一。临床实验发现，移植流产胎儿中脑腹侧(中脑多巴胺能神经前体细胞所在脑区)的细胞到病人的纹状体，部分病人的运动功能可以得到长期恢复，并且不需要或只需少量使用药物。移植的神经前体细胞部分可以分化成DA神经元，并释放DA[16, 17]。这些临床研究证明了干细胞治疗在PD治疗中的巨大潜能。然而流产胎儿脑组织来源有限，且存在伦理学问题。人多能干细胞(hPSCs)，包括人胚胎干细胞(hESCs)和人诱导性多能干细胞(hiPSCs)，具有分化为全身所有类型细胞的潜能，是获得各类功能细胞用于治疗的理想细胞来源。遵循体内发育的原则，人多能干细胞可以诱导分化成为中脑多巴胺能神经元。这些细胞移植入PD模型鼠纹状体内，可以存活，并能够挽救帕金森的行为表现，给帕金森病的治疗带来了新的希望。
然而，在这些研究中都没有明确区分移植细胞中中脑多巴胺能神经元的亚型(A9/A10)。如上所述内源不同亚型的多巴胺能神经元其电生理特性，支配的脑区和生理功能完全不同。因此迫切需要开发针对中脑多巴胺能神经元不同亚型的分化方法，尤其是针对帕金森氏病的细胞治疗，需要开发高效的中脑黒质多巴胺能神经元富集的分化方法。并且对于分化得到的多巴胺能神经元需要从多个层面，包括标志物分子的表达，电生理特征，轴突投射的特征等验证其亚型特异性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特定的把多能干细胞分化为中脑黑质多巴胺能神经细胞的方法，以及由该方法获得的细胞或细胞制剂。
在本发明的第一方面，提供一种制备中脑黑质多巴胺能神经细胞的方法，包括：(1)将干细胞置于包含神经诱导剂的培养基中，在多阶段中以添加组分分别进行诱导；以及，(2)从培养物中获得所述干细胞来源的中脑黑质多巴胺能神经细胞。
在一个优选例中，(1)中，在多阶段中以不同的添加组分进行诱导：第一阶段：添加SB431542，DMH-1，SHH和CHIR99021；第二阶段：添加SAG， SHH和CHIR99021；第三阶段：添加SHH，SAG和FGF8b；第四阶段：添加 SHH和FGF8b。
在另一优选例中，第一阶段中，添加1～15μM(如2，5，8，12，14μM) SB431542，1～5μM(如0.4，0.6，1，3，5，10，15，18μM)DMH-1，200～ 1000ng/mL(如300，400，600，700，800，900ng/mL)的SHH，0.1～1μM(如 0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9μM)的CHIR99021。
在更优选的优选例中，第一阶段中，添加10±5μM的SB431542，2±1μM 的DMH-1，添加500±200ng/ml的SHH，0.4±0.2μM的CHIR99021。进一步优选地，添加10±2μM的SB431542，2±0.5μM的DMH-1，添加500±100 ng/ml的SHH，0.4±0.1μM的CHIR99021。
在另一优选例中，第二阶段中，添加0.1～5μM(如0.2，0.5，0.8，1，2， 3，4μM)的SAG，50～300ng/ml(如80，100，150，200，250ng/ml)的SHH， 0.1～1μM(如0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9μM)的CHIR99021。
在更优选的优选例中，第二阶段中，添加2±1μM的SAG，100±50ng/ml 的SHH，0.4±0.2μM的CHIR99021。进一步优选地，添加2±0.5μM的SAG， 100±20ng/ml的SHH，0.4±0.1μM的CHIR99021。
在另一优选例中，第三阶段中，添加5～100ng/ml(如10，15，20，30， 40，50，60，70，80ng/ml)；优选地为5～50ng/mL)的SHH，0.1～5μM(如0.2，0.5，0.8，1，2，3，4μM)的SAG，5～200ng/ml(如10，15，20，40，60，80， 100，150，200，250ng/ml)的FGF8b。
在更优选的优选例中，第三阶段中，添加20±10ng/ml的SHH和0.5± 0.2μM的SAG，100±50ng/ml的FGF8b。进一步优选地，添加20±5ng/ml 的SHH和0.5±0.1μM的SAG，100±20ng/ml的FGF8b。
在另一优选例中，第四阶段中，添加5～100ng/ml(如10，15，20，30， 40，50，60，70，80ng/ml)的SHH，5～80ng/ml(如10，15，20，30，40，50， 60，70ng/ml)的FGF8b。
在更优选的优选例中，第四阶段中，添加20±10ng/ml的SHH，20±10 ng/ml的FGF8b。进一步优选地，添加20±3ng/ml的SHH，20±3ng/ml的 FGF8b。
在另一优选例中，各阶段中，第一阶段：培养起始至培养6～8天；较佳地7±0.5天；第二阶段：培养6～8天至培养11～13天；较佳地12±0.5天；第三阶段：培养11～13天至培养18～20天；较佳地19±0.5天；第四阶段：培养18～20天至培养31～33天；较佳地32±0.5天。
在另一优选例中，所述的干细胞包括：胚胎干细胞或诱导性多能干细胞；较佳地，所述干细胞为人干细胞，所述胚胎干细胞或诱导性多能干细胞为人胚胎干细胞或人诱导性多能干细胞。
在本发明的另一方面，提供一种中脑黑质多巴胺能神经细胞，其由前面任一所述的方法制备获得。
在本发明的另一方面，提供一种中脑黑质多巴胺能神经细胞，所述的中脑黑质多巴胺能神经细胞在分化5～10天(如6，7，8，9天)后，表达中脑黑质多巴胺能神经元的表面分子标记物，包括酪氨酸羟化酶(TH)，FOXA2，EN1， LMX1A，NURR1和/或GIRK2，而很少表达腹侧被盖区多巴胺能神经元标记物CALB(CB)。
在另一优选例中，所述分化为体外分化，包括：在体外贴附和成熟，分化为成熟的中脑黑质多巴胺能神经元。
在另一优选中，所述分化为体内分化，包括：在体内成熟。
在另一优选例中，所述很少表达腹侧被盖区多巴胺能神经元标记物CALB 包括：表达CALB少于20％，较佳地少于15％，更佳地少于12％，10％，8％。
在另一优选例中，所述的中脑黑质多巴胺能神经细胞移植到脑的黑质区后，移植后分化获得的A9中脑多巴胺能(mDA)神经元轴突特异性投射到内源黑质多巴胺能神经元支配的靶脑区-背侧纹状体。
在另一优选例中，移植后分化获得的A9中脑多巴胺能神经元自身呈现内源黑质多巴胺能神经元的经典的电生理特性；包括低频的自发放电频率，超极化电流刺激可以诱导出sag。
在另一优选例中，移植后分化获得的A9中脑多巴胺能神经元到脑的黑质或纹状体，可以改善运动功能障碍。
在另一优选例中，所述中脑黑质多巴胺能神经细胞为A9中脑多巴胺能细胞；较佳地，其在分化5～10天(如6，7，8，9天)后，大于80％表达A9 mDA 神经元标记物GIRK2；更佳地大于85％表达A9 mDA神经元标记物GIRK2。
在另一优选例中，在分化5～10天后，总细胞中40％(如45％，50％，55％， 60％，70％)以上或TUJ1+神经元中50％(如55％，60％，65％，70％，75％，80％) 以上的细胞具有该特征；更佳地，总细胞中50％(如55％，60％，65％，70％， 75％)以上或TUJ1+神经元中60％(如65％，70％，75％)以上的细胞具有该特征。
在本发明的另一方面，提供一种中脑黑质多巴胺能神经元，其由前面任一所述的中脑黑质多巴胺能神经细胞分化获得；较佳地，其表达中脑黑质多巴胺能神经元的表面分子标记物，包括TH，FOXA2，EN1，LMX1A，NURR1 和/或GIRK2，而很少表达腹侧被盖区多巴胺能神经元标记物CALB(CB)。
在本发明的另一方面，提供前面任一所述的中脑黑质多巴胺能神经细胞在制备治疗神经退行性疾病的制剂(包括细胞培养物或分离物)中的应用。
在本发明的另一方面，提供一种用于治疗神经退行性疾病的制剂，其包括：前面任一所述的中脑黑质多巴胺能神经细胞；以及，药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述制剂还用于作为进行大脑黑质区或纹状体移植的移植物(药物)。
在另一优选例中，所述制剂还用于防治运动功能障碍。
在另一优选例中，所述神经退行性疾病包括(但不限于)：帕金森症，阿尔茨海默症，路易体痴呆，亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症、神经损伤。
在本发明的另一方面，提供一种筛选改善神经退行性疾病的物质(包括潜在物质)的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理一模型体系，该模型体系为大脑神经环路受损或神经功能受损的模型体系，且含有中脑多巴胺能神经元(细胞)；和，(2)检测所述模型体系，若所述候选物质在统计学上促进(显著促进，如促进10％以上，20％以上，50％以上，80％以上等)多巴胺能神经元对于大脑中受损神经环路或促进其重塑神经功能，则该候选物质是对于修复大脑中受损神经环路或重塑神经功能有用的物质。
在另一优选例中，步骤(1)所述模型体系为动物模型体系，组织模型体系，器官模型体系，细胞(培养物)模型体系。
在另一优选例中，步骤(2)中，包括：观测所述候选物质对于中脑多巴胺能神经元的影响，若能促进(显著促进，如促进10％以上，20％以上，50％以上，80％以上等)中脑多巴胺能神经元对于黑质-纹状体通路的修复，则其是对于修复大脑中受损神经环路或重塑神经功能有用的物质。
在另一优选例中，步骤(2)中，包括：观测所述候选物质对于中脑多巴胺能神经元的影响，若能促进(显著促进，如促进10％以上，20％以上，50％以上，80％以上等)中脑多巴胺能神经元的突触前和突触后整合，则其是对于修复大脑中受损神经环路或重塑神经功能有用的物质。
在另一优选例中，步骤(2)中，包括：观测所述候选物质对于中脑多巴胺能神经元的影响，若能促进(显著促进，如促进10％以上，20％以上，50％以上，80％以上等)中脑多巴胺能神经元轴突投射到背侧(Caudate putamen， CPu)，则其是对于修复大脑中受损神经环路或重塑神经功能有用的物质。
在另一优选例中，步骤(2)中，包括：观测所述候选物质对于中脑多巴胺能神经元的影响，若能促进(显著促进，如促进10％以上，20％以上，50％以上，80％以上等)中脑多巴胺能神经元长出神经纤维、沿着内源黑质-纹状体神经连接路径、特异性地生长并延伸到其内源靶区域-纹状体、和纹状体神经元形成神经连接，并投射到纹状体，则其是对于修复大脑中受损神经环路或重塑神经功能有用的物质。
在另一优选例中，步骤(2)中，包括：所述模型体系为动物体系，该动物具有运动功能障碍的特点，还包括：观测动物的运动能力，若所述候选物质进一步改善(显著改善，如改善10％以上，20％以上，50％以上，80％以上等) 其运动功能障碍，则其是对于修复大脑中受损神经环路或重塑神经功能有用的物质。
在另一优选例中，步骤(2)中，包括：步骤(1)包括：在测试组中，用候选物质处理一模型体系；和/或，步骤(2)包括：检测所述体系中多巴胺能神经元对于大脑中受损神经环路或其重塑神经功能的作用、或检测中脑多巴胺能神经元对于黑质-纹状体通路的修复作用、或检测中脑多巴胺能神经元的突触前和突触后整合情况、或观测动物的运动功能障碍情况；并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达体系；若所述候选物质在统计学上促进多巴胺能神经元对于大脑中受损神经环路或其重塑神经功能、或促进中脑多巴胺能神经元对于黑质-纹状体通路的修复作用、或促进中脑多巴胺能神经元的突触前和突触后整合、或改善动物的运动功能障碍，则该候选物质是对于修复大脑中受损神经环路或重塑神经功能有用的物质。
在另一优选例中，所述的筛选方法不包括以疾病治疗为直接目的的方法。
在另一优选方式中，所述的候选物质包括(但不限于)：化合物，相互作用分子，生物大分子等。
在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的物质或潜在物质进行进一步的细胞实验、动物(如鼠、非人灵长类动物)实验或针对人的临床实验，以从候选物质中进一步选择和确定对于修复大脑中受损神经环路或重塑神经功能有用的物质。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、移植在黑质的人神经元的轴突投射
(A和B)黑质移植小鼠脑片矢状切面，mDA(A)和Glu(B)神经元的hNCAM 免疫组化染色。标尺，250um。黑框区域在右上方被放大。白色框的区域在右下角被放大。标尺，放大的图像为25um
(C)解剖结构的三个代表性矢状切面示意图。
(D)在相应矢状面上，野生型小鼠(左图)或移植了mDA神经元(中图)或 Glu神经元(右图)的PD小鼠的TH免疫染色。
(E)量化hNCAM+纤维在不同区域的分布。mDA组n＝8,Glu组n＝6。
(F)hNCAM+纤维在mDA移植小鼠背侧(CPu)和腹侧纹状体(Acb)的相对分布。(A)、(B)和(D)中的图像是从多个高倍放大图像中自动拼接出来的。另见图8。
图2、黑质移植神经元的轴突投射路径
(A)移植了mDA神经元的小鼠脑的近似的中外侧平面和相应的连续矢状面hNCAM免疫染色示意图。
(B)在不同矢状面绘制hNCAM+轴突投射。方框区域在(C)-(F)中放大。
(C-F)高倍镜显示轴突的投射路径和区域。标尺，250um。(C)中红色箭头表示MFB中hNCAM+轴突。(D)中红色箭头表示上行的hNCAM+轴突。(F)所示为外侧纹状体中hNCAM+纤维的分布。(D)和(F)中的蓝色箭头表示皮层中的hNCAM+纤维。
(G)不同宿主脑区移植的mDA或Glu神经元纤维中hNCAM+纤维的形态分布及与人STEM121和TH的共标记。标尺，50毫米(上面)和25毫米(下面)。
(H)定量mDA或Glu神经元移植小鼠CPu中与TH共标的人STEM121 的像素的百分比。数据以平均值±SEM表示。t检验。***p<0.001。
(A)和(C-F)中的图像是从多个高倍放大的图像中自动拼接出来的。另见图9。
图3、遗传标记的人mDA神经元的轴突投射和电生理特性
(A)移植人的mDA和非mDA神经元的可视化和电生理记录策略。
(B)构建TH-tdTomato/ChR2-EYFP双位点敲入hESC细胞系 (TH-tdTomato/AAVS1-ChR2-EYFP hESCs)的策略。
(C)利用上述hESCs细胞系在分化第42天的免疫染色显示tdTomato和 EYFP在TH+神经元中共表达(白色箭头)，而在TH-神经元中没有tdTomato(白色箭头)。标尺，20um。
(D)免疫组化图像显示在黑质移植的转基因人mDA神经元的移植块中包含tdTomato+/EYFP+mDA神经元(白色箭头)和tdTomato-/EYFP+非mDA神经元细胞(白色箭头)。
(E)黑质移植的PD小鼠脑片连续冠状切片免疫染色的tdTomato。标尺， 1mm。如图所示，框内区域被放大。标尺，0.1mm。点红色箭头表示来自腹侧纹状体的上行轴突。
(F)人STEM121与tdTomato的共标记。标尺，50um。
(G-I)移植部位的冠状面切片，来自PD小鼠大脑的纹状体(G和H)或黑质(I)移植块的tdTomato和EYFP的免疫染色。(G)中的框区在下面放大。(I) 中的图像是同一移植块的顶部和底部的两个独立图像的合成。标尺，1mm，顶部(G)；100mm，底部(G)；250um(H)和(I)。
(J)在mDA神经元报告小鼠(DAT-cre/Ai9)内源SNc mDA神经元或纹状或黑色移植的人mDA神经元移植3个月后，出现典型的自发性动作电位 (sAPs)。
(K-M)来自mDA神经元报告小鼠内源中间VTA或者SNc(K)或纹状移植的人非mDA神经元或mDA神经元(L)在移植后6个月检测典型电压凹陷特性。括号中的数字表示记录的细胞中显示凹陷的神经元数量。凹陷幅度用(M)表示，统计样本数量在柱子中显示。数据以平均值±SEM表示。t检验，##p<0.01， ##p<0.001。
(E)、(G)和(H)中的图像自动从多个高倍放大图像中拼接。(I)中的图像是从同一截面的上半部和下半部的两幅独立图像拼接而成的。另见图10和11。
图4、狂犬病介导的基因标记人类mDA神经元输入的追踪
(A)跟踪输入到PD小鼠的SN或纹状体中的基因标记人类mDA神经元的输入的策略。(B)TH-iCre hESC细胞系的构建的示意图。
(C)在移植部位表达EGFP和tdTomato的神经元。比例尺，1mm。(D)免疫组织化学图像显示SN移植部位神经元中tdTomato，EGFP和TH的表达。白色箭头表示EGFP和tdTomato在TH+神经元中共表达。比例尺，100mm。
(E)连续的冠状切片显示了被追踪的宿主神经元(EGFP+/tdTomato-)向黑质或纹状体移植的人mDA神经元的分布。仅显示了移植物同侧的一侧。比例尺，1mm。
(F)定量统计标记为向黑质或纹状体移植的人mDA神经元的同侧标记的输入，以所有同侧输入的百分比表示。数据表示为平均值±SEM。只显示平均输入百分比大于1％的黑质或纹状体移植物的大脑区域。对于纹状体移植，n＝ 3，对于黑质移植物，n＝5。ND，未检测到。学生t检验，*p<0.05，**p<0.01， ***p<0.001。
(G)在不同宿主脑区域中将标记的神经元输入到移植的mDA神经元上的放大图像。比例尺，200mm。
(H)冠状截面显示在Acb中标记的神经元输入到移植的mDA神经元。方框的区域在(H1)下放大。显示了来自另一只动物的输入神经元的示例分布 (H2)。白色箭头指示标记的输入神经元呈斑块状分布。比例尺为1mm(上图) 和0.5mm(下图)。
(C-E)和(H)中的图像是从多个高倍率图像中自动拼接而成的。(G)中的图像从平铺图像放大。另见图12。
图5、人源mDA或非mDA神经元输入的电生理特性
(A和B)在移植后3个月或6个月内在纹状体(A)或黑质(B)中移植的人 mDA或非mDA神经元有典型的sEPSC和sIPSC。
(C和D)sIPSC(C)和sEPSC(D)的频率和幅度。数据表示为平均值±SEM。单向方差分析，然后进行Holm-Sidak事后检验。*p<0.05，**p<0.01，***p <0.001；比较3个月和6个月移植的mDA或非DA神经元。##p<0.01，###p <0.001；mDA和非mDA神经元之间的比较。
(E)野生型SCID小鼠的内源性纹状体或SNc神经元，和移植后6个月在纹状体或黑质的非mDA或mDA神经元的sIPSC/sEPSC比。数据表示为平均值±SEM。单向方差分析，然后进行Holm-Sidak事后检验。##p<0.01，###p <0.001。该列中显示了用于统计的样本编号。
图6、移植动物的行为后果
(A)建立动物模型，移植和行为分析的实验过程。每月对这些动物进行行为学测试，包括苯丙胺诱导的旋转，轮转测试和圆柱体测试。
(B)苯丙胺诱导的旋转行为在移植后6个月内发生变化。
(C)旋转脚架测试显示了移植前后跌落时间的变化。
(D)圆柱体测试显示移植前后同侧偏好变化。
在所有三个行为测试中，黑质mDA组n＝11，黑质Glu组n＝8，黑色 ACSF组n＝8，纹状体mDA组n＝8。数据表示为平均值±SEM。两步方差分析，然后进行Holm-Sidak检验。***p＜0.001。
图7、接受移植后PD小鼠的双向控制
(A)双向调控PD小鼠中移植的人类mDA神经元的示意图。
(B)产生mCherry和Bi-DREADD hESC品系的示意图。
(C)免疫染色显示，在Bi-DREADD hESC分化第42天，分化出的mDA 神经元中，TH，hM3Dq-mCherry和血凝素(HA)标记的KORD共表达。比例尺， 50毫米。
(D)免疫组织化学图像显示，从Bi-DREADD hESCs分化而来的mDA神经元在移植后共表达了人类核(hNs)，mCherry和TH。比例尺，50毫米。
(E)动物模型的实验过程，移植和行为分析。S旋转，自发旋转。
(F和G)苯丙胺诱导的旋转和圆柱体测试显示旋转行为(F)或同侧优先触觉(G)的变化。
(H)圆柱试验显示，用媒介物，CNO或SALB处理后，PD小鼠的同侧优先触觉发生了变化。
(I和J)自发旋转测试显示CNO或SALB引起的同侧净旋转(I)和同侧优先旋转(J)的变化。
图8、mDA和Glu神经元的体外分化和TH纤维体内分布
(A-B)来自hESC的第32天培养物的免疫染色显示了mDA的标记祖细胞(A) 和前脑谷氨酸祖细胞(B)。Ho，Hoechst，比例尺＝25um。(C)(A)和(B)中给出的细胞分化的定量。(D-E)来自hESC的42天培养物的免疫染色显示mDA的标记神经元(D)和前脑谷氨酸神经元(E)。比例尺＝25um。(F)量化(D)和(E)中介绍的细胞分化过程。(G)区域量化野生型小鼠TH+纤维的分布，如图1D所示。n ＝5。皮层中TH+阳性细胞胞体也包括在我们的计算中。
图9、黑质移植的mDA和Glu神经元的存活，轴突投射和突触形成
(A)来自PD小鼠大脑的hNCAM的免疫组织化学图像。移植的mDA神经元显示了CPu中hNCAM+纤维的分布和分支化。红色箭头表示hNCAM+纤维的珠状结构。比例尺＝50um(B)移植了nDA的小鼠受损大脑的免疫组织化学图像。元在不同的大脑区域显示出hNCAM+纤维的形态。比例尺＝125um。
(C)来自PD小鼠大脑的hNCAM的免疫组织化学图像。移植的Glu神经元在小鼠皮质和OB(嗅球)显示hNCAM+纤维的分布和分支化。比例尺＝ 125um。
(D)免疫组织化学图像显示在黑质中移植的共表达人源细胞核(hN)和 GIRK2TH阳性的细胞。方框的区域在下面被放大。对于大图像，比例尺＝100um，对于放大图像，比例尺＝25um。箭头指示双阳性细胞。
(E)免疫组织化学图像显示在黑质中移植的人类核(hN)阳性细胞共表达 FOXA2和LMX1A。比例尺＝100um。
(F)(D和E)中的细胞身份的定量。
(G)对具有人源移植的mDA神经元的小鼠大脑进行了人类特异性染色突触素和宿主CPu中的TH(上图)或GABA(下图)。方框的区域在右面被放大。白色箭头表示人类特异性的沿TH纤维与TH发生突触素共定位。白色箭头表示 GABA神经元周围的人特异性突触素与GABA的细胞体共定位。
(H)将具有移植神经的Glu神经元的小鼠大脑染色和宿主CPu中的人类特异性突触素和GABA。方框的区域在右边被放大。白色箭头表示人特异性突触素的共定位在GABA神经元细胞周围。
图10、hESC TH-tdTomato/AAVS1-ChR2-EYFP的细胞系建立与表征。
(A)hESC TH-tdTomato/AAVS1-ChR2-EYFP的细胞系策略的示意图。显示了TH位点插入或纯合的PCR引物分别由红色箭头和黑色箭头表示。AAVS1 基因座的PCR引物插入或纯合由绿色箭头和蓝色箭头指示。
(B)hESC TH-tdTomato/AAVS1-ChR2-EYFP的PCR基因分型。正确靶向 TH位点或AAVS1位点的预期PCR产物为分别为
Figure RE-GDA0002785024140000121
(红色箭头)或
Figure RE-GDA0002785024140000122
Figure RE-GDA0002785024140000123
(绿色箭头)。分别用于鉴定TH基因座或AAVS1基因座杂合性，通过
Figure RE-GDA0002785024140000124
Figure RE-GDA0002785024140000125
(黑色箭头)或
Figure RE-GDA0002785024140000126
(蓝色箭头)的PCR产物。那些没有
Figure RE-GDA0002785024140000127
或
Figure RE-GDA0002785024140000128
PCR产物是纯合的。母细胞系H9 ESCs作为对照。TH-tdTomato/ AAVS1-ChR2-EYFP hESC细胞系在TH位点和AAVS1位点中均为纯合子；
(C)DIC和荧光图像显示TH-tdTomato/AAVS1-ChR2-EYFP hESC和ESC 中和mDA神经元分化过程中的tdTomato和EYFP的表达。tdTomato在中间 (D15)和末期(D48)阶段表达，但不在ES或mDA神经元分化的早期(D9)阶段。比例尺＝100um；
(D)来自上述hESC的第42天培养物的免疫染色显示TH+神经元和 tdTomato的共表达。方框区域在下面放大。白色箭头指示tdTomato和TH高表达的神经元。白色箭头表示tdTomato和TH低表达的神经元。比例尺＝20um；
(E)免疫组织化学图像显示tdTomato在黑质mDA移植物TH+神经元中的表达。方框的区域为放大区域。白色箭头状和白色箭状表示tdTomato和TH高表达和低表达的神经元。比例尺＝20um；
(F)免疫组织化学图像在黑质mDA移植物中显示5-HT阳性的5-羟色胺神经元。方框中为放大区域。白色箭头表示tdTomato-和5-HT+的神经元。比例尺＝20um；
(G)从tdTomato和EYFP免疫染色的移植部位的冠状切面。在PD小鼠的大脑纹状体移植了源自TH-tdTomato/AAVS1-ChR2-EYFP的mDA神经元，显示mDA神经元的特定投射；
到CPu，但不包括邻近的大脑区域。比例尺＝1mm。方框中区域在下面放大。比例尺＝100um。图像从多个位置自动拼接自高倍率图像。
(H)向PD小鼠大脑移植了源自TH-tdTomato/AAVS1-ChR2-EYFP的mDA神经元切片的DIC和荧光图像。白色箭头表示tdTomato+mDA神经元，白色箭头表示EYFP+移植物中的tdTomato-非mDA神经元。比例尺＝50um。
图11、将人mDA或非mDA神经元移植到黑质或纹状体中功能成熟的电生理检查
(A-D)在纹状体(A和C)或黑质(B和D)在移植后3个月移植人mDA或非 mDA神经元中，典型的全细胞膜片钳记录的蓝光诱发的动作电位(A和B)或电流诱发的动作电位(C和D)。
(E和F)在3个月的纹状体(E)或黑质(F)移植的人类非mDA神经元移植后，典型的全细胞膜片钳记录的自发动作电位(sAPs)。虚线表示阈值电位。
(G和H)来自mDA神经元报告鼠(DAT-Cre/Ai9)的内源SNc mDA神经元的电位频率自发动作电位频率(sAP)(G)和亚阈值振荡(H)，或在3个月时纹状或黑质移植的人mDA神经元移植后作图。数据表示为平均值±SEM。样本统计数字在列中指示。单向方差分析，p>0.05。
(I和J)在6个月后移植人mDA神经元移植后纹状体(I)或黑质(J)的典型的全细胞膜片钳记录的自发动作电位(sAP)。虚线表示阈值电位。
(K和L)对移植后6个月移植了人类非mDA和mDA神经元输入电阻 (Rm)，膜电容(Cm)和纹状体(K)或黑质(L)的Tau作图。数据表示为平均值± SEM。统计的样本数是列中指示。学生t检验，#p<0.05。
图12、构建TH-icre hESC细胞系，狂犬病毒示踪基因标记人源的和老鼠内源的mDA神经元
(A)TH-iCre hESC细胞系基因型分析策略示意图。用于TH位点插入或纯合性的PCR引物分别由红色箭头和黑色箭头表示。绿色箭头表示用于去除 PGK-Pur的PCR引物。
(B)TH-iCre hESC系的PCR基因型分析。正确靶向TH位点的PCR产物在 1000bp左右(红色箭头)。纯合子克隆被约为1000bp左右的PCR产物鉴定(黑色箭头)，没有PCR产物的克隆为纯合子。用于去除PGK的PCR产物在750bp 左右(绿色箭头)。母细胞株(H9 ESCs)作为对照。选择PGK-pur去除的TH位点杂合克隆(红色星号)进行实验。
(C)慢病毒编码由泛素启动子驱动的cre依赖性mCherry表达 (Lenti-Ubi-DIO-mCherry)的图示。
(D)由TH-icre分化得到的mDA神经元通过感染慢病毒Lenti-Ubi-DIO-mCherry在TH+mDA神经元中表达mCherry。方框区被放大到右边。白色箭头状表示mDA神经元中mCherry和TH的共同表达。白色箭状表示低表达TH的mCherry表达神经元。标尺＝20um。
(E)免疫组化图像显示，移植在纹状体的TH-icre hESC细胞分化的得到的 mDA神经元在移植6个月后感染AAV-DIO-TVA-2A-NLS-tdTomato病毒，移植的mDA神经元中tdTomato和TH共表达。方框区被放大到右边。白色箭头状表示共表达的神经元。标尺＝20um。
(F)免疫组化图像显示皮层CTIP2+或SATB2+神经元，CPu区GABA+或 DARPP32+神经元，DR区5-HT+神经元都与黑质移植的人mDA神经元连接。白色箭头状表示共表达的神经元。标尺＝100um。
(G)狂犬病介导的内源性mDA神经元的跨突触示踪。共聚焦图像显示，在DAT-Cre小鼠的SNc中EGFP和tdTomato表达神经元。标尺＝0.5mm。
(H)一系列冠状面切片显示了date-cre小鼠内源性mDA神经元的追踪神经元(EGFP+/tdTomato-)分布。仅显示移植部位同侧的一侧。标尺＝1毫米。
(I)放大框内区域。(I)放大图像显示标记的向内源性mDA神经元传入的神经元呈斑块状分布。标尺＝0.5mm。
(J)标记到的宿主不同脑区传入纹状体移植的mDA神经元的高放大图像。标尺200um。
(G)和(H)中的图像是从多个高倍放大的图像中自动拼接出来的。
(I)和(J)中的图像是从平铺图像中放大的。
图13、内源神经元对移植神经元的功能性传入以及移植神经元的sIPSCs 和sEPSCs动力学
(A和B)在移植后3或6个月，在纹状体(A)或黑质的(B)的脑片上非mDA 或mDA神经元的自发兴奋性突触后电流(sEPSCs)和自发的抑制性突触后电流 (sIPSCs)的典型图示。
(C-F)A、B中sEPSCs和sIPSCs的单独的定量分析。数据以均数±SEM表示。统计数据的样本号显示在列中。单因素方差分析后采用Holm-Sidak事后检验。p>0.05。(G和H)野生型SCID小鼠脑切片内源性侧SNc mDA。
(G)或纹状体神经元(H)中典型的sEPSCs和sIPSCs的全细胞膜片钳记录。
图14、mCherry-和Bi-DREADD表达的hESC细胞系的构建和表征
(A)表达mCherry或Bi-DREADD的hESC克隆的PCR基因型鉴定。正确靶向AAVS1基因座的预期PCR产物约为2000bp(红色箭头)。纯合子克隆是没有
Figure RE-GDA0002785024140000151
PCR产物的克隆(黑色箭头)中的纯合子测试，
Figure RE-GDA0002785024140000152
PCR产物的克隆是杂合的。选择纯合克隆(红色星号)进行实验。
(B)免疫染色显示了mCherry，hM3Dq-mcherry或HA标记的KORD在 mCherry或Bi-DREADD hESC细胞系中的表达。比例尺＝50um。
(C)第16天的祖细胞的免疫染色。Ho，Hoechst。比例尺＝50um。
(D)来自mCherry或Bi-DREADD hESC细胞系分化的mDA神经元第42 天的培养物的免疫染色。比例尺＝50um。
(E)免疫染色分化的第42天显示TH和mCherry的共表达，但不在HA标记的KORD细胞系中。比例尺＝50um。
(F和G)来自mCherry hESC(F)或Bi-DREADD hESC(G)的黑质移植的 mDA神经元的免疫组织化学图像显示转基因mCherry或hM3Dq-mCherry和人源STEM121的共表达。比例尺＝20um。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，揭示了一种特定的把多能干细胞分化为中脑黑质多巴胺能神经细胞的方法。分化成熟的A9 mDA神经元，可表达中脑黑质多巴胺能神经元的表面分子标记物，包括TH，FOXA2，EN1，LMX1A，NURR1，和GIRK2，而很少表达腹侧被盖区多巴胺能神经元标记物CALB。所述A9mDA 神经细胞移植到黑质，其轴突可特异性投射到内源黑质多巴胺能神经元支配的靶脑区-背侧纹状体；黑质移植的A9 mDA神经元接受更多的抑制性输入而兴奋性输入较少，这一受调控模式和内源黑质多巴胺能神经元类似；移植的 A9 mDA神经元自身表现为内源黑质多巴胺能神经元经典的电生理特性，包括低频的自发放电频率，超极化电流刺激可以诱导出sag；把A9 mDA神经细胞移植到神经退行性疾病个体的黑质或纹状体，可以改善运动功能障碍。
术语
如本发明所用，“治疗”(treatment或treat)一词此处是包含对一哺乳动物 (特别是人类)进行预防性(例如，预防性药物(prophylactic))、治疗性(curative) 或舒减性(palliative)治疗；且包含(1)预防、治疗或减缓一个体罹患一疾病(例如癌症)，其中该个体为罹患该疾病的高风险族群，或是已罹患该疾病而尚未确诊断定；(2)抑制一疾病(例如抑制其发生)；或是(3)减轻一疾病(例如减轻与该疾病相关的征状)。
如本发明所用，所述“中脑黑质多巴胺能神经细胞”、“干细胞来源的中脑多巴胺能神经细胞”与“A9 mDA神经细胞”可互换使用/引用。
如本发明所用，所述的“细胞”包括“细胞群”，也包括“细胞培养物”。
如本发明所用，“个体”、“机体”、“受试对象”或“受试者”(subject) 是指包含人类的动物(如啮齿类动物，灵长类动物)，其可接受本发明的细胞(中脑黑质多巴胺能神经细胞)或细胞制剂的治疗。
如本发明所用，“防治”包括“预防”、“缓解”和“治疗”。
如本发明所用，“神经环路”是脑内不同性质和功能的神经元通过各种形式的连接；本发明中尤其关注黑质-纹状体神经环路。
如本发明所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。
如本发明所用，“有效量(Effective Amount)”是指一药剂(本发明中为细胞或细胞制剂)的用量足以产生缩所需的疗效反应。有效量也包括所述药剂治疗利益效果超越其毒性或有害影响的情形。药剂的有效量不必然能够治愈疾病或病症，但能够延缓、阻碍或防止该疾病或病症的发生，或是可缓减与疾病或病症相关的病征。可将治疗有效量可分成一、二或更多剂，而以适当的剂型在指定期间内施用一次、二次或更多次。
干细胞来源的神经元及其制备
本发明提供了一种中脑黑质多巴胺能神经细胞(或细胞群)，其主要为A9 中脑多巴胺能神经细胞。
作为本发明的优选方式，本发明获得的干细胞来源的神经元中，大于80％表达A9mDA神经元标记物GIRK2；更佳地大于85％表达A9 mDA神经元标记物GIRK2。
作为本发明的优选方式，所述中脑黑质多巴胺能神经细胞表达标志物： FOXA2，LMX1A，和EN1。若是进行进一步分化约一周后，其还表达酪氨酸羟化酶(TH)以及EN1，FOXA2，LMX1A和NURR1(较佳地，总细胞中40％以上或TUJ1+神经元中50％以上的细胞具有该特征；更佳地，总细胞中50％以上或TUJ1+神经元中60％以上的细胞具有该特征)。
本发明还提供了一种体外制备中脑黑质多巴胺能细胞的方法，包括：(1) 将干细胞置于培养基中包含神经诱导剂；以及，(2)从培养物中获得所述中脑黑质多巴胺能细胞。
作为本发明的优选方式，(1)中，培养基中添加神经诱导剂；并且，在多阶段中以不同的添加组分进行诱导：第一阶段：添加SB431542，DMH-1，SHH 和CHIR99021；第二阶段：添加SAG，SHH和CHIR99021；第三阶段：添加 SHH和CHIR99021；第四阶段：添加SHH和FGF8b。
在本发明的更为优选的方式中，本发明人还优化了各个添加组分的添加时机。优选地，各阶段中，第一阶段：培养起始至培养6～8天；较佳地7± 0.5天；第二阶段：培养6～8天至培养11～13天；较佳地12±0.5天；第三阶段：培养11～13天至培养18～20天；较佳地19±0.5天；第四阶段：培养 18～20天至培养31～33天；较佳地32±0.5天。
在本发明的更为优选的方式中，本发明人还优化了各个添加组分的添加量。添加量的优化有利于获得/富集本发明中特定的中脑黑质多巴胺能细胞。
通过本发明的优化的方法获得的中脑黑质多巴胺能神经细胞具有良好的作用，包括修复大脑中受损神经环路或重塑神经功能；更具体地包括：通过在黑质脑区形成神经纤维、投射到纹状体进行修复；或通过与脑中的靶细胞之间能够形成突触连接进行修复；或通过将轴突投射到背侧(Caudate putamen， CPu)进行修复；或通过长出神经纤维、沿着内源黑质-纹状体神经连接路径、特异性地生长并延伸到其内源靶区域-纹状体、和纹状体神经元形成神经连接、投射到纹状体进行修复。
干细胞来源的神经细胞的修复作用
神经元是大脑的基本功能单元，个体脑内有上千种不同类型的神经元，神经元之间形成复杂而精确的网络连接(神经环路)，是个体感知世界，思考和行为的基础。很多神经系统疾病，包括中风，脑外伤，和神经退行性疾病(帕金森病和阿尔兹海默病等)，都会导致脑内神经元的丢失和神经连接的破坏，进而产生严重的神经功能障碍，比如偏瘫，运动迟缓，肌肉僵直，学习记忆能力受损等。然而包括人在内的成年哺乳动物大脑神经再生能力十分有限，对于这些神经元丢失导致神经连接破坏和神经功能受损的疾病，临床上缺乏有效治疗措施。神经系统疾病干细胞治疗的关键是对受损神经环路的修复和功能重建，然而个体脑内神经元之间精确的网络连接是在发育过程中逐渐形成的，其中涉及复杂的神经纤维生长导向的机制。在成年疾病脑环境中，移植的神经细胞能否长出神经纤维，桥接“失联”的上游和下游脑区，进而修复受损的神经环路仍然不清楚。更重要的是这种修复作用是移植细胞随机整合的结果还是特异性的修复？其背后的机制和原则是什么？这些都是神经系统疾病干细胞治疗领域亟待解决的关键问题。
针对以上问题，本发明人以帕金森氏病为疾病模型，研究了成年脑内移植干细胞来源的神经细胞修复受损神经环路的可行性和机制。帕金森氏病是以静止性震颤，肌强直，运动迟缓等为主要表现的全球第二大神经退行性疾病，其主要原因是大脑黑质脑区的多巴胺能神经元进行性丢失，导致黑质脑区至纹状体脑区神经连接的破坏，进而造成纹状体内多巴胺分泌不足，最终导致病人运动功能的障碍。本发明人一直致力于开发针对不同类型神经元的人源干细胞神经分化技术，并在此基础上建立了高效的人干细胞分化中脑黑质多巴胺能神经元的方法。进一步地，通过基因编辑技术对人干细胞进行了遗传学标记，从而能够特异性示踪干细胞来源的人多巴胺能神经元及其神经纤维。本发明人把遗传学标记的人多巴胺能神经元移植到帕金森氏病模型鼠受损的黑质脑区，结果发现，黑质脑区移植的人多巴胺能神经元长出大量神经纤维，沿着内源黑质-纹状体神经连接路径，特异性地生长并延伸到其内源靶区域- 纹状体，和纹状体神经元形成神经连接，并且绝大部分神经纤维都投射到了纹状体。本发明人进一步通过遗传学技术和狂犬病毒介导的示踪技术，追踪了黑质移植的人多巴胺能神经元接受的上游神经支配，发现移植的人多巴胺能神经元接受与内源黑质多巴胺能神经元相似的神经支配。对神经元电生理功能的研究发现，移植的人多巴胺能神经元表现出和内源动物黑质多巴胺能神经元相似的电生理特性，接受相似的神经递质调控。这些结果说明，帕金森病模型动物脑内移植的人多巴胺能神经元特异性的修复和重建了受损的黑质-纹状体神经连接，并且其结构和功能与内源神经连接高度一致。最后，本发明人通过行为学检测发现，细胞移植组动物运动功能障碍随着移植时间延长逐渐得到改善，而通过化学遗传学技术抑制移植神经细胞的活性，动物运动功能的改善就消失了，提示移植细胞重建的神经功能连接介导了模型动物行为学的恢复。有趣的是，本发明人在帕金森病模型动物的黑质移植另外一种类型的神经细胞-人皮层谷氨酸能神经元，其神经纤维则主要投射到皮层和嗅球脑区，几乎不投射到纹状体，无法修复受损的黑质-纹状体神经环路，模型动物的运动功能障碍也不能得到改善，说明只有特定类型的细胞才能修复特定的神经功能环路。
本发明提示，成年脑内受损的神经连接可以通过移植干细胞来源的神经细胞实现结构和功能上的修复，重塑神经功能。同时本发明也发现，不同类型的神经细胞对环路的修复作用是不同的，提示对于不同类型神经元丢失造成的神经系统疾病，需要有针对性的移植特定的神经细胞进行环路修复和治疗。这些发现为脑损伤和神经退行性疾病的治疗提供了新的思路和理论基础。现在人脑内主要的神经细胞类型已经可以通过干细胞神经分化技术在体外高效获得，干细胞技术的发展将为很多神经系统疾病的治疗带来新的希望。
因此，基于本发明人的新发现，本发明的技术方案具有以下特点：(1)干细胞(如，人胚胎干细胞)来源的多巴胺能神经元具有黑质中脑多巴胺能神经元的特征；(2)功能性输入依赖于移植神经细胞的类型而不是移植的位置；(3)中脑多巴胺能神经元可以精准修复黑质-纹状体通路；(4)功能性修复的黑质-纹状体通路恢复了神经退行性疾病(如帕金森症)模型动物的运动功能。
药物筛选
本发明人将源自人胚胎干细胞(hESC)的中脑多巴胺(mDA)或谷氨酸(Glu) 皮质神经细胞移植到动物PD模型的黑质或纹状体中，发现移植的细胞与宿主环路广泛整合。朝向背侧纹状体的轴突路径由移植神经元的类型决定，突触前的输入很大程度上取决于移植的部位，而抑制性与兴奋性输入则由移植神经元的类型决定。hESC衍生的mDA神经元显示A9神经元的特征并恢复重建的黑纹状体环路的功能，以调节运动功能的改善。这些结果表明，在移植重建的环路和内源性神经网络之间，特定于细胞类型的突触前和突触后整合的相似性，凸显了hPSC衍生的神经元亚型在成年大脑中进行特定回路修复和功能恢复的能力。
基于本发明人的新发现，可以基于这些发现来筛选修复大脑中受损神经环路或重塑神经功能的物质。可从所述的物质中找到对于大脑损伤、神经退行性疾病等有用的药物。
因此，本发明提供一种筛选修复大脑中受损神经环路或重塑神经功能的物质(包括潜在物质)的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理一模型体系，该模型体系为大脑神经环路受损或神经功能受损的模型体系，且含有中脑多巴胺能神经元(中脑多巴胺能细胞)；和，(2)检测所述模型体系，若所述候选物质在统计学上促进多巴胺能神经元对于大脑中受损神经环路或促进其重塑神经功能，则该候选物质是对于修复大脑中受损神经环路或重塑神经功能有用的物质。
结合本发明的研究结果，可通过分析候选物质作用后，中脑多巴胺能神经元对于黑质-纹状体通路的修复情况、中脑多巴胺能神经元的突触前和突触后整合情况、中脑多巴胺能神经元轴突投射到背侧和/或动物模型的运用能力，来确定所述潜在物质(候选物质或候选药物)的有效性。
结合本发明的研究结果，可通过系统性分析候选物质作用后，中脑多巴胺能神经元长出神经纤维、沿着内源黑质-纹状体神经连接路径、特异性地生长并延伸到其内源靶区域-纹状体、和纹状体神经元形成神经连接，并投射到纹状体的能力的变化，来确定所述潜在物质(候选物质或候选药物)的有效性。
在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到候选物质处理前后的变化，还可设置对照组(Control)，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的模型体系(如空白对照或安慰剂对照)。
另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于修复大脑中受损神经环路或重塑神经功能真正有用的物质。
药物制剂
本发明还提供了一种药物组合物(制剂)，它含有有效量(如 0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的0.0001-10wt％)本发明的方法制备的中脑黑质多巴胺能细胞，以及药学上可接受的载体。
所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。
本发明所述的中脑黑质多巴胺能细胞的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
具体的治疗有效量取决于多种因素，例如欲治疗的特定状况、个体的生理条件(如，个体重、年龄或性别)、接受治疗的个体类型、治疗持续时间、并行治疗(如有)的本质以及所用的具体配方和化合物或其衍生物的结构。举例来说，可将治疗有效量表示成活性成分的总重量，例如以克、毫克或微克来表示；或表示成活性成分重量相对于体重的比例，例如表示为每公斤体重多少毫克(mg/kg)。或者是，可将有效量表示成活性成分(如本发明的细胞或细胞制剂)的浓度，例如摩尔浓度、重量浓度、体积浓度、重量摩尔浓度、摩尔分率、重量分率及混合比值。本领域技术人员可依据动物模式的剂量来计算药剂(如本发明的细胞或细胞制剂)的人体等效剂量(human equivalent dose,HED)。举例来说，本领域技术人员可依据美国食品药物管理局(FDA)所公告的“估算成人健康志愿者在初始临床治疗测式的最大安全起始剂量”(Estimating the Maximum Safe Starting Dose in InitialClinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)来估算人体使用的最高安全剂量。
本发明的具体实施例中，给出了一些针对动物如鼠的给药方案。从动物如鼠的给药剂量换算为适用于人类的给药剂量是本领域技术人员易于作出的，例如可根据Meeh-Rubner公式来进行计算：Meeh-Rubner公式： A＝k×(W2/3)/10,000。式中A为体表面积，以m2计算；W为体重，以g计算； K为常数，随动物种类而不同，一般而言，小鼠和大鼠9.1，豚鼠9.8，兔10.1，猫9.9，狗11.2，猴11.8，人10.6。应理解的是，根据药物以及临床情形的不同，根据有经验的药师的评估，给药剂量的换算是可以变化的。
本发明还提供了含有所述的药物组合物或直接含有所述的中脑黑质多巴胺能细胞的药盒。此外，所述的药盒中还可包括说明药盒中药物的使用方法的说明书。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
细胞培养
H9人胚胎干细胞系和H9人胚胎干细胞报告系培养在铺有受辐照的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的干细胞培养液中。培养液由DMEM/F-12，KOSR， 1xNEAA，0.5x Glutamax，0.1mM 2-巯基乙醇和4ng/ml FGF-2组成。每天更换一次新鲜的培养基，并每周用DispaseII传代。
中脑多巴胺能神经元和前脑谷氨酸能神经元的产生
中脑多巴胺能(mDA)神经元前体细胞的诱导方法包括：于MEF饲养层或vetronection上的人胚胎干细胞(传代后1天)在添加有SB431542(10μM)和 DMH-1(2μM)的神经诱导培养基(NIM)(DMEM/F-12、1xNEAA，1xN2 supplement)中培养。为了使分化细胞形成中脑底板前体细胞，从第1天到第7 天，在培养物中添加SHH(C25II，500ng/ml)和CHIR99021(0.4μM)。在第7天，用移液器轻轻吹下神经上皮细胞集落，并重新贴在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，用添加SAG(2μM)，SHH(100ng/ml)和CHIR99021(0.4μM)的NIM再培养6天(D7-12)。在第12天，撤去CHIR99021，将SHH浓度降低至20ng/ml，将SAG(0.5μM)和FGF8b(100ng/ml)加入培养液中以使前体细胞在悬浮液中扩增直至第19天。第32天，在含有20ng/ml SHH和20ng/ml FGF8b的神经诱导培养基中培养，直至移植。对于体外分化，在第32天，于37℃用Accutase 孵育3-5分钟使神经球解离。然后铺在涂有Matrigel的玻璃盖玻片上，用添加有脑源性神经营养因子(BDNF，10ng/ml)，胶质细胞系衍生的神经营养因子 (GDNF，10ng/ml)，抗坏血酸(AA，200μM)，cAMP(1μM)，转化生长因子β3(TGFβ3，1ng/ml)和化合物E(CompoundE，0.1μM)的神经分化培养基 (Neurobasal培养基，1xN2 supplement，1xB27)(NDM)继续培养。
从人胚胎干细胞诱导产生前脑谷氨酸(Glu)神经元的方法：将H9人胚胎干细胞克隆培养1周，每天更换培养基。然后，将hESC克隆从饲养层分离，并在ES培养基中生长4天，以帮助形成细胞聚集体。为了进行神经诱导，将细胞聚集体在添加有2μM SB431542和2μMDMH-1的NIM的培养瓶中培养3 天。然后将ESC聚集体粘附到玻连蛋白包被的6孔板上，在NIM中培养，直到在第16天左右形成神经管样的玫瑰花状结构。用1mL移液器轻轻吹落玫瑰花状结构，并悬浮在相同的培养基中再培养10天。第26天，将前体细胞用Accutase消化4分钟，消化成小球。在装有NIM的培养瓶中再培养1天后，收集小球并将其移植到动物模型中，或在添加了BDNF(10ng/ml)，GDNF(10 ng/ml)，AA(200μM)，cAMP(1μM)，IGF1(10ng/ml)的NDM中培养一周，贴附、成熟，用于免疫荧光染色。
PD模型和细胞移植
在SCID小鼠中进行构建PD模型的手术流程包括：将成年SCID小鼠(8-12 周)用1-2％的异氟烷与氧气混合麻醉。将1μL的6-OHDA(3mg/ml，溶于含1％抗坏血酸的盐水中)直接注入左侧大脑黑质中(前后[AP]＝-2.9mm，侧面[L]＝ -1.1mm，垂直[V]＝4.5mm，垂直深度从头骨计算)。在6-OHDA损伤手术后 4周，选择苯丙胺诱导后可以在1.5小时内以大于6圈/分钟旋转的动物进行细胞移植。将动物随机分组并移植谷氨酰胺能神经元前体细胞、多巴胺能神经元前体细胞或人工脑脊液(ACSF)(对照)。将50,000个细胞重悬于1μL含Rock 抑制剂(0.5μM)，B27，20ng/ml BDNF的ACSF中，并注入左侧黑质(前后[AP] ＝-2.9mm，侧面[L]＝1.1mm，垂直[V]＝4.4mm，垂直深度从头骨计算)或左纹状体(AP＝+0.6mm，L＝1.8mm，V＝3.2mm，垂直深度从硬脑膜计算)。
供体质粒构建
从Addgene获得了TALEN工具、人密码子优化的化脓性链球菌野生型 Cas9(Cas9-2A-GFP)、Cas9切口酶(Cas9D10A-2A-GFP)和pCAG-Flpo(质粒# 52342，质粒#52341，质粒#44719，质粒#44720，质粒#60662)。通过用 FRT序列替换PL552中的loxP序列(#68407)，构建了包含两侧带有FRT的 PGK-Puro表达盒的PL652供体质粒载体。
为了产生TH-iCre供体质粒，从基因组DNA中紧邻TH基因的STOP密码子上游或下游的序列中分别扩增出具有左同源臂和右同源臂的DNA片段。用带有P2A序列的引物，从pDIRE(Addgene质粒#80945)中扩增出融合了P2A 序列的iCre基因的DNA片段。然后将这三个片段克隆到质粒PL652的多克隆位点中。
为了产生TH-tdTomato供体质粒，用带有P2A序列的引物，从 pAAV-FLEX-ArchT-tdTomato(Addgene质粒#28305)中扩增出融合了P2A序列的tdTomato基因的DNA片段。从AAVS1-pur-CAG-EGFP质粒(Addgene质粒#80945)扩增出具有hGH polyA信号序列的DNA片段。然后将TH-iCre供体质粒中的左右同源臂的DNA片段、含有P2A-tdTomato序列的DNA片段和含有hGH polyA信号序列的DNA片段克隆到质粒PL552的多克隆位点中。
为了构建AAVS1-neo-CAG-ChR2-EYFP供体质粒，本发明人从 pAAV-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP(Addgene质粒#26973)扩增出ChR2-EYFP 基因替换了AAVS1-Neo-CAG-Flpe-ERT2质粒(Addgene质粒#68460)中的 FlpeERT2基因。
为了构建AAVS1-pur-CAG-Bi-DREADD供体质粒(AAVS1-pur-CAG- hM3Dq-mcherry-P2A-HA-KORD)和AAVS1-pur-CAG-mCherry供体质粒，本发明人从AAVS1-pur-CAG-hM3Dq-mCherry(Addgene质粒#80948)，分别扩增了mCherry或hM3Dq-mCherry，从 pAAV-hSyn-dF-HA-KORD-IRES-mCitrine(Addgene质粒#65417扩增了 HA-KORD。两个DREADD基因、hM3Dq-mcherry和HA-KORD通过P2A进行连接(hM3Dq-mcherry-P2A-HA-KORD)以确保这两个基因在同一细胞中同时表达，最后用hM3Dq-mcherry-P2A-HA-KORD或mCherry基因取代 AAVS1-pur-CAG-EGFP中的EGFP。SA-Neo，在剪接受体序列后先后连接T2A 自裂解肽序列和新霉素抗性基因。CAG，人工合成的具有肌动蛋白增强子和巨细胞病毒早期启动子的CAGGS启动子。
电穿孔和人胚胎干细胞报告细胞系的构建
H9 hESCs用Rho激酶(ROCK)抑制剂预处理6-8小时(0.5mM)。然后用 TrypLETMExpress Enzyme消化成单细胞。并在500mL电穿孔缓冲液(5mM KCl，5mM MgCl2、15mMHEPES，102.94mM Na2HPO4和47.06mM NaH2PO4， pH＝7.2)中加入合适配比的质粒，在0.4cm电转杯(Phenix Research Products) 中，用Gene Pulser Xcell(Bio-Rad)以250V，500mF的条件进行电穿孔，然后将细胞接种在6孔板的MEF饲养层上，用含有ROCK抑制剂的培养基进行培养。每天用MEF滋养过的ESC培养基(CM)换液。72小时后，将嘌呤霉素(0.5μg /ml)或G418(50-100μg/ml)加入到CM中，筛选两周。筛选后，将细胞用ROCK 抑制剂预处理6-8小时，然后挑取单克隆。通过基因组PCR来鉴定外源基因是否整合。
为了构建TH-iCre敲入hESC品系，用CRISPR在H9 ESCs的内源TH基因的STOP密码子紧接上游敲入了包含一个P2A连接的密码子优化的Cre重组酶(iCre)基因和STOP密码子，然后是两侧带有FRT的PGK-Puro序列(PGK 启动子驱动的Puro)。然后通过瞬时表达Flpo将两侧带有FRT的PGK-Puro去除。
为了构建TH-tdTomato/AAVS1-ChR2-EYFP hESC系，用CRISPR在H9 ESCs的内源TH基因的STOP密码子紧接上游敲入了包含一个P2A连接的密码子优化的tdTomato基因和STOP密码子，随后是polyA序列和PGK-Pur序列，然后通过TALEN将ChR2表达盒敲入AAVS1基因座。为了构建 Bi-DREADD或mCherry hESC细胞系，通过TALEN将 hM3Dq-mCherry-P2A-HA-KORD或mCherry表达盒插入H9 hESC的AAVS1 基因位点。
全细胞膜片钳和脑切片记录
移植后3个月和6个月，使用Leica VT1200S震动切片机预冷的切片液中，制备前脑或中脑水平的350μm厚的冠状脑切片(切片液的组成：100mM glucose，75mM NaCl，26mMNaHCO3、2.5mM KCl，2mM MgCl2-6H20、 1.25mM NaH2PO4-6H20和0.7mM CaCl2)。然后将脑片转移到含饱和95％O2 /5％CO2的人工脑脊液ACSF中孵育(ACSF其组成为：124mM NaCl，4.4mM KCl，2mM CaCl2、1mM MgSO4、25mM NaHCO3、1mM NaH2PO4和10mM glucose)使其恢复1h后再记录，电流信号通过Axon 700B放大器(Axon)记录。脑片记录外液与脑片孵育液均为ACSF，记录电极(3-5MΩ)，内含电极内液， (内液组成为：112mM Cs-Gluconate，5mM TEA-Cl，3.7mM NaCl，0.2mM EGTA，10mM HEPES，2mM MgATP，0.3mM Na3GTP和5mM QX-314(用CsOH调节至pH 7.2)用于自发性兴奋性突触后电流(sEPSC)和自发性抑制性突触后电流(sIPSC)记录。对于sEPSC或sIPSC记录，将细胞分别钳位到60mV 和0mV。在整个实验过程中膜电阻Rm保持在15-30MΩ。记录过程中Rm变化大于15％的细胞将被丢弃。数据采集的滤波为1kHz，采样频率为10kHz。在电流钳状态下，记录蓝光刺激(473nm，频率5Hz，光强10mM/mm2)或去极化电流(0-100pA，步阶10pA，持续时间2s)诱导的动作电位(APs)。在电流钳模式下分别将90pA或120pA电流注入移植或内源性mDA神经元中进行 Sag检测。通过EYFP阳性的移植细胞中tdTomato荧光信号来区分mDA神经元和非mDA神经元。
病毒注射和狂犬病毒追踪实验
对于狂犬病毒追踪实验，200nL表达Cre诱导的TVA和tdTomato的AAV 病毒，(AAV2/9-Ef1a-DIO-TVA-2A-NLS-tdTomato，效价1.29*10^12基因拷贝(gc)/ml)，或将200nL表达Cre诱导的狂犬病糖蛋白(AAV2/9-Ef1a-DIO-G，滴度1.29*10^12gc/ml)的AAV共注入移植后5个月的PD小鼠的移植部位(黑质：AP＝2.9mm，L＝1.1mm，V＝4.4mm，垂直深度从头骨计算；纹状体： AP＝+0.6mm，L＝1.8mm，V＝3.2mm，垂直深度从硬脑膜计算)。3周后，将 EnVA假型、狂犬蛋白G缺失、表达EGFP的狂犬病病毒(RVdG-EGFP，400nl，效价2*10^8pfu/ml)注射到同一位点以进行反突触标记。一周后，处死小鼠以进行组织学分析。对于内源性mDA神经元，将病毒注射到DAT-Cre/Ai9小鼠的SNc(AP＝2.9mm，L＝1.1mm，V＝4.5mm，垂直深度从头骨计算)。固定后，用冷冻切片机进行切片(30毫米厚)。用荧光显微镜(Olympus VS120)通过20倍物镜对所有未染色的冠状切片(1：4series)成像。使用VS-ASW(Olympus) 软件使用10％的重叠率自动拼接平铺的图像。根据Paxinos和Franklin(2007)，使用Photoshop手动标记了标记的神经元的位置和大脑区域的轮廓。一些部分进行了免疫染色以阐明细胞身份。
组织制备和免疫组织化学
用过量的戊巴比妥(250mg/kg，腹腔内)处死动物，并先用盐水灌注，再用4％冰冷的磷酸盐缓冲的多聚甲醛(PFA)灌注。取出大脑并将其依次浸入20％和30％的蔗糖中直至沉没。在冷冻切片机(Leica SM2010R)上，以30mm的厚度切下连续矢状(从内侧到外侧0.12至3.12mm)或冠状(从Bregma 1.42至0.10 mm)切片，并在20℃下保存在冷冻保护剂溶液中。将漂浮的脑片与一抗在4℃中孵育1-2晚，然后除去未结合的一抗。对于DAB染色，将切片与相应的生物素化二抗孵育1h，然后在室温下与抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶孵育 1h。用DAB染色试剂盒观察免疫反应性。然后将切片用乙醇脱水，在二甲苯中透化，并固定在中性树脂中。为了进行荧光免疫标记，将切片与相应的荧光二抗在室温下孵育1小时。然后通过Fluoromount-G进行封片。
慢病毒包装
通过使用磷酸钙/DNA共沉淀法转染包装质粒和骨架质粒，在293T细胞中产生慢病毒。293T细胞在含有10％FBS的Dulbecco MEM(DMEM)中培养。转染72小时后，收集含有病毒颗粒的上清液，并在4℃以27000rpm超离心2 小时浓缩。然后将病毒颗粒重悬于DPBS中。
成像和细胞定量
为了量化TH细胞中表达EN1，FOXA2，LMX1A，NURR1，GIRK2和 TUJ-1的细胞的数量或TH细胞的比例，使用ImageJ软件对至少5张从盖玻片中随机选择的图像进行计数。数据重复三次，并表示为平均值±SEM。为了测量大脑切片中的人源纤维密度，使用Nikon TE600或Olympus VS120显微镜捕获平铺图像。通过图像处理和分析系统(Image Pro Plus 5.1软件)测量了人脑在小鼠大脑不同区域的光密度。数据显示为不同区域的光密度。对于TH，GIRK2，LMX1A，人细胞核(hN)和FOXA2染色，用尼康A1R-Si激光扫描共聚焦显微镜(尼康)或荧光显微镜(奥林巴斯VS120)通过60倍物镜勾勒并捕获移植物。用ImageJ手动计数单染或双染细胞。数据表示为TH-，LMX1A-， FOXA2-与总hN的比例，或GIRK2/TH/hN与TH/hN细胞的比例。所有数据均表示为平均值±SEM。
行为测试：旋转测试
在移植前以及移植后每月至6个月对苯丙胺诱导的旋转进行测试。腹膜注射苯丙胺(2mg/ml生理盐水中，5mg/kg)5-10分钟后，通过摄像机记录1.5 小时。数据表示为90分钟内每分钟的平均净转数。
对于自发旋转测试，在注射CNO(1.2mg/kg)20分钟，SALB(5mg/kg)5分钟或盐水20分钟后，记录动物60分钟。
行为测试：圆柱体实验
将个体动物放在玻璃圆筒中，并用照相机记录3分钟。计算小鼠脑损伤同侧和对侧的爪子与圆柱体壁接触的次数。数据表示为同侧触摸占总触摸次数的百分比。为了进行药物治疗，在圆筒实验之前，先对动物进行CNO(1.2mg /kg)处理20分钟，SALB(5mg/kg)处理5分钟或用盐水处理20分钟。
行为测试：转棒实验
利用转棒(Med Associates Instruments)测试运动协调性。所有动物都进行了为期两天的预训练，以达到稳定的表现。在第1天，在转棒上训练小鼠，该转棒在300s的时间内从每分钟2(rpm)加速到20rpm，共进行了3次。在第 2天，在300s的时间内对小鼠进行两次从3rpm加速到30rpm，一次从4rpm 加速到40rpm的转棒训练。从第3天开始在转棒上进行测试，该转棒在300s 的时间内从4rpm加速到40rpm。监测小鼠停留在杆上的时间。将每只动物的三次重复测试的平均持续时间用于数据分析。
量化和统计分析
使用SPSS软件进行统计分析。在所有研究中，均通过Student-T检验，配对t检验，双因素方差分析，Holm-Sidak检验，Two-way RM ANOVA和 Tukey’s post hoc检验或One-way ANOVA和Holm-Sidak检验进行数据分析。统计学显著性确定为p<0.05。
本发明的各个缩写的英文注释如表1。
表1
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实施例1、移植的人多巴胺能神经元和谷氨酸能神经元投射到不同的脑区
在发育过程中，轴突的定向投射通常取决于细胞的内在特性。为了了解在成年脑内，细胞的内在特性是否依然能够决定细胞的投射靶标，本发明人将hESC分化得到的mDA或前脑谷氨酸能神经元前体细胞移植进PD模型小鼠的中脑。本发明人的方法能够将hESC分化为mDA或Glu的神经前体细胞。在mDA神经元分化的第32天(移植当天)，大多数前体细胞表达底板和中脑标志物CORIN，FOXA2，LMX1A，和EN1(图8A和8C)。到第42天，总细胞中69％或TUJ1+神经元中84％的细胞表达酪氨酸羟化酶(TH)以及EN1， FOXA2，LMX1A和NURR1(图8D和8F)，表明mDA神经元特性。此外，大多数TH+神经元共表达A9 mDA神经标记物GIRK2(>85％)，但较少表达A10 mDA神经标记物Calbindin(CALB)(15％)(图8D和8F)。因此，大多数TH+ 神经元具有A9 mDA神经元特征。在Glu神经元分化的第32天，大多数细胞表达背侧前脑标志物PAX6和前脑标志物FOXG1，表明了它们是背侧前脑神经前体细胞(图8B和8C)。到第42天，有82％的细胞为vGLUT1阳性，并且这些神经元中的大多数表达CTIP2(>80％)或TBR1(>85％)，表明分化得到的是前脑皮质的5/6层的Glu神经元(图8E和8F)。
之后，本发明人将mDA(图1A)或Glu前体细胞(图1B)移植进入PD小鼠的SN脑区。移植后6个月，所有移植动物中均存在移植细胞。mDA神经元移植脑的连续矢状切面显示，大部分hNCAM+神经纤维都分布在尾状壳(CPu) 中(图1A和1D)，该区域主要由A9 mDA神经元支配(Bjorklund和Dunnett， 2007)。从三个代表性矢状平面对hNCAM+纤维密度进行定量分析(图1C)，表明在CPu脑区，平面L2.16中的有72％hNCAM+纤维总量，平面L1.44中有 62％，平面L0.72中有45％(图1E)。在嗅结节Tu(17％–20％)和伏隔核(Acb； 9％-16％)中检测到较少的hNCAM+纤维，这些脑区主要接收A10 mDA神经元投射。其余区域，包括杏仁核和皮质，占总纤维的不到15％(图1E)。在纹状体内，人源纤维在平面L0.72和L1.44上分别有72％和87％投射到背侧纹状体 (CPu)(图1F)。hNCAM+纤维的分布模式，尤其是在CPu中，与正常动物中内源性TH+纤维的分布模式相似(图1D和8G)。
相反，Glu神经元的轴突生长是局部的，投射在整个中脑(图1B)。它们也向远处发出轴突，但主要是到达杏仁核，嗅球(OB)，无症状性物质(SI)和大脑皮层，而在CPu仅检测到一小部分的hNCAM+纤维(2％–8％)(图1B，1D和 1E)。
综上所述，这些结果表明，移植的人类神经前体细胞分化为各自的神经元类型，而轴突则投射到为不同的大脑区域。
实施例2、移植的人mDA神经元投射经过同源的途径
从连续矢状切面(图2A)显示，移植的mDA神经元沿着清晰界定的沿前脑内侧束(MFB)延展了延髓部的轴突(图2B，L1.08和红色箭头在图2C中)。从侧面看，它们延伸穿过SI(图2B，L1.44)和杏仁核(图2B，L2.04)。从喙吻侧看，hNCAM+纤维穿过了Acb(图2B-2E)，其中大部分hNCAM+纤维沿着皮层和纹状体之间的边界进入CPu(图2A和图2D中的红色箭头)。在皮质中检测到少量hNCAM+纤维(图2D和2F中的蓝色箭头)。这些结果表明，移植的mDA 神经元的大多数轴突投射均遵循内源性黑质-纹状体途径。
在背侧/外侧纹状体中，密集的hNCAM+纤维呈现分枝状，形成密集的分枝状网络(图2D–2F和图9A)。在Tu(图2C和2D)中也观察到了轴突的分支，但在Acb，杏仁核和MFB(图9B)中未观察到轴突的分支，表明投射特异的轴突分支。用STEM121染色的大多数人纤维都呈TH阳性(图2G和2H)，表明这些神经纤维是多巴胺能。在OB和皮层中观察到了来自移植的Glu神经元 hNCAM+纤维的分支(图9C)。
对mDA移植物的免疫组织化学分析表明68％的移植细胞共表达TH和人细胞核(hNs)，并且大多数TH+细胞也表达GIRK2以及FOXA2和LMX1A(图9D–图9F)，暗示了A9 mDA特性。人特异性突触素(hSyn)点沿CPu中的TH+ 的纤维分布，其中一些位于GABA+细胞体上(图9G)。相比之下，在前脑神经元移植组中几乎没有观察到hSyn+突触，并且几乎没有定位在GABA+细胞体上的(图9H)。这些结果表明，移植的人mDA神经元与宿主脑中的靶细胞之间能够形成突触连接。
实施例3、遗传标记揭示人类mDA神经元的特定轴突神经分布
为了阐明由移植的mDA神经元引起的特定轴突神经分布，本发明人建立了一个带有tdTomato表达的TH报告基因hESC系，概括了内源TH基因的表达(方法详细信息)。本发明人进一步将ChR2-EYFP融合蛋白表达盒敲入 AAVS1基因位点，以实现特定的标记和对已移植人细胞的操纵(图3A，3B， 10A和10B)。最终的hESC，称为TH-tdTomato/AAVS1-ChR2-EYFPhESC，在整个mDA神经元分化过程中结构性表达ChR2-EYFP，而tdTomato仅在mDA神经元分化的后期表达(图10C)，并且仅在TH+mDA神经元中表达(图 3C和10D)，强调了TH+细胞的特异表达。
然后，本发明人将源自TH-tdTomato/AAVS1-ChR2-EYFP hESC的mDA 前体细胞移植到PD模型小鼠的SN或纹状体中(图3A)。移植六个月后，所有移植动物中都出现了EYFP+移植细胞(图3D)，而tdTomato仅在TH+mDA 神经元中表达，而不在非mDA神经元中表达；例如5-HT+神经元(图10E和 10F)。SN细胞移植的大脑连续冠状切片显示，大多数人mDA神经元投射分布在CPu中，在那里，纤维形成了密集且分支的网络(图3E，b和c)。Acb 中仅存在一小部分mDA神经元投射(图3E，切片1-3)。在这些冠状切片(图3E，切片1和2，a和b，红色虚线箭头)中，确定了mDA神经元轴突的延髓投射路径。tdTomato+投影显示STEM121呈阳性(图3F)，证实了是人细胞来源。这些结果验证了hNCAM染色显示的来自移植人mDA神经元的特异性轴突寻路和靶向作用(图1和2)。在纹状体移植中，tdTomato+mDA神经元纤维占据了整个CPu，并且大多数纤维都局限于CPu中(图3G，3H和10G)。在黑质移植中，tdTomato+纤维显示出仅限于周围移植物的大量树突生长(图3I)，表明人mDA树突和轴突的细胞和靶标特异性分支。此外，hESC衍生的多巴胺 (DA)神经元分布在纹状体和黑质移植物的周围(图3H和3I)，这一现象与PD 患者的人胎脑移植极为相似。
细胞特征(图8D，9D和9F)和特定的投射(图1、2和3)表明本发明人的 mDA神经元类似于SN pars compacta(SNc)中的神经元。利用遗传报告基因，本发明人在mDA神经元(EYFP+/tdTomato+)和非mDA神经元(EYFP+/ tdTomato+)上进行了全细胞膜片钳记录(图10H)。本发明人发现，纹状体或黑质移植物中的人mDA神经元和非mDA神经元在移植后3个月内显示出电流或蓝光诱导的动作电位(AP)和自发AP(sAP)(图3J和11A–11F)，提示移植人神经元的功能成熟。重要的是，移植到纹状体和黑质中的人mDA神经元的sAP 表现出规律的放电，放电频率低(纹状体组0.87±0.20Hz，黑质组0.83±0.15Hz) 和亚阈值振荡电位慢(0.29)纹状体组为±0.06Hz，黑质组为0.26±0.13Hz(图3J， 11G和11H)。移植6个月后，在人mDA神经元的sAP中观察到明显的超极化(AHP)(图11I和11J)。这些生理特征与内源性SNc(A9)mDA神经元的特征一致(图3J；Guzman et al.,2009；Lammel et al.,2008；Nedergaard et al.,1993). 此外，与非mDA神经元相比，移植的mDA神经元在移植后6个月的纹状体或黑质移植物中显示出更高的膜电容(Cm)和更低的神经元输入电阻(Rm)趋势 (图11K和11L)。此外，内源性SNc mDA神经元的特征在于响应超极化电流注入时的凹陷幅值(Evans et al.,2017；Lammel et al.,2008；Neuhoff et al., 2002)。使用mDA神经元报告基因小鼠(DAT-Cre/Ai9)，本发明人发现所有记录的SNc神经元在阈值以下范围(37.2±3.8mV，n＝15/15)中都显示出典型的凹陷幅值(图3K和3M))。但是，在11个内源性VTA mDA神经元中，只有5 个显示电压凹陷，其幅度要小得多(23.0±1.6mV，n＝5/11)(图3K和3M)。有趣的是，纹状体中移植的人mDA神经元显示出明显的电压凹陷(32.5±3.3mV， n＝13/16)。相比之下，在29个移植的非mDA神经元中，只有11个显示出电压凹陷，其幅度小得多(14.9±2.9mV，n＝11/29)(图3L和3M)。
这些结果表明，移植的人mDA神经元具有A9 mDA神经元的功能特征。
实施例4、结构学上人神经元的突触输入与移植部位有关
狂犬病病毒介导的追踪已被用来追踪PD模型中移植细胞的解剖学输入。为了揭示移植的人mDA神经元的突触前信号输入，本发明人将Cre-loxP基因表达系统与狂犬病病毒介导的突触追踪相结合(图4A)。本发明人建立了 TH-iCre hESC系，使Cre重组酶在表达TH的细胞中直接表达而不会破坏内源 TH的表达(图4B，12A和12B)。通过用表达Cre依赖性mCherry的慢病毒感染TH-iCre hESC衍生的神经元培养物后，TH+mDA神经元中唯一的mCherry 表达，证明了该系统的特异性(图12C和12D)。将TH-iCre mDA前体细胞移植到PD小鼠的黑质或纹状体中五个月后，表达AAV的Cre依赖TVA和 NLS-tdTomato(AAV-DIO-TVA-2A-NLS-tdTomato)以及表达Cre的AAV依赖狂犬病糖蛋白(G)(AAV-DIO-G)被共注入到移植部位(图4A)。一个月后，将表达EGFP(RVdG-EGFP)的EnvA假型和G缺失的狂犬病病毒注入移植部位(图 4A)。因为仅移植的人mDA神经元表达Cre重组酶，所以TVA，tdTomato和 G的表达仅限于人mDA神经元，而非mDA神经元。实际上，tdTomato仅在 TH+人mDA神经元中表达(图12E)。因为RVdG-EGFP仅感染表达TVA的 (tdTomato+)人类mDA神经元，所以移植的起始人类mDA神经元共表达EGFP 和tdTomato。在移植的人mDA神经元中G的共表达使RVdG-EGFP突触地传播到它们的突触前伴侣(Wickersham et al.,2007)；因此，宿主突触前神经元仅表达EGFP(图4A)。
起始神经元(EGFP+/tdTomato+)仅在人移植细胞中发现，并且是TH+(图 4C和4D)。经突触标记的宿主神经元(EGFP+/tdTomato+)在远离移植的大脑区域很容易被检测到(图4E)。在经移植的大脑中，在纹状体中发现了标记最丰富的宿主神经元，包括CPu和Acb(图4E-4G)。CPu中标记的宿主神经元表达 GABA和DARPP32，提示是纹状体中棘神经元(图12F)。在Acb中，标记的宿主神经元形成斑块，在不同样本中观察到这一现象(图4H)。在皮层区域，CTIP2+和SATB2+皮层神经元被发现投射到人黑质mDA神经元(图4E-4G和 12F)。在下丘脑区域，下丘脑外侧(PLH)的花梗部分和下丘脑室旁核(Pa)强烈投射到SN的人mDA神经元上。在末端纹状体(ST)和杏仁核中央(Ce)的床核中也发现了标记密集的宿主神经元，但在其他杏仁核区域则没有(图4E-4G)。此外，在苍白球(GP)，腹侧苍白球(VP)和延伸杏仁核(EA)中观察到分散的神经元。在更多的尾部区域，背缝(DR)，导水管周围灰色(PAG)。桥脑网状核(Pn)包含大量标记的神经元(图4E-4G)。本发明人在DR中发现了投射到SN中人 mDA神经元的5-HT+神经元(图12F)。移植的人mDA神经元的突触前输入分布，与DAT-Cre小鼠中内源性SNcmDA神经元上的分布惊人地相似，后者在 DA神经元中表达Cre(图12G和12H)，并且在Acb中也观察到了呈片状分布输入的内源性mDA神经元。
在纹状体移植的大脑中，在CPu中发现了密集的突触前输入，但在Acb 中却未发现。与黑质移植的人mDA神经元相比，在GP和皮质区域观察到了更多的输入。束旁丘脑核(PF)和腹中丘脑核(MD)倾向投射到纹状体人DA神经元上。在纹状体移植的大脑中Ce和SN网状部分(SNR)中也发现了标记的宿主神经元。在尾脑较多的区域，如PAG，DR，臂旁核(PB)和Pn，几乎没有标记神经元(图4E，4F和12J)。
因此，移植于纹状体和黑质的人mDA神经元接收的输入来自不同的大脑区域，表明位置依赖的突触前输入。与内源性mDA神经元一样，黑质移植的人mDA神经元也从相似的脑区接受大量的输入。
实施例5、移植神经元的类型决定了其功能输入特性
电生理记录显示，移植后3个月，纹状体或黑质移植块中的人mDA和非 mDA神经元中几乎未检测到sEPSC和sIPSC(分别为自发性兴奋性和抑制性突触后电流)(图5A-5D)。令人惊讶的是，移植后6个月，纹状体或黑质移植块中来自mDA和非mDA神经元的sIPSCs和sEPSCs的平均频率而非幅度显著增加(图5A-5D)。移植的非mDA神经元和mDA神经元之间的sEPSC或sIPSC 上升时间或衰减时间没有差异(图13A–13F)。这些结果表明，功能输入是在3到6个月内建立的，不受移植位置或神经元类型的影响。
有趣的是，在黑质移植块中，mDA神经元中的sIPSC频率高于非mDA 神经元中的sIPSC频率(图5C)。相比之下，纹状体和黑质移植块中，mDA神经元中的sEPSC频率显著低于非mDA神经元中的sEPSC频率(图5D)。通过计算sIPSC/sEPSC比，本发明人发现，移植的人mDA神经元接收的抑制输入更多，其sIPSC/sEPSC比为3.28，与内源性mDA神经元的模式相似，而人非 mDA神经元受到的抑制/兴奋性输入，sIPSC/sEPSC比为0.95(图5E和13G)。与非mDA神经元相比，人mDA神经元的sIPSC/sEPSC比值更高(2.61)的趋势在纹状体移植块中也观察到(图5E)，而内源性纹状体神经元接受了更多的兴奋性输入，sIPSC/sEPSC比为0.86(图5E和13H)。
这些结果表明，移植神经元的类型而不是移植部位，决定了移植神经元的抑制性和兴奋性输入特征。
实施例6、mDA而非Glu神经元的移植可纠正PD小鼠的运动障碍
移植前和移植后每4周通过苯丙胺诱导的旋转，旋转试验和圆柱体试验评估了黑质移植细胞的功能效果(图6A)。纹状体移植细胞的PD小鼠对于苯丙胺诱导的旋转，于3个月开始恢复，并在移植后4个月恢复。随着时间的流逝，小鼠通过向对侧旋转逐渐显示出过度补偿(图6B)。4-5个月后，在黑质移植mDA的PD小鼠中也观察到了功能恢复；但是，到6个月过度补偿消失(p <0.001；图6B)。相反，那些黑质接受了谷氨酸神经元或人工脑脊髓液(ACSF；对照)的小鼠在苯丙胺诱导的旋转中没有显示出任何恢复的迹象(p>0.05；图 6B)。
在用于评估运动协调和平衡且不依赖于多巴胺能系统药理刺激的旋转试验中，在接受了人mDA神经元黑质或纹状体移植的PD小鼠中，跌落的时长随时间的推移而显著增加(p<0.001)，但接受黑质Glu神经元或ACSF的小鼠则没有(p>0.05；图6C)。
在圆柱体试验，一种测量前肢运动能力的方法，所有组在6-OHDA损伤后均表现出优先的同侧肢体触碰。在黑质或纹状体移植人mDA后4个月，小鼠同侧接触偏好显著降低(接近50％)(p<0.001)，但黑质移植Glu神经元或 ACSF的小鼠却没有改变(p>0.05；图6D)。
实施例7、运动恢复取决于黑质-纹状体神经环路的功能重建
为了确定PD模型动物的行为恢复是否取决于重建的黑质-纹状体环路，本发明人将移植的源自hESC的mDA神经元设置了“双向开关”(图7A)。本发明人建立了一种称为Bi-DREADD-hESCs的hESC细胞系，通过在AAVS1基因座中插入两个DREADD(由药物专门激活的受体)，分别为由CNO激活的兴奋性hM3Dq受体(Alexander等，2009)和由Salvinorin B(SALB)激活的KORD 抑制性受体(Vardy等，2015；图7B，14A和14B)。将mCherry表达敲入AAVS1 基因座的hESC(mCherry-hESCs)作为对照(图7B，14A和14B)。在培养中或移植后从Bi-DREADD-hESC或mCherry-hESC衍生的神经元中很容易检测到转基因的表达(图7C，7D和14C-14G)。移植后六个月，Bi-DREADD组和 mCherry(对照组)组观察到运动恢复，这是由苯丙胺诱导的旋转减少和同侧接触偏好降低所证实的(p<0.05；图7E-7G)。
使用不需要安非他明刺激DA释放的圆柱体试验和自发旋转试验，本发明人发现CNO(1mg/kg)处理可进一步降低同侧的优先接触(p<0.05；图7H)，而SALB(5mg/kg)处理增加了使用Bi-DREADD移植的相同动物的同侧触觉 (p<0.01；图7H)。CNO或SALB处理对接受表达mCherry的小鼠的同侧接触没有影响(p>0.05；图7H)。在自发旋转测试中，对照小鼠未显示明显的运动平衡变化。但是，在用Bi-DREADD细胞移植的小鼠中，CNO处理显著诱导了比同侧旋转更多的对侧旋转(p<0.01)(图7I)，同侧旋转比从48.49±8.10下降到34.83±6.23(p<0.05；图7J)。相反，SALB显著增加了同侧净旋转(p<0.05)，同侧旋转比从48.49±8.10增至58.42±9.91(p<0.01；图7J)。无论有无CNO或 SALB处理，mCherry小鼠均未显示明显变化(p>0.05；图7I和7J)。
这些结果表明，前肢运动障碍的恢复和不对称旋转取决于移植细胞的活性。
讨论
在本发明中，开发了遗传标记策略，以精确地绘制PD小鼠模型中来自移植的人源mDA神经元的投射和突触输入。本发明人发现，移植到黑质中的人源mDA神经元特异投射到背侧纹状体。狂犬病病毒介导的追踪显示，移植的 mDA神经元以与内源性mDA神经元极为相似的方式接受突触输入。电生理记录显示，主要是对移植的mDA神经元的抑制性输入，似乎取决于细胞的类型，而不取决于移植部位。通过突触前和突触后整合，原位移植的人源mDA神经元可以根据移植细胞的活性来挽救PD小鼠的运动功能障碍。这些发现揭示了移植神经元与细胞类型相关的功能性回路整合，突出了使用干细胞的特定神经元类型修复神经回路以治疗神经系统疾病的前景。
什么决定了成熟的大脑中移植神经元的靶向投射仍然未知。通过将两种类型的投射神经元mDA和Glu神经元移植到PD小鼠的黒质中，本发明人发现两种神经元类型都可以通过很长的路径投射轴突，但是会通过不同的途径将轴突投射到不同的靶标上，其中大多数的移植的mDA神经元轴突投射到 CPu。通过使用TH报告细胞系进一步证实了这一点，该报告细胞显示出几乎排他的投射到背侧(CPu)，而非腹侧纹状体(Acb)。因为CPu是SNc(A9)mDA神经元的主要靶标(Bjorklund和Dunnett，2007；Joel和Weiner，2000)，所以本发明人的发现表明，人源mDA神经元大多是A9mDA神经元。确实，本发明人的细胞特征，尤其是电生理记录证实了人源mDA神经元的A9类型。这种解释表明，在先前的研究中看到的许多到其他大脑区域的轴突投射可能来自非mDA神经元。总之，这些结果强烈表明投射路径和投射靶脑区很大程度上取决于移植神经元的类型。
正确将突触输入到移植神经元中对于恢复丢失的功能也很关键。在本发明中，TH-iCre系统能够特异的识别移植到人源mDA神经元的单突触输入，从而揭示出一种有趣的模式。从总体上看移植物，解剖上的突触输入似乎与移植位置有关，即使向黑质和纹状体移植的mDA神经元从重叠区域(如背侧纹状体)接受输入，类似于Adler等人的观察。但是，移植的人源mDA神经元和内源mDA神经元的输入的惊人相似性表明，细胞类型在决定突触输入中发挥着作用。这在功能级别上显示得更清楚。与非mDA神经元相比，移植的 mDA神经元接受更多的抑制性但较少的兴奋性输入，而与是否将细胞移植到纹状体或黑质中无关，这表明移植的神经元的类型决定了功能性突触输入。
通过移植的mDA神经元的突触前和突触整合，可以自然地认为重建的黑纹-状体环路有助于PD小鼠的运动恢复。已经证明，移植到纹状体中的人类 mDA神经元在功能上与纹状体神经元相连，并使用光遗传学和化学遗传学工具促进动物行为的恢复。在当前的研究中，使用Bi-DREADD策略可以在相同的移植细胞上激活和抑制，这清楚地证明了重建的黑质-纹状体环路是有功能的，这是PD小鼠行为恢复的基础。
结合精确的基因标记和功能检测，本发明人发现，成熟脑中移植细胞对神经环路的恢复(包括寻路，靶向特异性和功能输入建立)很大程度上取决于移植神经的内在特性。因此，至关重要的是移植高度富集，命运决定的神经前体细胞，以重建特定环路以达到治疗效果。因此，基于细胞的疗法来治疗神经系统疾病是现实的。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (20)

1.一种制备中脑黑质多巴胺能神经细胞的方法，包括：
(1)将干细胞置于包含神经诱导剂的培养基中，在多阶段中以添加组分分别进行诱导；以及
(2)从培养物中获得所述干细胞来源的中脑黑质多巴胺能神经细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，在多阶段中以不同的添加组分进行诱导：
第一阶段：添加SB431542，DMH-1，SHH和CHIR99021；
第二阶段：添加SAG，SHH和CHIR99021；
第三阶段：添加SHH，SAG和FGF8b；
第四阶段：添加SHH和FGF8b。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在多阶段中以不同的添加组分进行诱导时：
第一阶段：添加1～15μM DMH-1，200～1000ng/mL的SHH，0.1～1μM的CHIR99021；
第二阶段：添加0.1～5μM的SAG，50～300ng/ml的SHH，0.1～1μM的CHIR99021；
第三阶段：添加5～100ng/ml的SHH，0.1～5μM的SAG，5～200ng/ml的FGF8b；
第四阶段：添加5～100ng/ml的SHH，5～80ng/ml的FGF8b。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在多阶段中以不同的添加组分进行诱导时：
第一阶段：添加10±5μM的SB431542，2±1μM的DMH-1，添加500±200ng/ml的SHH，0.4±0.2μM的CHIR99021；
第二阶段：添加2±1μM的SAG，100±50ng/ml的SHH，0.4±0.2μM的CHIR99021；
第三阶段：添加20±10ng/ml的SHH和0.5±0.2μM的SAG，100±50ng/ml的FGF8b；
第四阶段：添加20±10ng/ml的SHH，20±10ng/ml的FGF8b。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，各阶段中，
第一阶段：培养起始至培养6～8天；较佳地7±0.5天；
第二阶段：培养6～8天至培养11～13天；较佳地12±0.5天；
第三阶段：培养11～13天至培养18～20天；较佳地19±0.5天；
第四阶段：培养18～20天至培养31～33天；较佳地32±0.5天。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的干细胞包括：胚胎干细胞或诱导性多能干细胞；较佳地，所述干细胞为人干细胞，所述胚胎干细胞或诱导性多能干细胞为人胚胎干细胞或人诱导性多能干细胞。
7.一种中脑黑质多巴胺能神经细胞，其由权利要求1～6任一所述的方法制备获得。
8.一种中脑黑质多巴胺能神经细胞，所述的中脑黑质多巴胺能神经细胞在分化5～10天后，表达中脑黑质多巴胺能神经元的表面分子标记物，包括酪氨酸羟化酶，FOXA2，EN1，LMX1A，NURR1和/或GIRK2，而很少表达腹侧被盖区多巴胺能神经元标记物CALB。
9.如权利要求7或8所述的中脑黑质多巴胺能神经细胞，其特征在于，所述的中脑黑质多巴胺能神经细胞移植到脑的黑质区后，移植后分化获得的A9中脑多巴胺能神经元轴突特异性投射到内源黑质多巴胺能神经元支配的靶脑区-背侧纹状体；和/或
移植后分化获得的A9中脑多巴胺能神经元自身呈现内源黑质多巴胺能神经元的经典的电生理特性；包括低频的自发放电频率，超极化电流刺激可以诱导出sag；和/或
移植后分化获得的A9中脑多巴胺能神经元到脑的黑质或纹状体，可以改善运动功能障碍。
10.如权利要求7或8所述的中脑黑质多巴胺能神经细胞，其特征在于，所述中脑黑质多巴胺能神经细胞为A9中脑多巴胺能细胞；较佳地，其在分化5～10天后，大于80％表达A9mDA神经元标记物GIRK2；更佳地大于85％表达A9 mDA神经元标记物GIRK2。
11.如权利要求7或8所述的中脑黑质多巴胺能神经细胞，其特征在于，在分化5～10天后，总细胞中40％以上或TUJ1+神经元中50％以上的细胞具有该特征；更佳地，总细胞中50％以上或TUJ1+神经元中60％以上的细胞具有该特征。
12.一种中脑黑质多巴胺能神经元，其由权利要求7～11任一所述的中脑黑质多巴胺能神经细胞分化获得；较佳地，其表达中脑黑质多巴胺能神经元的表面分子标记物，包括TH，FOXA2，EN1，LMX1A，NURR1和/或GIRK2，而很少表达腹侧被盖区多巴胺能神经元标记物CALB。
13.权利要求7～11任一所述的中脑黑质多巴胺能神经细胞在制备治疗神经退行性疾病的制剂中的应用。
14.一种用于治疗神经退行性疾病的制剂，其包括：权利要求7～11任一所述的中脑黑质多巴胺能神经细胞；以及，药学上可接受的载体。
15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述制剂还用于：
作为进行大脑黑质区或纹状体移植的移植物；
防治运动功能障碍。
16.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述神经退行性疾病包括：帕金森症，阿尔茨海默症，路易体痴呆，亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症、神经损伤。
17.一种筛选改善神经退行性疾病的物质的方法，所述方法包括：
(1)用候选物质处理一模型体系，该模型体系为大脑神经环路受损或神经功能受损的模型体系，且含有中脑多巴胺能神经元；和
(2)检测所述模型体系，若所述候选物质在统计学上促进多巴胺能神经元对于大脑中受损神经环路或促进其重塑神经功能，则该候选物质是对于修复大脑中受损神经环路或重塑神经功能有用的物质。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述模型体系为动物模型体系，组织模型体系，器官模型体系，细胞模型体系。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，包括：
观测所述候选物质对于中脑多巴胺能神经元的影响，若能促进中脑多巴胺能神经元对于黑质-纹状体通路的修复，则其是对于修复大脑中受损神经环路或重塑神经功能有用的物质；或
观测所述候选物质对于中脑多巴胺能神经元的影响，若能促进中脑多巴胺能神经元的突触前和突触后整合，则其是对于修复大脑中受损神经环路或重塑神经功能有用的物质；或
观测所述候选物质对于中脑多巴胺能神经元的影响，若能促进中脑多巴胺能神经元轴突投射到背侧，则其是对于修复大脑中受损神经环路或重塑神经功能有用的物质；或
观测所述候选物质对于中脑多巴胺能神经元的影响，若能促进中脑多巴胺能神经元长出神经纤维、沿着内源黑质-纹状体神经连接路径、特异性地生长并延伸到其内源靶区域-纹状体、和纹状体神经元形成神经连接，并投射到纹状体，则其是对于修复大脑中受损神经环路或重塑神经功能有用的物质。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述模型体系为动物体系，该动物具有运动功能障碍的特点，还包括：观测动物的运动能力，若所述候选物质进一步改善其运动功能障碍，则其是对于修复大脑中受损神经环路或重塑神经功能有用的物质。
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