JP2024513912A - ドーパミン作動性前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）及び使用方法 - Google Patents

ドーパミン作動性前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）及び使用方法 Download PDF

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Abstract

脳障害を処置するために使用され得る中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞が本明細書において提供される。改善したモノSMAD法が提供され、多能性細胞を中脳ドーパミン作動性(DA)ニューロン又は中脳ニューロン前駆体に分化させるために使用され得る。一部の態様では方法は、例えばパーキンソン病などの脳障害の処置について顕著に改善された特性を有するドーパミン作動性ニューロン前駆細胞を生成するために使用され得る、モノSMAD培養プロトコール及び培養期間について提供される。パーキンソン病及び他の脳疾患を中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞を用いて処置する方法も提供される。

Description

優先権の主張
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる2021年4月7日出願、米国仮出願第63/171,837号及び2021年11月4日出願、米国仮出願第63/275,691号への優先権の利益を主張する。
1.発明の分野
本発明は、分子生物学及び薬の分野に一般に関する。より具体的には、多能性幹細胞からニューロン前駆細胞を産生する方法及び関連する処置方法に関する。
2.関連技術の説明
パーキンソン病(PD)は、A9中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンの減少及び続くドーパミンニューロンシグナル伝達の減少による運動障害として現れる衰弱性神経変性疾患である。ドーパミン作動性薬治療及び脳深部刺激(DBS)を含む現在のPD処置は、運動症状の改善に対処している。
PDの臨床的及び社会的コストは、上昇すると予測され、現在の処置選択肢は、かなりの限界を示している。人々が高齢化し続けることから、PDは、全世界で2040年までに患者が控えめに見積もって1400万人を超えて、劇的に増加すると予測されている(Dorsey & Bloem, 2018)。PD患者は、広範な非運動特性を呈する場合があるが、明確な症状は、ドーパミン作動性黒質ニューロンの減少に続発する線条体のドーパミン作動性機能不全による進行性の運動障害である。現在の治療は、対症的で、主に運動障害の回復を中心にしている。
ドーパミンアゴニスト送達は、中程度から軽度の緩和を典型的にはもたらすだけである。L-ドーパを用いた処置は、慎重な用量管理を必要とし、通常4～6年間有効なだけであり、しばしばジスキネジアを生じる。例えば、経口L-DOPA又はドーパミン作動性アゴニストは、初期は運動症状の緩和をもたらし得るが、5～10年後に大部分の患者は、衰弱する運動症状の日内変動(motor fluctuation)及びジスキネジアを経験する(Ahlskog & Muenter, 2001)。DBSは、侵襲性の挿入物の使用を必要とし、周知の精神神経性の副作用を有し、典型的には10年未満について有効である。視床下核(STN)又は淡蒼球の内部セグメントのDBS刺激は、一部の患者ではDA減少を補えるが、このアプローチは認知機能低下を示さない若年患者のために主に示されており、定期的な電池交換が必要である。これらの処置のうちで根底にある疾患病理、mDAニューロンの進行性の減少に対処するものはない。
細胞移植治療が検証されたが、これらの努力にはかなりの制約が伴っていた。減少した細胞を置き換え、10～15年間PD運動症状の緩和をもたらす細胞に基づく治療は、PDの処置についての主要な目標である。胎児組織を使用する研究が実施された(Brundin et al., 1986、Doucet et al., 1989、Freeman, Sanberg, et al., 1995)。中脳神経前駆細胞の供給源として胎児腹側中脳(fVM)細胞を使用する研究が実施された(Barker et al., 2013)、しかし、細胞の移植を伴ういくつかの異なる研究の中の有効な結果は、混在しているか又は一貫していなかった(例えば、Barbuti et al., 2021、Barker, Drouin-Ouellet, & Parmar, 2015)。
fVM細胞への投与を伴う置き換え治療は、民族的及び技術的の両方の制約を示す。げっ歯類及びヒト胎児胎児腹側中脳(hfVM)ドナー組織由来のドーパミンニューロンは、実験動物のドーパミン枯渇線条体にグラフトされた場合に、治療的に有益であり得る(Steinbeck & Studer, 2015、Wianny & Vezoli, 2017)。非盲検hfVM試験(Freeman, Olanow, et al., 1995、Lindvall et al., 1990)での一部の患者は、臨床的改善を示した。しかし、予め定義された二次エンドポイント(統一パーキンソン病評価スケール、UPDRS)は、若年(年齢<60歳、(Freed et al., 2001))又は障害が少ない(オフでのUPDRS < 49、(Olanow et al., 2003))対象において統計的に有意な利益を示したが、無作為化二重盲検プラセボ対照臨床試験は、試験の主なエンドポイントに合致するにはこれらの利益が変動し過ぎたことを示した。加えて一部の患者は、グラフト誘導ジスキネジア(GID)を発症し(Freed et al., 2001、Hagell et al., 2002、Ma et al., 2002)、既に存在したL-DOPA誘導ジスキネジア及び望ましいドーパミン作動性ニューロンと共にセロトニン作動性細胞を含有する移植片(Hagell & Cenci, 2005、Lane & Smith, 2010)に関連している可能性があった。これらの発見は、アプローチの再評価を促した。さらに近年、欧州の協同的コンソーシアムTRANSEUROは、グラフトの前にL-DOPA誘導ジスキネジアを発症したことがない比較的初期の疾患段階の患者11名での非盲検試験(NCT01898390)における胎生移植を再考した(Barker & consortium, 2019)。
疾患プロセスを停止するか、又は元に戻す治療が現在無いことから、新規の有効なPD処置に対する満たされていない大きな必要性がある。限定的なドナー組織利用可能性及び胎児組織を使用することの倫理的問題のために、fVM治療は、幅広い臨床使用のために有用ではないと考えられ、したがって、胚性幹細胞(ESC)及び人工多能性幹細胞(iPSC)などの他の細胞供給源が調査されている。例えばPDを処置するために使用され得るドーパミン作動性ニューロンを多能性細胞から生成する新規で改善された方法に対する必要性が明らかにある。
一部の態様では本開示は、疾患の処置又は哺乳動物対象への生着について改善された特性を有するドーパミン作動性(DA)前駆細胞の培養物、好ましくは前駆中脳ドーパミン作動性(mDA)細胞培養物を提供することによって、先行技術の制約を克服する。多能性幹細胞、例えば人工多能性幹(iPS)細胞からそのようなDA前駆細胞培養物を作製する方法が提供される。DA前駆細胞について同等のパターン形成が分化培養の37日目に向かういくつかの時点で観察されたWO2018/035214に記載されたモノSMAD法を用いた以前の実験とは対照的に、本開示は、モノSMAD法を使用する分化培養の約360～456時間、より好ましくは約384～432時間後に利用されたDA前駆細胞が、驚くべきことに、パーキンソン病(PD)の処置などの治療適用について優れた特性を示し得るという発見に一部基づいている。下の実施例に示されるとおり、これらの条件下でこれらの期間に分化させたこれらの細胞は、PDの6-OHDA胸腺欠損ヌードラットモデルを使用するin vivoでの生着及び神経支配において劇的な改善を示すことが観察された。本明細書で提供されるモノSMAD分化法でのこれらの期間は、したがって、劇的に改善された治療可能性を有する細胞の培養物を生成するために重要であると考えられる。線条体に投与された細胞を受けたラットでの行動実験は、PD症状の処置の改善及びin vivoでの回復をもたらした。移植されたmDA前駆細胞、未成熟ニューロン及び分裂終了ニューロンの生存期間並びに有効性についての細胞成熟度を片側パーキンソン病ラットにおいて検査した。中脳DA前駆細胞は、生存期間、神経支配及び有効性に関して未成熟又は成熟ニューロンよりも著しく優れていた。同位置(黒質内)生着は、mDA前駆細胞が、長い距離にわたって前脳構造を神経支配するために未成熟ニューロンよりも大きな能力を有したことを実証した。前駆細胞が広い用量範囲で評価された場合、構造での及び機能での明らかな用量応答が観察された。グラフトはiPSC由来であったが、テラトーマも著しい細胞増殖も観察されなかった。これらのデータは、PDを処置する移植のためのヒトiPSC由来mDA前駆細胞の使用を支持する。本明細書で提供する細胞培養物又はDA前駆細胞を使用して脳疾患、例えばPDを処置する方法も提供される。
一部の態様では、iPSC由来中脳DAニューロン前駆細胞(例えば、「FCDI DAPC-1」又はD17細胞)を含有する凍結保存された単一細胞懸濁物が提供される。DA前駆細胞は、本明細書で提供されるモノSMAD法を使用して培養物中で約360～456時間、より好ましくは約384～432時間の分化を使用して生成され得る。これらの細胞は、DAニューロン前駆細胞の集団を得るための方向付けた分化を介して同種ヒトiPS細胞又はiPS細胞系由来であり得る。下記の実施例に示すとおり、そのようなDAニューロン前駆細胞は、表現型マーカー(例えば、図1及び図2)及び発達中の中脳の黒質領域において見出されるドーパミンニューロン前駆体と同様の発達潜在力を有することが観察された(例えば、図3、図13及び図14)。FCDI DAPC-1は、前脳ニューロン及び、治療用使用のために有害である可能性がある残存iPSCの顕著な数の欠如が観察された(例えば、図5、図6及び表3)。治療用の使用が検討される他のDA細胞とは異なり、FCDI DAPC-1は、EdU取り込みによって実証されたとおり増殖する神経前駆細胞集団である(図7)。FCDI DAPC-1は、PDの6-OHDA胸腺欠損ラットモデルにおける回復の改善と関連する特徴である、優れた生着及び神経支配を示した(図9、図10及び図14)。
一部の態様では、ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞(例えば、FCDI DAPC-1)は、細胞が分化条件下で約360～456時間、より好ましくは約384～432時間培養されるモノSMAD法を使用して多能性幹細胞、例えばiPS細胞を培養することによって産生され得る。モノSMAD分化法(「モノSMAD阻害」又は「モノSMADi」法とも称される)は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるWO2018/035214に記載されている。モノSMADi法は、2つ以上のSMAD阻害物質を使用するSMADシグナル伝達の阻害を必要とする方法を超える有利点を提供できる。一般的にモノSMAD法は、1つだけのSMAD阻害物質(すなわち、単一のSMAD阻害物質、第2のSMAD阻害物質ではない)の使用を含む。モノSMAD法は:(i)Wntアゴニスト(例えば、CHIR99021)の添加を2日目又は3日目に調整すること、(ii)CHIR濃度を再最適化すること(例えば、約0.5～3.0μM、0.7～3μM、1～2.5μM、1.25～2.25μM、約1.25μMから約2μMを超える、若しくは約1.55、1.65、1.75μM又はこの間に導き出せる任意の範囲を使用する)、及び/或いは(iii)3～5日目に分化培地にMEK阻害物質(例えば、PD0325901)を含めること、を含み得る。方法は、例えば、上記態様(i及びii)、(ii及びiii)、(i及びiii)又は(i、ii及びiii)を含み得る。一部の実施形態では、細胞は、BMP阻害物質(例えば、ドルソモルフィン又はLDN-193189)に曝露されるが、細胞はTGF-β阻害物質、SB431542などに曝露されない。細胞は、中脳DAニューロン又はFOXA2+/LMX1A+細胞に分化する細胞であってよい。これらの方法は、単一のSMAD阻害物質(例えば、ドルソモルフィンのみ、又はLDN-193189のみ)だけを含む培地を用いたiPS細胞系からのmDA前駆細胞形成のために使用され得る。
本開示の一態様は、次のシグナル伝達モジュレーター:(a)スモールマザーズアゲインストデカペンタプレジック(Small Mothers Against Decapentaplegic)(SMAD)シグナル伝達の第1の阻害物質、(b)ソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達の少なくとも1つの活性化因子、及び(c)ウイングレス(wingless)(Wnt)シグナル伝達の少なくとも1つの活性化因子、の存在下でヒト多能性細胞を培養することによって生成された中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロン前駆細胞を含む培養物であって、方法がスモールマザーズアゲインストデカペンタプレジック(SMAD)シグナル伝達の第2の阻害物質の存在下でヒト多能性細胞を培養することを含まず、ヒト多能性細胞が、分化を誘導する条件下で約360から約456時間培養され、次いで細胞が、冷蔵又は凍結保存され、中脳ドーパミン作動性前駆細胞が、フォークヘッドボックスタンパク質A2(FOXA2)及びLIMホメオボックス転写因子1(LMX1)の両方を発現する(FOXA2+/LMX1+細胞)、培養物に関する。一部の実施形態では、ヒト多能性細胞は、分化を誘導する条件下で約384から約432時間培養される。一部の実施形態では、mDAニューロン前駆細胞は、NURR1を発現しない。mDAニューロン前駆細胞は、フォークヘッドボックスタンパク質A2(FOXA2)、LIMホメオボックス転写因子1(LMX1)及びEN1を発現し得る。mDAニューロン前駆細胞は、OTX2をさらに発現し得る。一部の実施形態では、フォークヘッドボックスタンパク質A2(FOXA2)及びLIMホメオボックス転写因子1(LMX1)は、mDAニューロン前駆細胞の約60%から約100%又は約85%から約95%以上によって同時発現される。一部の実施形態では、mDAニューロン前駆体の約65～75%はFOXA2及びLMX1の両方を同時発現する。一部の実施形態では、中脳ドーパミン作動性前駆細胞は(FOXA2、LMX1A、ETV5及びEN1)を発現し、中脳ドーパミン作動性前駆細胞は(NURR1、TH、CALB1、BARHL1及びGRIK2)を発現しない。一部の実施形態では、mDAニューロン前駆細胞は増殖している又は分裂している細胞を含む。一部の実施形態では、mDAニューロン前駆細胞の少なくとも約40%以上又は約50～75%は増殖している又は分裂している。培養物は約5%以下のセロトニン作動性ニューロン前駆細胞をさらに含み得る。セロトニン作動性ニューロン前駆細胞はBARLH1を発現し得る。培養物はグリア前駆細胞をさらに含む。グリア前駆細胞は、GLAST、SLC13A、CD44及び/又はhGFAPを発現し得る。SMADシグナル伝達の阻害物質はBMP阻害物質、例えば、LDN-193189、ドルソモルフィン、DMH-1又はノギンなどであり得る。一部の実施形態では、BMP阻害物質はLDN-193189である。LDN-193189は、約0.2μMから約4μM、より好ましくは約1μMから約4μM、約1μMから約3μM、約0.5μMから約4μM、約0.5μMから約2μM、約0.2μMから約4μM、約0.2μMから約2μM若しくは約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2μM又はこの間に導き出せる任意の範囲の濃度で存在し得る。一部の実施形態では、SMADシグナル伝達阻害物質はTGFβ阻害物質である。TGFβ阻害物質はSB431542であり得る。一部の実施形態では、SB431542は、約1～20μM、約5～15μM、約9～11μM又は約10μMの濃度で存在する。多能性細胞は、培養1～15、1～16又は1～17日目にSMADの阻害物質と共に培養され得る。多能性細胞は、培養1～17日目にSMADの阻害物質と共に培養され得る。多能性細胞は、15、16又は17日間、実質的に持続的に、又は毎日、SMADの阻害物質と共に培養され得る。多能性細胞は、17日間、実質的に持続的に、又は毎日、SMADの阻害物質と共に培養され得る。SMADの阻害物質は、約50～2000又は50～500nMの濃度で存在し得る。SMADの阻害物質は、約180～240nMの濃度で存在し得る。方法は、多能性細胞をMEK阻害物質に接触させることをさらに含み得る。一部の実施形態では、MEK阻害物質はPD0325901である。PD0325901は、約0.25～2.5μMの濃度で存在し得る。MEK阻害物質は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後約1～3日間、又は1～3日目、2～4日目、3～5日目に、又は1、2、3、4若しくは5日目に多能性細胞に接触され得る。一部の実施形態では、MEK阻害物質は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後に約24から約48時間多能性細胞に接触される。一部の実施形態では、MEK阻害物質は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始約1～2日後に始めて約3～4日間毎日又は実質的に持続的に多能性細胞に接触される。一部の実施形態では、MEK阻害物質は、1日目のSMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後2～5日目又は3～6日目に多能性細胞に接触される。Wntシグナル伝達の活性化因子はGSK3阻害物質であり得る。一部の実施形態では、GSK3阻害物質はCHIR99021である。CHIR99021は、約1.5～2μM、約1.5～1.7μM、約1.6～1.7μM又は約1.65μMの濃度で存在し得る。一部の実施形態では、CHIR99021はSMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後9～17日目に約4～7μMの濃度で存在する。Wntシグナル伝達の活性化因子は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後1～3日間多能性細胞に接触され得る。Wntシグナル伝達の活性化因子は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後24～48時間以内に多能性細胞に接触され得る。一部の実施形態では、多能性細胞は、14、15又は約16日間、実質的に持続的に、又は毎日、Wntシグナル伝達の活性化因子と共に培養される。一部の実施形態では、Wntシグナル伝達の活性化因子は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後2～17日目に多能性細胞に接触される。一部の実施形態では、SHHシグナル伝達の活性化因子は、パルモルファミン(purmorphamine)又はC25II Shhである。方法は、多能性細胞をSHHシグナル伝達の2つの活性化因子に接触させることをさらに含み得る。SHHシグナル伝達の2つの活性化因子は、パルモルファミン及びC25II Shhであり得る。一部の実施形態では、SHHシグナル伝達の少なくとも1つの活性化因子は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始と同じ日に、又はSMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後24～48時間以内に多能性細胞に接触される。一部の実施形態では、SHHシグナル伝達の少なくとも1つの活性化因子は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始と共に、又は後に、1～7日目に多能性細胞に接触される。方法は、多能性細胞をFGF-8に接触させることをさらに含み得る。一部の実施形態では、FGF-8は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始と同じ日に多能性細胞に接触されない。一部の実施形態では、FGF-8は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後9～17日目又は11～17日目に多能性細胞に接触される。FGF-8は、約50～200ng/mLの濃度で存在し得る。多能性細胞は、ニューロンプロモーターの調節下に抗生物質耐性導入遺伝子を含み得る。方法は、細胞を抗生物質、化学療法剤、DNA架橋剤、DNA合成阻害物質又は有糸分裂阻害物質に接触させることによって、多能性細胞由来の神経細胞、中脳DAニューロン又はmDAニューロン前駆細胞について選択することをさらに含み得る。方法は、多能性細胞を抗生物質又は化学療法剤(例えば、マイトマイシンC)に接触させることをさらに含み得る。一部の実施形態では、マイトマイシンCは、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後27、28、29及び/又は30日目に多能性細胞に接触される。一部の実施形態では、抗生物質はG418(ジェネテシン)である。方法は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始より前にROCK阻害物質を含む培地で多能性細胞を培養すること又はインキュベートすることをさらに含み得る。方法は、多能性細胞をブレビスタチンに接触させることをさらに含み得る。ブレビスタチンは、分化の5日目及び17日目に細胞に接触され得る。一部の実施形態では、mDAドーパミン作動性前駆細胞は、NURR1、MAP2及びTHを発現しない。それにもかかわらずmDAドーパミン作動性前駆細胞は、例えば、将来の追加的な成長又は分化後に、NURR1、MAP2及び/又はTHを発現する潜在力を保持し得る。一部の実施形態では、mDAドーパミン作動性前駆細胞はEN1を発現する。PITX2及びPITX3の両方は、成熟ドーパミン作動性ニューロンにおいて観察されているが、mDAドーパミン作動性前駆細胞は、これらのマーカーを低レベルで発現し得るか、又は実質的に発現しない。一部の実施形態では、mDAドーパミン作動性前駆細胞は、GBX2、OTX1、OTX2、ETV5、CORIN及び/又はDCXを発現する。一部の実施形態では、多能性細胞はヒト人工多能性幹(iPS)細胞である。LMX1はLIMホメオボックス転写因子1アルファ(LMX1A)であり得る。一部の実施形態では、細胞組成物中の細胞の約5%以下(例えば約1%未満又は0.5%未満)は、セロトニン作動性細胞又はセロトニン作動性前駆細胞である。方法は、ヒト多能性細胞をDNase又はエンドヌクレアーゼ(例えば、DNase I又はBenzonase(登録商標))の存在下でインキュベートすることをさらに含み得る。DNase I又はBenzonase(登録商標)は約10～20U/mL又は約10～15U/mLの濃度で存在し得る。例えば、DNase I Benzonase(登録商標)は、培養17日目に、例えば単一細胞調製物などの細胞調製物中の細胞凝集塊化を例えば低下させるために添加され得る。一部の実施形態では、ヒト多能性細胞は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後4～6日目の少なくとも1日にエンドヌクレアーゼの存在下で培養される。ヒト多能性細胞は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後5日目にエンドヌクレアーゼの存在下で培養され得る。培養物は容器手段に含まれ得る。一部の実施形態では、中脳ドーパミン作動性ニューロン又は中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞は、医薬調製物に含まれる。医薬調製物は注射用に製剤化される。一部の実施形態では、医薬調製物はヒアルロン酸マトリックスを含む。培養物は、細胞約2,500個/μLから細胞約150,000個/μL、細胞約2,500個/μLから細胞約100,000個/μL、細胞約10,000個/μLから細胞約150,000個/μL、細胞約40,000個/μLから細胞約100,000個/μL又は細胞約15,000～45,000個/μLを含み得る。細胞は、中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞又はDAPC-1細胞であり得る。培養物は、細胞約1×106個から約25×106個、より好ましくは約3×106個から約9×106個を含有し得る。一部の実施形態では、培養物中の細胞の約10%以下、より好ましくは約7%以下がセロトニン作動性前駆細胞である。一部の実施形態では、培養物中の細胞の約5%以下がセロトニン作動性前駆細胞である。一部の実施形態では、培養物中の細胞の約5%以下がSERT及びTPH2を発現する。下記の実施例において示すとおり、培養物は、14日目のSERT及びTPH2の発現に基づいておよそ5%のセロトニン作動性細胞(セロトニン作動性前駆細胞)を含有し、セロトニン作動性ニューロンが生着後に残存しなかったことが観察された。一部の好ましい実施形態では、セロトニン作動性細胞の総数は約5%以下である一方で、一部の実施形態では、培養物は約6%、7%、8%又はより多いセロトニン作動性細胞を含有する場合がある。一部の実施形態では、培養物中の細胞の約0.1～5%以下は、FOXG1を発現する、及び/又はここで、培養物中の細胞の約0.1～5%以下は、PAX6を発現する。一部の実施形態では、培養物中の細胞の約1%未満は、FOXG1を発現する、及び/又はここで培養物中の細胞の約1%未満はPAX6を発現する。
本開示の別の態様は、上に又は本明細書に記載の培養物の治療有効量を対象に投与することを含む哺乳動物対象における疾患を処置する方法に関し、例えば、好ましくはここで、培養物は対象の脳に投与される。哺乳動物対象はヒトであり得る。疾患は、中枢神経系(CNS)の疾患であり得る。一部の実施形態では、疾患はパーキンソン病(PD)又はパーキンソンプラス症候群(PPS)である。一部の実施形態では、培養物は、エングレイルド(Engrailed)1(EN1)を発現するが、NURR1を発現しないmDA前駆細胞を含む。一部の実施形態では、培養物は完全に分化していないドーパミン作動性ニューロンを含む。培養物は、対象の線条体、例えば被殻又は黒質に投与される。一部の実施形態では、培養物は、対象の線条体又は被殻の1つより多い位置に投与される。培養物は、対象の線条体又は被殻の複数の部位に、及び/又は複数の針管で投与される。培養物は、医薬組成物に含まれ得る。医薬組成物は、ヒアルロン酸マトリックスを含み得る。一部の実施形態では、培養物は、細胞約15,000～45,000個/μL若しくは約2×105、2.5×105、3×105、4×105、4.5×105個又はこの間に導き出せる任意の範囲の中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞を含む。培養物は、細胞約1×106から約25×106個、より好ましくは約3×106から約9×106個を含有し得る。培養物は、細胞約2,500個/μLから細胞約150,000個/μL、細胞約10,000個/μLから細胞約150,000個/μL、細胞約40,000個/μLから細胞約100,000個/μL若しくは細胞約10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000個/μL又はこの間に導き出せる任意の範囲を含み得る。一部の実施形態では、対象はパーキンソン病を有し、ここで対象は、培養物の投与後に少なくとも1つの運動症状における改善を示す。一部の実施形態では、対象は、振戦、筋硬直、動作緩慢、転倒、眩暈、すくみ(movement freezing)、筋けいれん又はジストニアの1つ以上における低下を示す。中脳ドーパミン作動性前駆細胞は、対象の線条体又は被殻を少なくとも一部神経再支配し得る。一部の実施形態では、中脳ドーパミン作動性前駆細胞は、投与後に限定的な、わずかな増殖を示すか、又は増殖を示さない。中脳ドーパミン作動性前駆細胞は、いまだ分裂している、又は増殖している少なくとも一部の細胞を含み得るにもかかわらず、中脳ドーパミン作動性前駆細胞は、投与後に分化し続ける場合がある。一部の実施形態では、細胞培養物中の細胞の約1%未満、好ましくは0.5%未満は、セロトニン作動性細胞である。一部の実施形態では、投与された細胞の少なくとも80%は、対象への投与後にFOXA2及びLMX1の両方を発現する分化した細胞に分化する。一部の実施形態では、分化した細胞の少なくとも85%はFOXA2及びLMX1の両方を発現する。一部の実施形態では、投与された細胞の少なくとも約60%は、FOXA2及びLMX1の両方を発現する。培養物は、投与より前に低温で凍結され得る(例えば、液体窒素中、低温で凍結される)。例えば、細胞は保存のために低温で凍結されてよく、続いて細胞が対象に投与される室温にされてよい。FOXA2及びLMX1を発現する分化した細胞は、エングレイルド(EN1)、チロシンキナーゼ(TH)、オルソデンティクルホメオボックス(orthodenticle homeobox)2(OTX2)、核受容体関連1タンパク質(NURR1)、ニューロン特異的クラスIIIベータチューブリン(Tuj1)、TTF3、ペアード様ホメオドメイン3(PITX3)、achaete-scute複合体(ASCL)、初期B細胞因子1(EBF-1)、初期B細胞因子3(EBF-3)、トランスサイレチン(TTR)、シナプシン、ドーパミントランスポーター(DAT)及びGタンパク質共役内向き整流カリウムチャネル(Kir3.2/GIRK2)、CD142、DCSM1、CD63並びにCD99からなる群から選択される少なくとも1つのマーカーをさらに発現し得る。一部の実施形態では、FOXA2及びLMX1又はFOXA2及びTHを発現する分化した細胞は、エングレイルド、PITX3及びNURR1をさらに発現する。一部の実施形態では、細胞培養物中の細胞の約10～25%はFOXA2及びチロシンヒドロキシラーゼ(TH)を同時発現する。多能性細胞は、ヒト人工多能性幹(iPS)細胞であり得る。一部の実施形態では、LMX1はLIMホメオボックス転写因子1アルファ(LMX1A)である。一部の実施形態では、細胞組成物中の細胞の約5%未満、約1%未満又は0.5%未満は、セロトニン作動性細胞である。一部の実施形態では、投与は宿主のグリオーシスを生じない。投与は、対象の脳における非ニューロン細胞の成長又は増殖を生じないか又は本質的に生じない。投与は、対象の脳におけるmDA前駆細胞の生着、及び/又はmDA前駆細胞による対象の脳の少なくとも一部における神経支配を生じ得る。投与は注射(例えば、定位注射(stereotaxic injection))を介してであり得る。
本開示の一態様は、次のシグナル伝達モジュレーター:(a)スモールマザーズアゲインストデカペンタプレジック(SMAD)シグナル伝達の第1の阻害物質、(b)ソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達の少なくとも1つの活性化因子、及び(c)ウイングレス(Wnt)シグナル伝達の少なくとも1つの活性化因子、の存在下でヒト多能性細胞を培養することを含む、フォークヘッドボックスタンパク質A2(FOXA2)及びLIMホメオボックス転写因子1(LMX1)の両方を発現するヒト細胞(FOXA2+/LMX1+細胞)を含む細胞組成物を調製するin vitroでの方法であって、スモールマザーズアゲインストデカペンタプレジック(SMAD)シグナル伝達の第2の阻害物質の存在下でヒト多能性細胞を培養することを含まず、ヒト多能性細胞が、分化を誘導する条件下で約360から約456時間又はこの間に導き出せる任意の範囲で培養され、次いで細胞が、冷蔵又は凍結保存される、方法に関する。一部の実施形態では、ヒト多能性細胞は、分化を誘導する条件下で約384から約432時間培養される。一部の実施形態では、ヒト細胞はNURR1を発現しない。ヒト細胞は、フォークヘッドボックスタンパク質A2(FOXA2)、LIMホメオボックス転写因子1(LMX1)及びエングレイルドホメオボックス1(EN1)を発現し得る。ヒト細胞は、OTX2をさらに発現し得る。一部の実施形態では、フォークヘッドボックスタンパク質A2(FOXA2)は、細胞の約85～95%によって発現される。一部の実施形態では、FOXA2及びLIMホメオボックス転写因子1(LMX1)は、ヒト細胞の約65%から約85%以上、又は約65%から約75%によって同時発現される。SMADシグナル伝達の阻害物質は、BMP阻害物質(例えば、LDN-193189、ドルソモルフィン、DMH-1又はノギン)であり得る。一部の実施形態では、BMP阻害物質はLDN-193189である。LDN-193189は、例えば約0.2μMから約4μMの濃度で、又は約1μMから約3μM、約0.5μMから約4μM、約0.5μMから約2μM、約0.2μMから約4μM、約0.2μMから約2μM若しくは約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2μM又はこの間に導き出せる任意の範囲の濃度で存在し得る。一部の実施形態では、SMADシグナル伝達阻害物質はTGFβ阻害物質(例えば、SB431542)である。SB431542は、約1～20μM、5～15μM、9～11μM又は約10μMの濃度で存在し得る。多能性細胞は、培養1～15日目、1～16日目又は1～17日目にSMADの阻害物質と共に培養され得る。一部の実施形態では、多能性細胞は、培養1～17日目にSMADの阻害物質と共に培養される。多能性細胞は、15、16又は17日間、実質的に持続的に、又は毎日、SMADの阻害物質と共に培養され得る。一部の実施形態では、多能性細胞は、17日間、実質的に持続的に、又は毎日、SMADの阻害物質と共に培養される。SMADの阻害物質は約50～2000又は約50～500nMの濃度で存在し得る。一部の実施形態では、SMADの阻害物質は約180～240nMの濃度で存在する。方法は、多能性細胞をMEK阻害物質(例えば、PD0325901)に接触させることをさらに含み得る。PD0325901は約0.25～2.5μMの濃度で存在し得る。一部の実施形態では、MEK阻害物質は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後約1～3日間、又は1～3日目、2～4日目、3～5日目に、又は1、2、3、4若しくは5日目に多能性細胞に接触される。一部の実施形態では、MEK阻害物質は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後に約24から約48時間多能性細胞に接触される。一部の実施形態では、MEK阻害物質は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始約1～2日後に始めて約3～4日間毎日又は実質的に持続的に多能性細胞に接触される。一部の実施形態では、MEK阻害物質は、1日目のSMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後2～5日目又は3～6日目に多能性細胞に接触される。Wntシグナル伝達の活性化因子は、GSK3阻害物質(例えば、CHIR99021)であり得る。一部の実施形態では、CHIR99021は、約1.5～1.7μM、約1.6～1.7μM、約1.65μM又はこの間に導き出せる任意の範囲の濃度で存在する。一部の実施形態では、CHIR99021は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後9～17日目に約4～7μMの濃度で存在する。一部の実施形態では、Wntシグナル伝達の活性化因子は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後1～3日間多能性細胞に接触される。Wntシグナル伝達の活性化因子は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後24～48時間以内に多能性細胞に接触され得る。一部の実施形態では、多能性細胞は、14、15又は約16日間、実質的に持続的に、又は毎日、Wntシグナル伝達の活性化因子と共に培養される。一部の実施形態では、Wntシグナル伝達の活性化因子は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後2～17日目に多能性細胞に接触される。SHHシグナル伝達の活性化因子は、パルモルファミン又はC25II Shhであり得る。方法は、多能性細胞をSHHシグナル伝達の2つの活性化因子(例えば、パルモルファミン及びC25II Shh)に接触させることをさらに含み得る。一部の実施形態では、SHHシグナル伝達の少なくとも1つの活性化因子は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始と同じ日に、又はSMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後24～48時間以内に多能性細胞に接触される。SHHシグナル伝達の少なくとも1つの活性化因子は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始と共に、又は後に、1～7日目に多能性細胞に接触され得る。方法は、多能性細胞をFGF-8に接触させることをさらに含み得る。一部の実施形態では、FGF-8は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始と同じ日に多能性細胞に接触されない。一部の実施形態では、FGF-8は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後9～17日目又は11～17日目に多能性細胞に接触される。FGF-8は約50～200ng/mLの濃度で存在し得る。多能性細胞は、ニューロンプロモーターの調節下に抗生物質耐性導入遺伝子を含み得る。方法は、細胞を抗生物質、化学療法剤、DNA架橋剤、DNA合成阻害物質又は有糸分裂阻害物質に接触させることによって、多能性細胞由来の神経細胞、中脳DAニューロン又はmDA前駆細胞について選択することをさらに含み得る。方法は、多能性細胞を抗生物質又は化学療法剤に接触させることをさらに含み得る。化学療法剤はマイトマイシンCであり得る。一部の実施形態では、マイトマイシンCは、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後27、28及び/又は29日目に多能性細胞に接触される。一部の実施形態では、抗生物質はG418(ジェネテシン)である。方法は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始より前にROCK阻害物質を含む培地で多能性細胞を培養すること又はインキュベートすることをさらに含み得る。方法は、多能性細胞をブレビスタチンに接触させることをさらに含み得る。一部の実施形態では、ブレビスタチンは分化の5日目及び17日目に細胞に接触される。一部の実施形態では、ヒト多能性細胞の少なくとも40%、少なくとも60%、少なくとも80%又は少なくとも85%は分化し、FOXA2及びLMX1の両方を発現する。一部の実施形態では、ヒト多能性細胞の約10～25%は分化し、FOXA2及びチロシンヒドロキシラーゼ(TH)の両方を発現する。多能性細胞はヒト人工多能性幹(iPS)細胞であり得る。一部の実施形態では、LMX1はLIMホメオボックス転写因子1アルファ(LMX1A)である。一部の実施形態では、FOXA2及びLMX1又はFOXA2及びTHを発現する分化した細胞は、オルソデンティクルホメオボックス2(OTX2)、核受容体関連1タンパク質(NURR1)、ニューロン特異的クラスIIIベータチューブリン(Tuj1)、TTF3、ペアード様ホメオドメイン3(PITX3)、achaete-scute複合体(ASCL)、初期B細胞因子1(EBF-1)、初期B細胞因子3(EBF-3)、トランスサイレチン(TTR)、シナプシン、ドーパミントランスポーター(DAT)及びGタンパク質共役内向き整流カリウムチャネル(Kir3.2/GIRK2)、CD142、DCSM1、CD63並びにCD99からなる群から選択される少なくとも1つのマーカーをさらに発現する。FOXA2+/LMX1+細胞はエングレイルド(EN1)をさらに発現し得る。FOXA2+/LMX1+細胞は、EN1、Pax8及びETV5をさらに発現し得る。一部の実施形態では、FOXA2+/LMX1+細胞はNURR1を発現しない。FOXA2+/LMX1+細胞は、GBX2、OTX1、OTX2、ETV5、CORIN及び/又はDCXを発現し得る。一部の実施形態では、細胞組成物中の細胞の約1%未満、好ましくは5%以下は、セロトニン作動性細胞である。方法は、DNase又はエンドヌクレアーゼの存在下でヒト多能性細胞をインキュベートすることをさらに含み得る。エンドヌクレアーゼは、DNase I又はBenzonase(登録商標)であり得る。DNase I又はBenzonase(登録商標)は、約10～20U/mLの濃度で、若しくは約10～15U/mLの濃度で又はこの間に導き出せる任意の範囲で存在し得る。一部の実施形態では、ヒト多能性細胞は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後4～6日目の少なくとも1日にエンドヌクレアーゼの存在下で培養される。一部の実施形態では、ヒト多能性細胞は、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後5日目にエンドヌクレアーゼの存在下で培養される。
一部の実施形態では、本明細書において提供されるモノSMAD法を使用して上に述べた範囲よりも長い又は短い期間分化させた細胞が提供される。例えば、D17細胞に加えて、分化のさらに後の段階にある細胞、例えばD24細胞及び/又はD37細胞は本明細書において提供され、神経学的な又は脳の疾患を処置するために対象に投与され得る。一部の実施形態では、本明細書において提供されるモノSMAD法を使用して少なくとも18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36若しくは37日間又はこの間に導き出せる任意の範囲で分化させた細胞を含む培養物は、提供され、例えば、医薬組成物に含まれ得る、又はin vitro試験(例えば、毒性学試験、薬物スクリーニング、電気生理学的試験など)のために使用され得る、又はin vivoで神経学的疾患を処置するために使用され得る。一部の実施形態では、本明細書において提供されるモノSMAD法を使用して、約12、13、14、15、16日間又はこの間に導き出せる任意の範囲の期間分化させた細胞は本明細書において提供され、そのような細胞が、例えばPDなどの本明細書に記載される神経学的疾患を処置するために哺乳動物対象に投与され得ることは期待される。下記の実施例に示されるとおり、D17、D24及びD37細胞は以下のとおり次の細胞マーカーを発現し得る:
本開示の別の態様は、上に又は本明細書で記載の方法によって生成された中脳ドーパミン作動性ニューロン又は中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞を含む培養物に関する。培養物は、容器手段に含まれていてよい。一部の実施形態では、中脳ドーパミン作動性ニューロン又は中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞は、医薬調製物に含まれる。医薬調製物は、注射用に製剤化され得る。
本開示の別の態様は:(a)上に若しくは本明細書に記載の方法によって分化したFOXA2+/LMX1A+細胞又は上に若しくは本明細書に記載のmDA前駆細胞(例えば、D17細胞)を試験化合物に接触させること、及び(b)細胞の機能、生理機能又は生存率を測定すること、を含む試験化合物をスクリーニングする方法に関する。測定することは、細胞の毒性学的応答について又は電気生理学的応答の変化について検査することを含み得る。一部の実施形態では、細胞は中脳ドーパミン作動性ニューロン又は中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞である。
本発明との組合せで使用され得る追加的な条件及び方法は、例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるU.S. 2015/0265652、U.S. 2015/0010514及びWO2013/067362において見出され得る。本発明との組合せで使用され得る、多能性細胞を精製する、又はそのニューロン若しくは中脳DAニューロンへの分化を促進する追加的方法として、例えば、Kirkeby et al.(2012)、Kriks, et al.(2011)、Chung, et al.(2011)、Xi et al.(2012)、Young et al.(2014)、Jaeger et al.(2011)、Jiang et al.(2012)及びUS2016/0177260が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「分化日数」は、分化培地への多能性細胞の曝露の開始が1日目で、培地中の細胞のインキュベーションの日数を指す。一部の好ましい実施形態では、1日目の分化培地は単一のSMAD阻害物質を含む。分化培地でのインキュベーション又は培養より前に細胞は、例えば、分化培地でのインキュベーションの1、2又は3日前(すなわち、0日目、-1日目及び/又は-2日目)にEssential 8(商標)基礎培地及びEssential 8(商標)補充(Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA)を含むか、又はそれからなる培地中で、場合によりROCK阻害物質の添加(例えば、H1152を約0.25～5μM、0.5、0.75、1、1.25、1.5、2、3、4若しくはこの間に導き出せる任意の範囲で、例えば、-2日目に含む)、及び/又はブレビスタチン(blebbestatin)(例えば、約0.1～20μM、より好ましくは約1.25～5μM又は約2.5μMの濃度)の添加を伴ってインキュベートされ得る。
本明細書で使用される場合、指定の構成成分に関して「本質的に含まない」は、指定のいずれの構成成分も組成物に意図的に製剤化されない、及び/又は夾雑物として若しくは痕跡量でのみ存在することを意味して本明細書において使用される。組成物の任意の意図しない夾雑から生じる指定の構成成分の総量は、好ましくは0.01%未満である。最も好ましいのは、その中に指定の構成成分の量が標準的な分析法を用いて検出され得ない組成物である。
本明細書で使用される場合、指定「a」又は「an」は、1つ以上を意味し得る。請求項(複数可)において使用される場合、単語「含む(comprising)」と併せて使用される場合に単語「a」又は「an」は、1つ又は1つより多くを意味し得る。
特許請求の範囲における「又は」の使用は、二者択一のみを指すと明確に示されているか、又は選択肢が相互排他的である場合を除いて「及び/又は」を意味して使用されるが、本開示は、唯一の選択肢及び「及び/又は」を指す定義を支持する。本明細書で使用される場合、「別の」は少なくとも第2の以上のものを意味し得る。
本出願全体を通じて用語「約」は、値が、デバイス、値を決定するために使用される方法又は研究対象に存在する変動についての固有の変動の誤差を含むことを示して使用される。
本発明の他の目的、特性及び有利点は、続く詳細な記載から明らかになるであろう。しかし、詳細な記載及び具体的な実施例が本発明の好ましい実施形態を示している一方で、例示の方法によってのみ提供されることは、本発明の精神及び範囲内の種々の変更及び改変が、本詳細な記載から当業者に明らかになることから理解されるべきである。
本特許又は出願ファイルは、カラーで描かれた少なくとも1つの図面を含む。カラーの図面を伴うこの特許又は特許出願公開のコピーは、特許庁への請求及び必要な費用の支払いによって提供される。
以下の図面は、本発明の明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、1つ以上のこれらの図面を、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な記載との組み合わせで参照することにより、さらに良好に理解され得る。
最終生成物のFOXA2のフローサイトメトリーである。
DA前駆体の純度(FOXA2+/LMX1+)である。
DAニューロンの分化能(NURR1+/S100β-)である。
ニューロンの分化能(MAP2+/ネスチン-)である。
前脳ニューロンである。FCDI DAPC-1細胞を、(図5A)抗PAX6(Biolegend #901301)又は(図5B)抗FOXG1で染色した。iCell GABA Neuron(FCDI)が陽性対照として示されており、これらは前脳表現型にパターン化された細胞であり、主にGABA作動性であり、PAX6+ニューロンの分集団を含有し、FOXG1+ニューロンの分集団も含有する。
残存iPSCのRT-QPCRである。
増殖細胞からなるFCDI DAPC-1である。(図7A)FCDI DAPC-1製造の全体を通したEdU組み込みの時間経過である。ほぼ半分のFCDI DAPC-1細胞が増殖している。(図7B)解凍後培養物中のFCDI DAPC-1のFOXA2+集団へのEdU組み込みの時間経過である。増殖は、細胞がmDA前駆体段階から成熟DAニューロンへ分化すると減少する。(図7C)17日目に24時間かけてmDA前駆細胞に組み込まれたEdUは、前駆細胞の成熟後12日間、Nurr1+細胞に保持される。
ヌードラットにおけるアンフェタミン(Amphetamine)回転である。示されている回転は、取ったすべての記録の平均である。エラーバーは、平均標準誤差を表し、n=1群当たり10～12匹の動物である。
移植の6か月後の線条体神経再支配である。神経再支配が、TH陽性細胞の染色を使用して示されている。グラフトにおけるTH+細胞の数にD17及び24Dで統計的な差はなかったが、D17細胞による線条体の神経支配は、D24細胞より良好であることが観察された。
黒質内グラフトは線条体を神経支配する。細胞が黒質(subtantia nigra)中に直接注射される場合、D17グラフトは、D24細胞と比較して、内側前脳束及び線条体へのより良好な神経支配を示した。
qPCR前駆体マーカーの時間経過である。前駆体マーカーは、D17細胞とD24細胞で僅かに異なっている。Lmx1、Pitx2、Nurr1及びPitx3は、D24細胞に高レベルで発現しており、一方、En-1、Pax8、ETV5及びGlastは、D17細胞に高レベルで発現している。
qPCRマーカーの時間経過である。成熟マーカーも発現が異なっており、AQP4及びチロシンヒドロキシラーゼ(TH)は、D17細胞と比較してD24細胞に高レベルで発現している。
D17とD24培養物の免疫細胞化学(ICC)の比較である。
遺伝子発現のバイオリンプロットである。
代替的細胞タイプを使用したアンフェタミン回転である。示されている回転は、取ったすべての記録の平均である。エラーバーは、平均標準誤差を表し、n=4～10匹の動物である。
細胞集団のパーセンテージである。hNucのパーセントは、hNuc+細胞の数を450,000個の注射細胞で割ることによって計算し、TH及びKi67は同じグラフト中の生着hNucのパーセンテージである。結果を、hNuc(図16A)、TH(図16B)及びKi67(図16C)について示す。ラットの組織スライスによるデータを示す。各集団のパーセンテージを各グラフのタイトルに列挙する(全投入でのhNuc、数えた全hNucでのTH及び数えた全hNucでのKi67)。
hNuc、TH及びKi67の立体解析学的分析である。12番目の切片毎(シリーズの1/2)を、hNuclei、TH又はhKi67で染色し、不偏立体解析により定量化した。各動物において、グラフト域の輪郭を取り、数えた。各グラフは独自のY軸を有する。図17Aは、各試験群の各動物のhNuc陽性細胞の数、平均及び平均標準誤差(SEM)を示す。図17Bは、平均及びSEMを含む、各試験群における各動物のTH陽性細胞の数を示す。図17Cは、平均及びSEMを含む、各試験群における各動物のKi67陽性細胞の数を示す。
パネル1(上段)は、1.50uMのCHIR(図18A)、1.75uMのCHIR(図18B)及び2.00uMのCHIR(図18C)で作製された細胞におけるフローサイトメトリーによるFoxA2発現を示す。パネル2(下段)は、フローサイトメトリーによるFoxA2(y軸)/Lmx(x軸)発現を示す。
qPCRを使用して測定された、様々な日数の分化の後に生成された細胞における遺伝子の発現である。
in vivoにおけるD17前駆体の特徴付け、並びに機能、生存及び神経支配についての分析である。(図20A)手術前、並びに生着の2、4及び6か月後に測定した、d-アンフェタミン誘導回転の時間ベース分析である。(図20B)低、中、高又は最大可能用量のグラフトに含有されたhNuclei-ir細胞の立体解析推定値である。TH-ir細胞の立体解析推定値(図20C)及び各群における立体解析推定値(図20D)の定量化である。(E)hGFAP(スケールバー200*m)及び(F)5-HT(スケールバー1mm(差し込み図25*m))で染色されたグラフト切片の代表的画像である。DAB処理(図20G)hNuclei及び(図20H)TH、又は免疫蛍光三重標識(図20I)hNuclei/TH/FoxA2(緑色/赤色/青色)及び(図20J)TH/Girk2/カルビンディン(緑色/赤色/青色)の低、中、高及び最大可能用量のグラフトを含有する代替的画像である。スケールバー=500*m。
in vitroにおける分化及び遺伝子発現である。(図21A)分化及び移植の概略図である。MMC=マイトマイシンc(mitomycin c)。(図21B)標的及びオフターゲット領域、細胞型及びニューロン成熟マーカーのiPSC-mDA分化の17、24及び37日目におけるmRNA発現を比較するqPCRである。3つの生物学的複製を、各処理時点で技術的に三重に分析した。平均Ct値は、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)に対して表している(ΔCt)。エラーバーはSEMである。有意性が表7に示されている。
in vitroにおけるタンパク質発現である。(図22A)mDA標的マーカーのiPSC-mDA分化の17、24及び37日目の免疫反応性集団を比較するフローサイトメトリーである。FOXA2+、FOXA2+/LMX1+、NURR1+、MAP2+及びFOXA2+/TH+で示される肝細胞の陽性細胞集団の定量化である。3つの生物学的複製を各時点で分析した(平均±SEM)。(図22B)標的及びオフターゲットマーカーのiPSC-mDA分化の17、24及び37日目における免疫反応性集団を比較する免疫細胞化学である。画像は、各時点で分析された3つの生物学的複製の代表例である。
グラフトの生存及び機能である。(図23A)手術前、並びに生着の2、4及び6か月後に測定した、d-アンフェタミン誘導回転の時間ベース分析である。移植の4か月後には、D17はP<0.0005であり、G418はP<0.005であり、移植の6か月後には、D17及びD24はP<0.0005であり、G418はP<0.05である。データは、テューキー調整を有する混合型ANOVAで分析し、エラーバーはSEMである。比較をビヒクル群で行った。(図23B)hNuclei及び(図23C)hKi-67で染色した代表的なグラフト切片であり、グラフトの境界を黒で輪郭を描いた。(図23D)hNuclei-ir(D37/G418に対してD17はP<0.001、D37/G418それぞれに対してD24はP<0.0005及びP<0.005)、並びに(図23E)hKi-67-ir細胞(D37に対してD17はP<0.05、G418に対してD17はP<0.01、D37に対してD24はP<0.05)の不偏立体解析による定量化である。スケールバー=(図23B)では500μMであり、(図23C、差し込み図)では50μMである。hNuclei推定値は、テューキー調整を有する一元配置ANOVAにより分析し、エラーバーはSDを表す。hKi-67推定値は、クラスカルウォリス検定及びDwass-Steele-Critchlow-Fligner事後により分析した。
in vivoにおけるドーパミン作動性表現型の可視化である。(図24A)DAB処理THで染色された代表的なグラフト含有切片である。グラフト内に含有されたTH-ir細胞(図24B)の6か月後のin vivoにおける定量化である(それぞれ、D37/G418に対してD17はP<0.001及びP<0.005、D37/G418に対してD24はP<0.0005及びP<0.01)。(図24C)グラフト誘導TH-ir線維の光学密度である。有意なP値を、D24、D37及びG418に対してD17(P<.0005、P<.001、P<.05)、D37に対してD24(P<.01)、並びにD37に対してG418(P<.0005)で計算した。(図24D)TH/FOXA2/hNuclei(緑色/赤色/青色)の免疫蛍光三重標識である。スケールバー(A)=500μMであり、(D)=20μMである。
黒質に移植されたグラフト化細胞の長距離神経支配である。前脳から黒質内の移植片部位まで及ぶ、冠状切片におけるhNCAM免疫反応性の代表的なコンピュータ倒立顕微鏡写真である。DAB処理画像は逆転しており、神経支配の程度を示すように調整し、すべての高画質化(enhancement)を各試料に同一様式で適用した。AC=前交連、AON=前嗅核、cc=脳梁、CPu=尾状核被殻、Fr=前頭皮質、NAc=側坐核、PrL=前辺縁域(prelimbic area)、Sept=中隔、T=移植片、Tu=嗅結節。
in vivoにおけるD17前駆体の機能、生存及び神経支配についての定量的分析である。(図26A)手術前、並びに生着の2、4及び6か月後に測定した、d-アンフェタミン誘導回転の時間ベース分析である。テューキー調整を有する混合型ANOVAで分析して、生着の4か月後には、MDFはP<0.0001であり、高用量はP<0.0005であり、生着の6か月後には、MDF及び高用量はP<0.0001であり、中用量はP<0.005であった。比較をビヒクル群で行った。(図26B)低、中、高又は「最大可能」用量のグラフトに含有されたhNuclei-ir細胞(図26Eで可視化されている)の立体解析推定値である。テューキー調整を有する一元配置ANOVAにより、すべての比較においてP<0.0001である。(図26C)低、中、高又は「最大可能」用量のグラフトに含有されたTH-ir細胞(図26Fで可視化されている)の立体解析推定値である。テューキー調整を有する一元配置ANOVAで分析して、全群では、MFDはP<0.0001であり、中及び低用量群に対して高用量群は、それぞれP<0.005及びP<0.05であった。(図26D)グラフト誘導THの光学密度の定量化である。テューキー調整を有する一元配置ANOVAは、中及び低用量に対してMFD、並びに中及び低用量に対して高用量ではP<0.0001、高用量に対してMFDではP<0.05を示した。組織学的及び行動学的データのそれぞれについてのテューキー調整を有する一元配置又は混合効果ANOVAであり、エラーバーは、組織学的及び行動学的データのそれぞれのSD又はSEMを表す。低用量群の画像は、実質的に生存したグラフトを有するラットのものである。スケールバー=500μM。
ドーパミン作動性表現型と行動回復との相関関係、及びmDAサブタイプの可視化である。(図27A)TH-ir細胞の推定数、及びd-アンフェタミン誘導回転の正味変化の大きさの絶対値に対してプロットされ、且つ対数回帰曲線に当てはめられたTH光学濃度測定値である。低/中又は高/「最大可能」用量及び行動回復の線形回帰である。免疫蛍光三重標識(図27B)hNuclei/TH/FOXA2(青色/緑色/赤色)及び(図27C)TH/GIRK2/カルビンディン(緑色/赤色/青色)の低、中、高及び最大可能用量のグラフトを含有する代替的画像である。
グラフトに観察された非ドーパミン作動性細胞タイプである。各群におけるhKi-67で染色したグラフト片の代表的な顕微鏡写真(図28A)及び立体解析推定数(図28B)である。(図28C)hGFAP(グリア)、(図28D)、Iba1(マイクログリア)及び(図28E)5-HT(セロトニン作動性ニューロン)で染色したグラフト片の代表的な画像である。スケールバーは、(図28A)=100μM、(図28C)=200μM、(図28D)=500μM、(図28E)=1mm(E、差し込み図)=25μMである。Dwass-Steele-Critchlow-Fligner方法を伴うクラスカルウォリス検定により、低用量に対する中用量はP<0.05であり、他はすべてP<0.005である。
in vitroにおけるタンパク質発現の可視化である。mDA標的及びオフターゲットマーカーのiPSC-mDA分化の17、24及び37日目における免疫反応性集団を比較する免疫細胞化学である。画像は、各時点で分析された3つの生物学的複製の代表例である。
短期生着である。(図30A)hNCAM又は(図30B)THで染色された注射の3か月後のインタクトラットにおける、両側G418、D37、D24又はD17線条体グラフトを含有する冠状切片である。
in vitroにおける単一細胞遺伝子発現である。A)FoxA2、B)LMX1A、C)NURR1、D)TH、E)CALB1、F)ETV5、G)EN1、H)BARHL1及びI)GIRK2による、標的マーカーのiPSC-mDA分化の17、24及び36日目のmRNA発現を比較する単一細胞qPCR(Fluidigm)である。96個の個別の細胞を各処理時点で評価した。各細胞のLog2発現値をグラフに単一マーカーとして表した。エラーバーはSEMである。
潜在的に危険な非標的細胞マーカーのFOXG1+及びPAX6+細胞のFCDI DAPC-1フローサイトメトリーアッセイは、前脳ニューロン前駆体の非常に低いパーセンテージを実証している。
0-19DPTからのセロトニン作動性細胞集団のFCDI DAPC-1 qPCRアッセイである。
14DPTでのSERTのFCDI DAPC-1 qPCRアッセイは、バッチにおいて一貫して低い発現を示す。
セロトニン作動性マーカーの5-HTのFCDI DAPC-1 ICCアッセイは、SERT及びTPH2のqPCRの結果を支持する。代表的な画像は、1、8、15及び20-DPTの時点で5-HT(赤色)のICC染色を示す。
例示的実施形態の記載
一部の態様では、本発明は、多能性細胞、例えば人工多能性幹細胞を、in vivoで脳の疾患の処置について顕著に改善した特性を示し得るドーパミン作動性(DA)ニューロン前駆細胞に分化させる組成物及び方法を提供することによって先行技術における制約を克服する。方法は、単一のSMAD阻害物質(「モノSMAD阻害物質」)の存在下で多能性細胞を指定の期間、例えば約360～456時間又はより好ましくは約384～432時間、モノSMAD条件下で分化させることを含む。一般に、及び以前の二重SMAD法とは対照的に、モノSMAD法は、2つのSMAD阻害物質を利用する二重SMAD法とは対照的に1つだけのSMAD阻害物質の使用を含む。NURR1を発現する未成熟ニューロンが、NURR1を発現しないあまり成熟していない前駆細胞よりもより有効であると結論付けた以前の研究(Ganat et al., 2012、Qiu et al., 2017)とは対照的に、中脳ドーパミン作動性(mDA)前駆細胞は、NURR1を発現せず、NURR1を発現するmDA前駆細胞と比較してin vivoでより優れた有効性(例えば、PDの処置のため)を示して本明細書において提供される(例えば、D17細胞)。下の実施例において示されるとおり、これらの指定の期間分化させた中脳DAニューロン前駆細胞を含む細胞培養物は、これらのモノSMAD法を使用して他の期間について分化させた細胞培養物と比較して、in vivoで優れた特性を示すことが驚くべきことに観察され、生着及び神経支配における顕著な改善がPDのラットモデルの処置のためにこれらの細胞を使用して観察され、機能回復の増加が生じた。脳疾患(例えば、PD)を処置する関連する細胞培養物及び方法も提供される。
一部の態様では、PDは、人工多能性幹細胞(iPSC)から分化したmDA細胞の細胞置換治療を投与することによって対象において処置される。下の実施例に示されるとおり、iPSC由来分裂終了mDAニューロンとは対照的に、mDA前駆細胞は、PDなどの脳疾患の細胞移植治療を含む処置について優れた結果を生じることが観察された。移植片の生存期間及び有効性への細胞成熟の効果は、mDA前駆細胞(分化の17日目に凍結保存、D17)、未成熟ニューロン(D24)及び分裂終了ニューロン(D37)を免疫無防備片側パーキンソン病ラットに生着させることによって検討した。D17前駆細胞は、細胞生存期間、線維伸長及びin vivoでの運動障害への有益な効果について、未成熟D24又は成熟D37ニューロンよりも著しく優れていたことが観察された。腹側中脳への黒質内の観察された生着は、D24細胞よりもD17細胞が、線条体を含む前脳構造へのさらに長い距離を超えて神経支配する大きな能力を有したことを実証した。D17細胞が幅広い用量範囲(線条体あたり細胞7,500～450,000個が注射された)にわたって検査された場合、生存しているニューロンの数、神経支配及び機能回復に関して明らかな用量応答が観察された。重要なことに、これらのグラフトはiPSC由来であったが、いかなる動物においてもテラトーマ形成及び他の細胞の顕著な伸長は観察されなかった。これらのデータは、PDの臨床治療処置のためのこれらのiPSC由来D17 mDA前駆細胞の使用を支持する。
I.定義
「多能性(Pluripotency)」又は「多能性(pluripotent)」は、1つ以上の組織又は臓器を構成するすべての細胞に、例えば、3つの胚葉:内胚葉(例えば、胃の内膜、胃腸管、肺)、中胚葉(例えば、筋肉、骨、血液、泌尿生殖器)又は外胚葉(例えば、上皮組織、神経系)のいずれにも分化する潜在力を有する幹細胞又は未分化細胞を指す。
「人工多能性幹細胞」は、iPS細胞又はiPSCと一般に略され、非多能性細胞、典型的には成体体細胞又は、最後まで分化した細胞、例えば、線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、上皮細胞などから、非多能性細胞にリプログラミング因子を導入すること、又はそれに接触させることによって人工的に調製された種類の多能性幹細胞を指す。
「胚性幹(ES)細胞」は、初期胚由来の多能性幹細胞である。
「付着培養物」は、細胞又は細胞の凝集物が表面に接着している培養物である。
「懸濁培養物」は、細胞又は細胞の凝集物が液体培地中に懸濁されている間に複製する培養物を指す。
外部から加えられた構成成分を「本質的に含まない」ことは、培地中に細胞以外の供給源由来の特定の構成成分を含まないか、又は本質的に含まない培地を指す。外部から加えられた増殖因子又はシグナル伝達阻害物質、例えば、TGFβ、bFGF、TGFβスーパーファミリーシグナル伝達阻害物質などを「本質的に含まない」ことは、外部から加えられた構成成分の最低限量又は検出限界以下の量を意味し得る。例えば、TGFβ又はbFGFを本質的に含まない培地又は環境は、5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.01、0.001ng/mL未満又はこの間に導き出せる任意の範囲を含有し得る。例えば、シグナル伝達阻害物質を本質的に含まない培地又は環境は、0.2、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.005、0.001μM又はこの間に導き出せる任意の範囲を含有し得る。
「分化」は、あまり特定化していない細胞が、より特定化している少なくとも1つの新たな細胞型の後代を形成するプロセスである。例えば幹細胞はニューロン前駆細胞に分化でき、ニューロン前駆細胞はDAニューロンに分化できる。
用語「凝集促進培地」は、作用の様式にいかなる制限も含まずに、細胞の凝集物形成を増強する任意の培地を意味する。
用語「凝集物」、すなわち胚様体は、懸濁液中で培養された分化した細胞、部分的に分化した細胞及び/又は多能性幹細胞を含む細胞の均一な又は不均一なクラスターを指す。
「ニューロン」又は「神経細胞」又は「神経細胞型」又は「神経系列」は、任意のニューロン系列細胞を含み得、他に指定しない限り、いかなる限定も伴わずに、ニューロンの個体発生過程の任意の段階の細胞も指すと理解され得る。例えば、ニューロンは、ニューロン前駆細胞及び/又は成熟ニューロンの両方を含み得る。「神経細胞」又は「神経細胞型」及び「神経系列」細胞は、他に指定しない限り、いかなる限定も伴わずに、任意のニューロン系列及び/又は神経の個体発生過程の任意の段階も含み得る。例えば、神経細胞は、ニューロン前駆細胞、グリア前駆細胞、成熟ニューロン及び/又はグリアを含み得る。
特定のタンパク質を「コード」する「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」又は「断片」は、適切な制御配列の調節下に置かれた場合にin vitro又はin vivoで転写され、場合により遺伝子産物、例えば、ポリペプチドに翻訳もされる核酸分子である。コード領域は、cDNA、ゲノムDNA又はRNA形態のいずれかで存在し得る。DNA形態にある場合、核酸分子は一本鎖(すなわち、センス鎖)又は二本鎖であり得る。
用語「導入遺伝子」は、人工的に又は外来性核酸などの天然の手段によって細胞又は生物体に導入された遺伝子、核酸又はポリヌクレオチドを指す。外来性核酸は、異なる生物体若しくは細胞由来であってよい、又は生物体若しくは細胞内に天然に存在する核酸の1つ以上の追加的なコピーであってよい。
用語「プロモーター」は、DNA制御配列を含むヌクレオチド領域を指すその通常の意味で本明細書において使用され、ここで制御配列はRNAポリメラーゼに結合し、下流(3'方向)コード配列の転写を開始することができる遺伝子由来である。
本明細書で使用される場合、「中脳DAニューロン前駆細胞」、「mDAニューロン前駆細胞」、「mDAニューロン前駆細胞」及び「mDA前駆細胞」は、互換的に使用され、FoxA2、Lmx1及びEN1(中脳特異的マーカー)を発現するニューロン前駆細胞を指すが、細胞はNurr1を発現しない。中脳DAニューロン前駆細胞は:GBX2、OTX2、ETV5、DBX1TPH2、TH、BARHL1、SLC6A4、GATA2、NR4A2、GAD1、DCX、NXK6-1、RBFOX3、KCNJ6、CORIN、CD44、SPRY1、FABP7、SLC17A7、OTX1及び/又はFGFR3の1つ以上を発現できる。一部の実施形態では、mDA前駆細胞はTHを発現する、例えば、mDA前駆細胞は、THを発現できないが、追加的な分化の後に、THを発現する能力は保持し得る。mDA前駆細胞は、異なる分化の段階で選択された遺伝子(select gene)を発現し得る。
「神経幹細胞(NSC)」は、自己再生でき、潜在的に制限なく増殖できる多能性細胞であり、ニューロン、アストロサイト及び/又はオリゴデンドロサイトに最終的に分化できる後代細胞を産生できる。NSCの非幹細胞後代は、神経前駆細胞と称される。「神経前駆細胞」は、1つより多い細胞型に増殖及び分化する能力を有する前駆細胞である。神経前駆細胞は、単能性、二能性又は多能性であり得る。神経前駆細胞の特徴的な特性は、幹細胞とは異なり、それが限定的な増殖能力を有し、自己再生を示さないことである。「神経前駆細胞」(NPC)は、神経前駆細胞及び神経幹細胞の両方を含む、神経幹細胞のすべての未分化の後代からなる細胞の混合集団を指す。用語、神経前駆細胞は、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞由来のNSC及び神経前駆細胞の混合集団を記載するために使用され得る。
II.モノSMAD阻害のためのSMAD阻害物質
一部の態様では、多能性細胞は、神経細胞の培養物を産生するためにモノSMAD法を使用して約360～456時間、より好ましくは約384～432時間の期間分化させた。モノSMAD法では、単一のSMAD阻害物質、例えば単一BMPシグナル伝達阻害物質又は単一TGF-βシグナル伝達阻害物質は、多能性細胞(例えば、iPS細胞、ES細胞)をニューロン細胞、例えば、中脳ドーパミン作動性細胞に転換する方法においてSMADシグナル伝達を阻害するために使用される。一般に、及び分化の他の二重SMAD法とは対照的に、モノSMAD分化法は、単一のSMAD阻害物質だけを利用し、第2のSMAD阻害物質は分化培地に含まれない。例えば一部の態様では、多能性細胞は、中脳DAニューロン前駆細胞を含むニューロン前駆細胞の集団に転換され、ここで分化は単一のBMPシグナル伝達阻害物質を含む培地中で生じる。一部の実施形態では、BMP阻害物質は、LDN-193189、ドルソモルフィン又はDMH-1である。BMPシグナル伝達の阻害物質の非限定的な例として、ドルソモルフィン、ドミナントネガティブBMP、切断型BMP受容体、可溶性BMP受容体、BMP受容体-Fcキメラ、ノギン、LDN-193189、フォリスタチン、コーディン、グレムリン(gremlin)、サーベラス/DANファミリータンパク質、ベントロピン(ventropin)、高用量アクチビン及びアムニオンレス(amnionless)が挙げられる。一部の実施形態では、核酸、アンチセンス、RNAi、siRNA又は他の遺伝学的方法は、BMPシグナル伝達を阻害するために使用され得る。本明細書で使用される場合、BMPシグナル伝達阻害物質は、単に「BMP阻害物質」と称される場合がある。BMP阻害物質は、分化の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16日目及び/若しくは17日目又はこの間に導き出せる任意の範囲(例えば、1～17、1～16、1～15、2～15日目など)に分化培地に含まれてよい。一部の実施形態では、BMP阻害物質は分化の1～17日目の全日に分化培地に含まれる。それにもかかわらず、BMP阻害物質は、特定の時期、例えば上記の1、2又は3日目に分化培地から除去され得ると予測される。一部の実施形態では、BMP阻害物質は、場合により11～17日目に分化培地に含まれず、一部の好ましい実施形態ではBMP阻害物質は、1～10日目に分化培地に含まれる。モノSMAD法は、WO2018/035214にさらに考察されている。
一部の実施形態では、BMP阻害物質は、LDN-193189、ドルソモルフィン、DMH-1又はノギンである。例えば、細胞は、約1～2500、1～2000又は1～1,000nM LDN-193189(例えば、約10から500、50から500、50から300、50、100、150、200、250、300、500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250若しくは約2500nM LDN-193189、又はこの間に導き出せる任意の範囲)を含む培地で培養され得る。一部の実施形態では、細胞は、約0.1から10μMドルソモルフィン(例えば、約0.1から10、0.5から7.5、0.75から5、0.5から3、1から3、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.55、1.6、1.65、1.7、1.75、2、2.25、2.5、2.75、3若しくは約2μMドルソモルフィン、又はこの間に導き出せる任意の範囲)を含む培地で培養され得る。一部の実施形態では、細胞は、約1μM DMH-1(例えば、約0.2～8、0.5～2若しくは約1μM DMH-1、又はこの間に導き出せる任意の範囲)を含む培地で培養され得る。LDN-193189、ドルソモルフィン及びDMH-1は、iPS細胞から中脳ドーパミン作動性ニューロン又はmDA前駆細胞を産生するモノSMAD阻害法において良好に使用され得る。一部の実施形態では、BMP阻害物質はK 02288又はDMH2である。
一部の態様では、TGFβ阻害物質は、中脳ドーパミン作動性ニューロン又はmDA前駆細胞を多能性細胞、例えばiPS細胞から生成するためにモノSMAD方法においてSMADを阻害するために使用され得る。例えば一部の実施形態では、分化培地はTGFβシグナル伝達阻害物質を含む。TGFβシグナル伝達の非限定的な例として、LDN-193189、SB-525334、GW788388、A-83-01、GW6604、IN-1130、Κi26894、LY2157299、LY364947(HTS-466284)、A-83-01、LY550410、LY573636、LY580276、NPC-30345、SB-431542、SB-505124、SD-093、Sml6、SM305、SX-007、Antp-Sm2A及びLY2109761が挙げられる。例えば、分化培地中のTGFβ阻害物質はSB431542であり得る。一部の態様では、細胞は約0.1から100μM SB431542(例えば、約1から100、10から80、15から60、20～50の間又は約40μM SB431542)を含む培地で培養される。本明細書で使用される場合、TGFβ受容体阻害物質を含むTGFβシグナル伝達阻害物質は、単に「TGFβ阻害物質」と称される場合がある。一部の実施形態では、TGFβ阻害物質は分化培地に含まれない。一部の実施形態では、TGFβ阻害物質(例えば、SB431542)は、モノSMAD阻害物質として1～3日目又は1、2、3及び/若しくは4日目に分化培地に含まれる。下の実施例に示されるとおり一部の実施形態では、BMP阻害物質は、これらの化合物がTGFβ阻害物質の使用と比較して、多能性細胞の中脳DAニューロン又はmDA前駆細胞への優れた分化をもたらすことが観察されたことから、モノSMAD阻害物質として使用される。
III.MEK阻害物質の含有
一部の態様では、MEK阻害物質は、多能性細胞、例えばiPS細胞から中脳ドーパミン作動性ニューロン又はmDA前駆細胞を産生するために、例えば、BMP阻害物質又はモノSMAD阻害物質との組合せで分化培地に含まれる。一部の実施形態では、MEK阻害物質は、PD0325901である。使用され得るMEK阻害物質の非限定的例として、PD0325901、トラメチニブ(GSK1120212)、セルメチニブ(AZD6244)、ピマセルチブ(AS-703026)、MEK162、コビメチニブ、PD184352、PD173074、BIX 02189、AZD8330及びPD98059が挙げられる。例えば一部の実施形態では、方法は、約0.1から10μMの間(例えば、約0.1から5、0.5から3又は0.5から1.5μMの間)のMEK阻害物質、例えばPD0325901の存在下で細胞を培養することを含む。一部の実施形態では、細胞はMEK阻害物質(例えば、PD0325901)に分化の3、4、5日目又は3～5日目に接触される。
したがってある特定の態様では、細胞を分化させることは、BMP阻害物質、ソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達の活性化因子、Wntシグナル伝達の活性化因子、MEK阻害物質又は前述のものの組合せを含む培地中で多能性細胞の集団を培養することを含み、ここで培地は、外部から加えられたFGF8bを含有しない。一部の場合では、TGFβ阻害物質は、BMP阻害物質の代わりに使用され得る。一部の実施形態では、方法はDA特異的マーカーを使用する細胞の精製を含まない。一部の態様では、多能性細胞は、ニューロンプロモーターの調節下にニューロン細胞の精製のために使用され得る耐性遺伝子を含む(例えば、抗生物質耐性遺伝子を発現するニューロン細胞は抗生物質への曝露で生き残るが、一方で非ニューロン細胞は死滅する)。
一部の実施形態では、中脳DAニューロン前駆細胞は:多能性細胞の集団を得ること、MEK阻害物質(例えば、PD0325901)を含む培地において細胞を神経系列細胞集団に分化させること、ここで培地は分化の1日目に外部から加えられたFGF8bを含有しない、及び中脳DAニューロン又はmDA前駆細胞に富む集団を提供するように神経系列細胞集団の細胞をさらに分化させることを含む方法によって産生され得る。一部の実施形態では、1日目の分化培地でのFGF8(例えば、FGF8b)の含有は、一部の場合、中脳DAニューロン前駆細胞への細胞の分化を妨害するか、又は阻止し得ることが観察された。一部の実施形態では、FGF8は、場合により分化のさらに後の日に、例えば9、10、11、12、13、14、15、16、17日目又はこの間に導き出せる任意の範囲などに分化培地に含まれてもよく、例えば、好ましくはここで多能性細胞の接触は、1日目に分化培地中で単一のSMAD阻害物質を用いて開始される。
IV.Wnt活性化因子又はGSK阻害物質の含有
一部の態様では、Wnt活性化因(例えば、GSK3阻害物質)は、多能性細胞、例えばiPS細胞から中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞を生成するために、例えば、BMP阻害物質又はモノSMAD阻害物質との組合せで分化培地に含まれる。一部の実施形態では、多能性細胞は中脳DAニューロン又はmDA前駆細胞を含むニューロン細胞の集団にであり、ここで分化はWntシグナル伝達の少なくとも第1の活性化因子を含む培地においてである。
種々のWnt活性化因子又はGSK3阻害物質は、本開示の種々の態様において使用され得る。例えば、WNTシグナル伝達の活性化因子は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3(GSK3)阻害物質であり得る。GSK3阻害物質の非限定的な例として、NP031112、TWS119、SB216763、CHIR-98014、AZD2858、AZD1080、SB415286、LY2090314及びCHIR99021が挙げられる。一部の実施形態では、多能性細胞は、SB415286ではない単一のSMAD阻害物質と接触される。一部の実施形態では、Wntシグナル伝達の活性化因子はCHIR99021である。これにより一部の態様では、実施形態による使用のための培養培地は、約0.1から約10μMのCHIR99021(例えば、約0.1から5、0.5から5、0.5から3の間、約1.25から2.25を超える、約1.25、1.5、1.55、1.65、1.7、1.75、1.8、1.9、2.0若しくは約1.75μM CHIR99021、又はこの間に導き出せる任意の範囲)を含む。一部の好ましい実施形態では、約1.6～1.7μM又は約1.65μMのCHIR99021が使用される。
一部の好ましい実施形態では、場合によりWnt活性化因子(例えば、GSK3阻害物質)は、分化の1日目に分化培地に含まれない。一部の実施形態では、Wnt活性化因子又はGSK阻害物質(例えば、CHR99021)は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16日目及び/若しくは17日目に、又はこれらの日の任意の組合せ若しくはすべてにおいて分化培地に含まれる。例えば一部の実施形態では、Wnt活性化因子又はGSK阻害物質は、2～17日目又は3～17日目に分化培地に含まれる。
V.ソニックヘッジホッグ活性化因子
一部の態様では、ソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達の活性化因子は、多能性細胞、例えばiPS細胞から中脳ドーパミン作動性ニューロン又はmDA前駆細胞を生成するために、分化培地に、例えば、BMP阻害物質又はモノSMAD阻害物質との組合せで含まれる。一部の実施形態では、ソニックヘッジホッグ活性化因子は、ソニックヘッジホッグ(Shh)又は変異体Shhである。Shhは、例えば、ヒト又はマウスタンパク質であってよく、又はヒト又はマウスShh由来であってよい。例えば一部の実施形態では、Shhは、変異体マウスShhタンパク質、例えばマウスC25II Shh又はヒトC24II Shhである。一部の実施形態では、分化培地はShh(例えば、C25II Shh)及びSHHの小分子活性化因子、例えばパルモルファミンなど、の両方を含む。いかなる理論にも拘束されるものではないが、Shh及び/又はソニックヘッジホッグの活性化因子は、神経底板(neural floor plate)分化を促進し得る。
一部の実施形態では、mDA前駆細胞は、SHHシグナル伝達の第1の活性化因子を少なくとも含む培地で多能性細胞を培養することを含む方法によって多能性細胞から生成される。例えば、SHHシグナル伝達の活性化因子は、組換えSHHポリペプチド(若しくはその一部)又は小分子活性化因子であり得る。ある特定の態様では、SHHの活性化因子は、Shh C25II、パルモルファミン又はパルモルファミン類似物(例えば、スムーズンドアゴニスト、例えば、SAG-1又は3-クロロ-N-[(1r,4r)-4-(メチルアミノ)シクロヘキシル]-N-[3-(ピリジン-4-イル)ベンジル]ベンゾ[b]チオフェン-2-カルボキサミド)であり得る。それによりある特定の態様では、実施形態による使用のための培養培地は、約0.1から10μMパルモルファミン(例えば、約0.1から20、0.5から10、0.5から5の間、又は約2μMパルモルファミン)を含む。さらなる態様では、培養培地は、約1から1,000ng/ml Shh C25II(例えば、約10から1,000、10から500、50から500又は約100ng/ml Shh C25II)を含む。一部の実施形態では、SHHシグナル伝達の活性化因子は、Shh C25II及びパルモルファミンの両方を含む。例えば細胞は、約0.1から10μMパルモルファミン及び約1から1,000ng/ml Shh C25IIを含む培地で培養され得る。SHH活性化因子(複数可)(例えば、Shh C25II及びパルモルファミン)は、1、2、3、4、5、6及び/又は7日目に分化培地に含まれ得る。一部の実施形態では、SHH活性化因子は、1日目は分化培地から除かれる。例えば種々の実施形態では、SHH活性化因子(複数可)は、1～6又は2～7日目に分化培地に含まれる。
したがってある特定の態様では、多能性細胞は、B27サプリメント、1～3000若しくは1～1000nM LDN-193189(又は0.1から100μM SB431542)、0.1から50μMパルモルファミン、1から1,000ng/ml Shh C25II及び0.1から10μM CHIR99021を含むDMEM/F12培地を用いる付着培養系で1～6日間分化して培養され得る。一態様では培地は、B27サプリメント、200nM LDN-193189(又は10μM SB431542)、2μMパルモルファミン、100ng/ml Shh C25II及び1.25μM CHIR99021を含み得る。一部の実施形態では、MEK阻害物質は、1～2日後に培地に含まれる(例えば、MEK阻害物質は、分化の2～4日目又は2、3及び/若しくは4日目に含まれる)。
VI.多能性幹細胞の供給源
多能性幹細胞は、神経誘導のために本明細書に開示の方法において使用され得る。方法及び組成物は、本明細書において開示され、例えば、改善された治療用特性(例えば、神経変性疾患、例えばPDの処置のため)を有する中脳DAニューロン前駆細胞を産生するために使用され得る。
用語「多能性幹細胞」又は「多能性細胞」は、3つすべての胚層、すなわち内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞を生じさせることができる細胞を指す。理論的には多能性幹細胞は身体の任意の細胞に分化できるが、多能性の実験的判定は、各胚層のいくつかの細胞型への多能性細胞の分化に典型的には基づいている。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、胚盤胞の内部細胞塊由来の胚性幹(ES)細胞である。他の実施形態では、多能性幹細胞は、体細胞をリプログラミングすることに由来する人工多能性幹細胞である。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、体細胞核移植に由来する胚性幹細胞である。多能性幹細胞は、健康な対象(例えば、健康なヒト)又は疾患(例えば、神経変性疾患、パーキンソン病など)を有する対象から得られ得る、又はそれに由来し得る。
A.胚性幹細胞
胚性幹(ES)細胞は、胚盤胞の内部細胞塊由来の多能性細胞である。ES細胞は、発達している胚の外側の栄養外胚葉層を除去し、次いで、非増殖細胞のフィーダー層上で内部細胞塊を培養することによって単離され得る。適切な条件下で、増殖している未分化のES細胞のコロニーが産生される。コロニーは、移され、個々(individual)の細胞に分離され、次いで新鮮フィーダー層上に再度蒔かれ得る。再度蒔かれた細胞は、増殖し続け、未分化のES細胞の新たなコロニーを産生する。次いで新たなコロニーは、移され、分離され、再び蒔かれ、増殖するようにされる。未分化のES細胞を「継代培養」又は「継代」するこのプロセスは、未分化のES細胞を含有する細胞系を産生するように反復され得る(例えば、米国特許第5,843,780号、第6,200,806号、第7,029,913号に記載のとおり)。「初代細胞培養物」は、組織、例えば、胚盤胞の内部細胞塊などから直接得られた細胞の培養物である。「継代培養物」は、初代細胞培養物由来の任意の培養物である。
マウスES細胞を得る方法は十分周知である。一方法では、マウスの129系統由来の着床前胚盤胞は、栄養外胚葉を除くためにマウス抗血清を用いて処置され、内部細胞塊は化学的に不活性化されたマウス胚性線維芽細胞のフィーダー細胞層上で、ウシ胎仔血清を含有する培地中で培養される。発生した未分化ES細胞のコロニーは、ES細胞の集団を産生するためにマウス胚性線維芽細胞フィーダー層上で、ウシ胎仔血清の存在下で継代培養される。一部の方法では、マウスES細胞は、サイトカイン白血病抑制因子(LIF)を血清含有培養培地に加えることによって、フィーダー層の非存在下で増殖され得る(Smith, 2000)。他の方法ではマウスES細胞は、骨形成タンパク及びLIFの存在下で無血清培地中で増殖され得る(Ying et al., 2003)。
ヒトES細胞は、以前記載された方法(Thomson et al., 1995、Thomson et al., 1998、Thomson and Marshall, 1998、Reubinoff et al, 2000.)を使用して胚盤胞から得られ得る。一方法では、5日目のヒト胚盤胞は、ウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清に曝露され、次いで栄養外胚葉細胞を溶解するためにモルモット補体の1:5希釈物に曝露される。溶解した栄養外胚葉細胞をインタクトな内部細胞塊から除去した後に、内部細胞塊は、ガンマ不活性化マウス胚性線維芽細胞のフィーダー層上でウシ胎児血清の存在下で培養される。9から15日後、内部細胞塊由来の細胞の凝集塊は、化学的に(例えば、トリプシンへの曝露)又は機械的に解離され、ウシ胎児血清を含有する新鮮培地中、マウス胚性線維芽細胞のフィーダー層に再度蒔かれる。さらなる増殖により、未分化形態を有するコロニーは、マイクロピペットによって選択され、凝集塊に機械的に解離され、再度蒔かれる(米国特許第6,833,269号を参照されたい)。ES様形態は、明らかに高い核に対する細胞質の比及び顕著な核小体を有する小型のコロニーとして特徴付けられる。得られたES細胞は、短いトリプシン処理又はマイクロピペットによる個々のコロニーの選択によって日常的に継代され得る。一部の方法では、ヒトES細胞は、ES細胞を塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下で線維芽細胞のフィーダー層上で培養することによって血清を用いずに増殖され得る(Amit et al., 2000)。他の例では、ヒトES細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する「条件」培地の存在下でタンパク質マトリックス、例えばMatrigel(商標)又はラミニン上で細胞を培養することによってフィーダー細胞層を用いずに増殖され得る(Xu et al., 2001)。培地は、線維芽細胞を同時培養することによって予め条件付けされてよい。
アカゲザル及びコモンマーモセットES細胞の単離の方法も周知である(Thomson, and Marshall, 1998、Thomson et al., 1995、Thomson and Odorico, 2000)。
ES細胞の別の供給源は、確立されたES細胞系である。種々のマウス細胞系及びヒトES細胞系は周知であり、それらの成長及び増殖のための条件は明らかにされている。例えば、マウスCGR8細胞系は、マウス系統129の胚の内部細胞塊から確立され、CGR8細胞の培養物はフィーダー層を用いずにLIFの存在下で成長できる。さらなる例として、ヒトES細胞系H1、H7、H9、H13及びH14は、Thomson et al.(2000)によって確立された。加えてH9系のサブクローンH9.1及びH9.2は開発された。例えば、参照により本明細書に組み込まれるYu and Thomson, 2008に記載のものなど、当技術分野において周知の実質的に任意のES又は幹細胞系は、本開示と共に使用され得ることが期待される。
ES細胞の供給源は、胚盤胞、胚盤胞の内部細胞塊を培養することに由来する細胞、及び確立された細胞系の培養物から得られた細胞を含み得る。したがって、本明細書で使用される場合、用語「ES細胞」は、胚盤胞の内部細胞塊、内部細胞塊の培養物から得られたES細胞及びES細胞系の培養物から得られたES細胞を指し得る。
B.人工多能性幹細胞
人工多能性幹(iPS)細胞は、ES細胞の特徴を有するが、分化した体細胞のリプログラミングによって得られる。人工多能性幹細胞は、種々の方法によって得られた。一方法では、成人ヒト皮膚線維芽細胞は、レトロウイルス形質導入を使用して、転写因子Oct4、Sox2、c-Myc及びKlf4を用いてトランスフェクトされる(Takahashi et al., 2006、2007)。トランスフェクトされた細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を補充した培地中でSNLフィーダー細胞(LIFを産生するマウス細胞線維芽細胞細胞系)上に蒔かれる。およそ25日後、ヒトES細胞コロニーに似ているコロニーが培養物中に現れる。ES細胞様コロニーは、採取され、bFGFの存在下でフィーダー細胞上で増殖される。一部の好ましい実施形態では、iPS細胞はヒトiPS細胞である。
人工多能性幹細胞は、ヒトES細胞に形態学的に類似しており種々のヒトES細胞マーカーを発現する。ヒトES細胞の分化を生じることが周知である条件下で増殖した場合、人工多能性幹細胞はそれに応じて分化する。例えば人工多能性幹細胞は、ニューロン構造及びニューロンマーカーを有する細胞に分化できる。実質的任意のiPS細胞又は細胞系は、例えば、Yu and Thomson, 2008に記載されるものを含んで、本開示と共に使用され得ることが期待される。当業者に理解されるとおり、種々のiPS細胞系が生成され、これらの確立された細胞系由来のiPS細胞は、本開示の種々の実施形態において使用され得る。
別の方法では、ヒト胎児又は新生児線維芽細胞は、レンチウイルス形質導入を使用して4つの遺伝子Oct4、Sox2、Nanog及びLin28でトランスフェクトされる(Yu et al., 2007)。感染12～20日後、ヒトES細胞形態を有するコロニーは見えるようになる。コロニーは、採取され、増殖される。コロニーを形成している人工多能性幹細胞は、形態学的にヒトES細胞に類似しており、種々のヒトES細胞マーカーを発現し、マウスへの注射後に神経組織、軟骨及び腸上皮を有するテラトーマを形成する。
マウス細胞から人工多能性幹細胞を調製する方法も周知である(Takahashi and Yamanaka, 2006)。iPS細胞の誘導は、Soxファミリー由来の少なくとも1つのメンバー及びOctファミリー由来の少なくとも1つのメンバーの発現又はそれへの曝露を典型的には必要とする。Sox及びOctは、ES細胞同一性を特定する転写制御階層の中心であると考えられている。例えば、SoxはSox-1、Sox-2、Sox-3、Sox-15又はSox-18であってよく、OctはOct-4であってよい。Nanog、Lin28、Klf4又はc-Mycなどの追加的な因子は、リプログラミング効率を増加させることができ、リプログラミング因子の具体的なセットは、Sox-2、Oct-4、Nanog及び、場合によりLin-28を含む、又はSox-2、Oct4、Klf及び、場合によりc-Mycを含むセットであり得る。
ES細胞などのiPS細胞は、SSEA-1、SSEA-3及びSSEA-4(Developmental Studies Hybridoma Bank、National Institute of Child Health and Human Development、Bethesda Md.)並びにTRA-1-60及びTRA-1-81(Andrews et al., 1987)に対する抗体を使用して、免疫組織化学又はフローサイトメトリーによって同定又は確認され得る特徴的な抗原を有する。胚性幹細胞の多能性は、例えば、細胞およそ0.5～10×106個を8～12週齢オスSCIDマウスの後肢筋肉に注射することによって、確認され得る。テラトーマ発達は、3つの胚葉それぞれの少なくとも1つの細胞型を実証する。
iPS細胞は、Octファミリーメンバー及びSoxファミリーメンバー、例えば、上に記載のとおりKlf又はNanogとの組合せでのOct4及びSox2、を含むリプログラミング因子を発現するように改変された体細胞を使用して生成され得る。体細胞は、例えば、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉系細胞、肝臓細胞、胃細胞又はβ細胞などへの多能性を誘導され得る任意の体細胞であり得る。一部の実施形態ではT細胞もリプログラミングのための体細胞の供給源として使用され得る(例えば、参照により本明細書に組み込まれるWO 2010/141801を参照されたい)。
リプログラミング因子は、1つ以上のベクター、例えば、インテグレーティングベクター、染色体にインテグレートしないRNAウイルスベクター(参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第13/054,022号を参照されたい)又はエピソームベクター、例えばEBVエレメントベースのシステム(例えば、参照により本明細書に組み込まれるWO 2009/149233、Yu et al., 2009を参照されたい)に含まれる発現カセットから発現され得る。さらなる態様では、リプログラミングタンパク質又はRNA(例えば、mRNA又はmiRNA)は、タンパク質又はRNAトランスフェクションによって体細胞に直接導入され得る(Yakubov et al., 2010)。
C.体細胞核移植に由来する胚性幹細胞
多能性幹細胞は、ドナー核が紡錘体がない卵母細胞に移行される体細胞核移植の手段によって調製され得る。核移植によって産生された幹細胞は、ドナー核と遺伝的に同一である。体細胞核移植由来の胚性幹細胞を生成する方法は、Tachibana et al., 2013に提供されている。本明細書で使用される場合、用語「ES細胞」は、受精した核を含有する胚由来の胚性幹細胞を指し、核移植によって産生された胚性幹細胞は「NT-ESC」と称される。
VII.分化用培地
本開示のある特定の態様による分化培地は、その基本培地として動物細胞を培養するために使用される培地を使用して調製され得る。一部の実施形態では、分化培地は、単一のBMP阻害物質又は単一のTGFベータ阻害物質だけを使用して多能性細胞を中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞(例えば、D17細胞)に分化させるために使用される。例えば、多能性細胞の分化(例えば、中脳ドーパミン作動性前駆細胞へ)を促進するために使用される分化培地は、単一のBMP阻害物質(例えば、LDN-193189又はドルソモルフィン、例えば、分化の1～17日目、ソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達の活性化因子(例えば、パルモルファミン、ヒトC25II SHH又はマウスC24II SHH;例えば、1～6、2～7若しくは1～7日目)、Wntシグナル伝達の活性化因子(例えば、GSK阻害物質、例えば、CHIR99021、例えば、2～17若しくは3～17日目)及び/又はMEK阻害物質(例えばPD0325901、例えば、2～4若しくは3～5日目)を含み得る。一部の実施形態では、単一のTGFβ阻害物質(例えば、SB-431542、例えば、1～4日目)は、単一のBMP阻害物質の代わりに使用され得る、しかし、一部の実施形態では、単一のBMP阻害物質は、単一のTGF-β阻害物質の使用と比較して、FOXA2+/LMX1A+細胞への優れた分化を生じ得る。一部の実施形態では、FGF-8(例えば、FGF-8b)は、初日又は1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10日目又はこれらの任意の組合せ(例えば、1～8日目)に分化培地に含まれない、例えば、一部の実施形態では、FGF-8は、9、10、11、12、13、14、15、16及び17日目又はこれらの任意の組合せで、分化培地に含まれる。種々の実施形態では、分化培養はTGFβ及びbFGF又はどちらか一方を含有し得る、分化培地は、TGFβ及びbFGFを本質的に含まない。
ある特定の態様では、実施形態による分化の方法は、広範な培地条件を通じた細胞の継代を含み、例えば細胞は、
- 単一のBMP阻害物質(又はTGFβ阻害物質)、ソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達の活性化因子及びWntシグナル伝達の活性化因子、を含む培地での付着培養物中、
- 単一のBMP阻害物質(又はTGFβ阻害物質)、SHHシグナル伝達の活性化因子及びWntシグナル伝達の活性化因子、を含む培地での懸濁物中、ここで細胞凝集物は形成される、
- 成熟のためのB27サプリメント、L-グルタミン、BDNF、GDNF、TGFβ、アスコルビン酸、ジブチリルcAMP及びDAPT(場合により、外部から加えられたレチノール又はレチノイン酸を含まない)を含むニューロベーサル培地での付着培養物中
で培養される。
基本培地として、任意の既知組成の培地、例えば、イーグル基本培地(BME)、BGJb、CMRL 1066、グラスゴーMEM、改良MEM Zinc Option、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、培地199、イーグルMEM、αMEM、DMEM、Ham、RPMI 1640及びフィッシャー培地、これらの変法又は組合せは、使用され得、ここでTGFβ及びbFGFは、含まれても含まれなくてもよい。
さらなる実施形態では細胞分化環境は、サプリメント、例えばB-27サプリメント、インスリン、トランスフェリン及びセレン(ITS)サプリメント、L-グルタミン、NEAA(非必須アミノ酸)、P/S(ペニシリン/ストレプトマイシン)、N2サプリメント(5μg/mLインスリン、100μg/mLトランスフェリン、20nMプロゲステロン、30nMセレン、100μMプトレシン(Bottenstein, and Sato, 1979 PNAS USA 76, 514-517)及び/又はβ-メルカプトエタノール(β-ME)も含有し得る。これだけに限らないが、フィブロネクチン、ラミニン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、レチノイン酸が挙げられる追加的な因子は、加えられても、加えられなくてもよいことは、意図される。
増殖因子は、分化培地に加えられても、加えられなくてもよい。上に概説した因子に加えて、又はその代わりに、増殖因子、例えば、上皮増殖因子ファミリー(EGF)のメンバー、FGF2及び/又はFGF8を含む線維芽細胞増殖因子ファミリー(FGF)のメンバー、血小板由来増殖因子ファミリー(PDGF)のメンバー、トランスフォーミング増殖因子(TGF)/骨形成タンパク(BMP)/増殖及び分化因子(GDF)ファミリーアンタゴニストなどは、プロセスの種々のステップで使用され得る。一部の実施形態では、FGF-8は本明細書に記載のとおり分化培地に含まれる。分化培地に加えられる場合も、加えられない場合もある他の因子として、Notch受容体ファミリーを通じてシグナル伝達を活性化、又は不活性化できる分子が挙げられ、これだけに限らないが、デルタ様及びJaggedファミリーのタンパク質並びにガンマセクレターゼ阻害物質及びDAPTなどのNotchプロセシング若しくは切断の他の阻害物質が挙げられる。他の増殖因子として、インスリン様増殖因子ファミリー(IGF)、ウイングレス関連(WNT)因子ファミリー及びヘッジホッグ因子ファミリーのメンバーが挙げられる。
追加の因子は、神経幹細胞/前駆細胞の増殖及び生存、並びにニューロン生存及び分化を促進するために凝集形成及び/又は分化培地に加えられてよい。これらの神経栄養因子として、これだけに限らないが、神経増殖因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン-3(NT-3)、ニューロトロフィン-4/5(NT-4/5)、インターロイキン6(IL-6)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、カルジオトロフィン、トランスフォーミング増殖因子(TGF)/骨形成タンパク(BMP)/増殖及び分化因子(GDF)ファミリーのメンバー、これだけに限らないがニュールツリン、ニューブラスチン(neublastin)/アルテミン(artemin)及びパーセフィンが挙げられるグリア由来神経栄養因子(GDNF)ファミリー、並びに肝細胞増殖因子に関連する及びこれを含む因子が挙げられる。分裂終了ニューロンを形成するように最終的に分化した神経培養物は、これだけに限らないが、5-フルオロ2'-デオキシウリジン、マイトマイシンC及び/又はシトシンβ-D-アラビノフラノシド(Ara-C)が挙げられる有糸分裂阻害物質又は有糸分裂阻害物質の混合物も含有し得る。
培地は、血清含有培地又は無血清培地であってよい。無血清培地は、未処理又は未精製の血清を含まない培地を指し、それにより、精製された血液由来成分又は動物組織由来成分(例えば、増殖因子)を含む培地を含み得る。異種性の動物由来成分の混入を防ぐ観点から、血清は幹細胞(複数可)と同じ動物由来であり得る。一部の実施形態では、培地は規定培地であり、培地は血清又は他の動物組織由来成分を含有しない(例えば、照射されたマウス線維芽細胞又は照射された線維芽細胞フィーダー細胞を用いて調整された培地)。
培地は、血清の代替物を含有しても、含有しなくてもよい。血清の代替物として、アルブミン(例えば、脂質リッチアルブミン、組換えアルブミンなどのアルブミン代用物、植物デンプン、デキストラン及びタンパク質加水分解物)、トランスフェリン(又は他の鉄輸送体)、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオグリセロール(thiolglycerol)又はこれらの等価物を適切に含有する材料が挙げられる。例えば、血清の代替物は、国際公開第98/30679号に開示される方法によって調製され得る。代替的に、市販で入手可能な材料は、さらなる利便性のために使用され得る。市販で入手可能な材料として、ノックアウト血清リプレースメント(KSR)及び既知組成の脂質濃縮物(Chemically-defined Lipid concentrate)(Gibco)が挙げられる。
培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸(例えば、非必須アミノ酸)、ビタミン(複数可)、増殖因子、サイトカイン、抗酸化物質、2-メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤及び無機塩も含有し得る。2-メルカプトエタノールの濃度は、例えば、約0.05から1.0mM、詳細には約0.1から0.5若しくは0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1、1.5、2、2.5、5、7.5、10mM又は任意の中間の値であり得るが、幹細胞(複数可)を培養するために適切である限り濃度は、具体的にこれらに限定されない。
一部の実施形態では、多能性幹細胞は、神経誘導及び底板パターン形成を改善するために凝集形成の前に培地で培養される(例えば、凝集形成を誘導するように単一細胞又は小さな凝集物に解離される前)。本発明のある特定の実施形態では、幹細胞はフィーダー細胞、フィーダー細胞抽出物及び/又は血清の非存在下で培養され得る。
B.培養条件
細胞(複数可)を培養するために使用される培養容器として、具体的に限定されないが:その中で細胞を培養することができる限り、フラスコ、組織培養用フラスコ、スピナーフラスコ、ディッシュ、ペトリディッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、管、トレイ、CellSTACK(登録商標)Chambers、培養バッグ及びローラーボトルを含む。細胞は、培養物の必要に応じて、約0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、800、1000、1500mL以上又はこの間に導き出せる任意の範囲の体積で培養され得る。ある特定の実施形態では、培養容器は、生物学的に活性な環境を支持する任意のデバイス又はシステムを指し得るバイオリアクターであり得る。バイオリアクターは、約2、4、5、6、8、10、15、20、25、50、75、100、150、200、500リットル、1、2、4、6、8、10、15立方メートル以上又はこの間に導き出せる任意の範囲の体積を有してよい。
培養容器表面は、細胞付着を有して、又は目的に応じずに調製されてよい。細胞付着培養容器は、細胞への容器表面の付着性を改善するために細胞付着用の任意の物質、例えば、細胞外基質(ECM)を用いてコーティングされ得る。細胞付着のために使用される基質は、幹細胞又はフィーダー細胞(使用される場合)を接着する目的の任意の物質であり得る。細胞付着のための非限定的な基質として、コラーゲン、ゼラチン、ポリ-L-リシン、ポリ-D-リシン、ポリ-L-オルニチン、ラミニン、ビトロネクチン及びフィブロネクチン並びにこれらの混合物、例えば、Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫細胞由来タンパク質混合物(例えば、Matrigel(商標)又はゲルトレックス)及び溶解した細胞膜調製物(Klimanskaya et al., 2005)が挙げられる。一部の実施形態では、細胞付着培養容器は、カドヘリンタンパク質、例えば、上皮カドヘリン(E-カドヘリン)を用いてコーティングされる。
他の培養条件は、適切に決定され得る。例えば、培養温度は約30から40℃、例えば約31、32、33、34、35、36、37、38、39℃以上であり得るが、具体的にはこれらに限定されない。CO2濃度は約1から10%、例えば約2から7%又はこの間に導き出せる任意の範囲であってよい。酸素分圧は約1、5、8、10、20%以上又はこの間に導き出せる任意の範囲であってよい。
付着培養は、ある特定の態様で使用され得る。所望により細胞は、フィーダー細胞の存在下で培養され得る。フィーダー細胞が使用される場合、間質細胞、例えば胎性線維芽細胞は、フィーダー細胞として使用され得る(例えば、Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual(1994)、Gene Targeting, A Practical Approach(1993)、Martin(1981); Evans et al.(1981)、Jainchill et al.,(1969)、Nakano et al.,(1996)、Kodama et al.(1982)並びに国際公開第01/088100号及び第2005/080554号を参照)。一部の実施形態では、フィーダー細胞は細胞培養培地に含まれておらず、細胞は定められた条件を使用して培養され得る。
他の態様では、懸濁培養物は使用され得る。使用され得る懸濁培養物は、担体上の懸濁培養物(Fernandes et al., 2007)又はゲル/バイオポリマー封入を含む(米国特許公開第2007/0116680号)。幹細胞の懸濁培養物は、培養容器又は培地中のフィーダー細胞(使用される場合)に関して非付着条件での細胞(例えば、幹細胞)の培養物を一般に含む。幹細胞の懸濁培養物は、幹細胞の解離培養物及び幹細胞の凝集懸濁培養物を一般に含む。幹細胞の解離培養物は、懸濁された幹細胞の培養物、例えば、単一の幹細胞又は複数の幹細胞(例えば、細胞約2から400個)から構成される小さな細胞凝集物のものを含む。解離培養が継続される場合、培養され、解離された細胞は、幹細胞のより大きな凝集物を通常形成し、それにより凝集懸濁培養物は、産生又は利用され得る。凝集懸濁培養法として、胚様体培養法(Keller et al., 1995を参照されたい)及びSFEB(無血清胚様体)法(Watanabe et al., 2005)、国際公開第2005/123902号)が挙げられる。
C.多能性幹細胞の培養
多能性幹細胞、例えばES細胞を調製及び培養する方法は、細胞生物学、組織培養並びにテラトカルシノーマ及び胚性幹細胞を含む発生学の標準的なテキスト及び総説に見出すことができる: Guide to Techniques in Mouse Development (1993)、Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro (1993)、Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy (1998)、すべて参照により本明細書に組み込まれる。組織培養において一般に使用される標準的な方法は、Animal Cell Culture (1987)、Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (1987)及びCurrent Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology (1987 & 1995)に記載されている。
体細胞はリプログラミング因子を導入された又はそれに接触された後に、これらの細胞は多能性及び未分化な状態を維持するために十分な培地中で培養され得る。人工多能性幹(iPS)細胞の培養は、例えば、これにより参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第2007/0238170号及び米国特許公開第2003/0211603号及び米国特許公開第2008/0171385号に記載のとおり、霊長類多能性幹細胞、胚性幹細胞又はiPS細胞を培養するために開発された種々の培地及び技術を使用できる。当業者に周知のとおり多能性幹細胞の培養及び維持のための追加的な方法が使用され得ることは理解される。
ある特定の実施形態では、定められていない条件が使用される場合がある、例えば、多能性細胞は、幹細胞を未分化状態に維持するために線維芽細胞フィーダー細胞上で、又は線維芽細胞フィーダー細胞に曝露された培地で培養される場合がある。代替的に、多能性細胞は、定められたフィーダー不含有培養系、例えばTeSR培地(Ludwig et al., 2006a、Ludwig et al., 2006b)又はE8培地(Chen et al., 2011、PCT/US2011/046796)を使用して本質的に未分化な状態で培養及び維持され得る。フィーダー不含有培養系及び培地は、多能性細胞を培養及び維持するために使用され得る。これらのアプローチは、マウス線維芽細胞「フィーダー層」を必要とせずに、ヒト多能性幹細胞が本質的に未分化な状態を維持できるようにする。
種々のマトリックス構成成分が、ヒト多能性幹細胞を培養する、維持する又は分化させるために使用され得る。例えば、その全体が参照により組み込まれるLudwig et al. (2006a、2006b)に記載のとおり、コラーゲンIV、フィブロネクチン、ラミニン及びビトロネクチンは組合せで、多能性細胞増殖のための固体支持体を提供する手段として培養表面をコーティングするために使用され得る。
Matrigel(商標)もヒト多能性幹細胞の細胞培養及び維持のための基質を提供するために使用され得る。Matrigel(商標)は、マウス腫瘍細胞によって分泌されるゼラチン状のタンパク質混合物であり、BD Biosciences (New Jersey、USA)から市販で入手可能である。この混合物は、多数の組織において見出される複雑な細胞外環境に類似しており、細胞培養のための基質として細胞生物学者によって使用される。一部の実施形態では、E-カドヘリン(例えば、組換えE-カドヘリン基層)は、多能性細胞、例えば、ヒト多能性細胞又はヒトiPS細胞の培養及び維持のための基質として提供される。関連する方法は、例えば、Nagaoka et al. (2010)に示されている。
D.単一細胞継代
多能性幹細胞培養の一部の実施形態では、培養容器がいっぱいになると、コロニーは解離に適した方法によって凝集細胞に、又はさらに単一細胞に分割され、次いで細胞は継代のために新たな培養容器に置かれる。細胞の継代又は分割は、長期間の培養条件下で細胞が生き延び、増殖できるようにする技術である。細胞は、それらが約70%～100%コンフルエントである場合に典型的には継代される。
多能性幹細胞の単一細胞解離に続く単一細胞継代は、細胞増殖を促進すること、細胞選別、分化のための規定の播種並びに培養手順及びクローン増殖の自動化を可能にすることなどのいくつかの有利点を有して本方法において使用され得る。例えば、単一細胞にクローン的に由来する後代細胞は、遺伝子構造において均一であり得、及び/又は細胞周期が同期しており、標的にする分化を増加させることができる。単一細胞継代の例示的方法は、参照により本明細書に組み込まれるUS 2008/0171385に記載されている。
ある特定の実施形態では、多能性幹細胞は、単一の個々の細胞、又は単一の個々の細胞の組合せに、及び細胞2、3、4、5、6、7、8、9、10個以上を含む小さな細胞クラスターに解離され得る。解離は、機械力によって、又は細胞解離剤、例えばキレート剤、クエン酸ナトリウム(クエン酸Na)又は酵素、例えばトリプシン、トリプシンEDTA、Accutase、TrypLE Selectなどによって達成され得る。細胞の解離は、細胞を解離する化学的分離(例えば、キレーター若しくは酵素を使用する)及び/又は機械的かき混ぜを使用して達成され得る。
多能性幹細胞の供給源及び増殖の必要性に基づいて、解離された細胞は、個々に又は小さなクラスターで新たな培養容器に約1:2、1:4、1:5、1:6、1:8、1:10、1:20、1:40、1:50、1:100、1:150、1:200以下又はこの間に導き出せる任意の範囲などの分割比で移されてよい。懸濁物細胞系の分割比は、培養細胞懸濁物の体積で行われてよい。継代間隔は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20日間以下又はこの間に導き出せる任意の範囲ごとであり得る。例えば、さまざまな酵素的継代プロトコールでの達成可能な分割比は、1:2で3～7日ごと、1:3で4～7日ごと及び1:5から1:10でおよそ7日ごと、1:50から1:100で7日ごとであり得る。高い分割比が使用される場合、継代間隔は、少なくとも12～14日又は過剰な自発的分化若しくは細胞死による細胞損失を有さない任意の期間に延長され得る。
ある特定の態様では、単一細胞継代は、クローニング効率及び細胞生存期間を増加させるために有効な小分子、例えば、ROCK阻害物質又はミオシンII阻害物質の存在下であってよい。ROCK阻害物質又はミオシンII阻害物質、例えば、Y-27632、HA-1077、H-1152又はブレビスタチンは、有効濃度で、例えば、約0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50から約100μM以上又はこの間に導き出せる任意の範囲で使用され得る。
E.幹細胞の分化
改善された治療特性(例えば、パーキンソン病を処置するためなど)を有するmDA前駆細胞を生成する方法が本明細書で提供される。多能性幹細胞の分化は、種々の手段で、例えば接着したコロニーにおいて、又は細胞凝集物の形成によって、例えば、低接着環境において誘導されてよく、ここでこの凝集物は、胚様体(EB)と称される。EB内の分子的及び細胞の形態学的シグナル及び事象は、発達中の胚でのそのような細胞の天然の個体発生過程の多くの態様を模倣する。細胞をニューロン分化に方向付ける方法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国公開第2012/0276063号に提供されている。DAニューロン分化についてのさらなる詳細及び具体的なプロトコールは、参照により本明細書に組み込まれるPCT公開第WO2013/067362号に提供されている。
胚様体(EB)は、多能性幹細胞、例えばES細胞又はiPS細胞由来であり得る細胞の凝集物であり、マウス胚性幹細胞を用いて研究されている。in vivoでの分化に固有のいくつかの合図を再現するために、三次元凝集物(すなわち、胚様体)は中間のステップとして生成され得る。細胞凝集の始めに、分化は開始され得、細胞は胚発生を限定的な程度で再現し始める。それらは栄養外胚葉組織(胎盤を含む)を形成できないが、生物体に存在する他の実質的にすべての種類の細胞を発生できる。神経分化は、凝集物形成に続いて促進され得る。
細胞凝集は、非組織培養処置プレート又はスピナーフラスコでの懸滴、プレーティングによって強いられる場合があり、いずれの方法も典型的なコロニー増殖を形成するように細胞が表面に付着することを妨げる。ROCK阻害物質又はミオシンII阻害物質は、多能性幹細胞を培養するために凝集物形成の前、その間又は後に使用され得る。
多能性幹細胞は、細胞培養の分野において周知の任意の方法を使用して凝集促進培地に播種され得る。例えば、多能性幹細胞は、単一のコロニーとして、又はクローンの群として凝集促進培地に播種され得、多能性幹細胞は、本質的に個々の細胞としても播種され得る。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、当技術分野において周知の機械的又は酵素的方法を使用して本質的に個々の細胞に解離される。非限定的な例の方法により、多能性幹細胞は、細胞と培養表面との間及び細胞自体の間の接続を破壊するタンパク分解酵素に曝露され得る。凝集物形成及び分化のために多能性幹細胞を個別化するために使用され得る酵素として、これだけに限らないが、その種々の市販の製剤でのトリプシン、例えばTrypLE、又は酵素の混合物、例えばAccutase(登録商標)が挙げられる。ある特定の実施形態では、多能性細胞は、培養表面での培養物形成のための培養培地に本質的に個々の(又は分散された)細胞として添加又は播種され得る。
例えば、分散された多能性細胞は、培養培地に播種され得る。これらの実施形態では、培養表面は、当技術での標準的な無菌性細胞培養法、例えば、非付着表面と適合性である任意の材料で本質的に構成され得る。培養表面は、本明細書に記載のマトリックス構成成分を追加的に含み得る。一部の実施形態では、マトリックス構成成分は、細胞及び培地に表面を接触させる前に培養表面に適用され得る。
コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、matrigelなどの基質は、分化を誘導するために使用され得る。分化は、増殖誘導増殖因子の存在下で懸濁物中に細胞を置くことによっても、増殖を再開することなく(すなわち、ニューロスフェアを解離することなく)誘導され得る。
一部の実施形態では、細胞は培養培地中の固定された基質上で培養される。次に増殖誘導増殖因子は、細胞に投与され得る。増殖誘導増殖因子は、細胞が基質(例えば、ポリオルニチン処置プラスチック又はガラス)に付着し、平板化し、さまざまな細胞型に分化し始めるようにできる。
V.非静置培養
ある特定の態様では、非静置培養は多能性幹細胞の培養及び分化のために使用され得る。非静置培養は、例えば、プラットフォーム又は培養容器、特に大体積回転バイオリアクターを振とうすること、回転させること又は撹拌することを使用して、細胞が調節された移動速度に保たれる任意の培養であり得る。一部の実施形態では、ロッカーテーブル(rocker table)は使用され得る。かくはんは、栄養分及び細胞老廃物の循環を改善でき、より均一な環境を提供することによって細胞の凝集も調節できる。例えば回転速度は、少なくとも又は最大で約10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100rpm又はこの間に導き出せる任意の範囲に設定され得る。多能性幹細胞、細胞凝集物、分化した幹細胞又はこれら由来の後代細胞のための非静置培養におけるインキュベーション期間は、約4時間、8時間、16時間若しくは1、2、3、4、5、6日間若しくは1、2、3、4、5、6、7週間以上又はこの間に導き出せる任意の範囲であってよい。
VI.細胞の遺伝的変更及び精製
一部の実施形態では、本明細書で提供される細胞、例えばmDA前駆細胞は、遺伝的に変更されてよい。細胞は、ポリヌクレオチドが人工的操作の任意の好適な手段によって細胞に移行された場合、又は細胞が、ポリヌクレオチドが遺伝され、変更された元の細胞の後代である場合に「遺伝的に変更された」又は「トランスジェニック」であると呼ばれる。一部の実施形態では、細胞は抗生物質耐性遺伝子を例えばニューロンプロモーター、例えばMAP2プロモーターなどの調節下に含み得る。例えば、一部の実施形態では、マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子であり、ニューロン細胞は、細胞培養物を抗生物質に曝露し、それによりニューロン細胞に分化していない細胞を死滅させることによって精製され得る。例えば、MAP2プロモーターの調節下でネオマイシン遺伝子を発現する細胞は、非ニューロン細胞を死滅させるためにG418に曝露され得る。本発明と共に使用され得る追加的な方法は、その全体において部分放棄を含むことなく、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第14/664,245号に記載されている。
一部の実施形態では、ドーパミン作動性ニューロンを含む細胞の集団は、分裂細胞を死滅させる有糸分裂阻害物質又は化学療法剤に細胞を曝露することによって精製され得る。例えば、一部の実施形態では、本発明の方法によって産生された未成熟中脳DAニューロン(例えば、D27～D31細胞)を含む細胞の集団は、例えば、分裂細胞を死滅させるために細胞をマイトマイシンCに接触させることによって精製され得る。
VII.ドーパミン作動性ニューロン及びドーパミン作動性ニューロン前駆体の使用
本明細書で提供されるmDA前駆細胞(例えば、D17細胞)は、種々の適用において使用され得る。これらの方法として、これだけに限らないが、in vivoでの細胞の移植又は埋め込み;in vitroでの細胞傷害性化合物、発癌物質、変異原増殖/制御因子、医薬化合物などのスクリーニング;神経変性の機序の解明;いずれの薬物及び/又は増殖因子によって機序が作動するかを研究すること;遺伝子治療;並びに生物学的に活性な産生物の産生が挙げられる。
A.試験化合物スクリーニング
本明細書で提供される中脳DA前駆体(例えば、D17細胞)は、本明細書で提供されるDAニューロン又はmDA前駆細胞の特徴に影響を与える因子(例えば、溶媒、小分子薬、ペプチド及びポリヌクレオチド)又は環境条件(例えば、培養条件若しくは操作)をスクリーニングするために使用され得る。
一部の適用では、幹細胞(分化した又は未分化)は、神経系列に沿う細胞の成熟を促進する、又は長期間の培養でそのような細胞の増殖及び維持を促進する因子をスクリーニングするために使用され得る。例えば、候補の神経成熟因子又は増殖因子は、異なるウエル中の幹細胞にそれらを添加すること、次にさらなる培養及び細胞の使用のための望ましい判断基準により、生じたすべての表現型変化を判定することによって検査され得る。
本開示のスクリーニング適用は、薬物研究における医薬化合物の検査を含む。検査の標準的な方法は、例えば、In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997)に提供されている。実施形態のある特定の態様では、本明細書で詳述される方法によって産生された細胞は、短期間培養において初代ニューロンに以前実施されたように、標準的な薬物スクリーニング及び毒性アッセイ(例えば、細胞系列に特異的な疾患を処置するための治療用分子を同定するため、確認するため及び機能の特定のため又は送達を検査するための検査)のための検査細胞として使用され得る。候補医薬化合物の活性の評価は、本発明のある特定の態様で提供されたニューロンを候補化合物と組み合わせること、化合物に起因する細胞の電気生理学、形態学的、マーカー表現型又は代謝活性におけるすべての変化を決定(未処置細胞と又は不活性化合物を用いて処置された細胞と比較)すること、及び次に化合物の効果と観察された変化との相互関係を比較することを一般に含む。スクリーニングは、化合物がニューロン細胞に薬理学的効果を有するように設計されるという理由、又は他所で効果を有するように設計された化合物が意図しない神経の副作用を有する可能性があるという理由のいずれでも行われてよい。2つ以上の薬物は、可能性がある薬物間相互効果を検出するために組合せで検査され得る(細胞と同時に又は連続的に組み合わせることによって)。
一部の応用では化合物は、潜在的な神経毒性についてスクリーニング又は検査され得る。細胞傷害性は、最初に細胞生存率、生存期間、形態学又は培養培地への酵素の漏出への影響によって決定され得る。一部の実施形態では、検査は、化合物(複数可)が毒性を生じることなく細胞機能(例えば、神経伝達又は電気生理学)に影響を与えるかどうかを決定するために実施される。
B.中枢神経系の疾患の処置
1.中枢神経系の疾患
本明細書で提供されるドーパミン作動性ニューロン及びmDA前駆細胞(例えば、D17細胞)は、中枢神経系(CNS)の疾患を有する個体において神経細胞を再生するために移植され得る。一部の実施形態では、本発明の方法により産生されたmDA前駆細胞は、CNS疾患を処置するために対象に投与され得る(例えば、パーキンソン病を処置するために脳又は中脳、例えば尾状核、被殻又は黒質に投与される)。そのような疾患として、これだけに限らないが、神経変性疾患、例えば、パーキンソニズムが挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「パーキンソニズム」は、運動を調節する脳の部分である基底核におけるドーパミンの不足にすべて関連する疾患の群を指す。症状として、振戦、運動緩慢(極度の動作緩慢)、屈曲姿勢、姿勢不安定性及び硬直が挙げられる。パーキンソニズムの診断は、これらの症状のうちの少なくとも2つの存在が必要であり、そのうちの1つは振戦又は運動緩慢である必要がある。パーキンソニズムの最も一般的な形態は、特発性又は古典的パーキンソン病(PD)であるが、診断の無視できない少数の診断、全体の約15パーセントは、パーキンソンプラス症候群(PPS)の1つが存在する場合がある。これらの症候群は、非定型パーキンソニズムとしても周知であり、大脳皮質基底核変性症、レビー小体病、多系統萎縮症(multiple systematrophy)及び進行性核上性麻痺を含む。一般的にパーキンソン病は、脳の、主に、黒質と呼ばれる脳の領域での重要な神経細胞の機能不全及び死を含む。これらの重要な神経細胞の多くはドーパミンを産生する。これらのニューロンが死んだ場合、ドーパミンの量が減少し、ヒトが運動を正常に調節できないようにする。腸管もパーキンソン病患者において退化するドーパミン細胞を有し、これが、疾患の一部である胃腸管症状における重要な原因因子である可能性がある。個体が経験する詳細な症状は、ヒトによって変動する場合がある。パーキンソン病の主な運動徴候として、次の:手、腕、脚、あご及び顔面の振戦、運動緩慢又は動作緩慢、四肢及び躯幹の硬直及びこわばり並びに姿勢不安定性又は平衡障害及び協調運動障害が挙げられる。
一部の実施形態では、iPSC由来mDA前駆細胞(例えば、D17細胞)は、他のiPSC由来成熟mDAニューロンと比較してPDの臨床処置のための改善された特性を示し得る。底板中間体を介して分化したiPSC由来mDAニューロンは、片側性の6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)病変を有する胸腺欠損ラットに生着でき、長期間生存し、薬物誘導運動非対称性を低減又は戻すことができる(Hiller et al., 2020、Wakeman et al., 2017)。発生の種々の段階にある細胞は、以前移植された(Bye, Thompson, & Parish, 2012、Kirkeby et al., 2012、Kriks et al., 2011、Niclis et al., 2017)。
一部の実施形態では、本明細書において提供されるmDA前駆細胞は、疾患、例えばPDの臨床処置のための優れた特性を示し得る。下の実施例に示されるとおり、1)臨床的に使用され得るmDA前駆細胞の生成をもたらすiPSCの系及び分化プロセスが開発された、2)免疫無防備ラットにおけるiPSC由来mDA前駆細胞(in vitroで17日目に凍結保存された)の線条体内グラフトは、6-OHDA誘導運動非対称性を完全に元に戻し、多数が生存し、宿主線条体を高密度に神経再支配し、24及び37日目に凍結保存された細胞のグラフトより優れている、3)D17前駆細胞は、in vivoで成熟し、適切なmDA系列を維持することが観察された、4)黒質に置かれたD17及びD24グラフトは、通常は終脳中心ドーパミン系によって神経支配される複数の宿主標的への長距離の軸索増殖を示した、5)高用量のD17前駆細胞は、低用量よりも早く、より完全な機能回復を細胞生存期間及びグラフト由来TH神経支配における対応する増加と共にもたらした、並びに6)本発明者らの分化プロトコールに供されたiPSCを移植した場合に、テラトーマ及び細胞の過剰な増殖のいずれも観察されなかった。本明細書で提供されるmDA前駆細胞は、臨床的に使用された場合に上に列挙された上記有利点の1つ以上又はすべてを示し得る。
一部の実施形態では、mDA前駆細胞(例えば、D17細胞)は、ドーパミン作動性ニューロンの死が関与する脳疾患又は脳傷害、例えば、パーキンソン病(PD)を処置するために患者に投与される。下の実施例に示されるとおり、mDA前駆細胞は、PDの動物モデル(すなわち、片側パーキンソン病ラット)を使用してin vivoで生着、神経支配及び機能的有効性が観察された。mDA前駆細胞又は前駆細胞(17日目に凍結保存された、「D17」)、未成熟mDAニューロン(「D24」)及び精製mDAニューロン(「D37」)は、検査され、市販で入手可能なR&Dグレード精製mDAニューロン(D38、「G418」)と比較された(Hiller et al., 2020、Wakeman et al., 2017)。D17又はD24細胞は、黒質(SN)にグラフトされた場合に長距離神経支配をもたらすことが観察された。D17 mDA前駆細胞は、最もロバストな生存期間及び線維伸長を有することが観察され、用量範囲探索実験(dose-ranging experiment)は片側パーキンソン病ラットにおいて機能的回復の早期開始をもたらした最低用量を決定するために使用された。これらの結果は、本明細書で提供されるmDA前駆細胞が、哺乳動物対象、例えばヒトにおいてPDを処置するために使用され得ることを実証した。
本明細書に開示されるmDA前駆細胞(例えば、D17細胞)の種々の薬用量は、哺乳動物対象、例えばヒトに治療用に投与され得ることが期待される。例えば、細胞約2,500個/μLから細胞約150,000個/μL、細胞約10,000個/μLから細胞約150,000個/μL、細胞約40,000個/μLから細胞約100,000個/μL、細胞約15,000個/μLから細胞約45,000個/μL、細胞約3×106～9×106個、細胞2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、1×104、2×104、3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104、9×104、1×105、1.1×105、1.2×105、1.3×105、1.4×105又は1.5×105個/μLの中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞、又はこの間に導き出せる任意の範囲は、哺乳動物対象、例えばヒトに投与され得る。哺乳動物対象、例えばヒト患者に投与される細胞の総数は約1×105から約100×106個の範囲であってよく、細胞の総数は対象の症状及び他の特徴に基づいて臨床医によって選択され得ることが期待される。好ましくは、細胞は対象の脳に投与される。例えばmDA前駆細胞は、対象の線条体、例えば被殻又は黒質に投与され得る。一部の場合では、mDA前駆細胞を対象の脳の1カ所に投与することは十分であり得る。他の実施形態では、mDA前駆細胞は、対象の脳(例えば、線条体又は被殻)の複数の部位に、及び/又は複数の針管で投与される。ヒト対象では、線条体中の複数の部位でのmDA細胞の投与は、一部の場合では、mDA前駆細胞によるより広範な神経支配を促進し得ることが期待される。
2.細胞を投与する方法
本明細書で提供される細胞は、局所的又は全身性にのいずれかで対象に投与され得る。一部の好ましい実施形態では、mDA前駆細胞(例えば、D17細胞)は、対象の脳に投与される。DAニューロンを対象に投与する方法、例えば、脳への定位投与は、当技術分野において周知であり、本明細書で提供される細胞及び細胞培養物に適用され得る。患者が自分自身の細胞由来の細胞を受ける場合、これは自家移植と呼ばれ、そのような移植片は、拒絶の可能性が低い。
幹細胞又は分化したニューロン細胞を対象、特にヒト対象に投与する例示的方法として、対象の標的部位(例えば、線条体及び/又は黒質)への細胞の注射又は移植が挙げられる。mDA前駆細胞は、対象への細胞の注射又は移植による誘導を促進する送達デバイスに挿入され得る。そのような送達デバイスとして、レシピエント対象の身体に細胞及び液体を注射するための管、例えば、カテーテルが挙げられる。好ましい一実施形態では、管は追加的に針、例えばシリンジを有し、それを通じて本発明の細胞は、所望の位置で対象に導入され得る。幹細胞は、そのような送達デバイス、例えば、シリンジにさまざまな形態で挿入され得る。例えば、細胞は、溶液に懸濁されてよく、細胞凝集物であってよく、又は代替的にそのような送達デバイスに含有される場合は支持マトリックスに埋め込まれてよい。
幹細胞、ニューロン又はニューロン前駆細胞が組み込まれ得る又は埋め込まれ得る支持マトリックスは、レシピエント適合性であり、レシピエントに有害でない産生物に分解するマトリックスを含み得る。支持マトリックスは、天然の(例えば、ヒアルロン酸、コラーゲンなど)及び/又は合成の生分解性マトリックスであり得る。使用され得る合成生分解性マトリックスとして、合成ポリマー、例えば、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル及びポリ乳酸が挙げられる。一部の実施形態では、ドーパミン作動性ニューロン(例えば、完全に分化していないドーパミン作動性ニューロン)は、ヒアルロン酸マトリックスに埋め込まれ、神経変性疾患(例えば、パーキンソン病)を処置するために対象に投与される。
本明細書で使用される場合、用語「溶液」は、その中で本発明の細胞が生存可能なままである薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む。薬学的に許容される担体及び希釈剤として、生理食塩水、水性緩衝液、溶媒及び/又は分散媒が挙げられる。そのような担体及び希釈剤の使用は、当技術分野において周知である。溶液は、好ましくは無菌であり、容易なシリンジ通過性(syringability)が存在する程度の流動性である。
好ましくは溶液は、製造及び保存の条件下で安定であり、微生物、例えば細菌及び真菌の夾雑作用に備えて保存される。一部の実施形態では、mDA前駆細胞(例えば、D17細胞)を含有する溶液は、BSS PLUS(Alcon、Fort Worth、TX)の無菌溶液中で患者に投与される。所望により、保存剤又は抗生物質は、投与のための医薬組成物に含まれてよい。本発明の溶液は、本明細書に記載のmDAニューロン前駆細胞を薬学的に許容される担体又は希釈剤に、及び所望により他の成分に組み込むことによって調製され得る。
3.薬用量及び投与
一態様では、本明細書に記載の方法は、対象におけるニューロン前駆細胞(例えば、D17細胞)又はDAニューロンの生着を増強する方法を提供する。一部の実施形態では、対象は哺乳動物、例えば、ヒトである。
組成物は、投与製剤と適合性の様式で、治療有効量で投与される。投与される量及び時期は、処置される対象、活性成分を利用する対象の系の能力及び望まれる治療効果の程度によって決まる。投与される必要な各活性成分の正確な量は、開業医の判断によって決まり、各患者又は対象に固有であり得る。好適な薬用量の範囲は、投与の経路に応じて決まる場合があり、種々の投与方法が使用され得る。
本明細書に開示されるmDA前駆細胞(例えば、D17細胞)の種々の薬用量は、哺乳動物対象に治療用に投与され得る。例えば、細胞約2,500個/μLから細胞約150,000個/μL、細胞約10,000個/μLから細胞約150,000個/μL、細胞約40,000個/μLから細胞約100,000個/μL、細胞約15,000～45,000個/μL、細胞約1×106～9×106個/μL、約2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、1×104、2×104、3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104、9×104、1×105、1.1×105、1.2×105、1.3×105、1.4×105又は1.5×105個の中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞、又はこの間に導き出せる任意の範囲は、哺乳動物対象、例えばヒトに投与され得る。哺乳動物対象、例えばヒト患者に投与される細胞の総数は約1×105から約100×106個の範囲であってよく、細胞の総数は対象の症状及び他の特徴に基づいて臨床医によって選択され得ることが期待される。一部の実施形態では、mDA前駆細胞は、哺乳動物対象、好ましくはヒト患者の脳又は中枢神経系に注射を介して(例えば、脳の単一の部位又は複数の部位、例えば線条体又は被殻に)投与される。
4.有効性
DAニューロン生着を増強するための所与の処置の有効性は、当業者により決定され得る。しかし、本明細書において用語が使用される場合、処置は、本明細書に記載の細胞集団を用いた処置後に、例えば、不十分なDAニューロン生着の徴候又は症状のいずれか1つ又はすべてが有益なように変更される、他の臨床的に認められた症状が改善される、又はさらに、例えば少なくとも10%回復する、場合に「有効な処置」と考えられる。有効性は、入院加療、医療介入の必要性(すなわち、疾患の進行が停止される)又は生着不全の頻度によって評価される個体の悪化の不在によっても測定され得る。これらの指標を測定する方法は、当業者に周知である及び/又は本明細書に記載されている。処置は、個体又は動物における(一部の非限定的な例としてヒト又は哺乳動物が挙げられる)疾患の任意の処置を含み、:(1)疾患を抑制すること、例えば、生着不全を予防すること、又は(2)疾患を緩和すること、例えば、1つ以上の症状の軽減を生じることが挙げられる。疾患の処置のための有効量は、それを必要とする哺乳動物に投与された場合に、疾患に対する処置又は治療利益を生じるために十分である量を意味する。薬剤の有効性は、身体的指標、例えば、DAニューロン生着、例えば、振戦、運動緩慢、屈曲姿勢、平衡及び協調などについて評価することによって決定され得る。一部の実施形態では、生着又は神経機能は、代謝、活性、ドーパミン作動性神経伝達(例えば、ドーパミン作動性系をイメージングするためにPETトレーサーを使用する)を検出するためにPETスキャンを使用してin vivoで(例えば、ヒトにおいて)測定され得る。有効性は、パーキンソン病の動物モデルにおいて、例えば、行動試験、例えば、ステップテスト又はシリンダーテストを実施することによって評価され得る。
C.市販用、治療用及び研究用目的の流通
製造、流通及び使用の目的のために、神経細胞、例えば、本明細書に記載の中脳DAニューロン前駆細胞は、細胞培養物又は懸濁物の形態で、等張の賦形剤又は培養培地中に、場合により輸送又は保存を容易にするために凍結されて供給され得る。
本明細書で記載されるmDA前駆細胞は、例えば、製造、流通又は使用の際の任意の時点で存在する細胞のセット又は組合せを含むさまざまな試薬系を使用して提供され得る。細胞セットは、本開示に記載される2つ以上の細胞集団の任意の組合せを含んでよく、これだけに限らないが、プログラミング由来細胞(神経系列細胞、それらの前駆体及びサブタイプ)、未分化幹細胞又は他の分化した細胞型との組合せが例示される。セットの細胞集団は、同じゲノム又はその遺伝子改変された形態を共有し得る。セットの各細胞型は、合わせて又は別々の容器に、同じ施設又は異なる場所で、同時に又は異なる時期に、同じ主体の又は取引関係を共有する異なる主体の管理(control)下でパッケージされ得る。
IV.[実施例]
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示されている技法は、本発明の実践に良好に機能することを本発明者たちに発見された技法を代表し、よって本発明の実践の好ましい様式を構成すると考えられ得ることを、当業者は理解するべきである。しかし、当業者は、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行い、依然として、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく同様又は類似の結果を得ることができることを、本開示を踏まえて理解するべきである。
[実施例1]
細胞培養物を生成する物質及び方法
Essential 8培地中のVTN-TNに拡大されたヒト人工多能性幹(iPS)細胞系の中脳ニューロン分化を、表1に詳述されている様々な分化培地組成及びスケジュールを使用して小分子及び増殖因子誘導により実施した。一般に、iPS細胞を1日目にD1 DAニューロン誘導培地、2日目にD2ニューロン誘導培地、並びに3及び4日目にD3-D4 DA誘導培地で培養した。5日目に、細胞をTrypLEで15分間解離させ、DAクエンチ培地に収集してから、細胞をスピナーフラスコ懸濁培養に移してD5 DAニューロン凝集形成培地に凝集体を形成させた。
6日目に、凝集体を沈降させ、約66%の培地を除去し、凝集体をDAニューロン誘導培地に供給した。7～16日目に、凝集体をDAニューロン凝集維持培地に毎日供給し、培地を11目から16日目まで取り換えた。17日目に、凝集体をTrypLEにより単一細胞懸濁液に解離し、D17 DAニューロン凝集平板培養培地中のMatrigelに平板培養した。18、20、22日目に、培地をDopaニューロン成熟培地に交換した。24日目に、細胞を、Accutaseを使用して解離し、DAニューロン成熟平板培養培地で平板培養した。翌日に、培地をDopaニューロン成熟培地に交換した。
27及び29日目に、培地をDAニューロン成熟培地+マイトマイシンCに交換した。31日目に、細胞をAccutaseで解離し、ポリ-L-オルニチン(PLO)/ラミニンコーティングフラスコのDAニューロン成熟平板培養培地で再平板培養した。次に、32、34及び36日目に細胞をDopaニューロン成熟培地に供給した。37又は38日目に、細胞をAccutaseで再び解離し、分析に付した又は後の使用のために凍結保存した。
Essential 8培地中のVTN-TNに拡大されたヒト人工多能性幹(iPS)細胞系の中脳ニューロン分化を、表2に詳述されている様々な分化培地組成及びスケジュールを使用して小分子及び増殖因子誘導により実施した。一般に、iPS細胞を1日目にD1 DAニューロン誘導培地、2日目にD2ニューロン誘導培地、並びに3及び4日目にD3-D4 DA誘導培地で培養した。5日目に、細胞をTrypLEで15分間解離させ、DAクエンチ培地に収集してから、細胞をスピナーフラスコ懸濁培養に移してD5 DAニューロン凝集形成培地に凝集体を形成させた。
6及び7日目に、凝集体を沈降させ、約66%の培地を除去し、凝集体をD6-7 DA誘導培地(6及び7日目)に供給した。8～10日目に、凝集体をD8-10 DA凝集維持培地に毎日供給した。11～16日目に、凝集体をD11-16 DA凝集維持培地に毎日供給した。17日目に、凝集体を、TrypLEにより単一細胞懸濁液に解離し、15分間クエンチで静置(DAクエンチ培地1)してから、洗浄して凍結保存培地に凍結保存した。凍結保存細胞を液体窒素の気相で貯蔵した。
[実施例2]
mDA前駆体パターン化
方法の17日目にFoxA2及びLmx1を同時発現する細胞のパーセンテージにより測定すると、mDA前駆体の効率的なパターン化には、一般に、製造プロセスの終了時にmDAニューロンの高濃縮集団を得る必要がある。17日目に大部分の細胞がmDA前駆体ではない場合、得られるニューロンは、非中脳表現型ニューロンの大集団を有する、或いは典型的にはニューロン脱離をもたらす、又は有糸分裂後のニューロンを精製することに困難さ若しくは不能をもたらす、増殖細胞の成長を有する。
benzonase(登録商標)(エンドヌクレアーゼ、EMD Millipore)をインキュベーションに5日目に10U/mLの濃度で含めた改変を伴って、これらのmono-SMAD実験を繰り返した。インキュベーションに5日目にbenzonase(登録商標)を含めることは、凝集形成における過剰な凝集塊化を低減又は防止することが観察された。
[実施例3]
FoxA2/Lmx1同時発現のフローサイトメトリーアッセイ
FoxA2/Lmx1同時発現は、ドーパミンニューロン前駆体パターン化の成功のために重要な読取りであり、したがって、免疫細胞化学画像に実行される細胞計数ソフトウエアを使用して誘導される結果より主観性及び変動性が少ない細胞内フローサイトメトリーアッセイを開発した。このアッセイは、分析されたICC画像からの計数に相関する結果を伴って、17日目から24日目の処理においてFoxA2及びLmx1を同時発現する細胞のパーセンテージを正確に定量化することができる。前駆体パターン化は、細胞が17日目に>65%のFoxA2+/Lmx1+である場合に成功したと考えられる。
[実施例4]
iPSC-mDAニューロンからのドーパミン放出
iPSC系「K」(21534.101)を分化させて処理を完了し(37日目)、凍結保存した。細胞を解凍し、高密度(8.8×105/cm2)で平板培養した。細胞を、DAPTを有さない成熟培地に3日目毎に合計で14日間にわたって供給した。アッセイ当日、細胞を洗浄し、HBSS(56mMのKClを伴う又は伴わない)で30分間インキュベートした。放出溶液中のドーパミン濃度を、競合ドーパミンELISAキット(Eagle Biosciences)を使用して決定した。iPSC由来前脳ニューロン(iCell Neurons)からは、ドーパミン放出は検出されなかった。逆に、最適化mono-SMADi方法(DA Therapy Neurons)を使用して誘導されたiPSC-mDA細胞は、最適化dual-SMAD方法(iCell DopaNeurons)を使用して誘導された細胞と少なくとも同じほどドーパミンを分泌した。よって、細胞は、成熟ドーパミンニューロンの主要な機能的特質を実施することができる。
[実施例5]
iPSC-mDAニューロンの電気的活性
凍結保存iPSC-mDAニューロンを解凍し、PEIコーティング48ウエル多電極アレイ(MEA)プレートに平板培養した。細胞を、米国特許出願第14/830,162号における FUJIFILM Cellular Dynamics, Incの適用プロトコール「Measuring synchronous neuronal activity on the Maestro multielectrode array」に従って培養した。最適化mono-SMADiプロトコール(DA Therapy)により作製されたニューロンは、最適化dual-SMADi protocol(iCell Dopa G100)により作製された細胞と比較して、平均発火率(mFR)、バースト(マクロBPMS)及び接続性を含む、類似した電気的活性を実証した。平均発火率(mFR)、頻度、及び接続性、バースト強度は経時的に増加し、解凍のおよそ16日後に横ばいになった。時間ラスタープロットは、ウエル中のすべての電極における明瞭なスパイク間間隔、高いバースト強度及びバースティングを示し、高度な電気的活性を実証した。
[実施例6]
FCDI DAPC-1ニューロンの定量的遺伝子発現プロファイル
方法の37日目に、RNAを、最適化mono-SMADi方法(バッチ1～4)を使用して誘導されたiPSC-mDA細胞の4つのバッチ及び最適化dual-SMADiプロトコール(iCell DopaNeurons)を使用して誘導されたiPSC-mDA細胞の1つのバッチから抽出した。RNAを単離した後、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を、TaqMan Gene Expression Assays(Applied Biosystems)を使用して実施し、結果をGAPDH対照に対する相対的発現として表した。値<10-4をバックグラウンドと考える(網掛けボックス)。中脳及びmDAニューロンマーカーの発現は、バッチ間で類似し、異なるプロトコールを使用して作製された細胞間で類似していた。非中脳領域又は非mDA細胞タイプのマーカーは低く、mono-SMADi及びdual-SMADi由来細胞間でも類似していた。結果を図12及び図13に示す。
[実施例7]
ラットのパーキンソン病モデル系におけるiPSC-DA前駆体及びニューロンの生着
iPSC系「K」を最適化mono-SMADiプロトコールを使用して分化し、分化過程の異なる段階(17日目、24日目及び37日目)に凍結保存した。加えて、最適化dual-SMADiプロトコール(iCell Dopa)を使用して誘導されたiPSC-mDA細胞を、方法の37日目に凍結保存した。細胞を解凍し、6-OHDA治療されたが無症候性のヌード(RNU)ラット(n=1群当たり3匹)の線条体の両側に移植した(注射1回当たり4.5×105細胞)。3か月後、細胞の生着及び神経支配を冠状切片の組織学により評価した。ニューロン生着及び神経支配が4群すべてに観察されたが(Human NCAM染色)、iPSC-DA前駆細胞(17日目)及び未成熟mDAニューロン(24日目)は、より成熟したmono-SMADi及びdual-SMADi由来mDAニューロン(それぞれ37日目及び37日目、Cell Dopa)と比較して、遙かに大きなグラフト及び著しい神経支配を有した。加えて、多数のDAニューロン(TH+)が、前駆体及び未成熟DAニューロングラフトに観察された。Ki67染色は、37日目の細胞におけるグラフトに増殖細胞がほとんどないこと、並びに17日目及び24日目の細胞におけるグラフトにKi67+細胞がほとんどないことを明らかにした。腫瘍、神経成長又は他の有害効果は、これらの動物のいずれにも観察されなかった。これらの結果は、最適化mono-SMADi分化方法における早期(17～24日目)に取り出した細胞が、より成熟した細胞と比較して良好に生着及び神経支配できることを示唆している。結果を図9に示す。
[実施例8]
上記の実験を、様々なCHIR濃度を使用して繰り返した。結果を図18に示す。結果に示されているように、約1.5～約1.75μMのCHIR99021濃度を使用した場合、顕著な改善が観察された。
[実施例9]
mDA前駆細胞の特徴付け
iPSC由来中脳ドーパミンニューロン前駆細胞を含有する凍結保存単一細胞懸濁液(「FCDI DAPC-1」)を、上記実施例に記載された方法を介して生成した。ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞の集団を得る定方向分化を介して、同種ヒトiPSC系(FCDI命名21534.101)から細胞を誘導した。
FOXA2フローサイトメトリーアッセイを、上記実施例に記載されたように生成されたmDA前駆細胞に実施した。FOXA2フローサイトメトリーアッセイは、mDA前駆細胞が、FCDI DAPC-1の正確な底板パターン化を示したことを指し示した。結果を図1に示す。
FOXA2/LMXフローサイトメトリーアッセイは、FCDI DAPC-1 mDA前駆細胞におけるFOXA2及びLMXの同時発現を明らかにした。並行ICC染色を比較のために実施し、黄色に見える同時発現細胞が観察された。結果を図2に示す。
解凍後培養の12日後に、FCDI DAPC-1 mDA前駆細胞は、NURR1発現により実証されるように、未成熟DAニューロンに分化する潜在性を有する。並行ICC染色も実施した。結果を図3に示す。
MAP2/ネスチンフローサイトメトリーアッセイを使用して、解凍の14日後に成熟(有糸分裂後)ニューロンになる潜在性を有する細胞のパーセンテージを確認した。代表的なバッチの結果を図4に示す。相互排他的ネスチン共染色を、MAP+集団のより良好な分離及びゲーティングのために含めた。
FCDI DAPC-1(「PD Therapy Cells」、開発初期の方法の変形形態)に類似した細胞によるドーパミン分泌を、成熟培地で5週間培養した後に測定した。30分のインキュベーションの際にHBSSに放出されたドーパミンの濃度を測定した。細胞の脱分極(HBSS+56mMのKCl)の後に、高い値を得た。
FCDI DAPC-1細胞を、抗PAX6(Biolegend #901301)(図5A)又は抗FOXG1(図5B)で染色した。iCell GABA Neuron(FCDI)が陽性対照として示されており、これらは前脳表現型にパターン化された細胞であり、主にGABA作動性であり、PAX6+ニューロンの分集団を含有し、FOXG1+ニューロンの分集団も含有する。結果を図5A～Bに示す。
REX1、TDGF1及びNODALのRT-QPCRアッセイは、DA前駆細胞においてスパイクした阻害的シナプス後電流(iPSC)を検出することができる(FCDI DAPC-1方法)。REX1アッセイは最も高感度のものであり、FCDI DAPC-1方法の100,000個の細胞毎に1個のiPSCを再現的に検出する。結果を図6に示す。
上記に示されたように、ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞は、表現型マーカー(図1及び図2)を表示し、発育中脳の黒質領域に見出されるドーパミンニューロン前駆体(図3、図4)に類似した発育潜在性を表示した。FCDI DAPC-1は、治療用途に有害であり得る有意な前脳ニューロン及び残存iPSCを欠いている(図5A～B、図6及び表3)。重要なことに、他のDA細胞治療用生成物と異なり、FCDI DAPC-1は、EdU組み込みにより実証されたように、増殖性前駆細胞であることが観察された(図7)。
[実施例10]
PD動物モデルにおけるin vivoでの運動障害の低減
パーキンソン病(PD)の動物モデルである6-OHDA病変胸腺欠損ヌードラット(RNUCrl:NIH-Foxn1rnu)をさらなる研究に使用した。これらの動物は、有意な運動障害を表示し、これはアンフェタミン誘導回転試験を使用して観察することができる(Blesa et al., 2014; Campos et al., 2013; Deumens et al., 202;Vermilyea, et al., 2018)。上記の実施例に記載されたように産生されたドーパミン作動性前駆ニューロン(D19)を、マウスの黒質に投与し、このことが動物の運動障害を軽減するかを、アンフェタミン誘導回転試験を使用して観察することによって決定した。下記に考察されているように、成熟D37ニューロンは、動物の運動障害を改善しなかったが、マウスへのD17及びD19ドーパミン作動性前駆ニューロンの投与は、in vivoにおいて6か月までに運動障害を完全に逆転させることができた。
黒質線条体ドーパミン系に片側損傷を有するラット(例えば、神経毒、例えば、6-ヒドロキシドーパミン、α-シヌクレインの過剰発現又は毒性シヌクレインプロトフィブリルの注射により誘導された)を、パーキンソン病に見られるドーパミンニューロンの欠失を模倣する実験モデルとして使用した。アンフェタミン回転試験は、病変により誘導される運動機能障害の程度をモニターするために一般的に使用され、この試験は、移植誘導機能回復を実証する又はDAニューロン機能を保存若しくは回復させることを目的とした神経保護介入の有効性を実証する標準的なツールにもなっている。この試験は、例えば、Wakeman et al., 2017に記載されている。
アンフェタミン回転を、上記に記載されたラットPDモデルにおいて試験した。図8に示されているように、17日目の(D17)ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞の投与は、アンフェタミン回転試験で観察すると、6か月までにラットにおいて運動症状の軽減をもたらした。D24未成熟ニューロンは、運動能力を改善したが、D24ニューロンの効果は、D17ニューロンの効果より少ないと思われ、このことは4か月及び6か月の時点で特に注目された。
脳スライスの免疫組織化学染色を、ラットの線条体へのニューロンの投与の6か月後に脳スライスに実施した。NCAM発現の増加が、成熟D37又はiCell(登録商標)Dopaニューロンと比較して、D17又はD24ニューロンの投与後に観察された。これらの結果は、前駆(D17)及び未成熟(D24)mDAニューロンが、生着において成熟(D37)mDAニューロンより能力が優れていることを示す。
線条体神経再支配が移植の6か月後に観察された。D17細胞の線条体神経支配は、試験した他のニューロンと比較すると最高であると思われた。D17及びD24細胞は、D37又はiCell(登録商標)Dopaニューロンと比較して、神経支配に顕著な改善を示した。結果を図9に示し、線条体へのグラフトの黒質内神経支配の例を図10に示す。
前駆体マーカーを、qPCRを使用してD17、D24及びD37細胞で測定した。D17及びD24細胞を比較すると、Lmx1、Nurr1及びPitx3は、D24細胞に高レベルで発現しており、一方、En-1、Pax8、ETV5及びGlastは、D17細胞に高レベルで発現している(図11)。成熟マーカーも細胞において測定し、AQP4及びチロシンヒドロキシラーゼ(TH)は、D17細胞と比較してD24細胞に高いレベルで発現している(図12)。様々な分化期間(D17、D24及びD37の時点)の後に生成された異なる細胞タイプにおける異なる遺伝子の正規化発現に関する追加のデータを、図19に示す。これらの結果は、D17ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞と比較して、D24細胞から成熟ドーパミン作動性ニューロンへの分化の増加と一致している。免疫細胞化学もD24及びD27細胞に実施し、結果を図13に示す。免疫細胞化学(ICC)実験の結果は、qPCR知見と一致した。
代替的細胞タイプの機能試験は、D19「中間」ドーパミン作動性細胞の投与が、6か月の時点で運動障害を完全に逆転できたことを示した。これらの細胞は、D17平板培養培地中のLN521に平板培養し、次いでニューロン成熟培地マイナスDAPT D16-18に供給し、D19で凍結したが、CHIR濃度を1.75から1.65μMに変更したD15まで、表2の記載された方法に従い、benzonaseをD5及びD17クエンチ培地に添加した改変を伴った。D19動物は、4か月で機能改善を示し始め、この群は、再凝集体(解離され、一晩で小さいサイズに再凝集され、D18に凍結されたD17細胞)又はこれらの対照細胞(再凝集体が作成されたD17細胞)と比較して、急速な改善を見せた。再凝集体及びこれらの対照細胞は、改善が実現される前の4か月時点では運動障害を維持していた。各動物に注射された細胞の総数は、D19では動物1匹当たり平均して290kであり、再凝集体では平均して333kであり、再凝集対照では動物1匹当たり平均して369kであった。再凝集体及び再凝集対照群のそれぞれにおいて、複数の動物(N=3匹)を試験した。D19動物群は、N=10匹の動物を有した。結果を図15に示す。
[実施例11]
D17ドーパミン作動性前駆ニューロンの発現
脳スライスを生着の6か月後にヒト核(hNuc)、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)及びKi67の存在について染色した。THは、ドーパミン作動性ニューロン及びドーパミン作動性ニューロン前駆体ニューロンによるドーパミンの産生に関与する。Ki67は、細胞増殖に関与する遺伝子である。h-Nucは、ニューロン前駆細胞により発現される遺伝子マーカーであり、さらなる細胞拡大が生着後に起こるかを評価するために測定した。結果を図16に示す。DAB方法を使用してHuNucleiが染色された40μmの冠状切片の全シリーズを、Stereo Investigator光分留器(Microbrightfield Bioscience、バージョン10.40)を使用して60×倍率で数えた。TH(12番目毎の連続切片)及びHuNuclei(12番目毎の連続切片)の立体解析パラメーターは、HuNuclei(Gundersen m=1)では平均CE=0.13を有するグラフト総面積の9%を数えるためのフレームサイズ(75μm×75μm)及びグリッドサイズ(250μm×250μm)であり、TH(Gundersen m=1)では平均CE=0.17を有するグラフト総面積の12.6%を数えるためのフレームサイズ(80μm×80μm)及びグリッドサイズ(225μm×225μm)であった。パーセンテージは、各グラフトにおけるhNuc、TH及びKi67陽性細胞の計算数に基づいて計算した。細胞の総投入数により割られた細胞の総計算数は、陽性パーセントを生じる。
図16A～Cに示されているように、各群平均は、hNucの100%を超える陽性を示し、生着後の細胞拡大を示している。殺処分の6か月時点では、Ki67陽性集団は、D18及び再凝集体を除いて、平均してhNuc集団の1%未満を占める。Ki67のこの低いパーセンテージは、細胞が生着の6か月後にはもはや増殖しないという概念を支持するが、生着日後早期の生着細胞の増殖能を反映していない。全群で100%を超える平均hNuc陽性を有することは、生着後早期の増殖細胞タイプが、もはや増殖しないが、ヒト起源マーカーを保持する最終的細胞タイプに変化したことを示唆している。TH陽性細胞のパーセンテージは、この動物研究では以前に見られたものより遙かに低い。この群の平均は10～15%のあたりであり、一方以前は、本発明者たちは20～30%の範囲の平均TH+パーセントを経験している。
hNuc、TH及びKi67の立体解析学的分析を実施した。12番目毎の切片 (シリーズの1/2)を、hNuclei、TH又はhKi67で染色し、不偏立体解析により定量化した。各動物において、グラフト域の輪郭を取り、数えた。各グラフは独自のY軸を有する。結果を図17A～Cに示す。
平均及び平均標準誤差(SEM)を含む、各試験群における各動物のhNuc陽性細胞の数を図17Aに示す。このマーカーの使用は、hNuclei-irである細胞がヒト起源(注射試験物質)のものであることを実証している。D17のT75新鮮群は、他のすべての群と比較して最大範囲の生着hNuc+細胞を示す。他のすべての群は、その群内のすべての動物で一貫した細胞の生着を有すると思われる。各群の平均は、試料によってばらつきがある。一元配置ANOVA検定を使用する分析は、D17 T75のhNuc+細胞の平均数に統計的有意性があることを示す。新鮮及びD19群(p=0.0385)。
平均及びSEMを含む、各試験群における各動物のTH陽性細胞の数を図17Bに示す。TH-ir陽性細胞は、ドーパミンを産生することができる細胞タイプを示し、その細胞は、移植の前に実施された切除による試験物質からのものである。D17 T75 6時間群(定量化すると1匹の動物のみが染色を有した)を除いて、すべての群は、生着したTH+細胞に類似した数を示し、平均しておおよそ60,000個の細胞である。一元配置ANOVA検定は、TH生着についてこれらの処置群に統計的な差はないことを示している。
図17Cは、各群の各動物のKi67陽性細胞の数、平均及びSEMを示す。Ki67-ir細胞は、分裂/伝播が可能である細胞タイプを示す。このアッセイに使用される特異的抗体は、ヒト特異的であり、ヒト起源の細胞にのみ結合する。これらの結果は、投与された細胞が非常に低い率の細胞増殖を表示することを示す。
in vivoにおける行動の改善は、D17細胞が投与された6-OHDA病変動物において観察された。in vivoにおけるD17前駆体の特徴付け、並びに機能、生存及び神経支配についての分析を、図20A～Jに示す。手術前、並びに生着の2、4及び6か月後に測定した、d-アンフェタミン誘導回転の時間ベース分析である(図20A)。低、中、高又は最大可能用量のグラフトに含有されたhNuclei-ir細胞の立体解析推定値である(図20B)。TH-ir細胞の立体解析推定値(図20C)及び各群における立体解析推定値(図20D)の定量化を実施した。グラフト切片は、hGFAP(図20E)、5-HT(図20F)の陽性染色を示した。低、中、高及び最大可能用量のD17細胞を、hNuclei(図20G)、TH(図20H)、免疫蛍光三重標識hNuclei/TH/FoxA2(図20I)及びTH/Girk2/カルビンディン(図20J)について画像化した。これらの結果は、パーキンソン病の動物モデルを使用して観察すると、D17細胞を投与して、in vivoにおいて行動能力を回復できることを実証している。
[実施例12]
物質及び方法
以下の方法を実施例10～12に記載されている実験に使用した。
病変及び生着:雌ヌードラットは、8～9週齢で6-OHDA病変を受けた。神経毒を内側前脳束に直接投与し、同時にラットを定位装置において麻酔をかけた。ラットを、アンフェタミンを使用した病変後の3週間毎に試験し、Rotometerを使用して測定した回転数をスコア付けした。病変の成功(30分間に≧5回/分の回転)を示す動物を、アンフェタミン回転データに基づいて実験処置群に無作為に分配して、細胞又はビヒクル対照を受けさせた。新たに調製した細胞を150,000細胞/μLの濃度で3μLの体積(動物1匹当たり40,000個の細胞)により、ラットの線条体に直接注射した。
回転測定:病変の後、動物は、病変側に向かって回転行動(周回)を示し、病変が成功したことを指し示している。この行動は、脳内のドーパミンの量を増加させるアンフェタミンを使用して誘導された。ラットをチャンバーに5分間順応させた後、回転を90分間追跡し、5分毎にビニングし、平均正味毎分回転数を計算した。アンフェタミン回転を生着後の2か月毎に測定した(図1)。アポモルヒネ注射を使用して、病変半球の反対方向への回転を追跡した。アポモルヒネ誘導回転を、60分間追跡し、生着後の3か月毎に測定した(図2)。
死後分析:ラット(6か月)に麻酔をかけ、氷冷0.9%食塩水、続いて4%パラホルムアルデヒドで経心的に灌流した。脳を取り出し、4%パラホルムアルデヒドで18～24時間後固定してから、スクロース勾配(10%、20%、30%)中に設置し、沈下させた。すべての脳を凍結スレッジミクロトームにおいて40μm冠状切片に切片化し、適用可能であればニッケル増強を伴う3,3'-ジアミノベンジン(DAB)を使用する免疫組織化学又は蛍光免疫細胞化学で処理した。TH及びHuNuclei(シリーズの1/2)の立体解析パラメーターは、60×倍率で数えたTH(Gundersen m=1)の平均CE=0.14を有する総面積の9%を数えるためのフレームサイズ(80μm×80μm)及びグリッドサイズ(350μm×350μm)であった。グラフトを含有する切片(12番目の切片毎)をKi-67で染色した。グラフト体の全面積(100%)を、Olympus BX61を使用して数えた。Ki67+細胞の数を、5つの切片で数えたKi67+細胞の数の合計の12×で計算する。
[実施例13]
in vitroにおけるmDA前駆細胞の特徴付け
以前の移植研究は、研究グレードiPSC由来mDAニューロン、及び同じ分化プロトコール(Hiller et al., 2020; Wakeman et al., 2017)の変形を使用して作製された細胞を利用した。細胞治療の開発における次の段階では、cGMP製造及び臨床用途に好適な方法に移行するステップを取った。臨床グレードヒトiPSC系を使用した。iPSCマスターセルバンク及びワーキングセルバンクを、cGMP条件下で製造した。iPSC-mDA分化の初期段階を、小分子阻害剤のタイミング及び濃度を変更することによって適合させた。安全性及び規制の問題に対処するため、分化方法に使用される原材料は、可能な場合は臨床グレードのものであった。最も進行した成熟段階(D37)に分化したiPSC-mDAニューロンを、低濃度のマイトマイシンCを使用して増殖細胞を除去する以前に記載された分化方法(Hiller et al., 2020)によって濃縮した(図21A)。この手法は、R&DグレードG418細胞に使用される薬物選択カセットの必要性を迂回した。mDA前駆体(D17)及び未成熟(D24)mDAニューロンをマイトマイシンCで濃縮することができず、それは、これらが依然として増殖性であるからであり、よってこの実験の主な目的は、適合分化方法(濃縮ステップを用いない)が、グラフト化D17及びD24細胞において不要な細胞増殖を防止するのに適切であるかを決定することであった。
以前の研究は、ヒトiPS-mDAニューロンが高レベルの局所的中脳マーカー、並びに低レベルの前脳及び後脳マーカーを発現し得るという証拠を提供した(Hiller et al., 2020; Wakeman et al., 2017)。類似した遺伝子発現パネルを使用して、翻訳用途に適合された分化方法を使用して作製された細胞を特徴付けた(図21B、表5)。分化のすべての段階(17、24及び37日目)は、局所的中脳マーカーのOTX2、FOXA2及びLMX1Aを高レベルで発現した。EN1は、D17で最も高く発現し、D24までに減少し、この発現レベルをD37まで維持した。より成熟したmDAマーカー(NURR1、TH、DAP、GIRK、CALB)は、D17で非常に低いレベルで発現し又は全く発現せず、D24からD37まで漸進的な増加を示した。PITX3発現は、D24で最高であった。良好な生着を予測することが報告されたマーカー(Kirkeby et al., 2017)のETV5及びSPRY1は、全段階で発現し、一方、CNPY1は、D17及びD24で低い発現を有し、D37ではほぼ検出不能であった。非mDA細胞タイプ、例えば、運動(PHOX2A、HB9)、コリン作動性(CHAT)、グルタミン酸作動性(VGLUT1)、GABA作動性(GAD1)及びセロトニン作動性(SERT)ニューロンのマーカーの発現レベルは、分化のすべての段階において低く発現した/発現しなかった。最も高く発現したオフターゲットマーカーはGLASTであり、いくつかのアストロサイト前駆体が培養物に存在したことを示している。mDAニューロンと同じ分子マーカーの一部を発現するSTNニューロンの存在(Kee et al., 2017; Nouri & Awatramani, 2017)と一致して、DBX1、PITX2及びBARHL1の発現は、分化の全段階で観察された。後脳マーカーのHOXA2は発現せず、低レベルの前脳マーカーは、D17～37にわたって検出された。フローサイトメトリーは、<1%のD17細胞がFOXG1又はPAX6を発現することを実証し、前脳ニューロン前駆体の欠如を示した。中脳の赤核に発現するBRN3A(Agarwala, Sanders, & Ragsdale, 201; Wallen et al., 1999)も検出された。試験したすべての時点(D17、D24及びD37)において、神経幹細胞のマーカーSOX1は発現されず、培養細胞が幹細胞分化段階を過ぎたことを示した。3つの時点のそれぞれにおいてニューロン前駆体マーカーDCXが発現し、一方、より成熟した神経マーカーのNEUNの発現は、D17～D37で増加した。
次いでフローサイトメトリーを使用して、タンパク質レベルでmDA集団を検査し(図22A)、単一細胞PCRを使用して、RNAレベルでmDA集団を検査した(図31A～I)。FOXA2免疫反応性(ir)細胞のパーセンテージは、D17からD37まで高いまま(>80%)であり、一方、FOXA2及びLMX1の同時発現は、D17ではおよそ70%であり、D24までに90%超に増加した。FOXA2/LMX1-ir細胞のこの集団は、D37培養物において高いまま(約85%)であった。予想されたように、qPCRの結果と一致して、より成熟したマーカー、例えば、NURR1、MAP2及びTHは、D17試料において検出されなかった。これらの3つのマーカーのそれぞれの合計集団パーセンテージは、経時的に増加し、D24試料ではそれぞれおよそ20%が免疫反応性であり、D37試料では50%(NURR1、FOXA2/TH)又は90%(MAP2)が免疫反応性であった。免疫細胞化学を使用して、これらの細胞集団を視覚的に確認した(図22B、図29)。フローサイトメトリーの結果に一致して、LMX1A及びFOXA2は、それぞれの発育時点で細胞に高いパーセンテージで同時発現した。同様にフローサイトメトリーと一致して、NURR1-及びTH-ir細胞は、D17には存在せず、一方、僅かな量がD24までに見られ、多数の細胞と鮮明な個別の細胞もD37に観察された。MAP2はD17試料において検出されなかったが、D37では強固なMAP2-irにより発現が経時的に増加した。逆に、ネスチン-ir細胞は、D17及びD24の両方において豊富であったが、D37ではほぼ検出不能であった。STNマーカーのBARHL1及びPITX2は、すべての時点で検出され、D17では僅かな免疫反応性細胞しか存在せず、経時的に検出される細胞の数が増加した。小さいパーセンテージのD37細胞がBARHL1を発現し、STNニューロンがNURR1-ir細胞の少数サブセットであること及び未熟mDAニューロンの数の方がかなり多いことを示唆している。
まとめると、これらのデータは、STN及び赤核細胞を含むSNに近い領域の細胞を含む、主に中脳表現型を有する培養物の産生を、分化プロトコールが生じることを示している。さらに、前脳又は後脳細胞の最小限の汚染が観察された。D17細胞は、前駆段階であることが観察され、EN1以外に、成熟mDAニューロンの特徴であるNURR1又は他のマーカーを発現しなかった。
[実施例14]
移植片の生存及び機能に対する細胞成熟度の効果
移植片の生存に対する細胞成熟度の効果を評価するため、D17、D24、D37又はG418細胞のグラフトをインタクト胸腺欠損ラットの線条体の両側に注射した。移植の3か月後(図30A～B)、ヒト特異的神経細胞接着分子(hNCAM)で染色された冠状切片は、比較的小さなG418及びD37グラフトを明らかにし、僅かなhNCAM-ir線維しか宿主線条体を神経支配していない。対照的に、大きなhNCAM-irグラフト及びこれらの処理が、D17又はD24細胞のいずれかが生着した動物において可視化された。すべてのグラフトがTH-irニューロンを含有したが、D17グラフトのみが、fVM移植材料に特徴的に見られたものに類似した方法で細胞構造的に配置され、ドーパミン作動性細胞体がグラフトの周辺に局在化した(L. Thompson, Barraud, Andersson, Kirik, & Bjorklund, 2005)。
免疫無防備インタクトラットの脳に生存している改変分化プロトコール産生細胞を観察した後、本発明者たちは、長期機能性研究を実施した。反復d-アンフェタミン誘導回転により確証された片側6-OHDA誘導内側前脳束(MFB)病変を有するラットに、ビヒクル対照又はD17、D24、D37若しくはG418細胞(150,000細胞/μL、3μL、n=9～11匹/群)を移植し、注射の6か月後に殺処分した。要約表(表4)は、各細胞タイプ及び投薬群についての組織学的及び行動学的知見を記載する。

各細胞タイプの機能的能力を実証するため、ベースライン(6-OHDA病変の10～11週間後)のd-アンフェタミン誘導回転試験を、移植の2、4及び6か月後に実施した(図24A)。ビヒクル又はD37グラフトを受けた片側パーキンソン病ラットは、機能回復を実証できなかった。テューキーの事後検定を有する混合効果ANOVAは、D17、D24又はG418細胞を受けたラットが、注射の6か月後までに運動非対称の有意な(P<0.005、P<0.005、P<0.05)回復を呈したことを明らかにした。加えて、D17グラフトを受けた動物は、注射の4か月後までに回転の完全な(P<0.0005)正常化を表示した。これらの驚くべき結果は、PDの動物モデルを使用して観察すると、in vivoにおける機能回復を促進するD17細胞の優位性を実証している。
各細胞タイプの移植片の生存を定量化するため、ヒト特異的核(hNuclei)を、不偏立体解析を使用してグラフト切片において数えた(図23B、図23D)。D17群では304,303±140,487個のhNuclei-ir細胞、D24群では266,956±95,419個、D37群では52,623±22,955個及びG418群では108,093±188,944個の平均(±SD)が、これらの実験に基づいて推定され、それぞれ移植細胞の67.6%、59.3%、11.7%及び24.0%を表した。テューキー事後調整を有する一元配置ANOVAは、D37及びD418のそれぞれと比較して、D17(P<0.005、P < 0.01)及びD24(P<0.005、P<0.05)細胞から構成されるグラフトの良好な生着及び生存を実証した。
過剰レベルの増殖は、脳内単純奇形腫又は系統制限細胞の過成長(例えば、ニューロン前駆体)の発生のリスクを増加するため、任意の細胞タイプを臨床用途から除外する。ヒト特異的Ki-67(hKi-67)の立体解析推定値は、D17グラフトのhKi-67-ir細胞では3,412±1,391個、D24グラフトでは1,858±2,275個、D37グラフトでは0±180個及びG418グラフトでは352±697個の中央値(±IQR)を明らかにし、それぞれhNuclei-ir細胞のわずか1.2%、0.6%、0.0%及び0.6%を表した(図23C、図23E)。本発明者たちは、Dwass-Steele-Critchlow-Fligner事後検定を伴うクラスカルウォリス順位和検定を使用して、hNuclei-ir細胞の割合の数としてD17とG418(P<0.01)又はD37(P<0.05)の間、並びにD24とD37(P<0.05)の間及びD17とD37(P<0.005)の間においてhKi-67-ir細胞の総数に有意な差を検出した。これらの知見は、分化の初期に移植された細胞グラフトがより多くの移植後増殖細胞を含有したことを実証している。D17及びD24グラフトは、3か月及び6か月目のサイズが定量的に類似しており、移植の直後に鎮静した増殖に関連する任意の体積拡大を示唆している。決定的なことは、隣接脳領域を圧迫する奇形腫又は成長の証拠がなかったことである。
立体解析を使用して、各グラフトにおけるTH-ir細胞の数を推定し、D17グラフトでは79,061±44,167個のTH-ir細胞、D24グラフトでは67,830±25,944個、D37グラフトでは9,318±5,523個及びG418グラフトでは20,355±23,452個の平均(±SD)が観察され、それぞれ推定hNuclei-ir細胞の24.0%、25.5%、6.1%及び23.5%を表した(図24A～B)。TH-ir集団は、テューキーの事後検定を伴う一元配置ANOVAにより、D37及びG418移植片のそれぞれと比較して、D17(P<0.0001、P<0.005)、並びにD24(P<0.0005及びP<0.01)移植片において有意に大きかった。また生じたTH-ir細胞にもD17とD37(P<0.05)の間に有意な差があった。
各細胞タイプが宿主線条体をTH-ir軸索で神経再支配する能力を評価するため、本発明者たちは、グラフト体を除いて、線条体中のTH光学密度を測定した。ビヒクル処置動物のTH除神経線条体及び基準点として対側インタクト線条体を使用して、データを、得られた最小及び最大値にそれぞれ基づいて0から1まで尺度変更し光学密度単位(ODU)に変換した(図24C)。本発明者たちは、D17処置動物における0.46±0.14ODU、D24処置ラットにおける0.29±0.03ODU、D37処置ラットにおける0.13±0.09ODU及びG418処置ラットにおける0.33±0.03ODUの平均(±SD)を計算した。D17グラフトは、他のいずれの細胞タイプより有意に多くのTH-ir処理を有し(D24、D37及びG418のそれぞれと比較して、P<0.0005、P<0.0001、P<0.05)、一方、D24(P<0.001)及びG418(P<0.0005)の両方の細胞は、D37移植片より有意に多くのTH-ir処理を有し、テューキー事後調整を有する一元配置ANOVAを使用して示された。まとめると、これらのデータは、発育の初期(即ち、D17)に移植された細胞は、濃縮TH集団及び神経突起成長を含むことを実証している。
FOXA2は、真性mDAニューロンの誘導及び維持に重要な役割を果たす(Domanskyi, Alter, Vogt, Gass, & Vinnikov, 2014; Kittappa, Chang, Awatramani, & McKay, 2007)。免疫蛍光共標識化を利用して、hNuclei/TH-irニューロンにおけるFOXA2発現を決定し(図24D)、大部分の移植細胞がFOXA2を発現することを示した。hNuclei/FOXA2-ir細胞の実質的なサブセットもTHを発現し、真性mDA表現型を確証した。
[実施例15]
mDA前駆細胞による長距離部位特異的神経支配
長い距離にわたって神経支配する能力は、ヒト脳においてPDを処置する幹細胞グラフトの投与からの治療応答を促進するために極めて役に立つ。細胞のこれらの能力を評価するため、本発明者たちは、D17細胞又はD24細胞をラットのSNにグラフトし、前脳において自然標的への長距離突起が形成されるかを検査した。グラフトした6か月後、hNCAM免疫反応性を冠状切片で評価して、グラフト及びこれらの標的から発出されている線維を確認した(図25)。D24グラフトからの突起は、縁前皮質、嗅結節、前嗅核、中隔及び側坐核におけるA10構造を神経支配し、A9標的である線条体には線維が散在していた。本発明者たちは、前脳皮質(A10)に加えて、これらの同じA9及びA10標的へのD17グラフトによる顕著に高密度の神経支配を観察した。D17及びD24グラフト化動物の両方において、本発明者たちは、検査した大部分の吻側脳領域(SNにおけるグラフトの大部分の吻側側面からおよそ7～8mm)にhNCAM-ir線維を観察し、長い距離にわたって線維を突出させる能力を実証した。これらの結果は、長い距離にわたって自然標的を神経支配するD17細胞の優位性を実証した。
[実施例16]
mDA前駆細胞による用量応答
D17グラフトは、最も強固な有効性、生存可能性、及び問題のある増殖を伴わないドーパミン作動性表現型発現を実証し、本発明者たちにより、さらなる研究用に選択された。最適な投薬戦略を決定するため、D17細胞の濃度を、初期検査に使用した量から滴定した。片側パーキンソン病胸腺欠損ラットは、3μLの線条体移植片の最大可能用量(MFD)の150,000細胞/μL、高用量(40,000s細胞/μL)、中用量(10,000細胞/μL)、低用量(25,000細胞/μL)又はビヒクル対照を受けた(n=8～11匹/群)。運動非対称を、移植後の2か月毎にd-アンフェタミン誘導回転により6か月間評価し、その時点でラットを殺処分し、脳を組織学的に評価した。
本発明者たちは、すべての行動学的及び組織学的分析において明瞭な用量応答を観察した。ビヒクル又は低用量の移植細胞を受けたラットは、d-アンフェタミン誘導回転試験において機能回復を実証することができなかった。テューキー事後検定を有する混合効果ANOVAは、中(P=0.002)、高(P<0.0001)又は「最大可能」(P<0.0001)用量を受けたラットが、移植の6か月後までに運動非対称に完全な正常化を表示したことを明らかにした(図26A)。注目すべきは、高(P=0.0002)又は最大可能(P<0.0001)用量が、注射後の4か月の早さで回転を正常化するのに有用であった。さらに、2つの最高用量群のラットにおける広範囲な神経支配は、d-アンフェタミン誘導回転の過剰保障を生じ、グラフト化前に見られたものと反対の方向への周回を生じた(図26A)。
グラフトのhNuclei染色を定量化すると(図26B、図26E)、生存細胞の数は投与量と直接相関し、推定平均(±SD)は、MFD処置動物では611,588±53,377個の生存細胞、高用量動物では214,898±91,906個、中用量動物では36,848±18,816個及び低用量動物では4,604±5,904個であった。低、中及び高用量と比較したMFD、並びに中及び低用量と比較した高用量について、テューキー事後検定を有する一元配置ANOVAにより有意な差を計算した(すべての比較においてP<0.0001)。
本発明者たちは、不偏立体解析を使用して各グラフト(図26C、図26F)内のTH-ir細胞の数も定量化した。予想されたように、TH-ir細胞の数は投与量と直接相関し、推定平均(±SD)は、MFDグラフトでは59,929±18,927kのTH-ir細胞、高用量グラフトでは19,973±5,759個、中用量グラフトでは6,400±4,709個及び低用量グラフトでは1,087±1,471個のTH-ir細胞であり、それぞれ推定hNucleiir細胞の10.2%、10.0%、15.0%及び7.5%を表す。低、中及び高用量と比較したMFD(P<0.0001)、並びに中(P=0.03)及び低用量(P=0,02))と比較した高用量について、テューキー事後検定を有する一元配置ANOVAを使用して有意な差を計算した。
各細胞タイプが宿主組織をTH-ir処理で補充する能力を評価するため、本発明者たちは、上記に記載されたのと同様に線条体中のTH光学密度を測定及び処理した。線条体を神経再支配する突起の密度は投与量と直接相関し、MFD、高、中及び低用量群のそれぞれにおいて計算した平均(±SD)は、0.51±0.04ODU、0.36±0.16ODU,、0.13±0.06ODU及び0.09±0.12ODUであった(図26D)。MFDを低(P<.0001)、中(P<.0001)及び高(p<0.05)用量と比較した場合、並びに中(p<0.0001)及び低(P<0.0001)と比較した高用量の場合、有意な差が、テューキー事後検定を有する一元配置ANOVAにより見出された。
最初の評価では、低用量群は、4,604±5,904個のhNuclei-ir細胞及び1,087±1,471個のTH-ir細胞を含有しているにもかかわらず、行動の修正を表示しなかった。さらなる検査は、運動非対称を回復しなかった、生存グラフトがほとんどない5匹のラットを明らかにした。対照的に、相当量の生存グラフト(1,827個、2,068個及び4,100個のTH-ir細胞を含有する)を有するラットは、移植後の6か月までに様々な程度(それぞれ、18%、49%及び85%の回転低減)で回復した。D17 mDA前駆体の異なる用量の行動効果をさらに精査するため、行動回復を、TH-ir細胞の数及びTH光学密度に対してプロットした(図27A)。データの非線形品質の観点から、対数回帰を使用して、これらの相関関係を評価した。TH光学密度のr2=0.3625(P<0.0005)及びTH-ir細胞のr2=0.4887(P<0.00001)の結果が観察され、機能回復との中程度の相関関係を示した。本発明者たちがデータを低/中及び高/MFD群に分けた場合、TH光学密度(r2=0.6340、P<0.0005)及びTH-ir細胞(r2=0.3618、P<0.05)では低/中群に線形関係が観察された。これらの分析は、ドーパミン作動性表現型の両方の測定に明瞭な天井効果があったが、グラフト由来神経支配は、低用量において全体的なグラフト機能のより強固な指標であったことを示した。
[実施例17]
in vivoにおけるmDA表現型の特徴付け
mDA表現型を確証するため、注射検査の6か月後にグラフトの免疫蛍光三重標識を実施した(図27B)。大多数のグラフト化細胞はTH/FOXA2を発現し、最もTHを同時発現している細胞は、グラフトの境界に局在した。加えて、TH/GIRK2を発現する多くのhNuclei-ir細胞(62.6±2.9%)が観察され、より少ない割合でTH/カルビンディン-ir(31.8±1.7%)の細胞があり(図27C)、A9とA10の両方のドーパミン作動性サブタイプが、SNにグラフトされたD17細胞による長距離神経支配パターンと一致したことを明示した。THを発現しないいくつかのGIRK2-ir細胞(3.3±1.2%)が観察され、これらは傍小脳脚又は黒質旁起源のものであり得る。これらの結果は、D17細胞が、他の細胞と比較して長距離標的の優れた神経支配を生じるという観察を支持する。
[実施例18]
増殖、グリオーシス又はセロトニン作動性汚染の試験
決定的なことは、hKi-67で染色された切片に実施された不偏立体解析により決定され(図28A、B)、本発明者たちの前記研究と一致して、低レベルの連続増殖が6か月後のグラフトに見られることであった。本発明者たちは、MFDグラフトでは1,006±18,927kのTH-ir細胞、高用量グラフトでは1,038±741個、中用量グラフトでは532±745個及び低用量グラフトでは0±5個のhKi-67-ir細胞を推定し、それぞれ推定hNuclei-ir細胞の0.4%、0.4%、1.2%及び0.0%を表す。本発明者たちは、高(P=0.003)、中(P=0.004)及び低(P=0.003)用量と比較したMFD、並びに高(P=0.003)及び中(P=0.04)用量群と比較した低用量群を、hKi-67-ir細胞の総数について、並びに高及び「最大可能用量」(P<0.05)と比較した低用量のパーセンテージについて、有意な差を、クラスカルウォリス及びDwass-Steele-Critchlow-Fligner方法を使用して計算した。ここでも、本発明者たちは奇形腫の形成の証拠を報告していない。
グラフト内のアストロサイトーシスの程度を評価するため、切片をヒト特異的GFAPで染色した(図28C)。本発明者たちは、いくつかのアストロサイト体を有するグラフト体の中を走る長線維におおむね似ている免疫反応性パターンを観察し、これは、qPCRで検出され、ネズミfVMグラフトに類似しているGLAST発現と一致した(L. H. Thompson, Kirik, & Bjorklund, 2008)。本発明者たちは、Iba1-irを評価して、異種移植片に対して上昇したマイクログリア応答があるかを決定した。一般に、動物が僅かに増加した免疫反応性及び/又は上昇したマイクログリアを示す、開頭術に近接する皮質内の注射部位の近く、硬膜穿刺部位、及びグラフト周辺近くを除いて、Iba1-irは際立っていなかった。反応性形態を有するIba1-irマイクログリアが、移植片の中又は周囲の近くに観察され(中用量群における1匹の動物は、より強力なIbal-irをグラフトに有し)、一部の動物は、肥厚処理を有するマイクログリアの集団及びより強力な染色を、開頭術に近接するグラフトの背側側面の近く及び硬膜穿刺部位に有した(図28D)。本発明者たちは、D17グラフトがごく僅かなセロトニン作動性(5-HT)細胞を含有し(図28E)、MFDグラフトに推定して277±194個の5-HT-ir細胞を有した(推定hNuclei-ir細胞の0.04%であった)。これらのデータは、まとめて、オフターゲット細胞タイプ又は宿主グリオーシスの全体的な成長欠如を示す。
[実施例19]
PDの処置のためのiPSC由来mDA前駆細胞
上記の実験に示されたように、成熟(D37/G418)ニューロンのグラフトは、未成熟ニューロン(D24)及び前駆体(D17)の移植片と、行動効果の点からも組織学的特徴に関しても明瞭に異なった。グラフトサイズの差は、hNCAM-及びTH-免疫染色に基づいて注射の3か月後の早さで明らかになり、成熟(D37/G418)ニューロンは、薄い鉛筆型グラフトを形成し、より若い(D17/D24)細胞は比較的大きなグラフトを形成した。グラフト化の6か月後に、本発明者たちは、D37又はG418と比較して強力なドーパミン作動性表現型をD17及びD24グラフトに観察し、これはまた、D17-及びD24-グラフト化ラットにおけるd-アンフェタミン誘導運動非対称の完全な逆転を反映した。すべての細胞タイプ及び用量では、グラフト化細胞はTH/FOXA2を発現し、in vivoにおけるグラフト後の6か月間での成熟が継続していること、並びに移植前駆体及び未成熟ニューロンに由来する成熟mDAニューロンを生じることを確証した。本発明者たちがD17及びD24細胞を黒質内にグラフトした場合、長い距離におよぶA9及びA10標的の両方の優先的な神経支配が観察された。これらの知見は、fVM及びESC-VM組織の初期観察(Cardoso et al., 2018; Grealish et al., 2014)に一致し、グラフト内にTH/GIRK2-ir細胞及びTH/カルビンディン-ir細胞の両方を示す上記実験によっても支持される。GIRK2及びCALBINDINは、A9及びA10 mDAを分化するために通例的に使用され、配列決定び/又は高度多重化を使用して、これらの集団をさらに確定することもできる。グラフト化iPSC mDA細胞がラット脳内で長い距離にわたって突出する能力は、これらの手法をヒト被殻に適用できることを示している。
宿主線条体へのグラフト由来TH免疫反応性線維の成長における顕著な差が、使用された分化プロトコールに応じて観察された。D17、D24及びG418細胞がグラフトされたラットは、線条体の全体を網羅するTH-ir線維を呈し、一方、D37細胞がグラフトされたラットは、グラフト誘導行動回復を呈さず、宿主を神経支配するグラフト由来TH-ir軸索をほとんど示さなかった。事実、高倍率画像は、これらのグラフトがTH-ir細胞及び線維を含有しても、これらの軸索がD37グラフトの最も外側の縁に達すると突然終わることを明らかにした。D17グラフトにおけるTH-ir細胞の数とD24グラフトにおけるTH-ir細胞の数が同等であり、D37グラフトにおけるTH-ir細胞の数とG418グラフトにおけるTH-ir細胞の数が同等であることから、D17及びG418細胞が宿主を神経支配する傾向が、これらの機能の基礎にある可能性が高い。事実、大きな(67,800個のTH-ir細胞)D24グラフトを有する動物の行動の結果が、小さい(6,400個のTH-ir細胞)D17グラフトに類似していることが観察され、いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、この知見は、宿主線条体の類似した神経再支配が原因であることが予期される。回帰分析は、D17 TH-ir細胞及びこれらの処理の数に天井効果を示したが、より低い用量でも、神経支配は、行動回復を有するTH-ir細胞の数より高く相関した。ラットに観察されたこれらの結果は、ヒトにおける改善された治療応答を得るために特に重要であり、被殻(PD患者では3.96cm3(Yin et al., 2009))は、ラット線条体より相当大きい。より多くのTH-ir細胞及びこれらの処理が、ヒトに臨床利益を生じるために必要であり、代替的に又は組み合わせて、ラットで見られる大きなグラフトに関連する復帰の減少をおそらく有することなく、細胞を、被殻の全体的な神経再支配の助けとなる配列の多数の針路に沿って、多数の部位に沈着させることができる。ここでの 17 mDA前駆体が広範囲の用量で有効であるという指摘は、臨床医が、この細胞を投与するために、様々な外科的手法を利用するいくらかの許容度を有し得ることを示す。ヒトにおける投薬レジメンをなおさらに最適化する追加の研究を実施することができ、類似した治療結果が観察されることが予期される。
成熟細胞(G481、D37)のグラフト中には、増殖細胞はまれに観察されるのみであり、以前の観察(Hiller et al., 2020; Wakeman et al., 2017)に一致していた。D17及びD24グラフトは、G418/D37細胞のグラフトより多くのhKi-67細胞を含有したが生存グラフト細胞の割合としての増殖細胞の数は低く(D17/D24グラフトにおいて100,000個のhNuclei-ir当たり<1,000個)、望ましくない細胞増殖を防止するために精製ステップが必要ないことを実証した。さらに、hKi-67-ir細胞は、グラフト化ラットのいずれにも、活性細胞分裂を示すクラスターに存在しなかった。別の安全性の懸念は、fVMが移植された患者のサブセットにおいて報告されている(Freed et al., 201; Hagell & Cenci, 2005; Olanow et al., 2009)GIDの発生であり、セロトニン作動性ニューロンの異常なグラフト化がGIDの発生に寄与することが示唆されてきた。iPSC由来mDA前駆細胞グラフトの安全性についてのさらなる証拠として、本発明者たちは、GIDを誘導すると推論されるもの(Carlsson et al., 2009)に近い数のセロトニン作動性ニューロンを観察しなかった。
幹細胞由来mDA細胞を使用する上記の移植研究は、一部の実施形態において、前駆体及び未成熟ニューロンの発育段階を利用する。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本明細書に提供されるmDA前駆細胞は、臨床試験に成功裏に使用されてきた胎児組織の有益な効果の多くを呈し得ることが予期される。異なるプロトコールのために異なる研究に使用される発育段階の細胞を直接比較することは困難であるが、翻訳用途に適合させる努力に焦点を合わせた細胞のうちの多くは、神経成熟因子、例えば、BDNF、GDNF、TGF-β3及び/又はDAPTへの曝露を組み込む(Doi et al., 2020; Kim et al., 2021; Kirkeby et al., 2017; Song et al., 2020)。異なる発育段階を直接比較する研究において、結論は、NURR1+未成熟ニューロンが、成熟度の少ない前駆体より有効であるというものであった(Ganat et al., 2012; Qiu et al., 2017)。対照的に、上記の研究は、mDAパターン化因子(SMAD阻害、SHH、WNT、FGF8)に曝露され、且つNURR1発現の前に凍結保存されたD17細胞が、成熟因子(D24、NURR1+/-)で追加の週にわたって培養された同じ細胞より性能が優れたグラフトを生じることを実証している。両方の成熟段階の細胞は、類似した数で生着し、mDAニューロンに成熟し、性能の相違は、単なる増殖潜在性の差ではないことを示唆しており、いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、このことは、神経支配、A9パターン化及び/又はin vivoで受けた他の初期mDA成熟シグナルにおける差から生じ得ることである。グラフト化細胞の単一細胞配列決定を使用して、グラフトに含まれる他の非ドーパミン作動性細胞をさらに分析することができる。重要なことに、D17細胞は、適切にパターン化されていること及びmDAパターン化に「ロックイン(lock in)」するため又は望ましくない(例えば、セロトニン作動性)細胞タイプの増殖を防止するために、移植前に成熟因子に曝露する必要がなかったことが観察された。
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、上記に提示されたデータは、mDAニューロン又は前駆細部が線条体へのグラフト化の時点で成熟しすぎているとすれば、これらは、典型的にはあまり生存せず、顕著な行動効果は少ないという概念を支持する。上記の研究は、D17前駆体の比較的小さなグラフトが片側パーキンソン病ラットに行動回復を誘発するのに十分なドーパミン作動性神経支配を生じ得ることも実証している。これらのデータは、比較的小さな総数の細胞を各患者の線条体の少数の位置に注射できるという概念を支持し、このことはPDの治療を生じることがあり、好ましい臨床安全性が観察され得ることも示す。
臨床試験で試験された他のいくつかのmDA前駆細胞は、ESC(NCT04802733)(Piao et al., 2021)又はiPSC(JMA-IIA00384、UMIN000033564)(Doi et al., 2020)から誘導された。上記のデータは、本明細書に提供されるmDA前駆細胞(例えば、D17細胞)を患者に投与して、PDを処置できることを示す。望ましい場合、mDA前駆細胞を免疫抑制薬物若しくはレジメン、及び/又は望ましい場合にはドーパミン補充療法と組み合わせて投与してもよい。一部の実施形態において、ドーパミン補充療法は、mDA前駆細胞の投与後には患者に投与されない。本明細書に提供されるmDA前駆細胞(例えば、D17細胞)は、PD患者を選択するために投与される場合、注意深く選択された群にドーパミン細胞補充療法を使用して有意な臨床利益を達成できることが予期される。
[実施例20]
オフターゲット細胞タイプのレベル
中脳DA前駆体分化の際の不正確なパターン化は、危険なオフターゲット細胞タイプ、例えば、前脳(吻側)表現型を有するニューロン前駆体及びセロトニン作動性細胞を生じ得る。前脳タイプの細胞は特に懸念材料であり、それは、以前のDAニューロン分化プロトコールが、多くの場合、in vivoにおいてロゼット構造を形成し得る吻側(FOXG1+)及び/又は側方(PAX6+)細胞タイプを有するニューロン前駆体を含み、生着後の数か月間にわたって持続することが観察されている神経成長を生じるからである。よって培養物を、オフターゲット又は非ドーパミン作動性細胞タイプについて試験した。
FCDI DAPC-1(17日目のDA前駆体)細胞を、実施例1(表2)に記載されたように分化させ、凍結保存した。細胞を解凍し、17日目の前駆細胞(解凍0日後、0DPT)のフローサイトメトリー又はqPCRj分析の前に、DPBSで洗浄した。あるいは、細胞を解凍し、より成熟した細胞に発現するマーカーの発現を評価する後の時点(解凍後7～20日、7-20DPT)の細胞分析のために、DA成熟培地で培養した。
フローサイトメトリーアッセイを使用して、解凍時のFOXG1及びPAX6発現をモニターした。FOXG1及びPAX6のフローサイトメトリーを6個の代表的な操作バッチで実施し、それぞれ1又は2個の別個の時点(n=合計9個)で解凍した。平均して、FCDI DAPC-1は、解凍時に、標準偏差(SD)の0.1%を伴って0.1%のFOXG1+及び0.7%のSDを伴って0.4%のPAX6+であり、FCDI DAPC-1が、これらのオフターゲット細胞タイプのマーカーを欠いていることを確証している(図32)。潜在的に危険な細胞を発現するオフターゲット細胞マーカーのFOXG1+及びPAX6+のフローサイトメトリーアッセイに基づいて、細胞培養物は、非常に低いパーセンテージのそのような前脳ニューロン前駆体を含有している。結果を下記の表5に示す。
相当量では、グラフト中のセロトニン作動性細胞の包含は、潜在的に危険であり、グラフト誘導ジスキネジアに寄与し得る(Carlsson et al., 2009)。セロトニン作動性細胞の最終的なマーカーには、セロトニン(5-HT)、及び5-HT合成の律速酵素であるトリプトファンヒドロキシラーゼ-2(TPH)、及び5-HTトランスポーター(SERT)が挙げられる。これらのマーカーは成熟細胞にのみ発現するので、解凍直後の(0DPT)FCDI DAPC-1にアッセイを実施しなかった。セロトニン作動性細胞前駆体のための公知の最終的なマーカーはない。セロトニン作動性細胞を検出できる最早期の時点を決定するため、qPCR及び免疫組織化学(ICC)を使用して、FCDI DAPC-1を、0DPT(解凍後0日)、7DPT、14DPT及び19-20DPTでで評価した。qPCRによるセロトニン作動性マーカー発現の陽性対照として、セロトニン作動性細胞を有する脳領域であるヒトの脳橋からの全RNA試料を含めた。
SERT及びTPH2の発現レベルは、脳橋と比較して、0DPT及び培養における成熟の全体の両方においてFCDI DAPC-1では低いことが観察された(図33)。結果を下記の表6に示す。SERT発現は、0DPTから7DPTの間に有意に増加し、次いで14DPTの後に顕著に低減した。TPH2は、0DPTから19DPTまで発現の漸増を示した。両方のマーカーでは、ピーク発現は、7DPT又は14DPTのいずれかで見られ、14DPTでの発現は、異なるDAPC-1バッチで一貫していた(図34)。結果を下記の表7に示す。
マーカーとして0.01未満のLog2正規化発現値は、非常に低い発現であると考えられ、0.001未満の値は、検出未満であると考えられる。これらの結果は、FCDI DAPC-1培養物中の細胞が、qPCRの使用により示されるように、セロトニン作動性マーカーのSERT及びTPH2を非常に低いレベルで発現することを示している。
セロトニン作動性細胞のパーセントを決定するため、本発明者たちは、解凍後培養物の時間経過に沿って細胞の5-HTにICC染色を実施した。結果を下記の表8に示す。本質的に、解凍後1日目(1DPT)に5-HT+細胞は観察されなかった。5-HT+細胞の有意な集団が8DPT、15DPT及び20DPTに観察された。ハイコンテントイメージングソフトウエア(Molecular Devices ImageXpress)を使用した定量化は、およそ0.2%(0DPT)、3.4%(8DPT)、2.1%(15DPT)及び5.6%(20DPT)であるセロトニン作動性ニューロンのパーセンテージを示した。このデータは、DAPC-1が、成熟(有糸分裂後)セロトニン作動性ニューロンとして8DPTまでに可視化され得る、およそ5%のセロトニン作動性ニューロン前駆体を含有することを実証している。このパーセンテージは経時的に増加しない。
[実施例21]
物質及び方法
以下の物質及び方法を実施例13～20に使用した。
統計分析:統計分析をSAS(投薬研究における立体解析及び行動の結果)又はPrism(バージョン9.1.2、GraphPad)により実施した。グラフはPrismで作製した。免疫組織化学分析のデータは、Dwass-Steele-Critchlow-Fligner事後方法を伴うクラスカルウォリス検定により分析したhKi-67を除いて、テューキー事後検定を有する一元配置分散分析を使用して分析した。行動データは、テューキー事後検定を有する混合効果分散分析により分析した。組織学データは、hKi-67(中央値±IQR)を除いて、平均±sDで表した。中央値パーセンテージは、各動物におけるhNuclei-ir細胞の割合としてTH-又はhKi-678-ir細胞について報告した。回転は、平均±SEMで報告した。
細胞分化:研究使用G418ニューロン(iCell DopaNeurons, Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.)は、以前に記載されたように誘導し(Hiller et al., 2020; Wakeman et al., 2017)、分化過程でニューロンのG418薬物選択を可能にするように及び方法の38日目にニューロンの凍結保存を可能にするように操作iPSC系を利用した。臨床開発では、細胞治療開発に適切な手順及び試薬を使用してリプログラム化された非操作iPSC系を選択し、cGMP製造施設(Waisman Biomanufacturing, Madison, WI)においてマスターセルバンク(MCB)及びワーキングセルバンク(WCB)に拡大した。iPSC-mDA分化プロトコールをこのiPSC系に合わせて調整し、この調整にはSMADシグナル伝達阻害(LDN-193189、Reprocell)の簡素化、及びGSK-3阻害(CHIR99021、Reprocell)を1日後ろの方法の2日目にシフトし、このタイミングで高濃度に調整することが挙げられる。原材料を、臨床開発に適切になるように向上させ、GMPグレードShh C25II、BDNF、GDNF及びTGFβ3(Bio-techne)の使用が挙げられる。D37ニューロンは、以前に記載されたようにマイトマイシンC(Tocriis、方法の27及び29日目に150ng/mL)を使用して(Hiller et al., 2020)、工程中に精製し、方法の37日目にCryoStor(Biolife Solutions)で凍結保存した。D17前駆体は、前駆体の凝集体を、CTS TrypLE Select Enzyme(Thermo)で解離し、成熟培地(Kriks et al., 2011)又はマイトマイシンC処置に曝露することなく、方法の17日目に凍結保存した。D24未成熟ニューロンは、成熟培地に1週間平板培養した後であるが、マイトマイシンC処置を有することなく、方法の後期(方法の24日目)に凍結保存した。iPSC DA成熟段階を比較するために使用された細胞は、臨床解釈に適合された製造プロセスを使用して、研究所において産生された。用量範囲研究に使用されたD17細胞は、同じ方法を使用して制御された格付け無しのクリーンな実験室で作製した。
qPCR:細胞を解凍し、1:100ベータ-メルカプトエタノールを含有するBuffer RLT Plus(Qiagen)で溶解した。全RNAを、RNeasy Plus kit(Qiagen)を使用して抽出した。cDNAを、500ngのRNA投入によるHigh Capacity RNA-to-cDNA Kit(ThermoFisherを使用して生成した。定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPR)を、TaqMan Gene Expression Master Mix(ThermoFisher)、TaqManアッセイ(アッセイのリストは表5を参照すること)及び2.5 ngのcDNA投入を使用して、LightCycler480(Roche)により実施した。値は、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)に対して表している。3つの生物学的複製を、各処理時点で技術的に三重に分析した。
フローサイトメトリー:細胞を以前に記載されたように解凍した(Wakeman et al., 2017)。細胞を遠心分離し、GhostDye510(Tonbo Biosciences)で染色し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、緩衝剤(DPBS中2%FBS)で洗浄した。細胞を1×BD Perm/Wash(BD Biosciences)+0.2%mのTriton X-100(Triton X-100を含有しなかったMap2染色を除く)中の一次抗体により4℃で染色し(抗体及び希釈剤のリストについては表6を参照すること)、二次抗体(適切な場合)により室温で標識した。フローサイトメトリーを、MACSQuant(登録商標)Analyzer 10フローサイトメーター(Miltenyi Biotec)で実施した。3つの生物学的複製を、各成熟時点で分析した。
免疫細胞化学:細胞を解凍し、170,000細胞/ウエルで96ウエルプレートに播種し、一晩培養し、4%パラホルムアルデヒドで固定した。細胞を染色緩衝剤(DPBS中2%のFBS、2%のロバ血清、0.2%のTriton X-100)中の一次抗体により4℃で染色し(抗体及び希釈剤のリストについては表6を参照すること)、二次抗体(適切な場合)及びヘキスト(ThermoFisher)により室温で標識した。細胞をImageXpress High Content Imager(Molecular Devices)により10×倍率で分析した。3つの生物学的複製を、各時点で分析した。
動物の処置手順:すべての動物の処置手順は、Rush University Medical CenterにおけるInstitutional Animal Care and Use Committeの承認によって実践した。
病変誘導及び移植:雌胸腺欠損ヌード(rnu)ラットを、受け取った後、1週間順応させた。9～10週齢(170～200g)のラットは、6-OHDA(3μLの0.5%アスコルビン酸の15mg)の片側注射を右MFB(前側/後側[AP]:-4.0mm、内側/外側[ML]:十字縫合から-1.3mm、背側/腹側[DV]:硬膜から-7.0mm)に受けた。病変後の10週間までに確証病変を有する動物は、iPSC-mDA細胞(n=8～11/群)の線条体(AP:+0.5mm、ML:十字縫合から±3.0mm、DV:硬膜から-5.3mm)注射を受け、移植の3又は6か月後に殺処分された。凍結保存細胞を解凍し、細胞をトリパンブルー排除により数えた。細胞を遠心分離し、注射に適切な密度で再懸濁した。黒質内グラフトを、AP:+0.5mm、ML:十字縫合から-3.0mm、DV:硬膜から-5.0mmに設置した。すべての実験において、注射体積は3μLであった。150,000細胞/μLの濃度を細胞成熟度比較及び黒質内実験に使用し、2,500、10,000、30,000又は150,000細胞/μLを用量範囲実験に使用した。
d-アンフェタミン誘導回転:動物はd-アンフェタミンの腹腔内注射(2.5mg/kg、Sigma)を受け、半透明チャンバー内のハーネスの中に設置され、Rotometerシステム(San Diego Instruments)に接続された。d-アンフェタミン投与後の10～40分間にわたる正味同側(時計回り)回転を報告した。
組織処理:組織を処理し、免疫組織学分析及び立体解析分析を以前に記載されたように実施した(Hiller et al., 2020)。簡潔には、ラットにケタミン/キシアラジン混合物で麻酔を掛け、生理食塩水、続いて4%パラホルムアルデヒドで灌流した。脳を取り出し、スクロース勾配中に設置し、滑走式マイクロトームで40μMに切片化した。自由浮遊切片を、表6に列挙されている免疫蛍光三重標識化又はDAB処理の抗体濃度を使用して染色した。切片をガラスゼラチンコーティングスライドに載せ、カバースリップをかぶせ、画像化した。
立体解析:カバースリップをかぶせたスライドを不偏立体解析(StereoInvestigator v10.40、MBF biosciences)により分析した。細胞成熟比較実験では、総グラフト面積の5.22%をTH、hNuclei又はhKi-67により染色組織のシリーズの半分(連続切片の1/12)において探索した。用量範囲実験では、5.22%のTH-ir及びhNuclei-irグラフト、28.4%のhKi-67-irグラフト又は20.3%の5-HT-irグラフトを、染色組織のシリーズの半分(連続切片の1/12)において探索した。Gundersen m=1の誤差係数≧0.45を有する又はhNuclei-若しくはTH-染色切片のいずれかに数えられた細胞がなかった中又は低用量群の動物では、シリーズの追加の半分(連続切片の1/12)を染色し、同じパラメーターを使用して再探索した。次いで推定値をシリーズ全体(連続切片の1/6)で計算し、結果を平均化した。
光学密度:THで染色された7個(グラフトの中央±3個)の冠状切片のグレースケール画像を、各動物において分析した。それぞれの切片において、輪郭を、グラフト本体を除いた線条体の周りに描き、面積の平均画素密度を、ImageJを使用して記録した。値を各動物で平均化し、除神経線条体の最小点を0及びインタクト線条体の最大点を1と見なして、データを尺度変更した。細胞成熟度比較及び用量範囲実験のデータセットを別個に尺度変更した。
mDAサブタイプの定量化:4匹のmFD動物のグラフト切片をTH/GIRK2/カルビンディンで染色し、NIS Elements ARソフトウエア(バージョン5.10.01)を使用して、Nikon A1RHDカメラを備えたNikon Eclipse Ti2共焦点顕微鏡により画像化し、tiffファイルに保存した。各グラフトの53～80個の細胞のマーカーを、ImageJ(バージョン1.53a)を使用してz-stackにより定量化した。
0-19DPTのセロトニン作動性細胞集団のqPCRアッセイ:解凍時及び7-、14-又は19-DPTの培養中の6個FCDI DAPC-1バッチにおける、SERT及びTPH2に付いてのRT-PCRアッセイである。網掛けは、それぞれ、対応する時点の異なるバッチを表す。脳橋は、陽性対照脳領域である。6個のバッチのそれぞれのアッセイの平均ΔCq(CqASSAY-CqGAPDH)及び標準偏差を表に示す。
本明細書に開示及び特許請求されているすべての方法は、本開示を踏まえて過剰な実験なしに実行及び実践することができる。本発明の組成物及び方法が好ましい実施形態に関して記載されてきたが、本発明の概念、精神及び範囲を逸脱することなく、本明細書に記載されている方法、及び方法のステップ又は一連のステップに変更を適用できることが当業者に理解される。より詳細には、化学的にも生理学的にも関連するある特定の薬剤を、本明細書に記載されている薬剤に置き換えることができ、同時に同じ又は類似した結果が達成されることが理解される。当業者に明らかなすべてのそのような類似した置換基及び修正は、添付の特許請求の範囲に定義されている本発明の精神、範囲及び概念の範囲内であることが認められる。
文献
以下の文献は、それらが本明細書に記載されたものを補足する例示的手順または他の詳細を提供する限りにおいて、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
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Claims (209)

  1. 次のシグナル伝達モジュレーター:
    (a)スモールマザーズアゲインストデカペンタプレジック(Small Mothers Against Decapentaplegic)(SMAD)シグナル伝達の第1の阻害物質、
    (b)ソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達の少なくとも1つの活性化因子、及び
    (c)ウイングレス(wingless)(Wnt)シグナル伝達の少なくとも1つの活性化因子
    の存在下でヒト多能性細胞を培養することによって生成された中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロン前駆細胞を含む培養物であって、
    方法が、スモールマザーズアゲインストデカペンタプレジック(SMAD)シグナル伝達の第2の阻害物質の存在下でヒト多能性細胞を培養することを含まず、
    ヒト多能性細胞が、分化を誘導する条件下で約360から約456時間培養され、次いで細胞が、冷蔵又は凍結保存され、
    中脳ドーパミン作動性前駆細胞が、フォークヘッドボックスタンパク質A2(FOXA2)及びLIMホメオボックス転写因子1(LMX1)の両方を発現する(FOXA2+/LMX1+細胞)、培養物。
  2. ヒト多能性細胞が、分化を誘導する条件下で約384から約432時間培養される、請求項１に記載の培養物。
  3. mDAニューロン前駆細胞がNURR1を発現しない、請求項１に記載の培養物。
  4. mDAニューロン前駆細胞が、フォークヘッドボックスタンパク質A2(FOXA2)、LIMホメオボックス転写因子1(LMX1)及びEN1を発現する、請求項１又は２に記載の培養物。
  5. mDAニューロン前駆細胞がOTX2をさらに発現する、請求項４に記載の培養物。
  6. フォークヘッドボックスタンパク質A2(FOXA2)及びLIMホメオボックス転写因子1(LMX1)が、mDAニューロン前駆細胞の約60%から約100%又は約85%から約95%以上によって同時発現される、請求項１から５のいずれか一項に記載の培養物。
  7. mDAニューロン前駆体の約65～75%がFOXA2及びLMX1の両方を同時発現する、請求項６に記載の培養物。
  8. 中脳ドーパミン作動性前駆細胞が、FOXA2、LMX1A、ETV5及びEN1を発現し、中脳ドーパミン作動性前駆細胞が、NURR1、TH、CALB1、BARHL1及びGRIK2を発現しない、請求項１から７のいずれか一項に記載の培養物。
  9. mDAニューロン前駆細胞が増殖している又は分裂している細胞を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の培養物。
  10. mDAニューロン前駆細胞の少なくとも約40%以上が増殖している又は分裂している、請求項９に記載の培養物。
  11. mDAニューロン前駆細胞の約50～75%が増殖している又は分裂している、請求項１０に記載の培養物。
  12. 約5%以下のセロトニン作動性ニューロン前駆細胞をさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の培養物。
  13. セロトニン作動性ニューロン前駆細胞がBARLH1を発現する、請求項１２に記載の培養物。
  14. グリア前駆細胞をさらに含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の培養物。
  15. グリア前駆細胞がGLAST、SLC13A、CD44及び/又はhGFAPを発現する、請求項１４に記載の培養物。
  16. SMADシグナル伝達の阻害物質がBMP阻害物質である、請求項１から８のいずれか一項に記載の培養物。
  17. BMP阻害物質が、LDN-193189、ドルソモルフィン、DMH-1又はノギンである、請求項１６に記載の培養物。
  18. BMP阻害物質がLDN-193189である、請求項１７に記載の培養物。
  19. LDN-193189が約0.2μMから約4μM、より好ましくは約1μMから約4μMの濃度で存在する、請求項１８に記載の培養物。
  20. LDN-193189が約1μMから約3μMの濃度で存在する、請求項１９に記載の培養物。
  21. LDN-193189が約0.5μMから約4μMの濃度で存在する、請求項１９に記載の培養物。
  22. LDN-193189が約0.5μMから約2μMの濃度で存在する、請求項２１に記載の培養物。
  23. LDN-193189が約0.2μMから約4μMの濃度で存在する、請求項１９に記載の培養物。
  24. LDN-193189が約0.2μMから約2μMの濃度で存在する、請求項２３に記載の培養物。
  25. SMADシグナル伝達阻害物質がTGFβ阻害物質である、請求項１から８のいずれか一項に記載の培養物。
  26. TGFβ阻害物質がSB431542である、請求項２５に記載の培養物。
  27. SB431542が約1～20μMの濃度で存在する、請求項２６に記載の培養物。
  28. SB431542が約5～15μMの濃度で存在する、請求項２６に記載の培養物。
  29. SB431542が約10μMの濃度で存在する、請求項２６に記載の培養物。
  30. 多能性細胞が、培養1～15日目、1～16日目又は1～17日目にSMADの阻害物質と共に培養される、請求項１から２９のいずれか一項に記載の培養物。
  31. 多能性細胞が、培養1～17日目にSMADの阻害物質と共に培養される、請求項３０に記載の培養物。
  32. 多能性細胞が、15、16又は17日間、実質的に持続的に、又は毎日、SMADの阻害物質と共に培養される、請求項１から３１のいずれか一項に記載の培養物。
  33. 多能性細胞が、17日間、実質的に持続的に、又は毎日、SMADの阻害物質と共に培養される、請求項３２に記載の培養物。
  34. SMADの阻害物質が約50～2000又は50～500nMの濃度で存在する、請求項１から３３のいずれか一項に記載の培養物。
  35. SMADの阻害物質が約180～240nMの濃度で存在する、請求項３４に記載の培養物。
  36. 方法が、多能性細胞をMEK阻害物質に接触させることをさらに含む、請求項１から３５のいずれか一項に記載の培養物。
  37. MEK阻害物質がPD0325901である、請求項３６に記載の培養物。
  38. PD0325901が約0.25～2.5μMの濃度で存在する、請求項３７に記載の培養物。
  39. MEK阻害物質が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後約1～3日間、又は1～3日目、2～4日目、3～5日目に、又は1、2、3、4若しくは5日目に多能性細胞に接触される、請求項３５から３８のいずれか一項に記載の培養物。
  40. MEK阻害物質が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後に約24から約48時間多能性細胞に接触される、請求項３９に記載の培養物。
  41. MEK阻害物質が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始約1～2日後に始めて約3～4日間毎日又は実質的に持続的に多能性細胞に接触される、請求項３６から４０のいずれか一項に記載の培養物。
  42. MEK阻害物質が、1日目のSMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後2～5日目又は3～6日目に多能性細胞に接触される、請求項４１に記載の培養物。
  43. Wntシグナル伝達の活性化因子がGSK3阻害物質である、請求項１から４０のいずれか一項に記載の培養物。
  44. GSK3阻害物質がCHIR99021である、請求項４３に記載の培養物。
  45. CHIR99021が約1.5～2μMの濃度で存在する、請求項４４に記載の培養物。
  46. CHIR99021が約1.5～1.7μMの濃度で存在する、請求項４４に記載の培養物。
  47. CHIR99021が約1.6～1.7μMの濃度で存在する、請求項４５に記載の培養物。
  48. CHIR99021が約1.65μMの濃度で存在する、請求項４５に記載の培養物。
  49. CHIR99021が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後9～17日目に約4～7μMの濃度で存在する、請求項４４に記載の培養物。
  50. Wntシグナル伝達の活性化因子が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後1～3日間多能性細胞に接触される、請求項１から４９のいずれか一項に記載の培養物。
  51. Wntシグナル伝達の活性化因子が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後24～48時間以内に多能性細胞に接触される、請求項５０に記載の培養物。
  52. 多能性細胞が、14、15又は約16日間、実質的に持続的に、又は毎日、Wntシグナル伝達の活性化因子と共に培養される、請求項１から５１のいずれか一項に記載の培養物。
  53. Wntシグナル伝達の活性化因子が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後2～17日目に多能性細胞に接触される、請求項１から５２のいずれか一項に記載の培養物。
  54. SHHシグナル伝達の活性化因子が、パルモルファミン又はC25II Shhである、請求項１から５２のいずれか一項に記載の培養物。
  55. 方法が、多能性細胞をSHHシグナル伝達の2つの活性化因子に接触させることをさらに含む、請求項５４に記載の培養物。
  56. SHHシグナル伝達の2つの活性化因子が、パルモルファミン及びC25II Shhである、請求項５５に記載の培養物。
  57. SHHシグナル伝達の少なくとも1つの活性化因子が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始と同じ日に、又はSMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後24～48時間以内に多能性細胞に接触される、請求項１から５６のいずれか一項に記載の培養物。
  58. SHHシグナル伝達の少なくとも1つの活性化因子が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始と共に、又は後に、1～7日目に多能性細胞に接触される、請求項５７に記載の培養物。
  59. 方法が、多能性細胞をFGF-8に接触させることをさらに含む、請求項１から５８のいずれか一項に記載の培養物。
  60. FGF-8が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始と同じ日に多能性細胞に接触されない、請求項５９に記載の培養物。
  61. FGF-8が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後9～17日目又は11～17日目に多能性細胞に接触される、請求項５９又は６０に記載の培養物。
  62. FGF-8が約50～200ng/mLの濃度で存在する、請求項５９から６１のいずれか一項に記載の培養物。
  63. 多能性細胞が、ニューロンプロモーターの調節下に抗生物質耐性導入遺伝子を含む、請求項１から６２のいずれか一項に記載の培養物。
  64. 方法が、細胞を抗生物質、化学療法剤、DNA架橋剤、DNA合成阻害物質又は有糸分裂阻害物質に接触させることによって、多能性細胞由来の神経細胞又は中脳DAニューロンについて選択することをさらに含む、請求項１から６３のいずれか一項に記載の培養物。
  65. 方法が、多能性細胞を抗生物質又は化学療法剤に接触させることをさらに含む、請求項１から６３のいずれか一項に記載の培養物。
  66. 化学療法剤がマイトマイシンCである、請求項６４又は６５に記載の培養物。
  67. マイトマイシンCが、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後27、28、29及び/又は30日目に多能性細胞に接触される、請求項６６に記載の培養物。
  68. 抗生物質がG418(ジェネテシン)である、請求項６４又は６５に記載の培養物。
  69. 方法が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始より前にROCK阻害物質を含む培地で多能性細胞を培養すること又はインキュベートすることをさらに含む、請求項１から６８のいずれか一項に記載の培養物。
  70. 方法が、多能性細胞をブレビスタチンに接触させることをさらに含む、請求項１から６９のいずれか一項に記載の培養物。
  71. ブレビスタチンが分化の5日目及び17日目に細胞に接触される、請求項１から７０のいずれか一項に記載の培養物。
  72. mDAドーパミン作動性前駆細胞が、NURR1、MAP2及びTHを発現しない、請求項１から７１のいずれか一項に記載の培養物。
  73. mDAドーパミン作動性前駆細胞が、EN1を発現する、請求項１から７２のいずれか一項に記載の培養物。
  74. mDAドーパミン作動性前駆細胞が、GBX2、OTX1、OTX2、ETV5、CORIN及び/又はDCXを発現する、請求項１から７２のいずれか一項に記載の培養物。
  75. 多能性細胞がヒト人工多能性幹細胞(iPS)細胞である、請求項１から７３のいずれか一項に記載の培養物。
  76. LMX1がLIMホメオボックス転写因子1アルファ(LMX1A)である、請求項１から７５のいずれか一項に記載の培養物。
  77. 方法が、ヒト多能性細胞をDNase又はエンドヌクレアーゼの存在下でインキュベートすることをさらに含む、請求項１から７６のいずれか一項に記載の培養物。
  78. エンドヌクレアーゼがDNase I又はBenzonase(登録商標)である、請求項７７に記載の培養物。
  79. DNase I又はBenzonase(登録商標)が約10～20U/mLの濃度で存在する、請求項７８に記載の培養物。
  80. DNase I又はBenzonase(登録商標)が約10～15U/mLの濃度で存在する、請求項７９に記載の培養物。
  81. ヒト多能性細胞が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後4～6日目の少なくとも1日にエンドヌクレアーゼの存在下で培養される、請求項７７から７９のいずれか一項に記載の培養物。
  82. ヒト多能性細胞が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後5日目にエンドヌクレアーゼの存在下で培養される、請求項７７から７９のいずれか一項に記載の培養物。
  83. 容器手段に含まれる、請求項１から８２のいずれか一項に記載の培養物。
  84. 中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞が、医薬調製物に含まれる、請求項１から８３のいずれか一項に記載の培養物。
  85. 医薬調製物が注射用に製剤化される、請求項５に記載の培養物。
  86. 中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞を、細胞約2,500個/μLから細胞約150,000個/μL、細胞約2,500個/μLから細胞約100,000個/μL、細胞約10,000個/μLから細胞約150,000個/μL、細胞約40,000個/μLから細胞約100,000個/μL又は細胞約15,000～45,000個/μL含む、請求項１から８５のいずれか一項に記載の培養物。
  87. 培養物中の細胞の約10%以下、より好ましくは約7%以下がセロトニン作動性前駆細胞である、請求項１から８６のいずれか一項に記載の培養物。
  88. 培養物中の細胞の約5%以下がセロトニン作動性前駆細胞である、請求項８７に記載の培養物。
  89. 培養物中の細胞の約5%以下がSERT及びTPH2を発現する、請求項８７に記載の培養物。
  90. 培養物中の細胞の約0.1～5%以下がFOXG1を発現する、及び/又は培養物中の細胞の約0.1～5%以下がPAX6を発現する、請求項１から８９のいずれか一項に記載の培養物。
  91. 培養物中の細胞の約1%未満がFOXG1を発現する、及び/又は培養物中の細胞の約1%未満がPAX6を発現する、請求項９０に記載の培養物。
  92. 請求項１から９１のいずれか一項に記載の培養物の治療有効量を対象に投与することを含む、哺乳動物対象における疾患を処置する方法であって、好ましくは培養物が対象の脳に投与される、方法。
  93. 哺乳動物対象がヒトである、請求項９２に記載の方法。
  94. 疾患が中枢神経系(CNS)の疾患である、請求項９３に記載の方法。
  95. 疾患がパーキンソン病(PD)又はパーキンソンプラス症候群(PPS)である、請求項９４に記載の方法。
  96. 培養物が、エングレイルドを発現するが、NURR1を発現しないmDA前駆細胞を含む、請求項９２から９５のいずれか一項に記載の方法。
  97. 培養物が、対象の線条体、例えば被殻又は黒質に投与される、請求項９６に記載の方法。
  98. 培養物が、対象の線条体又は被殻の1つより多い位置に投与される、請求項９７に記載の方法。
  99. 培養物が、対象の線条体又は被殻の複数の部位に、及び/又は複数の針管で投与される、請求項９７に記載の方法。
  100. 培養物が医薬組成物に含まれる、請求項９６に記載の方法。
  101. ヒアルロン酸マトリックスを含む、請求項１００に記載の方法。
  102. 培養物が、細胞約1×106個から約25×106個、より好ましくは約3×106個から約9×106個を含む、請求項９２から１０１のいずれか一項に記載の方法。
  103. 培養物が、細胞約2,500個/μLから細胞約150,000個/μLを含む、請求項９２から１０２のいずれか一項に記載の方法。
  104. 培養物が、細胞約10,000個/μLから細胞約150,000個/μLを含む、請求項１０３に記載の方法。
  105. 培養物が、細胞約40,000個/μLから細胞約100,000個/μLを含む、請求項１０３に記載の方法。
  106. 対象がパーキンソン病を有し、培養物の投与後に対象が少なくとも１つの運動症状における改善を示す、請求項９２から１０５のいずれか一項に記載の方法。
  107. 対象が、振戦、筋硬直、動作緩慢、転倒、眩暈、すくみ、筋けいれん又はジストニアの１つ以上における低下を示す、請求項１０６に記載の方法。
  108. 中脳ドーパミン作動性前駆細胞が、対象の線条体又は被殻を少なくとも一部神経再支配する、請求項９２から１０７のいずれか一項に記載の方法。
  109. 中脳ドーパミン作動性前駆細胞が、投与後に限定的な増殖を示す、請求項９２から１０８のいずれか一項に記載の方法。
  110. 細胞培養物中の細胞の約5%以下が、セロトニン作動性細胞又はセロトニン作動性前駆細胞である、請求項９２から１０９のいずれか一項に記載の方法。
  111. 投与された細胞の少なくとも80%が、FOXA2及びLMX1の両方を発現する分化した細胞に分化する、請求項９２から１１０のいずれか一項に記載の方法。
  112. 分化した細胞の少なくとも85%がFOXA2及びLMX1の両方を発現する、請求項１１１に記載の方法。
  113. 投与された細胞の少なくとも約60%が、FOXA2及びLMX1の両方を発現する、請求項９２から１１２のいずれか一項に記載の方法。
  114. 培養物が投与より前に低温で凍結される、請求項９２から１１３のいずれか一項に記載の方法。
  115. 培養物が投与より前に液体窒素中、低温で凍結される、請求項１１４に記載の方法。
  116. FOXA2及びLMX1を発現する分化した細胞が、エングレイルド(EN1)、チロシンキナーゼ(TH)、オルソデンティクルホメオボックス2(OTX2)、核受容体関連1タンパク質(NURR1)、ニューロン特異的クラスIIIベータチューブリン(Tuj1)、TTF3、ペアード様ホメオドメイン3(PITX3)、achaete-scute複合体(ASCL)、初期B細胞因子1(EBF-1)、初期B細胞因子3(EBF-3)、トランスサイレチン(TTR)、シナプシン、ドーパミントランスポーター(DAT)及びGタンパク質共役内向き整流カリウムチャネル(Kir3.2/GIRK2)、CD142、DCSM1、CD63並びにCD99からなる群から選択される少なくとも1つのマーカーをさらに発現する、請求項１１１に記載の方法。
  117. FOXA2及びLMX1又はFOXA2及びTHを発現する分化した細胞が、エングレイルド、PITX3及びNURR1をさらに発現する、請求項１１６に記載の方法。
  118. 細胞培養物中の細胞の約10～25%がFOXA2及びチロシンヒドロキシラーゼ(TH)を同時発現する、請求項１１１から１１６のいずれか一項に記載の方法。
  119. 多能性細胞がヒト人工多能性幹(iPS)細胞である、請求項９２から１１８のいずれか一項に記載の方法。
  120. LMX1がLIMホメオボックス転写因子1アルファ(LMX1A)である、請求項９２から１１９のいずれか一項に記載の方法。
  121. 細胞組成物中の細胞の約1%未満、好ましくは0.5%未満が、セロトニン作動性細胞である、請求項９２から１２０のいずれか一項に記載の方法。
  122. 投与が宿主のグリオーシスを生じない、請求項９２から１２１のいずれか一項に記載の方法。
  123. 投与が、対象の脳における非ニューロン細胞の成長又は増殖を生じないか又は本質的に生じない、請求項９２から１２２のいずれか一項に記載の方法。
  124. 投与が、対象の脳におけるmDA前駆細胞の生着、及び/又はmDA前駆細胞による対象の脳の少なくとも一部における神経支配を生じる、請求項９２から１２３のいずれか一項に記載の方法。
  125. 投与が注射を介してである、請求項９２から１２４のいずれか一項に記載の方法。
  126. 注射が定位注射である、請求項１２５に記載の方法。
  127. 次のシグナル伝達モジュレーター:
    (a)スモールマザーズアゲインストデカペンタプレジック(SMAD)シグナル伝達の第1の阻害物質、
    (b)ソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達の少なくとも1つの活性化因子、及び
    (c)ウイングレス(Wnt)シグナル伝達の少なくとも1つの活性化因子
    の存在下でヒト多能性細胞を培養することを含む、フォークヘッドボックスタンパク質A2(FOXA2)及びLIMホメオボックス転写因子1(LMX1)の両方を発現するヒト細胞(FOXA2+/LMX1+細胞)を含む細胞組成物を調製するin vitroでの方法であって、
    スモールマザーズアゲインストデカペンタプレジック(SMAD)シグナル伝達の第2の阻害物質の存在下でヒト多能性細胞を培養することを含まず、
    ヒト多能性細胞が、分化を誘導する条件下で約360から約456時間培養され、次いで細胞が、冷蔵又は凍結保存される、方法。
  128. ヒト多能性細胞が、分化を誘導する条件下で約384から約432時間培養される、請求項１２７に記載の方法。
  129. ヒト細胞がNURR1を発現しない、請求項１２７に記載の方法。
  130. ヒト細胞が、フォークヘッドボックスタンパク質A2(FOXA2)、LIMホメオボックス転写因子1(LMX1)及びエングレイルドホメオボックス1(EN1)を発現する、請求項１２７又は１２８に記載の方法。
  131. ヒト細胞がOTX2をさらに発現する、請求項１３０に記載の方法。
  132. フォークヘッドボックスタンパク質A2(FOXA2)及びLIMホメオボックス転写因子1(LMX1)が、ヒト細胞の約65%から約85%以上によって同時発現される、請求項１２７から１３０のいずれか一項に記載の方法。
  133. SMADシグナル伝達の阻害物質がBMP阻害物質である、請求項１２７から１３２のいずれか一項に記載の方法。
  134. BMP阻害物質が、LDN-193189、ドルソモルフィン、DMH-1又はノギンである、請求項１３３に記載の方法。
  135. BMP阻害物質がLDN-193189である、請求項１３４に記載の方法。
  136. LDN-193189が約0.2μMから約4μMの濃度で存在する、請求項１３５に記載の方法。
  137. LDN-193189が約1μMから約3μMの濃度で存在する、請求項１３６に記載の方法。
  138. LDN-193189が約0.5μMから約4μMの濃度で存在する、請求項１３６に記載の方法。
  139. LDN-193189が約0.5μMから約2μMの濃度で存在する、請求項１３８に記載の方法。
  140. LDN-193189が約0.2μMから約4μMの濃度で存在する、請求項１３６に記載の方法。
  141. LDN-193189が約0.2μMから約2μMの濃度で存在する、請求項１４０に記載の方法。
  142. SMADシグナル伝達阻害物質がTGFβ阻害物質である、請求項１２７から１３２のいずれか一項に記載の方法。
  143. TGFβ阻害物質がSB431542である、請求項１４２に記載の方法。
  144. SB431542が約1～20μMの濃度で存在する、請求項１４３に記載の方法。
  145. SB431542が約5～15μMの濃度で存在する、請求項１４３に記載の方法。
  146. SB431542が約10μMの濃度で存在する、請求項１４３に記載の方法。
  147. 多能性細胞が、培養1～15、1～16又は1～17日目にSMADの阻害物質と共に培養される、請求項１２７から１４６のいずれか一項に記載の方法。
  148. 多能性細胞が、培養1～17日目にSMADの阻害物質と共に培養される、請求項１４７に記載の方法。
  149. 多能性細胞が、15、16又は17日間、実質的に持続的に、又は毎日、SMADの阻害物質と共に培養される、請求項１２７から１４８のいずれか一項に記載の方法。
  150. 多能性細胞が、17日間、実質的に持続的に、又は毎日、SMADの阻害物質と共に培養される、請求項１４９に記載の方法。
  151. SMADの阻害剤が約50～2000又は50～500nMの濃度で存在する、請求項１２７から１５０のいずれか一項に記載の方法。
  152. SMADの阻害物質が約180～240nMの濃度で存在する、請求項１５１に記載の方法。
  153. 多能性細胞をMEK阻害物質に接触させることをさらに含む、請求項１２７から１５２のいずれか一項に記載の方法。
  154. MEK阻害物質がPD0325901である、請求項１５３に記載の方法。
  155. PD0325901が約0.25～2.5μMの濃度で存在する、請求項１５４に記載の方法。
  156. MEK阻害物質が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後約1～3日間、又は1～3日目、2～4日目、3～5日目に、又は1、2、3、4若しくは5日目に多能性細胞に接触される、請求項１５２から１５５のいずれか一項に記載の方法。
  157. MEK阻害物質が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後約24から約48時間多能性細胞に接触される、請求項１５６に記載の方法。
  158. MEK阻害物質が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始の約1～2日後に始めて約3～4日間毎日又は実質的に持続的に多能性細胞に接触される、請求項１５３から１５７のいずれか一項に記載の方法。
  159. MEK阻害物質が、1日目のSMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後2～5日目又は3～6日目に多能性細胞に接触される、請求項１５８に記載の方法。
  160. Wntシグナル伝達の活性化因子がGSK3阻害物質である、請求項１２７から１５７のいずれか一項に記載の方法。
  161. GSK3阻害物質がCHIR99021である、請求項１６０に記載の方法。
  162. CHIR99021が約1.5～1.7μMの濃度で存在する、請求項１６１に記載の方法。
  163. CHIR99021が約1.6～1.7μMの濃度で存在する、請求項１６２に記載の方法。
  164. CHIR99021が1.65μMの濃度で存在する、請求項１６２に記載の方法。
  165. CHIR99021が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後9～17日目に約4～7μMの濃度で存在する、請求項１６１に記載の方法。
  166. Wntシグナル伝達の活性化因子が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後1～3日間多能性細胞に接触される、請求項１２７から１６５のいずれか一項に記載の方法。
  167. Wntシグナル伝達の活性化因子が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後24～48時間以内に多能性細胞に接触される、請求項1６６に記載の方法。
  168. 多能性細胞が、14、15又は約16日間、実質的に持続的に、又は毎日、Wntシグナル伝達の活性化因子と共に培養される、請求項１２７から１６７のいずれか一項に記載の方法。
  169. Wntシグナル伝達の活性化因子が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後2～17日目に多能性細胞に接触される、請求項１２７から１６８のいずれか一項に記載の方法。
  170. SHHシグナル伝達の活性化因子が、パルモルファミン又はC25II Shhである、請求項１２７から１６８のいずれか一項に記載の方法。
  171. 多能性細胞をSHHシグナル伝達の2つの活性化因子に接触させることをさらに含む、請求項１７０に記載の方法。
  172. SHHシグナル伝達の2つの活性化因子が、パルモルファミン及びC25II Shhである、請求項１７１に記載の方法。
  173. SHHシグナル伝達の少なくとも1つの活性化因子が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始と同じ日に、又はSMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後24～48時間以内に多能性細胞に接触される、請求項１２７から１７２のいずれか一項に記載の方法。
  174. SHHシグナル伝達の少なくとも1つの活性化因子が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始と共に、又は後に、1～7日目に多能性細胞に接触される、請求項１７３に記載の方法。
  175. 多能性細胞をFGF-8に接触させることをさらに含む、請求項１２７から１７４のいずれか一項に記載の方法。
  176. FGF-8が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始と同じ日に多能性細胞に接触されない、請求項１７５に記載の方法。
  177. FGF-8が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後9～17日目又は11～17日目に多能性細胞に接触される、請求項１７５又は１７６に記載の方法。
  178. FGF-8が約50～200ng/mLの濃度で存在する、請求項１７５から１７７のいずれか一項に記載の方法。
  179. 多能性細胞が、ニューロンプロモーターの調節下に抗生物質耐性導入遺伝子を含む、請求項１２７から１７８のいずれか一項に記載の方法。
  180. 細胞を抗生物質、化学療法剤、DNA架橋剤、DNA合成阻害物質又は有糸分裂阻害物質に接触させることによって、多能性細胞由来の神経細胞又は中脳DAニューロンについて選択することをさらに含む、請求項１２７から１７９のいずれか一項に記載の方法。
  181. 多能性細胞を抗生物質又は化学療法剤に接触させることをさらに含む、請求項１２７から１７９のいずれか一項に記載の方法。
  182. 化学療法剤がマイトマイシンCである、請求項１８０又は１８１に記載の方法。
  183. マイトマイシンCが、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後27、28、28及び/又は29日目に多能性細胞に接触される、請求項１８２に記載の方法。
  184. 抗生物質がG418(ジェネテシン)である、請求項１８０又は１８１に記載の方法。
  185. SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始より前にROCK阻害物質を含む培地で多能性細胞を培養すること又はインキュベートすることをさらに含む、請求項１２７から１８４のいずれか一項に記載の方法。
  186. 多能性細胞をブレビスタチンに接触させることをさらに含む、請求項１２７から１８５のいずれか一項に記載の方法。
  187. ブレビスタチンが、分化の5日目及び17日目に細胞に接触される、請求項１２７から１８６のいずれか一項に記載の方法。
  188. ヒト多能性細胞の少なくとも40%が分化し、FOXA2及びLMX1の両方を発現する、請求項１２７から１４１又は１４７から１８７のいずれか一項に記載の方法。
  189. ヒト多能性細胞の少なくとも60%が分化し、FOXA2及びLMX1の両方を発現する、請求項１８８に記載の方法。
  190. ヒト多能性細胞の少なくとも80%が分化し、FOXA2及びLMX1の両方を発現する、請求項１８９に記載の方法。
  191. ヒト多能性細胞の少なくとも85%が分化し、FOXA2及びLMX1の両方を発現する、請求項１８９に記載の方法。
  192. ヒト多能性細胞の約10～25%が分化し、FOXA2及びチロシンヒドロキシラーゼ(TH)の両方を発現する、請求項１２７から１４１又は１４７から１８７のいずれか一項に記載の方法。
  193. 多能性細胞が、ヒト人工多能性幹(iPS)細胞である、請求項１２７から１９２のいずれか一項に記載の方法。
  194. LMX1が、LIMホメオボックス転写因子1アルファ(LMX1A)である、請求項１２７から１９３のいずれか一項に記載の方法。
  195. FOXA2及びLMX1又はFOXA2及びTHを発現する分化した細胞が、EN1、オルソデンティクルホメオボックス2(OTX2)、ニューロン特異的クラスIIIベータチューブリン(Tuj1)、TTF3、ペアード様ホメオドメイン3(PITX3)、achaete-scute複合体(ASCL)、初期B細胞因子1(EBF-1)、初期B細胞因子3(EBF-3)、トランスサイレチン(TTR)、シナプシン、ドーパミントランスポーター(DAT)及びGタンパク質共役内向き整流カリウムチャネル(Kir3.2/GIRK2)、CD142、DCSM1、CD63並びにCD99からなる群から選択される少なくとも1つのマーカーをさらに発現する、請求項１８８から１９４のいずれか一項に記載の方法。
  196. FOXA2+/LMX1+細胞がエングレイルド(EN1)をさらに発現する、請求項１２７から１９４のいずれか一項に記載の方法。
  197. FOXA2+/LMX1+細胞が、EN1、Pax8及びETV5をさらに発現する、請求項１２７から１９４のいずれか一項に記載の方法。
  198. FOXA2+/LMX1+細胞がNURR1を発現しない、請求項１２７から１９７のいずれか一項に記載の方法。
  199. FOXA2+/LMX1+細胞が、GBX2、OTX1、OTX2、ETV5、CORIN及びDCXを発現する、請求項１９７に記載の方法。
  200. 細胞組成物中の細胞の5%以下が、セロトニン作動性細胞である、請求項１２７から１９６のいずれか一項に記載の方法。
  201. DNase又はエンドヌクレアーゼの存在下でヒト多能性細胞をインキュベートすることをさらに含む、請求項１２７から２００のいずれか一項に記載の方法。
  202. エンドヌクレアーゼが、DNase I又はBenzonase(登録商標)である、請求項２０１に記載の方法。
  203. DNase I又はBenzonase(登録商標)が約10～20U/mLの濃度で存在する、請求項２０２に記載の方法。
  204. DNase I又はBenzonase(登録商標)が約10～15U/mLの濃度で存在する、請求項２０３に記載の方法。
  205. ヒト多能性細胞が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後4～6日目の少なくとも1日にエンドヌクレアーゼの存在下で培養される、請求項２０１から２０３のいずれか一項に記載の方法。
  206. ヒト多能性細胞が、SMADシグナル伝達の阻害物質との接触の開始後5日目にエンドヌクレアーゼの存在下で培養される、請求項２０１から２０３のいずれか一項に記載の方法。
  207. (a)請求項１２７から２０６のいずれか一項に記載の方法によって分化したFOXA2+/LMX1A+細胞又は請求項１から８６のいずれか一項に記載のmDA前駆細胞を試験化合物に接触させること、及び
    (b)細胞の機能、生理機能又は生存率を測定すること
    を含む、試験化合物をスクリーニングする方法。
  208. 前記測定することが、細胞の毒性学的応答について又は電気生理学的応答の変化について検査することを含む、請求項２０７に記載の方法。
  209. 細胞が、中脳ドーパミン作動性ニューロン又は中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞である、請求項２０７又は２０８に記載の方法。
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