CN117441011A - 多巴胺能前体细胞及使用方法 - Google Patents

多巴胺能前体细胞及使用方法 Download PDF

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CN117441011A CN202280033180.6A CN202280033180A CN117441011A CN 117441011 A CN117441011 A CN 117441011A CN 202280033180 A CN202280033180 A CN 202280033180A CN 117441011 A CN117441011 A CN 117441011A
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克里斯托弗·麦克马洪
兰德尔·利尔里什
卡里埃·查韦斯
凯拉·汤姆普森
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Abstract

本文中提供了可用于治疗脑病症的中脑多巴胺能神经元前体细胞。提供了改进的单SMAD方法，其可用于使多能细胞分化成中脑多巴胺能(DA)神经元或中脑神经元前体。在一些方面中，提供了可用于产生多巴胺能神经元前体细胞的单SMAD培养方案和培养持续时间的方法，所述多巴胺能神经元前体细胞具有显著改善的特性以用于治疗脑病症，例如帕金森病。还提供了使用中脑多巴胺能神经元前体细胞治疗帕金森病和其他脑疾病的方法。

Description

多巴胺能前体细胞及使用方法
优先权声明
本申请要求于2021年4月7日提交的美国临时申请序列No.63/171,837和于2021年11月4日提交的美国临时申请序列No.63/275,691的优先权权益，其全部内容在此通过引用并入于此。
背景技术
1.技术领域
本发明一般地涉及分子生物学和医学领域。更具体地，本发明涉及从多能干细胞产生神经元前体细胞的方法和相关的治疗方法。
2.相关技术的描述
帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)是使人衰弱的神经退行性疾病，其由于A9中脑多巴胺能(mDA)神经元的缺失和随后的多巴胺神经元信号传导的缺失而表现为运动障碍。目前的PD治疗(包括多巴胺能药物治疗和深部脑刺激(deep brain stimulation，DBS))解决了运动症状改善。
预计PD的临床和社会成本将会上升，并且目前的治疗选项表现出显著的局限性。随着人口持续老龄化，预计PD将急剧上升，据保守估计，到2040年全球将有超过1400万受害者(Dorsey&Bloem，2018)。虽然PD患者可显示出一系列非运动特征，但其定义症状是由于继发于多巴胺能黑质神经元缺失的纹状体多巴胺能不足而引起的进行性运动缺陷。目前的治疗是对症的，主要集中于改善运动缺陷。
多巴胺激动剂的递送通常仅提供轻度至中度的减轻。用L-多巴治疗需要仔细的剂量管理，通常仅在4至6年内有效，并且经常导致运动障碍。例如，经口L-多巴或多巴胺能激动剂最初可提供运动症状的减轻，但在5至10年之后，大多数患者会经历使人衰弱的运动波动和运动障碍(Ahlskog&Muenter,2001)。DBS需要使用侵入性植入物，具有已知的神经精神病学副作用，并且通常有效不到10年。对苍白球(globus pallidus)的内部区段或丘脑底核(subthalamic nucleus，STN)进行DBS刺激可补偿一些患者中的DA缺失，但这种方法主要适应于未显示出认知衰退的年轻患者，并且需要定期更换电池。这些治疗均没有解决潜在的疾病病理，即mDA神经元的进行性丧失。
虽然已经测试了细胞移植治疗，但这些努力仍具有显著的局限性。替换缺失的细胞并提供针对PD运动症状的减轻持续10至15年的基于细胞的治疗是治疗PD的主要目标。已经进行了使用胚胎组织的研究(Brundin et al.,1986；Doucet et al.,1989；Freeman,Sanberg,et al.,1995)。已经进行了使用胚胎腹侧中脑(fetal ventral mesencephalon，fVM)细胞作为中脑神经祖细胞来源的研究(Barker et al.,2013)；然而，涉及细胞移植的数项不同研究的效力结果已经混合或不一致(例如，Barbuti et al.,2021；Barker,Drouin-Ouellet,&Parmar,2015)。
涉及施用于fVM细胞的替代治疗表现出伦理和技术二者的限制。来自啮齿动物和人胚胎腹侧中脑(human fetal ventral mesencephalic，hfVM)供体组织的多巴胺神经元在移植到实验动物的多巴胺耗竭纹状体时，在治疗上能够是有帮助的(Steinbeck&Studer,2015；Wianny&Vezoli,2017)。开放标签的hfVM试验中的一些患者(Freeman,Olanow,etal.,1995；Lindvall et al.,1990)表现出临床改善。然而，随机化的双盲、安慰剂对照的临床试验表明，这些益处变化太大而未达到试验的主要终点，尽管预定的次要终点(统一帕金森病评定量表，(Unified Parkinson’s Disease Rating Scale，UPDRS))在年轻(<60岁；(Freed et al.,2001))或较少受损(UPDRS in off<49；(Olanow et al.,2003)))的对象中显示出统计学上显著的益处。另外，一些患者出现了移植物诱导的运动障碍(graft-induced dyskinesias，GID)(Freed et al.,2001；Hagell et al.,2002；Ma et al.,2002)，这可能与预先存在的L-多巴诱导的运动障碍和包含血清素能细胞以及期望的多巴胺能神经元的移植物有关(Hagell&Cenci,2005；Lane&Smith,2010)。这些发现促使人们重新评价这种方法。最近，欧洲协作联盟TRANSEURO在一项开放标签试验(NCT01898390)中对11名处于相对早期疾病阶段的患者重新进行了胚胎移植(fetal transplantation)，所述患者在移植之前没有出现L-多巴诱导的运动障碍(Barker&consortium，2019)。
由于目前还没有阻止或逆转疾病进程的治疗，因此存在对新的和有效的PD治疗的重大的未满足的需求。由于有限的供体组织可用性和使用胚胎组织的伦理问题，因此fVM治疗可能无法用于广泛的临床应用，并因此正在研究另一些细胞来源，例如胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)。显然，需要用于从多能细胞产生多巴胺能神经元的新的和改善的方法，其可用于例如，治疗PD。
发明内容
在一些方面中，本公开内容通过提供多巴胺能(DA)祖细胞培养物，优选祖细胞中脑多巴胺能(mDA)细胞培养物来克服现有技术中的限制，所述培养物具有用于治疗疾病或植入到哺乳动物对象中的改善的治疗特性。提供了从多能干细胞(例如诱导多能干细胞(iPS))制备这样的DA祖细胞培养物的方法。与WO2018/035214中描述的使用单SMAD方法的先前实验(其中到分化培养的第37天的数个时间点观察到DA祖细胞的等同模式)相反，本公开内容部分基于以下发现：使用单SMAD方法在分化培养约360至456个小时，更优选约384至432小时之后利用的DA祖细胞可出乎意料地显示出用于治疗应用(例如治疗帕金森病(PD))的优异特性。如以下实施例中所示，使用PD的6-OHDA无胸腺裸大鼠模型，观察到在这些时间量内在这些条件下分化的这些细胞在体内在植入和神经支配方面显示出显著的改善。因此，如本文中提供的单SMAD分化方法中的这些时间范围显示出对产生具有显著提高的治疗潜力的细胞培养物是至关重要的。对接受施用于纹状体的细胞的大鼠进行的行为实验得到PD症状的改善治疗和体内恢复。在半侧帕金森病(hemiparkinsonian)大鼠中测试了针对移植的mDA祖细胞、未成熟神经元和有丝分裂后神经元的存活和效力的细胞成熟度。就存活、神经支配和效力而言，中脑DA祖细胞显著地优于未成熟或成熟神经元。同源(homotopic)(黑质内(intranigral))植入表明与未成熟神经元相比，mDA祖细胞具有长距离神经支配前脑结构的更大的能力。当在广泛的剂量范围内评估祖细胞时，观察到明显的结构和功能剂量响应。虽然移植物来源于iPSC，但没有观察到畸胎瘤或显著的细胞增殖。这些数据支持使用人iPSC来源mDA祖细胞用于移植来治疗PD。还提供了使用本文中提供的细胞培养物或DA祖细胞来治疗脑疾病(例如PD)的方法。
在一些方面中，提供了包含iPSC来源的中脑DA神经元祖细胞(例如，“FCDI DAPC-1”或D17细胞)的经冷冻保存的单细胞悬液。使用本文中提供的单SMAD方法，使用培养中约360至456个小时，更优选约384至432个小时的分化，可以产生DA祖细胞。这些细胞可通过定向分化来源于同种异体的人iPS细胞或iPS细胞系，以获得DA神经元祖细胞群。如以下实施例中所示，观察到这样的DA神经元祖细胞具有表型标志物(例如，图1和图2)和与发育中中脑的黑质区中存在的多巴胺神经元前体相似的发育潜能(例如，图3、图13和图14)。观察到FCDI DAPC-1缺乏显著数目的前脑神经元和可对治疗应用有害的残余iPSC(例如，图5、图6和表3)。与已被考虑用于治疗应用的其他DA细胞不同，FCDI DAPC-1是增殖的神经祖细胞群，如通过EdU并入所表明的(图7)。FCDI DAPC-1显示出优异的植入和神经支配，这是与PD的6-OHDA无胸腺大鼠模型中改善的恢复相关的特征(图9、图10和图14)。
在一些方面中，多巴胺能神经元前体细胞(例如，FCDI DAPC-1)可通过使用单SMAD方法培养多能干细胞(例如iPS细胞)来产生，其中使所述细胞在分化条件下培养约360至456个小时，或更优选约384至432小时。单SMAD分化方法(也称为“单SMAD抑制”或“单SMADi”方法)描述于例如WO2018/035214中，其通过引用整体并入本文。与需要使用两种或更多种SMAD抑制剂抑制SMAD信号传导的方法相比，单SMADi方法可提供优势。通常来说，单SMAD方法仅涉及使用一种SMAD抑制剂(即，单SMAD抑制剂，而不是第二SMAD抑制剂)。单SMAD方法可包括：(i)Wnt激动剂(例如，CHIR99021)的添加错开至第2天或第3天，(ii)重优化CHIR浓度(例如，使用约0.5至3.0μM、0.7至3μM、1至2.5μM、1.25至2.25μM、大于约1.25μM至约2μM、或约1.55、1.65、1.75μM、或其中可推导的任何范围)，和/或(iii)在第3至5天在分化培养基中包括MEK抑制剂(例如，PD0325901)。所述方法可包括例如以上方面(i和ii)、(ii和iii)、(i和iii)或(i、ii和iii)。在一些实施方案中，将细胞暴露于BMP抑制剂(例如，多索吗啡(dorsomorphin)或LDN-193189)，但是细胞不暴露于TGF-β抑制剂，例如SB431542。细胞可以由细胞分化成中脑DA神经元或FOXA2+/LMX1A+细胞。这些方法可用于从iPS细胞系形成mDA祖细胞，其中培养基仅包含单一的SMAD抑制剂(例如，仅多索吗啡或仅LDN-193189)。
本公开内容的方面涉及包含中脑多巴胺能(mDA)神经元前体细胞的培养物，所述神经元前体细胞通过在以下信号传导调节剂的存在下培养人多能细胞而产生：(a)小母亲抗去脑瘫(Small Mothers Against Decapentaplegic，SMAD)信号传导的第一抑制剂，(b)音猬因子(Sonic hedgehog，SHH)信号传导的至少一种激活剂，和(c)wingless(Wnt)信号传导的至少一种激活剂；其中所述方法不包括在小母亲抗去脑瘫(SMAD)信号传导的第二抑制剂的存在下培养人多能细胞；并且其中使人多能细胞在诱导分化的条件下培养约360至约456个小时，并随后冷藏或冷冻保存所述细胞；并且其中所述中脑多巴胺能前体细胞表达叉头框蛋白A2(FOXA2)和LIM同源框转录因子1(LMX1)二者(FOXA2+/LMX1+细胞)。在一些实施方案中，使人多能细胞在诱导分化的条件下培养约384至约432小时。在一些实施方案中，所述mDA神经元前体细胞不表达NURR1。所述mDA神经元前体细胞可表达叉头框蛋白A2(FOXA2)、LIM同源框转录因子1(LMX1)和EN1。所述mDA神经元前体细胞还可表达OTX2。在一些实施方案中，约60％至约100％或约85％至约95％或更多的mDA神经元前体细胞共表达叉头框蛋白A2(FOXA2)和LIM同源框转录因子1(LMX1)。在一些实施方案中，约65％至75％的mDA神经元前体共表达FOXA2和LMX1二者。在一些实施方案中，中脑多巴胺能前体细胞表达(FOXA2、LMX1A、ETV5和EN1)，而中脑多巴胺能前体细胞不表达(NURR1、TH、CALB1、BARHL1、或GRIK2)。在一些实施方案中，所述mDA神经元前体细胞包含增殖细胞或分裂细胞。在一些实施方案中，至少约40％或更多，或约50％至75％的mDA神经元前体细胞正在增殖或正在分裂。所述培养物还可包含约5％或更少的血清素能神经元前体细胞。所述血清素能神经元前体细胞可表达BARLH1。所述培养物还可包含胶质祖细胞。胶质祖细胞可表达GLAST、SLC13A、CD44和/或hGFAP。SMAD信号传导的抑制剂可以是BMP抑制剂，例如如LDN-193189、多索吗啡、DMH-1、或头蛋白(noggin)。在一些实施方案中，BMP抑制剂是LDN-193189。LDN-193189可以以下的浓度存在：约0.2μM至约4μM，更优选约1μM至约4μM，约1μM至约3μM，约0.5μM至约4μM，约0.5μM至约2μM，约0.2μM至约4μM，约0.2μM至约2μM，或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2μM、或其中可推导的任何范围。在一些实施方案中，SMAD信号传导抑制剂是TGFβ抑制剂。TGFβ抑制剂可以是SB431542。在一些实施方案中，SB431542以约1至20μM、约5至15μM、约9至11μM或约10μM的浓度存在。多能细胞可在培养的第1至15、1至16或1至17天与SMAD的抑制剂一起培养。多能细胞可在培养的第1至17天与SMAD的抑制剂一起培养。多能细胞可以与SMAD的抑制剂基本上连续地或每天一起培养，持续15、16或17天。多能细胞可与SMAD的抑制剂基本上连续地或每天一起培养，持续17天。SMAD的抑制剂可以以约50至2000nM或50至500nM的浓度存在。SMAD的抑制剂可以以约180至240nM的浓度存在。所述方法还可包括使多能细胞与MEK抑制剂接触。在一些实施方案中，MEK抑制剂是PD0325901。PD0325901可以以约0.25至2.5μM的浓度存在。在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后，MEK抑制剂可与多能细胞接触约1至3天，或者在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后第1至3天、第2至4天、第3至5天，或者第1、2、3、4或第5天MEK抑制剂可与多能细胞接触接触。在一些实施方案中，在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后约24至约48小时，使MEK抑制剂与多能细胞接触。在一些实施方案中，在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后约1至2天开始，使MEK抑制剂与多能细胞每天或基本上连续地接触，持续约3至4天。在一些实施方案中，在第1天开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后第2至5天或第3至6天，使MEK抑制剂与多能细胞接触。Wnt信号传导的激活剂可以是GSK3抑制剂。在一些实施方案中，GSK3抑制剂是CHIR99021。CHIR99021可以以约1.5至2μM、约1.5至1.7μM、约1.6至1.7μM或约1.65μM的浓度存在。在一些实施方案中，在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后第9至17天，CHIR99021以约4至7μM的浓度存在。在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后1至3天，Wnt信号传导的激活剂可与多能细胞接触。在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后24至48小时内，Wnt信号传导的激活剂可与多能细胞接触。在一些实施方案中，使多能细胞与Wnt信号传导的激活剂基本上连续地或每天一起培养，持续14、15或约16天。在一些实施方案中，在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后第2至17天，使Wnt信号传导的激活剂与多能细胞接触。在一些实施方案中，SHH信号传导的激活剂是嘌呤胺或C25II Shh。所述方法还可包括使多能细胞与SHH信号传导的两种激活剂接触。SHH信号传导的两种激活剂可以是嘌呤胺和C25II Shh。在一些实施方案中，在开始与SMAD信号传导抑制剂接触的同一天或者在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后24至48小时内，使SHH信号传导的至少一种激活剂与多能细胞接触。在一些实施方案中，在开始与SMAD信号传导抑制剂接触的第1至7天或在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后第1至7天，使SHH信号传导的至少一种激活剂与多能细胞接触。所述方法还可包括使多能细胞与FGF-8接触。在一些实施方案中，不在开始与SMAD信号传导抑制剂接触的同一天使FGF-8与多能细胞接触。在一些实施方案中，在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后第9至17天或第11至17天，使FGF-8与多能细胞接触。FGF-8可以以约50至200ng/mL的浓度存在。多能细胞可包含在神经元启动子控制下的抗生素抗性转基因。所述方法还可包括通过使细胞与抗生素、化学治疗剂、DNA交联剂、DNA合成抑制剂或有丝分裂抑制剂接触来选择来源于多能细胞的神经细胞、中脑DA神经元或mDA神经元前体细胞。所述方法还可包括使多能细胞与抗生素或化学治疗剂(例如丝裂霉素C)接触。在一些实施方案中，在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后第27、28、29和/或30天，使丝裂霉素C与多能细胞接触。在一些实施方案中，抗生素是G418(遗传霉素)。所述方法还可包括在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之前，在包含ROCK抑制剂的培养基中培养或孵育多能细胞。所述方法还可包括使多能细胞与blebbistatin接触。blebbistatin可在分化的第5天和第17天与细胞接触。在一些实施方案中，mDA多巴胺能前体细胞不表达NURR1、MAP2或TH。尽管如此，mDA多巴胺能前体细胞在另外的生长或分化之后可在例如未来保留表达NURR1、MAP2、和/或TH的潜力。在一些实施方案中，mDA多巴胺能前体细胞表达EN1。mDA多巴胺能前体细胞可表达低水平的PITX2或PITX3或者基本上不表达PITX2或PITX3，尽管在成熟的多巴胺能神经元中已经观察到这两种标志物。在一些实施方案中，mDA多巴胺能前体细胞表达GBX2、OTX1、OTX2、ETV5、CORIN和/或DCX。在一些实施方案中，多能细胞是人诱导多能干(iPS)细胞。LMX1可以是LIM同源框转录因子1α(LMX1A)。在一些实施方案中，细胞组合物中约5％或更少(例如，少于约1％，或少于0.5％)的细胞是血清素能细胞或血清素能前体细胞。所述方法还可包括在DNA酶或内切核酸酶(例如，DNA酶I或)的存在下孵育人多能细胞。DNA酶I或可以以约10至20U/mL或约10至15U/mL的浓度存在。例如，可以在培养的第17天添加DNA酶I例如，以降低细胞制剂例如单细胞制剂中的细胞凝结。在一些实施方案中，在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后第4至6天中的至少一者，在内切核酸酶的存在下培养人多能细胞。在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后第5天，可在内切核酸酶的存在下培养人多能细胞。培养物可包含在容器装置中。在一些实施方案中，中脑多巴胺能神经元或中脑多巴胺能神经元前体细胞包含在药物制剂中。所述药物制剂可被配制成用于注射。在一些实施方案中，药物制剂包含透明质酸基质。所述培养物可包含约2,500个细胞/μL至约150,000个细胞/μL，约2,500个细胞/μL至约100,000个细胞/μL，约10,000个细胞/μL至约150,000个细胞/μL，约40,000个细胞/μL至约100,000个细胞/μL，或约15,000至45,000个细胞/μL。细胞可以是中脑多巴胺能神经元前体细胞或DAPC-1细胞。所述培养物可包含约1e6至约25e6，更优选约3e6至约9e6个细胞。在一些实施方案中，培养物中约10％或更少，更优选约7％或更少的细胞是血清素能前体细胞。在一些实施方案中，培养物中约5％或更少的细胞是血清素能前体细胞。在一些实施方案中，培养物中约5％或更少的细胞表达SERT和TPH2。如以下述实施例中所示，基于在第14天SERT和TPH2的表达，观察到培养物包含约5％血清素能细胞(血清素能前体细胞)，并且血清素能神经元在植入之后不存活。虽然在一些优选实施方案中，血清素能细胞的总数为约5％或更少，但在一些实施方案中，培养物可包含约6％、7％、8％或更高的血清素能细胞。在一些实施方案中，培养物中约0.1％至5％或更少的细胞表达FOXG1，和/或其中培养物中约0.1％至5％或更少的细胞表达PAX6。在一些实施方案中，培养物中少于约1％的细胞表达FOXG1，和/或其中培养物中少于约1％的细胞表达PAX6。
本公开内容的另一方面涉及在哺乳动物对象中治疗疾病的方法，其包括向对象施用治疗有效量的上述或本文中所述的培养物，例如，优选地其中向所述对象的脑施用培养物。哺乳动物对象可以是人。所述疾病可以是中枢神经系统(central nervous system，CNS)的疾病。在一些实施方案中，疾病是帕金森病(PD)或帕金森叠加综合征(PPS)。在一些实施方案中，培养物包含表达锯齿状蛋白1(EN1)但不表达NURR1的mDA前体细胞。在一些实施方案中，培养物包含未完全分化的多巴胺能神经元。可向对象的纹状体(例如壳核或黑质)施用培养物。在一些实施方案中，向对象的纹状体或壳核中的多于一个位置施用培养物。可向对象的纹状体或壳核中多个部位和/或多个针道(needle tract)处施用培养物。培养物可包含在药物组合物中。所述药物组合物可包含透明质酸基质。在一些实施方案中，培养物包含约15,000至45,000个细胞/μL，或约2e5、2.5e5、3e5、4e5、4.5e5、或其中可推导的任何范围的中脑多巴胺能神经元前体细胞。培养物可包含约1e6至约25e6，更优选约3e6至约9e6个细胞。培养物可包含约2,500个细胞/μL至约150,000个细胞/μL，约10,000个细胞/μL至约150,000个细胞/μL，约40,000个细胞/μL至约100,000个细胞/μL、或约10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000个细胞/μL、或其中可推导的任何范围。在一些实施方案中，对象患有帕金森病，并且其中所述对象在施用培养物之后表现出至少一种运动症状的改善。在一些实施方案中，对象表现出以下中一者或更多者的减轻：震颤、肌僵硬、运动缓慢、跌倒、头晕、运动冻结、肌痉挛或肌张力障碍。中脑多巴胺能前体细胞可至少部分地重新神经支配对象的纹状体或壳核。在一些实施方案中，中脑多巴胺能前体细胞在施用之后表现出有限的、较少的增殖或无增殖。尽管如此，中脑多巴胺能前体细胞可包含至少一些仍在分裂或增殖的细胞，并且中脑多巴胺能前体细胞可在施用之后继续分化。在一些实施方案中，细胞培养物中少于约1％，或优选少于0.5％的细胞是血清素能细胞。在一些实施方案中，在施用于对象之后，至少80％的所施用细胞分化成表达FOXA2和LMX1二者的分化细胞。在一些实施方案中，至少85％的分化细胞表达FOXA2和LMX1二者。在一些实施方案中，至少约60％的所施用细胞表达FOXA2和LMX1二者。可在施用之前低温冷冻(例如，在液氮中低温冷冻)培养物。例如，可以将细胞低温冷冻储存，并随后使其达到室温，将细胞施用于对象。表达FOXA2和LMX1的分化细胞还可表达选自以下中的至少一种标志物：锯齿状蛋白(EN1)、酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TH)、orthodenticle同源框2(orthodenticle homeobox2，OTX2)、核受体相关1蛋白(nuclear receptor related1protein，NURR1)、神经元特异性III类β-微管蛋白(Tuj1)、TTF3、成对样同源结构域3(paired-like homeodomain，PITX3)、achaete-scute复合物(achaete-scute complex，ASCL)、早期B细胞因子1(early B-cell factor 1，EBF-1)、早期B细胞因子3(early B-cellfactor 3，EBF-3)、甲状腺素转运蛋白(transthyretin，TTR)、突触蛋白、多巴胺转运蛋白(dopamine transporter，DAT)、和G蛋白偶联的内向整流钾通道(Kir3.2/GIRK2)、CD142、DCSM1、CD63和CD99。在一些实施方案中，表达FOXA2和LMX1，或FOXA2和TH的分化细胞还表达锯齿状蛋白、PITX3和NURR1。在一些实施方案中，细胞培养物中约10％至25％的细胞共表达FOXA2和酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)。多能细胞可以是人诱导多能干细胞(iPS)。在一些实施方案中，LMX1是LIM同源框转录因子1α(LIM homeobox transcriptionfactor 1alpha，LMX1A)。在一些实施方案中，细胞组合物中少于约5％、少于约1％或少于0.5％的细胞是血清素能细胞。在一些实施方案中，施用不会导致宿主胶质增生。所述施用可导致对象脑中无或基本上无非神经元细胞的生长或增殖。所述施用可导致mDA前体细胞在对象脑中的植入和/或mDA前体细胞对对象的脑的至少一部分的神经支配。施用可通过注射(例如，立体定向注射)来进行。
本公开内容的一个方面涉及用于制备包含表达叉头框蛋白A2(FOXA2)和LIM同源框转录因子1(LMX1)二者的人细胞(FOXA2+/LMX1+细胞)的细胞组合物的体外方法，其包括在以下信号传导调节剂的存在下培养人多能细胞：(a)小母亲抗去脑瘫(SMAD)信号传导的第一抑制剂，(b)音猬因子(SHH)信号传导的至少一种激活剂，和(c)wingless(Wnt)信号传导的至少一种激活剂；其中所述方法不包括在小母亲抗去脑瘫(SMAD)信号传导的第二抑制剂的存在下培养人多能细胞；并且其中使所述人多能细胞在诱导分化的条件下培养约360至约456个小时，或其中可推导的任何范围，并随后冷藏或冷冻保存所述细胞。在一些实施方案中，使人多能细胞在诱导分化的条件下培养约384至约432小时。在一些实施方案中，人细胞不表达NURR1。人细胞可表达叉头框蛋白A2(FOXA2)、LIM同源框转录因子1(LMX1)和锯齿状蛋白同源框1(EN1)。人细胞还可表达OTX2。在一些实施方案中，约85至95％的细胞表达叉头框蛋白A2(FOXA2)。在一些实施方案中，约65％至约85％或更多，或约65％至约75％的人细胞共表达FOXA2和LIM同源框转录因子1(LMX1)。SMAD信号传导的抑制剂可以是BMP抑制剂(例如，LDN-193189、多索吗啡、DMH-1或头蛋白)。在一些实施方案中，BMP抑制剂是LDN-193189。LDN-193189可例如以约0.2μM至约4μM的浓度存在，或者以以下浓度存在：约1μM至约3μM、约0.5μM至约4μM、约0.5μM至约2μM、约0.2μM至约4μM、约0.2μM至约2μM、或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2μM、或其中可推导的任何范围。在一些实施方案中，SMAD信号传导的抑制剂是TGFβ抑制剂(例如，SB431542)。SB431542可以以约1至20μM、5至15μM、9至11μM或约10μM的浓度存在。多能细胞可在培养第1至15、1至16或1至17天与SMAD的抑制剂一起培养。在一些实施方案中，多能细胞在培养的第1至17天与SMAD的抑制剂一起培养。多能细胞可与SMAD的抑制剂基本上连续地或每天一起培养，持续15、16或17天。在一些实施方案中，使多能细胞与SMAD的抑制剂基本上连续地或每天一起培养，持续17天。SMAD的抑制剂可以以约50至2000nM或约50至500nM的浓度存在。在一些实施方案中，SMAD的抑制剂以约180至240nM的浓度存在。该方法还可包括使多能细胞与MEK抑制剂(例如，PD0325901)接触。PD0325901可以以约0.25至2.5μM的浓度存在。在一些实施方案中，在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后，使MEK抑制剂与多能细胞接触约1至3天，或者在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后第1至3、2至4、3至5天，或第1、2、3、4或第5天使MEK抑制剂与多能细胞接触。在一些实施方案中，在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后约24至约48小时，使MEK抑制剂与多能细胞接触。在一些实施方案中，在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后约1至2天开始，使MEK抑制剂与多能细胞每天或基本上连续地接触，持续约3至4天。在一些实施方案中，在第1天开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后第2至5天或第3至6天，使MEK抑制剂与多能细胞接触。Wnt信号传导的激活剂可以是GSK3抑制剂(例如，CHIR99021)。在一些实施方案中，CHIR99021以约1.5至1.7μM、约1.6至1.7μM、约1.65μM或其中可推导的任何范围的浓度存在。在一些实施方案中，在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后第9至17天，CHIR99021以约4至7μM的浓度存在。在一些实施方案中，在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后1至3天，使Wnt信号传导的激活剂与多能细胞接触。在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后24至48小时内，使Wnt信号传导的激活剂与多能细胞接触。在一些实施方案中，使多能细胞与Wnt信号传导的激活剂基本上连续地或每天一起培养14、15或约16天。在一些实施方案中，在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后第2至17天，使Wnt信号传导的激活剂与多能细胞接触。SHH信号的激活剂可以是嘌呤胺或C25IIShh。该方法还可包括使多能细胞与SHH信号传导的两种激活剂(例如，嘌呤胺和C25II Shh)接触。在一些实施方案中，在开始与SMAD信号传导抑制剂接触的同一天或者在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后24至48小时内，使SHH信号传导的至少一种激活剂与多能细胞接触。在开始与SMAD信号传导抑制剂接触的第1至7天或在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后第1至7天，可使SHH信号传导的至少一种激活剂与多能细胞接触。所述方法还可包括使多能细胞与FGF-8接触。在一些实施方案中，不在开始与SMAD信号传导抑制剂接触的同一天使FGF-8与多能细胞接触。在一些实施方案中，在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后第9至17天或第11至17天，使FGF-8与多能细胞接触。FGF-8可以以约50至200ng/mL的浓度存在。多能细胞可包含在神经元启动子控制下的抗生素抗性转基因。所述方法还可包括通过使细胞与抗生素、化学治疗剂、DNA交联剂、DNA合成抑制剂或有丝分裂抑制剂接触来选择来源于多能细胞的神经细胞、中脑DA神经元或mDA前体细胞。所述方法还可包括使多能细胞与抗生素或化学治疗剂接触。化学治疗剂可以是丝裂霉素C。在一些实施方案中，在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后第27、28、28和/或29天，使丝裂霉素C与多能细胞接触。在一些实施方案中，抗生素是G418(遗传霉素)。所述方法还可包括在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之前，在包含ROCK抑制剂的培养基中培养或孵育多能细胞。所述方法还可包括使多能细胞与blebbistatin接触。在一些实施方案中，blebbistatin在分化的第5天和第17天与细胞接触。在一些实施方案中，至少40％、至少60％、至少80％或至少85％的人多能细胞分化并表达FOXA2和LMX1二者。在一些实施方案中，约10％至25％的人多能细胞分化并表达FOXA2和酪氨酸羟化酶(TH)二者。多能细胞可以是人诱导多能干(iPS)细胞。在一些实施方案中，LMX1是LIM同源框转录因子1α(LMX1A)。在一些实施方案中，表达FOXA2和LMX1或者FOXA2和TH的分化细胞还表达选自以下中的至少一种标志物：orthodenticle同源框2(OTX2)、核受体相关1蛋白(NURR1)、神经元特异性III类β-微管蛋白(Tuj1)、TTF3、成对样同源结构域3(PITX3)、achaete-scute复合物(ASCL)、早期B细胞因子1(EBF-1)、早期B细胞因子3(EBF-3)、甲状腺素转运蛋白(TTR)、突触蛋白、多巴胺转运蛋白(DAT)和G蛋白偶联的内向整流钾通道(Kir3.2/GIRK2)、CD142、DCSM1、CD63和CD99。FOXA2+/LMX1+细胞还可表达锯齿状蛋白EN1。FOXA2+/LMX1+细胞还可表达EN1、Pax8和ETV5。在一些实施方案中，FOXA2+/LMX1+细胞不表达NURR1。FOXA2+/LMX1+细胞可表达GBX2、OTX1、OTX2、ETV5、CORIN和/或DCX。在一些实施方案中，细胞组合物中少于约1％，优选少于0.5％的细胞是血清素能细胞。所述方法还可包括在DNA酶或内切核酸酶的存在下孵育人多能细胞。内切核酸酶可以是DNA酶I或DNA酶I或可以以约10至20U/mL的浓度或以约10至15U/mL或其中可推导的任何范围的浓度存在。在一些实施方案中，在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后第4至6天中的至少一者，在内切核酸酶的存在下培养人多能细胞。在一些实施方案中，在开始与SMAD信号传导抑制剂接触之后第5天，在内切核酸酶的存在下培养人多能细胞。
在一些实施方案中，提供了使用本文中所提供范围的单SMAD方法的相比于上述分化持续较长或较短时间的细胞。例如，除了D17细胞之外，本文中还提供了处于分化后期的细胞，例如D24细胞和/或D37细胞，并且可将其施用于对象以治疗神经或脑疾病。在一些实施方案中，提供了包含使用本文中提供的单SMAD方法已经分化至少18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或37天或其中可推导的任何范围的细胞的培养物，并且所述培养物可以例如包含在药物组合物中或用于体外测试(例如毒理学测试、药物筛选、电生理测试)或用于治疗体内神经疾病。在一些实施方案中，本文中提供了使用本文中提供的单SMAD方法分化并持续约12天、13天、14天、15天、16天或其中可推导的任何范围的时间段的细胞，并且预期可将这样的细胞施用于哺乳动物对象以治疗如本文中所述的神经疾病，例如如PD。如以下实施例所示，D17、D24和D37细胞可表达以下细胞标志物，如下：
表X1：
标志物 D17 D24 D37
FoxA2 + + +
LMX1A + + +
NURR1 - + +
TH - + +
CALB1 - - +
ETV5 + + +
EN1 + - -
BARHL1 - - -
GIRK2 - - +
“+”＝观察到的表达；“-”＝非常低的表达或未观察到表达
本公开内容的另一方面涉及包含通过上述或本文中所述方法产生的中脑多巴胺能神经元或中脑多巴胺能神经元前体细胞的培养物。培养物可包含在容器装置中。在一些实施方案中，中脑多巴胺能神经元或中脑多巴胺能神经元前体细胞包含在药物制剂中。该药物制剂可配制成用于注射。
本公开内容的另一方面涉及筛选测试化合物的方法，其包括：(a)使通过上述或本文中所述方法分化的FOXA2+/LMX1A+细胞或者上述或本文中所述的mDA前体细胞(例如，D17细胞)与测试化合物接触，以及(b)测量细胞的功能、生理或生存力。所述测量可包括测试细胞的毒理学响应或改变的电生理学响应。在一些实施方案中，细胞是中脑多巴胺能神经元或中脑多巴胺能神经元前体细胞。
可以与本发明组合使用的另外的条件和方法可见于例如美国2015/0265652、美国2015/0010514和WO2013/067362，其通过引用整体并入本文。可与本发明组合使用的用于纯化或促进多能细胞分化成神经元或中脑DA神经元的另外的方法包括，例如，Kirkeby etal.(2012),Kriks,et al.(2011)；Chung,et al.(2011),Xi et al.(2012)；Young et al.(2014)；Jaeger et al.(2011),Jiang et al.(2012)和US2016/0177260。
本文中使用的“分化日”是指细胞在培养基中的孵育日，其中多能细胞在第1天开始暴露于分化培养基。在一些优选实施方案中，第1天的分化培养基包含单一的SMAD抑制剂。在分化培养基中孵育或培养之前，细胞可在分化培养基中孵育之前在包含以下或由以下组成的培养基中孵育例如1、2或3天(即，在第0天、第-1天和/或第-2天)：Essential 8TM基础培养基和Essential 8TM补充剂(Thermo Fisher Scientific；Waltham，MA)，任选的添加ROCK抑制剂(例如，包含约0.25至5μM、0.5、0.75、1、1.25、1.5、2、3、4或其中可推导的任何范围的H1152，例如，在第-2天)，和/或blebbestatin(例如，浓度为约0.1至20μM，更优选为约1.25至5μM、或约2.5μM)。
如本文中所使用的，就指定组分而言“基本上不含”在本文中用于意指指定组分未被有目的地配制到组合物中和/或仅以污染物或以痕量存在。由组合物的任何意外污染引起的指定组分的总量优选低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法不能检测到指定组分之量的的组合物。
如本文在说明书中所使用的，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或更多个/种。如本文在权利要求书中所使用的，当与词语“包含/包括”结合使用时，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或更多个/种。
尽管本公开内容支持指仅替代方案和“和/或”的定义，但是权利要求书中术语“或/或者”的使用用于意指“和/或”，除非明确地指出仅指替代方案或者替代方案相互排斥。本文中使用的“另一”可意指至少第二个/种或更多个/种。
贯穿本申请中，术语“约”用于表示值包括用于装置、用来确定所述值的方法的固有误差变异，或者所述研究对象之间存在的变异。
根据以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应理解，虽然指示了本发明的优选实施方案，但详细描述和具体实施例仅以举例说明的方式给出，因为对本领域技术人员而言，根据该详细描述，本发明的精神和范围内的多种变化和修改将变得明显。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一幅以彩色绘制的附图。在提出请求并支付必要的费用后，官方将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。
以下附图构成了本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过结合本文中给出的具体实施方案的详细描述来参考这些附图中的一个或更多个可以更好地理解本发明。
图1：最终产物的FOXA2流式细胞术。
图2：DA祖细胞纯度(FOXA2+/LMX1+)。
图3：DA神经元分化潜能(NURR1+/S100β-)。
图4：神经元分化潜能(MAP2+/巢蛋白-)。
图5A至B：前脑神经元。将FCDI DAPC-1细胞用(图5A)抗PAX6(Biolegend#901301)或(图5B)抗FOXG1染色。iCell GABA神经元(FCDI)作为阳性对照示出；它们是具有前脑表型的细胞，主要是GABA能的，并且包含PAX6+神经元的亚群以及还包含FOXG1+神经元的亚群。
图6：针对残余iPSC的RT-QPCR。
图7A至C：由增殖细胞组成的FCDI DAPC-1。(图7A)FCDI DAPC-1制备中EdU并入的时间进程。近一半的FCDI DAPC-1细胞正在增殖。(图7B)解冻后培养物中FCDI DAPC-1的FOXA2+群体中的EdU并入的时间进程。增殖随着细胞从mDA祖细胞阶段分化成成熟的DA神经元而降低。(图7C)在第17天并入到mDA祖细胞中持续24小时时期的EdU在祖细胞成熟之后12天保留在Nurr1+细胞中。
图8：裸大鼠中的苯丙胺旋转(Amphetamine Rotation)。示出的旋转是所有记录的平均值。误差棒表示平均值的标准误差，n＝10至12只动物/组。
图9：移植后6个月的纹状体重新神经支配。使用针对TH阳性细胞进行染色而示出的重新神经支配。尽管移植中的TH+细胞数在D17与D24之间没有统计学差异，但是观察到D17细胞对纹状体的神经支配优于D24细胞。
图10：黑质内移植神经支配纹状体。当将细胞直接注射到黑质中时，与D24细胞相比，D17移植显示出对内侧前脑束和纹状体更好的神经支配。
图11：qPCR祖细胞标志物的时间进程。祖细胞标志物在D17与D24细胞之间略有不同。Lmx1、Pitx2、Nurr1和Pitx3在D24细胞中以更高的水平表达，而En-1、Pax8、ETV5和Glast在D17细胞中以更高的水平表达。
图12：qPCR标志物的时间进程。成熟标志物在表达上也有所不同；与D17细胞相比，在D24中AQP4和酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)以更高的水平表达。
图13：D17和D24培养物的免疫细胞化学(immunocytochemistry，ICC)比较。
图14：基因表达的小提琴图(Violin Plot)。
图15：使用替代细胞类型的苯丙胺旋转。示出的旋转是所有记录的平均值。误差棒表示平均值的标准误差，n＝4至10只动物。
图16A至C：细胞群百分比。通过将hNuc+细胞数除以450,000个所注射细胞来计算hNuc百分比，TH和Ki67是相同移植中所植入hNuc的百分比。示出了hNuc(图16A)、TH(图16B)和Ki67(图16C)的结果。示出了来自大鼠的组织切片的数据。每个群体的百分比列于每幅图的标题中(来自总输入的hNuc，来自计数的总hNuc的TH，以及来自计数的总hNuc的Ki67)。
图17A至C：hNuc、TH和Ki67的体视学分析。将每第12th个切片(1/2系列)针对hNuclei、TH或hKi67进行染色，并通过无偏性体视学进行量化。对于每只动物，勾勒出移植区域的轮廓并计数。每幅图具有独有的Y轴。图17A示出了每个测试组中来自每只动物的hNuc阳性细胞数、平均值和平均值的标准误差(standard error of the mean，SEM)。图17B示出了每个组中来自每只动物的TH阳性细胞数，包括平均值和SEM。图17C示出了每个组中来自每只动物的Ki67阳性细胞数，包括平均值和SEM。
图18A至C：组1(panel 1)(顶部)示出了在用1.50μM CHIR(图18A)、1.75μM CHIR(图18B)和2.00μM CHIR(图18C)制备的细胞中通过流式细胞术测得的FoxA2表达。组2(底部)示出了通过流式细胞术测得的FoxA2(y轴)/Lmx(x轴)表达。
图19：使用qPCR测量的在不同分化日之后所产生细胞中基因的表达。
图20A至J：体内D17祖细胞的功能、存活和神经支配的表征和分析。(图20A)术前以及在植入后2、4和6个月测量的d-苯丙胺诱导的旋转的基于时间的分析。(图20B)低、中、高或最大可行剂量的移植中包含的hNuclei-ir细胞的体视学估计。(图20C)TH-ir细胞的体视学估计和(图20D)每组的体视学估计的定量。(E)hGFAP(比例尺200*m)和(F)5-HT(比例尺1mm(插图(inset)25*m))染色的移植切片的代表性图像。包含DAB处理的(图20G)hNuclei和(图20H)TH或免疫荧光三重标记的(图20I)hNuclei/TH/FoxA2(绿色/红色/蓝色)和(图20J)TH/Girk2/钙结合蛋白(绿色/红色/蓝色)的低、中、高和最大可行剂量的移植的代表性图像。比例尺＝500*m。
图21A至B：体外的分化和基因表达。(图21A)分化和移植的示意图。MMC＝丝裂霉素c。(图21B)qPCR比较了在iPSC-mDA分化第17、24和37天靶区域和脱靶(off-target)区域、细胞类型和神经成熟标志物的mRNA表达。每个过程时间点以技术性一式三份来分析三次生物学重复。平均Ct值相对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(ΔCt)表示。误差棒为SEM。显著性在表7中示出。
图22A至B体外蛋白质表达。(图22A)流式细胞术比较了在iPSC-mDA分化第17、24和37天处mDA靶标志物的免疫反应性群体。示出了针对FOXA2+、FOXA2+/LMX1+、NURR1+、MAP2+和FOXA2+/TH+的活细胞的阳性细胞群的定量。对每个时间点分析三次生物学重复(平均值±SEM)。(图22B)免疫细胞化学比较了在iPSC-mDA分化第17、24和37天处mDA靶标志物和脱靶标志物的免疫反应性群体。图像表示每个时间点分析的三次生物学重复。
图23A至E：移植存活和功能。(图23A)术前和在植入后2、4和6个月测量的d-苯丙胺诱导的旋转的基于时间的分析。在移植后4个月，对于D17 P<0.0005，以及对于G418 P<0.005；在移植后6个月，对于D17和D24 P<0.0005，以及对于G418 P<0.05。通过混合ANOVA与Tukey调整来分析数据；误差棒为SEM。相对于载剂组进行了比较。(图23B)hNuclei和(图23C)hKi-67染色的代表性移植切片，用黑色轮廓表示移植边界(graft border)。(图23D)hNuclei-ir(D17 vs.D37/G418 P<0.0001；对于D24 vs.D37/G418分别为P<0.0005和P<0.005)以及(图23E)hKi-67-ir细胞(对于D17 vs.D37为P<0.05；对于D17 vs.G418为P<0.01；对于D24 vs.D37为P<0.05)的无偏体视学定量。在(图23B)中比例尺＝500μM；在图23C(插图)中比例尺＝50μM。hNuclei估计通过单因素ANOVA与Tukey调整进行分析；误差棒表示SD。通过Kruskal-Wallis检验和Dwass-Steele-Critchlow-Fligner事后来分析hKi-67估计值。
图24A至D：体内多巴胺能表型的可视化。(图24A)DAB处理的TH染色的代表性的含移植切片。(图24B)在体内6个月之后移植物中包含的TH-ir细胞的定量(对于D17 vs.D37/G418，P<0.0001和P<0.005；对于D24 vs.D37/G418分别为P<0.0005和P<0.01)。(图24C)移植物来源TH-ir纤维的光密度。计算了D17 vs D24、D37和G418的显著性P值(P<.0005，P<.0001，P<.05)；D24 vs D37(P<.001)；以及G418 vs D37(P<.0005)。(图24D)免疫荧光三重标记TH/FOXA2/hNuclei(绿色/红色/蓝色)。比例尺(A)＝500μM；(D)＝20μM。
图25：移植到黑质中的所移植细胞的长范围神经支配。从前脑到黑质中的移植部位扫描的冠状切片中hNCAM免疫反应性的代表性计算机倒置显微图。将DAB处理的图像倒置并调整以示出神经支配的程度；所有增强均以相同的方式应用于每个样品。AC＝前连合，AON＝前嗅核，cc＝胼胝体，CPu＝尾核/壳核，Fr＝额叶皮质，NAc＝伏隔核(nucleusaccumbens)，PrL＝前边缘区，Sept＝隔膜，T＝移植，Tu＝嗅结节。
图26A至F：体内D17祖细胞的功能、存活和神经支配的定量分析。(图26A)术前和在植入后2、4和6个月测量的d-苯丙胺诱导的旋转的基于时间的分析。在移植之后4个月，对于MFD P<0.0001，以及对于高剂量P<0.0005；在移植之后6个月，对于MFD和高剂量P<0.0001；对于中剂量P<0.005；通过混合ANOVA与Tukey调整进行分析。相对于载剂组进行比较。(图26B)在低、中、高或“最大可行”剂量的移植物中包含的hNuclei-ir细胞(在图26E中可见)的体视学估计。对于通过单因素ANOVA与Tukey调整进行的所有比较，P<0.0001。(图26C)在低、中、高或“最大可行”剂量的移植物中包含的TH-ir细胞(在图26F中可见)的体视学估计。对于MFD vs.所有组P<0.0001；对于高剂量组vs.中剂量组和低剂量组分别为P<0.005和P<0.05；通过单因素ANOVA与Tukey调整进行分析。(图26D)移植物来源TH光密度的定量。单因素ANOVA与Tukey调整显示对于MFD vs中剂量和低剂量以及高剂量vs中剂量和低剂量，P<0.0001；对于MFD vs高剂量，P<0.05。分别对组织学或行为学数据进行单因素或混合效应ANOVA与Tukey调整；误差棒分别表示组织学或行为数据的SD或SEM。低剂量组的图像来自具有大量存活移植物的大鼠。比例尺＝500μM。
图27A至C：多巴胺能表型与行为恢复的相关性和mDA亚型的可视化。(图27A)将TH-ir细胞的估计数目和TH光密度计的测量值相对于d-苯丙胺诱导的净旋转的变化幅度的绝对值作图，并用对数回归曲线拟合。低/中或高/“最大可行”剂量和行为恢复的线性回归。包含免疫荧光三重标记(图27B)hNuclei/TH/FOXA2(蓝色/绿色/红色)和(图27C)TH/GIRK2/钙结合蛋白(绿色/红色/蓝色)的低、中、高和“最大可行”剂量的移植物的代表性图像。
图28A至E：移植物中观察到的非多巴胺能细胞类型。(图28A)针对hKi-67染色的移植物切片的代表性显微图和(图28B)每组的体视学估计。(图28C)针对hGFAP(胶质)、(图28D)Iba1(小胶质细胞)和(图28E)5-HT(血清素能神经元)染色的移植物切片的代表性图像。比例尺(图28A)＝100μM；(图28C)＝200μM；(图28D)＝500μM；(图28E)＝1mm(E，插图)＝25μM。对于中剂量vs.低剂量，P<0.05；对于通过Kruskal-Wallis检验与Dwass,Steel,Critchlow-Fligner方法的所有其他比较，P<0.005。
图29：体外蛋白质表达的可视化。免疫细胞化学比较了在iPSC-mDA分化第17、24和37天处mDA靶标志物和脱靶标志物的免疫反应性群体。图像代表针对每个时间点分析的三次生物学重复。
图30A至B：短期移植。对注射后3个月的完整大鼠中包含双侧G418、D37、D24或D17纹状体移植物的冠状切片进行(图30A)hNCAM或(图30B)TH的染色。
图31A至I：体外的单细胞基因表达。单细胞qPCR(Fluidigm)比较了iPSC-mDA在分化第17、24和36天的以下靶标志物的mRNA表达：A)FoxA2，B)LMX1A，C)NURR1，D)TH，E)CALB1，F)ETV5，G)EN1，H)BARHL1和I)GIRK2。针对每个过程时间点评价96个单独的细胞。每个细胞的Log2表达值表示为图上的单个标志。误差棒为SEM。
图32：对潜在危险的非靶细胞标志物FOXG1+和PAX6+细胞的FCDI DAPC-1流式细胞术测定表明非常低百分比的前脑神经元祖细胞。
图33：针对0至19DPT的血清素能细胞群的FCDI DAPC-1 qPCR测定。
图34：针对14DPT的SERT的FCDI DAPC-1 qPCR测定表明批次间一致的低表达。
图35：血清素能标志物5-HT的FCDI DAPC-1 ICC测定支持了SERT和TPH2的qPCR结果。示出了时间点1-、8-、15-和20-DPT的5-HT(红色)的ICC染色的代表性图像。
具体实施方式
在一些方面中，本发明通过提供用于使多能细胞(例如诱导多能干细胞)分化成多巴胺能(DA)神经元前体细胞的组合物和方法来克服现有技术中的限制，所述多巴胺能神经元前体细胞可显示出显著改善的用于体内治疗脑疾病的特性。所述方法可涉及在单SMAD条件下，在单一的SMAD抑制剂(“单SMAD抑制”)的存在下使多能细胞分化特定量的时间，例如约360至456个小时，或更优选约384至432小时。一般而言，并且与以前的双SMAD方法相反，单SMAD方法涉及仅使用一种SMAD抑制剂，而双SMAD方法使用两种SMAD抑制剂。与先前的研究相反，该研究认为表达NURR1的未成熟神经元比不表达NURR1的不太成熟的祖细胞更有效(Ganat et al.,2012；Qiu et al.,2017)，本文中提供了不表达NURR1的中脑多巴胺能(mDA)前体细胞(例如，D17细胞)，并且其与表达NURR1的mDA前体细胞相比在体内表现出优异的效力(例如，用于治疗PD)。如以下实施例中所示，与使用这些单SMAD方法分化其他时间段的细胞培养物相比，出人意料地观察到包含分化这些特定量时间的中脑DA神经元前体细胞的细胞培养物在体内显示出优异的特性，并且使用这些细胞培养物治疗PD大鼠模型观察到植入和神经支配的显著改善，这使得功能恢复提高。还提供了相关的细胞培养物和治疗脑疾病(例如PD)的方法。
在一些方面中，通过施用由诱导多能干细胞(iPSC)分化的mDA细胞的细胞替代治疗来在对象中治疗PD。如以下实施例中所示，与iPSC来源的有丝分裂后mDA神经元相反，观察到mDA祖细胞对涉及细胞移植治疗例如PD的脑疾病的治疗产生优异的结果。通过将mDA祖细胞(在分化的17天冷冻保存，D17)、未成熟神经元(D24)和有丝分裂后神经元(D37)植入到免疫妥协的半侧帕金森病大鼠中来检查细胞成熟度对移植物的存活和效力的影响。观察到D17祖细胞对于细胞存活、纤维向外生长和体内运动缺陷的有益作用而言，显著优于未成熟的D24或成熟的D37神经元。观察到的向腹侧中脑的黑质内植入表明，与D24细胞相比，D17细胞具有更大的在更长的距离内神经支配前脑结构(包括纹状体)的能力。当在大剂量范围内(7,500至450,000个注射细胞/纹状体)测试D17细胞时，观察到关于存活神经元数目、神经支配和功能恢复方面的明显剂量响应。重要的是，尽管这些移植物来源于iPSC，但在任何动物中均没有观察到畸胎瘤形成或其他细胞的显著向外生长。这些数据支持将这些iPSC来源D17 mDA祖细胞应用于PD的临床治疗性治疗。
I.定义
“多能性”或“多能”是指具有分化成构成一种或更多种组织或器官的所有细胞的潜能的干细胞或未分化的细胞，所述组织或器官例如，三个胚层中的任一个：内胚层(例如，内胃膜(stomach lining)、胃肠道、肺)、中胚层(例如，肌肉、骨、血液、泌尿生殖道)，或外胚层(例如，表皮组织、神经系统)。
“诱导多能干细胞”(通常缩写为iPS细胞或iPSC)是指通过使非多能细胞引入重编程因子或使其与重编程因子接触而从非多能细胞(通常是成年体细胞或终末分化细胞，例如成纤维细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等)人工制备的多能干细胞类型。
“胚胎干(embryonic stem，ES)细胞”是来源于早期胚胎的多能干细胞。
“贴壁培养”是指其中细胞或细胞聚集体附着于表面的培养。
“悬浮培养”是指其中当细胞或细胞聚集体在悬浮于液体培养基中时进行繁殖的培养。
“基本上不含”外部添加的组分是指不含或基本上不含来自培养基中除细胞以外来源的特定组分的培养基。“基本上不含”外部添加的生长因子或信号传导抑制剂(例如TGFβ、bFGF、TGFβ超家族信号传导抑制剂等)可意指外部添加组分的量最小或量不可检测。例如，基本上不含TGFβ或bFGF的培养基或环境可包含小于5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.01、0.001ng/mL或其中可推导的任何范围。例如，基本上不含信号抑制剂的培养基或环境可包含小于0.2、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.005、0.001μM，或其中可推导的任何范围。
“分化”是这样的过程，通过该过程，较不特化的细胞形成至少一种更特化的新细胞类型的后代。例如，干细胞可分化成神经元前体细胞，并且神经元前体细胞可分化成DA神经元。
术语“聚集促进培养基”意指增强细胞的聚集形成而对作用方式没有任何限制的任何培养基。
术语“聚集体”(即胚状体)是指包含悬浮培养的分化细胞、部分分化细胞和/或多能干细胞的细胞的同质或异质簇。
“神经元”或“神经细胞”或“神经细胞类型”或“神经谱系”可包括任何神经元谱系细胞，并且可用来指神经元个体发育的任何阶段而无任何限制的细胞，除非另有说明。例如，神经元可包括神经元前体细胞和/或成熟神经元二者。“神经细胞”或“神经细胞类型”和“神经谱系”细胞可包括任何神经元谱系和/或神经个体发育的任何阶段而而无限制，除非另有说明。例如，神经细胞可包括神经元前体细胞、胶质前体细胞、成熟神经元和/或神经胶质。
“编码”特定蛋白质的“基因”、“多核苷酸”、“编码区”、“序列”、“区段”或“片段”是当置于适当调节序列的控制下时在体外或体内被转录和任选地还翻译成基因产物(例如多肽)的核酸分子。编码区可以以cDNA、基因组DNA或RNA的形式存在。当以DNA形式存在时，核酸分子可以是单链(即有义链)或双链的。
术语“转基因”是指通过人工或天然手段引入到细胞或生物体中的基因、核酸或多核苷酸，例如外源核酸。外源核酸可来自不同的生物体或细胞，或者其可以是生物体或细胞内天然存在的核酸的一个或更多个另外的拷贝。
在本文中以其普通意义使用的术语“启动子”是指包含DNA调节序列的核苷酸区域，其中所述调节序列来源于能够结合RNA聚合酶并启动下游(3’方向)编码序列转录的基因。
本文中使用的“中脑DA神经元前体细胞”、“mDA神经元前体细胞”、“mDA神经元祖细胞”和“mDA前体细胞”可互换使用并且指表达FoxA2、Lmx1和EN1(中脑特异性标志物)的神经元前体细胞；但是该细胞不表达Nurrl。中脑DA神经元前体细胞可表达以下中的一种或更多种：
GBX2，OTX2，ETV5，DBX1TPH2，TH，BARHL1，SLC6A4，GATA2，NR4A2，GAD1，DCX，NXK6-1，RBFOX3，KCNJ6，CORIN，CD44，SPRY1，FABP7，SLC17A7，OTX1，和/或FGFR3。在一些实施方案中，mDA前体细胞确实表达TH；例如，mDA前体细胞还可以不表达TH，但在另外的分化之后可保留表达TH的能力。mDA前体细胞可以在不同的分化阶段表达选择的基因。
“神经干细胞(Neural Stem Cell，NSC)”是能够自我更新和无限可能增殖的多能细胞，并且可产生能够最终分化成神经元、星形胶质细胞和/或少突胶质细胞的子代细胞。NSC的非干细胞子代被称为神经祖细胞。“神经祖细胞”是具有增殖和分化成多于一种细胞类型之能力的祖细胞。神经祖细胞可以是单能的、双能的或多能的。神经祖细胞的显著特征是，与干细胞不同，它具有有限的增殖能力，并且不表现出自我更新。“神经前体细胞”(NPC)是指由神经干细胞的所有未分化子代组成的混合细胞群，包括神经祖细胞和神经干细胞二者。术语神经前体细胞可用于描述来源于胚胎干细胞或诱导多能干细胞的NSC和神经祖细胞的混合群体。
II.用于单SMAD抑制的SMAD抑制剂
在一些方面中，使用单SMAD方法将多能细胞分化约360至456个小时，更优选约384至432小时的时期，以产生神经细胞的培养物。在单SMAD方法中，在将多能细胞(例如iPS细胞、ES细胞)转化成神经元细胞(例如中脑多巴胺能细胞)的方法中，使用单一的SMAD抑制剂(例如单一的BMP信号传导抑制剂或单一的TGF-β信号传导抑制剂)来抑制SMAD信号传导。通常，与另外的双SMAD分化方法相反，单SMAD分化方法仅使用单一的SMAD抑制剂，并且第二SMAD抑制剂不包含在分化培养基中。例如，在一些方面中，使多能细胞转化成神经元前体细胞群，包括中脑DA神经元前体细胞，其中分化发生在包含单一的BMP信号传导抑制剂的培养基中。在一些实施方案中，BMP抑制剂是LDN-193189、多索吗啡或DMH-1。BMP信号传导抑制剂的一些非限制性实例包括多索吗啡、显性阴性BMP、截短的BMP受体、可溶性BMP受体、BMP受体-Fc嵌合体、头蛋白、LDN-193189、卵泡抑素、腱蛋白(chordin)、gremlin、cerberus/DAN家族蛋白、ventropin、高剂量激活素、和无羊膜蛋白(amnionless)。在一些实施方案中，核酸、反义、RNAi、siRNA或其他遗传方法可用于抑制BMP信号传导。本文中使用的BMP信号传导抑制剂可简称为“BMP抑制剂”。BMP抑制剂可在分化的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16和/或第17天，或其中可推导的任何范围(例如，第1至17天、第1至16天、第1至15天、第2至15天等)包含在分化培养基中。在一些实施方案中，BMP抑制剂在所有分化的第1至17天包含在分化培养基中。尽管如此，预期在某个时间例如在以上第1、2或3天，从分化培养基中排除BMP抑制剂是可以的。在一些实施方案中，BMP抑制剂任选地在第11至17天不包含在分化培养基中，并且在一些优选实施方案中，BMP抑制剂在第1至10天包含在分化培养基中。在WO2018/035214中还讨论了单SMAD方法。
在一些实施方案中，BMP抑制剂是LDN-193189、多索吗啡、DMH-1或头蛋白。例如，细胞可以在包含约1至2500、1至2000或1至1,000nM LDN-193189(例如，约10至500、50至500、50至300、50、100、150、200、250、300、500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、或约2500nM LDN-193189、或其中可推导的任何范围)的培养基中培养。在一些实施方案中，细胞可以在包含约0.1至10μM多索吗啡(例如，约0.1至10、0.5至7.5、0.75至5、0.5至3、1至3、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.55、1.6、1.65、1.7、1.75、2、2.25、2.5、2.75、3、或约2μM多索吗啡，或其中可推导的任何范围)的培养基中培养。在一些实施方案中，细胞可以在包含约1μM DMH-1(例如，约0.2至8、0.5至2或约1μM DMH-1，或其中可推导的任何范围)的培养基中培养。LDN-193189、多索吗啡和DMH-1可成功地用于单SMAD抑制方法中以从iPS细胞中产生中脑多巴胺能神经元或mDA前体细胞。在一些实施方案中，BMP抑制剂是K 02288或DMH2。
在一些方面中，TGFβ抑制剂可用于在单SMAD方法中抑制SMAD，以从多能细胞(例如iPS细胞)中产生中脑多巴胺能神经元或mDA前体细胞。例如，在一些实施方案中，分化培养基包含TGFβ信号传导抑制剂。TGFβ信号传导抑制剂的一些非限制性实例包括LDN-193189，SB-525334，GW788388，A-83-01，GW6604，IN-1130，Ki26894，LY2157299，LY364947(HTS-466284)，A-83-01，LY550410，LY573636，LY580276，NPC-30345，SB-431542，SB-505124，SD-093，Sm16，SM305，SX-007，Antp-Sm2A，和LY2109761。例如，分化培养基中的TGFβ抑制剂可以是SB431542。在一些方面中，细胞在包含约0.1至100μM SB431542(例如，约1至100、10至80、15至60、20至50或约40μM SB431542)的培养基中培养。本文中使用的TGFβ信号传导抑制剂(包括TGFβ受体抑制剂)可简称为“TGFβ抑制剂”。在一些实施方案中，TGFβ抑制剂不包含在分化培养基中。在一些实施方案中，TGFβ抑制剂(例如，SB431542)作为单SMAD抑制剂在第1至3天或者第1、2、3和/或第4天包含在分化培养基中。如以下实施例中所示，在一些实施方案中，BMP抑制剂用作单SMAD抑制剂，因为与使用TGFβ抑制剂相比，观察到这些化合物产生多能细胞向中脑DA神经元或mDA前体细胞的优异分化。
III.MEK抑制剂的包含
在一些方面中，MEK抑制剂包含在分化培养基中，例如，与BMP抑制剂或单SMAD抑制剂组合以从多能细胞例如iPS细胞中产生中脑多巴胺能神经元或mDA前体细胞。在一些实施方案中，MEK抑制剂是PD0325901。可使用的MEK抑制剂的非限制性实例包括PD0325901、曲美替尼(trametinib)(GSK1120212)、司美替尼(selumetinib)(AZD6244)、pimasertib(AS-703026)、MEK162、考比替尼(cobimetinib)、PD184352、PD173074、BIX 02189、AZD8330和PD98059。例如，在一些实施方案中，该方法包括在约0.1至10μM(例如，约0.1至5μM；0.5至3或0.5至1.5μM)的MEK抑制剂(例如PD0325901)的存在下培养细胞。在一些实施方案中，细胞在分化的第3、4、5天或第3至5天与MEK抑制剂(例如，PD0325901)接触。
因此，在某些方面中，使细胞分化包括在包含BMP抑制剂、音猬因子(SHH)信号传导的激活剂、Wnt信号传导的激活剂、MEK抑制剂或前述物质的组合的培养基中培养多能细胞群，其中所述培养基不包含外源添加的FGF8b。在一些情况中，可使用TGFβ抑制剂代替BMP抑制剂。在一些实施方案中，该方法不包括使用DA特异性标志物来纯化细胞。在一些方面中，多能细胞包含在神经元启动子控制下的抗性基因，其可用于纯化神经元细胞(例如，表达抗生素抗性基因的神经元细胞在暴露于抗生素时将存活，而非神经元细胞将死亡)。
在一些实施方案中，中脑DA神经元前体细胞可通过包括以下的方法产生：获得多能细胞群；在包含MEK抑制剂(例如，PD0325901)的培养基中使所述细胞分化成神经谱系细胞群，其中所述培养基在分化的第1天不包含外源添加的FGF8b；以及进一步使神经谱系细胞群的细胞分化，以提供中脑DA神经元或mDA前体细胞的富集群体。在一些实施方案中，已经观察到，在一些情况中，在第1天在分化培养基中包含FGF8(例如，FGF8b)可阻止或防止细胞分化成中脑DA神经元前体细胞。在一些实施方案中，FGF8可任选地在分化的后期例如如第9、10、11、12、13、14、15、16、17天或其中可推导的任何范围包含在分化培养基中，例如，优选地，其中在第1天在分化培养基中用单一的SMAD抑制剂启动多能细胞的接触。
IV.Wnt激活剂或GSK抑制剂的包含
在一些方面中，Wnt激活剂(例如，GSK3抑制剂)包含在分化培养基中，例如，与BMP抑制剂或单SMAD抑制剂组合，以从多能细胞例如iPS细胞中产生中脑多巴胺能神经元前体细胞。在一些实施方案中，使多能细胞成为包含中脑DA神经元或mDA前体细胞的神经元细胞群，其中分化在包含Wnt信号传导的至少第一激活剂的培养基中进行。
多种Wnt激活剂或GSK3抑制剂可用于本公开内容的多个方面中。例如，WNT信号传导的激活剂可以是糖原合酶激酶3(glycogen synthase kinase 3，GSK3)抑制剂。GSK3抑制剂的非限制性实例包括NP031112、TWS119、SB216763、CHIR-98014、AZD2858、AZD1080、SB415286、LY2090314和CHIR99021。在一些实施方案中，多能细胞与非SB415286的单一的SMAD抑制剂接触。在一些实施方案中，Wnt信号传导的激活剂是CHIR99021。因此，在一些方面中，根据一些实施方案使用的培养基包含约0.1至约10μM CHIR99021(例如，约0.1至5、0.5至5、0.5至3、大于约1.25至2.25、约1.25、1.5、1.55、1.65、1.7、1.75、1.8、1.9、2.0或约1.75μM的CHIR99021、或其中可推导的任何范围)。在一些优选实施方案中，使用约1.6至1.7μM或约1.65μM的CHIR99021。
在一些优选实施方案中，在分化的第1天，Wnt激活剂(例如，GSK3抑制剂)任选地不包含在分化培养基中。在一些实施方案中，Wnt激活剂或GSK抑制剂(例如CHR99021)在第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16和/或第17天、或者在这些天的任意组合或在所有这些天包含在分化培养基中。例如，在一些实施方案中，Wnt激活剂或GSK抑制剂在第2至17天或第3至17天包含在分化培养基中。
V.音猬因子激活剂
在一些方面中，音猬因子(SHH)信号传导的激活剂例如，与BMP抑制剂或单SMAD抑制剂组合包含在分化培养基中，以从多能细胞(例如iPS细胞)中产生中脑多巴胺能神经元或mDA前体细胞。在一些实施方案中，音猬因子激活剂是音猬因子(Shh)或突变体Shh。Shh可以是例如人或小鼠蛋白质，或者其可来源于人或小鼠Shh。例如，在一些实施方案中，Shh是突变体小鼠Shh蛋白，例如小鼠C25II Shh或人C24II Shh。在一些实施方案中，分化培养基包含Shh(例如C25II Shh)和SHH的小分子激活剂(例如嘌呤胺)二者。不希望受任何理论的束缚，音猬因子的激活剂和/或Shh可促进神经底板分化。
在一些实施方案中，mDA前体细胞通过包括以下的方法由多能细胞产生：在包含SHH信号传导的至少第一激活剂的培养基中培养多能细胞。例如，SHH信号传导的激活剂可以是重组SHH多肽(或其部分)或小分子激活剂。在某些方面中，SHH的激活剂可以是ShhC25II、嘌呤胺或嘌呤胺类似物(例如，平滑激动剂(Smoothened agonist)，例如SAG-1或3-氯-N-[(1r,4r)-4-(甲基氨基)环己基]-N-[3-(吡啶-4-基)苄基]苯并[b]噻吩-2-甲酰胺)。因此，在某些方面中，根据一些实施方案使用的培养基包含约0.1至10μM嘌呤胺(例如，约0.1至20、0.5至10、0.5至5或约2μM嘌呤胺)。在另一些方面中，培养基包含约1至1,000ng/mlShh C25II(例如，约10至1,000、10至500、50至500或约100ng/ml Shh C25II)。在一些实施方案中，SHH信号传导的激活剂包括Shh C25II和嘌呤胺二者。例如，细胞可以在包含约0.1至10μM嘌呤胺和约1至1,000ng/ml Shh C25II的培养基中培养。SHH激活剂(例如Shh C25II和嘌呤胺)可在第1、2、3、4、5、6和/或7天包含在分化培养基中。在一些实施方案中，SHH激活剂在第1天被排除在分化培养基之外。例如，在多个实施方案中，SHH激活剂在第1至6天或第2至7天包含在分化培养基中。
因此，在某些方面中，多能细胞可在具有DMEM/F12培养基的贴壁培养系统中分化培养1至6天，所述DMEM/F12培养基包含B27补充剂、1至3000或1至1000nM LDN-193189(或0.1至100μM SB431542)、0.1至50μM嘌呤胺、1至1,000ng/ml Shh C25II和0.1至10μMCHIR99021。在一个方面中，培养基可包含B27补充剂、200nM LDN-193189(或10μMSB431542)、2μM嘌呤胺、100ng/ml Shh C25II和1.25μM CHIR99021。在一些实施方案中，MEK抑制剂在1至2天之后包含在培养基中(例如，MEK抑制剂在分化的第2至4天，或第2、3和/或4天包含在内)。
VI.多能干细胞的来源
多能干细胞可用于本文中公开的用于神经诱导的方法中。本文中公开了方法和组合物，其可用于例如产生具有改善的治疗特性的中脑DA神经元前体细胞(例如，用于治疗神经退行性疾病例如PD)。
术语“多能干细胞”或“多能细胞”是指能够产生所有三个胚层(即内胚层、中胚层和外胚层)的细胞。虽然理论上多能干细胞可分化成机体的任何细胞，但是多能性的实验确定通常是基于多能细胞分化成每个胚层的数种细胞类型。在一些实施方案中，多能干细胞是来源于囊胚内细胞团的胚胎干(ES)细胞。在另一些实施方案中，多能干细胞是通过重编程体细胞而获得的诱导多能干细胞。在一些实施方案中，多能干细胞是通过体细胞核移植而获得的胚胎干细胞。多能干细胞可以从健康对象(例如，健康人)或患有疾病(例如，神经退行性疾病、帕金森病等)的对象得到或获得。
A.胚胎干细胞
胚胎干(ES)细胞是来源于囊胚的内细胞团的多能细胞。ES细胞可通过去除发育中胚胎的外部滋养外胚层，然后在非生长细胞的饲养层上培养内团细胞来分离。在适当条件下，产生增殖的、未分化ES细胞的集落。可以取出集落，解离成单细胞，并随后重新平板接种在新鲜的饲养层上。重新平板接种的细胞可以继续增殖，产生新的未分化的ES细胞集落。然后可以取出新的集落，解离，再次重新平板接种并使其生长。这种“传代培养(subculturing)”或“传代”未分化ES细胞的过程可以重复进行以产生包含未分化ES细胞的细胞系(例如，如美国专利No.5,843,780；6,200,806；7,029,913中所述)。“原代细胞培养”是从组织例如如囊胚的内细胞团直接获得的细胞的培养。“传代培养(subculture)”是来源于原代细胞培养的任何培养。
用于获得小鼠ES细胞的方法是公知的。在一种方法中，将来自129小鼠品系的植入前囊胚用小鼠抗血清处理以去除滋养外胚层，并将内细胞团在包含胎牛血清的培养基中在化学灭活的小鼠胚胎成纤维细胞的饲养细胞层上培养。将出现的未分化ES细胞的集落在胎牛血清的存在下在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上传代培养以产生ES细胞群。在一些方法中，可通过向含血清培养基添加细胞因子白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)在饲养层不存在的情况下培养小鼠ES细胞(Smith,2000)。在另一些方法中，可在骨形态发生蛋白和LIF的存在下在无血清培养基中培养小鼠ES细胞(Ying et al.,2003)。
人ES细胞可使用先前描述的方法从囊胚中获得(Thomson et al.,1995；Thomsonet al.,1998；Thomson and Marshall,1998；Reubinoff et al,2000.)。在一种方法中，使第5天的人囊胚暴露于兔抗人脾细胞抗血清，并随后暴露于豚鼠补体的1:5稀释液以裂解滋养外胚层细胞。在从完整的内细胞团去除裂解的滋养外胚层细胞之后，将内细胞团在γ-灭活的小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层上并在胎牛血清的存在下培养。在9至15天之后，可将来源于内细胞团的细胞团块化学地(即暴露于胰蛋白酶)或机械地解离，并重新平板接种在包含胎牛血清和小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的新鲜培养基中。在进一步增殖后，通过微量移液管选择具有未分化形态的集落，将其机械解地离成团块并重新平板接种(参见美国专利No.6,833,269)。ES样形态的特征在于致密的集落，具有明显高的细胞核与细胞质之比，以及明显的核仁。可通过简单的胰蛋白酶化或通过微量移液管选择单集落来常规传代所得ES细胞。在一些方法中，可通过在碱性成纤维细胞生长因子的存在下将ES细胞在成纤维细胞的饲养层上培养，在无血清的情况下培养ES细胞(Amit et al.,2000)。在另一些方法中，可通过在包含碱性成纤维细胞生长因子的“条件”培养基的存在下将细胞在蛋白质基质例如MatrigelTM或层黏连蛋白上培养，在无饲养细胞层的情况下培养人ES细胞(Xu et al.,2001)。该培养基可预先通过与成纤维细胞共培养来条件化。
用于分离恒河猴(rhesus monkey)和普通狨猴(common marmoset)ES细胞的方法也是已知的(Thomson,and Marshall,1998；Thomson et al.,1995；Thomson and Odorico,2000)。
ES细胞的另一来源是建立的ES细胞系。多种小鼠细胞系和人ES细胞系是已知的，并且已经确定了针对其生长和增殖的条件。例如，从小鼠品系129胚胎的内细胞团建立小鼠CGR8细胞系，并且可在无饲养层的情况下，在LIF的存在下培养CGR8细胞的培养物。作为另一个实例，Thomson et al.(2000)建立了人ES细胞系H1、H7、H9、H13和H14。另外，已经开发了H9系的亚克隆H9.1和H9.2。预期本领域已知的几乎任何ES或干细胞系均可用于本公开内容，例如如Yu and Thomson,2008中描述的那些，其通过引用并入本文。
ES细胞的来源可包括囊胚、来源于培养囊胚的内细胞团的细胞和从已建立的细胞系的培养物获得的细胞。因此，本文中使用的术语“ES细胞”可指囊胚的内细胞团细胞、从内细胞团细胞的培养物获得的ES细胞和从ES细胞系的培养物获得的ES细胞。
B.诱导多能干细胞
诱导多能干(iPS)细胞具有ES细胞的特征，但通过重编程已分化的体细胞而获得。已经通过多种方法获得诱导多能干细胞。在一种方法中，使用逆转录病毒转导，用转录因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4来转染成人皮肤成纤维细胞(Takahashi et al.,2006,2007)。将经转染细胞平板接种在补充有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基中的SNL饲养细胞(产生LIF的小鼠细胞成纤维细胞系)上。在约25天之后，类似人ES细胞集落的集落出现在培养物中。挑取ES细胞样集落并将其在bFGF的存在下在饲养细胞上扩增。在一些优选实施方案中，iPS细胞是人iPS细胞。
诱导多能干细胞在形态学上类似于人ES细胞，并表达多种人ES细胞标志物。当在已知导致人ES细胞分化的条件下培养时，诱导多能干细胞相应地分化。例如，诱导多能干细胞可分化成具有神经元结构和神经元标志物的细胞。预期几乎任何iPS细胞或细胞系均可用于本公开内容，包括例如Yu and Thomson,2008中描述的那些。如本领域技术人员将理解的，已经产生了多种iPS细胞系，并且来自这些已建立的细胞系的iPS细胞可用于本公开内容的多个实施方案中。
在另一种方法中，使用慢病毒转导，将人胚胎或新生儿成纤维细胞用四种基因Oct4、Sox2、Nanog和Lin28转染(Yu et al.,2007)。在感染之后12至20天，具有人ES细胞形态的集落变得可见。挑取集落并使其扩增。构成集落的诱导多能干细胞在形态学上类似于人ES细胞，表达多种人ES细胞标志物，并且在注射到小鼠中之后形成具有神经组织、软骨和肠上皮的畸胎瘤。
从小鼠细胞制备诱导多能干细胞的方法也是已知的(Takahashi and Yamanaka,2006)。iPS细胞的诱导通常需要来自Sox家族的至少一个成员和来自Oct家族的至少一个成员的表达，或者暴露于来自Sox家族的至少一个成员和来自Oct家族的至少一个成员。Sox和Oct被认为是指定ES细胞身份的转录调节层级的核心。例如，Sox可以是Sox-1、Sox-2、Sox-3、Sox-15、或Sox-18；Oct可以是Oct-4。另一些因素可以提高重编程效率，例如Nanog、Lin28、Klf4或c-Myc；特定的重编程因子组可以是包含Sox-2、Oct-4、Nanog和任选的Lin-28的组；或者包含Sox-2、Oct4、Klf和任选的c-Myc的组。
如ES细胞一样，iPS细胞具有可使用针对SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4的抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank,National Institute of Child Health andHuman Development,Bethesda Md.)和针对TRA-1-60和TRA-1-81的抗体(Andrews et al.,1987)通过免疫组织化学或流式细胞术来鉴定或确认的特征性抗原。胚胎干细胞的多能性可通过例如将约0.5至10×106个细胞注射到8至12周龄雄性SCID小鼠的后腿肌肉中来确定。畸胎瘤发生表明三个胚层中各自的至少一种细胞类型。
可使用体细胞来产生iPS细胞，所述体细胞已经被修饰以表达包含Oct家族成员和Sox家族成员的重编程因子，例如与Klf或Nanog组合的Oct4和Sox2，例如，如上所述。体细胞可以是能够被诱导成多能性的任何体细胞，例如如成纤维细胞、角质细胞、造血细胞、间充质细胞、肝细胞、胃细胞或β细胞。在一些实施方案中，T细胞也可用作用于重编程的体细胞来源(例如，参见WO 2010/141801，其通过引用并入本文)。
重编程因子可由包含在一种或更多种载体中的表达盒表达，所述载体例如整合载体、染色体非整合RNA病毒载体(参见美国申请No.13/054,022，通过引用并入本文)或附加型载体，例如基于EBV元件的系统(例如，参见WO 2009/149233，通过引用并入本文；Yu etal.,2009))。在另一方面中，可通过蛋白质或RNA转染将重编程蛋白质或RNA(例如mRNA或miRNA)直接引入到体细胞中(Yakubov et al.,2010)。
C.通过体细胞核移植获得的胚胎干细胞
可通过体细胞核移植的手段来制备多能干细胞，其中将供体细胞核移植到无纺锤体的卵母细胞中。通过核移植产生的干细胞在遗传上与供体核相同。用于产生经由体细胞核移植而获得的胚胎干细胞的方法提供于Tachibana et al.,2013中。本文中使用的术语“ES细胞”是指来源于包含受精卵核的胚胎的胚胎干细胞，并且通过核移植产生的胚胎干细胞被称为“NT-ESC”。
VII.用于分化的培养基
根据本公开内容的某些方面的分化培养基可使用待用于培养动物细胞的培养基作为其基础培养基来制备。在一些实施方案中，仅使用单一的BMP抑制剂或单一的TGF-β抑制剂，使用分化培养基使多能细胞分化成中脑多巴胺能神经元前体细胞(例如，D17细胞)。例如，用于促进多能细胞的分化(例如分化成中脑多巴胺能前体细胞)的分化培养基可包含单一的BMP抑制剂(例如LDN-193189或多索吗啡；例如在分化的第1至17天；音猬因子(SHH)信号传导的激活剂(例如嘌呤胺，人C25II SHH，或小鼠C24II SHH；例如在第1至6天、第2至7天或第1至7天)；Wnt信号传导的激活剂(例如GSK抑制剂，例如CHIR99021；例如，在第2至17天或第3至17天)和/或MEK抑制剂(例如PD0325901；例如，在第2至4天或第3至5天)。在一些实施方案中，单一的TGFβ抑制剂(例如SB-431542；例如，在第1至4天)可用于代替单一的BMP抑制剂；然而，在一些实施方案中，与使用单一的TGF-β抑制剂相比，单一的BMP抑制剂可导致细胞优异的分化成FOXA2+/LMX1A+细胞。在一些实施方案中，FGF-8(例如，FGF-8b)在第一天或在第1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天，或其任意组合(例如，第1至8天)不包含在分化培养基中；例如，在一些实施方案中，FGF-8在第9、10、11、12、13、14、15、16和17天或其任意组合包含在分化培养基中。在多个实施方案中，分化培养基可包含TGFβ和bFGF，或者作为替代，分化培养基可基本上不含TGFβ和bFGF。
在某些方面中，根据一些实施方案的分化方法涉及通过一系列培养基条件进行的细胞传代，例如：
-在包含以下的培养基中以贴壁培养方式培养细胞：单一的BMP抑制剂(或TGFβ抑制剂)；音猬因子(SHH)信号传导的激活剂；和Wnt信号传导的激活剂；
-在包含以下的培养基中以悬浮方式培养细胞：单一的BMP抑制剂(或TGFβ抑制剂)；SHH信号传导的激活剂；和Wnt信号传导的激活剂，其中形成细胞聚集体；
-在包含以下的神经基础培养基中以贴壁培养方式培养细胞：B27补充剂、L-谷氨酰胺、BDNF、GDNF、TGFβ、抗坏血酸、二丁酰基cAMP和DAPT(以及，任选地，缺乏外源性添加的视黄醇或视黄酸)，以用于成熟。
作为基础培养基，可使用任何化学限定的培养基，例如Eagle基础培养基(Eagle’sBasal Medium，BME)、BGJb、CMRL 1066、Glasgow MEM、Improved MEM Zinc Option、Iscove改良的Dulbecco培养基(Iscove’s modified Dulbecco’s medium，IMDM)、199培养基、Eagle MEM、αMEM、DMEM、Ham、RPMI 1640和Fischer培养基、其变体或组合，其中TGFβ和bFGF可包含在内或可以不包含在内。
在另一些实施方案中，细胞分化环境还可包含补充剂，例如B-27补充剂、胰岛素、转铁蛋白和硒(ITS)补充剂、L-谷氨酰胺、NEAA(非必需氨基酸)、P/S(青霉素/链霉素)、N2补充剂(5μg/mL胰岛素、100μg/mL转铁蛋白、20nM孕酮、30nM硒、100μM腐胺(Bottenstein,andSato,1979PNAS USA 76,514-517)和/或β-巯基乙醇(β-ME)。预期可添加或可以不添加另外的因子，包括但不限于纤连蛋白、层黏连蛋白、肝素、硫酸肝素、视黄酸。
分化培养基中可添加或可以不添加生长因子。除了上述因素之外或代替上述因素，可在该过程的多个步骤中使用生长因子，例如表皮生长因子家族(epidermal growthfactor，EGF)的成员、成纤维细胞生长因子家族(fibroblast growth factor，FGF)的成员(包括FGF2和/或FGF8)、血小板来源生长因子家族(platelet derived growth factor，PDGF)的成员、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)/骨形态发生蛋白(bonemorphogenetic protein，BMP)/生长和分化因子(growth and differentiation factor，GDF)家族拮抗剂。在一些实施方案中，FGF-8包含在本文中所述的分化培养基中。可以添加或可以不添加到分化培养基中的另外的因子包括通过Notch受体家族可激活或失活信号传导的分子，包括但不限于δ样和Jagged家族的蛋白质以及γ分泌酶抑制剂和另外的Notch加工或切割的抑制剂，例如DAPT。另一些生长因子可包括胰岛素样生长因子家族(insulinlike growth factor，IGF)、wingless相关(WNT)因子家族和hedgehog因子家族的成员。
可以在聚集体形成和/或分化培养基中添加另外的因子，以促进神经干/祖细胞增殖和存活以及神经元存活和分化。这些神经营养因子包括但不限于神经生长因子(nervegrowth factor，NGF)、脑来源神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)、神经营养因子-4/5(NT-4/5)、白介素-6(IL-6)、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、心肌营养因子、转化生长因子(TGF)/骨形态发生蛋白(BMP)/生长和分化因子(GDF)家族的成员、胶质来源神经营养因子(glial derived neurotrophic factor，GDNF)家族包括但不限于神经营养因子(neurturin)、神经胚素(neublastin)/artemin，和persephin和与肝细胞生长因子相关的因子以及包括肝细胞生长因子。终末分化以形成有丝分裂后神经元的神经培养物也可包含有丝分裂抑制剂或有丝分裂抑制剂(包括但不限于5-氟2’-脱氧尿苷、丝裂霉素C和/或胞嘧啶β-D-阿拉伯糖-呋喃糖苷(Ara-C))的混合物。
培养基可以是含血清或无血清的培养基。无血清培养基可是指不具有未经加工或未经纯化血清的培养基，并因此可以包括具有经纯化血液来源组分或动物组织来源组分(例如生长因子)的培养基。从防止异源动物来源组分污染的角度来看，血清可以与干细胞来源于同一动物。在一些实施方案中，所述培养基是限定培养基，并且所述培养基不包含血清或其他动物组织来源的组分(例如经辐照的小鼠成纤维细胞或已用经辐照成纤维细胞饲养细胞条件化的培养基)。
培养基可包含或可不包含血清的任何替代品。血清的替代品可包括适当地包含以下的物质：白蛋白(例如富含脂质的白蛋白、白蛋白替代物例如重组白蛋白、植物淀粉、右旋糖酐和蛋白质水解物)、转铁蛋白(或其他铁转运蛋白)、脂肪酸、胰岛素、胶原前体、痕量元素、2-巯基乙醇、3’-硫代甘油(3’-thiolgiycerol)或其等同物。例如，血清的替代品可通过国际公开No.98/30679中公开的方法来制备。或者，为了更加便利，可以使用可商购获得的材料。可商购获得的材料包括敲除血清替代品(knockout Serum Replacement，KSR)和化学限定脂质浓缩物(Gibco)。
培养基还可包含脂肪酸或脂质、氨基酸(例如非必需氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂物质、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂和无机盐。2-巯基乙醇的浓度可以是例如约0.05至1.0mM，并且特别是约0.1至0.5、或0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1、1.5、2、2.5、5、7.5、10mM或任何中间值，但是浓度不特定限于此，只要其适于培养干细胞即可。
在一些实施方案中，将多能干细胞在聚集体形成之前在培养基中培养，以改善神经诱导和底板模式化(floor plate patterning)(例如，在解离成单细胞或小聚集体以诱导聚集体形成之前)。在本发明的某些实施方案中，可以在不存在饲养细胞、饲养细胞提取物和/或血清的情况下培养干细胞。
B.培养条件
用于培养细胞的培养容器可包括但不特定地限于：瓶、用于组织培养的瓶、旋转瓶、皿、培养皿、用于组织培养的皿、多皿(multi dish)、微板、微孔板、多板(multi plate)、多孔板、微载片、室载片、管、托盘、室、培养袋和滚瓶，只要其能够在其中培养细胞即可。可将细胞以以下体积进行培养：至少或约0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、800、1000、1500mL或其中可推导的任何范围，这取决于培养的需要。在某个实施方案中，培养容器可以是生物反应器，其可以是指支持生物活性环境的任何装置或系统。生物反应器的体积可以为至少或约2、4、5、6、8、10、15、20、25、50、75、100、150、200、500升，1、2、4、6、8、10、15立方米，或其中可推导的任何范围。
培养容器表面可用细胞黏合剂或不根据目的来制备。细胞黏附培养容器可包被有用于细胞黏附的任何基质(substrate)(例如细胞外基质(extracellular matrix，ECM)来改善血管表面对细胞的黏附性。用于细胞黏附的基质可以是旨在附着干细胞或饲养细胞(如果使用的话)的任何物质。用于细胞黏附的非限制性基质包括胶原蛋白、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、聚-L-鸟氨酸、层黏连蛋白、玻连蛋白和纤连蛋白及其混合物，例如来自Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞的蛋白质混合物(例如MatrigelTM或Geltrex)和裂解的细胞膜制剂(Klimanskaya et al.,2005)。在一些实施方案中，细胞黏附培养容器包被有钙黏着蛋白，例如上皮钙黏着蛋白(E-钙黏着蛋白)。
另一些培养条件可以适当地限定。例如，培养温度可以是约30至40℃,例如，至少或约31、32、33、34、35、36、37、38、39℃，但不特定地限于此。CO2浓度可以是约1％至10％，例如约2％至7％，或其中可推导的任何范围。氧张力可以是至少或约1％、5％、8％、10％、20％或其中可推导的任何范围。
在某些方面可使用黏附培养(adhesion culture)。如果期望的话，可在饲养细胞的存在下培养细胞。在其中使用饲养细胞的情况下，基质细胞例如胚胎成纤维细胞可用作饲养细胞(例如，参见；Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual(1994)；Gene Targeting,A Practical Approach(1993)；Martin(1981)；Evans et al.(1981)；Jainchill et al.,(1969)；Nakano et al.,(1996)；Kodama et al.(1982)；以及国际公开No.01/088100和2005/080554)。在一些实施方案中，饲养细胞不包含在细胞培养基中，并且细胞可使用限定的条件进行培养。
在另一些方面中，可使用悬浮培养。可使用的悬浮培养包括载体(Fernandes etal.,2007)或凝胶/生物聚合物包封(美国专利公开No.2007/0116680)上的悬浮培养。干细胞的悬浮培养通常涉及在相对于培养基中的培养容器或饲养细胞(如果使用的话)的非黏附状况下的对细胞(例如干细胞)的培养。干细胞的悬浮培养通常包括干细胞的解离培养和干细胞的聚集悬浮培养。干细胞的解离培养涉及悬浮干细胞(例如单个干细胞或由多个干细胞(例如，约2至400个细胞)构成的小细胞聚集体的那些)的培养。当继续解离培养时，培养的、解离的细胞通常形成更大的干细胞聚集体，并此后可产生或利用聚集体悬浮培养。聚集体悬浮培养方法包括类胚体培养方法(参见Keller et al.,1995)和SFEB(无血清类胚体)方法(Watanabe et al.,2005)；国际公开No.2005/123902)。
C.多能干细胞的培养
用于制备和培养多能干细胞例如ES细胞的方法可见于细胞生物学、组织培养和胚胎学中的标准教科书和综述中，包括teratocarcinomas and embryonic stem cells:Guide to Techniques in Mouse Development(1993)；Embryonic Stem CellDifferentiation in vitro(1993)；Properties and uses of Embryonic Stem Cells:Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy(1998)，所有均通过引用并入本文。组织培养中使用的标准方法通常描述于Animal Cell Culture(1987)；GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells(1987)；和Current Protocols in MolecularBiology and Short Protocols in Molecular Biology(1987&1995)。
在将体细胞引入重编程因子或与重编程因子接触之后，可以在足以维持多能性和未分化状态的培养基中培养这些细胞。诱导多能干(iPS)细胞的培养可使用被开发用于培养灵长类多能干细胞、胚胎干细胞或iPS细胞的多种培养基和技术，例如如美国专利公开2007/0238170和美国专利公开2003/0211603以及美国专利公开2008/0171385中所述，其通过引用并入本文。应理解，可使用本领域技术人员已知的用于培养和维持多能干细胞的另外的方法。
在某些实施方案中，可以使用未限定的条件；例如，可在成纤维细胞饲养细胞或已经暴露于成纤维细胞饲养细胞的培养基上培养多能细胞，以使干细胞维持未分化状态。或者，可使用限定的、饲养层非依赖性的培养系统(feeder-independent culture system)，例如TeSR培养基(Ludwig et al.,2006a；Ludwig et al.,2006b)或E8培养基(Chen etal.,2011；PCT/US2011/046796)来培养多能细胞并使其维持在基本上未分化的状态。饲养层非依赖性的培养系统和培养基可用于培养和维持多能细胞。这些方法使人多能干细胞保持在基本上未分化的状态，而不需要小鼠成纤维细胞“饲养层”。
多种基质组分可用于培养、维持或分化人多能干细胞。例如，胶原蛋白IV、纤连蛋白、层黏连蛋白和玻连蛋白的组合可用于包被培养表面，作为为多能细胞生长提供固体支持的手段，如Ludwig et al.(2006a；2006b)中所述，其通过引用整体并入。
MatrigelTM也可用于为人多能干细胞的细胞培养和维持提供基质。MatrigelTM是由小鼠肿瘤细胞分泌的胶状蛋白质混合物，并且可从BD Biosciences(New Jersey,USA)商购获得。这种混合物类似于存在于许多组织中的复杂胞外环境，并被细胞生物学家用作细胞培养的基质。在一些实施方案中，提供E-钙黏着蛋白(例如，重组E-钙黏着蛋白基层)作为用于培养和维持多能细胞(例如人多能细胞或人iPS细胞)的基质。例如，在Nagaoka et al.(2010)中提供了相关方法。
D.单细胞传代
在多能干细胞培养的一些实施方案中，一旦培养容器是满的，则通过任何适合于解离的方法将集落分割成聚集的细胞或甚至单细胞，然后将所述细胞置于新的培养容器中用于传代。细胞传代或分割是使细胞能够在培养条件下长时间存活和生长的技术。当细胞为约70％至100％汇合时，通常将其进行传代。
多能干细胞的单细胞解离随后是单细胞传代可用于本发明的方法中，其具有数个优点，例如促进细胞扩增、细胞分选和用于分化的限定的接种，以及使培养程序和克隆扩增自动化。例如，从单细胞克隆获得的子代细胞在遗传结构上可以是同质的和/或在细胞周期上可以是同步的，这可以提高定向分化。用于单细胞传代的示例性方法可以如US2008/0171385中所述，其通过引用并入本文。
在某些实施方案中，多能干细胞可解离成单个单细胞，或者单个单细胞的组合和包含2、3、4、5、6、7、8、9、10个细胞或更多细胞的小细胞簇。解离可通过机械力或通过细胞解离剂(例如螯合剂、柠檬酸钠(柠檬酸Na(Na Citrate))或酶，例如胰蛋白酶、胰蛋白酶-EDTA、Accutase、TrypLE Select等)来实现。可以使用化学分离(例如，使用螯合剂或酶)和/或机械搅拌来解离细胞，从而实现细胞的解离。
基于多能干细胞的来源和扩增的需要，可以将解离的细胞单独或以小簇转移到新的培养容器，分割比(splitting ratio)为例如至少或约1:2、1:4、1:5、1:6、1:8、1:10、1:20、1:40、1:50、1:100、1:150、1:200或其中可推导的任何范围。悬浮细胞系分割比可以根据培养细胞悬浮液的体积来确定。传代间隔可以是至少或约每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天或其中可推导的任何范围。例如，不同酶传代方案的可实现的分割比可以是每3至7天1:2，每4至7天1:3，以及约每7天1:5至1:10，每7天1:50至1:100。当使用高分割比时，传代间隔可延长至至少12至14天或任何时间段，而不会有由于过度自发分化或细胞死亡而引起的细胞损失。
在某些方面中，单细胞传代可以在有效提高克隆效率和细胞存活的小分子(例如ROCK抑制剂或肌球蛋白II抑制剂)的存在下进行。ROCK抑制剂或肌球蛋白II抑制剂(例如Y-27632、HA-1077、H-1152或blebbistatin)可以以有效浓度使用，例如以至少或约0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50至约100μM，或其中可推导出的任何范围。
E.干细胞的分化
本文中提供了用于产生具有改善的治疗特性(例如，用于治疗帕金森病等)的mDA前体细胞的方法。多能干细胞的分化可以以多种方式诱导，例如在附着集落中或通过例如在低附着环境中形成细胞聚集体，其中这些聚集体被称为类胚体(embryoid body，EB)。EB中的分子和细胞形态发生信号和事件模拟了发育中胚胎中这样的细胞的天然个体发育的许多方面。用于指导细胞向神经元分化的方法提供于例如美国公开No.2012/0276063中，其通过引用并入本文。用于DA神经元分化的更详细和具体的方案提供于PCT公开No.WO2013/067362中，其通过引用并入本文。
类胚体(EB)是可来源于多能干细胞(例如ES细胞或iPS细胞)的细胞的聚集体，并且已经用小鼠胚胎干细胞进行了研究。为了再现体内分化固有的一些信号，可产生三维聚集体(即类胚体)作为中间步骤。当细胞聚集开始后，可启动分化，并且细胞可以开始在有限的程度上再现胚胎发育。虽然它们不能形成滋养外胚层组织(其包括胎盘)，但生物体中存在的几乎每个其他类型的细胞均可以发育。聚集形成之后可以促进神经分化。
细胞聚集可以通过悬滴、平板接种在未经组织培养处理的板或旋转瓶中来实现；这两种方法中任一者都可以防止细胞黏附至表面以形成典型的集落生长。可以在聚集体形成之前、期间或之后使用ROCK抑制剂或肌球蛋白II抑制剂以培养多能干细胞。
可以使用细胞培养领域已知的任何方法将多能干细胞接种到聚集促进培养基中。例如，多能干细胞可以作为单集落或克隆群接种到聚集促进培养基中，并且多能干细胞也可以作为基本上单独的细胞接种。在一些实施方案中，使用本领域已知的机械或酶方法将多能干细胞解离成基本上单独的细胞。作为非限制性实例，可将多能干细胞暴露于破坏细胞与培养表面之间以及细胞自身之间的连接的蛋白水解酶。可用于使多能干细胞个体化以用于聚集体形成和分化的酶可包括但不限于多种商业制剂形式的胰蛋白酶，例如TrypLE，或酶的混合物例如在某些实施方案中，可以将多能细胞作为基本上单独的(或分散的)细胞添加或接种到培养基，以用于在培养表面上形成培养物。
例如，可以将分散的多能细胞接种到培养基中。在这些实施方案中，培养表面可以基本上包含与本领域中标准无菌细胞培养方法相容的任何材料，例如非黏附表面。培养表面可另外地包含本文中所述的基质组分。在一些实施方案中，在使表面与细胞和培养基接触之前，可以将基质组分施加至培养表面。
可用于诱导分化的基质，例如胶原蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、层黏连蛋白、基质胶(matrigel)等。分化也可以通过在存在增殖诱导生长因子的情况下使细胞保持在悬浮液中来诱导，而不重新开始增殖(即，不解离神经球)。
在一些实施方案中，在培养基中在固定底物上培养细胞。然后可以向所述细胞施用增殖诱导生长因子。增殖诱导生长因子可使细胞黏附于底物(例如，经聚鸟氨酸处理的塑料或玻璃)、紧贴(flatten)、并开始分化成不同的细胞类型。
V.非静态培养
在某些方面中，非静态培养可用于培养和分化多能干细胞。非静态培养可以是通过使用例如摇动、旋转或搅拌平台或培养容器，特别是大体积旋转生物反应器来使细胞保持在受控移动速度下的任何培养。在一些实施方案中，可以使用摇床(rocker table)。搅拌可改善营养物和细胞废物产物的循环，并且还可以通过提供更均匀的环境来控制细胞聚集。例如，旋转速度可设定为至少或至多约10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100rpm，或其中可推导的任何范围。多能干细胞、细胞聚集体、分化的干细胞或从其中获得的子代细胞的在非静态培养中的孵育期可以是至少或约4小时、8小时、16小时，或1、2、3、4、5、6天，或1、2、3、4、5、6、7周，或其中可推导的任何范围。
VI.细胞的遗传改变和纯化
在一些实施方案中，本文中提供的细胞(例如mDA前体细胞)可被遗传改变。当通过任何合适的人工操作手段将多核苷酸转移到细胞中时，或者当细胞是继承了多核苷酸的最初改变的细胞的子代时，则称细胞是“遗传改变的”或“转基因的”。在一些实施方案中，细胞可包含例如在神经元启动子(例如如MAP2启动子)的控制下的抗生素抗性基因。例如，在一些实施方案中，标记基因是抗生素抗性基因，并且可以通过将细胞培养物暴露于抗生素来纯化神经元细胞，从而杀伤未分化成神经元细胞的细胞。例如，在MAP2启动子控制下表达新霉素基因的细胞可以暴露于G418以杀伤非神经元细胞。可与本发明一起使用的另外的方法在美国专利申请No.14/664,245中描述，其通过引用整体并入本文而不放弃任何权利。
在一些实施方案中，包含多巴胺能神经元的细胞群可通过将细胞暴露于有丝分裂抑制剂或化学治疗剂以杀伤分裂细胞来纯化。例如，在一些实施方案中，可将通过本发明方法产生的包含未成熟中脑DA神经元(例如D27-D31细胞)的细胞群纯化，例如通过使细胞与丝裂霉素C接触以杀伤分裂细胞进行。
VII.多巴胺能神经元和多巴胺能神经元前体的用途
本文中提供的mDA前体细胞(例如，D17细胞)可用于多种应用。这些方法包括但不限于：体内细胞的移植或植入；体外筛选细胞毒性化合物、致癌物、诱变剂、生长/调节因子、药物化合物等；阐明神经变性的机制；研究药物和/或生长因子运作的机制；基因治疗；以及生物活性产物的产生。
A.测试化合物筛选
本文中提供的中脑DA前体(例如D17细胞)可用于筛选影响本文中提供的DA神经元或mDA前体细胞的特征的因子(例如溶剂、小分子药物、肽和多核苷酸)或环境条件(例如培养条件或操作)。
在一些应用中，干细胞(分化的或未分化的)用于筛选促进沿神经谱系细胞成熟的因子，或者促进这样的细胞在长期培养中增殖和维持的因子。例如，根据细胞的进一步培养和使用的期望标准，可通过进行以下来对候选神经成熟因子或生长因子进行测试：将其添加至不同孔中的干细胞，并随后确定产生的任何表型变化。
本公开内容的筛选应用包括在药物研究中测试药物化合物。例如，在In vitroMethods in Pharmaceutical Research,Academic Press,1997)中提供了标准的测试方法。在一些实施方案的某些方面中，通过本文中详述方法产生的细胞可用作用于标准药物筛选和毒性测定(例如，鉴定、确定和测试功能特征或测试治疗细胞谱系特异性疾病的治疗分子的递送)的测试细胞，如先前在短期培养中针对原代神经元已经进行的。候选药物化合物活性的评估通常涉及将本发明某些方面中提供的神经元与候选化合物组合，确定可归因于该化合物的细胞的电生理学、形态学、标志物表型或代谢活性的任何变化(与未经处理的细胞或用惰性化合物处理的细胞相比)，并随后将该化合物的作用与观察到的变化相关联。可因该化合物被设计成对神经元细胞具有药理学作用，或者因被设计成在其他方面具有作用的化合物可具有非预期的神经副作用，而进行筛选。两种或更多种药物可组合测试(通过同时或依次与细胞组合)，以检测可能的药物-药物相互作用。
在一些应用中，可以筛选或测试化合物的潜在神经毒性。可首先通过对细胞生存力、存活、形态或酶渗漏到培养基中的影响来确定细胞毒性。在一些实施方案中，进行测试以确定化合物是否影响细胞功能(例如神经传递或电生理学)而不引起毒性。
B.中枢神经系统疾病的治疗
1.中枢神经系统的疾病
可移植本文中提供的多巴胺能神经元和mDA前体细胞(例如，D17细胞)以在患有中枢神经系统(CNS)疾病的个体中再生神经细胞。在一些实施方案中，可将根据本发明方法产生的mDA前体细胞施用于对象以治疗CNS疾病(例如，施用于脑或中脑，例如尾状核、壳核或黑质以治疗帕金森病)。这样的疾病可包括但不限于神经退行性疾病，例如帕金森综合征(parkinsonism)。
本文中使用的术语“帕金森综合征”是指一组极度与基底神经节中多巴胺不足有关的疾病，所述基底神经节是控制运动的脑的一部分。症状包括震颤、运动徐缓(运动极其缓慢)、屈曲姿势、姿势不稳定和僵硬。帕金森综合征的诊断要求存在这些症状中的至少两种，其中之一必须是震颤或运动徐缓。帕金森综合征的最常见形式是特发性或经典型帕金森病(PD)，但对于占总数约15％的显著少数的诊断来说，可能存在帕金森叠加综合征(PPS)之一。这些综合征(也称为非典型帕金森综合征)包括皮质基底节变性、路易体痴呆、多系统萎缩和进行性核上性麻痹。一般而言，帕金森病涉及脑中主要位于称为黑质的区域中的脑中的重要神经细胞的功能障碍和死亡。许多这些重要的神经细胞产生多巴胺。当这些神经元死亡时，多巴胺的量降低，使人无法正常地控制运动。在帕金森病患者中，肠也具有退化的多巴胺细胞，并且这可能是作为该疾病一部分的胃肠症状中的重要致病因素。个人经历的特定症状可因人而异。帕金森病的主要运动体征包括以下：手、臂、腿、颌和面部的震颤、运动徐缓或运动缓慢、四肢和躯干的僵硬或硬挺以及姿势不稳定或者受损的平衡和协调。
在一些实施方案中，与其他iPSC来源成熟mDA神经元相比，iPSC来源mDA前体细胞(例如，D17细胞)可表现出改善的用于PD临床治疗的特性。通过底板中间物分化的iPSC来源mDA神经元可在单侧6-羟基多巴胺(6-OHDA)损伤的无胸腺大鼠中移植、长期存活，并降低或逆转药物诱导的运动不对称性(Hiller et al.,2020；Wakeman et al.,2017)。先前已经移植了处于不同发育阶段的细胞(Bye,Thompson,&Parish,2012；Kirkeby et al.,2012；Kriks et al.,2011；Niclis et al.,2017)。
在一些实施方案中，本文中提供的mDA前体细胞可显示用于疾病(例如PD)的临床治疗的优异特性。如以下实施例中所示，1)开发了iPSC系和使得产生可临床使用的mDA前体细胞的分化过程；2)免疫妥协大鼠中iPSC来源mDA祖细胞(在体外第17天冷冻保存)的纹状体内移植完全逆转了6-OHDA诱导的运动不对称性、大量存活并密集地重新支配宿主纹状体，并且优于在第24天和37天冷冻保存的细胞的移植；3)观察到D17祖细胞在体内成熟并保持适当的mDA谱系；4)置于黑质中的D17和D24移植物表现出对通常由中脑多巴胺系统神经支配的多个宿主靶标的长距离轴突生长；5)较高剂量的D17祖细胞提供了相比于低剂量更快和更完全的功能恢复，相应地提高了细胞存活和移植物来源的TH神经支配；以及6)当移植经受了我们的分化方案的iPSC时，既没有观察到畸胎瘤，也没有观察到细胞的过度增殖。当在临床上使用时，本文中提供的mDA前体细胞可表现出以上所列优点中的一者或更多者或者全部。
在一些实施方案中，将mDA前体细胞(例如，D17细胞)施用于患者以治疗涉及多巴胺能神经元死亡的脑疾病或脑损伤，例如帕金森病(PD)。如以下实施例中所示，使用PD动物模型(即半侧帕金森病大鼠)观察mDA前体细胞在体内的植入、神经支配和功能效力。对mDA祖细胞或前体细胞(在第17天冷冻保存，“D17”)、未成熟的mDA神经元(“D24”)和经纯化的mDA神经元(“D37”)进行测试，并将其与商业上可获得的R&D级纯化的mDA神经元(D38，“G418”)进行比较(Hiller et al.,2020；Wakeman et al.,2017)。当D17或D24细胞移植到黑质(SN)中时，观察到其提供长距离的神经支配。观察到D17 mDA祖细胞具有最稳健的存活和纤维向外生长，并且使用剂量范围实验来确定在半侧帕金森病大鼠中发挥早期功能恢复的最低剂量。这些结果表明，本文中提供的mDA前体细胞可用于在哺乳动物对象(例如人)中治疗PD。
预期可将多种剂量的本文中公开的mDA前体细胞(例如D17细胞)治疗性地施用于哺乳动物对象，例如人。例如可将约2,500个细胞/μL至约150,000个细胞/μL、约10,000个细胞/μL至约150,000个细胞/μL、约40,000个细胞/μL至约100,000个细胞/μL、约15,000个细胞/μL至约45,000个细胞/μL、约3e6至9e6个细胞、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、1e4、2e4、3e4、4e4、5e4、6e4、7e4、8e4、9e4、1e5、1.1e5、1.2e5、1.3e5、1.4e5、或1.5e5个细胞/μL的中脑多巴胺能神经元前体细胞或其中可推导的任何范围施用于哺乳动物对象例如人。预期施用于哺乳动物对象(例如人患者)的细胞的总数目可为约1e5至约100e6，并且细胞的总数目可由临床医生基于对象的症状和其他特征来选择。优选地，向对象的脑施用细胞。例如，可向对象的纹状体例如壳核或黑质施用mDA前体细胞。在一些情况下，在对象脑中的一个位置施用mDA前体细胞可能是足够的。在另一些实施方案中，可在多个部位和/或多个针状束处向对象的脑(例如纹状体或壳核)中施用mDA前体细胞。在人对象中，预期在纹状体中的多个部位施用mDA细胞可在一些情况下促进mDA前体细胞更广泛的神经支配。
2.用于施用细胞的方法
本文中提供的细胞可局部地或全身地施用于对象。在一些优选实施方案中，将mDA前体细胞(例如，D17细胞)施用到对象的脑中。用于向对象施用DA神经元的方法(例如针对脑的立体定向施用)是本领域已知的，并且可应用于本文中提供的细胞和细胞培养物。如果患者正在接受来源于他或她自身细胞的细胞，则这被称为自体移植；这样的移植的排斥的可能性很小。
将干细胞或分化的神经元细胞施用于对象特别是人对象的示例性方法包括将细胞注射或移植到对象中的靶部位(例如纹状体和/或黑质)中。可将mDA前体细胞添加到递送装置中，该装置有助于通过注射或移植将细胞引入到对象中。这样的递送装置包括用于将细胞和流体注射到接受者对象体内的管，例如导管。在一个优选实施方案中，管另外地具有针，例如注射器，通过其可以将本发明的细胞引入到对象的期望位置中。可将干细胞以不同的形式添加到这样的递送装置例如注射器中。例如，当细胞包含在这样的递送装置中时，其可以悬浮在溶液中，处于细胞聚集体中，或者作为替代地包埋在支持基质中。
干细胞、神经元或神经元前体细胞可并入或包埋于其中的支持基质包括与接受者相容并降解成对接受者无害的产物的基质。支持基质可以是天然的(例如，透明质酸、胶原等)和/或合成的可生物降解的基质。可使用的合成的可生物降解基质包括合成聚合物，例如聚酐、聚原酸酯和聚乳酸(polylactic acid)。在一些实施方案中，将多巴胺能神经元(例如，未完全分化的多巴胺能神经元)包埋在透明质酸基质中，并施用于对象以治疗神经退行性疾病(例如，帕金森病)。
本文中使用的术语“溶液剂”包括在其中本发明的细胞保持存活的可药用的载体或稀释剂。可药用的载体或稀释剂包括盐水、水性缓冲溶液、溶剂和/或分散介质。这样的载体和稀释剂的使用在本领域中是已知的。溶液剂优选地是无菌的并且在容易注射性的程度上是流体。
优选地，该溶液剂在制备和储存的条件下是稳定的，并能抵抗微生物例如细菌和真菌的污染作用。在一些实施方案中，向患者施用在BSS PLUS(Alcon，Fort Worth，TX)的无菌溶液中的包含mDA前体细胞(例如，D17细胞)的溶液剂。如果期望的话，防腐剂或抗生素可包含在用于施用的药物组合物中。本发明的溶液剂可通过将本文中所述的mDA神经元前体细胞并入可药用的载体或稀释剂以及另外的成分(如果期望的话)中来制备。
3.剂量和施用
在一个方面中，本文中所述的方法提供了用于在对象中增强神经元祖细胞(例如，D17细胞)或DA神经元的植入的方法。在一些实施方案中，对象是哺乳动物，例如人。
组合物以与剂型制剂相容的方式并且以治疗有效量施用。待施用的量和时间取决于待治疗的对象、对象的身体利用活性成分的能力以及期望的治疗效果的程度。需要施用的各活性成分的精确量取决于从业者的判断，并且可能因每个患者或对象而异。合适的剂量范围可取决于施用途径，并且可使用多种施用方法。
本文中公开的多种剂量的mDA前体细胞(例如D17细胞)可以治疗性地施用于哺乳动物对象。例如可将约2,500个细胞/μL至约150,000个细胞/μL，约10,000个细胞/μL至约150,000个细胞/μL，约40,000个细胞/μL至约100,000个细胞/μL，约15,000至45,000个细胞/μL，约1e6至9e6个细胞/μL，约2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、1e4、2e4、3e4、4e4、5e4、6e4、7e4、8e4、9e4、1e5、1.1e5、1.2e5、1.3e5、1.4e5、或1.5e5个中脑多巴胺能神经元前体细胞，或其中可推导的任何范围施用于哺乳动物对象例如人。预期施用于哺乳动物对象(例如人患者)的细胞总数可在约1e5至约100e6的范围内，并且细胞的总数目可由临床医生基于对象的症状和其他特征来选择。在一些实施方案中，通过注射(例如，在脑中的单个部位或多个部位，例如纹状体或壳核中)将mDA前体细胞施用于哺乳动物对象(优选人患者)的脑或中枢神经系统。
4.效力
增强DA神经元植入的给定治疗的效力可由技术人员确定。然而，如果，例如不良DA神经元植入的任一或所有体征或症状以有益的方式改变，或者其他临床上可接受的症状得到改善，或甚至减轻，例如在用本文中所述的细胞群治疗后减轻至少10％，则治疗被认为是“有效的治疗”，如本文中所使用的术语。效力也可通过住院、对药物干预的需要(即疾病的进展停止)或移植失败的发生率所评估得个体恶化的失败来测量。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文中有所描述。治疗包括对个体或动物(一些非限制性实例包括人或哺乳动物)中疾病的任何治疗，并且包括：(1)抑制疾病，例如防止移植失败；或(2)减轻疾病，例如引起一种或更多种症状的消退。用于治疗疾病的有效量意指当对有此需要的哺乳动物施用时，足以对该疾病产生治疗或治疗益处的量。可通过评估例如DA神经元植入的身体指标，例如如震颤、运动徐缓、屈曲姿势、平衡和协调等来确定药剂的效力。在一些实施方案中，可以使用PET扫描检测代谢、活性、多巴胺能神经传递(例如，使用PET示踪剂对多巴胺能系统进行成像)在体内(例如，在人中)测量移植或神经功能。可以在帕金森病的动物模型中评估效力，例如，通过进行行为测试，例如台阶测试(step test)或圆柱体测试(cylinder test)。
C.出于商业、治疗和研究目的的分配
出于制备、分配和使用的目的，可以以在等张赋形剂或培养基中的细胞培养物或悬浮液的形式提供神经细胞，例如如本文中所述的中脑DA神经元前体细胞，任选地冷冻以促进运输或储存。
本文中所述的mDA前体细胞可使用不同的试剂系统来提供，例如，所述试剂系统包含在制备、分配或使用期间的任何时间存在的细胞组或细胞组合。所述细胞组可包含两种或更多种本公开内容中所述细胞群的任意组合，例如但不限于编程来源细胞(神经谱系细胞、其前体和亚型)，与未分化干细胞或其他分化细胞类型的组合。该组中的细胞群可共有相同的基因组或其遗传修饰形式。该组中的每种细胞类型可以在同一实体或共享商业关系的不同实体的控制下，在相同或不同的时间处一起包装或包装在同一设施的单独容器中，或包装在不同的位置。
IV.实施例
以下实施例包括在内来说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解的是，以下实施例中公开的技术表示由发明人发现在本公开内容的实践中发挥良好作用的技术，并因此可以被认为构成了用于本公开内容实践的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应理解，可在不脱离本发明的精神和范围的情况下对所公开的具体实施方案做出许多变化，并且仍然获得相同或相似的结果。
实施例1
用于产生细胞培养物的材料和方法
使用如表1中详述的多种分化培养基组合物和方案，使用小分子和生长因子诱导，在Essential 8培养基中对在VTN-TN上扩增的人诱导多能干(iPS)细胞系进行中脑神经元的分化。通常来说，将iPS细胞在第1天在D1 DA神经元诱导培养基(DA Neuron InductionMedium)中培养，在第2天在D2神经元诱导培养基(D2 Neuron Induction Medium)中培养，以及在第3天和第4天在D3-D4 DA诱导培养基中培养。在第5天，将细胞用TrypLE解离15分钟，并将其收集在DA淬灭培养基(DA Quench Medium)中，然后将细胞转移至旋转瓶悬浮培养以在D5 DA神经元聚集体形成培养基(DA Neuron Aggregate Formation Medium)中形成聚集体。
在第6天，使聚集体沉降，移除约66％的培养基，并且聚集体被饲喂DA神经元诱导培养基。在第7至16天，聚集体每天被饲喂DA神经元聚集体维持培养基(DA NeuronAggregate Maintenance Medium)，并在第11至16天更换培养基。在第17天，将聚集体用TrypLE解离成单细胞悬液，并将其平板接种到D17 DA神经元聚集体平板培养基(DA NeuronAggregate Plating Medium)中的Matrigel上。在第18、20、22天，用多巴胺神经元成熟培养基(DopaNeuron Maturation Medium)替换培养基。在第24天，使用Accutase解离细胞，并将其平板接种在DA神经元成熟平板培养基(DA Neuron Maturation Plating Medium)中。第二天，用多巴胺神经元成熟培养基替换培养基。
在第27和29天，用DA神经元成熟培养基加丝裂霉素C替换培养基。在第31天，用Accutase解离细胞并将其在DA神经元成熟平板培养基中重新平板接种到聚-L-鸟氨酸(poly-L-ornithine，PLO)/层黏连蛋白包被的瓶上。接下来，在第32、34和36天，将细胞被饲喂多巴胺神经元成熟培养基。在第37或38天，用Accutase再次解离细胞并进行分析或冷冻保存以用于之后使用。
表1：常规定时培养基条件(200nM LDN)。
使用表2中详述的多种分化培养基组合物和方案，使用小分子和生长因子诱导，在Essential 8培养基中对在VTN-TN上扩增的人诱导多能干(iPS)细胞系进行中脑神经元的分化。一般而言，将iPS细胞在第1天在D1 DA神经元诱导培养基中培养，在第2天在D2神经元诱导培养基中培养，以及在第3天和第4天在D3-D4 DA诱导培养基中培养。在第5天，将细胞用TrypLE解离15分钟，并将其收集在DA淬灭培养基中，然后将细胞转移至旋转瓶悬浮培养以在D5 DA神经元聚集体形成培养基中形成聚集体。
在第6天和第7天，使聚集体沉降，移除约66％的培养基，并且聚集体被饲喂D6-7DA诱导培养基(第6至7天)。在第8至10天，将聚集体每天用D8-10 DA聚集体维持培养基饲养。在第11至16天，将聚集体每天用D11-16 DA聚集体维持培养基饲养。在第17天，将聚集体用TrypLE解离成单细胞悬液，并使其在淬灭(DA淬灭培养基1)中静置15分钟，然后洗涤并在冷冻保存培养基中冷冻保存。将冷冻保存的细胞储存在液氮的蒸气相中。
表2：FCDI DAPC-1
实施例2
mDA祖细胞模式化(mDA Progenitor Patterning)
如通过在过程第17天共表达FoxA2和Lmx1的细胞的百分比所测量的，mDA祖细胞的有效模式化通常需要在制备过程结束时获得高度富集的mDA神经元群体。如果在第17天的大多数细胞不是mDA祖细胞，则获得的神经元将具有非中脑表型神经元的大量群体，或者将具有增殖细胞的外生长，这通常导致神经元脱离或者难以或不能纯化有丝分裂后神经元。
重复这些单SMAD实验，但有以下修改：在第5天在孵育中以浓度为10U/mL包含(内切核酸酶，EMD Millipore)。观察到在第5天在孵育中包含降低或防止了聚集体形成中的过度凝集。
实施例3
Fox A2/lmx 1共表达的流式细胞术测定
FoxA2/Lmx1共表达是成功的多巴胺神经元祖细胞模式化的关键读出，并因此开发了胞内流式细胞术测定，与使用在免疫细胞化学图像上运行的细胞计数软件得到的结果相比，其主观性和可变性更小。该测定可精确地量化在第17天至第24天过程中共表达FoxA2和Lmx1的细胞的百分比，结果与来自分析的ICC图像的计数相关。当细胞在第17天>65％FoxA2+/Lmx1+时，认为祖细胞模式化是成功的(图2)。
实施例4
来自iPSC-mDA神经元的多巴胺释放
使iPSC系“K”(21534.101)分化至过程完成(第37天)并冷冻保存。将细胞解冻并以高密度(8.8×105/cm2)平板接种。将细胞每三天用不含DAPT的成熟培养基饲养，持续总共14天。在测定日，将细胞洗涤并用HBSS(有或无56mM KCl)孵育30分钟。使用竞争性多巴胺ELISA试剂盒(Eagle Biosciences)来确定释放溶液中的多巴胺浓度。没有检测到来自iPSC来源前脑神经元(iCell神经元)的多巴胺释放。相反，使用优化的单SMADi方法获得的iPSC-mDA细胞(DATherapy Neuron)分泌的多巴胺与使用优化的双SMAD方法获得的细胞(iCellDopaNeuron)至少一样多。因此，这些细胞能够进行成熟多巴胺神经元的关键功能属性。
实施例5
iPSC-mDA神经元的电活性
将冷冻保存的iPSC-mDA神经元解冻并平板接种到PEI包被的48孔多电极阵列(MEA)板上。根据美国申请14/830,162中的FUJIFILM Cellular Dynamics,Inc申请方案“Measuring synchronous neuronal activity on the Maestro multielectrode array”培养细胞。与使用优化的双SMADi方案(iCell Dopa G100)制备的细胞相比，使用优化的单SMADi方案(DATherapy)制备的神经元表现出相似的电活性，包括平均发放频率(meanfiring rate，mFR)、脉冲(macro BPM)和连通性。平均发放频率(mFR)、频率和连通性脉冲强度随时间提高，在解冻之后约第16天达到平稳期。时间栅格图(temporal raster plot)显示出清晰的峰间间隔、高脉冲强度和孔中所有电极中的爆发，这证明了高度的电活性。
实施例6
FCDI DAPC-1神经元的定量基因表达谱
在第37天，从使用优化的单SMADi方法获得的iPSC-mDA细胞的四个批次(第1至4批)和使用优化的双SMADi方案获得的iPSC-mDA细胞的一个批次(iCell DopaNeuron)中提取RNA。在RNA分离之后，使用TaqMan基因表达测定(Applied Biosystems)进行实时定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，结果表示为相对于GAPDH对照的相对表达。值<10-4被认为是背景(阴影框)。中脑和mDA神经元标志物的表达在批次之间以及在使用不同方案制备的细胞之间是相似的。非中脑区域或非mDA细胞类型的标志物较低，并且其在单SMADi与双SMADi来源细胞之间也是相似的。结果在图12和图13中示出。
实施例7
大鼠帕金森病模型系统中iPSC-DA祖细胞和神经元的植入
将iPSC系“K”使用优化的单SMADi方案分化，并在分化过程的不同阶段(第17天、第24天和第37天)冷冻保存。另外，将使用优化的双SMADi方案(iCell Dopa)获得的iPSC-mDA细胞在过程第37天冷冻保存。将细胞解冻并双侧移植到经6-OHDA处理但无症状的裸(RNU)大鼠的纹状体(4.5×105个细胞/注射)(n＝3/组)。在3个月之后，通过冠状切片的组织学来评估细胞的植入和神经支配。尽管在所有四组(人NCAM染色)中均观察到神经元植入和神经支配，但与更成熟的单SMADi和双SMADi来源的mDA神经元(分别为第37天和第37天的iCellDopa)相比，iPSC-DA祖细胞(第17天)和未成熟的mDA神经元(第24天)具有更大的移植和较大的神经支配。另外，在祖细胞和未成熟DA神经元移植物中观察到大量的DA神经元(TH+)。Ki67染色揭示了在来自第37天细胞的移植物中几乎没有增殖细胞，并且在来自第17天和第24天细胞的移植物中几乎没有Ki67+细胞。在这些动物中的任一者中均没有观察到肿瘤、神经外生长或其他不良作用。这些结果表明，与更成熟的细胞相比，在优化的单SMADi分化过程的早期(第17至24天)提取的细胞能够更好地植入和神经支配。结果在图9中示出。
实施例8
使用多种CHIR浓度重复以上实验。结果在图18中示出。如结果所示，当使用浓度为约1.5至约1.75μM的CHIR99021时，观察到显著的改善。
实施例9
mDA祖细胞的表征
通过以上实施例中描述的方法产生了包含iPSC来源中脑多巴胺神经元祖细胞(“FCDI·DAPC-1”)的冷冻保存的单细胞悬液。通过定向分化从同种异体人iPSC系(FCDI命名为21534.101)得到该细胞，以获得多巴胺能神经元祖细胞群。
对如以上实施例中所述产生的mDA祖细胞进行FOXA2流式细胞术测定。FOXA2流式细胞术测定表明mDA祖细胞显示出FCDI DAPC-1的正确底板模式化。结果在图1中示出。
FOXA2/LMX流式细胞术测定揭示了FCDI DAPC-1 mDA祖细胞中FOXA2和LMX的共表达。进行平行ICC染色以进行比较，并观察到显示黄色的共表达细胞。结果在图2中示出。
在解冻后培养12天之后，FCDI DAPC-1 mDA祖细胞具有分化成未成熟DA神经元的潜力，如NURR1表达所证明。还进行了平行ICC染色。结果在图3中示出。
将MAP2/巢蛋白流式细胞术测定用于鉴定解冻后14天具有成为成熟(有丝分裂后)神经元潜能的细胞的百分比。代表性批次的结果在图4中示出。相互排斥的巢蛋白共染色被包括在内，以更好地分离MAP2+群体并对其设门。
表6
表7.qPCR的显著性(图1)。单因素ANOVA与Bonferroni事后检验。(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)
在成熟培养基中培养5周之后，测量类似于FCDI DAPC-1的细胞(“PD治疗细胞(PDTherapy Cells)”，来自发育早期的过程变体)的多巴胺分泌。测量了在HBSS中孵育30分钟期间释放的多巴胺浓度。在细胞去极化之后获得更高的值(HBSS+56mM KCl)。
将FCDI DAPC-1细胞用抗PAX6(Biolegend#901301)(图5A)或抗FOXG1(图5B)染色。iCell GABA神经元(FCDI)显示为阳性对照；它们是具有前脑表型的细胞，主要是GABA能的，并且包含PAX6+神经元的亚群以及FOXG1+神经元的亚群。结果在图5A至B中示出。
REX1、TDGF1和NODAL的RT-QPCR测定可检测掺入到DA祖细胞中的抑制性突触后电流(inhibitory post-synaptic currents，iPSC)(FCDI DAPC-1过程)。REX1测定是最灵敏的，可重复地检测100,000个FCDI DAPC-1过程细胞中的一个iPSC。结果在图6中示出。
表3：在过程第5天掺入到FCDI DAPC-1过程(5％)的iPSC的检测。
如上所示，多巴胺能神经元祖细胞显示出与发育中的中脑黑质区域中存在的多巴胺神经元前体(图3、图4)相似的表型标志物(图1和图2)和发育潜能。FCDI DAPC-1缺乏显著的前脑神经元和可能对治疗用途有害的残余的iPSC(图5A至B、图6和表3)。重要的是，不同于其他DA细胞治疗产物，观察到FCDI DAPC-1是增殖的祖细胞群，如通过EdU并入所证明的(图7)。
实施例10
体内PD动物模型中运动缺陷的减轻
将帕金森病(PD)的动物模型，6-OHDA损伤的无胸腺裸大鼠(RNU，Crl:NIH-Foxn1rnu)用于另外的研究。这些动物表现出显著的运动缺陷，这可使用苯丙胺诱导的旋转测试来观察(Blesa et al.,2014；Campos et al.,2013；Deumens et al.,2002；Vermilyea,et al.,2018)。将以上述实施例中所述产生的多巴胺能祖细胞神经元(D19)施用于小鼠的黑质，以确定这是否会减轻动物中的运动缺陷，如使用苯丙胺诱导的旋转测试所观察到的。如以下所讨论的，虽然成熟的D37神经元不能改善动物中的运动缺陷，但是对小鼠施用D17和D19多巴胺能祖细胞神经元能够在体内到6个月完全逆转这些运动缺陷。
具有单侧黑质纹状体多巴胺系统损伤(例如，由神经毒素例如6-羟基多巴胺、α-突触核蛋白过表达或毒性突触核蛋白原纤丝的注射诱导)的大鼠已被用作模拟帕金森病中观察到的多巴胺神经元缺失的实验模型。苯丙胺旋转测试通常用于监测由损伤诱导的运动障碍的程度，并且该测试也成为了表明移植诱导的功能恢复或者旨在保护或恢复DA神经元功能的神经保护干预的效力的标准工具。例如，在Wakeman et al.,2017中描述了该测试。
如上所述，在大鼠PD模型中测试苯丙胺旋转。如图8中所示，施用第17天(D17)的多巴胺能神经元前体细胞导致到6个月大鼠中运动症状的减轻，如用苯丙胺旋转测试所观察到的。D24未成熟神经元改善了运动表现，但是D24神经元的作用显示出比D17神经元的作用小，这在4个月和6个月的时间点特别地显著。
在向大鼠的纹状体施用神经元之后6个月，在脑切片中进行脑切片的免疫组织化学染色。与成熟的D37或Dopa神经元相比，在施用D17或D24神经元之后观察到NCAM表达提高。这些结果表明，祖细胞(D17)和未成熟(D24)mDA神经元在移植中优于更成熟(D37)mDA神经元。
在移植之后6个月观察到纹状体重新神经支配。与测试的其他神经元相比，D17细胞对纹状体的神经支配显示出是最高的。与D37或Dopa神经元相比，D17和D24细胞在神经支配方面显示出显著的改善。结果在图9中示出，并且移植物在纹状体中的黑质内神经支配的实例在图10中示出。
使用qPCR来测量D17、D24和D37细胞中的祖细胞标志物。当比较D17和D24细胞时，Lmx1、Nurr1和Pitx3在D24细胞中以较高水平表达，而En-1、Pax8、ETV5和Glast在D17细胞中以较高水平表达(图11)。还在细胞中测量了成熟标志物，并且与D17细胞相比，AQP4和酪氨酸羟化酶(TH)在D24中以更高的水平表达(图12)。图19示出了在不同分化持续时间(在D17、D24和D37时间点)之后产生的不同细胞类型中关于不同基因归一化表达的另外的数据。与D17多巴胺能神经元前体细胞相比，这些结果与D24细胞向成熟多巴胺能神经元的分化的提高一致。还对D24和D17细胞进行了免疫细胞化学，并且结果在图13中示出。来自免疫细胞化学(immunocytochemistry，ICC)实验的结果与qPCR结果一致。
替代细胞类型的功能测试示出了施用D19“中级”多巴胺能细胞能够在6个月的时间点完全逆转运动缺陷。这些细胞遵循表2中所述的方法，直至在D15它们被平板接种在D17平板培养基中的LN521上，并随后被饲喂Neuron Maturation Medium Minus DAPT D16-18，并在D19冷冻；但有以下修改：CHIR浓度从1.75μM改变为1.65μM，并且在D5和D17的淬灭培养基中添加了benzonase。D19动物到4个月开始表现出功能改善，并且与重新聚集体(reaggregate)(D17细胞解离并过夜重新聚集成更小的尺寸，并在D18冷冻)或其对照细胞(产生重新聚集体所来自的D17细胞)相比，观察到该组更快的改善。在实现改善之前的4个月时间点，重新聚集体及其对照细胞维持运动缺陷。每只动物注射的细胞总数目为：D19平均为290k/动物，重新聚集体平均为333k，以及重新聚集体对照为平均369k/动物。测试了重新聚集体和重新聚集体对照组(N＝3)中各自的多只动物。D19动物组具有N＝10只动物。结果在图15中示出。
实施例11
D17多巴胺能前体神经元的表达
在植入之后6个月，针对人nuclie(hNuc)、酪氨酸羟化酶(TH)和Ki67的存在，对脑切片进行染色。TH参与多巴胺能神经元和多巴胺能神经元前体神经元产生多巴胺。Ki67是参与细胞增殖的基因。h-Nuc是由神经元前体细胞表达的基因标志物，并且被测量以评价植入之后是否发生另外的细胞扩增。结果在图16中示出。使用Stereo Investigator光学分级器(Microbrightfield Bioscience，10.40版本)在60×放大率下对使用DAB方法的针对HuNuclei染色的全系列40μm冠状切片进行计数。TH(每12th个连续切片)和HuNuclei(每12th个连续切片)体视学参数为帧尺寸(frame size)(75μm×75μm)和网格尺寸(grid size)(250μm×250μm)，以对总移植物面积中9％进行计数，其中HuNuclei的平均CE＝0.13(Gundersen m＝1)；帧尺寸(80μm×80μm)和网格尺寸(225μm×225μm)，以对总移植物面积中12.6％进行计数，其中TH的平均CE＝0.17(Gundersen m＝1)。基于每个移植物中hNuc、TH和Ki67阳性细胞的计算数目来计算百分比。总的计算的细胞数除以总的输入的细胞数得出百分比阳性。
如图16A至C所示，每组平均值显示出超过100％的hNuc阳性，这表明移植之后的细胞扩增。在处死的6个月时间点，除了D18和重新聚集体之外，Ki67阳性群体平均占hNuc群体的小于1％。Ki67的这种低百分比支持了细胞在移植6个月之后不再增殖的观点，但并不反映所移植细胞在植入日期之后早期的增殖能力。所有组的平均hNuc阳性大于100％表明移植后早期的增殖细胞类型转变为不再增殖但保留其人源标志物的确定细胞类型。在这项动物研究中，TH阳性细胞的百分比比先前观察到的要小得多。这些组的平均值为约10至15％，而先前本发明人已经观察到TH+的平均百分比在20至30％的范围内。
对hNuc、TH和Ki67进行体视学分析。每12th个切片(1/2系列)进行hNuclei、TH或hKi67染色，并通过无偏体视学进行量化。对于每只动物，勾勒出移植区域的轮廓并计数。每幅图均具有独特的Y轴。结果在图17A至C中示出。
图17A中示出了来自每个测试组中每个动物的hNuc阳性细胞的数目，包括平均值和平均值的标准误差(SEM)。该标志物的使用表明了作为hNuclei-ir的细胞是人来源的(注射的测试物质)。与所有其他组相比，D17 T75新鲜组显示出最大范围的移植hNuc+细胞。所有其他组显示出在该组的所有动物之间具有一致的细胞移植。每组的平均值因样品而异。使用单因素ANOVA检验的分析表明，D17 T75中的hNuclei+细胞的平均数具有统计学显著性。新鲜组和D19组(p＝0.0384)。
图17B示出了每组中来自每只动物的TH阳性细胞的数目，包括平均值和SEM。TH-ir阳性细胞表示能够产生多巴胺的细胞类型，并且该细胞来自由于移植前进行消融的测试物质。除了D17 T75 6hr组(其仅具有来自一只动物的染色以进行定量)之外，所有组均显示出相似数目的移植TH+细胞，平均为约60,000个细胞。单因素ANOVA测试表明TH移植的这些治疗组之间没有统计学差异。
图17C示出了每组中每只动物的Ki67阳性细胞数、平均值和SEM。Ki67-ir细胞表示能够分裂/增殖的细胞类型。该测定中使用的特异性抗体是人特异性的，并且将仅与人源细胞结合。这些结果表明所施用细胞显示出非常低的细胞增殖率。
在施用D17细胞的6-OHDA损伤动物中观察到体内行为的改善。图20A至J示出了体内D17祖细胞的功能、存活和神经支配的表征和分析。对术前和在植入后2、4和6个月测量的d-苯丙胺诱导的旋转的基于时间的分析(图20A)。低、中、高或最大可行剂量的移植物中所包含的hNuclei-ir细胞的体视学估计(图20B)。对TH-ir细胞的体视学估计(图20C)和每组的体视学估计(图20D)进行定量。移植物切片显示出针对hGFAP(图20E)、5-HT(图20F)的阳性染色。针对hNuclei(图20G)、TH(图20H)、免疫荧光三重标记的hNuclei/TH/FoxA2(图20I)和TH/Girk2/钙结合蛋白(图20J)，对低、中、高和最大可行剂量的D17细胞进行成像。这些结果表明，可以施用D17细胞来恢复体内行为能力，如使用帕金森病动物模型所观察到的。
实施例12
材料和方法
在实施例10至12中描述的实验中使用以下方法。
损伤和移植：雌性裸大鼠在8至9周龄时接受6-OHDA损伤。将神经毒素直接施用于内侧前脑束(medial forebrain bundle)，同时将大鼠在立体定向装置中麻醉。将大鼠在损伤后使用苯丙胺每三周测试一次，以对使用旋转流量计测量的旋转进行评分。基于苯丙胺旋转数据，将指示成功损伤(30分钟时间内旋转≥5次/分钟)的动物随机分配到实验处理组中，以接受细胞或载剂对照。将新鲜准备的细胞以150,000个细胞/μL的浓度以3μL体积(每只动物450,000个细胞)直接注射到大鼠的纹状体中。
旋转测量：在损伤之后，动物显示出朝向损伤侧的旋转行为(盘旋(circling))，这表明损伤成功。这种行为是使用苯丙胺诱导的，其提高了脑中多巴胺的量。在使大鼠适应该室5分钟之后，追踪旋转，持续90分钟，每5分钟统计一次，并计算平均净旋转数/分钟。在植入之后每2个月测量一次苯丙胺旋转(图1)。将阿朴吗啡注射用于追踪受损伤半球的以反方向的旋转。将阿朴吗啡诱导的旋转追踪60分钟，并在植入之后每3个月测量一次(图2)。
尸检分析：将大鼠(6个月)麻醉，并经心脏灌注冰冷的0.9％盐水，随后是4％多聚甲醛。将脑取出并在4％多聚甲醛中后固定18至24小时，然后置于蔗糖梯度(10％、20％、30％)中并使其下沉。将所有脑在冷冻的滑动式切片机上切成40μm的冠状切片，并使用3,3’-二氨基联苯胺(DAB)的免疫组织化学(在适用的情况下使用镍增强)或荧光免疫组织化学进行处理。TH和HuNuclei(1/2系列)的体视学参数为帧尺寸(80μM×80μM)和网格尺寸(350μm×350μm)，以对总面积中9％进行计数，其中在60×放大率下，计数的TH的平均CE＝0.14(Gundersen m＝1)。对包含移植物的切片(每12th个切片)进行Ki-67染色。使用OlympusBX61对移植物主体(graft body)的整个面积(100％)进行计数。将Ki67+细胞数作为所计数5个切片中Ki-67+细胞数总和12×计算。
实施例13
体外mDA前体细胞的表征
先前的移植研究利用了研究级iPSC来源mDA神经元，以及使用相同分化方案的变化形式制备的细胞(Hiller et al.,2020；Wakeman et al.,2017)。对于细胞治疗发展的下一阶段，采取了另外的步骤来过渡到适用于cGMP制备和临床应用的过程。使用临床级人iPSC系。在cGMP条件下制备iPSC主细胞库和工作细胞库。iPSC-mDA分化的早期阶段通过改变小分子抑制剂的时间和浓度来调整。为了解决安全和监管问题，分化过程中使用的原材料尽可能为临床级。在分化过程期间使用低浓度的丝裂霉素C来去除增殖细胞以将分化至最高级成熟期(D37)的iPSC-mDA神经元富集，如前所述(Hiller et al.,2020)(图21A)。这种方法不需要R&D级G418细胞中使用的药物选择盒。mDA祖细胞(D17)和未成熟(D24)mDA神经元不能富含丝裂霉素C，因为它们仍在增殖；因此，这些实验的主要目标是为了确定调整的分化过程(没有富集步骤)是否足以防止移植的D17和D24细胞中不期望的细胞增殖。
先前的研究提供了人iPSC-mDA神经元可表达高水平的区域性中脑标志物和低水平的前脑和后脑标志物的证据(Hiller et al.,2020；Wakeman et al.,2017)。将类似的基因表达组用于表征使用适于翻译用途的分化过程制备的细胞(图21B，表5)。所有的分化阶段(第17、24和37天)均以高水平表达区域性中脑标志物OTX2、FOXA2和LMX1A。在D17，EN1表达最高，在D24表达下降，并且在D37维持该表达水平。更成熟的mDA标志物(NURR1、TH、DAP、GIRK、CALB)在D17以非常低的水平表达，或者根本不表达，并且显示出从D24至D37逐渐提高。PITX3表达在D24最高。据报道，预测良好移植的标志物(Kirkeby et al.,2017)ETV5和SPRY1在所有阶段均表达，而CNPY1在D17和D24表达较低，并且在D37几乎不可检出。非mDA细胞类型例如运动神经元(PHOX2A，HB9)、胆碱能神经元(CHAT)、谷氨酸能神经元(VGLUT1)、GABA能神经元(GAD1)和血清素能(SERT)神经元的标志物的表达水平在所有分化阶段均很低/不表达。最高表达的脱靶标志物是GLAST，表明在培养物中存在一些星形胶质细胞前体。与STN神经元的存在一致，所述STN神经元表达一些mDA神经元的相同分子标志物(Kee etal.,2017；Nouri&Awatramani,2017)，在分化的所有阶段均观察到DBX1、PITX2和BARHL1的表达。后脑标志物HOXA2不表达，并且在整个D17-37中检出低水平的前脑标志物。流式细胞术显示<1％的D17细胞表达FOXG1或PAX6，表明缺乏前脑神经元祖细胞。还检出了在中脑中在红核中表达的BRN3A(Agarwala,Sanders,&Ragsdale,2001；Wallen et al.,1999)。在测试的所有时间点(D17、D24和D37)，神经干细胞标志物SOX1均不表达，这表明培养的细胞已经经过了干细胞分化的阶段。在这三个时间点的每一个时间点，神经祖细胞标志物DCX均表达，而更成熟的神经标志物NEUN的表达从D17至D37提高。
表5
然后使用流式细胞术在蛋白质水平上检查mDA群体(图22A)，并使用单细胞PCR在RNA水平上检查mDA群体(图31A至I)。从D17至D37，FOXA2免疫反应性(ir)细胞的百分比保持较高(>80％)，而FOXA2和LMX1的共表达在D17为约70％，到D24提高高于90％。FOXA2/LMX1-ir细胞群在D37培养物中保持较高(约85％)。正如预期并且与qPCR结果一致，在D17样品中没有检测到更成熟的标志物例如NURR1、MAP2和TH。这三种标志物中每一种的总群体百分比随时间推移而提高，其中在D24样品中约20％是免疫反应性的，并且在D37样品中50％(NURR1，FOXA2/TH)或90％(MAP2)是免疫反应性的。将免疫细胞化学用于视觉上鉴定这些细胞群(图22B，图29)。与流式细胞术结果一致，LMX1A和FOXA2在每个发育时间点在高百分比的细胞中共表达。同样与流式细胞术一致，NURR1-ir和TH-ir细胞在D17不存在，而在D24观察到少量，并且在D37观察到更高数目的细胞以及更明亮的单个细胞。在D17样品中没有检测到MAP2，但MAP2的表达随时间推移而递增，在D37具有增强的MAP2-ir。相反，巢蛋白-ir细胞在D17和D24二者时均是丰富的，但在D37几乎不可检出。STN标志物BARHL1和PITX2在所有时间点均被检出，在D17存在很少的免疫反应性细胞，并且检出细胞数目随时间推移而递增。小百分比的D37细胞表达BARHL1，表明STN神经元是NURR1-ir细胞的少数亚群，并且在数量上被未成熟的mDA神经元显著地超过。
总之，这些数据表明，分化方案导致具有主要中脑表型的培养物的产生，其包括来自接近SN的区域的细胞，包括STN和红核细胞。此外，观察到前脑或后脑细胞的污染最小。观察到D17细胞处于祖细胞阶段，并且不表达NURR1或者除EN1之外表征成熟mDA神经元的其他标志物。
实施例14
细胞成熟度对移植物的存活和功能的作用
为了评价细胞成熟度对移植物存活的作用，将D17、D24、D37或G418细胞的移植物注射到完整无胸腺大鼠的双侧纹状体中。在移植之后3个月(图30A至B)，针对人特异性神经细胞黏附分子(human-specific neural cell adhesion molecule，hNCAM)染色的冠状切片显示相对小的G418和D37移植物，其中很少的hNCAM-ir纤维神经支配宿主纹状体。相比之下，在移植有D17或D24细胞的动物中，可见大的hNCAM-ir移植物及其突起(process)。虽然所有移植物均包含TH-ir神经元，但仅D17移植物在细胞结构上以与fVM移植物下典型观察到的方式相似的方式布置，其中多巴胺能细胞体位于移植物的周围(L.Thompson,Barraud,Andersson,Kirik,&Bjorklund,2005)。
在观察到改进的分化方案产生了在免疫受损的完整大鼠脑中存活的细胞之后，我们进行了长期的功能研究。对于具有通过重复的d-苯丙胺诱导的旋转而确定的单侧6-OHDA诱导的内侧前脑束(MFB)损伤的大鼠，用载剂对照或D17、D24、D37或G418细胞(150,000个细胞/μL；3μL；n＝9至11个/组)进行移植并在注射之后6个月处死。汇总表(表4)描述了每种细胞类型和给药组的组织学和行为学调查结果。
表4
为了证明每种细胞类型的功能能力，在移植之后2、4和6个月进行在基线(在6-OHDA损伤之后10至11周)处的d-苯丙胺诱导的旋转测试(图24A)。接受载剂或D37移植物的半侧帕金森病大鼠未能表现出功能恢复。混合效应ANOVA以及Tukey事后检验揭示，接受D17、D24、或G418细胞的大鼠到注射之后6个月表现出运动不对称的显著(P<0.005，P<0.005，P<0.05)恢复。另外，接受D17移植物的动物到注射之后4个月显示出旋转的完全正常化(P<0.0005)。这些出人意料的结果表明了D17细胞在体内促进功能恢复的优越性，如使用PD动物模型所观察到的。
为了量化每种细胞类型的移植物的存活，使用无偏体视学对移植物切片中的人特异性细胞核(hNuclei)进行计数(图23B，图23D)。基于这些实验，估计得出了以下组中hNuclei-ir细胞的平均值(±SD)：D17组中为304,303±140,487个；D24组中为266,956±95,419个；D37组中为52,623±22,955个；以及G418组中为108,093±188,944个，分别表示为移植细胞的67.6％、59.3％、11.7％和24.0％。单因素ANOVA以及Tukey事后调整显示，分别与D37和G418相比，包含D17(P<0.005，P<0.01)和D24(P<0.005，P<0.05)细胞的移植物具有更好的植入和存活。
由于发生脑内畸胎瘤或谱系受限细胞(例如神经祖细胞)的外生长的风险提高，过度的增殖水平将阻止任何细胞类型的临床应用。人特异性Ki-67(hKi-67)的体视学估计揭示了以下移植物中hKi-67-ir细胞的中位数(±IQR)：D17移植物中为3,412±1,391个；D24移植物中为1,858±2,275个；D37移植物中为0±180个；以及G418移植物中为352±697个，分别表示为hNuclei-ir细胞的仅1.2％、0.6％、0.0％和0.6％(图23C，图23E)。使用Kruskal-Wallis秩和检验和Dwass-Steele-Critchlow-Fligner事后检验，针对作为hNuclei-ir细胞比例的数目，我们检出了D17与G418(P<0.01)或D37(P<0.05)的hKi-67-ir细胞总数目之间，以及D24与D37(P<0.05)之间以及D17与D37(P<0.005)之间的显著性差异。这些调查结果表明，分化早期移植的细胞移植物在移植之后包含更多的增殖细胞。D17和D24移植物在3个月和6个月时在尺寸上定性地相似，这表明与增殖相关的任何体积膨胀在移植之后很快地消退。重要地，没有畸胎瘤或外生长压迫邻近脑区域的证据。
将体视学用于估计每个移植物中TH-ir细胞的数目，并观察到以下移植物中TH-ir细胞的平均值(±SD)：D17移植物中为79,061±44,167个；D24移植物中为67,830±25,944个；D37移植物中为9,318±5,523个，以及G418移植物中为20,355±23,452个，分别表示为所估计hNuclei-ir细胞的24.0％、25.5％、16.1％和23.5％(图24A至B)。通过单因素ANOVA以及Tukey事后检验，分别与D37移植和G418移植相比，在D17(P<0.0001，P<0.005)和D24(P<0.0005和P<0.01)移植中，TH-ir群体显著更高。D17与D37之间的TH-ir细胞产率(cellyield)也存在显著差异(P<0.05)。
为了评价借助于TH-ir轴突每种细胞类型重新神经支配宿主纹状体的能力，本发明人测量了纹状体中的TH光密度。不包括移植物主体。使用经载剂处理的动物的TH去神经支配纹状体和对侧完整纹状体作为参考点，将数据分别基于获得的最小和最大值从0至1重新标度(rescale)，并转化成光密度单位(optical density unit，ODU)(图24C)。本发明人计算得出D17处理的动物中ODU的平均值(±SD)为0.46±0.14；D24处理的大鼠中ODU的平均值(±SD)为0.29±0.03；D37处理的大鼠中ODU的平均值(±SD)为0.13±0.09；以及G418处理的大鼠中ODU的平均值(±SD)为0.33±0.03。D17移植物的TH-ir突起比任何其他细胞类型显著更多(分别与D24、D37和G418相比，为P<0.0005、P<0.0001、P<0.05)，而D24(P<0.001)和G418(P<0.0005)细胞二者的TH-ir突起比D37移植物显著更多，如使用单因素ANOVA以及Tukey事后调整所示。总之，这些数据表明，在发育早期移植的细胞(即D17)包含富含TH和神经突外生长的群体。
FOXA2在真实mDA神经元的诱导和维持中发挥关键作用(Domanskyi,Alter,Vogt,Gass,&Vinnikov,2014；Kittappa,Chang,Awatramani,&McKay,2007)。利用免疫荧光共标记来确定hNuclei/TH-ir神经元中的FOXA2表达(图24D)，并且显示出大多数移植细胞表达FOXA2。大量的hNuclei/FOXA2-ir细胞亚群也表达TH，这确定了真实的mDA表型。
实施例15
mDA前体细胞的长范围位点特异性神经支配
长距离神经支配的能力非常有助于促进通过施用干细胞移植来治疗人脑中PD的治疗响应。为了评估细胞中的这些能力，本发明人将D17细胞或D24细胞移植到大鼠的SN中，并检查是否形成了对其前脑中天然靶标的长范围投射。在移植之后6个月，在冠状切片中评价hNCAM免疫反应性，以鉴定来自移植物及其靶标的纤维产生(图25)。来自D24移植物的投射主要神经支配前肢皮层、嗅结节、前嗅核、隔膜和伏隔核中的A10结构，以及纹状体中的稀疏纤维，A9靶标。本发明人通过D17移植物观察到除额叶皮质(A10)之外的这些相同的A9和A10靶标的显著地密集的神经支配。在D17和D24移植的动物二者中，我们观察到所检查的最头侧脑区(most rostral brain region)中的hNCAM-ir纤维(距SN中移植物的最头侧约7至8mm)，这表明了长距离投射纤维的能力。这些结果表明了D17细胞在长距离神经支配其天然靶标方面的优越性。
实施例16
mDA前体细胞的剂量响应
D17移植物表现出最稳健的效力、生存力和多巴胺能表型表达，而无问题性增殖，并被本发明人选择用于进一步的研究。为了确定最佳的给药策略，D17细胞的浓度从最初检查中使用的量开始向下滴定。半侧帕金森病无胸腺大鼠接受最大可行剂量(maximumfeasibledose，MFD)为150,000个细胞/μL的3μL纹状体移植，高剂量(40,000个细胞/μL)、中剂量(10,000个细胞/μL)、低剂量(2,500个细胞/μL)或载剂对照(n＝8至11/组)。在移植之后每2个月通过d-苯丙胺诱导的旋转来评估运动不对称，持续6个月，此时将大鼠处死，并对脑进行组织学评估。
本发明人在所有行为和组织学分析中观察到清楚的剂量响应。接受载剂或低剂量移植细胞的大鼠在d-苯丙胺诱导的旋转测试中未能表现出功能恢复。混合效应ANOVA与Tukey事后调整揭示，接受中(P＝0.002)、高(P<0.0001)或“最大可行”(P<0.0001)剂量的大鼠在移植之后6个月表现出运动不对称的完全正常化(图26A)。值得注意的是，早在注射之后4个月，高(P＝0.0002)或“最大可行”(P<0.0001)剂量的移植物能有效地使旋转正常化。此外，来自两个最高剂量组的大鼠中的广泛神经支配导致d-苯丙胺诱导的旋转的过度补偿，导致在与移植前所见相反的方向上回旋(circling)(图26A)。
当对移植物中的hNuclei染色进行量化时(图26B，图26E)，存活细胞的数目与剂量直接相关，估计的平均值(±SD)在MFD处理的动物中为611,588±53,377个存活细胞；在高剂量动物中为214,898±91,906；在中剂量动物中为36,848±18,816；以及在低剂量动物中为4,604±5,904。通过单因素ANOVA与Tukey事后检验计算出MFD与低剂量、中剂量、和高剂量相比以及高剂量与中剂量和低剂量相比的显著性差异(对于所有比较均为P<0.0001)。
我们还使用无偏体视学对每个移植物中TH-ir细胞的数目进行了量化(图26C，图26F)。如所预期的，TH-ir细胞数与剂量直接相关，其中在MFD移植物中估计的平均值(±SD)为59,929±18,927个TH-ir细胞；高剂量移植物中为19,973±5,759个；中剂量移植物中为6,400±4,709个；以及低剂量移植物中为1,087±1,471个，分别表示为所估计hNuclei-ir细胞的10.2％、10.0％、15.0％和7.5％。使用单因素ANOVA与Tukey事后调整，计算MFD(P<0.0001)与低剂量、中剂量和高剂量相比以及高剂量与中剂量(P＝0.03)和低剂量(P＝0.002)相比的显著性差异。
为了评价每种细胞类型借助于TH-ir进程补充宿主组织的能力，本发明人以与上述相同的方式测量并处理了纹状体中的TH光密度。重新神经支配纹状体的投射的密度与剂量相关，其中在MFD剂量组、高剂量组、中剂量组和低剂量组中计算的平均值(±SD)分别为0.51±0.04ODU、0.36±0.16ODU、0.13±0.06ODU和0.09±0.12ODU(图26D)。当使用单因素ANOVA与Tukey事后检验将MFD与低剂量(P<.0001)、中剂量(P<.0001)和高剂量(P<0.05)进行比较时，以及将高剂量与中剂量(P<0.0001)和低剂量(P<0.0001)进行比较时，发现了显著性差异。
在第一次评估时，尽管低剂量组包含4,604±5,904个hNuclei-ir细胞和1,087±1,471个TH-ir细胞，但其未显示出行为校正。另外的检查揭示了很少有至没有(little-to-no)存活移植物的5只大鼠没有恢复运动不对称。相比之下，在移植之后6个月，具有大量存活移植物的大鼠(包含1,827；2,068；和4100个TH-ir细胞)得到不同程度的恢复(旋转的减轻分别为18％；49％；和85％)。为了进一步仔细检查不同剂量的D17 mDA祖细胞的行为作用，将行为恢复相对于TH-ir细胞数和TH光密度作图(图27A)。鉴于数据的非线性品质，将对数回归用于评估这些相关性。观察到对于TH光密度r2＝0.3625(P<0.0005)和对于TH-ir细胞r2＝0.4887(P<0.00001)的结果，这表明与功能恢复中度相关。当我们将数据分配成低/中和高/MFD组时，观察到低/中组中TH光密度(r2＝0.6340；P<0.0005)和TH-ir细胞(r2＝0.3618；P<0.05)的线性关系。这些分析表明，虽然多巴胺能表型的两个度量均具有明显的上限效应(ceiling effect)，但在较低剂量时，移植物来源的神经支配是总体移植物功能的更稳健的指标。
实施例17
体内mDA表型的表征
为了确定mDA表型，在注射之后6个月的实验中进行了移植物的免疫荧光三重标记(图27B)。大多数移植细胞表达TH/FOXA2，其中大多数TH共表达细胞位于移植物的边缘。另外，观察到表达TH/GIRK2(62.6±2.9％)的许多hNuclei-ir细胞，其中小的TH/钙结合蛋白-ir(31.8±1.7％)细胞群(图27C)显示A9和A10多巴胺能亚型二者，与移植到SN的D17细胞的长范围神经支配模式一致。观察到一些GIRK2-ir细胞不表达TH(3.3±1.2％)，这可能是臂旁(parabrachial)或黑质旁(paranigral)来源的。这些结果支持了这样的观察结果：与其他细胞相比，D17细胞产生了对长范围靶标的优异的神经支配。
实施例18
增殖、胶质增生或血清素能污染的测试
关键地，在6个月之后，在移植物中观察到低水平的持续增殖，如通过对针对hKi-67染色的切片进行的无偏体视学所确定的(图28A，B)，并且与我们先前的研究一致。我们估计MFD移植物中hKi-67-ir细胞为2,402±1,006个；高剂量移植物中为1,038±741；中剂量移植物中为532±745个；以及低剂量移植物中为0±5个hKi-67-ir细胞，其分别表示为所估计hNuclei-ir细胞的0.4％、0.4％、1.2％和0.0％。我们使用Kruskal-Wallis和Dwass,Steel,Critchlow-Fligner方法针对hKi-67-ir细胞的总数目计算了MFD与高剂量(P＝0.003)、中剂量(P＝0.004)和低剂量(P＝0.003)组相比的显著性差异，以及低剂量与高剂量(P＝0.003)和中剂量(P＝0.04)组相比的显著性差异，以及低剂量与高剂量和“最大可行”剂量相比的百分比(P<0.05)。同样，我们报道了没有畸胎瘤形成的证据。
为了评估移植物内星形细胞增生的程度，将切片用人特异性GFAP染色(图28C)。我们观察到免疫反应的模式，很大程度上类似于长纤维穿过具有一些星形细胞体的移植物主体，与通过qPCR检出的GLAST表达一致，并且类似于鼠fVM移植物((L.H.Thompson,Kirik,&Bjorklund,2008)。我们评价了Iba1-ir以确定是否存在对异种移植物的升高的小胶质细胞响应。一般而言，Iba1-ir不显著，除了在紧邻开颅术的皮质中的注射部位、硬脑膜穿刺部位和移植物的周围附近，在这些地方动物确实显示出轻微提高的免疫反应性和/或活化的小胶质细胞。在移植物内或移植物周围附近观察到具有反应性形态的Iba1-ir小胶质细胞(并且中剂量组中的一只动物在移植物中具有更强的Iba1-ir)，并且一些动物在靠近开颅术和硬脑膜穿刺部位的移植物的背面附近具有带有增厚突起(process)和更强染色的小胶质细胞群(图28D)。我们发现D17移植物包含非常少的血清素能(5-HT)细胞(图28E)，其中在MFD移植物中估计有277±194个5-HT-ir细胞(所估计hNuclei-ir细胞的0.04％)。这些数据共同示出了脱靶细胞类型或宿主胶质增生的外生长的总体缺乏。
实施例19
用于治疗PD的iPSC来源mDA前体细胞
如以上实验所示，成熟(D37/G418)神经元的移植物与未成熟神经元(D24)和祖细胞(D17)的移植物在行为作用和组织学特征二方面明显不同。基于hNCAM和TH免疫染色，移植物尺寸的差异早在注射之后3个月就很明显，其中成熟(D37/G418)神经元形成薄的、铅笔状移植物，并且更幼小(D17/D24)的细胞形成相对大的移植物。在移植之后6个月，我们在D17和D24移植物中观察到与D37或G418相比稳健的多巴胺能表型，这也反映在D17和D24移植大鼠中d-苯丙胺诱导的运动不对称的完全逆转。对于所有细胞类型和剂量，移植细胞表达TH/FOXA2，这确定了在体内移植之后6个月期间的成熟继续进行，并产生了来源于移植祖细胞和未成熟神经元的成熟mDA神经元。当我们将D17细胞和D24细胞经黑质内移植时，观察到A9和A10靶标二者长距离的优先神经支配。这些调查结果与对fVM和ESC-VM组织的早期观察一致(Cardoso et al.,2018；Grealish et al.,2014)并且也得到以上实验的支持，该实验示出了移植物中的TH/GIRK2-ir和TH/钙结合蛋白-ir细胞二者。GIRK2和钙结合蛋白通常用于区分A9和A10 mDA；测序和/或先进的多重技术也可用于进一步确定这些群体。所移植iPSC mDA细胞在大鼠脑中长距离投射纤维的能力表明这些方法可应用于人壳核。
根据所使用的分化方案，观察到移植物来源TH免疫反应性纤维进入宿主纹状体中的外生长中的显著差异。移植有D17、D24和G418细胞的大鼠表现出覆盖整个纹状体的TH-ir纤维，而移植有D37细胞的大鼠(其没有表现出移植物诱导的行为恢复)显示几乎没有移植物来源的TH-ir轴突神经支配宿主。事实上，高放大率图像显示，尽管这些移植物包含TH-ir细胞和纤维，但其轴突在到达D37移植物的最外边缘时突然终止。D17和D24移植物以及D37和G418移植物中TH-ir细胞的数目相当，很有可能D17和G418细胞神经支配宿主的倾向是其功能的基础。事实上，在具有大的(67,800个TH-ir细胞)D24移植物的动物、具有较小的(6,400个TH-ir细胞)D17移植物的动物中观察到相似的行为结局；不希望受任何理论的束缚，预计这一调查结果是由于宿主纹状体的类似重新神经支配引起。回归分析表明D17 TH-ir细胞数目及其突起的上限效应，但在较低剂量下，神经支配与行为恢复的相关性比TH-ir细胞数更高。在大鼠中观察到的这些结果对于在人中获得改善的治疗响应可能特别地重要，其中壳核(PD患者中为3.96cm3(Yin et al.,2009))比大鼠纹状体显著更大。更多的TH-ir细胞及其突起可能对人产生临床益处是必要的；作为替代或组合，细胞可以沿着多个针道以有助于壳核的总重新神经支配的布置沉积在多个部位，在此在大鼠中可能没有观察到与大移植物相关的收益递减。在此，D17 mDA祖细胞在广泛的剂量范围内是有效的迹象表明，临床医生在利用多种手术方法用于施用细胞时可具有一些自由度。可进行另外的研究以更进一步优化人的给药方案，并且预期将观察到类似的治疗结果。
在成熟细胞(G418，D37)的移植物中仅很少观察到增殖细胞，这与先前的观察一致(Hiller et al.,2020；Wakeman et al.,2017)。虽然D17和D24移植物比G418/D37细胞的移植物包含更多的hKi-67-ir细胞，但作为你存活移植细胞的比例的增殖细胞的数目较低(在D17/D24移植物中，<1,000个/100,000个hNuclei-ir)，这表明不需要纯化步骤来防止不期望的细胞增殖。此外，hKi-67-ir细胞不存在于指示任何移植大鼠中的活跃细胞分裂的簇中。另一个安全性问题是GID的发生，其在具有fVM移植的患者亚群中已被报道(Freed etal.,2001；Hagell&Cenci,2005；Olanow et al.,2009)，并且已经表明血清素能神经元的异常移植有助于GID的发生。作为iPSC来源mDA前体细胞移植物的安全性的另外的证据，本发明人没有观察到数量接近那些假定诱导GID的血清素能神经元(Carlsson et al.,2009)。
在一些实施方案中，使用干细胞来源mDA细胞的以上移植研究利用祖细胞和未成熟神经元发育阶段。不希望受任何理论的束缚，预期本文中提供的mDA前体细胞可表现出已成功用于临床试验的胚胎组织的许多有益作用(Li&Li，2021)。由于分化方案的差异，很难直接比较不同研究中使用的细胞的发育阶段，但许多细胞是使其适应翻译应用的努力的焦点，包括暴露于神经元成熟因子例如BDNF、GDNF、TGF-β3和/或DAPT(Doi et al.,2020；Kimet al.,2021；Kirkeby et al.,2017；Song et al.,2020)。在直接比较不同发育阶段的研究中，结论是NURR1+未成熟神经元相比于较不成熟的祖细胞更有效(Ganat et al.,2012；Qiu et al.,2017)。相比之下，以上研究表明，暴露于mDA模式因子(SMAD抑制，SHH，WNT，FGF8)并在NURR1表达之前冷冻保存的D17细胞产生的移植物优于用成熟因子(D24，NURR1+/-)培养额外一周的相同细胞。处于两个成熟阶段的细胞以相似的数目移植并成熟成mDA神经元，这表明性能差异不仅仅是由于增殖潜能的差异；不希望受任何理论的束缚，这可能是由于神经支配、A9模式和/或体内接收的其他早期mDA成熟信号的差异引起。可将移植细胞的单细胞测序用于进一步分析包含在移植物中的其他非多巴胺能细胞。重要的是，观察到D17细胞已经被充分模式化，并且在移植之前不需要暴露于成熟因子来“锁定(lock in)”mDA模式化或防止不期望的(例如，血清素能)细胞类型的增殖。
不希望受任何理论的束缚，以上呈现的数据支持以下观点：如果mDA神经元或前体细胞在移植至纹状体时过于成熟，则它们通常存活地不太好，并且具有不太显著的行为作用。以上研究还表明，D17祖细胞的相对小的移植物可产生足以在半侧帕金森病大鼠引起行为恢复的多巴胺能神经支配。这些数据支持这样的观点：可以在每个患者的纹状体中在少量位置注射相对较小总数目的细胞，这可以导致PD的治疗，并且这些数据还表明可以观察到良好的临床安全性。
正在临床试验中测试的一些其他mDA祖细胞已来源于ESC(NCT04802733)(Piao etal.,2021)或iPSC(JMA-IIA00384，UMIN000033564)(Doi et al.,2020)。以上数据表明，可将本文中提供的mDA前体细胞(例如，D17细胞)施用于患者以治疗PD。如果期望的话，mDA前体细胞可与免疫抑制药物或方案和/或多巴胺替代治疗(如果期望的话)组合施用。在一些实施方案中，在施用mDA前体细胞之后，不向患者施用多巴胺替代治疗。预期本文中提供的mDA前体细胞(例如D17细胞)在施用于所选择PD患者时，其在仔细选择的PD患者组中使用多巴胺细胞替代治疗能够获得显著的临床益处。
实施例20
脱靶细胞类型的水平
中脑DA祖细胞分化期间的不正确模式化可产生危险的脱靶细胞类型，例如具有前脑(头侧)表型的神经祖细胞和血清素能细胞。前脑型细胞可以是值得特别关注的，因为先前的DA神经元分化方案通常包括具有头侧(FOXG1+)和/或外侧(lateral)(PAX6+)细胞类型的神经祖细胞，所述细胞类型可以在体内形成花式结构(rosette structure)，产生神经外生长，据观察，所述外生长在植入之后持续数月(Kriks et al.,2011)。因此，对培养物进行脱靶或非多巴胺能细胞类型的测试。
FCDI DAPC-1(第17天DA祖细胞)细胞如实施例1中所述进行分化和冷冻保存(表2)。在流式细胞术或qPCR分析第17天祖细胞之前，将细胞解冻并用DPBS洗涤(解冻后第0天，0DPT)。或者，将细胞解冻并在DA成熟培养基(表1)中培养，以用于在以后的时间点(解冻后7至20天，7-20DPT)分析细胞，以评估在更成熟的细胞中所表达标志物的表达。
使用流式细胞术测定来监测在解冻时FOXG1和PAX6的表达。对6个代表性的工程化批次进行FOXG1和PAX6流式细胞术测定，每个批次单独地解冻一次或两次(总共n＝9)。平均而言，FCDI DAPC-1在解冻时是具有0.1％标准偏差(SD)的0.1％ FOXG1+，和具有0.7％ SD的0.4％PAX6+，这确定了FCDI DAPC-1缺乏这些脱靶细胞类型的标志物表达(图32)。基于流式细胞术测定由潜在危险细胞表达的非靶标细胞标志物FOXG1+和PAX6+，细胞培养物包含非常低百分比的这样的前脑神经元祖细胞。结果在下表5中示出。
表5
大量移植物中包含血清素能细胞可能具有潜在的危险，并且可导致移植物诱导的运动障碍(Carlsson et al.,2009)。血清素能细胞的明确标志物包括血清素(5-HT)和色氨酸羟化酶-2(TPH2)(其是5-HT合成中的限速酶)，和5-HT转运蛋白(SERT)。由于这些标志物仅在成熟细胞中表达，因此解冻后(0DPT)没有立即对FCDI DAPC-1进行测定。血清素能细胞祖细胞没有已知的明确标志物。为了确定可以检出血清素能细胞的最早时间点，使用qPCR和免疫组织化学(immunohistochemistry，ICC)在0DPT(解冻后零天)、7DPT、14DPT和19-20DPT评价FCDI DAPC-1。作为通过qPCR测定的血清素能标志物表达的阳性对照，来自人脑桥(Pons)(含有血清素能细胞的脑区域)的总RNA样品包括在内。
与脑桥相比，在培养物中在0DPT和整个成熟过程二者中，观察到SERT和TPH2的表达水平在FCDI DAPC-1中较低(图33)。结果在下表6中示出。SERT表达在0DPT与7DPT之间显著提高，并随后在14DPT之后显著降低。TPH2显示出表达从0DPT至19DPT逐渐提高。对于这两种标志物，在7DPT或14DPT观察到峰表达，并且在14DPT的表达在不同的DAPC-1批次中是一致的(图34)。结果在以下表7中示出。
表6
表7
作为标记的低于0.001的Log2归一化的表达值被认为是非常低的表达，并且低于0.0001的值被认为是低于检测值。这些结果表明FCDI DAPC-1培养物中的细胞以非常低的水平表达血清素能标志物SERT和TPH2，如使用qPCR所示的。
为了确定血清素能细胞的百分比，我们在解冻后培养时间过程中对细胞进行5-HT的ICC染色(图35)。结果在下表8中示出。在解冻之后1天(1DPT)基本上没有观察到5-HT+细胞。在8DPT、15DPT和20DPT观察到显著的5-HT+细胞群。使用高内涵成像软件(MolecularDevices ImageXpress)的定量显示，血清素能神经元的百分比为约0.2％(0DPT)、3.4％(8DPT)、2.1％(15DPT)和5.6％(20DPT)。该数据表明，DAPC-1包含约5％的血清素能神经元祖细胞，其可以在8DPT作为成熟(有丝分裂后)血清素能神经元显现。该百分比不随时间推移而提高。
表8
实施例21
材料和方法
在实施例13至20中使用了以下材料和方法。
统计学分析：在SAS(给药研究中的体视学和行为学结局)或Prism(9.1.2版本，GraphPad)中进行统计学分析。在Prism中绘制图表。除了通过Kruskal-Wallis检验和Dwass,Steel,Critchlow-Fligner事后方法来分析的hKi-67之外，采用单因素方差分析与Tukey检验事后检验来分析来自免疫组织化学分析的数据。通过混合效应方差分析和Tukey检验事后检验来分析行为数据。除hKi-67(中位数±IQR)外，组织学数据均表示为平均值±SD。报道了每只动物的作为hNuclei-ir细胞的比例的TH--ir或hKi-67-ir细胞的中位数百分比。旋转作为平均值±SEM报道。
细胞分化：使用G418神经元(iCell DopaNeurons，Fujifilm Cellular Dynamics，Inc.)的研究如先前所述(Hiller et al.,2020；Wakeman et al.,2017)，利用经改造iPSC系以允许在分化过程期间对神经元的G418药物选择，并在过程第38天对神经元进行冷冻保存。对于临床开发，选择使用适合于细胞治疗开发的程序和试剂进行重编程的非改造iPSC细胞系，并在cGMP制备设施(Waisman Biomanufacturing,Madison,WI)中将其扩增成主细胞库(master cell bank，MCB)和工作细胞库(working cell bank，WCB)。针对该iPSC系来调整iPSC-mDA分化方案，包括SMAD信号传导抑制(LDN-193189，Reprocell)的简化，并在一天之后将GSK-3抑制(CHIR99021，Reprocell)转移到过程第2天，针对该时间调整了较高的浓度。将原材料升级以适合于临床开发，包括使用GMP级Shh C25II、BDNF、GDNF和TGFβ3(Bio-techne)。如前所述(Hiller et al.,2020)，使用丝裂霉素C(Tocris，150ng/mL，在过程第27和29天)在过程中纯化D37神经元，并在过程第37天用CryoStor(BiolifeSolutions)冷冻保存。除了祖细胞聚集体用CTS TrypLE Select酶(Thermo)解离并在过程第17天冷冻保存，不暴露于成熟培养基(Kriks et al.,2011)或丝裂霉素C处理之外，使用相同的分化过程制备D17祖细胞。D24未成熟神经元在过程后期(过程第24天)冷冻保存，这在成熟培养基中平板接种一周(但无丝裂霉素C处理)之后进行。用于比较iPSC DA成熟阶段的细胞在研究实验室中使用适于临床转化的制备方法来产生。用于剂量范围研究的D17细胞是在受控的、未分类的洁净实验室中使用相同方法制备。
qPCR：将细胞解冻并用包含1:100β-巯基乙醇的缓冲液RLT Plus(Qiagen)进行裂解。使用RNeasy Plus试剂盒(Qiagen)提取总RNA。使用具有500ng RNA输入的高容量RNA-to-cDNA试剂盒(ThermoFisher)产生cDNA。使用TaqMan基因表达主混合物(ThermoFisher)、TaqMan测定(参见表5的测定列表)和2.5ng cDNA输入，在LightCycler480(Roche)上进行定量聚合酶链式反应(qPCR)。值相对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)表示。对于每个时间点，以技术性一式三份的方式分析三次生物学重复。
流式细胞术：如前所述解冻细胞(Wakeman et al.,2017)。将细胞离心并用GhostDye510(Tonbo Biosciences)染色，用4％甲醛固定，并用洗涤缓冲液(DPBS中2％FBS)洗涤。在4℃下，用1×BD Perm/Wash(BD Biosciences)+0.2％ Triton X-100(除了Map2染色之外，其不含Triton X-100)中的一抗对细胞进行染色(参见表6中的抗体和稀释度列表)，并在室温下用二抗(在适用的情况下)进行标记。在分析仪10流式细胞仪(Miltenyi Biotec)上进行流式细胞术。对于每个成熟时间点，分析三次生物学重复。
免疫细胞化学：将细胞解冻，以170,000个细胞/孔接种至96孔板，过夜培养，并用4％甲醛固定。将细胞在4℃下用染色缓冲液(DPBS中的2％FBS、2％驴血清、0.2％Triton X-100)中的一抗进行染色(参见表6中的抗体和稀释度列表)，并在室温下用二抗(在适用的情况下)和Hoechst(ThermoFisher)进行标记。在ImageXpress高内涵成像仪(MolecularDevices)上以10×放大率来分析细胞。每个时间点分析三次生物学重复。
动物程序：所有动物程序均在拉什大学医学中心的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准下进行。
损伤诱导和移植：使雌性无胸腺裸(rnu)大鼠在接受之后适应一周。在9至10周龄时，(170至200g)大鼠接受6-OHDA(3μL 0.5％抗坏血酸中的15mg)的单侧注射至右MFB(前/后[AP]：-4.0mm；内侧/外侧(Medial/Lateral)[ML]：距前囟点-1.3mm，背侧/腹侧[DV]：距硬膜-7.0mm)。使在损伤之后10周证实具有损伤的动物接受纹状体(AP：+0.5mm；ML：距前囟点±3.0mm，DV：距硬膜-5.3mm)iPSC-mDA细胞的注射(n＝8至11/组)，并在移植之后3或6个月处死。将冷冻保存的细胞解冻，并通过台盼蓝排除法计数细胞。将细胞离心并以用于注射的适当的密度重悬。将黑质内移植物置于AP：+0.5mm；ML：距前囟点-3.0mm，DV：距硬膜-5.0mm。在所有实验中，注射体积为3μL。将150,000个细胞/μL的浓度用于细胞成熟度比较和黑质内实验，并且将2,500、10,000、30,000或150,000个细胞/μL、用于剂量范围实验。
d-苯丙胺诱导的旋转：动物接受腹膜内注射的d-苯丙胺(2.5mg/kg，Sigma)、置于半透明室中的挽具(harness)中，并连接至旋转计系统(San Diego Instruments)。报道了在d-苯丙胺施用之后10至40分钟时期的净同侧(顺时针)旋转。
组织处理：如前所述处理组织并进行免疫组织学和体视学分析(Hiller et al.,2020)。简言之，用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉大鼠，并用生理盐水随后用4％多聚甲醛灌注。将脑取出，置于蔗糖梯度中，并在滑动切片机上以40μM进行切片。使用表6中列出的用于免疫荧光三重标记或DAB处理的抗体浓度对自由浮动的切片进行染色。将切片封固在玻璃明胶(glass gelatin)涂覆的载片上、盖片、并成像。
体视学：通过无偏体视学(StereoInvestigator v10.40，MBF biosciences)分析盖玻片。对于细胞成熟度的比较实验，在经染色组织的半系列(1/12系列切片)中针对TH、hNuclei或hKi-67探测总移植物面积的5.22％。对于剂量范围实验，在经染色组织的半系列(1/12系列切片)中探测了5.22％的TH-ir和hNuclei-ir移植物、28.4％的hKi-67-ir移植物或20.3％的5-HT-ir移植物。对于具有Gundersen m＝1误差系数≥0.45，或者在hNuclei或TH染色切片中未计数细胞的低剂量或中剂量组中的动物，使用相同的参数对另外的半系列(1/12系列切片)进行染色和重新探测。然后计算整个系列(1/6系列切片)的估计值，并对结果取平均值。
光密度：对每只动物的针对TH染色的7个(移植物的中心±3)冠状切片的灰度图像进行分析。在每一个切片中，在纹状体周围勾勒出轮廓，不包括移植物主体，并使用ImageJ记录该面积的平均像素强度。对每只动物的值取平均值，并对数据进行重新调节，将去神经支配纹状体的最小点视为0，并将完整纹状体的最大点视为1。对细胞成熟度比较和剂量范围实验的数据集分别重新调节。
mDA亚型定量：对来自4只MFD动物的移植物切片进行TH/GIRK2/钙结合蛋白染色，并使用NIS Elements AR软件(5.10.01版本)通过具有Nikon A1RHD照相机的NikonEclipse Ti2共焦显微镜进行成像，并将其储存为.GIFf文件。使用ImageJ(1.53a版本)从z堆叠(z-stack)中量化每个移植物中53至80个细胞中的标志物。
对来自0至19DPT的血清素能细胞群的qPCR测定：在解冻时对6个FCDI DAPC-1批次和培养7、14或19DPT进行SERT和TPH2的RT-QPCR测定。每个阴影表示各自时间点的不同批次。脑桥是阳性对照脑区。表中示出了6个批次中每个测定的平均ΔCq(Cq测定–CqGAPDH)和标准偏差。
***
根据本公开内容，本文中公开和要求保护的所有方法无需过度实验即可进行和实施。虽然本发明的组合物和方法已根据一些优选实施方案进行了描述，但是对于本领域技术人员来说将明显的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可将变化应用于本文中所述的方法和方法的步骤中或步骤顺序中。更具体地，将明显的是，可以用某些在化学和生理学二者均相关的试剂替代本文中所述的试剂，同时实现相同或类似的结果。所有这样的对本领域技术人员而言明显的类似替代和修改均被认为在所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念之内。
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Claims (209)

1.培养物，其包含中脑多巴胺能(mDA)神经元前体细胞，所述中脑多巴胺能(mDA)神经元前体细胞通过在以下信号传导调节剂的存在下培养人多能细胞而产生：
(a)小母亲抗去脑瘫(SMAD)信号传导的第一抑制剂，
(b)音猬因子(SHH)信号传导的至少一种激活剂，和
(c)wingless(Wnt)信号传导的至少一种激活剂；
其中该方法不包括在小母亲抗去脑瘫(SMAD)信号传导的第二抑制剂的存在下培养所述人多能细胞；
并且其中所述人多能细胞在诱导分化的条件下培养约360至约456个小时，并随后冷藏或冷冻保存所述细胞；并且
其中所述中脑多巴胺能前体细胞表达叉头框蛋白A2(FOXA2)和LIM同源框转录因子1(LMX1)二者(FOXA2+/LMX1+细胞)。
2.权利要求1所述的培养物，其中所述人多能细胞在诱导分化的条件下培养约384至约432个小时。
3.权利要求1所述的培养物，其中所述mDA神经元前体细胞不表达NURR1。
4.权利要求1至2中任一项所述的培养物，其中所述mDA神经元前体细胞表达叉头框蛋白A2(FOXA2)、LIM同源框转录因子1(LMX1)和EN1。
5.权利要求4所述的培养物，其中所述mDA神经元前体细胞还表达OTX2。
6.权利要求1至5中任一项所述的培养物，其中约60％至约100％或约85％至约95％或更多的所述mDA神经元前体细胞共表达叉头框蛋白A2(FOXA2)和LIM同源框转录因子1(LMX1)。
7.权利要求6所述的培养物，其中约65％至75％的所述mDA神经元前体共表达FOXA2和LMX1二者。
8.权利要求1至7中任一项所述的培养物，其中所述中脑多巴胺能前体细胞表达FOXA2、LMX1A、ETV5和EN1；并且其中所述中脑多巴胺能前体细胞不表达NURR1、TH、CALB1、BARHL1或GRIK2。
9.权利要求1至8中任一项所述的培养物，其中所述mDA神经元前体细胞包含增殖细胞或分裂细胞。
10.权利要求9所述的培养物，其中至少约40％或更多的所述mDA神经元前体细胞正在增殖或正在分裂。
11.权利要求10所述的培养物，其中约50％至75％的所述mDA神经元前体细胞正在增殖或正在分裂。
12.权利要求1至9中任一项所述的培养物，其中所述培养物还包含约5％或更少的血清素能神经元前体细胞。
13.权利要求12所述的培养物，其中所述血清素能神经元前体细胞表达BARLH1。
14.权利要求1至12中任一项所述的培养物，其中所述培养物还包含胶质祖细胞。
15.权利要求14所述的培养物，其中所述胶质祖细胞表达GLAST、SLC13A、CD44和/或hGFAP。
16.权利要求1至8中任一项所述的培养物，其中SMAD信号传导的所述抑制剂是BMP抑制剂。
17.权利要求16所述的培养物，其中所述BMP抑制剂是LDN-193189、多索吗啡、DMH-1、或头蛋白。
18.权利要求17所述的培养物，其中所述BMP抑制剂是LDN-193189。
19.权利要求18所述的培养物，其中所述LDN-193189以约0.2μM至约4μM的浓度存在，更优选以约1μM至约4μM的浓度存在。
20.权利要求19所述的培养物，其中所述LDN-193189以约1μM至约3μM的浓度存在。
21.权利要求19所述的培养物，其中所述LDN-193189以约0.5μM至约4μM的浓度存在。
22.权利要求21所述的培养物，其中所述LDN-193189以约0.5μM至约2μM的浓度存在。
23.权利要求19所述的培养物，其中所述LDN-193189以约0.2μM至约4μM的浓度存在。
24.权利要求23所述的培养物，其中所述LDN-193189以约0.2μM至约2μM的浓度存在。
25.权利要求1至8中任一项所述的培养物，其中所述SMAD信号传导抑制剂是TGFβ抑制剂。
26.权利要求25所述的培养物，其中所述TGFβ抑制剂是SB431542。
27.权利要求26所述的培养物，其中所述SB431542以约1μM至20μM的浓度存在。
28.权利要求26所述的培养物，其中所述SB431542以约5μM至15μM的浓度存在。
29.权利要求26所述的培养物，其中所述SB431542以约10μM的浓度存在。
30.权利要求1至29中任一项所述的培养物，其中所述多能细胞在培养的第1至15天、第1至16天或第1至17天与所述SMAD抑制剂一起培养。
31.权利要求30所述的培养物，其中所述多能细胞在培养的第1至17天与所述SMAD抑制剂一起培养。
32.权利要求1至31中任一项所述的培养物，其中所述多能细胞与所述SMAD抑制剂基本上连续地或每天一起培养，持续15、16或17天。
33.权利要求32所述的培养物，其中所述多能细胞与所述SMAD抑制剂基本上连续地或每天一起培养，持续17天。
34.权利要求1至33中任一项所述的培养物，其中所述SMAD抑制剂以约50nM至2000nM或50nM至500nM的浓度存在。
35.权利要求34所述的培养物，其中所述SMAD抑制剂以约180nM至240nM的浓度存在。
36.权利要求1至35中任一项所述的培养物，其中该方法还包括使所述多能细胞与MEK抑制剂接触。
37.权利要求36所述的培养物，其中所述MEK抑制剂是PD0325901。
38.权利要求37所述的培养物，其中所述PD0325901以约0.25μM至2.5μM的浓度存在。
39.权利要求35至38中任一项所述的培养物，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后，使所述MEK抑制剂与所述多能细胞接触约1至3天，或者在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后第1至3天、第2至4天、第3至5天、或第1、2、3、4或第5天，使所述MEK抑制剂与所述多能细胞接触。
40.权利要求39所述的培养物，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后约24至约48小时，使所述MEK抑制剂与所述多能细胞接触。
41.权利要求36至40中任一项所述的培养物，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后约1至2天开始，使所述MEK抑制剂与所述多能细胞每天或基本上连续地接触，持续约3至4天。
42.权利要求41所述的培养物，其中在第1天开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后第2至5天或第3至6天，使所述MEK抑制剂与所述多能细胞接触。
43.权利要求1至40中任一项所述的培养物，其中所述Wnt信号传导的激活剂是GSK3抑制剂。
44.权利要求43所述的培养物，其中所述GSK3抑制剂是CHIR99021。
45.权利要求44所述的培养物，其中所述CHIR99021以约1.5μM至2μM的浓度存在。
46.权利要求44所述的培养物，其中所述CHIR99021以约1.5μM至1.7μM的浓度存在。
47.权利要求45所述的培养物，其中所述CHIR99021以约1.6μM至1.7μM的浓度存在。
48.权利要求45所述的培养物，其中所述CHIR99021以约1.65μM的浓度存在。
49.权利要求44所述的培养物，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后第9至17天，所述CHIR99021以约4μM至7μM的浓度存在。
50.权利要求1至49中任一项所述的培养物，其中在开始与所述SMAD的信号传导抑制剂接触之后1至3天，使所述Wnt信号传导的激活剂与所述多能细胞接触。
51.权利要求50所述的培养物，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后24至48小时内，使所述Wnt信号传导的激活剂与所述多能细胞接触。
52.权利要求1至51中任一项所述的培养物，其中所述多能细胞与所述Wnt信号传导的激活剂基本上连续地或每天一起培养，持续14、15、或约16天。
53.权利要求1至52中任一项所述的培养物，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后第2至17天，使所述Wnt信号传导的激活剂与所述多能细胞接触。
54.权利要求1至52中任一项所述的培养物，其中所述SHH信号传导的激活剂是嘌呤胺或C25II Shh。
55.权利要求54所述的培养物，其中该方法还包括使所述多能细胞与SHH信号传导的两种激活剂接触。
56.权利要求55所述的培养物，其中所述SHH信号传导的两种激活剂是嘌呤胺和C25IIShh。
57.权利要求1至56中任一项所述的培养物，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触的同一天或者在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后24至48小时内，使所述SHH信号传导的至少一种激活剂与所述多能细胞接触。
58.权利要求57所述的培养物，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触的第1至7天或者在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后第1至7天，使所述SHH信号传导的至少一种激活剂与所述多能细胞接触。
59.权利要求1至58中任一项所述的培养物，其中该方法还包括使所述多能细胞与FGF-8接触。
60.权利要求59所述的培养物，其中不在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触的同一天使所述FGF-8与所述多能细胞接触。
61.权利要求59至60中任一项所述的培养物，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后第9至17天或第11至17天，使所述FGF-8与所述多能细胞接触。
62.权利要求59至61中任一项所述的培养物，其中所述FGF-8以约50ng/mL至200ng/mL的浓度存在。
63.权利要求1至62中任一项所述的培养物，其中所述多能细胞包含在神经元启动子控制下的抗生素抗性转基因。
64.权利要求1至63中任一项所述的培养物，其中所述方法还包括通过使所述多能细胞与抗生素、化学治疗剂、DNA交联剂、DNA合成抑制剂或有丝分裂抑制剂接触来选择来源于所述细胞的神经细胞或中脑DA神经元。
65.权利要求1至63中任一项所述的培养物，其中该方法还包括使所述多能细胞与抗生素或化学治疗剂接触。
66.权利要求64至65中任一项所述的培养物，其中所述化学治疗剂是丝裂霉素C。
67.权利要求66所述的培养物，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后第27、28、29和/或30天，使所述丝裂霉素C与所述多能细胞接触。
68.权利要求64至65中任一项所述的培养物，其中所述抗生素是G418(遗传霉素)。
69.权利要求1至68中任一项所述的培养物，其中该方法还包括在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之前，在包含ROCK抑制剂的培养基中培养或孵育所述多能细胞。
70.权利要求1至69中任一项所述的培养物，其中该方法还包括使所述多能细胞与blebbistatin接触。
71.权利要求1至70中任一项所述的培养物，其中所述blebbistatin在分化的第5天和第17天与所述细胞接触。
72.权利要求1至71中任一项所述的培养物，其中所述mDA多巴胺能前体细胞不表达NURR1、MAP2或TH。
73.权利要求1至72中任一项所述的培养物，其中所述mDA多巴胺能前体细胞表达EN1。
74.权利要求1至72中任一项所述的培养物，其中所述mDA多巴胺能前体细胞表达GBX2、OTX1、OTX2、ETV5、CORIN、和/或DCX。
75.权利要求1至73中任一项所述的培养物，其中所述多能细胞是人诱导多能干(iPS)细胞。
76.权利要求1至75中任一项所述的培养物，其中所述LMX1是LIM同源框转录因子1α(LMX1A)。
77.权利要求1至76中任一项所述的培养物，其中该方法还包括在DNA酶或内切核酸酶的存在下孵育所述人多能细胞。
78.权利要求77所述的培养物，其中所述内切核酸酶是DNA酶I或
79.权利要求78所述的培养物，其中所述DNA酶I或以约10U/mL至20U/mL的浓度存在。
80.权利要求79所述的培养物，其中所述DNA酶I或以约10U/mL至15U/mL的浓度存在。
81.权利要求77至79中任一项所述的培养物，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后第4至6天中的至少一者，在内切核酸酶的存在下培养所述人多能细胞。
82.权利要求77至79中任一项所述的培养物，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后第5天，在内切核酸酶的存在下培养所述人多能细胞。
83.权利要求1至82中任一项所述的培养物，其中所述培养物包含在容器装置中。
84.权利要求1至83中任一项所述的培养物，其中所述中脑多巴胺能神经元前体细胞包含在药物制剂中。
85.权利要求5所述的培养物，其中所述药物制剂被配制成用于注射。
86.权利要求1至85中任一项所述的培养物，其中所述培养物包含约2,500个细胞/μL至约150,000个细胞/μL、约2,500个细胞/μL至约100,000个细胞/μL、约10,000个细胞/μL至约150,000个细胞/μL、约40,000个细胞/μL至约100,000个细胞/μL、或约15,000至45,000个细胞/μL的中脑多巴胺能神经元前体细胞。
87.权利要求1至86中任一项所述的培养物，其中所述培养物中约10％或更少、更优选约7％或更少的细胞是血清素能前体细胞。
88.权利要求87所述的培养物，其中所述培养物中约5％或更少的细胞是血清素能前体细胞。
89.权利要求87所述的培养物，其中所述培养物中约5％或更少的细胞表达SERT和TPH2。
90.权利要求1至89中任一项所述的培养物，其中所述培养物中约0.1％至5％或更少的细胞表达FOXG1，和/或其中所述培养物中约0.1％至5％或更少的细胞表达PAX6。
91.权利要求90所述的培养物，其中所述培养物中少于约1％的细胞表达FOXG1，和/或其中所述培养物中少于约1％的细胞表达PAX6。
92.在哺乳动物对象中治疗疾病的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的权利要求1至91中任一项所述的培养物，优选地其中向所述对象的脑施用所述培养物。
93.权利要求92所述的方法，其中所述哺乳动物对象是人。
94.权利要求93所述的方法，其中所述疾病是中枢神经系统(CNS)的疾病。
95.权利要求94所述的方法，其中所述疾病是帕金森病(PD)或帕金森叠加综合征(PPS)。
96.权利要求92至95中任一项所述的方法，其中所述培养物包含表达锯齿状蛋白但不表达NURR1的mDA前体细胞。
97.权利要求96中任一项所述的方法，其中向所述对象的纹状体，例如壳核或黑质施用所述培养物。
98.权利要求97所述的方法，其中向所述对象的纹状体或壳核中的多于一个位置施用所述培养物。
99.权利要求97所述的方法，其中向所述对象的纹状体或壳核中多个部位处和/或多个针道处施用所述培养物。
100.权利要求96所述的方法，其中所述培养物包含在药物组合物中。
101.权利要求100所述的方法，其包括透明质酸基质。
102.权利要求92至101中任一项所述的方法，其中所述培养物包含约1e6至约25e6，更优选约3e6至约9e6个细胞。
103.权利要求92至102中任一项所述的方法，其中所述培养物包含约2,500个细胞/μL至约150,000个细胞/μL。
104.权利要求103所述的方法，其中所述培养物包含约10,000个细胞/μL至约150,000个细胞/μL。
105.权利要求103所述的方法，其中所述培养物包含约40,000个细胞/μL至约100,000个细胞/μL。
106.权利要求92至105中任一项所述的方法，其中所述对象患有帕金森病，并且其中所述对象在施用所述培养物之后表现出至少一种运动症状的改善。
107.权利要求106所述的方法，其中所述对象表现出以下中一者或更多者的减轻：震颤、肌僵硬、运动缓慢、跌倒、头晕、运动冻结、肌痉挛或肌张力障碍。
108.权利要求92至107中任一项所述的方法，其中所述中脑多巴胺能前体细胞至少部分地重新神经支配所述对象的纹状体或壳核。
109.权利要求92至108中任一项所述的方法，其中所述中脑多巴胺能前体细胞在所述施用之后表现出有限的增殖。
110.权利要求92至109中任一项所述的方法，其中该细胞培养物中约5％或更少的细胞是血清素能细胞或血清素能前体细胞。
111.权利要求92至110中任一项所述的方法，其中至少80％的所施用细胞分化成表达FOXA2和LMX1二者的分化细胞。
112.权利要求111所述的方法，其中至少85％的所述分化细胞表达FOXA2和LMX1二者。
113.权利要求92至112中任一项所述的方法，其中至少约60％的所施用细胞表达FOXA2和LMX1二者。
114.权利要求92至113中任一项所述的方法，其中所述培养物在所述施用之前低温冷冻。
115.权利要求114所述的方法，其中所述培养物在所述施用之前在液氮中低温冷冻。
116.权利要求111中任一项所述的方法，其中表达FOXA2和LMX1的所述分化细胞还表达至少一种选自以下中的标志物：锯齿状蛋白(EN1)、酪氨酸激酶(TH)、orthodenticle同源框2(OTX2)、核受体相关1蛋白(NURR1)、神经元特异性III类β微管蛋白(Tuj1)、TTF3、成对样同源结构域3(PITX3)、achaete-scute复合物(ASCL)、早期B细胞因子1(EBF-1)、早期B细胞因子3(EBF-3)、甲状腺素转运蛋白(TTR)、突触蛋白、多巴胺转运蛋白(DAT)和G蛋白偶联的内向整流钾通道(Kir3.2/GIRK2)、CD142、DCSM1、CD63和CD99。
117.权利要求116所述的方法，其中表达FOXA2和LMX1或者FOXA2和TH的所述分化细胞还表达锯齿状蛋白、PITX3和NURR1。
118.权利要求111至116中任一项所述的方法，其中该细胞培养物中约10％至25％的细胞共表达FOXA2和酪氨酸羟化酶(TH)。
119.权利要求92至118中任一项所述的方法，其中所述多能细胞是人诱导多能干(iPS)细胞。
120.权利要求92至119中任一项所述的方法，其中所述LMX1是LIM同源框转录因子1α(LMX1A)。
121.权利要求92至120中任一项所述的方法，其中该细胞组合物中少于约1％、优选少于0.5％的细胞是血清素能细胞。
122.权利要求92至121中任一项所述的方法，其中所述施用不导致宿主胶质增生。
123.权利要求92至122中任一项所述的方法，其中所述施用不导致或基本上不导致所述对象的脑中非神经元细胞的生长或增殖。
124.权利要求92至123中任一项所述的方法，其中所述施用导致所述mDA前体细胞植入在所述对象的脑中和/或所述mDA前体细胞对所述对象的至少一部分脑的神经支配。
125.权利要求92至124中任一项所述的方法，其中所述施用通过注射进行。
126.权利要求125所述的方法，其中所述注射是立体定向注射。
127.用于制备包含表达叉头框蛋白A2(FOXA2)和LIM同源框转录因子1(LMX1)二者的人细胞(FOXA2+/LMX1+细胞)的细胞组合物的体外方法，其包括在以下信号传导调节剂的存在下培养人多能细胞：
(a)小母亲抗去脑瘫(SMAD)信号传导的第一抑制剂，
(b)音猬因子(SHH)信号传导的至少一种激活剂，和
(c)wingless(Wnt)信号传导的至少一种激活剂；
其中所述方法不包括在小母亲抗去脑瘫(SMAD)信号传导的第二抑制剂的存在下培养所述人多能细胞；
并且其中所述人多能细胞在诱导分化的条件下培养约360至约456个小时，并随后冷藏或冷冻保存所述细胞。
128.权利要求127所述的方法，其中所述人多能细胞在诱导分化的条件下培养约384至约432个小时。
129.权利要求127所述的方法，其中所述人细胞不表达NURR1。
130.权利要求127至128中任一项所述的方法，其中所述人细胞表达叉头框蛋白A2(FOXA2)、LIM同源框转录因子1(LMX1)和锯齿状蛋白同源框1(EN1)。
131.权利要求130所述的方法，其中所述人细胞还表达OTX2。
132.权利要求127至130中任一项所述的方法，其中约65％至约85％或更多的所述人细胞共表达叉头框蛋白A2(FOXA2)和LIM同源框转录因子1(LMX1)。
133.权利要求127至132中任一项所述的方法，其中所述SMAD信号传导的抑制剂是BMP抑制剂。
134.权利要求133所述的方法，其中所述BMP抑制剂是LDN-193189、多索吗啡、DMH-1、或头蛋白。
135.权利要求134所述的方法，其中所述BMP抑制剂是LDN-193189。
136.权利要求135所述的方法，其中所述LDN-193189以约0.2μM至约4μM的浓度存在。
137.权利要求136所述的方法，其中所述LDN-193189以约1μM至约3μM的浓度存在。
138.权利要求136所述的方法，其中所述LDN-193189以约0.5μM至约4μM的浓度存在。
139.权利要求138所述的方法，其中所述LDN-193189以约0.5μM至约2μM的浓度存在。
140.权利要求136所述的方法，其中所述LDN-193189以约0.2μM至约4μM的浓度存在。
141.权利要求140所述的方法，其中所述LDN-193189以约0.2μM至约2μM的浓度存在。
142.权利要求127至132中任一项所述的方法，其中所述SMAD信号传导抑制剂是TGFβ抑制剂。
143.权利要求142所述的方法，其中所述TGFβ抑制剂是SB431542。
144.权利要求143所述的方法，其中所述SB431542以约1μM至20μM的浓度存在。
145.权利要求143所述的方法，其中所述SB431542以约5μM至15μM的浓度存在。
146.权利要求143所述的方法，其中所述SB431542以约10μM的浓度存在。
147.权利要求127至146中任一项所述的方法，其中所述多能细胞在培养的第1至15天、第1至16天或第1至17天与所述SMAD抑制剂一起培养。
148.权利要求147所述的方法，其中所述多能细胞在培养的第1至17天与所述SMAD抑制剂一起培养。
149.权利要求127至148中任一项所述的方法，其中所述多能细胞与所述SMAD抑制剂基本上连续地或每天一起培养，持续15、16或17天。
150.权利要求149所述的方法，其中所述多能细胞与所述SMAD抑制剂基本上连续地或每天一起培养，持续17天。
151.权利要求127至150中任一项所述的方法，其中所述SMAD抑制剂以约50nM至2000nM或50nM至500nM的浓度存在。
152.权利要求151所述的方法，其中所述SMAD抑制剂以约180nM至240nM的浓度存在。
153.权利要求127至152中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述多能细胞与MEK抑制剂接触。
154.权利要求153所述的方法，其中所述MEK抑制剂是PD0325901。
155.权利要求154所述的方法，其中所述PD0325901以约0.25μM至2.5μM的浓度存在。
156.权利要求152至155中任一项所述的方法，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后，使所述MEK抑制剂与所述多能细胞接触约1至3天，或者在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后第1至3天、第2至4天、第3至5天、或第1、2、3、4或第5天，使所述MEK抑制剂与所述多能细胞接触。
157.权利要求156所述的方法，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后约24至约48小时，使所述MEK抑制剂与所述多能细胞接触。
158.权利要求153至157中任一项所述的方法，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后约1至2天开始，使所述MEK抑制剂与所述多能细胞每天或基本上连续地接触，持续约3至4天。
159.权利要求158所述的方法，其中在第1天开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后第2至5天或第3至6天，使所述MEK抑制剂与所述多能细胞接触。
160.权利要求127至157中任一项所述的方法，其中所述Wnt信号传导的激活剂是GSK3抑制剂。
161.权利要求160所述的方法，其中所述GSK3抑制剂是CHIR99021。
162.权利要求161所述的方法，其中所述CHIR99021以约1.5μM至1.7μM的浓度存在。
163.权利要求162所述的方法，其中所述CHIR99021以约1.6μM至1.7μM的浓度存在。
164.权利要求162所述的方法，其中所述CHIR99021以1.65μM的浓度存在。
165.权利要求161所述的方法，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后第9至17天，所述CHIR99021以约4μM至7μM的浓度存在。
166.权利要求127至165中任一项所述的方法，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后1至3天，使所述Wnt信号传导的激活剂与所述多能细胞接触。
167.权利要求166所述的方法，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后24至48小时内，使所述Wnt信号传导的激活剂与所述多能细胞接触。
168.权利要求127至167中任一项所述的方法，其中使所述多能细胞与所述Wnt信号传导的激活剂基本上连续地或每天一起培养，持续14、15或约16天。
169.权利要求127至168中任一项所述的方法，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后第2至17天，使所述Wnt信号传导的激活剂与所述多能细胞接触。
170.权利要求127至168中任一项所述的方法，其中所述SHH信号传导的激活剂是嘌呤胺或C25II Shh。
171.权利要求170所述的方法，其中所述方法还包括使所述多能细胞与SHH信号传导的两种激活剂接触。
172.权利要求171所述的方法，其中所述SHH信号传导的两种激活剂是嘌呤胺和C25IIShh。
173.权利要求127至172中任一项所述的方法，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触的同一天或者在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后24至48小时内，使所述SHH信号传导的至少一种激活剂与所述多能细胞接触。
174.权利要求173所述的方法，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触的第1至7天或者在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后第1至7天，使所述SHH信号传导的至少一种激活剂与所述多能细胞接触。
175.权利要求127至174中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述多能细胞与FGF-8接触。
176.权利要求175所述的方法，其中不在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触的同一天使所述FGF-8与所述多能细胞接触。
177.权利要求175至176中任一项所述的方法，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后第9至17天或第11至17天，使所述FGF-8与所述多能细胞接触。
178.权利要求175至177中任一项所述的方法，其中所述FGF-8以约50ng/mL至200ng/mL的浓度存在。
179.权利要求127至178中任一项所述的方法，其中所述多能细胞包含在神经元启动子控制下的抗生素抗性转基因。
180.权利要求127至179中任一项所述的方法，其中所述方法还包括通过使所述多能细胞与抗生素、化学治疗剂、DNA交联剂、DNA合成抑制剂或有丝分裂抑制剂接触来选择来源于所述细胞的神经细胞或中脑DA神经元。
181.权利要求127至179中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述多能细胞与抗生素或化学治疗剂接触。
182.权利要求180至181中任一项所述的方法，其中所述化学治疗剂是丝裂霉素C。
183.权利要求182所述的方法，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后第27、28、28和/或29天，使所述丝裂霉素C与所述多能细胞接触。
184.权利要求180至181中任一项所述的方法，其中所述抗生素是G418(遗传霉素)。
185.权利要求127至184中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之前，在包含ROCK抑制剂的培养基中培养或孵育所述多能细胞。
186.权利要求127至185中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述多能细胞与blebbistatin接触。
187.权利要求127至186中任一项所述的方法，其中使所述blebbistatin在分化的第5天和第17天与所述细胞接触。
188.权利要求127至141或147至187中任一项所述的方法，其中至少40％的所述人多能细胞分化并表达FOXA2和LMX1二者。
189.权利要求188所述的方法，其中至少60％的所述人多能细胞分化并表达FOXA2和LMX1二者。
190.权利要求189所述的方法，其中至少80％的所述人多能细胞分化并表达FOXA2和LMX1二者。
191.权利要求189所述的方法，其中至少85％的所述人多能细胞分化并表达FOXA2和LMX1二者。
192.权利要求127至141或147至187中任一项所述的方法，其中约10％至25％的所述人多能细胞分化并表达FOXA2和酪氨酸羟化酶(TH)二者。
193.权利要求127至192中任一项所述的方法，其中所述多能细胞是人诱导多能干(iPS)细胞。
194.权利要求127至193中任一项所述的方法，其中所述LMX1是LIM同源框转录因子1α(LMX1A)。
195.权利要求188至194中任一项所述的方法，其中表达FOXA2和LMX1或者FOXA2和TH的所述分化细胞还表达至少一种选自以下中的标志物：EN1、orthodenticle同源框2(OTX2)、神经元特异性III类β微管蛋白(Tuj1)、TTF3、成对样同源结构域3(PITX3)、achaete-scute复合物(ASCL)、早期B细胞因子1(EBF-1)、早期B细胞因子3(EBF-3)、甲状腺素转运蛋白(TTR)、突触蛋白、多巴胺转运蛋白(DAT)和G蛋白偶联的内向整流钾通道(Kir3.2/GIRK2)、CD142、DCSM1、CD63和CD99。
196.权利要求127至194中任一项所述的方法，其中所述FOXA2+/LMX1+细胞还表达锯齿状蛋白(EN1)。
197.权利要求127至194中任一项所述的方法，其中所述FOXA2+/LMX1+细胞还表达EN1、Pax8和ETV5。
198.权利要求127至197中任一项所述的方法，其中所述FOXA2+/LMX1+细胞不表达NURR1。
199.权利要求197中任一项所述的方法，其中所述FOXA2+/LMX1+细胞表达GBX2、OTX1、OTX2、ETV5、CORIN和DCX。
200.权利要求127至196中任一项所述的方法，其中所述细胞组合物中5％或更少的细胞是血清素能细胞。
201.权利要求127至200中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在DNA酶或内切核酸酶的存在下孵育人多能细胞。
202.权利要求201所述的方法，其中所述内切核酸酶是DNA酶I或
203.权利要求202所述的方法，其中所述DNA酶I或以约10U/mL至20U/mL的浓度存在。
204.权利要求203所述的方法，其中所述DNA酶I或以约10U/mL至15U/mL的浓度存在。
205.权利要求201至203中任一项所述的方法，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后第4至6天中的至少一者，在内切核酸酶的存在下培养所述人多能细胞。
206.权利要求201至203中任一项所述的方法，其中在开始与所述SMAD信号传导的抑制剂接触之后第5天，在内切核酸酶的存在下培养所述人多能细胞。
207.筛选测试化合物的方法，其包括：
(a)使通过权利要求127至206中任一项所述的方法分化的FOXA2+/LMX1A+细胞或权利要求1至86中任一项所述的mDA前体细胞与所述测试化合物接触，以及
(b)测量所述细胞的功能、生理或生存力。
208.权利要求207所述的方法，其中所述测量包括测试所述细胞的毒理学响应或改变的电生理学响应。
209.权利要求207至208中任一项所述的方法，其中所述细胞是中脑多巴胺能神经元或中脑多巴胺能神经元前体细胞。
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