WO2005080554A1 - 胚性幹細胞の分化調節方法 - Google Patents

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Asuka Morizane
Jun Takahashi
Hideki Hayashi
Yoshiki Sasai
Nobuo Hashimoto
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Kyoto University
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    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for regulating the differentiation of stem cells such as embryonic stem cells, a kit for regulating the differentiation of stem cells, a method for screening a factor having an activity of inducing differentiation of stem cells, and the like.
  • Parkinson's disease is a chronic progressive disease mainly due to degeneration of the nigrostriatal dopamine neurons.
  • oral therapy mainly using L-D ⁇ PA (L-dihydroxyphenylalanine) has been performed.
  • L-D ⁇ PA L-dihydroxyphenylalanine
  • the effect gradually decreases in many patients. Becomes less susceptible to side effects such as skinnyness. Therefore, the development of more effective treatments is being sought.
  • PA6 cells are mouse-derived cells, and it is considered that the neural PA cell culture cultured in the co-presence of the cells contains components derived from mouse PA6 cells.
  • Cell transplantation using cells that have come into contact with xenogeneic cells during the culture process is considered xenotransplantation, and at present such xenotransplantation has not been recognized in clinical cell transplantation.
  • the present invention aims to develop a method for inducing differentiation of stem cells in the presence of allogeneic components in order to realize clinical application of transplantation of cells obtained by inducing differentiation of stem cells such as embryonic stem cells.
  • Another object of the present invention is to realize such differentiation induction by a more practical technique.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-described problems, and as a result, have found that culture of stem cells such as embryonic stem cells can be regulated by culture in the presence of a factor derived from meningeal cells. Was completed. That is, the present invention is as follows:
  • stem cells are embryonic stem cells
  • meningeal cells are cells derived from primitive meninges
  • meningeal cells are cells derived from the dura mater
  • both the stem cells and the meningeal cells are cells derived from the same mammalian species;
  • stem cells are embryonic stem cells
  • An agent for inducing stem cell differentiation comprising a meningeal cell and a factor derived from Z or meningeal cell;
  • kit for stem cell culture including (i) and (ii):
  • Figure 1 shows each of the embryonic stem cells cultured for 14 days in the presence of primordial meningeal cells. The colony positive rate (%) for the marker is shown.
  • the present invention provides a method for regulating the differentiation of stem cells such as embryonic stem cells, which comprises culturing stem cells such as embryonic stem cells in the presence of factors derived from meningeal cells.
  • the animals to which the present invention is applied include vertebrates, for example, mice, rats, guinea pigs, hamsters, egrets, cats, dogs, sheep, pigs, pigs, dogs, goats, monkeys And humans.
  • “Mening cells” refers to cells derived from the primordial meninges (meniges prirai ti va) or meninges (meniges). For example, primordial meninges, primary cultured cells prepared from meninges And cell lines derived from the primary cultured cells.
  • the primordial meninges are the coarse fetal mesenchymal tissues that surround the brain and spinal cord, which differentiate and eventually form meninges.
  • the meninges consist of the dura, arachnoid, and pia mater, the tissues that surround the brain and spinal cord.
  • the meningeal cells used in the present invention cells derived from autologous or allogeneic cells can be used at the time of cell transplantation, and are considered to be low in immunogenicity.
  • meningeal cells it is preferable to use cells derived from the same mammalian species as the stem cells used in the present invention.
  • Meningeal cells can be prepared by a method well-known in the art according to the method described in “Separation and culture of functional cells 3. Isolation and culture of normal cells”, Maruzen Shoten (1989), and the like. For example, first, the primordial meninges from several fetuses of a mammal or the dura from adult mammals are collected and immersed in a PBS (-) solution. Next, the collected primitive meninges or dura are mechanically dissociated, and the suspended cells are collected by centrifugation. An appropriate medium is added to the collected cells to prepare a cell suspension, and the suspension is seeded in an incubator.
  • the obtained primary cultured cells can be passaged by a method well known in the art.
  • primary cultured cells derived from meninges prepared as described above are grown to subconfluence in an appropriate medium. After subconfluence, cells are detached from the dish by trypsinization and passaged.
  • the number of passages of the primary cultured cells derived from meninges is not particularly limited as long as the differentiation of ES cells can be induced.
  • the number of passages is preferably 4 or more from the viewpoint of achieving stable differentiation induction.
  • the establishment of cell lines from primary cultured cells of meninges is well known in the art, as described in “Separation and culture of functional cells 5. Establishment and application of cell lines”, Maruzen Shoten (1989) It can be performed by the method of. Methods for establishing cell lines include treatment with viruses, chemical carcinogens, radiation, and methods of isolating cells that have acquired unrestricted growth ability from primary cultured cells. By culturing stem cells in the presence of the cell lines, it is confirmed whether or not the established cell lines have stem cell differentiation-inducing ability. As the meninges-derived cell line used in the present invention, those having the ability to induce differentiation of stem cells, preferably into neural stem cells, are used.
  • the medium used for culturing meningeal cells can be prepared using a medium used for culturing animal cells as a basal medium.
  • Basic media include BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM medium, Improved MEM Z inc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium, a MEM medium, DMEM medium, Any medium that can be used for culturing animal cells, such as a ham medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, and a mixed medium thereof, can be used.
  • any incubator can be used as long as it can culture meningeal cells, but an incubator for cell culture is preferable.
  • the cell culture incubator include a flask, a tissue culture flask, a dish, a petri dish, a tissue culture dish, a manolech dish, a microplate, a microplate, and a microplate. Plates, manole plates, manole chips, platelets, chamber slides, petri dishes, tubes, trays, culture bags, roller bottles, and the like.
  • the surface of the incubator on the side in contact with the cells can be artificially treated. Examples of artificially treating the surface of the incubator include collagen coat, gelatin coat, poly-L-lysine coat, fibronectin coat, and laminin coat. It can also be processed to have a negative charge, such as a primary door (Falcon).
  • “Stem cell” refers to a cell that has both pluripotency and self-renewal ability.
  • the stem cells are not particularly limited, but are preferably those capable of differentiating into neural cells.
  • embryonic stem cells neural stem cells (fetal brain-derived neural stem cells, adult brain-derived neural stem cells) And the like, and preferably an embryonic stem cell.
  • embryonic stem cells refers to cells that can be cultured in vitro and have a pluripotency capable of differentiating into all cells constituting a living body.
  • embryonic stem cells include (a) embryonic stem cells of mammals and the like established by culturing early embryos before implantation, specifically, inner cells constituting the early embryos Embryonic stem cells established from clumps, EG cells established from primordial germ cells, cells isolated from a pluripotent cell population of the early embryo before implantation (eg, primitive ectoderm), Alternatively, cells obtained by culturing the cells can be mentioned.
  • the embryonic stem cells in the present invention include (b) embryonic stem cells established by culturing an early embryo produced by nuclear transfer of a somatic cell nucleus, and (c) (a) Alternatively, an embryonic stem cell obtained by modifying a gene on the chromosome of the embryonic stem cell of (b) using a genetic engineering technique may be used.
  • Embryonic stem cells in (a) were obtained from the pre-implantation early embryo by the literature (Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor). Laboratory Press (1994)).
  • the nucleus After excision of the nucleus of the mammalian cell and subsequent initialization (operation to return the nucleus to a state where it can be regenerated again), the nucleus is started to develop using a method in which it is injected into an unfertilized egg of an enucleated mammal, By culturing eggs that have started to develop, eggs that have nuclei of other somatic cells and that have started normal development can be obtained.
  • a plurality of methods are known as methods for initializing the nucleus of somatic cells.
  • the following method is known.
  • the culture medium for culturing the cells providing the nucleus is preferably 3 to 10 days from a medium containing 5 to 30%, preferably 10% fetal calf serum (eg, M2 medium). Induces the cell cycle to a quiescent state (GO phase or G1 phase) by changing the culture to an oligotrophic medium containing 0 to 1%, preferably 0.5% fetal calf serum for 5 days Can be initialized.
  • a quiescent state GO phase or G1 phase
  • fetal calf serum eg, M2 medium
  • oligotrophic medium containing 0 to 1%, preferably 0.5% fetal calf serum for 5 days
  • This method is suitable when the mammal is, for example, a sheep, a goat, or a sea lion.
  • the cells can be initialized by injecting nuclei of cells that provide nuclei into enucleated unfertilized eggs of a mammal of the same species and culturing them for several hours, preferably for about 1 to 6 hours. This method is suitable when the mammal is, for example, a mouse.
  • the reprogrammed nuclei can begin to develop in enucleated unfertilized eggs. Several methods are known for initiating development of reprogrammed nuclei in enucleated unfertilized eggs.
  • the nucleus is induced by inducing the cell cycle to the quiescent state (GO phase or G1 phase) and transplanted into an enucleated unfertilized egg of the same mammal by electrofusion, etc. to activate the egg and generate Can be started.
  • This method is suitable when the mammal is, for example, a sheep, a goat, or a sea lion.
  • the nuclei initialized by injecting nuclei into enucleated unfertilized eggs of the same mammal are transplanted again to enucleated non-fertilized eggs of the same mammal by a method using a micromanipulator, etc.
  • a cell-forming substance eg, strontium
  • a cell division inhibitor eg, cytochalasin B
  • Embryonic stem cells can be obtained using the known methods described in, for example, Kuomani Yuanore Series 8 Gene Targeting, Generation of Mutant Mice Using ES Cells, Yodosha (1995) and the like.
  • the embryonic stem cell (c) can be produced, for example, by using homologous recombination technology.
  • the gene on the chromosome to be modified includes a gene for a histocompatibility antigen, a disease-related gene based on damage to nervous system cells, and the like.
  • Modification of the target gene on the chromosome can be performed by anipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Noyo Mayu Yuanore Series 8 Gene Targeting, Generation of Mutant Mice Using ES Cells, Yodosha (1995), etc.
  • the method can be performed using the method described in (1).
  • a genomic gene of a target gene to be modified eg, a histocompatibility antigen gene or a disease-related gene
  • a target vector is prepared.
  • the target vector thus prepared is introduced into embryonic stem cells, and cells that have undergone homologous recombination between the target gene and the target vector are selected to produce embryonic stem cells with modified genes on the chromosome can do.
  • genomic gene of the target gene can be isolated by using a genome DNA library screening system (Genome Systems), Universal GenoraeWalker TM Kits (CL0NTECH), or the like. Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Production of Target Better for Homologous Recombination of Target Genes, and Efficient Selection of Homologous Recombinants.
  • the target vector can be used in either a replacement type or an insulation type.
  • a selection method a method such as positive selection, motor selection, negative selection, poly A selection, etc. is used. be able to.
  • Examples of a method for selecting a desired homologous recombinant from the selected cell lines include a Southern hybridization method and a PCR method for genomic DNA.
  • Embryonic stem cells can be obtained from a predetermined institution, or a commercially available product can be purchased.
  • human embryonic stem cells, KhES-1, KhES-2 and KhES-3 are available from the Kyoto University Institute for Regenerative Medicine.
  • culture in the presence of a factor derived from meningeal cells refers to culturing in the presence of a factor secreted by meningeal cells and Z or a cell fragment of meningeal cells, which have stem cell differentiation-inducing activity.
  • Means for achieving such culture include, for example, culture in the presence of meningeal cells, culture in a culture supernatant obtained by culturing meningeal cells, and addition of a crude purified solution of the culture supernatant.
  • Culturing in a culture medium containing a factor that is secreted by meningeal cells culturing in a culture medium containing a factor secreted by meningeal cells, and culturing in a culture medium containing cell fragments of meningeal cells. Culture in the presence of membrane cells is preferred.
  • the collected stem cells are cultured in an appropriate culture medium (for example, 8% KNOCKOUT in 500 ml of Glasgow MEM medium).
  • an appropriate culture medium for example, 8% KNOCKOUT in 500 ml of Glasgow MEM medium.
  • TM SR 100 x Non-Es sential Amino Acids solution (manufactured by Gibco) 5 ml, 100 x pyruvic acid (manufactured by Sigma) 5 ml and 1 x 1CT 1 M 2-mercaptoethanol 0.5 ml Medium), and inoculated at a cell density of several inches to several hundred cells cm 2 in an incubator in which meningeal cells are cultured, and preferably several percent at 37 ° C. for 3 to 20 days.
  • stem cells and meningeal cells when culturing stem cells in the presence of meningeal cells, when stem cells and meningeal cells are in physical contact, or when both cells are in the same culture system, substances can be transferred. This includes the case where cells are separated by a septum and physical contact of the cells themselves is not possible.
  • a culture supernatant obtained by culturing meningeal cells or crude purification of the culture supernatant
  • the method of adjusting the differentiation of stem cells by culturing the stem cells in a culture medium to which the liquid has been added is performed using a culture supernatant obtained by culturing meningeal cells or a crudely purified solution of the culture supernatant.
  • This can be achieved by culturing stem cells by a method well known in the art.
  • a culture supernatant obtained by culturing meningeal cells can be obtained by the above-described method for culturing meningeal cells.
  • the crude purified solution of the culture supernatant can be obtained by fractionating the culture supernatant prepared as described above and preparing a fraction having stem cell differentiation-inducing activity.
  • Stem cells are cultured in a culture medium supplemented with factors secreted by meningeal cells and in a culture medium supplemented with Z or a cell fragment of meningeal cells to regulate stem cell differentiation. It can be performed by culturing stem cells by using a factor and Z or a cell fragment of meningeal cells by a method well known in the art. Factors secreted by meningeal cells and / or cell fragments of meningeal cells having stem cell differentiation inducing activity can be obtained by the screening method described below.
  • the medium used for inducing differentiation of stem cells can be prepared using a medium used for culturing animal cells as a basal medium.
  • a basal medium those similar to the basal medium used for culturing meningeal cells can be used.
  • various growth factors as serum substitutes, factors produced by meningeal cells, and the like can be added.
  • the incubator any incubator capable of culturing stem cells (and meningeal cells) can be used, and preferably the same incubator as used in culturing meningeal cells is used. It is desirable to use.
  • Stem cells can be induced into neural cells by the method of regulating differentiation of the present invention.
  • Examples of neural cells include neural stem cells, neural cells, neural tube cells, neural crest cells, and the like.
  • a nerve cell has the function of receiving stimulation from another nerve cell or stimulus receptor cell and transmitting the stimulus to another nerve cell, muscle or gland cell.
  • Nerve cells can be classified according to the difference in neurotransmitters produced by the nerve cells. For example, neurons are classified according to differences in secretory neurotransmitters. The neurons classified by these neurotransmitters include, for example, dopamine-secreting neurons, acetylcholine-secreting neurons, serotoene-secreting neurons, noradrenaline-secreting neurons, and adrenaline-secreting neurons. Neurons, glutamate-secreting neurons, and the like. Dopamine-secreting neurons, noradrenaline-secreting neurons, and adrenaline-secreting neurons are collectively referred to as catecholamine-secreting neurons.
  • the method of the present invention can be used for differentiation into nerve cells, it is preferably used for differentiation into catecholamine-secreting neurons, more preferably dopamine-secreting neurons. be able to.
  • One of the features of the neurons induced to differentiate by the method of the present invention is that the percentage of tyrosine hydroxylase (TH) -positive colonies is about 50% or more.
  • the neural cells differentiated by the method of the present invention are further characterized in that they are substantially free of serotonin-secreting cells.
  • substantially not contained means that after induction of differentiation, the rate of cough-tonin-positive co-knee knee is about 10% or less.
  • Neural stem cells are cells that have the ability to differentiate into nerve cells, as trocytes and oli godendrocytes, and have the ability to self-renew, and neural cells in the brain It has a function of supplying an astrocyte and an oligodendrocyte. Therefore, methods for confirming the identity of neural stem cells include methods of actually transplanting them to the brain and confirming their differentiation potential, and in vitro neural stem cells, neural cells, astrosites, and oligodendrocytes. Neurol., Neuroscience, 8, 389 (1997); Science, 283, 534 (1999). In addition, neural stem cells having such a function are anti-nestin, which recognizes the cytoskeletal protein nestin, which has been confirmed to be expressed in neural progenitor cells. It can be stained with an antibody (Science, 27666 (1997)). Therefore, neural stem cells can also be confirmed by staining with an anti-nestin antibody.
  • the cells obtained by the method of regulating differentiation of the present invention can be used as therapeutic agents for diseases based on disorders of nervous system cells.
  • Disorders based on nervous system disorders include Parkinson's disease, Huntington's disease, Alcheimer's disease, ischemic brain disease, epilepsy, brain trauma, spinal cord injury, motor neuron disease, neurodegenerative disease, retinitis pigmentosa Disease, inner ear hearing loss, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, and diseases caused by neurotoxic damage.
  • the cells obtained by the method for regulating differentiation of the present invention are used as a therapeutic agent for a disease based on a disorder of a nervous system cell
  • the cells are preferably transplanted to a subject after the purity of the cells is increased.
  • any known method for increasing cell purity can be used as long as it is a known method for cell separation and purification.
  • a method using a flow cytometer fe eg, Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
  • Monoclonal Antibodies Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press (1993), Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Pressat Oxford University Press (1996), Int. Immunol., 10, 275 (1998), Exp. Hematol , 25, 972 (1997)), the Inning method (e.g., onoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press (1993), Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Pressat Oxford University Press (1996), J. Immunol., 141, 2797 (1988)), cell fractionation method using density difference of sucrose concentration (for example, tissue culture technology (third edition), Asakura Shoten (1996)) ) Is increased.
  • the method of the present invention for increasing the purity of differentiated cells includes the step of culturing neural cells, particularly neural cells, obtained by inducing differentiation of stem cells as described above, in a medium containing an anticancer agent. This removes undifferentiated cells This makes it possible to obtain differentiated cells with higher purity, which is more suitable as a medicine. That is, by treating with an anticancer agent, cells other than the target differentiated cells, for example, undifferentiated cells can be removed.
  • examples of the anticancer agent include mitomycin C, 5-fluorouracil, adriamycin, ara C, and methotrexate. These anticancer agents are preferably used at a concentration that is more cytotoxic to cells in an undifferentiated state than cells in which differentiation has been induced. Specifically, according to the method described above, culture using these anticancer agents can be performed to determine the optimal concentration. For example, the concentration of 100% of the concentration described in the Japanese Pharmacopoeia when these anticancer agents are used in a living body can be determined. An example is a method of culturing at 37 ° C. for several hours, preferably for 2 hours in a CO 2 incubator aerated at 5% carbon dioxide using a medium containing a concentration of 1 to 1 time.
  • any medium can be used as long as it can culture the cells into which the differentiation has been induced.
  • the above-mentioned medium and the like can be mentioned.
  • stem cells obtained by nuclear transplantation of nuclei of somatic cells or stem cells modified in chromosomal genes is often used. The problem can be overcome.
  • nerve cells of an individual who has provided the somatic cell can be obtained.
  • the cells of such individuals are useful not only as transplantation medicines themselves, but also as diagnostic materials for judging whether or not existing drugs are effective for the individuals.
  • long-term cultivation of differentiated cells enables determination of oxidative stress and susceptibility to senescence.Comparing functions and longevity with cells derived from other individuals, neurodegenerative diseases, etc. It is possible to assess an individual's risk for various diseases, and the evaluation data is useful for providing an effective preventive method for a disease diagnosed with a high future incidence.
  • any method can be used as long as it is suitable for the target disease, and known methods suitable for each disease are known for each disease.
  • stem cells are obtained from a disease patient, and the resulting stem cells are cultured by adding meningeal cells and factors derived from meningeal cells. After inducing differentiation of the nerve cells from the stem cells, the disease can be treated by transplantation into a patient at the site of the disease (for example, see Nature Neuroscience, 2, 1137 (1999)).
  • the present invention provides a method of screening a meningeal cell-derived factor having an activity of inducing neural cell differentiation from stem cells, using an activity of inducing neural cell differentiation from stem cells as an index, and a method obtained by the method.
  • Factors having an activity to induce differentiation of neural cells from stem cells can be obtained from meningeal cells.
  • the cloning method is used.
  • cDNA is prepared from meningeal cells, and the cDNA is inserted downstream of a promoter of an appropriate expression vector to prepare a recombinant vector, and a cDNA library is prepared. Make it.
  • a transformant producing a gene product produced by a meningeal cell is obtained, and has an activity of inducing differentiation of a neural cell from a stem cell.
  • Select a transformant that produces the gene product is obtained.
  • a factor having an activity of inducing differentiation of a nervous system cell from a stem cell can be obtained.
  • the host cells used in the screening method include stem cells and gods. Any cells can be used as long as they do not have the activity of inducing the differentiation of transgenic cells. Examples of such cells include CH0 cells, MDCK cells, rat fibroblasts 3Y1, and COS cells.
  • meningeal cells having an activity to induce differentiation of neural cells from stem cells are used.
  • RNAs are prepared from meningeal cells by a method such as guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method, guanidine acid thiocyanate 'phenol' Cloguchiform (AGPC) method, or the like. Then, using a method such as the oligo (dT) -immobilized cellulose column method, or using a commercially available kit (eg, Fast Track raRNA Isolation Kit (Invitrogen), Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia)) Prepare mRNA.
  • a method such as guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method, guanidine acid thiocyanate 'phenol' Cloguchiform (AGPC) method, or the like.
  • AGPC guanidine acid thiocyanate 'phenol' Cloguchiform
  • Kits include, for example, a method using an upperScript Plasraid System ror cDNA synthesis ana Plasraid Cloning (manufactured by Life Technologies) and a ZAP-cDNA Synthesis Kit (manufactured by STRATAGENE).
  • the expression vector used for preparing the cDNA library is not particularly limited as long as the insert can be expressed in the above-mentioned host cells.
  • Examples thereof include pcDNAI, pCDM8 (Funakoshi), pCDM8 (Nature , 329, 840, (1987)), manufactured by EBV Vector (Invitrogen), pRc / CMV2 ( manufactured by Invitrogen), P Rc / RSV (manufactured by Invitrogen), REP4 (Invitrogen Corp.), cDNA3.1 Vector (manufactured by Invitrogen), pXTl (Invitrogen), pSG5 (Invitrogen), BK-CMV (Stratagene), pBK-RSV (Stratagene) and the like.
  • the prepared cDNA library may be used as it is, but it has the activity of inducing the differentiation of stem cells into neural cells to enrich the target gene.
  • a cDNA library prepared by using the mRNA of a cell having no DNA or by the subtraction method can be used. .
  • any method for introducing DNA into animal cells can be used, such as the electoral poration method, the calcium phosphate method, or the like.
  • the Lipofekshon method is mentioned.
  • the gene product encoded by the introduced cDNA can be expressed by culturing the thus obtained transformant in a medium.
  • the method for culturing the transformant in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • the medium use commonly used RPMI 164 medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, 199 medium, or a medium obtained by adding fetal bovine serum or the like to such medium. I can do it.
  • Culture is carried out usually p H 6 ⁇ 8, 3 0 ⁇ 4 0 ° C, 5% C 0 2 1 ⁇ 7 days under the conditions such as the presence. If necessary, antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium during the culture.
  • a co-culture of stem cells and a transformant enables selection of a transformant that produces a gene product having an activity of inducing differentiation of a neural cell from a stem cell.
  • Isolation of the cDNA introduced into the selected transformant and determination of the gene sequence of the isolated cDNA can be performed by a method known per se.
  • meningeal cell-derived factors having an activity of inducing differentiation of neural cells from stem cells can be obtained. More specifically, the factor can be purified using the meningeal cells of the present invention as a starting material, and using, as an index, a promoting effect of inducing differentiation of neural cells from stem cells when added to a medium. Purification methods include, for example, solvent extraction, salt precipitation with ammonium sulfate, desalination, precipitation with organic solvents, and anion exchange chromatography. Electrophoresis methods such as chromatography, cation exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, isoelectric focusing, etc. Alternatively, a combination of these methods may be mentioned.
  • the screening method of the present invention is useful because it enables screening of factors derived from meningeal cells having an activity of inducing differentiation of neural cells from stem cells.
  • factors derived from meningeal cells obtained by the screening method are useful as additives in a culture medium for inducing differentiation of stem cells.
  • the present invention provides an agent for inducing differentiation of a stem cell, comprising a meningeal cell and a factor derived from Z or meningeal cell.
  • the agent for inducing differentiation of the present invention can be used to induce stem cells to differentiate into the above-mentioned neural cells.
  • meningeal cell-derived factors are provided in various forms.
  • a factor derived from a meningeal cell is provided as a solution or a solid containing the factor.
  • the solution containing the factor include a culture supernatant obtained by culturing meningeal cells, a crude purified solution of the culture supernatant, a solution in which a factor secreted by meningeal cells is dissolved, and cells of meningeal cells.
  • a solution in which fragments are dissolved may be used.
  • Other factors having stem cell differentiation-inducing activity can also be added to these solutions.
  • the present invention describes that (i) meningeal cells and / or factors derived from meningeal cells, and (ii) that they should or can be used for inducing differentiation of stem cells into neural cells.
  • a stem cell culture kit is provided, comprising instructions and an antibody against Z or a neural cell marker. The kit of the present invention can be used to induce stem cells to differentiate into the above-mentioned neural cells.
  • meningeal cell-derived factors are provided in various forms, as in the differentiation inducer.
  • the kit of the present invention can also culture meningeal cells in addition to the above-mentioned active ingredients. It further includes a medium, an incubator for cell culture, and reagents for detecting and quantifying dopamine.
  • Antibodies against neural cell markers are not limited as long as they are capable of confirming the differentiation of stem cells into neural cells.
  • tyrosine hydroxylase TH
  • serotonin nestin
  • NCAM CAM
  • MAP2 MAP2ab Tujl
  • NeuN GABA
  • glutamate antibodies against ChAT.
  • Examples of the medium in which meningeal cells can be cultured include the above-described medium used in culturing meningeal cells.
  • Examples of the incubator for cell culture include the incubators described above.
  • the kit of the present invention is useful for providing a simple means for inducing differentiation of stem cells.
  • the antibodies used are as follows:
  • E-force helin is generally a marker for epithelial cells, but its expression is also observed in undifferentiated ES cells. In the following examples, the cells are used to detect undifferentiated ES cells.
  • GFAP is an astrocyte marker.
  • MAP2ab is a marker for mature neurons. (4) Nestin (mouse) Pharmingen 556309 1: 300
  • Nestin is a marker for neural stem cells.
  • Serotonin is a marker for cells that secrete serotonin, one of the neurotransmitters.
  • TH is a marker for cells that secrete catecholamines, but is also used as a marker for cells that produce dopamine.
  • Tujl is a marker for neurons. Unlike MAP2ab, it is also used as a marker for undifferentiated neural cells.
  • Reference Example 1 Preparation of feeder-one cells from primitive meningeal cells
  • primordial meninges were collected from 10 fetuses of C57BL6 mouse E14 under a microscope and immersed in a PBS (-) solution in a 15 ml tube.
  • the primordial meninges were mechanically detached by pitting, and the suspended cells were collected by centrifugation.
  • the collected cells were washed once with medium I (composition: ⁇ medium (Gibco) 500 ml, FBS (Hyclone) 55 ml, Pc / St (1: 100) (Gibco) 5.5 ml), and then washed again.
  • 5 ml of a 4 ⁇ 10 5 cells / ml cell suspension prepared by adding the medium I was sown on a 6 cm cell culture dish, and incubated at 37 ° C.
  • the primitive meningeal cells were then cultured for about one week and expanded to subconfluent. After subconfluence, the cells were detached from the dish using PBS containing 0.25% trypsin, and subcultured. Due to the slow growth speed, the Passage was performed at 1/2. Until Passage 2-4, the doubling time is around 7 days, after which the breeding speed is a little slower and the doubling time is 7 More than a day. Thereafter, the cells of Passage 2-5 were used as feeder cells.
  • the preparation of feeders using primitive meningeal cells was performed in the same manner as for PA6 cells (Kawasaki et al., Neuron 28: 31-40 (2000)). Specifically, the primordial meningeal cells prepared as described in 1.2 above were placed on an 8-well chamber slide (Falcon) coated with type I collagen [5.0 x 10 4 Itoda vesicle / Uenore Pokoko plating After confirming confluence 1-2 days later, the cells were used as a feeder cell layer.
  • Example 1 ES cell differentiation induction by culture in the presence of primitive meningeal cells
  • ES cells differentiation induction of ES cells was performed in the presence of primitive meningeal cells. Specifically, a co-needle of ES cells (one to several cell clumps) was sown on the single cell layer of the feeder obtained in Reference Example 1 and cultured at 37 ° C for 2 weeks. The cell concentration was 5 colonies per 1 well of the 8-well chamber.
  • dopamine in the medium cultured in the presence of primordial meningeal cells was quantified by HPLC. Based on the total number of colonies when colonies containing cells are regarded as positive colonies It is the ratio of positive colonies.
  • the ratio of nerve cells and first mouth sites is assumed to be one feeder cell. Thus, it was almost the same as or slightly lower than when PA6 cells were used (Fig. 1).
  • Fig. 1 When primitive meningeal cells were used as feeder cells, the proportion of serotonin-positive cells was very low (Fig. 1).
  • culturing ES cells in the presence of primordial meningeal cells induces differentiation of various nervous system cells (for example, dopamine-secreting neurons) and induces differentiation into serotonin-secreting neurons. It became clear that it was suppressed.
  • Reference Example 2 Preparation of feeder cells from dura
  • Example 2 ES cell differentiation induction by culture in the presence of dural cells
  • the colony positive rate was 5-10% for Tujl and 1% for TH.
  • neural stem cells and catecholamine-secreting neurons are induced to differentiate by culturing ES cells in the presence of dural cells. It became clear that it was. Industrial applicability
  • the present invention provides various practical means for enabling clinical application of cell transplantation.
  • a neural cell culture that is free from foreign components is obtained by using, as a feeder cell, meningeal cells derived from the same mammalian species as stem cells such as embryonic stem cells. Therefore, it is useful from the viewpoint of clinical application of cell transplantation.
  • meningeal cells can be easily obtained, the present invention has an advantage of high practicability.
  • the method of the present invention is useful because it can specifically induce differentiation of specific nervous system cells as compared with the conventional method.

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Abstract

臨床応用可能な胚性幹細胞等の幹細胞の分化誘導法を提供する。具体的には、培養培地において、髄膜細胞由来の因子の存在下で幹細胞を培養することを特徴とする、幹細胞の分化調節方法、及び当該分化調節方法により得られる細胞、並びに当該方法を行うための剤及びキットを提供する。また、本発明は、幹細胞から神経系細胞を分化誘導する活性を指標に、幹細胞から神経系細胞を分化誘導する活性を有する髄膜細胞由来の因子をスクリーニングする方法、及び当該スクリーニング方法により得られる髄膜細胞由来の因子も提供する。

Description

明細書
胚性幹細胞の分化調節方法 技術分野
本発明は、 胚性幹細胞等の幹細胞の分化調節方法、 幹細胞の分化調節 用キッ ト、 並びに幹細胞の分化誘導活性を有する因子のスクリ一エング 方法などに関する。 背景技術
パーキンソン病は、 黒質線条体ドパミン神経細胞の変性を主体とする 慢性進行性疾患である。 従来より、 L— D〇 P A ( L —ジヒ ドロキシフ ェニルァラニン） を中心とする内服療法が行われてきたが、 長期にわた る内服が必要なため、 多くの患者においてその効果が次第に減弱し、 ジ スキネジァなどの副作用になやまされるようになる。 このため、 より有 効な治療法の開発が模索されている。
このような疾患に対する有効な治療法として、 ドパミンを分泌する神 経細胞を移植する再生医療が考えられている。 このよ うな細胞移植治療 として、 例えば、 パーキンソン病患者に対して中絶胎児脳を移植する治 療が行われているが、 中絶胎児を利用することに倫理的な問題を指摘す る声が強い。 また、 実際には、 一人の患者を治療するのに 1 0体近い胎 児が必要であるために、 現実的な医療への応用に大きな障害となってい る。 従って、 ドパミン分泌神経細胞を、 社会通念上許容される方法で、 かつ多量に調製する方法の開発が望まれている。
以上のような背景から、 多分化能を保持したまま培養可能な未分化幹 細胞から目的とする機能性細胞を選択的かつ効率的に分化誘導するため の方法の開発が注目され、 様々な試みがなされている。 特に、 正常な機 能を有する ドパミン分泌神経細胞を、 未分化幹細胞から効率的に分化誘 導し取得する方法は、 パーキンソン病をはじめとする神経変性疾患患者 への医療の観点から切望されている。
これまでに、 胚性幹細胞より ドパミン分泌神経細胞を分化誘導する方 法としては、 P A 6細胞の共存下で胚性幹細胞を培養する方法が知られ てレヽる （例えば、 Kawasak i et a l . , Neuron 28： 31 - 40 (2000)参照）。. し かしながら、 P A 6細胞はマウス由来細胞であり、 当該細胞の共存下で 培養された神経系細胞培養物には、 マウス P A 6細胞由来の成分が混入 していると考えられる。 培養過程において異種細胞と接触した細胞を用 いる細胞移植は異種移植とみなされ、 また、 現在のところ、 臨床の細胞 移植ではそのような異種移植は認められていない。 さらには、 最近、 榭 立されたヒ ト胚性幹細胞に、 フィーダ一として使用されたマウス細胞由 来のシアル酸 （ヒ トに対する免疫原性を有する） が混入した例も報告さ れてぉり （Mart i n MJ et a l .， Nature Med i c i ne 1 1 (2)： 228 - 32 (2005) )、 安全性の観点から問題となっている。 以上の通り、 P A 6細胞の共存下 で胚性幹細胞を培養する方法は、 臨床応用の観点から必ずしも望ましい ものではないため、同種移植を可能とする技術の開発が求められている。 発明の開示
従って、 本発明は、 胚性幹細胞等の幹細胞の分化誘導により得られる 細胞の移植の臨床応用を実現するため、 同種由来の成分の存在下で幹細 胞を分化誘導する方法を開発することを目的とする。 また、 本発明は、 より実用性の高い手法でかかる分化誘導を実現することを目的とする。 本発明者らは、 上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、 髄膜細 胞由来の因子の存在下での培養により胚性幹細胞等の幹細胞の分化を調 節できることを見出し、 本発明を完成した。 即ち、 本発明は下記の通り である ：
( 1 ) 髄膜細胞由来の因子の存在下で幹細胞を培養することを特徴とす る、 幹細胞の分化調節方法；
( 2 ) 幹細胞が胚性幹細胞である、 上記 （ 1 ) の方法；
( 3 ) 神経系細胞が分化誘導される、 上記 （ 2) の方法；
(4 ) 神経系細胞がドパミン分泌神経細胞である、 上記 （3 ) の方法 ； ( 5 ) 髄膜細胞の存在下で胚性幹細胞を培養する、 上記 （ 2 ) の方法 ；
( 6 ) 髄膜細胞が原始髄膜由来の細胞である、 上記 （5 ) の方法 ；
( 7 ) 髄膜細胞が硬膜由来の細胞である、 上記 （5 ) の方法 ；
( 8 ) 幹細胞と髄膜細胞の両方が同一の哺乳動物種に由来する細胞であ る、 上記 （ 1 ) 〜 （ 7 ) のいずれかの方法；
( 9 ) 上記 （ 1 ) 〜 （ 8 ) のいずれかの方法により得られうる細胞 ；
( 1 0) 幹細胞から神経系細胞を分化誘導する活性を指標に、 幹細胞か ら神経系細胞を分化誘導する活性を有する髄膜細胞由来の因子をスクリ 一二ングする方法；
( 1 1 ) 幹細胞が胚性幹細胞である、 上記 （ 1 0 ) の方法 ；
( 1 2) 上記 （ 1 1 ) の方法により得られうる髄膜細胞由来の因子；
( 1 3) 髄膜細胞及び Z又は髄膜細胞由来の因子を含む、 幹細胞の分化 誘導剤 ；
( 1 4) 幹細胞が胚性幹細胞である、 上記 （ 1 3 ) の剤 ；
( 1 5) 以下、 （ i )、 （ i i ) を含む、 幹細胞培養用キッ ト ：
( i ) 髄膜細胞及び/又は髄膜細胞由来の因子、 並びに
( i i ) 幹細胞の神経系細胞への分化誘導に使用すべき、 又は使用され うることを記載する説明書、 及び/又は神経系細胞マ一カーに対する抗 体；
( 1 6 ) 幹細胞が胚性幹細胞である、 上記 （ 1 5 ) のキッ ト。 図面の簡単な説明
図 1は、 原始髄膜細胞の存在下で 1 4 日間培養された胚性幹細胞の各 マーカーに対するコ ロニー陽性率 （％) を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 髄膜細胞由来の因子の存在下で胚性幹細胞等の幹細胞を培 養することを特徴とする、 胚性幹細胞等の幹細胞の分化調節方法を提供 する。
本発明が適用される動物と しては、 脊椎動物、 例えば、 マウス、 ラッ ト、 モルモッ ト、 ハムスター、 ゥサギ、 ネコ、 ィヌ、 ヒ ッジ、 ブタ、 ゥ シ、 ゥマ、 ャギ、 サル、 ヒ トが挙げられる。
「髄膜細胞」 とは、 原始髄膜 （men i ges prirai t i va) 又は髄膜（men i ges ) に由来する細胞をいい、 例えば、 原始髄膜、 髄膜から調製される初代培 養細胞、 当該初代培養細胞から誘導された細胞株などが挙げられる。 原 始髄膜は、 分化して最終的に髄膜を形成する、 脳と脊髄を包む粗な胎性 間葉組織である。 髄膜は、 脳と脊髄を包む組織である硬膜、 クモ膜及び 軟膜から構成される。 本発明で用いられる髄膜細胞と しては、 細胞移植 に際して自己又は同種由来の細胞が使用でき、 免疫原性が低いと考えら れること、 及び入手が容易であることから、 原始髄膜由来の細胞、 硬膜 由来の細胞が好ましい。 また、 髄膜細胞としては、 本発明で用いられる 幹細胞と同一の哺乳動物種に由来する細胞を用いることが好ましい。 髄膜細胞は、 「機能細胞の分離と培養 3 . 正常細胞の分離と培養」、 丸善書店 （ 1 9 8 7 ) 等に記載された方法等に準じる当該分野で周知の 方法により調製できる。 例えば、 先ず、 哺乳動物の胎児数匹より原始髄 膜を、 又は哺乳動物の成体より硬膜を採取し、 PBS (-)溶液に浸す。 次い で、 採取した原始髄膜又は硬膜を機械的に乖離させ、 浮遊した細胞を遠 心分離により回収する。 回収した細胞に、 適切な培地を加えて細胞懸濁 液を調製し、 当該懸濁液を培養器に播種する。
得られた初代培養細胞は、 当該分野で周知の方法により継代できる。 例えば、 上記の通り調製した髄膜由来の初代培養細胞を、 適切な培地中 でサブコンフルェン トまで増殖させる。 サブコンフルェン ト後、 トリプ シン処理により細胞をディ ッシュから剥がし、 継代を行なう。 髄膜由来 の初代培養細胞の継代数は、 E S細胞の分化誘導が可能である限り特に 限定されないが、例えば、安定した分化誘導を達成するという観点から、 継代数は 4回以上が好ましい。
また、 髄膜の初代培養細胞からの細胞株の樹立は、 「機能細胞の分離と 培養 5 . 細胞株の樹立と応用」、 丸善書店 （ 1 9 8 7 ) 等に記載された 当該分野で周知の方法により行うことができる。 細胞株を樹立する方法 と しては、 ウィルス、 化学発癌剤、 放射線による処理、 及び初代培養細 胞の中から無制限な増殖能を獲得した細胞を単離する方法等が挙げられ る。 なお、 樹立された細胞株は、 当該細胞株の存在下で幹細胞を培養す ることによ り、 幹細胞の分化誘導能を有するか否かが確認される。 本発 明で用いられる髄膜由来の細胞株と しては、 幹細胞の、 好ましく は神経 幹細胞への分化誘導能を有するものが用いられる。
髄膜細胞の培養で用いられる培地は、 動物細胞の培養に用いられる培 地を基礎培地と して調製することができる。 基礎培地と しては、 BME 培 地、 BGJb培地、 CMRL 1066培地、 Glasgow MEM培地、 Improved MEM Z inc Opt ion培地、 IMDM培地、 Medi um 199培地、 Eagl e MEM培地、 a MEM培地、 DMEM培地、 ハム培地、 RPMI 1640培地、 Fi scher ' s培地、 およびこれら の混合培地など、 動物細胞の培養に用いることのできる培地であればい ずれも用いることができる。
髄膜細胞の培養で用いられる培養器と しては、 髄膜細胞を培養できる ものであればいかなる培養器でも用いることができるが、 好ましく は細 胞培養用培養器が望ましい。 細胞培養用の培養器と しては、 例えば、 フ ラスコ、 組織培養用フラスコ、 ディ ッシュ、 ペト リデッシュ、 組織培養 用ディ ッシュ、 マノレチディ ッシュ、 マイ ク ロプレー ト マイ ク ロ ウエノレ プレー ト、 マノレチプレー ト、 マノレチウエノレプレー ト、 セノ レー トス ト リ ップゥエル、 チャンバースライ ド、 シャーレ、 チューブ、 トレイ、 培養 バック、 ローラーボトル等が挙げられる。 培養器と細胞との接着性を制 御するために、 培養器の細胞と接触する側の表面を人工的に処理を施す こともできる。 培養器の表面を人工的に処理する例と しては、 コラーゲ ンコート、 ゼラチンコート、 ポリ一 L —リジンコー ト、 フイブロネクチ ンコート、 ラミニンコー ト等が挙げられる。 また、 プライマリア （Fal con 製） などのように負の電荷を持つよ うに処理することもできる。
「幹細胞」 とは、 多分化能と 自己複製能を併有する細胞をいう。 幹細 胞と しては、 特に限定されるものではないが神経系細胞に分化し得るも のが好ましく、 例えば、 胚性幹細胞、 神経幹細胞 （胎児脳由来神経幹細 胞、 成体脳由来神経幹細胞等） が挙げられるが、 好ましくは胚性幹細胞 である。
「胚性幹細胞 （E S細胞）」 とは、 インビトロにおいて培養することが 可能で、 かつ、 生体を構成するすべての細胞に分化しうる多分化能を有 する細胞をいう。 胚性幹細胞の例と しては、 （ a ) 着床以前の初期胚を培 養することによって樹立した哺乳動物等の胚性幹細胞が挙げられ、 具体 的には、 初期胚を構成する内部細胞塊よ り樹立された胚性幹細胞、 始原 生殖細胞から榭立された E G細胞、 着床以前の初期胚の多分化能を有す る細胞集団 （例えば、 原始外胚葉） から単離した細胞、 あるいはその細 胞を培養することによって得られる細胞が挙げられる。 また、 本発明に おける胚性幹細胞と しては、 （ b ) 体細胞の核を核移植することによって 作製された初期胚を培養することによって樹立した胚性幹細胞、 および ( c ) ( a ) あるいは （b ) の胚性幹細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子ェ 学の手法を用いて改変した胚性幹細胞が挙げられる。
( a ) の胚性幹細胞は、 着床以前の初期胚を、 文献 （Man ipulat ing the Mouse Embryo A Laboratory Manual , Second Edi t ion, Co l d Spring Harbor Laboratory Press (1994)) に記載された方法に従って培養することによ り調製することができる。
( b )の胚性幹細胞は、例えば、 Wilmut ら （Nature, 385, 810 (1997) )、 Cibelli ら （Science, 280， 1256 (1998))、 入谷明ら （蛋白質核酸酵素， 44, 892 (1999) )、 Baguisi ら (Nature Biotechnology, 17, 456 (1999) )、 Wakayaraa ら (Nature, 394, 369 (1998)； Nature Genetics, 22, 127 (1999) ; Pro Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984 (1999) )、 Rideoutlll ら （Nature Genetics, 24, 109 (2000)) 等によって報告された方法を用 いることにより、 例えば以下のように作製することができる。
哺乳類動物細胞の核を摘出後初期化 （核を再び発生を繰り返すことが できるような状態に戻す操作） し、 除核した哺乳動物の未受精卵に注入 する方法を用いて発生を開始させ、 発生を開始した卵を培養することに よって、 他の体細胞の核を有し、 かつ正常な発生を開始した卵が得られ る。
体細胞の核を初期化する方法としては複数の方法が知られている。 例 えば、 以下の方法が知られている。
核を提供する側の細胞を培養している培地を、 5〜 3 0 %、 好ましく は 1 0 %の仔ゥシ胎児血清を含む培地 （例えば、 M 2培地） から 3〜 1 0日、 好ましくは 5 日間、 0〜 1 %、 好ましくは 0. 5 %の仔ゥシ胎児 血清を含む貧栄養培地に変えて培養することで細胞周期を休止期状態 (G O期もしくは G 1期） に誘導することで初期化することができる。 この方法は、 哺乳動物が、 例えばヒッジ、 ャギ、 ゥシなどの場合に好適 である。
また、 同種の哺乳動物の除核した未受精卵に、 核を提供する側の細胞 の核を注入し、 数時間、 好ましくは約 1〜 6時間培養することで初期化 することができる。 この方法は、 哺乳動物が、 例えばマウスなどの場合 に好適である。 初期化された核は除核された未受精卵中で発生を開始することが可能 となる。 初期化された核を除核された未受精卵中で発生を開始させる方 法としては複数の方法が知られている。 細胞周期を休止期状態 （G O期 もしくは G 1期） に誘導し初期化した核を、 電気融合法などによって同 種の哺乳動物の除核した未受精卵に移植することで卵子を活性化し発生 を開始させることができる。 この方法は、 哺乳動物が、 例えばヒッジ、 ャギ、 ゥシなどの場合に好適である。
同種の哺乳動物の除核した未受精卵に核を注入することで初期化した 核を、 再度マイクロマニピュレーターを用いた方法などによって同種の 哺乳動物の除核した未受精卵に移植し、 卵子活性化物質 （例えば、 ス ト ロンチウムなど） で刺激後、 細胞分裂の阻害物質 （例えば、 サイ トカラ シン Bなど） で処理し第二極体の放出を抑制することで発生を開始させ ることができる。 この方法は、 哺乳動物が、 例えばマウスなどの場合に 好適である。
いったん発生を開始した卵が得られれば、 Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Secona Edition, Cold spring Harbor Laboratory Press (1994)； Gene Targeting, A Practical Approach, IRし Press at Oxford University Press (1993)； ノくィォマ二 ユ アノレシリーズ 8ジーンターゲッティング， E S細胞を用いた変異マウスの作製， 羊土 社 （1995) 等に記載の公知の方法を用い、 胚性幹細胞を取得することが できる。
( c ) の胚性幹細胞は、 例えば、 相同組換え技術を用いることにより作 製することができる。
例えば、 改変する染色体上の遺伝子と しては、 組織適合性抗原の遺伝 子、 神経系細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などがあげられる。
染色体上の標的遺伝子の改変は、 anipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994)； Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)； ノくィォマユユアノレシリーズ 8ジーン ターゲッティング， E S細胞を用いた変異マウスの作製， 羊土社 （1995) 等に記載の方法を用い、 行なうことができる。
具体的には、 例えば、 改変する標的遺伝子 （例えば、 組織適合性抗原 の遺伝子や疾患関連遺伝子など） のゲノム遺伝子を単離し、 単離したゲ ノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲッ トべク ターを作製する。 作製したターゲッ トべクターを胚性幹細胞に導入し、 標的遺伝子とターゲッ トべクターの間で相同組換えを起こした細胞を選 択することにより、 染色体上の遺伝子を改変した胚性幹細胞を作製する ことができる。
標的遺伝子のゲノ ム遺伝子を単離する方法と しては、 Molecular Cloning, A aboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 、1989) や Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons ( 1987-1997)等に記載された公知の方法があげられる。 また、 ゲノ ム D N Aライブラ リースク リ 一ユングシステム （Genome Systems製）や Universal GenoraeWalker™ Kits (CL0NTECH製）などを用レゝ ることにより、 標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離することができる。 標的遺伝子を相同組換えするためのターグッ トベタターの作製、 及び 相同組換え体の効率的な選別は、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)； ノくィォマ二ユアノレシリ —ズ 8ジーンターゲッティング， E S細胞を用いた変異マウスの作製， 羊土社 （1995)等に記載の方法にしたがって作製することができる。なお、 ターゲッ トベクターは、 リプレースメント型、 インサ一シヨ ン型いずれ でも用いることができ、 また、 選別方法と しては、 ポジティブ選択、 プ 口モーター選択、 ネガティブ選択、 ポリ A選択などの方法を用いること ができる。 選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法と し ては、 ゲノム D N Aに対するサザンハイブリダイゼーション法ゃ P C R 法等があげられる。
また、 胚性幹細胞は、 所定の機関より入手でき、 また、 市販品を購入 することもできる。 例えば、 ヒ ト胚性幹細胞である KhES - 1、 KhES-2 及 び KhES- 3は、 京都大学再生医科学研究所より入手可能である。
「髄膜細胞由来の因子の存在下」 で培養するとは、 幹細胞の分化誘導 活性を有する、 髄膜細胞が分泌する因子及び Z又は髄膜細胞の細胞断片 の存在下で培養することをいう。 このよ うな培養を実現する手段として は、 例えば、 髄膜細胞の存在下での培養、 髄膜細胞を培養して得られる 培養上清中での培養、 当該培養上清の粗精製液を添加した培養培地中で の培養、 髄膜細胞が分泌する因子を添加した培養培地中での培養、 及び 髄膜細胞の細胞断片を添加した培養培地中での培養などが挙げられる力 なかでも、 髄膜細胞の存在下での培養が好ましい。
髄膜細胞の存在下で幹細胞を培養し、 幹細胞の分化を調節する方法と しては、具体的には、回収した幹細胞を適切な培養培地（例えば、 Glasgow MEM培地 500 mlに 8%の KNOCKOUT™ SR、 100 X Non - Es sent i al Ami no Ac i ds 溶液 （Gi bco製） 5 ml、 100 Xピルビン酸 （S i gma製） 5 mlおよび 1 X 1CT1 M 2-メルカプトエタノール 0. 5ml を添加した培地） に懸濁し、 髄膜細胞 が培養されている培養器に、 数 "〜数百細胞 c m 2の細胞密度で播種 し、 3〜 2 0 日間 3 7 °Cで数％、 好ましくは 5 %の二酸化炭素を通気し た C O 2ィンキュベータ一にて培養する方法が挙げられる。
また、 髄膜細胞の存在下での幹細胞の培養としては、 幹細胞と髄膜細 胞とが物理的に接触している場合や、 両細胞が同じ培養系に存在するが 物質の行き来が可能な隔壁により隔てられ細胞自体の物理的接触ができ ない場合も含まれる。
髄膜細胞を培養して得られる培養上清中、 又は当該培養上清の粗精製 液を添加した培養培地中で幹細胞を培養し、 幹細胞の分化を調節する方 法は、 髄膜細胞を培養して得られる培養上清、 又は当該培養上清の粗精 製液を用いて、 当該分野で周知の方法により幹細胞を培養することで行 なうことができる。 髄膜細胞を培養して得られる培養上清は、 髄膜細胞 の上述の培養方法により得ることができる。 また、 当該培養上清の粗精 製液は、 上述のように調製した培養上清を分画し、 幹細胞の分化誘導活 性を有する画分を調製することにより得ることができる。
髄膜細胞が分泌する因子を添加した培養培地中、 及び Z又は髄膜細胞 の細胞断片を添加した培養培地中で幹細胞を培養し、 幹細胞の分化を調 節する方法は、 髄膜細胞が分泌する因子及び Z又は髄膜細胞の細胞断片 を用いて、 当該分野で周知の方法により幹細胞を培養することで行なう ことができる。 幹細胞の分化誘導活性を有する、 髄膜細胞が分泌する因 子及び 又は髄膜細胞の細胞断片は、 後述のスク リーユング方法により 得ることができる。
幹細胞の分化誘導で用いられる培地は、 動物細胞の培養に用いられる 培地を基礎培地と して調製することができる。 基礎培地と しては、 髄膜 細胞の培養で使用される基礎培地と同様のものを用いることができる。 また、 これら基礎培地に、 血清代替物と しての各種増殖因子、 髄膜細胞 などが産生する因子などを添加することができる。 さらに、 培養器と し ては、 幹細胞 （及び髄膜細胞） を培養できるものであればいかなる培養 器でも用いることができるが、 好ましく は髄膜細胞の培養で用いられる 培養器と同様のものを用いるのが望ましい。
本発明の分化調節方法によって、 幹細胞を神経系細胞に誘導すること ができる。 神経系細胞と しては、 例えば、 神経幹細胞、 神経細胞、 神経 管の細胞、 神経堤の細胞などが挙げられる。
神経細胞 （neuron) とは、 他の神経細胞あるいは刺激受容細胞からの 刺激を受け別の神経細胞、 筋あるいは腺細胞に刺激を伝える機能を有す る細胞をいう。 神経細胞は、 神経細胞が産生する神経伝達物質の違いに より分類することができ、 例えば、 分泌する神経伝達物質などの違いで 分類されている。これらの神経伝達物質で分類される神経細胞と しては、 例えば、 ドパミ ン分泌神経細胞、 アセチルコ リ ン分泌神経細胞、 セロ ト ェン分泌神経細胞、 ノルア ドレナリ ン分泌神経細胞、 ア ドレナリ ン分泌 神経細胞、 グルタ ミ ン酸分泌神経細胞などがあげられる。 ドパミ ン分泌 神経細胞、 ノルア ドレナリ ン分泌神経細胞、 ア ドレナリ ン分泌神経細胞 を総称してカテコールァミ ン分泌神経細胞と呼ぶ。
本発明の方法は、 神経細胞への分化のために用いることができるが、 神経細胞の中でも好ましくは、 カテコールアミ ン分泌神経細胞、 より好 ましく はドパミン分泌神経細胞への分化のために用いることができる。 本発明の方法により分化誘導された神経細胞は、チロシン水酸化酵素（T H ) 陽性のコロニー率が約 5 0 %以上であることを特徴の一つとする。 また、 本発明の方法により分化誘導された神経細胞は、 セロ トニン分 泌細胞を実質的に含まないことをさらなる特徴とする。 ここで 「実質的 に含まない」 とは、分化誘導後、セ口 トニン陽性のコ口ニー率が約 1 0 % 以下であることを意味する。
神経幹細胞とは、神経細胞、 ァス トロサイ ト （as trocyte) およびオリ ゴデンドロサイ ト （o l i godendrocyte) に分化しう る能力を有し、かつ自 己複製能力を有する細胞をいい、 脳内において神経細胞、 ァス トロサイ ト、 オリ ゴデンドロサイ トを供給する機能を有している。 従って、 神経 幹細胞であることを確認する方法と しては、 実際に脳に移植してその分 化能を確認する方法、 イ ンビ トロで神経幹細胞を神経細胞、 ァス トロサ イ ト、 オリ ゴデンドロサイ トに分化誘導させて確認する方法などが挙げ られる ( o l . Ce l l . Neurosc i ence, 8, 389 ( 1997)； Sc i ence, 283， 534 ( 1999) )。 また、 このよ うな機能を有した神経幹細胞は、 神経前駆細胞で の発現が確認されている細胞骨格蛋白質ネスチンを認識する抗ネスチン 抗体で染色可能である （Science, 276 66 (1997))。 従って、 抗ネスチ ン抗体で染色することにより神経幹細胞を確認することもできる。
本発明の分化調節方法により得られた細胞は、 神経系細胞の障害に基 づく疾患の治療薬として用いることができる。 神経系細胞の障害に基づ く疾患としては、 パーキンソン病、 ハンチン トン舞踏病、 アルッハイマ 一病、 虚血性脳疾患、 てんかん、 脳外傷、 脊髄損傷、 運動神経疾患、 神 経変性疾患、 網膜色素変性症、 内耳性難聴、 多発性硬化症、 筋萎縮性側 索硬化症、 神経毒物の障害に起因する疾患などが挙げられる。
また、 本発明の分化調節方法により得られた細胞を神経系細胞の障害 に基づく疾患の治療薬として用いる場合、 当該細胞の純度を高めた後に 被験体に移植されるのが好ましい。
細胞の純度を高める方法は、 公知となっている細胞分離精製の方法で あればいずれも用いることができるが、 例えば、 フローサイ トメーター 用いる方 fe (例 ば、 Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 988) Monoclonal Antibodies： principles and practice, Third Edition, Acad. Press (1993)、 Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Pressat Oxford University Press (1996)、 Int. Immunol. , 10, 275 (1998)、 Exp. Hematol. , 25, 97 2 (1997)参照）、 ニング法 (例； onoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press (1993)、 Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Pressat Oxford University Press (1996)、 J. Immunol. , 141， 2797 (1988)参照）、 ショ糖濃度の密度差を利用する細胞分画法 （例 えば、 組織培養の技術 （第三版）， 朝倉書店 （ 1 9 9 6 ) 参照） が举げら れる。
本発明の分化細胞の純度を高める方法は、 上述のような幹細胞を分化 誘導して得られた神経系細胞、 特に神経細胞を、 抗癌剤を含む培地中で 培養する工程を含む。 これにより、 未分化な状態の細胞を除去すること ができ、 より純度の高い分化細胞を得ることが可能で、 医薬と してよ り 好適となる。 即ち、 抗癌剤で処理することにより、 目的とする分化細胞 以外の細胞、 例えば未分化な細胞を除去することができる。
ここで、抗癌剤と しては、マイ トマイシン C、 5—フルォロウラシル、 ア ドリアマイシン、 ァラ Cまたはメ ト トレキセー トなどがあげられる。 これら抗癌剤は、 分化誘導した細胞より も未分化な状態の細胞に、 よ り 細胞毒性を示す濃度で用いることが好ましい。 具体的には、 上述した方 法にしたがい、 これら抗癌剤を用いた培養を行い、 至適濃度を決定する ことができ、 例えば、 これら抗癌剤を生体に用いる日本薬局方記載の濃 度の 1 0 0分の 1〜 1倍の濃度で含む培地を用い、 5 %の二酸化炭素を 通気した C O 2ィンキュベーターで、 3 7 °Cで数時間、 好ましく は 2時 間培養する方法をあげることできる。
ここで使用する培地と しては、 分化誘導した細胞を培養することが可 能な培地であればいかなるものも用いることができる。 具体的には、 上 述の培地等を挙げることができる。
また、 移植医療においては、 組織適合性抗原の違いによる拒絶がしば しば問題となるが、 体細胞の核を核移植した幹細胞、 又は染色体上の遺 伝子を改変した幹細胞を用いることで当該問題を克服できる。
また、 体細胞の核を核移植した幹細胞を用いて分化誘導することで、 体細胞を提供した個体の神経細胞を得ることができる。 このよ うな個体 の細胞は、 その細胞自身が移植医療と して有効のみならず、 既存の薬物 がその個体に有効か否かを判断する診断材料と しても有用である。 さら に、 分化誘導した細胞を長期に培養することで酸化ス トレスや老化に対 する感受性の判定が可能であり、 他の個体由来の細胞と機能や寿命を比 較することで神経変性疾患等の疾患に対する個体のリスクを評価するこ とができ、 それら評価データは将来の発病率が高いと診断される疾患の 効果的な予防法を提供するために有用である。 移植の方法としては、 対象となる疾患に適した方法であればいずれの 方法も用いることができ、 疾患ごとにそれぞれの疾患に適した公知の方 法が知られている。 例えば、 疾患患者より幹細胞を取得し、 髄膜細胞お よび髄膜細胞由来の因子を加えて、 得られた幹細胞を培養する。 該幹細 胞から神経細胞を分化誘導させたのちに、 患者の疾患部位に移植するこ とにより疾患を治療することができる（例えば、 Nature Neuroscience, 2, 1137 (1999) 参照）。
また、本発明は、幹細胞から神経系細胞を分化誘導する活性を指標に、 幹細胞から神経系細胞を分化誘導する活性を有する髄膜細胞由来の因子 をスク リーニングする方法、 及び当該方法により得られうる髄膜細胞に 由来する因子を提供する。
幹細胞から神経系細胞を分化誘導する活性を有する因子は、 髄膜細胞 より得ることができる。 例えば、 Molecular Cloning (第 2版）、 Current protocols in Molecular Biology 、苐 3版), Acaa. Press (1993)、 Antibody Engineering： A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1996) 等に記載された発現クローニングの方法が用 レヽられる。
具体的には、 髄膜細胞より c DNAを調製し、 該 c DNAを適当な発 現べクターのプロモーターの下流に挿入することにより、 組換えべクタ —を作製し、 c DN Aライブラリ一を作製する。 該組換えベクターを、 該発現べクターに適合した宿主細胞に導入することにより、 髄膜細胞が 生産する遺伝子産物を産生する形質転換体を得、 幹細胞から神経系細胞 を分化誘導する活性を有する遺伝子産物を産生する形質転換体を選択す る。 選択した該形質転換体に導入した c DNAにコードされている遺伝 子配列を決定することにより、 幹細胞から神経系細胞を分化誘導する活 性を有する因子を取得することができる。
本スク リ一二ング方法で用いられる宿主細胞としては、 幹細胞から神 経系細胞を分化誘導する活性を有していない細胞であれば如何なる細胞 でも用いることができる。 このような細胞と しては、 例えば、 CH0細胞、 MDCK細胞、 ラッ ト繊維芽細胞 3Y1、 COS細胞が挙げられる。
c D N Aの作製に用いられる細胞と しては、 幹細胞から神経系細胞を 分化誘導する活性を有する髄膜細胞が用いられる。
c D NAライブラ リーの調製は、 自体公知の方法により行なわれる。 先ず、 髄膜細胞から、 チォシアン酸グァニジン一 トリ フルォロ酢酸セシ ゥム法、 酸性チォシアン酸グァニジン ' フエノール ' クロ口ホルム （A G P C) 法等の方法により全 R N Aを調製する。 次いで、 オリ ゴ （ d T) 固定化セルロースカラム法等の方法により、又は市販のキッ ト（例えば、 Fast Track raRNA Isolation Kit (Invitrogen 製)、 Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia製）） を用いて、 mR NAを調製する。 調製した髄膜細胞 mR NAから c D NAライブラリーを作製する方法 と しては、 Molecular Cloning (第 2版)、 Current protocols in Molecular Biology (第 3版） 等に記載された方法、 あるいは市販のキッ ト、 例えば uperScript Plasraid System ror cDNA synthesis ana Plasraid Cloning (Life Technologies製）、 ZAP-cDNA Synthesis Kit (STRATAGENE 製）を用いる方法などが挙げられる。
c D NAライブラ リ一の作製に用いられる発現べクターと しては上述 の宿主細胞でィンサートの発現が可能である限り特に限定されないが、 例えば、 pcDNAI、pCDM8(フナコシ社製）、 pCDM8 (Nature, 329, 840， （1987))、 EBV Vector (Invitrogen 製）、 pRc/CMV2 (Invitrogen 製）、 PRc/RSV (Invitrogen製)、 REP4 (Invitrogen社製)、 cDNA3.1 Vector (Invitrogen 製）、 pXTl (Invitrogen製）、 pSG5 (Invitrogen製）、 BK-CMV (Stratagene 製）、 pBK-RSV (Stratagene製）等が挙げられる。
作製した c D NAライブラ リーをそのまま用いてもよいが、 目的とす る遺伝子を濃縮するために、 幹細胞から神経系細胞を分化誘導する活性 を有していない細胞の mR N Aを用レ、、 サブ トラクシヨ ン法 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5783 (1988)) を行なって作製した c D N A ライブラリーを用いることもできる。
組換えべクターの宿主細胞への導入方法と しては、 動物細胞に DN A を導入する方法であればいずれも用いることができ、 例えば、 エレク ト 口ポレーシヨ ン法、 リ ン酸カルシウム法、 リポフエクシヨ ン法が挙げら れる。
以上のよ うにして得られる形質転換体を培地に培養することにより、 導入した c D N Aがコードする遺伝子産物を発現させることができる。 形質転換体を培地に培養する方法は、 宿主の培養に用いられる通常の方 法に従って行う ことができる。 例えば、 培地と しては、 一般に使用され ている R PM I 1 6 4 0培地、 α MEM培地、 DMEM培地、 1 9 9培 地またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることがで きる。 培養は、 通常 p H 6〜 8、 3 0〜 4 0 °C、 5 % C 02存在下等の 条件下で 1〜 7 日間行われる。 また、 培養中必要に応じて、 カナマイシ ン、 ペニシリ ン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明のスク リーニング方法では、 幹細胞と形質転換体との共培養を 行なうことで、 幹細胞から神経系細胞を分化誘導する活性を有する遺伝 子産物を産生する形質転換体を選択することができる。 選択した形質転 換体に導入した c D N Aの単離、 および単離した c D ΝΛの遺伝子配列 の決定は、 自体公知の方法により行なう ことができる。
発現クローニングの手法以外にも、 幹細胞から神経系細胞を分化誘導 する活性を有する髄膜細胞由来の因子を取得することができる。 具体的 には、 本発明における髄膜細胞を出発原料と し、 培地中に添加した際の 幹細胞から神経系細胞を分化誘導する促進効果を指標と して当該因子を 精製することができる。 精製方法と しては、 例えば、 溶媒抽出法、 硫安 等による塩祈法、 脱塩法、 有機溶媒による沈殿法、 陰イオン交換クロマ トグラフィ一法、 陽イオン交換クロマトグラフィー法、 疎水性クロマト グラフィ一法、 分子篩を用いたゲルろ過法、 ァフィ二ティークロマトグ ラフィ一法、 クロマ トフォーカシング法、 等電点電気泳動等の電気泳動 法、 あるいはこれら方法の組合せが挙げられる。
本発明のスク リーニング方法は、 幹細胞から神経系細胞を分化誘導す る活性を有する髄膜細胞に由来する因子のスク リ一ユングを可能にする ため有用である。 また、 当該スクリーエング方法により得られる髄膜細 胞に由来する因子は、 幹細胞を分化誘導するための培養培地における添 加物として有用である。
さらに、 本発明は、 髄膜細胞及び Z又は髄膜細胞由来の因子を含む、 幹細胞の分化誘導剤を提供する。 本発明の分化誘導剤は、 幹細胞を上述 の神経系細胞に分化誘導するために用いることができる。
本発明の分化誘導剤では、 髄膜細胞由来の因子は、 種々の形態で提供 される。 例えば、 髄膜細胞由来の因子は、 当該因子を含む溶液又は固体 として提供される。 当該因子を含む溶液としては、 例えば、 髄膜細胞を 培養して得られる培養上清、 当該培養上清の粗精製液、 髄膜細胞が分泌 する因子を溶解した溶液、 及び髄膜細胞の細胞断片を溶解した溶液など が挙げられる。 また、 これら溶液に、 幹細胞の分化誘導活性を有するそ の他の因子を添加することもできる。
また、 本発明は、 （ i ) 髄膜細胞及び/又は髄膜細胞由来の因子、 並び に （ i i ) 幹細胞の神経系細胞への分化誘導に使用すべき、 又は使用さ れうることを記載する説明書、 及び Z又は神経系細胞マーカーに対する 抗体を含む、 幹細胞培養キッ トを提供する。 本発明のキッ トは、 幹細胞 を上述の神経系細胞に分化誘導するために用いることができる。
本発明のキッ トでは、 髄膜細胞由来の因子は、 分化誘導剤におけるも のと同様に、 種々の形態で提供される。
本発明のキッ トはまた、 上記有効成分に加え、 髄膜細胞を培養可能な 培地、 細胞培養用の培養器、 ドパミ ン検出 · 定量用試薬などをさらに含 んで構成される。
神経系細胞マーカ一に対する抗体としては、 幹細胞の神経系細胞への 分化を確認できる抗体である限り限定されず、 例えば、 チロシン水酸化 酵素 （T H)、 セロ トニン、 ネスチン、 N C AM、 MA P 2、 MA P 2 a b、 T u j l、 N e u N、 GA B A、 グルタメート、 C h ATに対する 抗体が挙げられる。
髄膜細胞を培養可能な培地としては、 髄膜細胞の培養で用いられる上 述した培地が挙げられる。 細胞培養用の培養器と しては、 上述した培養 器が挙げられる。
本発明のキッ トは、 幹細胞を分化誘導し得る簡便な手段の提供を可能 にするため有用である。 実施例
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、 実施例は本発 明の単なる例示を示すものにすぎず、 本発明の範囲を何ら限定するもの ではない。
材料
用いた抗体は下記の通りである ：
( 1 ) E—力 ドヘリ ン （ラッ ト） Takara ECCD2 M108 1:50
E-力 ドヘリ ンは、 一般的には上皮細胞マーカ一であるが、 未分化 ES 細胞でも発現が認められる。 下記実施例では、未分化 ES細胞を検出する ために用いている。
( 2 ) GFAP (ゥサギ） Cheraicon AB5804 1:2000
GFAPは、 ァス トロサイ トのマーカーである。
( 3 ) MAP2ab (マウス） Sigma Ml傷 1:500
MAP2abは、 成熟した神経細胞のマ一カーである。 ( 4 ) ネスチン （マウス） Pharmingen 556309 1:300
ネスチンは、 神経幹細胞のマーカーである。
( 5 ) セロ トニン （ゥサギ） DiaSorin 20080 1:20000
セロ トニンは、 神経伝達物質の一つであるセロ トニンを分泌する細胞 のマーカーである。
( 6 ) TH (ゥサギ） Cheraicon AB152 1:100
THは、 カテコールアミ ンを分泌する細胞のマーカ一であるが、 なかで も、 ドパミンを産生する細胞のマーカーとして用いられる。
( 7 ) Tujl (マウス） Babco MMS 435 - P 1:300
Tujlは、 神経細胞のマーカーである。 MAP2ab とは異なり、 未分化な神 経細胞のマーカーとしても用いられる。 参考例 1 ：原始髄膜細胞からのフィーダ一細胞の調製
1 . 1. 原始髄膜の初代培養
C57BL6マウス E14の胎児 10匹より、 顕微鏡下で原始髄膜を採取し、 15 mlチューブ中で PBS (-)溶液に浸した。 次いで、 原始髄膜をピぺッテ イングにより機械的に乖離させ、 浮遊した細胞を遠心分離により回収し た。 回収した細胞を培地 I (組成： ΜΕΜα培地 （Gibco 製） 500 ml、 FBS (Hyclone製） 55 ml, Pc/St (1:100) (Gibco製） 5.5 ml) で 1回洗浄し た後、 再度培地 I を加えて調製した 4X105細胞/ mlの細胞懸濁液 5 mlを 6 cm細胞培養ディッシュに蒔き、 37°Cにてィンキュベ一トした。
1 . 2. 原始髄膜細胞の継代
次いで、 原始髄膜細胞を約 1週間培養し、 サブコンフルェン トまで増 殖させた。 サブコンフルェント後、 0.25%ト リプシン含有 PBSを用いて細 胞をディッシュより剥がし、 継代を行った。 増殖スピードが遅かったた め、 Passageは 1/2で行なった。 Passage 2 - 4までは doubl ing timeは 7 日前後であり、 その後增殖スピードは少し遅くなり doubling timeは 7 日以上であった。 以降、 Passage 2-5 の細胞をフィーダ一細胞として用 いた。
1 . 3. フィーダ一細胞層の作製
原始髄膜細胞によるフィーダ一の作製は、 PA6 細胞 （Kawasaki ら， Neuron 28： 31-40 (2000)) と同様にして行なった。 具体的には、 上記 1.2. の通り調製した原始髄膜細胞を、 I型コラーゲンでコーティングさ れた 8 well chamber slide (Falcon製） 上【こ 5.0 X 104糸田胞 /ウエノレ ίこて プレーティングし、 1-2 日後にコンフルェントになっていることを確認 し、 フィーダ一細胞層として用いた。 実施例 1 ：原始髄膜細胞存在下での培養による E S細胞の分化誘導
次いで、原始髄膜細胞存在下で ES細胞の分化誘導を行なった。 具体的 には、参考例 1で得られたフィーダ一細胞層上に ES細胞のコ口ニー （1- 数個の細胞塊） を蒔き、 2 週間 37°Cで培養した。 細胞濃度は 8- well chamberの 1 ゥエルあたり、 コ ロニー 5個であった。 分化誘導培地 （GMEM (Gibco製） 500 ml、 100XNEAA (Gibco製） 5 ral、 100 X pyruvate (Sigma 製） 5 ml, 1 X 10"1 M 2 - ME (Wako製） 0.5 ml、 5% knockout serum replacement (Gibco製）） を 1 ゥエルあたり 0.5 ral加え、 1-2 日毎に培地交換を行な つた。 同時に、 既報 （Kawasaki ら， Neuron 28: 31 - 40 (2000)) に従い、 PA6細胞存在下で ES細胞の分化誘導を行なった。 培養 2週間後に細胞を 固定して免疫染色を行い、 原始髄膜細胞を用いた場合におけるコロニー 陽性率を、 PA6細胞を用いた場合と比較検討した。 また、 実際に TH陽性 細胞がドパミンを産生しているか否かを確認するため、 原始髄膜細胞存 在下で培養された培地中の ドパミンを HPLCにより定量した。 なお、 ここ でコロニー陽性率とは、 陽性細胞が含まれるコロニーを陽性コロニーと したときの、 コロニー総数に対する陽性コロニーの比率である。
その結果、 神経細胞、 ァス ト口サイ トの割合は、 フィーダ一細胞と し て PA6細胞を用いた場合とほぼ同等か若干低い程度であった （図 1 )。 ま た、 フィーダ一細胞として原始髄膜細胞を用いた場合、 セロ トニン陽性 細胞の割合は非常に低かった （図 1 )。 なお、 SSEA- 1 コ ロ ニー陽性率は 59. 09% ( n=l ) であった。 また、 フィーダ一細胞として原始髄膜細胞を用 いた場合、 培地中へのドパミ ンの放出が認められた （35. 45 pg/ml)。 以上より、原始髄膜細胞存在下で ES細胞を培養することにより種々の 神経系細胞 （例えば、 ドパミ ン分泌神経細胞） が分化誘導されること、 また、 セロ トニン分泌神経細胞への分化誘導が抑制されることが明らか となった。 参考例 2 ：硬膜からのフィーダ一細胞の調製
6-7週齢の雄 C57BL/6マウスから成体硬膜を採取し、 ハサミで 1 mm程 度まで切り刻んでパパイ ン細胞分散液 （Worth ington) に浸して 37°Cで 約 20分間反応させた。 次いで、 この硬膜をピぺッティングにより機械的 に乖離させ、 浮遊した細胞を遠心分離により回収した。
回収した細胞を培地 Iで 1回洗浄した後、 再度培地 I を加えて調製し た 4 X 105細胞/ ralの細胞懸濁液 5 ralを 6 cm細胞培養ディッシュに蒔き、 37°Cにてインキュベートした。 なお、 硬膜細胞の継代、 及びフィーダ一 細胞層の作製は、 参考例 1 と同様にして行なった。 実施例 2 ：硬膜細胞存在下での培養による E S細胞の分化誘導
次いで、硬膜細胞存在下で ES細胞の分化誘導を行なった。具体的には、 参考例 2で得られたフィーダ一細胞層上に ES 細胞のコ ロ ニーを撒いた 以外は、 実施例 1に記載される方法と同様にして行なった。
その結果、 コロニー陽性率は Tujlが 5- 10%、 THは 1%であった。
以上より、硬膜細胞存在下で ES細胞を培養することにより神経幹細胞、 カテコールアミ ン分泌神経細胞 （ドパミ ン分泌神経細胞） が分化誘導さ れることが明らかとなった。 産業上の利用可能性
本発明は、 細胞移植の臨床応用を可能とする種々の実用的な手段を提 供する。
本発明の方法によれば、 胚性幹細胞等の幹細胞と同一の哺乳動物種に 由来する髄膜細胞をフィーダ一細胞として用いることで、 異種由来の成 分が混入しない神経系細胞培養物を得ることが可能になるため、 細胞移 植の臨床応用という観点から有用である。 また、 髄膜細胞は容易に入手 可能であることから本発明は実用性が高いという利点を有する。さらに、 本発明の方法は、 従来方法よりも、 特定の神経系細胞を特異的に分化誘 導することができるため有用である。 本出願は、 日本で出願された特願 2 0 0 4— 4 6 4 8 8 (出願日 ： 2 0 0 4年 2月 2 3 日） を基礎としており、 その内容は本明細書に全て包 含されるものである。

Claims

請求の範囲
1 .髄膜細胞由来の因子の存在下で幹細胞を培養することを特徴とする、 幹細胞の分化調節方法。
2 . 幹細胞が胚性幹細胞である、 請求の範囲 1に記載の方法。
3 . 神経系細胞が分化誘導される、 請求の範囲 2に記載の方法。
4 . 神経系細胞がドパミン分泌神経細胞である、 請求の範囲 3に記載の 方法。
5 . 髄膜細胞の存在下で胚性幹細胞を培養する、 請求の範囲 2に記載の 方法。
6 .髄膜細胞が原始髄膜由来の細胞である、請求の範囲 5に記載の方法。
7 . 髄膜細胞が硬膜由来の細胞である、 請求の範囲 5に記載の方法。
8 .幹細胞と髄膜細胞の両方が同一の哺乳動物種に由来する細胞である、 請求の範囲 1〜 7のいずれかに記載の方法。
9 . 請求の範囲 1〜 8のいずれかに記載の方法により得られうる細胞。
1 0 . 幹細胞から神経系細胞を分化誘導する活性を指標に、 幹細胞から 神経系細胞を分化誘導する活性を有する髄膜細胞由来の因子をスクリ一 ニングする方法。
1 1 . 幹細胞が胚性幹細胞である、 請求の範囲 1 0に記載の方法。
1 2 . 請求の範囲 1 1に記載の方法により得られうる髄膜細胞由来の因 子。
1 3 . 髄膜細胞及び/又は髄膜細胞由来の因子を含む、 幹細胞の分化誘 導剤。
1 4 . 幹細胞が胚性幹細胞である、 請求の範囲 1 3に記載の剤。
1 5 . 以下、 （ i )、 （ i i ) を含む、 幹細胞培養用キッ ト ：
( i ) 髄膜細胞及び Z又は髄膜細胞由来の因子、 並びに
( i i ) 幹細胞の神経系細胞への分化誘導に使用すべき、 又は使用され うることを記載する説明書、 及びノ又は神経系細胞マーカ一に対する抗 体。
1 6. 幹細胞が胚性幹細胞である、 請求の範囲 1 5に記載のキッ ト。
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