JP2009077725A - 細胞を精製する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】組織破砕処理にかけてNSCを含む混合集団を得る工程、該細胞の混合集団をサイズ識別処理にかけて実質的に全ての細胞がある特定範囲のサイズに収まる細胞の集団を作成する工程、このサイズ識別工程と同時に又は逐次的に該集団を幹細胞表面マーカー識別処理にかけて、表現型がPNAloHSAloである実質的に均一な神経幹細胞の集団を作成する工程を含む方法により調製される。
【選択図】なし
Description
レイノルズ,B.A.及びワイス,S., Science 255: 1707-1710,1992。 リチャーズら, Natl. Acad. Sci. USA89: 8591-8595,1992。 マッケイ,R., Science 276: 66-71,1997。 ゲージ,F.H., Science 287: 1433-1438,2000。 クラーク,D.L., Science 288: 1660-1663,2000。 ビョーンソンら、 Science 283: 534-537,1999。
本明細書を通じて、論旨が別意を要求しない限り、語「含む( comprise)」、又はその変化形である「含む( comprises)若しくは「含む( comprising)」などは、述べられた要素若しくは整数又は要素若しくは整数の群を含むことを意味するが他の如何なる要素若しくは整数又は要素若しくは整数の群の排除を意味するものではないと解する。
HSAloPNAloの細胞集団は、更に表3に挙げる低レベルのマーカーを持つという特徴を有する。低レベルの細胞内マーカーには、III型β−チューブリン及び04が含まれる。
1.「純粋でない」集団では、その効果が幹細胞に直接的なものであって他の分子を介していないことを確定できない、
2.この情報により、内因性幹細胞が新しいニューロン又はグリアなどに分化するよう活性化するために使用できる治療法の発展が可能になる、
ことである。
成体のマウス(生後8〜10週)を頸部転位で犠牲にし、CNS組織をロイス及びアルバレス−バイラに完全に従ってヘペス緩衝化イーグル培地(HEM)中で切り割いた( Proc . Natl. Acad. Sci. USA 90: 2074-2077, 1993)。成体CBAマウスの側脳室壁の脳室ゾーン及び副脳室ゾーンの両方をNSC源として用いた。CNS組織を賽の目に切り、Mg++/Ca++を含まないHBSS(10mMのヘペス、200g/mlのEDTA、0.5mMのトリプシン、0.001%w/vのDNアーゼを含む)に移しpH7.6,37℃で10分間放置した。HEM+5%v/vのウシ胎児血清(FCS)を6ml添加し、その組織片を遠心分離(100xgで7分)で採取した。上清は除去し、PBS(pH7.4)中でペレット粉砕して単細胞懸濁液を作成し、続いて70μMの細胞ストレーナー(ファルコン)を通して組織片を除去した。
免疫染色のため、結果的に得られた懸濁液を20分間4℃でFITC結合PNA(1:200、ヴェクタ、バーリンゲーム、カリフォルニア州)、又はPE結合mCD24aと混合したPNA−FITC(1:200、クローンM1/69、ファーミンゲン)と共にインキュベートした。インキュベーションに続き、細胞懸濁液を遠心分離によりPBSで2度すすぎ、死滅細胞を標識するため、最後にPBS+1%v/vFCSヨウ化プロピジウム(P.I.、100pg/ml、モレキュラープローブ)ですすいだ後、GACS分析を行なった。細胞生存能力は通常は95%より大きく、全てのFACSゲートは未標識細胞を用いて設定した。
PNAloHSAloのNSCの表現型をより詳細に検討するため、選別した細胞は他の神経性マーカーについて免疫染色した。PNAloHSAloのNSCは、推定上の神経幹細胞及び神経前駆細胞のマーカーであるネスチンを発現したが(カラオラら、 Neuroscience 73:581-594 1996)、しかしながら、これらのNSCは細胞型に特異的な神経マーカー( III型βチューブリン、04又はGFAP)は発現しなかった。
PNAloHSAloNSCは、以前はNSCの起源と考えられた上衣細胞の繊毛形態を持たなかった。更に、上衣細胞は以前に高レベルのHSAを発現することが示されていたため、大部分の幹細胞がSVZに残留するという他の研究者らの結論(トロペペら、 J. Neuro sci. 17: 7850-7859, 1997)を有利にする。
CNS組織から収穫した選別された細胞の幹のような性質を評価するため、神経球を以前に記載されたように作成した(グリッティら、 J. Neurosci. 19: 3287-3297, 1999)。本質的に、選別された細胞は、FGF−2(ウシ20組換え体の10ng/ml、ボーリンジャー マンハイム)及びEGF(受容体グレードの20ng/ml、コラボラティブ・リサーチ)をNSCの頻度と濃縮を確かめるために10生細胞/cm2の濃度で、又は正確なNSC頻度を測定するために1ウェルにつき1細胞のいずれかで含む、成長因子を含まないと定義されたNS−A培地(基本培地、ダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)と栄養補給剤F12(ギブコ)(1;1)から成り、0.6%のグルコース、3mMのNaHCO3、5mMのHEPES、及び2mMのL−グルタミン、0.1mg/mlのアポ−トランスフェリン、25μg/mlのインスリン、60μMのプトレッシン(putres cene)、30μMの亜セレン酸ナトリウム(sodium selenite)及び20nMのプロゲステロン(シグマ)を含む)(1、10)中で培養した。培養された細胞の数と比較してイン・ビトロで7日(7DIV)後に形成された球体の数を数えるとNSC頻度が得られた。
PNAloHSAlo細胞からクローンとして誘導された球体[図3A]は、基礎培地で1日、次に基礎培地+1%v/vのFCSで5〜6日間、ポリ−L−オルニチンで被覆したカバーガラスへ移動して分化させ、次いでニューロン及びグリアの存在を免疫細胞化学(ICC)により評価した。100%のケースで、クローンとして誘導された球体はグリア繊維状酸性タンパク質に陽性(GFAP+ve)の星状細胞及び(III型β−チューブリンに陽性(β−tub+ve)のニューロン及び04+veのオリゴヌクレオチドを含んでいた[図3B]。
新たに単離したPNAloHSAloNSCが非神経細胞型を生じる可能性があるかどうかを判定するため、個々のNSCの筋を生ずる能力の定量的評価を可能にする最近開発された検定システムを用いた(ガリら、 Nature Neuroscience 3: 2000)。C2C12細胞中のNSCを容易に同定するため、PNAloHSAloNSCを、常にlacZ(22)及び増大したGFPの両方を発現するBU5X形質転換マウスから単離した(ハジャントナキスら、 Mech. Dev. 76: 79-90, 1998)。BU5Xマウスから得られたPNAloHSAloNSCは、CBAから得たものと同じ特性を示した。
下の例は、単離された細胞がインビボで機能的NSCとして作用することを示す。その結果は表4に示す。これらのデータは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子に突然変異を有する突然変異マウス、クエルコフ(querkopf)を採用して引き出した(トーマスら、 Development 127: 2537, 2000)。この研究の対象となる観察は、出生以降の野生型と比較した場合のクエルコフの嗅球の大きさにおける進行性の欠陥である。嗅球は、最終的に嗅小球及び糸球体周辺のニューロンに分化する副脳質領域幹細胞から誘導された細胞の連続的な移動のため、出生後一貫して成長することを思い出されたい。従って、本発明者らはクエルコフにおける欠陥が脳室周囲の領域での幹細胞の損失を反映するものかどうか、そしてもしそうであれば、どの選別集団にそれらが存在するのかを検討した。本発明者らはFACS分析により、突然変異及び野生型プロフィールがPNAloHSAlo集団における約6倍の減少を除き、全く同じであることを発見した(図2)。野生型PNAloHSAlo集団及び突然変異PNAloHSAlo集団の両方における幹細胞活性の頻度には有意な程の差がなく、PNAloHSAlo幹細胞の機能的能力には本質的な差はないがその全体的な数には劇的な減少があることを示した。更に、他の選別集団では幹細胞活性における変化が見られなかったので、これは幹細胞表現型における変化では説明できなかった。従ってこれらのデータは、クエルコフマウスにおける生後の嗅球ニューロンの形成における欠陥がPNAloHSAlo集団の特異的な欠乏のためであることを強く示唆し、これらの細胞の生体位での機能的役割を更に支持する。
様々なマーカー(外部及び内部)を定義する広範囲のプライマーを用いて、細胞の集団を評価し細胞集団を表現型により特徴付けた。マーカー及び使用したプライマーのヌクレオチド配列は表5に示す。
Claims (31)
- 生体試料から実質的に均一な未分化細胞の集団を作成する方法であって、該生体試料又はその部分試料を組織分裂処理にかけて精製対象の未分化細胞を含む混合集団を得る工程、該細胞の混合集団をサイズ識別処理にかけて実質的に全ての細胞がある特定範囲の大きさである細胞の集団を作成する工程、このサイズ識別工程と同時に又は逐次的に該集団を細胞表面マーカー識別処理にかけて実質的に均一な未分化細胞の集団を作成する工程を含む方法。
- 未分化細胞が未分化又は半未分化な神経幹細胞(NSC)である請求項1記載の方法。
- 実質的に均一な細胞集団が同じ型のNSCである細胞を少なくとも約50%含むものである、請求項2記載の方法。
- 組織破砕処理が結合している細胞外基質(ECM)組織から個々の細胞を分離する工程を含むものである、請求項1記載の方法。
- 約5から約50ミクロンまでの細胞が懸濁液中で得られるものである、請求項4記載の方法。
- 約12ミクロンより大きな細胞が懸濁液中で得られるものである、請求項5記載の方法。
- 該細胞の表現型がPNAloHSAloである、請求項1又は請求項5又は請求項6記載の方法。
- 生体試料又はその部分試料を組織破砕処理にかけて未分化細胞を含む混合集団を得る工程、該細胞の混合集団をサイズ識別処理にかけて実質的に全ての細胞がある特定範囲の大きさに収まる細胞集団を得る工程、このサイズ識別工程と同時に又は逐次的に該集団を未分化細胞表面マーカー識別処理にかけて実質的に均一な未分化細胞集団を作成する工程を含む方法により調製された、実質的に均一な未分化細胞集団。
- 該細胞がNSCである、請求項8記載の実質的に均一な未分化細胞集団。
- 該細胞の少なくとも約50%が同じ型である、請求項9記載の実質的に均一な未分化細胞集団。
- 該細胞の少なくとも約80%が同じ型である、請求項10記載の実質的に均一な未分化細胞集団。
- 該組織破砕処理が個々の細胞をECMから解離させる工程を含むものである、請求項8記載の実質的に均一な未分化細胞集団。
- 該細胞が約5から約50ミクロンまでのサイズのものである、請求項12記載の実質的に均一な未分化細胞集団。
- 該細胞が約12ミクロンより大きいサイズのものである、請求項12記載の実質的に均一な未分化細胞集団。
- 該細胞の表現型がPNAloHSAloである、請求項9又は請求項13又は請求項14記載の実質的に均一な未分化細胞集団。
- 生体試料又はその部分試料を組織破砕処理にかけてNSCを含む混合集団を得る工程、該細胞の混合集団をサイズ識別処理にかけて実質的に全ての細胞がある特定範囲のサイズに収まる細胞の集団を作成する工程、このサイズ識別工程と同時に又は逐次的に該集団を幹細胞表面マーカー識別処理にかけて実質的に均一なNSCの集団を作成する工程を含む方法により調製された実質的に均一なNSC集団。
- 該動物が哺乳動物である、請求項16記載の方法。
- 該哺乳動物がヒトである、請求項17記載の方法。
- 細胞置換療法が脳に関するものである、請求項16又は請求項17又は請求項18記載の方法。
- 細胞置換療法が器官に関するものである、請求項16又は請求項17又は請求項18記載の方法。
- 細胞置換療法が神経系に関するものである、請求項16又は請求項17又は請求項18記載の方法。
- 該神経幹細胞の表現型がPNAloHSAloである、請求項16記載の方法。
- 該神経系が中枢神経系(CNS)である、請求項21記載の方法。
- 該治療法がアルツハイマー病、パーキンソン病、急性脳傷害及びCNS機能不全から選択されるCNS障害に関するものである、請求項23記載の方法。
- 生体試料から実質的に均一なNCS集団を作成する方法により調製した実質的に均一なNSC集団を含む、細胞置換療法に用いる組成物であって、該方法が該生体試料又はその部分試料を組織破砕処理にかけて幹細胞を含む混合集団を得る工程、該細胞の混合集団をサイズ識別処理にかけて実質的に全ての細胞がある特定範囲の大きさに収まる細胞の集団を作成する工程、このサイズ識別工程と同時に又は逐次的に該集団を未分化細胞表面マーカー識別処理にかけて実質的に均一な幹細胞集団を作成する工程を含むものである、組成物。
- 該細胞がPNAloHSAloの表現型である、請求項25記載の組成物。
- 生体試料から実質的に均一なNSC集団を作成する工程を含む、動物の神経組織又は非神経組織を置換する方法であって、該生体試料又はその部分試料を組織破砕処理にかけて該細胞を含む混合集団を得る工程、該細胞の混合集団を細胞サイズ識別処理にかけて実質的に全ての細胞がある特定範囲の大きさに収まる細胞集団を作成する工程、このサイズ識別工程と同時に又は逐次的に該集団を細胞表面マーカー識別処理にかけて実質的に均一なNSC集団を得る工程、次いで該細胞の該実質的に均一な集団を上記の同じ動物又は該細胞を受容できる動物に導入する工程を含む方法。
- 該動物が哺乳動物である、請求項27記載の方法。
- 該哺乳動物がヒトである、請求項28記載の方法。
- 該NSCがPNAloHSAloの表現型である、請求項27記載の方法。
- 請求項16記載の方法に従って作成した均一なNSC集団を用いて同定された成長因子を含む組成物。
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