MXPA00012078A - Celulas ependimarias del tallo neural y metodo para su aislamiento. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a una celula totipotencial del sistema nervioso central, neural, ependimaria, celula que expresa la proteina superficial Notch 1 junto con al menos una proteina superficial elegida del grupo de Notch 2, Notch 3, CAR (proteina transmembranal de enlace al adenovirus) y CFTR (regulador de la conductancia transmembranal de la fibrosis quistica), y cuya ce1ula tambien comprende al menos un cilio. La invencion tambien se refiere a las preparaciones, incluyendo las preparaciones farmaceuticas que comprenden las celulas totipotenciales del SNC, neurales, ependimarias, los ensayos In vitro e in vivo basados en las mismas y otros diversos usos de las novedosas celulas ependimarias de acuerdo a la invencion.

Description

CÉLULAS EPENDIMARIAS DEL TALLO NEURAL Y MÉTODO PARA SU AISLAMIENTO Campo Técnico La presente invención se refiere a un método para aislar células ependimarias del tallo neural del sistema nervioso central, que nunca antes han sido identificadas y aisladas del sistema nervioso central de mamíferos. La invención también se refiere a las preparaciones que comprenden tales células novedosas per se, a las composiciones farmacéuticas que contienen las preparaciones, y a diversos usos médicos de las mismas, así como a los ensayos que utilizan las mismas.

Antecedentes de la Invención Hasta años recientes, una vista "estática" sobre el destino de las células nerviosas en el sistema nervioso central (SNC) era univer salment e prevaleciente, con base en el presunto de que las nuevas neuronas no podían ser generadas en el cerebro de mamíferos de adulto. No obstante, tal renovación de las neuronas ha sido descrita en ciertas regiones del sistema nervioso central de adultos, por ejemplo, en el bulbo olfatorio, donde las señales provenientes de las neuronas del órgano del olor alcanzan el cerebro (Kaplan y colaboradores, Science 197: 1092) y en la fascia dentada del hipocampo (Bayer y colaboradores, Science 216: 890) . Ya que las neuronas son incapaces de dividirse, la adición de nuevas neuronas sugirió la existencia de células inmaduras, por ejemplo, células progenitoras o totipotenciales, las cuales pueden generar neuronas. La evidencia que apoya la existencia de una célula totipotencial neural en el SNC de mamíferos adultos, fue presentada hace unos pocos años (Reynolds y colaboradores, Science 255: 1707) . Sin embargo, como en otros diversos órganos, el percatamiento de la existencia de una célula totipotencial ha llegado antes de identificar y localizar la misma. De manera interesante, la neurogénesis en el cerebro del adulto persiste a todo lo largo de la adultez en roedores (Kuhn PG, J. Neurosci. 16:20) y parece ser un fenómeno evolutivo bien conservado presente en una variedad de mamíferos (Gould y colaboradores, Neurosci. 17: 2492, Gould y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 95: 3168) . En humanos, el asunto es difícil de enfrentar, aunque los datos experimentales provenientes de cultivos de tejido cerebral de humanos adultos (Kirschenbaum y colaboradores, Cereb. Cortex 6:576) sugiere que puede existir neurogénesis continua también en el SNC de humanos ' adultos . La existencia de las células totipotenciales neurales en el SNC de mamíferos adultos fue primeramente demostrada mediante el cultivo de las células a partir del cerebro de rata adulta y de la médula espinal de la misma. Bajo ciertas condiciones de cultivo, puede ser propagada una población de células de la rama neural totipotenciales a partir de cerebro y médula espinal de rata adulta, disociada (Reynolds y colaboradores, Science 255:1707, Dev. Biol 175:1, Weiss y colaboradores, J. Neurosci. 16:7599) . El medio de cultivo tiene que contener factor mitogénico, por ejemplo el factor de crecimiento epidérmico (EGF) o el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), y el suero debe ser excluido. En contraste a las células totipotenciales, la mayoría de otros tipos . de células del SNC no sobreviven en estos cultivos. Bajo estas condiciones, las células simples proliferan in vitro y la progenie forma un cúmulo de células agregadas (Reynolds y colaboradores, Science 255:1707, Dev. Biol. 175:1) . Tales clones celulares se desprenden de la caja de cultivo después de unos pocos días in vitro. Las células continúan proliferando y forman un agregado celular esferoide característico, denominado como una neuroesfera, de células apretadamente acumuladas, todas las cuales son derivadas de una célula única. La mayoría de las células en la neuroesfera expresan la nestina (Lendahl y colaboradores, Cell, 60:585), pero no los marcadores típicos para las células diferenciadas. Estas células no diferenciadas se diferencian rápidamente si se siembran en placas sobre un substrato adhesivo o si se agrega suero al medio de cultivo. De manera importante, un clon de células derivadas de una célula simple puede generar neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, demostrando gue al menos la célula inicial era mult ipo t encial (Reynolds y colaboradores, Science 255:1707, ibid. Dev. Biol. 175:1) . Además, si un clon celular es disociado, muchas de las células formarán nuevos cúmulos de células multipotenciales no diferenciadas (Reynolds y colaboradores, Dev. Biol. 175:1), cumpliendo de este modo los criterios para ser células totipotenciales.

De este modo, el método anterior sufre del serio inconveniente de que la población celular utilizada es de una composición mixta, compleja. Cuando ha sido posible mejorar el desarrollo de algunos tipos celulares, es imposible extraer cualesquiera conclusiones respecto a la localización original de las células obtenidas. En consecuencia, han sido propuestos otros métodos para determinar la localización de las células totipotenciales del SNC de adultos, en donde diferentes partes del prosencéfalo de roedor de adulto han sido cuidadosamente disectadas y cultivadas para probar la capacidad de la neurogénesis . Estos estudios han demostrado que las células totipotenciales son más abundantes en la pared del ventrículo lateral y en el hipocampo (Lois y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos de América, 90:2074, Morsehead y colaboradores, Neuron 13:1071, Palmer y colaboradores, Mol. Cell. Neurosci. 6:474, ibid, 8:389). Además, las células totipotenciales pueden ser aisladas de las paredes del tercero y cuarto ventrículos, así como de la médula espinal de adulto, sugiriendo la presencia de células totipotenciales adyacentes al sistema ventricular a lo largo de la neuraxis completa (Weiss y colaboradores, J. Neurosci. 16:7599) . No obstante, la localización exacta y la identidad de las células totipotenciales neurales ha sido enigmática. La pared de los ventrículos laterales ha sido el objeto de estudios morfológicos detallados (Doetsch y colaboradores, J. Neurosci. 17:5046) . El sistema ventricular está revestido por una capa simple de células ependimar iaes . Las células ependimariaes de mamífero han sido consideradas adicionalmente como células altamente especializadas con la condición principal que es formar una barrera entre el tejido nervioso y el fluido cerebroespinal (Del Bigio, Glia 14:1), lo cual va en contra fuertemente de que estas células sean células totipotenciales no diferenciadas. Por debajo de la capa ependimaria está la. capa subependimaria, también conocida como la zona subventricular . Esta área alberga astrocitos, neuroblastos y células progenitoras (Doetsch y colaboradores, J. Neurosci. 17:5046) . Las células progenitoras en la capa subependima ia tienen una alta velocidad de proliferación (Morsehead y colaboradores, J. Neurosci, 12:249) . En general, las células totipotenciales proliferan muy lentamente y cuando las células subependimar ias proliferan rápidamente éstas fueron selectivamente muertas, la población de células totipotenciales no se vio disminuida, argumentando en contra de que estas células sean las células totipotenciales (Morsehead y colaboradores, Neuron 13:1071) . El documento WO 97/44442 (Johe) describe el aislamiento de células totipotenciales del SNC de mamíferos y más específicamente de la región subependimaria del cuerpo estriado que reviste los ventrículos laterales. No obstante, únicamente las células subependimar ias son utilizadas y de este modo no existe enseñanza adicional respecto a la identidad y al papel de las células ependimar ias de mamífero, que altere el papel convencional. El documento WO 95/13364 (Weiss y colaboradores) se refiere a un método para la proliferación de las células precursoras del SNC localizadas por el ventrículo del SNC de un mamífero. No obstante/ únicamente las células precursoras son descritas, y no existen enseñanzas con respecto a otras etapas celulares, tales como las células totipotenciales.

En este contexto, es interesante hacer notar que además del bulbo olfatorio y el hipocampo, los datos sobre la neurogénesis continua a todo lo largo de la adultez en otras regiones del cerebro de mamífero, han sido escasos. Como un ejemplo de que la neurogénesis puede ser un fenómeno más ampliamente difundido, ha sido aislado un pequeño número de células con la capacidad de generar neuronas in vitro, provenientes del cuerpo estriado y del septo (Palmer y colaboradores, Mol. Cell. Neurosci. 6:474), aunque no se ha probado si estas células tienen propiedades de células totipotenciales o si éstas son progenitores neuronales comprometidos. Existe evidencia creciente de que los daños al sistema nervioso pueden afectar las células totipotenciales en el SNC de adultos. Después de los daños a la médula espinal y al cerebro, la expresión de la nestina es incrementada en las células que revisten el canal central y en la zona subvent ricular , respectivamente (Frisén y colaboradores, J. Cell Biol. 131:453, Holmin y colaboradores, Eur. J. Neurosci. 9:65) . Se ha sugerido que estas células se derivan de las células totipotenciales. Con el tiempo, las células que expresan nestina son observadas progresivamente además desde él canal central y el ventrículo lateral, y estas células expresan marcadores astrociticos (Frisén y colaboradores, J. Cell Biol. 131:453, Holmin y colaboradores Eur . J. Neurosci. 9:65) . Estos datos han conducido a la sugerencia de que las células totipotenciales o células progenitores que residen por el sistema ventricular son inducidas a proliferar, a migrar hacia el sitio del daño y a diferenciarse a astrocitos. Además, las lesiones hipocampales incrementan la proliferación de las células progenitoras hipocampales y el número de neuronas granulares en el hipocampo (Gould y colaboradores, Neurosci. 80:427) . No obstante, ya que las células totipotenciales no han sido identificadas o exactamente localizadas, no es claro si las células totipotenciales juegan un papel en. los procesos de daño . Doetsch y colaboradores, Cell 97:703, han intentado recientemente analizar la identidad de una célula totipotencial neúral en la pared del ventrículo lateral del cerebro del adulto. Ellos proporcionan varios experimentos que sugieren que una célula totipotencial expresa la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) . La GFAP es expresada en muchos astrocitos y Doetsch y colaboradores concluyen que la célula totipotencial que ellos describen es un astrocito. No obstante, existe una plétora de estudios por parte de ellos y otros grupos que demuestran inequívocamente que GFAP es expresada en otros diversos tipos celulares, tales como ciertas células hepáticas, células de Sch ann no mielinizantes , tanicitos y células ependimar ias . Esto hace imposible concluir, con base en la expresión de GFAP, que la célula totipotencial que ellos describen sea un astrocito. No ha sido demostrado ningún marcador específico de astrocitos que sea expresado por las células totipotenciales neurales por Doetsch y colaboradores o cualquier otro grupo. El documento WO 99/16863 describe la generación de células hematopoyét icas provenientes de células totipotenciales neurales, multipotenciales, de mamífero. En consecuencia, las células totipotenciales neurales pueden ser administradas a pacientes que tienen leucemia, linfoma o deficiencia inmune en vez de un trasplante de médula ósea. No obstante, el documento es coiapletamenté silencioso respecto a la regeneración de otros órganos. En consecuencia, el descubrimiento de la existencia de células totipotenciales neurales en SNC de adulto de mamíferos es importante, y puede hacer posible el . desarrollar estrategias para estimular la generación de nuevas neuronas o células gliales. No obstante, varias cuestiones importantes han permanecido sin respuesta y son necesarios métodos mejores para cultivar estas células y para estudiarlas cuantitativamente in vivo. De manera más importante, es absolutamente vital identificar y localizar las células totipotenciales en SNC del adulto con el fin de ser capaces de estudiar estas células posteriormente y de estimular la generación de nuevas neuronas a partir de las células totipotenciales. Además, no existen métodos disponibles hoy en día para purificar las células totipotenciales en una etapa temprana en el cultivo de tejidos. Aunque existen varios métodos generales disponibles para purificar las poblaciones celulares en otros tejidos, es imposible utilizar estos métodos, o desarrollar nuevos métodos, sin el conocimiento de la identidad verdadera de la célula totipotencial.

Los estudios adicionales de una población celular mejor definida son requeridos para la selección de los compuestos farmacéuticos. Además, son necesarios el desarrollo de métodos cuantitativos para marcar y seguir las células totipotenciales y su progenie in vivo para permitir estudios detallados por ejemplo de la regulación de la generación de nuevas neuronas, para analizar el efecto de diferentes productos químicos o manipular genéticamente las células totipotenciales.

Nuevamente, aunque existen métodos conocidos en la técnica que pueden ser utilizados para seguir otras poblaciones celulares in vivo, es imposible utilizar estos métodos o desarrollar nuevos métodos para seguir las células totipotenciales, ya que la identidad de la célula totipotencial ha sido desconocida. El desarrollo de los métodos cuantitativos para seguir las células totipotenciales y su progenie en modelos animales de desórdenes y daños neurodegenerativos del SNC podría abrir la posibilidad para seleccionar nuevas estrategias de tratamiento en condiciones humanas donde hoy en día únicamente pueden ser aliviados algunos de los síntomas, pero no la pérdida neuronal per se.

De este modo, un problema dentro de este campo es que aun cuando las células totipotenciales neurales se sabe que existen, la localización e identidad de las mismas es desconocida. Si esto puede ser logrado, podría ser tomado un paso hacia delante por la investigación dirigida al proporcionar las metas definidas anteriormente.

Breve descripción de la invención El objetivo de la presente invención es resolver el problema anteriormente definido. Esto es logrado de acuerdo a la presente invención mediante la identificación del origen y la identidad de las células totipotenciales neurales y mediante el aislamiento selectivo de tales células totipotenciales del tejido del SNC . La invención radica de este modo en el descubrimiento sorprendente de que las células encontradas en la capa ependimaria son células totipotenciales neurales. De este modo, la presente invención proporciona una célula totipotencial del SNC neural, ependimaria, como" se define en la reivindicación 1. La invención también proporciona un método para el aislamiento de tales células totipotenciales del SNC neurales, ependimarias provenientes de la capa ependimaria . En consecuencia, por primera vez incluso, se describen en la presente la identidad efectiva y la localización de las células totipotenciales neurales, haciendo de este modo posible diversos usos y aplicaciones ventajosas de los mismos dentro del campo médico y de diagnóstico. La invención también se refiere a los ensayos in vitro e in vivo, asi como las composiciones farmacéuticas, en donde los nuevos hallazgos de acuerdo a la invención son venta osamente empleados.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 ilustra la marcación especifica de las células ependimarias y es un dibujo esquemático de la migración dé las neuronas en el prosencéfalo del adulto y la estructura de la pared del ventrículo lateral. La Figura 2 ilustra la generación de las neuronas del bulbo olfatorio y las neuroes feras . La Figura 3 ilustra el enriquecimiento de las células totipotenciales neurales con un marcador específico de células ependimarias.

La Figura 4 ilustra la proliferación de células ependimarias al mostrar una detección inmunohistoquimica de 5-bromo-2 ' -desoxiur idina (BrdU) en la pared lateral del ventrículo lateral después de dos semanas de administración continua de BrdU (A, B) o dos semanas de administración seguida por una semana sin BrdU (C, D) . La Figura 5 describe cómo es inducida la proliferación de las células ependimarias por el daño . La Figura 6 muestra la generación de los astrocitos a partir de células ependimarias después del daño a la médula espinal. La Figura 7 describe el trasplante de células totipotenciales purificadas derivadas de animales transgénicos . La Figura 8 muestra la generación de neuronas en la sustancia nigra proveniente de células totipotenciales en el ratón adulto. La Figura 9 ilustra las corrientes migratorias de células totipotenciales o su progenie en el mesencéfalo. La Figura 10 describe la generación de neuronas en el hipocampo a partir de células totipotenciales localizadas en la capa ependimaria.

La Figura 11 muestra la habilidad de las células totipotenciales del SNC ependimarias para contribuir a la generación de órganos múltiples. La Figura 12 presenta la contribución toráxica de las células totipotenciales ependimarias neurales del adulto, a los tejidos especializados. La Figura 13 presenta la contribución abdominal de las células totipotenciales ependimarias neurales del adulto a los tejidos especializados.

Definiciones En el contexto de la presente solicitud, el término "aislado" se refiere a las fracciones celulares aisladas de un animal o un humano y purificadas hasta al menos aproximadamente 10%, preferentemente al menos aproximadamente 30%, más preferentemente al menos aproximadamente 50% y más preferentemente al menos 60%, tal como aproximadamente 80%. En una modalidad particular de este aspecto de la invención, la pureza de las células aisladas es cercana al 100%, tal como aproximadamente 90%. En tal población celular que tiene una pureza de aproximadamente 90%, quizás únicamente aproximadamente 4% de las células totipotenciales actúan claramente como células totipotenciales "activas" pero el resto de las células totipotenciales están en reposto aunque éstas pueden tener la habilidad para ser transformadas en tales células totipotenciales "activas". Una célula totipotencial "activa" es definida como una célula que sufre autorrenovación y es multipotencial . El término "células totipotenciales neurales" se refiere a las células capaces de generar agregados de células no diferenciadas, denominadas neuroe s feras , bajo condiciones adecuadas, por ejemplo, un medio que contiene mitógenos apropiados. "Células ependimarias" se refiere a cualquier célula que reside parcial o completamente en la capa ependimaria en el sistema ventricular en el sistema nervioso central o el mismo tipo celular localizado en cualquier otro sitio. Una "célula ependimaria" es definida en la presente como la que incluye cualquier célula que tiene las características de una célula ependimaria aislada de la capa de las células ependimarias del tejido del SNC posnatal. En el presente contexto, se debe entender que el rasgo que caracteriza a las células totipotenciales de acuerdo a la invención es la capacidad de las mismas para generar nuevas células totipotenciales, células precursoras, o progeni toras , asi como nuevas neuronas, astroglia, u oligodendroglia. Las células totipotenciales neurales ependimarias también expresan algunos marcadores específicos de la superficie celular que pueden ser utilizados para fines de aislamiento e identificación, tales como Notch 1 (receptor transmembranal ) , Notch 2, Notch 3, CAR (adenovirus que se enlaza a la proteína transmembranal, Tomko y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci., Estados Unidos de América 94:3352) y CFTR (regulador de la conductancia transmembranal de la fibrosis quística, Kunzelmann Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 137:1) . Las células totipotenciales de SNC neurales ependimarias comprenden al menos un cilio. El término "adulto" se utiliza en la presente para diferenciar las células totipotenciales neurales previamente identificadas en embriones de las células totipotenciales neurales presentes obtenidas de mamíferos postnatales. De este modo, las células totipotenciales de adulto son en esencia células totipotenciales ño embrionarias.

Para fines de la presente invención, la disociación del tejido ependimario puede preferentemente ser llevada a cabo utilizando una o una combinación de enzimas de disociación elegidas del grupo de colagenasa,. tripsina y hialuronidasa, asi como el ácido cinurénico. El tejido ependimario puede también ser disociado por disociación mecánica, ya sea solo o en combinación con una o más de las enzimas anteriormente mencionadas.

Descripción detallada de la invención La invención se refiere a una célula totipotencial del SNC neural del adulto, que es una célula totipotencial ependimaria, en otras palabras una célula totipotencial neural que reside en la capa ependimaria. La invención proporciona de este modo células totipotenciales neurales, las cuales pueden ser caracterizadas por poseer las características de una célula ependimaria. . Más específicamente, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una célula totipotencial del SNC neural ependimaria, cuya célula expresa la proteína superficial Notch 1 junto con al menos una proteína superficial elegida del grupo de Notch 2, Noten 3, CAR (proteína t ransmembranal que se enlaza al adenovirus) y CFTR (regulador de la conductancia t ransmembrana 1 de la fibrosis quistica), y cuya célula también comprende al menos un cilio. En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método para aislar células totipotenciales del SNC neurales ependimarias a partir del tejido del SNC de adulto o postnatal, cuyo método comprende preferentemente la disociación del tejido ependimario y la recuperación de dichas células totipotenciales del SNC neurales, ependimarias del mismo. Dicha disociación puede ser realizada mediante cualquier método adecuado fácilmente elegido por alguien experto en este campo. Las células son recuperadas mediante separación por cualquier técnica adecuada a partir de cualquier material no deseado presente, la cantidad y la calidad del cual variará dependiendo del procedimiento utilizado para la obtención del tejido, así como de la condición del mismo. Este aspecto de la invención confía así pues en el aislamiento de un tipo celular particular del tejido del SNC postnatal. La persona experta en la técnica podría fácilmente comprender que esto puede ser logrado de diversas formas. De' este modo, por ejemplo, como se mencionó anteriormente, la capa de células ependimarias podría ser disectada del tejido neural y subsecuentemente procesada para aislar las células ependimarias del mismo. De este modo, el tejido ependimario puede ser selectivamente disociado y las células totipotenciales ependimarias aisladas o recuperadas del mismo. Alternativamente, las células totipotenciales ependimarias pueden selectivamente ser aisladas de una preparación del tejido del SNC, que puede comprender tipos heterogéneos de tejido. De este modo, por ejemplo, una región más grande de tejido cerebral, la cual puede contener tejidos diferentes de la capa de células ependimarias, puede ser disectado y las células ependimarias pueden ser selectivamente aisladas del mismo, por ejemplo mediante recuperación únicamente de las células que tienen características de células ependimarias. Como se discutirá con más detalle más adelante, esto puede ser logrado por ejemplo mediante el uso de técnicas de separación por afinidad con reactivos de afinidad que tienen especificidad para los marcadores de la superficie celular específicos para células ependimarias.

De este modo, las células totipotenciales ependimarias son disociadas, preferentemente a células simples, y luego separadas. Esto es proporcionado por la selección de las células obtenidas mediante el método para las células que muestran al menos una característica o rasgo de una célula totipotencial neural ependimaria. Las células totipotenciales neurales provenientes de adultos han sido descritas en la técnica anterior y el experto en este campo decidirá sobre los métodos de selección óptimos para las condiciones prevalecientes. En una modalidad ventajosa del presente método, el tejido es recolectado de la capa ependimaria de las paredes del sistema ventricular del cerebro o la médula espinal de dicho humano o animal. Tal disección y recuperación del tejido es fácilmente realizada por una persona experta en este campo mediante cualquier método rutinario adecuado. El paso de disociación es realizado mediante cualquier método adecuado, tal como un tratamiento enzimático y/o mecánico, y no está restringido de ninguna manera, siempre y cuando las células simples deseadas sean obtenidas como resultado del mismo. Los ejemplos de tales métodos son, por ejemplo, trituración, tratamiento con tripsina, tratamiento con colagenasa y tratamiento con hialuronidasa . Más preferentemente, la disociación es realizada mediante tratamiento enzimático con tripsina. La disociación del tejido puede alternati amente ser realizada mediante cualquier otro método fácilmente elegido por la persona experta, en vista de las condiciones prevalecientes. La selección de las células resultantes, tales como las células simples, es como se mencionó anteriormente realizada mediante cualquier método adecuado, dependiendo de la característica, rasgo o propiedad de una célula ependimaria utilizada. En una modalidad del presente método, la selección se realiza mediante el uso de la expresión de un marcador especifico de la superficie celular, tal como una proteina. Tal expresión de una proteina superficial puede por ejemplo ser la expresión de los receptores Notchl, Notch2 y/o Notch3, los cuales han sido previamente descritos en la literatura pero en otros contextos. En la modalidad más preferida de este método, las células simples son seleccionadas por su expresión del receptor Notchl. En una ' modal idad alternativa de este aspecto de la invención, las células simples son seleccionadas para utilizar células ependiiaarias previamente marcadas. Tal marcación puede ser con un colorante y es ventajosamente una marcación fluorescente, tal como Dil, como se muestra en el ejemplo 1. Dil ha sido también descrito en otros contextos y es bien conocido por la persona experta en este campo. La marcación de las células se utiliza extensamente dentro de la investigación y métodos de diagnóstico y la elección de una técnica adecuada es de este modo fácilmente realizada por la persona experta. En una modalidad alternativa, un virus, tal como un adenovirus o un lentivirus, pueden ser utilizados. En un aspecto adicional, la invención se refiere a una preparación que comprende células totipotenciales del SNC neurales, ependimar ias . Tal preparación puede ser obtenida mediante cualquiera de los métodos de aislamiento descritos en la presente. Tales preparaciones comprenden al menos aproximadamente 10%, tal como 10-50%, por ejemplo aproximadamente 35%, o en la modalidad preferida, hasta aproximadamente 90%, o más preferentemente un cultivo esencialmente puro, de las células totipotenciales neurales. Preferentemente, al menos aproximadamente 4% de estas células son células totipotenciales completamente activas.

Naturalmente, son posibles de obtener concentraciones mucho más altas, dependiendo del método de selección elegido. Previamente, en los procedimientos de la técnica anterior, las partes de un cerebro han sido disociadas y los factores de crecimiento específicos han sido agregados con el fin de inducir el crecimiento de un tipo celular especifico. Tales procedimientos pueden haber generado concentraciones relativamente altas de células al final, no obstante, que es después de varios días de desarrollo. De manera más importante, tales procedimientos nunca han sido dirigidos a la obtención de una población pura de células totipotenciales en una etapa temprana en el procedimiento de cultivo, ya que la identidad y las características (por ejemplo la expresión de los marcadores específicos de la superficie celular) de la célula totipotencial han sido desconocidas antes de la presente invención. De este modo, en la práctica, el presente método produce la concentración deseada de un tipo celular, por ejemplo las células totipotenciales ependimar ias descritas en la presente, que nunca han sido identificadas y/o localizadas previamente. En una modalidad específica, el producto consiste de aproximadamente 90-95% de las células totipotenciales neurales ependimar ias . En una modalidad ventajosa, el producto del método es una fracción celular que consiste casi completamente, es decir, de aproximadamente 100% de las células totipotenciales neurales ependimarias . En consecuencia, la presente invención se refiere a las células totipotenciales neurales aisladas, obtenibles mediante el método de acuerdo a la presente invención, asi como cualquier fracción de las células totipotenciales neurales aisladas. En otro aspecto más, las células totipotenciales ependimarias preparadas mediante el presente método pueden ser genéticamente modificadas.- Las manipulaciones pueden ser realizadas con el fin de modificar diversas propiedades de la célula, por ejemplo para hacerla más adaptada o resistente a ciertas condiciones ambientales, para inducir una producción de una o más sustancias a partir de las mismas, cuyas sustancias pueden por ejemplo mejorar la viabilidad de la célula, o alternativamente pueden ser útiles como fármacos o medicamentos. Los detalles adicionales respecto a las posibilidades y ventajas de tales células manipuladas de acuerdo a la invención, se proporcionan más adelante, en la sección "Discusión". Algunas de tales alteraciones genéticas pueden ser realizadas con el fin de hacer a las células más adecuadas para el uso en el trasplante, por ejemplo, con el fin de evitar el rechazo de las mismas por parte del paciente (para revisiones de los procedimientos de terapia génica, ver Anderson, Science 256:808; Nabel y Felgner TIBTECH 11:211; Mitani y Caskey TIBTECH 11:162; Mulligan Science 926; Dillon TIB TECH 11:167; Miller Nature 357:455; Van Brunt Biotechnology 6(10) :1149; Vigne Restorative Neurology and Neuroscience 8:35; Kremer and Perricaudet British Medical Bulletin 51(1)31: Haddada y colaboradores, en Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler and Bóhm (eds.) Springer-Verlag, Heidelberg Alemania; y Yu y colaboradores, Gene Therapy 1:13) . De este modo, la presente invención también abarca los métodos de terapia génica, en donde las células totipotenciales neurales son utilizadas asi como las preparaciones pretendidas para ser utilizadas en tales métodos, que comprenden las células de acuerdo a la invención. Tales métodos de terapia génica pueden ser utilizados para tratar y/o prevenir cualesquiera condiciones en donde las neuronas o la glia en el SNC hayan sido deterioradas o estén defectuosas. En otro aspecto más, la presente invención se refiere a una composición que comprende las células totipotenciales neurales para el uso en -terapia, por ejemplo como un medicamento. Además, la invención también se refiere al uso de una célula totipotencial neural en la preparación de una terapia, por ejemplo un medicamento, para la regulación de la neurogénesis o la gliogénesis en el sistema nervioso central, tal como el cerebro. Tal regulación es ya sea la inducción o la inhibición, y el tratamiento puede ser dirigido al mal de Parkinson, a la enfermedad de Alzheimer, a la apoplejía, trauma, etc. En el caso de las células gliales, el medicamento puede ser encaminado para el tratamiento de la esclerosis múltiple y otras condiciones relacionadas a la glia. Estas composiciones podrían también ser utilizadas en la generación de otros tejidos tales como el miocardio, que comprende las paredes atriales y ventriculares del corazón, la aorta dorsal, y el primordio del reborde genital y los túbulos mesonéfricos . Otros ejemplos de órganos que podrían ser generados son el tallo óptico, la capa retinal, y el cristalino del ojo, el oído interno, el hígado, el páncreas y otros órganos endocrinos. En una modalidad particular de la invención, estos aspectos de la invención utilizan células totipotenciales neurales obtenidas mediante- el método descrito anteriormente, aún cuando la invención también abarque los usos de cualesquiera células totipotenciales neurales, tales como las células totipotenciales neurales genéticamente modificadas, para los presentes fines. En consecuencia, la invención se refiere a una preparación farmacéutica que comprende al menos una célula totipotencial neural ependimaria de acuerdo a la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Las preparaciones de acuerdo a la invención pueden ser adaptadas para la inyección en una parte adecuada del sistema nervioso central. Tal preparación farmacéutica comprende cualquier portador adecuado, tal como un portador acuoso, por ejemplo, solución salina amortiguada, etc. La composición · activa de la presente invención es en general estéril y libre de cualquier material indeseable. Además, las preparaciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como sea requerido para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes ajustadores del H, etc. La concentración de la célula totipotencial neural presente, en la preparación, variará dependiendo de la aplicación pretendida de la misma y las dosis de la misma son decididas en consecuencia por el médico del paciente. Las células totipotenciales utilizadas pueden haber sido "aisladas mediante el presente método o cualquier otro método adecuado, u obtenidas de cualquier otra manera. En una modalidad preferida, la presente célula totipotencial puede haber sido genéticamente manipulada con el fin de estar especialmente adaptada para el uso pretendido de la misma. En un aspecto adicional, las células de la invención pueden ser administradas a un paciente, en donde tal administración es terapéuticamente útil. Alternativamente, las células de la invención pueden ser utilizadas para reemplazar o suplementar el tipo celular correspondiente en un paciente, mediante la administración de las células de la invención. Las células de la invención pueden ser utilizadas para recubrir implantes, actuando de este modo como una barrera entre el implante y el paciente. La administración de las células de la invención es lograda mediante los métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. En un aspecto adicional, la presente invención también se refiere a un animal, tal como un ratón, que comprende una célula totipotencial neural, ependimaria, genéticamente modificada de acuerdo a la invención. Tales animales pueden, por ejemplo, ser útiles como modelos en investigación o para prueba de nuevos fármacos. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de las células totipotenciales neurales presentes, como "objetivos de fármacos", preferentemente en ensayos in vitro, para estimular las células totipotenciales para generar un fenotipo neuronal particular o un subtipo glial particular. En una modalidad particular, la invención se refiere al uso de dichas células en el cultivo in vitro de nuevas neuronas. Tal uso puede por ejemplo involucrar el cultivo de las células totipotenciales neurales aisladas, como se describe con más detalle en la sección "Discusión" siguiente. La presente invención también se refiere a las sustancias obtenidas mediante el uso definido anteriormente.

En otro aspecto más, la presente invención se refiere a un método cuantitativo o cualitativo no desviado, preferentemente cuantitativo, para evaluar la neurogénesis y las corrientes migratorias de la progenie de las células totipotenciales, preferentemente en ensayos in vivo, en diversas regiones del cerebro, asi como las técnicas para analizar el número total de células totipotenciales y su progenie que migra hacia diversas regiones del cerebro. Esto es para el desarrollo de nuevos métodos de selección, cuyos métodos también están dentro del alcance de la presente invención, como se define por las reivindicaciones anexas. Éste podría ser de uso en el diagnóstico de pacientes que sufren de enfermedades neurodegenerativas, si el desarrollo de los marcadores de las células ependimarias , adecuados para la tomografía por emisión de positrones (PET) u otros sistemas de formación de imagen disponibles para visualizar el cerebro vivo con suficiente resolución, permite el diagnóstico de la migración defectuosa y/o la diferenciación de la progenie de las células totipotenciales en el SNC de humanos. De este modo, la presente invención también se refiere a los equipos y ensayos para realizar tales métodos, así como las sustancias obtenidas por los presentes métodos. En un último aspecto, la presente invención se refiere a un método para tratar a un paciente humano o animal que sufre de una enfermedad neurodegenerativa, cuyo método comprende el administrar a dicho humano o animal una cantidad farmacéuticamente efectiva de células totipotenciales neurales ependimarias . En general, tal método está basado en la administración de las células totipotenciales ependimarias de acuerdo a la invención, con una función deteriorada y la habilidad para producir neuronas u otros ¦ tipos celulares dependiendo del desorden del SNC del humano. Alternativamente, las neuronas o las células gliales generadas a partir de las células totipotenciales in vitro, pueden ser administradas al SNC. En una modalidad alternativa, la invención se refiere a un método para el tratamiento y/o prevención de desórdenes neurodegenerativos en un paciente humano o animal, en donde la habilidad de las células totipotenciales neurales, defectuosas, existentes, para producir nuevas neuronas o para migrar al objetivo apropiado, es restaurada. Tal método está basado en la administración de una sustancia que estimula e induce las propiedades nativas de las células totipotenciales neurales, y la capacidad de las mismas para producir neuronas. Alternativamente, tal método puede estar basado en la administración de una sustancia que efectivamente inhibe el proceso degenerativo de las neuronas. En consecuencia, las células de la presente invención pueden ser trasplantadas a un paciente para el tratamiento de la enfermedad o el daño mediante cualquier método conocido en la técnica, que sea apropiado para el sitio del trasplante. Los métodos de administración de las células de la invención incluyen, pero no están limitados , a las rutas intradérmica, intramuscular, intraper itoneal , intravenosa, subcutánea, intranasal, y epidural. Las células de la invención pueden ser administradas mediante cualquier ruta conveniente, por ejemplo mediante infusión o inyección de bolo, por absorción a través de los revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden ser administradas junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, puede ser deseable introducir las células de la invención dentro del sistema nervioso central mediante cualquier ruta adecuada, incluyend la inyección int raventr icular e intratecal; la inyección int raventr icular puede ser facilitada por un catéter intraventricular , por ejemplo, acoplado a un depósito, tal como un depósito Ommaya . Puede ser deseable administrar las células de la invención localmente al área en necesidad de tratamiento; esto puede ser logrado por ejemplo, y no a manera de limitación, mediante la infusión local durante la cirugía, la aplicación tópica, por ejemplo, en conjunto con un aposito de herida después de la cirugía, mediante inyección, por medio de un catéter, o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas, o fibras. Lo siguiente describe los métodos ejemplares que pueden ser modificados para el trasplante de las células transformadas: Los protocolos para, el aislamiento y trasplante de los tejidos fetales en humanos han sido reportados, y se han llevado a cabo las pruebas clínicas que involucran estos estudios. Por ejemplo, Lindvall, Science 247:574, han descrito los resultados respecto a los injertos y a la supervivencia de las neuronas de dopamina fetales después del trasplante dentro del cerebro. El enjuague y la disociación parcial de las células precursoras, si es necesario, puede ser llevado a cabo mediante una modificación del método descrito en Linvall, Arch. Neurol. 46:615. A manera de ejemplo, la implantación de las células dentro del cerebro puede ser realizada como sigue. La implantación es realizada en tres sitios en el putamen izquierdo con una técnica esterotáctica (Lindvall, Arch. Neurol 46:615) . Para cada sitio, 20 «1 de las células disociadas se extraen dentro del instrumento (diámetro exterior, 1.0 mm) . Las células son inyectadas a lo largo de un tracto lineal de 10, 12 y 14 mm, respectivamente, ya sea en porciones de 2.5 ael por 15 a 20 segundos cada uno. Entre cada inyección existe un plazo de 2 minutos, y la cánula es luego retraída 1.5 a 1.7 mm. Después de la inyección final, la cánula es dejada in situ por 8 minutos antes de ser lentamente retirada del cerebro. Después de la cirugía, la viabilidad celular es evaluada siguiendo el procedimiento de Brundin, Brain. Res. 331:251. Otro ejemplo más se describe por Caplan y colaboradores, 1993, Patente de los Estados Unidos No. 5, 226, 914. En resumen, después de que las células de la médula son cosechadas de los tapones de la médula ósea y el mesénquima de la médula, las células totipotenciales son separadas mediante centrifugación. Las células totipotenciales son aisladas además por adherencia selectiva a la superficie de plástico o de vidrio de una caja de cultivo de tejidos. Las células totipotenciales se dejan proliferar pero no diferenciar. Se agrega a las células bajo un ligero vacio, cubos de cerámica porosos compuestos de 60% de hidroxiapat ita y 40% de fosfato tricálcico. Los cubos con las células adheridas son implantados dentro de bolsas incisionales a lo largo de las espaldas de ratones desnudos. Las células totipotenciales mesenquimales se diferencian en hueso. El titulo de las células trasplantadas será efectivo en el tratamiento de un desorden o condición particular, y dependerá de la naturaleza del desorden o condición, y puede ser determinado mediante técnicas clínicas estándares. Además, los ensayos in vitro pueden opcionalmente ser empleados para ayudar a identificar los intervalos de dosis óptimos. La dosis precisa que va a ser empleada en la formulación dependerá también de la ruta de administración, y de la seriedad de la enfermedad o del desorden, y debe ser decidida de acuerdo al juicio del practicante y de las circunstancias de cada paciente. La invención también proporciona un envase o equipo farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención y/o los reactivos para preparar las composiciones farmacéuticas de la invención. Opcionalmente asociado con tal o tales recipientes puede estar un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la fabricación, uso o venta de los productos farmacéuticos o biológicos, cuyo aviso refleje la aprobación por parte, de la agencia, de la fabricación, uso o venta para la' administración a humanos. Las células de la invención pueden también ser mantenidas en cultivo para el uso en investigación, incluyendo investigación médica. Por ejemplo, las células pueden ser utilizadas para la selección de compuestos de prueba, de compuestos con función conocida para su habilidad para diferenciar las células de la invención en diferentes tipos celulares.

Descripción detallada de los dibujos Figura 1: Marcación específica de células ependimarias . Dibujo esquemático de la migración de las neuronas en el prosencéfalo del adulto y la estructura de la pared del ventrículo lateral (A) . El ventrículo (V) está revestido por células ependimarias (E) . Entre la capa ependimaria y el cuerpo estriado (S) está la zona subventricular (SVZ), donde las células precursoras (azul claro) se dividen para dar origen a las neuronas inmaduras (azul obscuro) . Las neuronas migran hacia el bulbo olfatorio (flecha azul) . (B) marcación de las células ependimarias. Dil es inyectado es tereotáxicamente en un ventrículo lateral, dando como resultado la marcación de la célula ependimaria a todo lo largo del sistema ventricular. En algunos de estos animales, se realizó una incisión (área gris en la sección transversal de la médula espinal) en el funículo dorsal de la médula espinal. La inyección con Dil marca la capa' ependimaria que reviste el ventrículo lateral (C, D) y el canal central de la médula espinal (E) seis horas después de la inyección. El plexo coroide (CP) está marcado en (C) .

Figura 2: Generación de neuronas y neuroesferas del bulbo olfatorio Diez días después de la inyección de Dil (A, C) o del adenovirus deficiente en replicación que expresa LacZ (B, D) dentro del ventrículo lateral contralateral , las células marcadas son observadas en la zona subventricular (A, B) y en el bulbo olfatorio (C, D) . El inserto en (C) muestra Dil en una neurona inmunorreactiva a la ß I I I - tubul ina . Las microfotografias en campo brillante (E) y de fluorescencia (F) que muestran las neuroesferas del cerebro de un animal que había recibido una inyección int raventr icular Dil. Dos neuroesferas muy débilmente marcadas o no marcadas son indicadas con cabezas de flecha.

Figura 3: Enriquecimiento de células totipotenciales neurales con un marcador específico de células ependimarias .

Localización por inmunofluorescencia de Notchl en la pared del ventrículo lateral (A) y en la médula espinal (B) . La inmunoreact ividad de Notchl es restringida en las células ependimarias que revisten el ventrículo lateral y el canal central. La localización selectiva de Notchl hacia las células ependimarias hizo posible el enriquecimiento de las células ependimarias a partir del cerebro agudamente disociado y del tejido de la médula espinal. Las células disociadas fueron incubadas con antisuero producido contra Notchl, seguido por incubación con anticuerpos secundarios conjugados a esferas magnéticas, y la separación magnética de las células marcadas (fracción Notchl) y no marcadas (fracción de lavado) . En los experimentos control, se omitió el antisuero primario. El número de células en cada fracción fue calculado y se contó el número de neuroesferas generadas en diferentes cultivos (C) .

Figura 4: Proliferación de células ependimarias Detección inmunohistoquímica de BrdU en la pared lateral del ventrículo lateral después de dos semanas de administración continua de BrdU (A, B) o dos semanas de administración seguido por una semana sin BrdU (C, D) . (B) y (D) muestran detalles de (A) y (C), respectivamente. Las células ependimarias marcadas son indicadas con cabezas de flecha en (B) y (D) .

Figura 5: La proliferación de células ependimarias es inducida por daño La detección inmunohistoquímica de BrdU en la médula espinal después de 8 horas (A, D-F) o dos semanas de administración (B, C) de BrdU. (G) proporción de células ependimarias de médula espinal que incorporan BrdU administrado durante las últimas 8 horas antes del sacrificio (núcleos marcados con BrdU/número total de núcleos de células ependimarias visualizados con yoduro de propidio, n=3-5 ratas en cada punto de tiempo, las barras de error muestran SEM) .

Figura 6: Generación de astrocitos a partir de células ependimarias después, del daño a la médula espinal Distribución de Dil, inmunorreact ividad con nestina y GFAP en la médula espinal. El animal en (D-F) fue sujeto a una incisión del funículo dorsal 4 semanas antes del análisis. Todos los animales recibieron una inyección de Dil int ravent r icular antes del daño. La inmunorreact ividad a Dil y a la nestina se muestra en las mismas secciones, y la inmunorreactividad a GFAP en una sección' adyacente en (A-F) . La delineación aproximada del área dañada es indicada por la línea discontinua en (D) . (G) muestra la inmunorreactividad a Dil (rojo) y a GFAP (verde) en el funículo dorsal 2 semanas después de la lesión. Una señal amarilla indica colocalización de la inmunorreacti idad a Dil y a GFAP. (H) visualización por microscopio de exploración con láser Confocal de inmunorreactividad a Dil y a GFAP en el tejido cicatrizante 2 semanas después del daño. Dos células marcadas con Dil inmunorreact ivas a GFAP son indicadas por cabezas de flecha, y una célula marcada con Dil que no muestra ningún GFAP detectable, es indicada con una flecha.

Figura 7; Trasplante de células totipotenciales neurales El trasplante de células totipotenciales purificadas, derivadas de ratones transgénicos que expresan LacZ al cuerpo estriado de ratas adultas. Las flechas apuntan a un grupo de células injertadas. (B) muestra un detalle de (A) .

Figura 8 Generación de neuronas en la sustancia nigra, provenientes de células totipotenciales en la capa ependimaria en la rata adulta. La microfotografia de las neuronas positivas a la t irosina-hidroxilasa, nigrales (verde) en la sustancia nigra parte compacta también marcada con Dil (rojo) en roedores después de la administración de este colorante fluorescente al animal adulto cuatro meses antes. Las flechas señalan a dos neuronas de dopamina nigrales que contienen el marcador fluorescente que marca las células totipotenciales neurales ependimarias .

Figura 9 Corrientes migratorias de células totipotenciales desde la capa ependimaria o su progenie en el mesencéfalo del ratón. Las flechas señalan a las corri.entes migratorias ventromediales (células rojas) de las células ependimar ias marcadas con Dil que alcanzan la sustancia nigra media parte compacta (*) . SNR=sustancia nigra parte reticulada, IP = núcleo interpeduncular . Las flechas muestran las direcciones lateral (1) y ventral (v) . Varias vías que alcanzan las partes rostral, caudal, media y lateral de la sustancia nigra parte compacta, respectivamente fueron identificadas. Además de la corriente ventromedial ilustrada, se identificaron una corriente dorsolateral y una corriente de linea intermedia.

Figura 10 Generación de neuronas en hipocampo de ratón a partir de células totipotenciales localizadas en la capa ependimaria. La microfotografia ilustra que las células ependimarias marcadas co Dil o su progenie, migran hacia la capa de células granulares de la circunvolución dentada (DG) del hipocampo. Las flechas muestran las direcciones lateral (1) y ventral (v) .

Figura 11 En (A) se muestra un embrión de 11 días de tipo silvestre (izquierda) y un embrión quimérico generado a partir de un blastocito el cual fue inyectado con las células totipotenciales neurales del cerebro provenientes de ratones Rosa26 adultos (derecha) . Existe alguna marcación endógena con X-gal en asociación con la vesícula ótica en el embrión de tipo silvestre. La contribución de las células provenientes de las células totipotenciales neurales del adulto, es obvia en varios tejidos incluyendo por ejemplo el corazón y el SNC en el embrión inyectado. En (B) , el ADNc de lacZ proveniente del amnios (A) , región de cabeza (H) , toráxica (Th) o región caudal (C) se amplificó mediante RT-PCR. La expresión de ARNm de lacZ que indica el quimerismo, es observada en los 3 embriones inyectados pero no en el control. Los cebadores para L19 fueron utilizados como control interno.

Figura 12 Detección inmunohistoquimica de ß-galactosidasa (A, B) y desmina (C, D) en una sección a través de la cavidad toráxica de un embrión de 11 días embriónico. En (E) y (F) se muestran conjuntamente la inmunomarcación con ß-galactosidasa (verde) y desmina (rojo) que demuestra la colocalización en el corazón.

Figura 13 Inmunomarcación para ß-galactosidasa (A) y desmina (B) en una sección a través de la cavidad abdominal superior de un embrión de 11 días de edad. El hígado muestra fuerte expresión . de ß-galactosidasa (A) . En (C) , la inmunot inción de la ß-galactosidasa y de la desmina se muestran conjuntamente demostrando la co-localización en el vértice del corazón. (D) muestra la inmunomarcación de la ß-galactosidasa en el intestino.

E emplos 1. Marcación de las células ependimarias y su progenie in vivo Para probar si las neuronas pueden ser generadas o no a partir de células ependimarias, se inyectó Dil con marcador fluorescente o un adenovirus deficiente en replicación que expresa el gen reportero LacZ, dentro de los ventrículos laterales de ratas o ratones adultos. Ratas macho Sprague-Dawley que pesaban 280-320 g o ratones macho C57BL/6 que pesaban 25-30 g fueron anestesiados con hidrato de cloral (400 mg/kg) . Se realizaron inyecciones estereotáxicas unilaterales de 10 µ? (ratas) o 3 µ? (ratones) de Dil al 0.2% p/v (Sondas Moleculares) en DMSO o 50 µ? de solución de adenovirus (que contenía 109 unidades formadoras de placa), 0.9 mm (ratas) o 0.5 mm (ratones) posterior y 1.4 mm (ratas) ó 0.7 mm (ratones) lateral al Bregma y 4 mm (ratas) ó 2 mm (ratones) por debajo de la duramadre dentro del ventrículo lateral. Las inyecciones dieron como resultado la marcación específica de la capa ependimaria a todo lo largo del sistema ventricula ; no se observó marcación en la zona subventricular ni en el parénquima cerebral (Figura 1) . De este modo, este método hace posible seguir específicamente el destino de las células ependimarias marcadas y su progenie. El análisis de la distribución de Dil reveló un número cada vez mayor de células marcadas en la corriente migratoria rostral (Goldman y colaboradores, Trends Neurosci. 21:108), y después de 10 días las primeras neuronas marcadas con Dil fueron observadas en el bulbo olfatorio, una región donde las nuevas neuronas son agregadas continuamente en mamíferos adultos (Figura 2). Similarmente, en animales inyectados con el adenovirus, la células que expresan LacZ fueron encontradas en el bulbo olfatorio a partir de 10 días después de la inyección, aunque a números mucho menores que en los animales inyectados con Dil, como se esperaba, ya que el adenovirus es deficiente en replicación y el marcador de este modo será únicamente heredado por un subgrupo de la progenie de la célula infectada (Figura 2) . La expresión de LacZ fue detectada con tinción con X-gal como se describe (Park y colaboradores, EMBO J. 16:3106). 2. Identificación y localización de las cél ulas totipotenciales neurales mediante cultivo de células ependimarias marcadas.

La marcación especifica del epéndima in vivo puede ser utilizada para probar si las células marcadas tienen propiedades de células totipotenciales in vitro. Después de la inyección de Dil (descrita anteriormente), las ratas fueron sacrificadas con C02, sus cerebros fueron retirados y mantenidos en PBS enfriado con hielo. Las paredes laterales de los ventrículos laterales fueron disectadas. El tejido se desmenuzó con tijeras, se cambió a 4 mi de medio de disociación (colagenasa tipo I al 0.075% (Worthington) , hialuronidasa al 0.075% (Sigma), 2000U de ADNasa I en 4 mi de PIPES 0.2 M (Sigma) e incubadas a 37°C por 30 minutos. La disociación mecánica mediante trituración sucesiva suave a través de una pipeta Pasteur de 5 mi y de 1 mi, fue seguida al dejar la suspensión por 2 minutos, permitiendo que los fragmentos más grandes se asentaran hacia el fondo. Posteriormente el sobrenandante se hizo pasar a través de una malla de 40 µp? (Falcon) . A la suspensión filtrada, se agregaron 4 mi de medio frío (DMEM/F12) . Las células fueron centrifugadas a 200 g por 4 minutos. El sobrenadante se eliminó, el botón o concentrado se resuspendió en 10 mi de solución de sucrosa (0.9 M en 0.5xHBSS) y se centrifugó por 10 minutos a 750 g. El sobrenadante se eliminó y el concentrado se resuspendió en 2 mi de medio de cultivo, se colocó sobre la parte superior de 10 mi de BSA al 4% en solución de EBSS y se centrifugó a 200 g por 7 minutos, seguido por un paso de lavado en DME /F12. El medio de cultivo se elaboró de: 0.5 mi de L-glutamina, 0.75 mi de HEPES 1 M (15 mM) , 50 µ? de EGF a 120 µ?/?a? (y/o 50 µ? de bFGF a 10 µ?/?a?), 1 mi de suplemento B27, 0.5 mi de 100x de penicilina/estreptomicina y, finalmente, medio DMEM-F12 hasta un volumen total de 50 mi. Los cultivos celulares fueron mantenidos a 37° c con 5% de C02 en una atmósfera húmeda. Bajo estas condiciones, se formaron en los cultivos, agregados de células esferoides características, de las células no diferenciadas. Estos agregados celulares se derivan de una célula totipotencial simple y de este modo representan un clon de células. De estas esferas, 88.6 ± 1.20% y 89.0 ± 1.23% del ventrículo lateral y de la médula espinal, respectivamente, fueron claramente marcados con Dil (media a partir de 5 experimentos independientes ± SEM) . Las esferas marcadas con Dil fueron recolectadas y disociadas a células simples. Muchas de estas células formaron nuevas esferas, y cuando se indujeron para diferenciarse mediante la adición de suero al medio, la mayoría de estas esferas secundarias generaron neuronas, astrocitos, oligodendrocitos. La generación de progenie diferenciada fue demostrada por marcación inmunohistoquímica con los siguientes anticuerpos específicos tipo celular: anti-proteína ácido fibrilar glial (Dako) para estrocitos, Tuj 1 (Babeo) para neuronas y 04 (Boehringer Mannheim) para oligodendrocitos. Estos experimentos identifican un método útil para estudiar las células ependimarias in vitro y demostrar que las células ependimarias tienen capacidad de autorrenovación y que éstas sori multipotenciales , por ejemplo, éstas son células totipotenciales de buena fe. 3. Protocolo y medios de cultivo Los protocolos de cultivo adecuados para el desarrollo y selección de células totipotenciales neurales ependimarias pueden ser encontrados en Johansson y colaboradores, Cell 96:25. No obstante, el ingrediente más importante en el medio de cultivo de tejidos para las células totipotenciales del SNC neurales', ependimarias , es un mitógeno que puede ser ya sea el factor de crecimiento epidérmico (EGF) o el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) . El segundo factor más importante es tener un suministro adecuado de cofactores y nutrientes, preferentemente los suplementos bien conocidos B27 o N2. Los siguientes medios especiales fueron utilizados: Medio para neuroes feras : DMEM/F12 47 mi B27 1 mi L-glutamina (reserva: 200 mM) 0.5 mi Penicilina/estreptomicina (1000 U cada una) 0.5 mi HEPES (reserva: 1 M) 0.75 mi Grado EGF-Receptor (reserva: 20 g/ml) 0.05 mi y/o BFGF (reserva: 10 g/ml) 0.05 mi Solución de HBSS-glucosa 500 mi HBSS, 10 X 50 mi D-glucosa (reserva: 300 mg/ml) 9.0 mi HEPES (reserva: 1M) 7.5 mi ddH20 ' 433.5 mi **pH hasta 7.5 Solución de sucrosa 500 mi HBSS, 10 X 25 mi Sucrosa 154 g ddH20 Aforar hasta 500 mi **pH hasta 7.5 Solución BSA-EBSS-HEPES 500 mi BSA (Catálogo Sigma No. A4503) 20 g HEPES (reserva: 1M) 10 mi EBSS, I Aforar hasta 500 mi rpH hasta 7.5 4. Disociación de tejido 13.3 mg de tripsina (Sigma catálogo No.

T4665) , 7.0 mg de hialuronidasa (Sigína catálogo No. H3884) y 2.0 mg de ácido cinurénico (Sigma catálogo No. K3375) se disolvieron conjuntamente en solución-de HBSS-glucosa a 37°C. La solución es esterilizó por filtración y luego, se agregaron 200 µ? de ADNasa a 4000 U/ml (Sigma catálogo No. D4527). El tejido ependimario fue disociado en ese medio a 37°C por 15 minutos. La reacción se trituró suavemente 10 veces con una pipeta de 5 mi, y luego la incubación se continuó por 15 minutos adicionales. La incubación en este medio no debe ser mayor de 30 minuto s . Inmediatamente después de esto, el tejido disociado se hizo pasar a través de un depurador de células de nailon de 70 µp? (Falcon No. 2350) . La mezcla se centrifugó a 1500 rpm por 5 minutos en un tubo cónico de 15 mi, el sobrenadante se removió, y el botón o concentrado se resuspendió en 10 mi de solución de sucrosa-HBSS . El concentrado resuspendido se centrifugó a 2000 rpm por 10 minutos, el sobrenadante se retiró, y el concentrado se resuspendió en 2 mi de 1 X EBSS. Se llenó un nuevo tubo cónico de 15 mi con 12 mi de solución BSA-EBSS-HEPES . La suspensión celular de 2 mi se aplicó cuidadosamente a la parte superior y la mezcla resultante se centrifugó por 7 minutos a 1500 rpm, el sobrenadante se retiró, y las células se resuspendieron en medio para neuroesjferas y se sembró en placa en cajas de 10 cm . El procedimiento anterior es ideal para la médula espinal, ya que éste remueve la mayoría de la mielina. No obstante, con pequeñas cantidades de tejido y para las células aisladas de las paredes ventriculares , el uso de tubos eppendorf después de la suspensión en sucrosa es más adecuado, y dará como resultado más células. Típicamente, el concentrado fue suspendido en 4 mi de solución de sucrosa-HBSS , y esta cantidad se dividió en cuatro tubos de 1.5 mi. El volumen de la solución BSA-EBSS-HEPES fue disminuido en escala consecuentemente. 5. Pase de neuroesferas Se incuba tripsina (Life Technologies #45300027) por 24 horas a 37°C. La tripsina es luego diluida (si es necesario) con PBS (solución salina amortiguada con fosfato) hasta un nivel que producirá disociación completa de las neuroesferas dentro de 5 minutos (empíricamente determinada por cada 500 mi tratados) . Las neuroesferas se recolectan a partir de placas de 10 cm y se dejan asentar suavemente en un tubo cónico de 15 mi. Una vez que las esferas han sido recolectadas en la punta inferior, el sobrenadante es retirado. Las neuroesferas son luego suspendidas en 1 X PBS, transferidas a un tubo eppendorf de 1 mi, y se dejan sedimentar. El sobrenadante se retira y se agregan a las esferas 500 µ? de tripsina (a 37°C) . Después de 2 minutos de incubación a 37°C, las esferas se trituran suavemente a través de la punta de una pipeta amarilla de 20 µ? y luego se dejan por 3 minutos adicionales. Las esferas son nuevamente trituradas, y cualesquiera cúmulos o esferas remanentes se dejan sedimentar por aproximadamente 30 segundos. Los 400-450 µ? superiores de las células tripsini zadas se retiran y se colocan en un nuevo tubo eppendorf que contiene un volumen igual de solución BSA-EBSS-HEPES . Las células son luego centrifugadas a 1500 rpm por 1 minuto, el concentrado de células se resuspende en 1 X PBS y luego se centrifuga nuevamente a 1500 rpm por 1 minuto. El sobrenadante se retira luego y el concentrado celular se resuspende en medio de neuroesferas :Medio Condicionado (50:50) (el Medio Condicionado se recolecta de los cultivos de neuroesferas que han estado en cultivo por al menos una semana. El medio se retira de los cultivos, se filtra a través de un filtro de 0.2 µp?, y luego se mezcla con un volumen igual de medio para neuroesferas recién elaborado) . Las células son luego sembradas en placa en el mismo medio pero sobre placas bacterianas (no placas tratadas con cultivo de tejidos) o una pr.oporción grande de las células se adherirán inicialmente al fondo de la placa lo cual inhibirá la formación de nuevas esferas. Después de 24 horas, las células pueden ser reemplazadas sobre placas de cultivo de tejido, si se desea. 6. Cultivo de células totipotenciales neurales ependimarias simples .

Una prueba directa del potencial de las células ependimarias para formar neuroes feras , podría ser el cultivar las células ependimarias individuales in vitro (Johansson y colaboradores 96:25) . Para este fin, se aislaron células ependimarias del tejido de la pared ventricular lateral, disociado, mediante dos criterios. Primeramente, las células tenían que poseer cilios, una característica morfológica distinta de las células ependimarias, pero no para las células provenientes de la zona subventricular . En segundo lugar, fue tomado tejido de los animales que habían recibido una inyección con Dil 6 horas antes del sacrificio, y únicamente se recolectaron las células marcadas con Dil. Las células que cumplieron ambos criterios fueron recogidas y transferidas a micropozos. Se cultivó una célula por pozo en el medio condicionado para neuroes feras . En estos cultivos, 58% (111 de las 192 células) de las células ependimarias sufrieron división celular. En la mayoría de estos pozos (99 pozos), las células murieron dentro de unos pocos días o formaron cúmulos de células muy pequeños. No obstante, 6.2% de las células iniciales (12 de 192) formaron neuroesferas grandes. Cuando se agregó suero al medio de estas neuroesferas, las células que expresan los marcadores especí fieos del tipo celular para neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, fueron identificadas. Esto reveló que las células ependimarias simples eran capaces de formar neuroesferas que pueden generar neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, por ejemplo estas son células totipotenciales neurales de buena fe. 7. Validación del método de marcación de Dil Ya que . algunos resultados dependen críticamente de la marcación de Dil única de las células ependimarias, pero de las células en la zona subventricular , la posibilidad de transferencia de Dil a las células subventriculares tuvo que ser descartada. Para excluir la transferencia directa de célula a célula de Dil a partir de las células ependimarias se cocultivaron células ependimarias marcadas con Dil con células genéticamente marcadas provenientes de ratones ROSA 26. No pudo ser observada transferencia detectable de Dil a las células ROSA 26. Para descartar la posibilidad de difusión pasiva de Dil desde el fluido cerebroespinal hacia las células subventriculares con el tiempo, se aspiró el fluido cerebroespinal desde el ventrículo lateral a partir de animales que habían recibido una inyección intraventricular de Dil el día anterior y se agregó a las células cultivadas. Se encontró únicamente marcación débil, indicando que la concentración de Dil fue muy baja. Además, la inyección del fluido cerebroespinal en el ventrículo lateral de otro animal, no dio como resultado ninguna marcación de las células que revisten el ventrículo. Estos datos sugieren que la concentración de Dil en el ventrículo lateral cae rápidamente después de una inyección intraventricular, y que una marcación pasiva retardada de las. células en la zona subvent r icular es muy improbable. 8. Purificación de células totipotenciales neurales mediante clasificación celular Se encontró que la proteina Notchl, un receptor de la superficie celular expresado en el sistema nervioso durante el desarrollo embrionario (Kopan y colaboradores, Trends Genet. 13:465), es selectivamente expresado en células ependimarias pero no en las células de la zona subventricular en el cerebro y la médula espinal de rata adulta (Figura 3) . Se tomó ventaja de esta expresión selectiva de Notchl para aislar las células ependimarias a partir de la pared ventricular lateral agudamente disociada, y del tejido de la médula espinal mediante clasificación magnética con antisuero Notchl. Para la clasificación magnética, las células se recolectaron como se describe an eriormente y se resuspendieron en 100 µ? de medio de cultivo de la composición anteriormente definida, 1 µ? del antisuero de conejo producido contra Notchl fue agregado y se incubó a 4°C por 20 minutos. Subsecuentemente, Las células fueron lavadas con 6 mi de DMEM/F12, el concentrado se resuspendió en 100 µ? de medio de cultivo y 30 µ? de antisuero anticonejo conjugado a esferas magnéticas prelavado (con 0.5% de BSA en PBS) (1.8-2.1xl07 esferas, Dynal) se agregó y se incubó por 20 minutos a 4°C con agitación ocasional. Después de la incubación, se agregaron 2 mi de medio de cultivo, la suspensión se transfirió a un tubo Eppendorf de 2 mi, se colocó en un separador magnético Dynal y se dejó por 2 minutos. El sobrenadante se recolectó en una caja Nunc de 35 mm no recubierta (fracción "lavada"), luego el imán se retiró del separador, se agregaron 2 mi de medio de cultivo (como se describe anteriormente), para resuspender la suspensión de esferas-células y se repitió el paso de separación magnética. El sobrenadante fue nuevamente transferido a una placa de cultivo. Después del retiro del imán, se agregaron 2 mi de medio de cultivo, las células restantes se resuspendieron y se transfirieron a una caja Nunc no recubierta de 35 mm a todo lo largo del procedimiento completo, todas las soluciones y las suspensiones celulares fueron mantenidas frias. Los cultivos celulares fueron mantenidos a 37°C, con 5% de C02 en una atmósfera húmeda. El medio de cultivo (composición como se describe anteriormente) fue renovado cada 3 a 4 días. Las células que tuvieron esferas magnéticas acopladas (clasificadas) o no (fracción de lavado) fueron luego cultivadas y evaluadas para la presencia de las células totipotenciales. Las neuroesferas comenzaron a aparecer alrededor del día 4-5 después del aislamiento. En experimentos donde las células habían sido clasificadas con el antisuero Notchl, pero no en experimentos donde el antisuero Notchl fue omitido, la mayoría de las esferas se formaron en la fracción clasificada (Figura 3) . Cuando las esferas formadas en la fracción clasificada por Notchl fueron disociadas, éstas formaron esferas secundarias las cuales fueron multipotentes corroborando que las células ependimarias son células totipotenciales neurales. En otros experimentos, la marcación in vivo de las- células ependimarias (ver arriba) con Dil fue seguida por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o la recolección manual de células fluorescentes y dio como resultado cultivos altamente enriquecidos de células ependimarias. 9. Las células ependimarias tienen una velocidad de generación lenta y generan una población precursora de amplificación transitoria Los estudios previos, basados en la falta de incorporación de los nucleótidos marcados después de una sola o unas pocas inyecciones, han indicado que las células ependimarias no proliferan en mamíferos adultos. Un rasgo característico de las células totipotenciales es que éstas proliferan lenta o raramente y la administración de los nucleótidos marcados sobre periodos prolongados de tiempo ha sido utilizada para identificar las células totipotenciales de ciclo lento en otros tejidos. Es de este modo probable que una velocidad de proliferación lenta de las células ependimarias, las cuales alguien podría esperar si éstas fueran células totipotenciales, podría faltar si son analizadas mediante una sola o unas pocas inyecciones de los nucleótidos marcados. Con el fin de caracterizar la proliferación de las células ependimarias, se suministró el análogo de timidina, 5-bromo-2 ' -desoxiuridina (BrdU, Sigma) continuamente en periodos prolongados de tiempo. En vez de realizar inyecciones repetidas, se administró BrdU a ratones adultos a través del agua para beber en un periodo de dos a seis semanas antes del análisis. Para lograr la marcación a largo plazo del cerebro del ratón, se agregó 1 mg/ml de BrdU al agua para beber de los ratones. El agua fue intercambiada dos veces a la semana y protegida de la luz con papel aluminio. BrdU fue eficientemente absorbida a través del intestino, y dio como resultado la marcación de las células ependimarias que revisten las paredes laterales de los ventrículos laterales. Las células ependimarias que revisten la parte superior o cubierta y la pared media de los ventrículos laterales fueron raramente marcadas, correspondiendo a la pared lateral que es la región neurogénica más activa. Números muy grandes de células marcadas con BrdU estuvieron presentes en la zona subventricular (Figura 4) . Las células marcadas en la zona subventricular fueron frecuentemente agrupadas en cúmulos de células apretados, dando la impresión de un clon de células (Figura 4) . Sorprendentemente, en muchos casos tal cúmulo celular estuvo localizado en estrecha proximidad a una célula ependimaria marcada (figura 4) . Las células precursoras proliferantes migran estrechamente de manera conjunta en la zona subventricular hacia la punta anterolateral del ventrículo lateral, donde éstas entran a la corriente migratoria rostral. La relación espacial entre una célula ependimaria marcada y un cúmulo de células de la zona subventricular existió en la gran mayoría de los casos, de modo que las células ependimarias fueron desplazadas hacia la corriente migratoria rostral en relación a la célula ependimaria marcada (Figura 4) . El hecho de que las células totipotenciales tengan una velocidad de proliferación lenta ha sido utilizado para localizar las células totipotenciales en otros tejidos. Cuando se administran nucleótidos marcados sobre periodos prolongados de tiempo, las células que proliferan rápida y lentamente serán marcadas. Al dejar que los animales sobrevivan por un periodo después de la administración del nucleótido marcado, a las células que proliferan rápidamente se les dará tiempo para diluir el marcador por divisiones continuas o por migración lejos. Por lo tanto, únicamente las células que proliferan lentamente conservarán el marcador con el tiempo. Se analizaron animales que habían recibido BrdU continuamente en un periodo de dos a seis semanas, seguido por dos semanas sin BrdU. En estos animales, muy pocas células marcadas fueron observadas en la zona subventricular, indicando que la gran mayoría de las células habían diluido el marcador por divisiones repetidas o porque migraron lejos (Figura 4) . No obstante, un número sustancial de células ependimarias estuvieron todavía marcadas ( figura 4 ) . Se estudió en seguida la proliferación de las células ependimarias de la médula espinal. Un número sustancial de células ependimarias -que revisten el canal central fueron marcadas después de la administración prolongada de BrdU a través del agua para beber (figura 5) . En contraste a la zona subventricular del ventrículo lateral, unas pocas células marcadas fueron observadas justo fuera del epéndima del canal central (Figura 5) . No obstante, las pocas células marcadas que fueron observadas junto al canal central frecuentemente residían en estrecha proximidad con una célula ependimaria marcada, sugiriendo qué esta célula puede derivarse del epéndima (Figura 5) . 10. Cultivo de células totipotenciales del SNC neurales , ependimarias a partir del cerebro de humano adulto El tejido de la pared ventricular lateral fue retirado de dos pacientes adultos durante la cirugía para eliminar focos epilépticos. El tejido fue disociado enzimáticamente como se describe con detalle para el tejido de roedores, procesado y cultivado exactamente de la misma manera. Después de aproximadamente una semana, aparecieron neuroesferas típicas en las cajas de cultivo. Cuando se indujeron a diferenciarse por siembra én placa las neuroesferas sobre poli-L-ornitina o por adición de suero, neuronas, astrocitos y oligodendrocitos (estudiados con los mismos marcadores específicos celulares que en los experimentos con roedores) se diferenciaron a partir de neuroesferas simples. 12. Método cuantitativo para analizar la neurogénesi s in vivo en una región cerebral definida , tal como la sustancia nigra parte compacta en el mesencéfalo Diversos datos no publicados de los presentes inventores los han persuadido a postular que la región del cerebro donde las neuronas de dopamina mueren en la enfermedad de Parkinson, por ejemplo, la sustancia nigra (Date, Brain Res. Bull. 40:1) representan una nueva región donde está presente la renovación continua de las neuronas. Las técnicas de conteo de células estereológicas "del estado de la técnica" in situ, han sido utilizadas y adicionalmente desarrolladas (Gundersen y colaboradores, APMIS 96:857; Janson y colaboradores, Neuroscience 57:931) y se analizó el número total de neuronas nigrales en ratones jóvenes y viejos, asi como el numero total de neuronas apoptóticas en la misma región. En resumen, los resultados no publicados, de los presentes inventores (Janson y colaboradores) indican que los ratones jóvenes y viejos tienen el mismo número de neuronas de dopamina nigrales, aunque un menor número de neuronas mueren espontáneamente a través de la apoptosis. Al mismo tiempo, los presentes inventores han encontrado que la nestina, un marcador para las células progenitoras neuronales como se describe anteriormente, está presente en una subpoblación de neuronas nigrales (datos no publicados, ¦ Janson y colaboradores) . Tomados conjuntamente estos datos indican la posibilidad de una neurogénesis continua en balance con la apoptosis neuronal, por ejemplo la renovación neuronal, la cual se describe más adelante. Los métodos cuantitativos permiten la sección in vivo de sustancias que aumentan la neurogéneis y/o la migración neuronal. A ratas y ratones adultos se les administró Dil a través de inyecciones ventriculares como se describe en el ejemplo anterior. A diversos intervalos de tiempo después de la inyección (horas-meses), los animales fueron transcardiacamente prefundidos con 15 mi de solución salina al 0.9%, seguido por 50 mi de paraformaldehido al 4°C (p/v) a + 4°C, y 0.4% (v/v) de ácido picrico en solución salina amortiguada con fosfato a 0.1 M, pH 6.9, durante 5 minutos. Después del retiro del cerebro, el tejido fue fijado por un periodo adicional de 90 minutos en el mismo fijador, y crioprotegido en sucrosa amortiguada (10% por 24 horas, 30% por 2 días) a +4°C. El mesencéfalo completo fue cortado con un criostato utilizando un diseño de toma de muestra aleatoria uniforme, sistemática, donde se tomaron secciones frontales de 40 µp? de espesor para seis series rostrocaudales paralelas. Una serie de secciones fue mantenida en PBS 0.1 M y la señal fluorescente fue inmediatamente convertida a una señal permanente de diaminobencidina (DAB) utilizando un protocolo modificado previamente descrito (Singleton y colaboradores, J. Neurosci. Meth. 64:47) . De este modo, las secciones que flotan libremente, recién cortadas, tomadas como muestra, fueron sumergidas por 10 minutos en H2O2 al 1% en Tris 0.1 M (pH 8.2) y luego lavadas en amortiguador solo. Luego el tejido fue preincubado en la oscuridad por 60 minutos a +4°C con DAB filtrado (1.5 mg/ml de amortiguador Tris pH 8.2), enjuagado en amortiguador Tris y luego montado sobre un portaobjetos de vidrio y cubierto con solución DAB fresca, la cual fue reemplazada con solución fresca cada 30 minutos durante el proceso de fotoconvers ión . En cada portaobjetos de muestra, la sustancia nigra fue identificada y la sección fue irradiada con luz ultravioleta utilizando un objetivo 10x y un filtro de rodamina en un microscopio de epif luorescencia (Nikon) . El proceso de fotoconversión fue cuidadosamente evaluado y cuando toda la señal fluorescente en la sustancia nigra fue visualizada con el producto DAB café, las secciones fueron inmunohistoquimicamente marcadas con un marcador (Vector SG, Vector) para las neuronas de dopamina ( tirosina-hidroxilasa) utilizando el sistema de avidina-biot ina-inmunoperoxidasa (Vector) (Janson y colaboradores Neuroscience 57:931) . Las cinco series paralelas de secciones fueron en vez de esto almacenadas en sucrosa al 30% en PBS 0.1 M a -20°C hasta que éstas fueron procesadas para la inmunohi s toquimica , y analizadas en un microscopio de exploración láser confocal utilizando varios marcadores para las glias y las neuronas (con controles apropiados) para determinar el fenotipo neuronal de las células marcadas con Dil en la sustancia nigra parte compacta (Figura 8) . Estimados cuantitativos del número total de cuerpos celulares inmunoreact i os a TH contrateñidos con violeta de cresilo ( TH/CV+neuronas ) asi como los cuerpos celulares inmunorreact ivos a TH que también contenían el marcador Dil se realizaron en el SNC bilateral. Las cuentas neuronales fueron determinadas utilizando secciones codificadas y una -técnica es tereológica, el fraccionador óptico (Janson y colaboradores, Neuroscience 57:931) . En resumen, las secciones muestreadas no desviadamente en el orden rostrocaudal fueron analizadas con un sistema CAST-Grid (Computer Assisted Stereological Toolbox. Olympus, Albertslund, Dinamarca), que consiste de una cámara de vídeo sobre un microscopio Olympus BH2 con una platina de espécimen motorizada y un microdispositivo para verificar periódicamente (microcator) los movimientos en el eje z (Haidenhain, Traunreut, Alemania); ambos están conectados a una PC con dotación lógica informática (software) GRID y una pantalla de alta resolución. Después de rodear el área de SNc en cada sección muestreada a baja amplificación, el análisis se realizó a alta amplificación (aceite de inmersión lOOx, apertura numérica 1.4) . Esto permitió una clara visual i zación de las células individuales en el área circulada densamente poblada, como el foco movido a través del tejido, el cual fue ópticamente disectado en rebanadas delgadas y evaluado por el dispositivo para verificar periódicamente (microcator) con una resolución de 0.5 µ??. Un muestreo aleatorio sistemático, uniforme, computari zado de pequeños volúmenes (extendiéndose de 6 a 9 µp? a lo largo del espesor de la sección) fue llevado a cabo; las neuronas con sus nucléolos dentro del volumen de toma de muestra que cumplieron los criterios estereológicos, fueron contadas en una fracción conocida del volumen nigral completo. Como se describió al principio (Chan y colaboradores, J. Pharmacol. Exp. Ther. 280:439), las neuronas nigrales fueron contadas si éstas mostraban pericariones teñidos con Nissl y la iniriunorreact ividad con TH dentro del cuerpo celular y/o sus dendritas. En la serie de secciones donde la señal de Dil fue fotoconvert ida, las neuronas TH+ que contenían Dil fueron contadas (evaluación a 3,600x) . Se determinó el coeficiente de error para cada estimado del número total de neuronas marcadas en diferentes categorías. Las cuentas obtenidas son independientes de cualesquiera cambios dimensionales e el. tejido durante el procesamiento tal como el encogimiento, que se determinó a lo largo del eje z. El número total de neuronas dopaminérgicas nigrales en diversos puntos de tiempo (unas pocas horas hasta 60 días) fue trazado gráficamente contra el tiempo, y a partir de la curva de regresión (r2 = 0.97) se encontró que 175 nuevas neuronas fueron generadas cada semana en esta región cerebral, que es alrededor de uno por ciento del número total de neuronas dopaminérgicas nigrales en el ratón. Varias corrientes migratorias de células marcadas con Dil fueron caracterizadas conforme éstas alcanzaban diferentes partes de la sustancia nigra parte compacta (no conocida o descrita anteriormente, Figura 9) . Con la aplicación de un protocolo modificado para el conteo de células utilizando un microscopio fluorescente, está siendo determinado el número total de células en cada una de las corrientes migratorias definidas. La interpretación de que las neuronas marcadas con Dil fueron por supuesto recién generadas, fue confirmada con marcación con BrdU en animales que recibieron administración crónica vía el agua para beber (1 mg/ml, ver ejemplo anterior, o mediante inyecciones intraperitoneales repetidas de BrdU) . Además, la evidencia de que las "nuevas" neuronas eran funcionales y desarrollaban procesos neuronales apropiados para las neuronas en proyección, fue apoyada por el hallazgo de Dil y/o BrdU en algunas de las neuronas nigrales TH+ que también demostró un marcador del cuerpo . celular retrógradamente transportado desde la región terminal nerviosa en el cuerpo estriado ( FluoroGold) . 12. La progenie de células totipotenciales ependimari a s marcadas incluyen neuronas en varias regiones cerebrales y de diversos fenotipos Utilizando el protocolo de marcación fluorescente in vivo descrito anteriormente, se identificaron varias regiones del cerebro donde las células marcadas con Dil fueron identificadas como neuronas. Estas regiones incluyen varias partes del hipocampo, incluyendo la capa granular de la circunvolución dentada (Figura 10), las capas corticales y las estructuras subcorticales presumiblemente tales como las neuronas que contienen ácido gamma-aminobut i ico (GABA) en las regiones subtalámica y de la sustancia nigra parte reticulada, .asi como las neuronas serotoninérgicas en los núcleos cerebrales raphe y las neuronas noradrenérgicas en el locus coeruleus. 13. Generación de células totipotenciales genéticamente modificadas in vitro Las células totipotenciales manipuladas mediante ingeniería genética fueron generadas mediante el cultivo de las células totipotenciales como se describe anteriormente, y luego t rans fectándolas con los plásmidos de expresión o los vectores virales. Para cada t rans f ección, se agregaron 4 _ µg del ADN (el método fue establecido utilizando el plásmido CMV-GFP de Clontech, que codifica para la proteína fluorescente verde (GFP) como un reportero) a 200 µ? de medio de cultivo (definido anteriormente) en un tubo cónico de 12 x 75 mm (15 mi) y suavemente mezclado. En un segundo tubo cónico se agregaron 15 µ? de reactivo Lipo fectamine en 200 µ? de medio de cultivo y se agitaron en torbellino suavemente. Las dos soluciones fueron luego combinadas mediante la adición de la segunda a la primera, e incubadas a temperatura ambiente por 45 minutos para permitir que se formaran los complejos de ADN-liposoma . Luego se agregaron 1.6 mi de medio de cultivo al tubo con los complejos de ADN-liposoma y esta solución se superpuso sobre las células (las cuales tenían la mayor parte de su medio cuidadosamente retirado) . Las células fueron incubadas 12 horas y luego el medio fue reemplazado con el medio de cultivo regular sin ADN. La detección de GFP fue realizada en un microscopio de fluorescencia 48-72 horas después de la t rans fección . Estas células totipotenciales pudieron ser clonalment e expandidas para generar esferas de células totipotenciales no diferenciadas, genéticamente modificadas. 14. Expresión alterada del gen en las células totipotenciales in vivo La factibilidad de la alteración de la expresión génica en las células totipotenciales in vivo fue realizada mediante la inyección de un adenovirus deficiente en replicación que lleva el gen reportero LacZ bajo el control del promotor RSV dentro de los ventrículos laterales como se describe anteriormente. La tinción con X-gal (descrita anteriormente) demostró la expresión de un gen repo'rtero en las células totipotenciales ependimar ias , y de este modo la factibilidad de la alteración de la expresión del gen en las células totipotenciales. Están siendo generadas células totipotenciales que poseen genes que impulsan la expresión del factor de crecimiento nervioso, el factor neurotrófico derivado de la linea de células gliales (factor de supervivencia neuronal), bcl-2 (un gen que promoverá la supervi encia de las células totipotenciales) y nurr 1 (el cual puede promover la generación de neuronas dopaminérgicas a partir de células totipotenciales) . 15. El uso de células totipotenciales provenientes de animales transgéni eos Se ha encontrado que es posible cultivar las células totipotenciales provenientes de animales transgénicos . Para estos estudios se han utilizado ratones que poseen el gen LacZ en su genoma (Zambrowicz y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci . Estados Unidos de América) . Estos ratones expresan el transgen ubicuamente en todos los tejidos (Zambrowicz y colaboradores. Proc. Nati. Acad. Sci Estados Unidos de América) . Las células totipotenciales provenientes de estos ratones fueron purificadas y cultivadas como se describe anteriormente. La expresión transgénica fuerte fue revelada mediante tinción con X-gal como se describe anteriormente. 16. Manipulación de proliferación de células totipotenciales y diferenciación por daño traumático En ratas adultas se realizó una laminectomia a nivel toráxico intermedio, para exponer la médula espinal, y el funículo dorsal fue cortado transversalmente con tijeras microquirúrgicas , y la lesión fue subsecuentemente extendida rostralmente por una incisión longitudinal superficial en el funículo dorsal. En otros animales, se perforó un orificio en el cráneo y se insertó una aguja dentro del tejido cerebral para inducir un daño. En algunos animales las células ependimarias habían sido marcadas 1 a- 10 días antes del daño por una inyección con Dil como se describe anteriormente. La cuanti f icación de la proporción de las células ependimarias que proliferan a diferentes puntos de tiempo después de una incisión en el funículo dorsal reveló un incremento de casi 50 veces 1 día después del daño, en comparación a los animales no dañados (Figura 5) . Después del primer día, la proliferación declinó gradualmente hacia lo normal dentro de un mes (Figura 5) . De igual modo, la proliferación de células ependima ias fue incrementada en gran medida en la pared del ventrículo lateral después del daño cerebral. En animales en los cuales las células ependimarias fueron marcadas con una inyección con Dil antes del daño a la médula espinal o al cerebro, se observaron un número cada vez mayor de células marcadas con Dil progresivamente fuera de la capa ependimaria en las primeras cuatro semanas después del daño (Figura 6) . Las células marcadas con Dil fueron abundantes en la formación del tejido cicatrizante dentro de una semana después de la lesión y persistieron allí por al menos un año. Dentro de la formación del. tejido cicatrizante en el daño o herida, la gran mayoría de las células marcadas con Dil mostraron inmunorreact ividad a la proteína ácido fibrilar glial, un marcador de astrocitos, indicando que la mayor parte de la progenie proveniente de células ependimarias se había diferenciado a astrocitos (Figura 6) . No obstante, no se encontraron marcadores neuronales en las células marcadas con ~DiI indicando que las señales requeridas para la transformación neuronal de las células totipotenciales no estaban presentes en este modelo animal. 17. Productos químicos que incrementan la neurogénesi s en la sustancia nigra parte compacta en el mesencéfalo A ratones separados se les administró 1-metil-4-fenil-1 , 2, 3, 6-t e t rahidropiridina (MPTP, RBI, Natick, MA, Estados Unidos de América) (40 mg/kg diluido en solución salina fisiológica, subcutáneamente) . Esta sustancia es conocida por sus acciones neurotóxicas selectivas sobre las neuronas dopaminérgicas en el mesencéfalo, provocando parkinsonismo en humanos y en animales experimentales (Langston y colaboradores, Science 219:979, Heikkila y colaboradores, Science 224:1451) . No obstante, la molécula tiene también estructuras en común con los compuestos que se sabe actúan como agentes neuroprotectores en modelos animales del mal de Parkinson, por ejemplo, nicotina (Janson y colaboradores, Neuroscience 57:931) . En los presentes experimentos, a los animales se les administró MPTP o vehículo y el curso de tiempo de los cambios en el número de células dopaminérgicas nigrales Dil+ o en el patrón de tinción de las corrientes migratorias de células Dil+ que se mueven hacia esta región cerebral, fueron analizados (ver arriba, el método cuantitativo para estudiar la neurogénesis en la sustancia nigra parte compacta en el mesencéfalo después de la marcación de las células ependimarias ) . El tratamiento condujo a mayores números de neuronas nigrales TH+/DÜ+ asi como TH+/BrdU+ indicando una neurogénesis incrementada. También, las corrientes migratorias de células Dil+ en el mesencéfalo parecieron más pronunciadas en animales tratados con MPTP, que pueden ser analizados cuantitativamente utilizando el método estereológico modificado descrito anteriormente. 18. Trasplante de células totipotenciales ependimarias Las células totipotenciales ependimarias provenientes del cerebro o de la médula espinal de ratones transgénicos Rosa 26 fueron purificadas y cultivadas como se describe anteriormente. Las esferas de células totipotenciales no diferenciadas provenientes de estos ratones, fueron trasplantadas hacia el cuerpo estriado de ratas adultas, mediante inyección estereotáxica de las esferas en 15 µ? de su medio de cultivo (descrito anteriormente) . Los animales fueron sacrificados 2 días después y los cerebros seccionados y analizados para la presencia de las células que expresan LacZ que se derivan de los ratones Rosa 26 por tinción por X-gal como se describe anteriormente. Las células injertadas fueron dispersadas en el tejido cercano al canal de inserción. Estas células frecuentemente tuvieron varios procesos (Figura 7) . 19. Desarrollo de ensayos para selección de alto rendimiento de sustancias que influyen sobre la diferenciación de las células totipotenciales neural es Son desarrollados los sistemas de prueba para evaluar eficientemente la habilidad de las sustancias para promover la diferenciación de las células totipotenciales neurales ependimarias en un fenotipo particular glial o neuronal . Tales sustancias podrían ser luego probadas in vivo como se describe anteriormente. 20. Amplío potencial de las células totipotenciales neurales cerebrales de adulto para generar tejidos de todas las capas germinales 20 a. Cultivo de SNC La pared lateral de los ventrículos laterales fue enzimáticamente disociada como se describe anteriormente (Johansson y colaboradores, Cell, 96:25) . El medio de cultivo consistió de 20 ng/ml de EGF (Collaborative Biomedical Products), suplemento B27 (Life Techonologies ) , glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, y 100 µg/ml de estreptomicina en medio DMEM-F12 (Life Technologies) . · Se agregó EGF (20 ng/ml) al medio cada 48 horas después de la siembra en placa inicial de las células. 20 b. Análisis de ARN Los ARN tisulares fueron extraídos utilizando RNeasy (Qiagen), y 500 ng del ARN total fueron transcritos inversamente en ADNc utilizando Superscript II (Life Technologies) y hexámeros aleatorios (Pharmacia) en un volumen de reacción de 50 µ? bajo condiciones recomendadas por el fabricante. Las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo en presencia de cloruro de magnesio 2.5 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8.8 a 25°C), cloruro de potasio 50 mM, 0.08% de Nonidet P40, 0.2 mM de cada uno de dNTP , 5 U de ADN-polimerasa Taq (Fermentas), 0.1 mg/ml de BSA, 50 pmoles de cada cebador oligonucleotidico y en presencia de alfa [32P] dCTP . Para normalizar los rendimientos del ADNc, se realizó una reacción de PCR semicuantitativa utilizando cebadores específicos para el ADNc que codifica para la ß-galactos idasa en combinación con cebadores específicos para la proteína riO.bosomal L19. Se utilizaron cuarenta ciclos de 94°C (1 minuto), 64°C (1 minuto) y 72°C (1 minuto) para amplificar la ß-galactos idasa con el siguiente par de cebador oligonucleotidico: oligonucleótido en sentido 5'TTG GAG TGA CGG CAG TTA TCT GGA-3' (SEQ ID. NO. 1) y oligonucleótido antisentido 5'-TCA ACC ACC GCA CGA TAG AGA TTC-3' (SEQ. ID. NO. 2) . Después de 25 ciclos, la reacción fue suplementada con 5 U de ADN-polimerasa Taq y los cebadores oligonucleotídicos específicos para L19 fueron agregados como un control interno: oligonucleótido en sentido 5' -CCT TGG ACA GAG TCT TGA TGA TCT CCT-3' ( SEQ . ID NO 3) y oligonucleótido antisentido 5'-CTT CTC AGG AGA TAC CGG GAA TCT AAG-3' (SEQ.ID. NO 4) . 20 c. Inmunohi stoquímica Secciones de criostato y células cultivadas se incubaron con anticuerpos primarios 1 hora a 37 °C o toda la noche a 4°C, se enjuagaron en PBS, y se incubaron con antisuero secundario por 45 minutos, a temperatura ambiente. 20 d. Agregación de mórulas e inyección de blastoci tos Las esferas proliferantes de células fueron t r ips ini zadas dentro de 4 a 6 días después de su aislamiento inicial y se resuspendieron en IX PBS para la agregación o microinyección . Las células totipotenciales neurales fueron ya sea agregadas con mórulas CD-1 o inyectadas en blastocitos derivados de ratones C57BL e implantadas en madres sustitutas utilizando técnicas y procedimientos estándares. 20 e. Integración de células totipotenciales neural es en la masa celular interna de los blastoci tos Con el fin de analizar el potencial diferenciador de las células totipotenciales neurales de adulto, se evaluó la habilidad de estas células para contribuir a la formación de diferentes tejidos mediante introducción de células totipotenciales neurales de adulto en el ambiente embrionario primario y siguen el destino de su progenie . Las células totipotenciales neurales muí t ipotentes pueden ser propagadas a partir de tejido cerebral y de la médula espinal de adulto disociado, bajo ciertas condiciones de cultivo. Bajo estas condiciones, las células simples proliferan y la progenie forma un cúmulo de células agregadas. Tales clones celulares se desprenden de la caja de cultivo después de. unos pocos días in vitro. En presencia de mitógenos tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) o el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), las células continúan proliferando y forman un agregado característico de células esferoides, denominado como neuroesfera, de células apretadamente acumuladas, todas las cuales son derivadas de una célula simple (Reynolds y colaboradores, Science 255: 1707) . Para probar inicialmente si las células totipotenciales neurales derivadas . de adulto pueden sobrevivir en el microambiente de la embr iogénesis muy temprana, las esferas simples de células totipotenciales neurales o de numerosas células simples enz imáticamente disociadas fueron inicialmente agregadas con mórulas compactadas de 8 células y se les dejó continuar su desarrollo in vitro casi hasta la etapa de blastocitos. Ya que las células totipotenciales neurales fueron cultivadas a partir de ratones Rosa 26 los cuales expresan ubicuamente la ß-galactos idasa derivada de Escherichia coli, estas células y su progenie pudieron ser fácilmente identificadas después de la fijación y tinción. En los blastocitos primarios, muchas de las células totipotenciales neurales parecieron acoplarse y proliferar sobre el t ro fectoderma externo (Figura 11A) . No obstante, una pocas de las células fueron capaces de entremezclarse con las células de mórula y fueron encontradas en la masa celular interna de los blastocitos en desarrollo (Figura 11B) . Ya que estas células totipotenciales neurales pudieron agregarse exitosamente con mórulas en etapa de 8 células y sobrevivir en la masa celular interna a la etapa de blastocito primario del desarrollo, fue plausible asumir que estas células pueden ser capaces de contribuir, al menos en parte, a la formación del sistema nervioso central embrionario o posiblemente a otros tejidos embrionarios. Una contribución más eficiente de las células totipotenciales neurales a la masa de células interna, fue adquirida mediante inyección de las células directamente dentro de los blastocitos primarios . 20 f. Las células totipotenciales neurales de adulto pueden contribuir a la generación de embriones de ratón quimérico Para probar la habilidad de las células totipotenciales neurales de adulto para contribuir a la generación de diferentes tejidos, los blastocitos C57/BL6 inyectados con 10 a 20 células totipotenciales neurales simples fueron transferidos a madres sustitutas y se les dejó desarrollar hasta el día embrionario 11. Los embriones fueron fijados en paraformaldehído y la expresión de LacZ fue evaluada mediante histoquímica X-gal e inmunohistoquímica con anticuerpos contra ß-galactosidasa . Otros embriones fueron utilizados para detectar la presencia del ARNm de la ß-galactosidasa utilizando RT-PCR. El examen de los embriones de montaje completo Ell teñidos para detectar la presencia de ß-galactosidasa derivada de las células totipotenciales neurales de adulto de ratones Rosa26, reveló grados variantes de quimerismo en los embriones analizados. Dentro de las carnadas, existió un alto grado de variación en el grado de quimerismo, y en todas las carnadas existieron siempre varios embriones los cuales carecieron completamente de células que expresan LacZ. Los embriones quimérios fueron de tamaño similar que los embriones no quiméricos, y no mostraron ninguna anormalidad anatómica manifiesta. Un embrión que mostró un alto grado de quimerismo es mostrado en la Figura 11, junto con un control no inyectado C57/B16 de tipo silvestre. El examen superficial del embrión derivado de un blastocito inyectado, revela contribución extensa de las células totipotenciales neurales derivadas de Rosa26 a la médula espinal ventral, el mes encé falo , los ojos, el corazón y a muchos otros órganos y tejidos internos. Los embriones que muestran menos contribución proveniente de las células totipotenciales neurales derivadas de Rosa26, mostraron principalmente tinción ya sea en el área de la unión intestino medio-intestino caudal o en el corazón. Un nivel relativamente bajo de tinción endógena fue frecuentemente observado en el embrión de tipo silvestre en el área de las vesículas óticas y en las venas umbilicales. No obstante, no se observó actividad endógena adicional en otras áreas de los embriones de tipo silvestre examinados. La especificidad de la tinción de X-gal en embriones quiméricos fue confirmada mediante marcación inmunohis toquímica de traslape con antisueros contra ß-galactosidasa . Las áreas que mostraron actividad similar a la ß-galactos idasa endógena en embriones de tipo silvestre, no se marcaron con antisueros contra ß-galactosidasa . Además, para probar la contribución de las células derivadas de Rosa26 de una manera todavía independiente, se utilizó RT-PCR para evaluar la presencia del ARNm de ß-galactos idasa en el ARN total aislado de embriones Ell inyectados con células totipotenciales neurales de adulto o a partir de los controles tipo silvestre no inyectados. Los embriones utilizados en este análisis fueron disectados transversalmente en tres secciones: cabeza (incluyendo los arcos braquiales), el área toráxica (por debajo de los arcos braquiales y por arriba del cordón umbilical) y la región caudal del embrión (incluyendo el área umbilical, las patas traseras y la cola) . Los cebadores oligonucleotidicos específicos para el gen de la ß-galactosidasa fueron utilizados para amplificar el ADNc obtenido a partir de cada una de las secciones embriónicas. Dos cebadores oligonucleotidicos adicionales, específicos para la detección del ARNm de L19, una proteína ribosomal, fueron también agregados a la reacción de PCR para servir como un control interno. El ARNm de la ß-galactosidasa no fue detectado en las muestras tomadas de los embriones no inyectados, mientras que una señal moderada fue observada predominantemente en la cabeza y en la región toráxica de los embriones que contenían el pulmón y el intestino medio. Esta distribución de expresión de LacZ fue consistente con el patrón observado en la tinción de montaje completo de otros embriones, para detectar el patrón de expresión del producto del gen de la ß- galactosidasa . 20 g. Las células totipotenciales neurales de adulto pueden participar en la generación de tejidos de todas las capas germinales Los ejemplos de las secciones de embriones quiméricos que muestran niveles máximos de contribución quimérica observados en tejidos provenientes de embriones inyectados con células totipotenciales neurales de adultos, se muestran en las Figuras 12 y 13, respectivamente. Las células totipotenciales neurales de adulto contribuyen significativamente a algunos tejidos de origen ectodérmico en el embrión de ratón Ell. Dentro de la región craneal, la contribución fue más aparente en las regiones ventral y media de la médula espinal, la lámina terminal del telencéfalo, el infundibulo del diencéfalo, el tallo óptico, la capa retinal y el cristalino del ojo, la cóclea del oído interno, y las plácodas nasales. Dentro de la región toráxica no obstante, puede ser observada ' comparativamente menor' contribución de las células totipotenciales neurales de adulto en el tejido derivado del ectoderma, de manera más notable hacia la epidermis . Una alta contribución quimérica de las células totipotenciales neurales derivadas del adulto puede también ser observada en tejidos derivados del endoderma embrionario definitivo. Esto es predominantemente observado en la región faríngea, la cual incluye el intestino anterior, la lengua, la cavidad oral, las bolsas faríngeas, y la glándula tiroides. Dentro de la región toráxica, la contribución de los tejidos de origen endodérmico fue también significativa en el esófago, la tráquea, las yemas pulmonares, el estómago, el intestino, el páncreas, y el hígado. Varios tejidos de origen mesodérmico también muestran un alto nivel de contribución proveniente de las células totipotenciales neurales de adulto. Estos ejidos incluyeron el notocordio, el miocardio que comprende las paredes atrial y ventricular del corazón, la aorta dorsal, y el primordio del reborde genital y los tubos mesonéfricos . No obstante aquí, es también importante hacer notar la contribución comparativamente reducida de las células totipotenciales neurales derivadas del adulto al desarrollo del músculo esquelético y del hueso. 20 h. Diferenciación a tipos celulares específicos de tejido Para analizar si las células que expresan LacZ derivadas de la célula totipotencial neural del adulto encontrada en los embriones quiméricos se habían diferenciado en tipos celulares típicos del tejido en los cuales éstas habían sido integradas, se estudió la expresión de distintos marcadores celulares expresados por las células que comprenden normalmente algunos de estos tejidos. Se utilizó la tinción inmunohistoquímica doble para demostrar la expresión traslapada de la ß-galactosidasa con los anticuerpos monoclonales específicos para Tujl, HB9, tirosina-hidroxilasa (TH) . Puercoespín sónico (Shh), actina y Desmina de músculo liso (Figuras 12 y 13) . Estos anticuerpos detectan la ß-tubulina III (específica para los microtúbulos axonales), neuronas motoras, neuronas dopaminérgicas , células productoras de Shh encontradas en la médula espinal ventral, músculo liso que reviste muchas arterias y venas, y un filamento intermediario encontrado en el músculo cardiaco y esquelético, respectivamente. Se utilizan anticuerpos adicionales para detectar la co- local i z ación de las células que secretan insulina o glucagón del páncreas con aquella de la ß-galactosidasa .

Discusión La pérdida de células es un factor común en muchos tipos de desórdenes del sistema nervioso. Distintos tipos celulares son afectados en diferentes enfermedades, por ejemplo, las neuronas dopaminérgicas en el mal de Parkinson, las neuronas motoras en la esclerosis lateral amiotrófica y los oligodendrocitos en la esclerosis múltiple. Varios tipos de células diferentes en una cierta área pueden ser afectados en otras situaciones, tales como apoplejía o daño traumático. Actualmente, no son disponibles métodos en la práctica clínica para estimular la generación de nuevas células en el sistema nervioso. El trasplante de células provenientes de embriones humanos o animales ha sido probado clínicamente con algunos resultados alentadores. No obstante, estos métodos tienen varios problemas, principalmente éticos e inmunológicos , lo cual hace muy improbable que éstos sean utilizados en algún número más grande de pacientes. La reciente comprobación de que existe una población de células totipotenciales muí t ipotenciales en el sistema nervioso central del adulto, ha alentado la esperanza de que puede ser posible estimular la generación de nuevas células en el sistema nervioso central del adulto a partir de las propias células totipotenciales del paciente. No obstante, han permanecido algunas pocas cuestiones clave sin responder, y han hecho difícil el proceder en este campo. La presente identificación de la célula totipotencial ha hecho ahora posible el desarrollar métodos para purificar estas células, estudiadas cuantitativamente in vivo, modificarlas genéticamente y estimularlas con compuestos farmacéuticos diversos in vitro e in vivo. Además, la presente invención proporciona evidencia de que las células totipotenciales siguen nuevas vías migratorias hacia diversos grupos de células neuroanatómicas en el SNC y que éstas son capaces de transformarse en neuronas in vivo. La invención también comprende un método cuantitativo no desviado para evaluar la neurogénesis en diversas regiones del cerebro asi como las técnicas para analizar el número total de células totipotenciales y su progenie que migra hacia diversas regiones del cerebro. Conjuntamente, los desarrollos proporcionados por la presente invención incrementan en gran medida las posibilidades de desarrollar estrategias para estimular la generación de nuevas células en el sistema nervioso central. La alteración de la expresión de los genes en las células puede hacer a estas células que produzcan una proteina dada de elección o puede prevenir la producción de una proteina no deseada. La manipulación de los genes de las células in vitro o in vivo de acuerdo con la presente invención puede ser benéfica en una amplia variedad de situaciones. Por ejemplo, las células manipuladas mediante ingeniería genética para expresar un factor de crecimiento, citocina, hormona o cualquier otra proteína pueden ser trasplantadas a individuos los cuales pueden necesitar la administración continua de tal proteína para estimular, por ejemplo, la señalización celular o la supervivencia celular. Las células de este modo servirán como administradores continuos para una sustancia farmacéutica. Las células para tal uso pueden ser genéticamente manipuladas, por ejemplo mediante transfección con vectores plasmídicos o virales, o las células pueden ser tomadas de los organismos transgénicos. Los organismos transgénicos que comprenden células de acuerdo a la presente invención están también dentro del alcance de la presente invención. Además, la expresión génica puede ser alterada in situ en un organismo, mediante la inducción de la expresión génica ectópica con vectores plasmídicos o virales, asi como los fragmentos de ADN o ARN antisentido. Bajo ciertas condiciones, puede ser valioso el utilizar las células que carecen de un cierto gen o producen niveles menores del producto génico. Por ejemplo, el trasplante de células o tejidos entre diferentes individuos está limitado por la expresión de ciertas células sobre las superficies de las células lo cual induce que el sistema inmune del huésped rechace el injerto. Esto es un problema mayor, especialmente si los dos individuos son de diferentes especies. Una manera para evitar este problema es generar células modificadas genéticamente o animales modificados genéticamente que carecen de genes que inducen el rechazo po un sistema inmune del huésped. Otras implicaciones importantes para la manipulación de la expresión del gen en células in vitro o in vivo incluyen la inducción de la diferenciación de una célula no diferenciada hacia un cierto destino celular o la estimulación de la supervi encia de las células mediante la supresión de las señales de muerte celular intrínseca o extrínseca. Además, al introducir ciertos genes es posible inmortalizar las células y generar líneas celulares clónales con características especiales. Ya que la identidad y la localización de las células totipotenciales neurales en el sistema nervioso central del adulto han sido desconocidas, ha sido difícil previamente el modificar estas células genéticamente, especialmente in vivo. La invención de los métodos para purificar las células totipotenciales en cultivo celular, permite todos los tipos de manipulación genética, por ejemplo la transfección de estas células con vectores de expresión plasmídicos o virales o la purificación de las células a partir de organismos transgénicos o la supresión de la expresión del gen por ejemplo con los fragmentos de ADN o ARN antisentido. La localización de la célula totipotencial in vivo permite la alteración de la expresión génica en estas células in situ, por ejemplo con vectores virales .

Anteriormente, se ha demostrado que las células totipotenciales provenientes de cerebro del adulto pueden contribuir a la formación de tejidos múltiples que se derivan de todas las capas germinales en los embriones de ratones quiméricos. La progenie de las células totipotenciales neurales expresa marcadores específicos tisulares adecuados para los tejidos en los cuales éstas se integran, y los cuales no son expresados en el sistema nervioso. Éstas se integran y diferencian de una manera funcional. Quizás el ejemplo más sorprendente de esto es la contribución grande y frecuente de la progenie de las células totipotenciales neurales al corazón; la funcionalidad de las células fue aquí obvia por un corazón latente de anatomía normal aparent e .

Control epigenético de la diferenciación celular El destino celular de los progenitores que surgen de estas células totipotenciales en tejidos específicos no puede ser automáticamente determinada, pero es determinado por la exposición de la célula a un grupo reproducible de señales extrínsecas. De hecho, en la caracterización de la progenie de células totipotenciales neurales, existe evidencia creciente de que los factores de crecimiento extrínsecos pueden directamente modificar el destino de las células totipotenciales neurales, desviando la diferenciación subsiguiente. Si las poblaciones de células totipotenciales clónales derivadas del hipocampo de roedor son transitoriamente expuestas al factor neurotrófico ciliar (CNTF) , éstas producen astrocitos a expensas de las neuronas; si éstas son transitoriamente expuestas a la hormona tiroidea (T3), éstas producen oligodendroci tos a expensas de las neuronas. Se observan los mismos resultados con células totipotenciales neurales embrionarias o de adulto (Johe y colaboradores, Genes Dev. 10:3129) . Estos datos sugieren que los factores de crecimiento afectan directamente el destino de las células totipotenciales, dando como resultado la producción de células progenitoras comprometidas para la generación de neuronas, astrositos, o oligodendrocitos . Han sido observados resultados similares utilizando células de la cresta neural clonalmente cultivadas; BMP2 induce las neuronas autonómicas; el factor de crecimiento glial induce el destino de las células Schwann, y el factor ß de crecimiento transformante (TGF-ß) induce la diferenciación del músculo liso ( Shah y colaboradores, Cell 77:349; Shah y colaboradores, Cell 85:331) . Estos datos sugieren que las diferencias regionales en la expresión del gen pueden no conducir a poblaciones molecularmente diferentes de las células totipotenciales y que las diferencias inherentes en el destino de las células totipotenciales puede ser modificado fácilmente por exposición a señales extrínsecas.

¿Carecen las células totipotenciales neurales del adulto de la restricción de línea o éstas se desdiferencian? Los experimentos de trasplante en embriones primarios han definido los puntos de tiempo cuando las células se llegan a restringir a ciertas líneas. El compromiso hacia un cierto destino es impuesto por la expresión de combinaciones específicas de genes. Los experimentos in vitro han demostrado el potencial de las células totipotenciales neurales de adulto para generar neuronas y células gliales. En la primera consideración, es por lo tanto natural asumir que una célula totipotencial neural de adulto necesita sufrir desdiferenciación con el fin de generar células de una linea diferente. No obstante, es notorio que muchos de los genes implicados en dar a una célula una cierta identidad de linea y una restricción, son expresados transitoriamente durante el desarrollo embrionario. La expresión de los genes que determinan la linea puede no ser necesaria después del desarrollo de un tejido ya que una población de células totipotenciales puede ser físicamente restringida a ese tejido particular y el ambiente molecular puede incitar a , destinos específicos tisulares sobre nuevas células. De este modo, es posible que las células totipotenciales del sistema nervioso central del adulto hayan perdido su compromiso neural . Definiendo la multipotencia de las células totipotenciales que residen en el sistema nervioso central del adulto, puede ser de ayuda para comenzar a comprender los eventos moleculares complejos necesarios para las células totipotenciales neurales del adulto, o las células totipotenciales en general, para dejar su estado en reposo y entrar a una fase proliferativa, para producir progenitores con un destino celular determinado. Existen indicaciones de que otras poblaciones de células totipotenciales pueden tener un más amplio potencial de diferenciación en el adulto que en el embrión. Por ejemplo, las células totipotenciales hematopoyé ticas trasplantadas al cerebro pueden generar astrocitos. Esto eleva la posibilidad de que las células totipotenciales en diferentes tejidos de adulto puedan ser muy similares y tengan un potencial cercano a las células totipotenciales embrionarias. De hecho, es posible que exista únicamente una población de células totipotenciales fundamentales que existe en el organismo del adulto. Para dirigirse más directamente a la potencia celular de las células totipotenciales neurales derivadas de la pared ventricular lateral del cerebro del adulto, se han colocado estas células en el microambient e de blastocitos primarios y se ha encontrado que estas células contribuyen a numerosos órganos y tejidos que son originalmente derivados de tres capas germinales durante el desarrollo embrionario. En resumen, la presente invención hará posible desarrollar nuevas estrategias de tratamiento en diversas enfermedades del SNC, no solamente en enfermedades con una progresión lenta de la neurodegeneración (incluyendo la enfermedad de Al zheimer , el mal de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica, la esclerosis múltiple) sino también en situaciones clínicas de trauma agudo a la cabeza o a la médula espinal, asi como en enfermedades cerebrovasculares . El presente hallazgo de que las células totipotenciales pueden transformarse en varios fenotipos neuronales diferentes (neuronas dopaminérgicas , neuronas GABA, neuronas serotoninérgicas ) asi como en tipos de tejidos completamente diferentes abren posibles aplicaciones más allá de las enfermedades anteriormente mencionadas, donde la pérdida celular es central al desarrollo de la enfermedad, en las nuevas áreas posibles, incluyendo la depresión y otros desórdenes mentales, asi como la cirugía cardiaca . Se citan en la presente diversas publicaciones, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en sus totalidades. La presente invención no está limitada en alcance por las modalidades específicas descritas, que se pretende como ilustraciones simples de aspectos individuales de la invención, y los métodos y componentes funcipnalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. Por supuesto, las diversas modificaciones de la invención, además de aquellas mostradas y descritas en la presente, se volverán aparentes por aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y de los dibujos anexos. Tales modificaciones se pretende que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Una célula totipotencial del sistema nervioso central, neural, ependimar i a , aislada, célula que expresa la proteina superficial Noten 1 junto con al menos una proteina superficial elegida del grupo de Notch 2, Noten 3, CAR (proteina t ransmembranal que se enlaza al adenovirus) y CFTR (regulador de la conductancia t ransmembranal de la fibrosis quistica), y célula que también comprende al menos un cilio.

2. Una célula totipotencial del sistema nervioso central neural, ependimaria, aislada, de conformidad con la reivindicación 1, que se origina de un mamífero, tal como un roedor o un humano.

3. Un método para aislar células totipotenciales del sistema nervioso central neurales, ependimarias , a partir del tejido del SNC post-natal, cuyo método comprende el aislar selectivamente las células ependimarias del tejido del SNC.

4. Un método para aislar células totipotenciales del SNC neurales, ependimar ias , de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el tejido ependimario es disociado y porque las células totipotenciales del SNC neurales, ependimarias , son recuperadas de ese tejido.

5. Un método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el tejido ependimario es enzimáticamente disociado por enzimas de hidrólisis, tales como colagenasa, tripsina,, o hialuronidasa, o porque éste es disociado por el ácido cinurénico.

6. Un método de conformidad con la reivindicación 4 o la reivindicación 5, caracterizado porque las células liberadas por la disociación del tejido ependimario son mantenidas en un medio de cultivo que comprende EGF y/o FGF.

7. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-6, caracterizado porque la recuperación de las células totipotenciales del SNC neurales, ependimarias, es lograda mediante la selección de las células simples para al menos una característica de una célula totipotencial del SNC, neural, ependimaria.

8. Un método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque las células simples son seleccionadas para la presencia de Notch 1, al menos un cilio, y la expresión de al menos una proteína superficial elegida del grupo de Notch 2, Notch 3, CAR y CFTR .

9. Un método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la característica de una célula totipotencial del SNC, neural, ependimaria es una previamente realizada marcando in vivo la célula ependimaria.

10. Una preparación celular que comprende células totipotenciales del SNC, neurales, ependimar ias , cuya preparación comprende al menos 50%, preferentemente al menos 80%, y lo más preferentemente al menos 90% de células totipotenciales de SNC neurales, ependimarias .

¦ 11. Una preparación celular de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque al menos 4% de las células totipotenciales son células totipotenciales activas, por ejemplo, sufren semirrenovación y son muí t ipotentes .

12. Una preparación celular de conformidad con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, caracterizada porque ésta ha sido preparada mediante un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-9.

13. Una preparación celular de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-12, que comprende células totipotenciales del SCN, neurales, ependimar ias , genéticamente manipuladas.

14. Una célula totipotencial del SNC, neural, ependimaria, de conformidad con cualquiera de la reivindicación 1 ó la reivindicación 2, para el uso médico.

15. Una composición farmacéutica que comprende una célula totipotencial del SNC neural, ependimaria, de conformidad con cualquiera de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, junto con un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable .

16. El uso de una célula totipotencial del SNC, neural, ependimaria de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para la fabricación de una composición farmacéutica para la generación de tejido neural..

17. El uso de una célula totipotencial del SNC, neural, ependimaria de conformidad con la rei indicación 1 o la reivindicación 2, para la fabricación de una composición farmacéutica para la generación de tejido no neural, tal como tejido en el corazón, el ojo, el oído interno, el hígado, el riñon, el páncreas y otros órganos endocrinos.

18. El uso de una célula totipotencial del SNC, neural, ependimaria de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, el mal de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica, la esclerosis múltiple, el trauma agudo de la cabeza o la médula espinal, enfermedades cerebrovasculares , enfermedades musculares, enfermedades cardiacas, enfermedades en el ojo, el oído, el hígado, riñon, el páncreas y otros órganos endocrinos.