MXPA00005880A - Celulas precursoras neurologicas, metodo para la produccion y uso de las mismas en la terapia para defectos neurologicos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a células precursoras neurológicas purificadas y aisladas, a un método de producción de las mismas a partir de células troncales embrionarias en cantidades ilimitadas, al uso de células precursoras neurológicas en la terapia para defectos neurológicos, especialmente en mamíferos, preferentemente humanos, y a la obtención de polipéptidos.

Description

CÉLULAS PRECURSORAS NEUROLOGICAS MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN Y USO DE LAS MISMAS EN LA TERAPIA DE DEFECTOS NEUROLOGICOS Campo del Invento La presente invención se refiere a células precursoras neurológicas derivadas de células troncales embrionarias purificadas y aisladas, a métodos para la generación de dichas células precursoras en cantidades ilimitadas y a su uso para (I) la terapia de defectos neurológicos, particularmente en mamíferos, preferentemente siendo seres humanos y (I I) para la generación de polipéptidos. El transplante de células neurológicas en los sistemas nerviosos de los mamíferos, representa un método prometedor para el tratamiento de numerosas enfermedades neurológicas. En estudios en animales, se han injertado una variedad de poblaciones de células en el cerebro y médula espinal (Bjorklund, en: Molecular and Cellular Approaches to the Treatment of Neurological Disease, Raven, Press, New York, 1993; Brüstle & McKay, Curr. Opinión Neurobiol. 6:688-695, 1996). Recientemente, también se ha aplicado el transplante neurológico para el tratamiento clínico de enfermedades seleccionadas, por ejemplo, para el tratamiento de pacientes con el mal de Parkinsons (Lindvall, en: Neural transplantation ¡n Parkinson's disease, Raven Press, New York, 1994; Olanow y asociados, TI NS 19: 102-109, 1996).

En contraste con muchos otros órganos, el sistema nervioso de mamíferos maduros, muestra únicamente un potencial de regeneración muy limitado. Esto se debe, al hecho de que las células precursoras requeridas para la generación de tejido nervioso está, con algunas excepciones, limitada al desarrollo del sistema nervioso. La capacidad de las células precursoras es un pre-requisito clave para una reparación de defectos a base de transplantes, en el sistema nervioso maduro. Por lo tanto, las células donantes para transplantes nerviosos, son derivadas en gran medida del cerebro embrionario. Por ejemplo, se requiere el tejido cerebral de hasta siete embriones humanos, para obtener una cantidad suficiente de tejido donante para el transplante a un solo paciente de Mal de Parkinson. Esto crea enormes problemas de ética, y es cuestionable si un método puede ser usado para el tratamiento de un gran número de pacientes. Recientemente, se han realizado numerosos esfuerzos para regular la disponibilidad limitada de células cerebrales embrionarias de mamíferos, mediante proliferación in vitro de células precursoras antes del transplante. Se utilizaron dos estrategias principales. Un método comprende, la inmortalización de células precursoras con oncogenes. La mayoría de los genes utilizados para éste método, han sido originalmente aislados del tejido del tumor. Estos "genes deí tumor", son insertados en el genoma de las células y provocan un continuo y apresurado crecimiento controlado (Lendahl & McKay, TINS 13: 132-137, 1990).

Las variantes más recientes y mejor controladas de esta técnica, emplean oncogenes sensibles a la temperatura. Este método permite la proliferación in vitro de las células bajo la temperatura "tolerante". La temperatura no tolerante, es elegida para igualar la temperatura corporal, dando como resultado la inestabilidad del producto del gen y suspendiendo la proliferación después del transplante (Renfranz y asociados, Cell 66:713-129, 1991 ). Sin embargo, el oncogen permanece en las células transplantadas y, la poca actividad o reactivación al último punto, no puede ser excluida completamente. Nunca se han dirigido estrategias a la remoción del oncogen después del término de la fase de proliferación, utilizando herramientas biológicas moleculares (Westerman & Leboulch, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8971 -8976, 1996). Como todas las línea celulares, las células precursoras inmortalizadas por oncogen, exhiben una alta susceptibilidad a las aberraciones de cromosomas. Otro método para la proliferación in vitro de células precursoras antes del transplante, es la estimulación de proliferación con factores de crecimiento (Cattaneo & McKay, Nature 347:762-765, 1990; Reynolds & Weiss, Science 255: 1707-1710, 1992; richards y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:8591 -8595, 1992; Ray y asociados, Proc. Natl. Acad Sci, USA 90:3602-3606, 1993; Kilpatrick & Bartlett, Neuron 10:255-265, 1993; Ray & Gage, J.Neorosci. 6:3548-3564, 1994; Davis & Temple, Nature 372:263-266, 1994; Vicario-Abejón y asociados, Neuron 15: 105-1 14, 1995; Gosh & Greenberg, Neuron 15:89-103, 1995; Gritti y asociados, J. Neurosci. 16: 1091 -1 100, 1996). En la actualidad está claro, que la extensión de factores de crecimiento, permite un expansión in vitro de los precursores nerviosos. Los primeros estudios de transplantes, utilizando células tratadas con factores de crecimiento, muestran resultados controversiales. Mientras que algunos científicos observaron una capacidad disminuida de estas células para integrarse en el tejido hospedero (Svendsen y asociados, Exp. Neurol. 137:376-388, 1996), existen estudios que sugieren que las células tratadas con factores de crecimiento, pueden incorporarse en el cerebro receptor (Gage y asociados, Proc. Natl . Acad. Sci. USA 92: 1 1879-1 1883, 1995). En resumen, actualmente no está claro el orden de magnitud de la proliferación celular de precursores nerviosos intermediados por el factor de crecimiento y el comportamiento biológico de estas células proliferadas, siguiendo el transplante en un sistema nervioso hospedero. Las estrategias de expansión celular intermediado por oncogen, conllevan a un alto riesgo con respecto a las aberraciones de los cromosomas y a la inducción del tumor potencial. La mayoría de las desventajas severas de estas estrategias, están en el hecho de que ambas dependen de la disponibilidad del tejido cerebral, la mayoría de las veces derivado de donantes embrionarios. Las células troncales embrionarias (células "ES"), proporcionan perspectivas completamente nuevas para la generación de células donantes para el transplante. Las células "ES", primero fueron descritas en ratones en 1981 (Martin, Proc. Natl. Aad. Sci. USA 78:7634-7638, 1981 ; Evans & Kaufman, Nature 292: 154-156, 1981 ). Estas pueden ser derivadas, por ejemplo, de la masa celular interna de embriones de 3 a 5 días de edad. Las células "ES" son pluripotentes y pueden generar todos los tipos de tejidos y de células. Esto se refleja mejor por el hecho de que dichas células "ES", inyectadas en otro blastoquiste, pueden participar en la generación de todos los tejidos, incluyendo el la línea bacteriana, produciendo de este modo, animales quiméricos (Bradley y asociados, Nature 309:255-256, 1984). Una característica única de las células "ES", es el hecho de que en la presencia del factor inhibidor de leucemia (LIF), de dichas células pueden ser mantenidas y proliferadas en una etapa pluripotente (Smith y asociados, Nature 335:688-690, 1988). En la actualidad, esto es explotado frecuentemente para la modificación genética de células "ES". La inyección de blastoquiste de estas células "ES" construidas, posteriormente es usada para generar animales transgénicos (Robertson y asociados, nature 323:445-448, 1986). La células "ES" han sido utilizadas, con menos frecuencia, para estudios de diferenciación in vitro. Esta técnica permite el estudio y manipulación experimental del desarrollo de tejido temprano, bajo condiciones controladas in vitro. Mientras que células troncales embrionarias pluripotentes han sido aisladas de una gran variedad de especies, incluyendo ratas (lannaconne y asociados, Dev. Biol. 163:288-292, 1994), hámster (Doetschman y asociados, Dev. Biol. 127:224-227, 1988), pájaros (Pain y asociados, Development 122:2339-23-48, 1996), peces (Sun y asociados, Mol. Mar. Biol. Biotechno. 4: 193-199, 1995), cerdo (Wheeleer, Reprod. Fértil. Dev. 6:563-568, 1994), ganado (First y asociados, Reprod. Fértil. Dev. 6:553-562) y primates (Thomson y asociados, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844-7848, 1995). Siguiendo durante varios meses el sometimiento de la solicitud de patente Alemana No. 197 56 864.5, dos equipos de investigación tuvieron éxito en el aislamiento de células "ES" y células troncales similares a "ES", del tejido humano embrionario (Thomson y asociados, Science 282: 1 145-1 147, 1998; (Shamblott, Proc. Nati, Acd. Sci, USA 95: 13726-13731 , 1998). Otros estudios recientes indican que las células troncales embrionarias y de embriones, pueden ser generadas mediante el transplante de núcleos de células embrionarias y de mamífero maduro, células en occites enucleados (Campbell y asociados, Nature 380: 65-66, 1996; Wilmut y asociados, Nature 385:810-813, 1997). Durante los dos últimos años, algunos grupos de investigación tuvieron éxito en la diferenciación in vitro de células "ES" en células del sistema nervioso. En la mayoría de los casos, la diferenciación nerviosa se inició, tratando células "ES" agregadas con ácido retinóico (Bain y asociados, Dev. Bio.168:342-357, 1995; Strübing y asociado, Mech. Dev. 53:275-287, 1995; Fraichard y asociados, J. Cell Sci. 108:3181 -3188, 1995; Finley y asociados, J. Neurosci. 16: 1056-1065, 1996). Algunas de las células diferenciadas de esta forma, exhibieron propiedades de neuronas (Bain y asociados, Dev.

Biol. 168:342-357, 1995); Strübin y asociados, Mech. Dev. 53:275-287, 1995; Fraichard y asociados, U. Cell Sci. 108:3181 -3188, 1995; Finley y asociados, J. Neurosci. 16: 1056-1065, 1996) y células glial (Fraichard y asociados, J. Cell Sci. 108:3181 -3188, 1995). La inducción mediada por ácido retinóico de diferenciación nerviosa, tiene dos desventajas importantes. La primera, es que la diferenciación nerviosa ocurre solamente en una fracción de estas células. Hasta ahora no ha sido posible una purificación suficiente de estas células neurológicas. La segunda, es que los ácidos retinóicos son un fuerte inductor de diferenciación de células "ES". Las neuronas y células gliales diferenciadas en la presencia de ácido retinóico, ha sido desarrollada en su mayor parte más allá de la etapa de un precursor y ha entrado a una fase postmitótica. Por lo tanto, son de valor limitado para las el enriquecimiento de las estrategias y transplante de células. Recientemente se reportó un método alternativo para la generación del precursor nervioso a partir de células, (Okabe y asociados, Mech. Dev. 59:89-102, 1996). Las células agregadas "ES", a los cuerpos embrionarios, son plaqueados y cultivados, durante varios días, en medios libres de suero. Durante este tiempo, la muerte masiva de células, se observa particularmente entre las células no neurológicas. Al final de esta etapa, más del 80% de las células expresan nestin, un filamento intermedio, que se encuentra normalmente en las células precursoras neurológicas (Frederiksen & McKay, J . Neruosci. 8: 1 144-1 151 , 1988); Lendahl y asociados, Cell 60:585-595, 1990). Estas células precursoras pueden ser expandidas adicionalmente, como un cultivo de monocapa en la presencia de un factor básico de crecimiento de fibrodisparo (bFGF), y al retirar bFGF, se diferencia en las neuronas y astrocitos (Okabe y asociados, Mech. Dev. 59:89-102, 1996). Sin embargo, es limitada la capacidad de estas células para proliferar en la presencia de bFGF y se observo una diferenciación astrocítica incrementada después de únicamente algunos pasajes. (Okabe, en: Current Protocols in Neurosciencia, John Wiley, New York, 1997). Después de dichos periodos cortos de proliferación, los cultivos aún contienen numerosas células embrionarias no diferenciadas, así como células no neurológicas diferenciadas. Las poblaciones que contienen dichos contaminantes no son adecuadas para transplantes reconstructivos. Las células "ES" no diferenciadas pueden generar tumores (teratocarcinomas) y, las células donantes no neurológicas, pueden formar tejido no nervioso dentro de los injertos. Hasta ahora, no ha habido un procedimiento conocido que permita la generación de células derivadas de células "ES", con propiedades neurológicas o gliales en una pureza requerida para los transplantes no tumorigénicos en el sistema nervioso y actividad funcional in vivo, tal como, por ejemplo, o reemplazo de las neuronas perdidas con recuperación del comportamiento anormal provocado por la pérdida de neuronas. La generación de cantidades suficientes de células precursoras neurológicas definidas, es actualmente uno de los problemas clave en el transplante nervioso. En la actualidad, las células precursoras son aisladas del cerebro embrionario del mamífero. Por ejemplo, se requiere material de hasta siete embriones humanos, para el transplante a un solo paciente del Mal de Parkinson. Dicha estrategia está asociada con severos problemas y no puede ser utilizada para tratar grandes cantidades de pacientes del Mal de Parkinson a largo plazo. Hasta ahora, los esfuerzos para la proliferación de células neurológicas in vitro, antes del transplante, no han conducido a mejoras significativas. La ¡nmortalización mediada por oncogen, conlleva riesgos considerables, debido a la introducción de un gen tumorigénico en las células donantes. El orden de la magnitud de la proliferación mediada por el factor de crecimiento de las células precursoras, no es suficiente para una aplicación clínica potencial. Además, actualmente no está clara, la capacidad que tienen las células expandidas para incorporarse en el tejido hospedero. Las células "ES", representan una interesante fuente donante alternativa, para los transplantes neurológicos. Su ventaja principal es que estas fuentes pueden ser multiplicadas, durante largos períodos de tiempo en un etapa no diferenciada, pluripotente (Slack, en: From Egg to Embryo, Cambridge University Press, Cambridge, 1991 ). Durante la proliferación, éstas fuentes mantienen su capacidad para diferenciarse en todos los tejidos, incluyendo tejido nervioso. Sin embargo, hasta ahora no ha sido posible diferenciarlas selectivamente en las células precursoras neurológicas. Los intentos para inducir una diferenciación nerviosa con ácido retinóico, siempre produjo poblaciones de células mezclas, con las células neurológicas que representan únicamente una fracción de las células (Bain y asociados, Dev. Biol. 168:342-357, 1995; Strüibing y asociados, Mech. Dev. 53:275-287, 1995; Fraichrd y asociados, J. Cell Sci. 108:3181 -3188, 1995; Finley y asociados, J. Neurosci. 16: 1056, 1065, 1996). Además, ha habido reportes con respecto a la formación inducida por ácido retinóico de neuronas derivadas de células "ES", pero no con respecto a precursores nerviosos inducidos por ácido retinóico. En un estudio realizado por Dinsmore y asociados, dichas poblaciones mezcladas fueron injertadas en el cerebro de ratas lesionadas por ácido quinólico. El ácido quinólico es una neurotoxína que daña y destruye las neuronas. Después del transplante , algunas de las células injertadas son mantenidas en su fenotipo neuronal. Sin embargo, no se observó la Ennervación funcional del cerebro hospedero o reconstitución de funciones del cerebro pérdidas en estos experimentos (Dinsmore y asociados, Cell Transplant 5:131 -143, 1996). El método de cultivo descrito por Okabe ya sodadas, comprende el plaqueo de cuerpos embrionarios en el medio ITSFn y no depende de ácido retinóico. Este método produce hasta el 85% de células que expresan el nestin marcador de la célula precursora neurológica (Okabe y asociados, Mech. Dev. 59:89-102, 1996). Sin embargo, la pureza de estas poblaciones de células, demasiadas, no son suficientes para ser usada para los propósitos reconstructivos. Por ejemplo, los precursores derivados de células "ES" injertadas cultivadas en un medio ITSFn, han sido mostradas para formar estructuras neuroepiteliales, así como tejido no nervioso, tal como cartílago y tejido adenoide. "ES" posible proliferar adicionalmente células cultivadas en ITSFn, en la presencia de bFGF. Sin embargo, las células pierden rápidamente su multipotencia y, dentro de algunos pasajes, de diferenciación predominante en astrocitos. Dentro de este amarre de corto tiempo, no ha sido posible separar las células no neurológicas de las células precursoras neurológicas. Otra desventaja importante de este paradigma, es la carencia de una generación eficiente de oligondendrocitos. Por ejemplo, Okabe y asociados, no se observó diferenciación oligodendrogiliar después del plan de diferenciación inducida por la extracción del factor de crecimiento. Aún después de la adición de la hormona tiroide T3, los antigenos oligodendrogliales fueron detectados únicamente en 1 -2% de las células (Okabe y asociados, Mech. Dev. 59:89-102, 1996). En lo que se refiere a la diferenciación neurológica, los estudios reportados por Okabe y asociados, no muestran evidencia de generación de neuronas que expresan hidroxilasa tirosina, transferasa colinacetil o serontonin - compuestos que son de gran importancia para la transducción de señal entre neuronas individuales. Además estos estudios no muestran evidencia de neuronas que expresan periferin. El periferin normalmente está expresado en neuronas periféricas y en neuronas del cerebro y de la médula espinal.

Por lo tanto, el reto de la presente invención, es proporcionar células precursoras aisladas y derivadas de células "ES" no tumorigénicas, con propiedades neurológicas o gliales, especialmente neuronas purificadas y células gliales, así como métodos para la producción de estas células precursoras en cantidades virtualmente ilimitadas. La generación de dichas células precursoras purificadas, permite el transplante en el sistema nervioso sin la formación de tumor, así como la actividad funcional in vivo, por ejemplo remielinación o reemplazo de las neuronas pérdidas con mejoría del comportamiento anormal, lo cual resulta de la pérdida neurológica y, una mejora de la terapia de defectos neurológicos. Estos retos, se cumplen a través de las Reivindicaciones de la presente invención, de la descripción detallada del invento y de las figuras adjuntas.

Tal como se usa en la presente invención, los términos y abreviaturas que se encuentran a continuación, tendrán los significados indicados: Atr o cite Célula glial del sistema nervioso. Los procesos de Astrocite son parte de la barrera de sangre del cerebro, la cual separa el sistema sanguíneo de los fluidos que se encuentran dentro del cerebro. Se sabe poco con respecto a otras funciones de este tipo de célula.

Autologous Procedente de la misma (por ejemplo, células de procedentes de la misma) BFGF Factor básico de crecimiento de fibrodisparo, idéntico al FGF-2 (factor 2 de crecimiento fibrodisparo). Un factor de crecimiento que estimula la proliferación de las células precursoras neurológicas. CNTF Factor neurotrófico ciliario. DMEM/F12 Medio Dulbecco's Modified Eagle /Nutritent Mix F12 (1 : 1 ). Un medio de cultivo celular disponible en el mercado, el cual puede ser usado durante el cultivo celular libre de suero (por ejemplo, elaborado por Life Technologies, No. 1 1320). EGF Factor de crecimiento de la epidermis. Un factor de crecimiento que estimula la proliferación de las células precursoras neurológicas. Cuerpos Embrionarios Agregados celulares que crecen en una suspensión. Los cuerpos embrionarios pueden ser generados mediante el crecimiento de las células "ES" en platos de cultivo bacteriano. Células "ES" Células troncales embrionarias. Estas células pueden ser aisladas de embriones jóvenes en la etapa de blastocist. Estas células representan células pluripotentes que pueden generar todos tipos de tejidos y de células. En el cultivo celular, estas células pueden ser mantenidas en una etapa pluripotente durante varios pasajes. Las células "ES", también pueden ser obtenidas a través del transplante nuclear, por ejemplo, el transplante de núcleos celulares en occites enucleados y el cultivo subsecuente para la etapa blastocyst. La definición de células "ES", también incluye células similares a células "ES", obtenidas de células de germen embrionario. Células de alimentación La población de células que soportan el crecimiento de otra población de células. Las células "ES", por ejemplo, frecuentemente son cultivadas en una capa de alimentación de fibrolasts embrionarios. ¡TSFn y N3FL Medios del cultivo celular derivados del medio DMEM/F12 (Okabe y asociados, Mech. Dev. 59:89-120, 1996). LIF Factor de inhibir de Leucemia. Un factor el cual inhibe la diferenciación de las células "ES". Precursor nervioso Célula inmadura del sistema nervioso, la cual tienen el potencial para desarrollarse en el sistema nervioso maduro, al como neuronas y gliales (astrocitos y oligodendrocites). Esferas Neurológicas •Agregados celulares, obtenidos a través de la proliferación de células precursoras neurológicas en el factor de crecimiento que contiene el medio de cultivo celular en platos de cultivo celular no cubiertos. Oligodendrocite La célula glial del sistema nervioso. La función conocida más importante de estas células es el aislamiento de procesos celulares nerviosos (axons). Los axons son aislados por medio de una funda de mielin generada por los oligodendrociteros. Los defectos en la formación de mielin dieron como resultado enfermedades de demielinación. Una de las enfermedades de demielinación más frecuentes, es la esclerosis múltiple (MS). PDGF Factor de crecimiento derivado de plaqueta. Un factor de crecimiento que puede, por ejemplo, en combinación con otros factores de crecimiento, la proliferación estimulada de células precursoras neurológicas. Las subunidades PGDF-a y PDGF-B, forman dímeros conocidos como PGDF-AA, PDGF-AB y PDGF-BB. Células Pluri- Multi y bipotentes Las células precursoras que tienen el potencial para diferenciarse dentro de muchos diferentes (pluri- y multipotentes) o, dentro de dos diferentes (bipotentes) tipos de células maduras. En neurobiología, las células bipotenciales son utilizadas frecuentemente como un término de células precursoras que pueden generar astrocitos y/o oligodendrocitos.

RT Temperatura ambiente. Por lo tanto, la presente invención se refiere a los precursores aislados con propiedades neurológicas o gliales derivados de células "ES" no tumorigénicas, preferentemente células precursoras que contienen normas del 15% de células embrionarias primitivas y no neurológicas. En una modalidad preferida, las células muestran monocapas o esferas neurológicas. En una modalidad particularmente preferida, las células muestran propiedades neurológicas, astrocíticas y/o oligodendrogilales. En otra modalidad preferida, las células precursoras están derivadas de las células "ES" aisladas de blastocistos las cuales fueron generadas mediante transplante nuclear en oocites. En otra modalidad preferida, las células precursoras, están derivadas de células troncales embrionarias, generadas a partir de las células germen embrionarias. En otra modalidad preferida las células precursoras son derivadas de células "ES" de mamíferos o oocites de mamíferos. En otra modalidad preferida, las células precursoras son derivadas de ratón, rata, hámster, oveja, cerdo, ganado primates no humanos y humanos. En una modalidad particularmente preferida, las células precursoras están mantenidas en un condición de congelación. En otra modalidad particularmente preferida, las células precursoras son utilizadas para generar las bibliotecas celulares compuestas de células precursoras autologas o no autologas.

La presente invención se refiere adicionalmente a un método para la generación de células precursoras purificadas con o sin propiedades neurológicas o gliales, que comprenden los pasos que se indican a continuación: (a) proliferación de células "ES". (b) cultivo de las células "ES" a partir de (a) una etapa celular precursora nerviosa. (c) proliferación de las células precursoras neurológicas en factor de crecimiento que contiene un medio libre de suero. (d) proliferación de las células precursoras neurológicas a partir de (c), en otro factor de crecimiento que contiene un medio libre de suero y el aislamiento de las células precursoras purificadas. (e) Proliferación de las células precursoras a partir de (d) en otro factor de crecimiento que contiene un medio libre de suero y el aislamiento de células precursoras purificadas con propiedades neurológicas o gliales. En una modalidad preferida de la presente invención, las células "ES" a partir de (a), son proliferadas para agregados, especialmente cuerpos embrionarios. En otra modalidad preferida de la presente invención, el factor de crecimiento que contiene un medio libre de suero en (c), contiene bFGF. En otras modalidades preferidas el factor de crecimiento que contiene un medio libre de suero en (d) y (e), contiene las combinaciones de factor de crecimiento bFGF-EGF y bFGF-PDGF, respectivamente. En otra modalidad preferida, las células precursoras neurológicas purificadas, son transferidas en un medio adecuado para inyección. La presente invención se refiere a un método para la generación de células precursoras purificadas con propiedades neurológicas o gliales, que comprenden las etapas que se encuentran a continuación: (a') proliferación de células "ES". (b') cultivo de las células "ES" a partir de (a') una etapa celular precursora nerviosa. (c') proliferación de las células precursoras neurológicas en factor de crecimiento que contiene un medio libre de suero. (d') proliferación de las células precursoras neurológicas a partir de (c'), en otro factor de crecimiento que contiene un medio Ubre de suero y el aislamiento de las células precursoras purificadas. (e') proliferación de las células precursoras a partir de (d') en otro factor de crecimiento que contiene un medio libre de suero y el aislamiento de células precursoras purificadas con propiedades neurológicas o gliales. En una modalidad preferida de la presente invención, las células "ES" a partir de (a'), son proliferadas a agregados, especialmente a cuerpos embrionarios. En una etapa adicional (f), las células precursoras gliales obtenidas en (e'), son guiadas hacia una diferenciación astrocitica o oligodendroglial, mediante la adición de factores simples al medio de cultivo; posteriormente, las células astrociticas o oligodendrogliales son aisladas. En una modalidad preferida de la presente invención , el factor de crecimiento que contiene un medio libre de suero en (c'), contiene bFGF. En otra modalidad preferida, el factor de crecimiento que contiene un medio libre de suero en (d'), (e') y (f ), contiene los factores de crecimiento bFGF y EGF, ya sea solos o en combinación. En otra modalidad preferida, el factor neurotrofico cilario (CNTF) y la hormona tiroides (T3, son utilizadas en la etapa (f ) para promover la diferenciación astrocitica y oligodendroglial, respectivamente. En otra modalidad preferida, las células precursoras neurológicas purificadas son transferidas en un medio adecuado para inyección. Las células precursoras neurológicas obtenidas mediante la presente invención, pueden ser utilizadas como una herramienta terapéutica para el tratamiento médico. Una aplicación preferida de las células precursoras neurológicas purificadas, es la generación de herramientas terapéuticas para el tratamiento de defectos neurológicos. Un aplicación particularmente preferida, es la reconstitución de células neurológicas o la remielinación de células neurológicas demielinadas, en particular, dentro de las áreas demielinadas del sistema nervioso, mediante el transplante celular en el sistema nervioso. Las aplicaciones preferidas incluyen la reconstitución de células neurológicas dañadas o perdidas, como resultado de desordenes traumáticos, de esquemia, degenerativos, genéticos, hipóxicos, metabólicos, infecciosos, noplásticos o tóxicos del sistema nervioso. "ES" particularmente preferida la reconstitución de células neurológicas en lesiones traumáticas del cerebro y médula espinal, infartos isquémicos y hemorrágicos, mal de Parkinson, mal de Huntington, Mal de Alzheimer, desordenes atrofíeos hereditarios. Las aplicaciones preferidas incluyen adicionalmente, la reconstitución de células neurológicas perdidas o dañadas, debido a los cambios relacionados con la edad. Una aplicación preferida es la remielinación de áreas demielinadas del sistema nervioso, particularmente en enfermedades tales como, esclerosis múltiple (MS), adrenoleucodistrofía y mal de Pelizeaus-Merzbacher. Otra aplicación preferida de las células precursoras neurológicas derivadas de "ES", es las transferencia de gen mediado por célula en el sistema nervioso. Las aplicaciones preferidas para la transferencia del gen mediado por célula, incluye desórdenes metabólicos hereditarios, debido a las deficiencias de enzimas y desordenes neoplásticos del sistema nervioso. La células precursoras neurológicas derivadas de células "ES", obtenidas a través de la presente invención, también puede ser utilizada para la producción in vitro de factores, por ejemplo, polipéptidos, para aplicaciones clínicas y comerciales.

Descripción Detallada del Invento La Figura 1 , es un representación esquemática de la generación de precursores nerviosos derivados de célula "ES". (A) células "ES" (círculos), proliferando en una capa de alimentación de fibrodisparos embrionarios (cuadradas). Después de la proliferación, las células "ES" pueden ser propagadas o congeladas adicionalmente en nitrógeno líquido. (B) son células "ES" de crecimiento en platos de cultivo celular cubierto por gelatina sin células de alimentación. (C) cuerpos embrionarios con diferenciación incipiente en células neurológicas (círculos negros). (D) los cuerpos embrionarios plaqueados que crecen en el medio ITSFn. Este medio favorece la supervivencia de las células neurológicas (círculos negros). (E) las células precursoras neurológicas derivadas de células "ES", proliferando en un factor de crecimiento que contiene el medio libre de suero en la presencia de bFGF (medio N3FL). (F) las células precursoras neurológicas derivadas de la célula "ES", proliferando en un factor de crecimiento que contiene un medio libre de suero en la presencia de bFGF y EGF (medio N3EFL). (G) células precursoras neurológicas derivadas de la célula "ES", proliferando en un factor de crecimiento que contiene un medio libre de suero en la presencia de bFGF y PDGF (medio N2FP). Después de dos pasajes en el medio N2FP, las células pueden ser utilizadas para los transplantes de remielinación. Alternativamente, estas células pueden ser congeladas en un medio de congelación libre de suero para usarse posteriormente. La Figura 2 es una representación esquemática de la generación de esferas neurológicas y poblaciones celulares derivadas de esferas de las células "ES". Las etapas de la (A) a la (E), son idénticas a la Figura 1 . (F) esferas neurológicas generadas a partir de cultivos N3FL, proliferando en un factor de crecimiento que contiene un medio libre de suero en la presencia de bFGF y EGF (medio N2EF). Las células en esta etapa, pueden ser crioconservadas. (G) Diferenciación in vitro de esferas neurológicas derivadas de células "ES", inducida por la extracción del factor de crecimiento. Las esferas dan origen a neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. (H) Transplante de esferas neurológicas derivadas de células "ES" en el sistema nerviosos. (I) Generación de células precursoras glial a partir de esferas neurológicas plaqueadas derivadas de células "ES" (Cultivos de Ensayo). Las esferas neurológicas derivadas de células "ES", son propagadas en la presencia de factores de crecimiento, hasta que comienzan a adherirse a los platos de cultivo celular no cubiertos. En este punto, las células gliales emigran hacia fuera de las esferas en el plato de cultivo celular. (K) Después de la remoción de las esferas, los precursores gliales derivados de las esferas son adicionalmente proliferados en la presencia de factores de crecimiento. Las células generadas en (I) y (K) pueden ser crioconservadas y las células precursoras gliales obtenidas en (K), pueden ser utilizadas para el transplante en el sistema nervioso. (L) y (M) Además de CNTF y T3 durante la extracción del factor de crecimiento, promueve la diferenciación astrocítica (L) y oligodendroglial (M) de los precursores gliales derivados de células "ES". La Figura 3 muestra cultivos de células precursoras neurológicas, después de la proliferación in vitro y la diferenciación de células "ES". (A - B) Fotos de contraste de fase de células precursoras neurológicas, derivadas de células "ES" J 1 , proliferando en el medio N2FP. (C - D) Diferenciación de oligodendroglial de cultivos N2FP cuatro días después de la extracción de bFGF y PDGF. Numerosas células expresan el antigen marcador oligodendroglial 04. Las fotos de contraste de inmunofluorescencia y fase, son mostradas en C y D, respectivamente. (E - F) diferenciación astrocítica de cultivos N2FP. Cuatro días después de la extracción del factor de crecimiento, pueden ser detectados numerosos astrocitos positivos GFAP. Las fotos de inmunofluorescencia y fase correspondiente, son mostradas en E y F, respectivamente. (G - H) Diferenciación nerviosa de cultivos N2FP. Además de los oligodendrocitos y astrocitos, las neuronas pueden ser detectadas después de la extracción del factor de crecimiento. Ellos exhiben procesos largos y expresión prominente de antigen beta-l l l-tubulin del marcador nervioso. Las fotos de inmunofluorescencia y contraste correspondientes, se muestran en G y H, respectivamente.

Figura 4. Secciones de vibración tomadas de un cerebro receptor, después del trasplante de precursores gliales derivados de células "ES". Después del trasplante en un cerebro de rata fetal, las células precursoras gliales, se diferencian en los oligodendrocitos y astrocitos. Los oligodendrocitos derivados de la célula "ES", mielinanan el cerebro hospedero. (A), Después del transplante intraventricular en un cerebro de feto de rata, los astrocitos derivados de donantes emigran en el tejido del cerebro. En este experimento, fueron inyectadas las suspensiones celulares sencillas de N2FP en el sistema ventricular de embriones de rata de 17 días de edad. Los animales receptores fueron analizados tres semanas después de nacidos. Se utilizó un anticuerpo para el antigen M2 glial específico de ratón, para detectar las células derivadas de donantes. El tercer ventrículo está visible en la parte media superior del campo del microscopio. (B) incorporación de las células gliales derivadas de células "ES" en la corteza cerebral de una ratón neonatal. Las células fueron implantadas en el ventrículo hospedero en un embrión de 16 días. Se realizó el análisis de inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo para el antigen M6 específico de ratón. Las células exhibieron una morfología astroglial característica. (C) Incorporación de oligodendrocitos derivados de células "ES", en el tectum (colliculus inferior) de una rata con deficiencia de mielina de 22 días de edad, la cual había recibido una inyección intraventricular de un cultivo N2FP en el embrión de 17 días. Las células donantes fueron identificadas utilizando hibridación in situ de ADN con una muestra de ADN para el ADN satélite de ratón (etiqueta nuclear negra). Las células incorporadas han iniciado la mielinación del cerebro hospedero. Ya que las ratas con deficiencia de mielina carecen de ¡nmureactividad PLP en el sistema nervioso central, la mielinación puede ser detectada utilizando un anticuerpo para PLP (procesos obscuros). (D) Observación de alta potencia de un oligodendorcito de mielinación derivado de la célula "ES", después de la incorporación en el hipotálamo de un animal receptor de 22 días de edad. La célula muestra señal de hibridación nuclear y procesos positivos PLP en una orientación paralela típica. Figura 5. Cultivos de esferas neurológicas derivadas de la célula "ES" y poblaciones de células derivadas de esferas. (A) Esferas neurológicas de 5 días de edad, derivadas de la línea celular "ES" J1 . Las esferas en esta etapa, pueden ser utilizadas para el transplante dentro del sistema nervioso. (B) Esferas neurológicas de dos semanas de edad, derivadas de células "ES" J1 , fueron manchadas con un anticuerpo para nestin, un filamento intermedio típicamente expresado en células precursoras neurológicas. En esta etapa, las esferas neurológicas son macroscópicamente visibles (foro de inmunofluorescencia). (C - D), Esferas neurológicas de cinco días de edad, derivadas de células "ES" CJ7, fueron plaqueadas en platos de cultivo celular plaqueadas con poliornitin y fibronectin y cultivadas, durante otros cinco días en la ausencia de factores de crecimiento. Las esferas se han desintegrado y diferenciado dentro de las células neurológicas. (D) Muestra un doble análisis de inmunofluorescencia, utilizando anticuerpos para el antigen nervioso beta-l l ftubulin (señal brillosa) y el nestin marcador de la célula precursora nerviosa (señal obscura, flechas). La comparación con la foto de contraste de fase correspondiente (C), revela que todas las células ilustradas en este campo, expresan cualquiera de los dos marcadores. (E - F) Cultivo de esferas neurológicas derivadas de células "ES" de 5 días de edad (derivadas de la línea celular "ES" J1 ), diferenciadas durante otros siete días en poliornitina y fibronectin en la ausencia de factores de crecimiento y manchadas con anticuerpos para la proteína 2 asociada con microtúbulos marcador nervioso (MAP2; E) y el neurotransmisor GABA (F). Estas micrográficas inmunofluorescentes, muestran que numerosas neuronas expresan el neurotransmisor GABA. Las poblaciones de células enriquecidas en célula GABAergic, pueden ser utilizadas durante el transplante neurológico en pacientes con el mal de Huntigtons. (G - H) Células procedentes del experimento de cultivo de la misma célula, manchadas con anticuerpos para el marcador nervioso MAP2 (G) y el glutamato neurotransmisor (H; G y H son micrográficas de ¡nmunofluorescencia). Numerosas neuronas expresan el glutamato neurotransmisor. (I) Cultivo de esferas neurológicas derivadas de una célula "ES" de 5 días de edad (derivada de la línea celular "ES" J 1 ), diferenciada durante otras 2 semanas en poliornitina y fibronectin en la ausencia de factores de crecimiento, y etiquetada doblemente con anticuerpos para los antigenes de marcador nervioso beta-IJI-tubulin (filamentos manchados en procesos celulares) y sinapsin (señal punteada asociada con los procesos celular). La foto demuestra que las neuronas generadas de las esferas neurológicas derivadas de la célula "ES", desarrollan morfologías maduras y expresan proteínas 5 sinápticas importantes para la señalización nerviosa. (K) Cultivo de esferas neurológicas derivadas de una célula "ES" de 5 días de edad (derivada de la línea celular "ES" J 1 ), diferenciada en poliornitina y fibronectin en la ausencia de factores de crecimiento y etiquetada con un anticuerpo para hiroxilasa de tirosina. Las neuronas que expresan hiroxilasa de tirosin, son utilizadas para el transplante en • pacientes con el mal de Parkinson. Este análisis de inmunofluorescencia demuestra que numerosas neuronas derivadas de la célula "ES", expresan esta enzima. (L) Cultivo de una esfera nerviosa derivada de una célula "ES" de 1 1 días de edad (derivada de la línea celular "ES" J 1 ), diferenciada durante otra semana en poliornitina y fibronectin en la ausencia de factores de crecimiento y etiquetada con un anticuerpo para la proteína acídica fibrilaria glial • del antigen astrogliar (GFAP). Este análisis de inmunofluorescencia demuestra que las esferas neurológicas derivadas de la célula "ES", también dan origen a astrocitos. (M) Cultivo de esferas neurológicas derivadas de una célula "ES" de 5 días de edad (derivada de la línea celular "ES" J1 ), diferenciada durante otros 5 días en poliornitina y fibronectin en la ausencia de factores de crecimiento y etiquetada con un anticuerpo para el marcador oligodendroglial 04. Este análisis de inmunofluorescencia, demuestra que las esferas neurológicas derivadas de la célula "ES", también dan origen a oligodendrocitos. Figura 6. Células precursoras gliales generadas a partir de esferas neurológicas derivadas de células "ES". (A) Ejemplo típico de un cultivo llamado de ensayo. Las esferas neurológicas derivadas de la línea celular "ES" J1 , se adhiere a platos de cultivo celular no cubiertos y genera un outgrowth de células gliales. Las esferas adherentes, pueden ser removidas fácilmente mediante, agitación, dejando atrás una monocapa de células precursoras gliales purificadas. (B) Análisis de ¡nmunofluorescencia de una población de células precursoras gliales, generada como un cultivo de ensayo a partir de esferas neurológicas derivadas de la célula "ES" (derivada de la línea celular "ES" J 1 ). Este análisis de ¡nmunofluorescencia demuestra que las células precursoras gliales expresan el antigen nervioso A2B5. Figura 7. Diferenciación prevista de precursores gliales derivados de la célula "ES", mediante la adición de factores simples. Un cultivo de ensayo generado a partir de esferas neurológicas derivadas de la célula "ES" (derivadas de la línea celular "ES" J1 ), y proliferada en la presencia de EGF y bFGF, fue tratada con CNTF (10 ng/ml) o T3 (3 ng/ml). Dos días después, EGF y bFGF, fueron extraídas mientras que las células continuaron recibiendo CNTF o T3. Después de 5 días de la extracción del factor de crecimiento, las células fueron fijadas y manchadas con anticuerpos para el antigen astrocítico GFAP y el antigen oligodendroglial 04. Las fotos de inmunofluorescencia y contraste de fase, demuestran que la adición de CNTF o T3, tiene influencia en la diferenciación de las células precursoras derivadas de la célula "ES". En la presencia de CNTF, la mayoría de las células, adquieren una morfología astrocítíca y expresan el marcador astrocítico GFAP. En la presencia de T3, las células adquieren una morfología oligodendrogilial multipolar y expresan, el marcador oligodendroglial 04. Figura 8. Diferenciación nerviosa de esferas neurológicas derivadas de la célula "ES" (derivada de la línea células "ES" J 1 ) in vitro (A - B), y después del transplante en el sistema nervioso de ratas lesionadas por ácido iboténico, un animal modelo del mal de Huntingtons (C - D). Las esferas neurológicas de cinco días de edad, fueron injertadas en el estriato de ratas adultas lesionadas por ácido iboténico. Al mismo tiempo, fue diferenciada una alícuota de las esferas mediante la extracción del factor de crecimiento durante 5 días in vitro y, fueron manchadas subsecuentemente con un anticuerpo para el neurotransmisor GABA (A, inmunofluorescencia, b, imagen de contraste de fase correspondiente). Las figuras ilustran que numerosas neuronas derivadas de células "ES", expresan el neurotransmisor GABA. Siete semanas después del transplante, se detectó un transplante vital que exhibe diferenciación nerviosa en el cerebro de la rata adulta (C y D). La revisión general de un transplante el cual es identificado con un anticuerpo para el antigen nervioso M6 específico de ratón (inmunofluorescencia). El injerto muestra un manchado homogéneo y está bien integrado en el cerebro receptor. Este animal también mostró una mejora funcional con la normalización del comportamiento de rotación inducido por la lesión de ácido iboténico. (D) Axons derivados de la célula donante que ha crecido a partir del transplante dentro del cerebro hospedero adyacente. Manchado inmunofluorescente con un anticuerpo para M6. Para arrancar la generación de células precursoras neurológicas, las células troncales embrionarias, por ejemplo de origen de ratón, pueden ser proliferadas hasta la cantidad deseada en un medio que contiene suero en una capa de alimentación de fibrodisparos embrionarios no mitóticos, de acuerdo con los métodos estándar (Hogan y asociados, Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Press, New York, 1994). Además de las líneas celulares de ratón establecidas, tal como J1 (Li y asociados, Cell 69:915-926, 1992), R1 (Nagy y asociados Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:8424-8428, 1993) y CJ7 (Swiatek & Gridley, Genes Dev. 7:2071 ,2084, 1993), las células "ES" también pueden ser obtenidas a partir de embriones, por ejemplo, blastocists de ratón de desde 3 hasta 4 días de edad (Hogan y asociados, Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Press, New York, 1994). Las células "ES", también pueden ser obtenidas de otras especies tales como, rata (lannaconne y asociados, De. Biol. 163:288-292, 1994), hámster (Doetschman y asociados, Dev. Biol. 127:224-227, 1988). Pájaros (Pain y asociados, Desarrollo 122:2339-2348, 1996), peces (Sun y asocidos, Mol. Mar. Biol. Biotechno. 4: 193-199, 1995,) cerdo (Wheeler, Reprod. Fértil. Dev. 6:563-568, 1994), ganado (First y asociados, Reprod. Fértil. Dev. 6:553-562), primates (Thomson y asociados, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844-7848, 1995) o de tejido embrionario de humano. Algunos meses después del seguimiento del sometimiento de la solicitud de patente Alemana No. 197 56 864.5, dos equipos de investigación tuvieron éxito en el aislamiento de las células "ES" y células troncales similares a "ES", de tejido humano (Thomson y asociados, Science 282: 1 145-1 147, 1998; Shamblott y asociados, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726-13731 , 1998). - Estudios más recientes han indicado que las células troncales de embriones y embrionarias, pueden ser generada mediante el transplante de núcleos procedentes de células de un individuo maduro dentro de occites enucleados (Wilmut y asociados, Nature 385:810-813, 1997). Para un especialista, es obvio que una combinación de dichas estrategias de transferencia nuclear con la presente invención aquí descrita, permite la generación de células precursoras neurológicas autologas procedentes de células diferenciadas del mismo individuo. La generación de embriones a través de la transferencia de núcleos de células maduras en oocites enucleados, ha sido aplicada a un gran numero de mamíferos, tales como, oveja (Wilmut y asociados, Nature 385:810-813, 1997) y es, por lo tanto, también aplicable para humanos. Las células "ES" o células similares a la célula "ES", también pueden ser obtenidas a partir de células germen embrionarias. Los estudios publicados después de la fecha de prioridad de esta solicitud de patente, muestran que las células "ES" de humano, pueden ser aisladas de blastocistis humana (Thomson y asociados, Science 282: 1 145-1 147, 1998), y las células similares a la célula "ES", pueden ser obtenidas a partir de células germen primordiales de humanos (Shamblott y asociados, Proc. Natl. Acá. Sci. USA 95: 13726-13731 , 1998). Estos estudios indican que los métodos descritos en la presente de solicitud de patente, solo o en combinación con estrategias de transferencia nuclear, también pueden ser aplicados para tumores. Las líneas celulares "ES" dependientes de alimentación, pueden ser plaqueadas en platos de cultivo celular cubiertos con gelatina y agregados en forma subsecuente en platos de Petri no cubiertos, en la ausencia de LIF para formar cuerpos de embriones (Okabe y asociados, Mech. Dev. 59:89-102, 1996). Posteriormente los cuerpos de embriones de cuatro días de edad, pueden ser plaqueados en platos de cultivo celular y crecidos durante de cuatro a cinco días en un medio libre de suero (medio TSFn; Okabe y asociados, Mech. Dev. 59:89-102, 1996). Durante este tiempo la muerte de la célula pronunciada, puede ser detectada entre células no neurológicas. Después de desde cuatro hasta ocho días en el medio ITSF, las células pueden ser triturada hasta una suspensión de célula sencilla, utilizando una pipeta de perforación pequeña y transferida en el medio N3FL. N3FL es un medio libre de suero que contiene bFGF (Okabe y asociados, Mech. Dev. 59:89-102, 1996). bFGF es utilizada para promover la proliferación de células precursoras no neurológicas. Después de un período de desde 4 hasta 8 días en el medio N3FL, se inicia la generación de las poblaciones de células 5 precursoras gliales o neurológicas. En contraste con los precursores nerviosos, los precursores gliales exhiben un potencial proliferativo pronunciado. El método aquí descrito, explota esta proliferación potencial. Las células derivadas de cultivo N3FL, son propagados subsecuentemente a través de diferentes medios que contienen factor de crecimiento libre de suero. Durante esta etapa, se puede • observar un fuerte enriquecimiento de precursores bipotentes con capacidad de diferenciación astrocítica y oligodendroglial. De manera similar, las células embrionarias primitivas y las células no neurológicas, son diferenciadas y eliminadas de los cultivos. Para este fin, las células cultivadas en el medio N3FL, son recogidas en forma mecánica, trituradas hasta una suspensión celular simple y transferidas en un medio libre de suero, el cual puede contener los • factores de crecimiento bFGF y EGF (medio N3EFL). En este medio las células son propagadas como monocapa hasta que estas células se vuelven subconfluentes. Después de aproximadamente dos pasajes, las células cultivados en este medio pueden ser utilizadas para ios propósitos de transplante. Para una purificación adicional, se puede incluir una etapa adicional. Las células cultivadas en el medio N3EFL, pueden ser recogidas en forma mecánica, trituradas hasta una suspensión celular simple y replaqueadas en un medio libre de suero, que contiene una segunda combinación del factor de crecimiento, por ejemplo, bFGF y PDGF. Las células obtenidas a través de este protocolo, pueden ser • 5 propagadas a través de pasajes adicionales en este medio. Después de aproximadamente dos pasajes, el cultivo consiste de células precursoras neurológicas purificadas, las cuales pueden ser utilizadas directamente o después del aislamiento, por ejemplo, para transplantes de remielinación. En esta etapa, estas células forman una capa de células homogénea con una morfología bipolar o multipolar. Estas células pueden ser congeladas y descongeladas en esla etapa o, en etapas anteriores sin la pérdida de sus propiedades de célula precursora. Si los factores de crecimiento no son agregados en varios días, la extracción del factor de crecimiento, inducirán a la diferenciación in vitro. En este caso, los análisis inmunohistoquímicos muestran la presencia de antigenes marcadores para oligodendrocitos (por ejemplo, 04) y astrocitos (por ejemplo, GPAP), además de los marcadores para células precursoras neurológicas (por ejemplo, nestin). Las células positivas 04 y GFAP, pueden contar para el 20% - 40% y 30% - 70% de la población celular, respectivamente. Además, en estos cultivos se pueden encontrar las células que expresan antigenes nerviosos. También se inicia la generación de células precursoras neurológicas y gliales, en forma de esferas neurológicas, después de un período de desde 4 hasta 8 días en el medio N3FL. Para enriquecer las células neurológicas, las células que crecen en el medio N3FL, son recogidas en forma mecánica, trituradas hasta una suspensión celular simple y propagadas adicionalmente en platos de cultivo celular no cubiertos en un medio libre de suero, el cual puede contener los factores de crecimiento bFGF y EGF. Dentro de algunos días, las células formarán agregados celulares (esferas neurológicas), las cuales están compuestas principalmente de células precursoras neurológicas positivas por nestin. Las esferas neurológicas pueden ser propagadas adicionalmente como un cultivo de suspensión. En contraste, las células neurológicas diferenciadas y las células no neurológicas, tienden a adherirse a la superficie de los platos de cultivo celular. Tan pronto como se hayan formado las esferas pequeñas, éstas son removidas del cultivo y son transferidas dentro de platos de cultivo celular no cubiertos nuevos. Dentro de algunos días (5-7), las esferas pueden ser usadas para los propósitos de transplante. En este caso, los precursores nerviosos dentro de las esferas, se diferencian dentro de las células neurológicas maduras, las cuales enervan el cerebro hospedero. Las esferas neurológicas pequeñas no diferenciadas, pueden ser congeladas en nitrógeno líquido en un medio de congelación libre de suero, descongeladas y diferenciadas posteriormente. La presente invención también se refiere a células neurológicas diferenciadas en una composición de esferas, que puede ser adecuada para el transplante. Estas células pueden ser obtenidas a través de diferenciación in vitro de las células precursoras derivadas de la célula "ES", con propiedades neurológicas o gliales mencionadas en la presente descripción. Para inducir la diferenciación in vitro, los factores de crecimiento son extraídos y las esferas compuestas de células precursoras neurológicas no diferenciadas son plaqueadas, por ejemplo, en platos de cultivo celular cubiertos con poliomitin y fibronectin. En estas condiciones, las esferas se adhieren rápidamente a la superficie del plato de cultivo celular y, además de los precursores nerviosos positivos por nestin, se producen neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. La adhesión de neuronas puede ser diferenciada adicionalmente para expresar una variedad de marcadores nerviosos, por ejemplo, MAP2, beta-l l l-tubulin, sinapsin, colinacetiltransferasa, hidroxilasa de tirosina, GABA, glutamato, serotonin, periferin y calbindin. La maduración y supervivencia de las neuronas diferenciadas, puede ser aumentada mediante la adición de neurotrofinas, por ejemplo, BDNG o neurotrofin 3 (NT-3). En el medio libre de suero, que contiene factores de crecimiento tales como, por ejemplo, bFGF y EGF, las esferas neurológicas derivadas de la célula "ES", pueden ser mantenidas en un cultivo de suspensión durante varias semanas. En esta etapa, las esferas pueden crecer a un gran tamaño fácilmente detectable a simple vista. En estas condiciones se puede observar un incremento de nivel de diferenciación celular, dentro de las esferas neurológicas. Por lo tanto, estas esferas pueden ser utilizadas para el transplante de neuronas derivadas de la célula "ES", aún en una etapa de diferenciación avanzada. Esto no es posible, utilizando neuronas derivadas de la célula "ES" en un cultivo de monocapa, ya que el recoger estas células invariablemente conducirá a dañar de manera importante el proceso nervioso y a la destrucción de los cuerpos celulares nerviosos. Durante el último par de años, se han identificados numerosos factores que tienen influencia en la diferenciación de poblaciones de células neurológicas. Estos factores, pueden por ejemplo, conducir a la polarización dentro del tejido nervioso. Por ejemplo, se mostró que el producto de la alambrada sónica del gen, induce a un fenotipo ventral en el tejido nervioso (Ericson y asociados, Cell 81 :747-756, 1995). Se espera que dichos factores también tengan influencia en la diferenciación de las células neurológicas generadas de manera artificial a partir de células "ES". Para un especialista, es obvio que la aplicación de dichos factores, permitirá la generación de células neurológicas y gliales, con fenotipos específicos. Por ejemplo, la inducción de un fenotipo mesencefálico ventral, puede producir células adecuadas para el transplante en paciente con el mal de Parkinson. En fragmentos de tejido nervioso cultivado, ya se ha mostrado que la alambrada Sónica puede inducir a neuronas mesencefálicas ventrales dopaminergicas. (Wang y asociados, Nature Med. 1 : 1 184-1 188, 1995). Durante la generación de células precursoras a partir de esferas neurológicas derivadas de la célula "ES", las esferas están propagadas en suspensión en un factor de crecimiento que contiene un medio libre de suero, hasta que comienzan a adherirse a la superficie no cubierta del plato de cultivo celular. Durante esta fase, bFGF y EGF, de manera individual o en combinación, pueden ser utilizados como factores de crecimiento. Después de la adhesión de las esferas, las células con morfología glial, emigran desde las esferas que se encuentran en la superficie de los platos de cultivo celular (también llamadas células de ensayo). El desarrollo preciso de esta población celular no está claro. Presumiblemente, el incremento de diferenciación de células dentro de I as esferas, conduce a la formación de precursores gliales, que exhiben un comportamiento de adhesión y migración aumentado. Las esferas que producen células de ensayo, pueden ser utilizadas como generadores de precursores gliales. Hasta este punto, las esferas que generan precursores gliales son cultivadas únicamente durante períodos de tiempo cortos (< 1 días) en platos de cultivo celular no cubiertos. Tan pronto como las células gliales se hayan adherido, las esferas son separadas en forma mecánica del plato y transferidas dentro de otro plato. Esto produce monocapas de precursores gliales formadas por anillos, las cuales pueden ser proliferadas adicionalmente en la presencia de factores de crecimiento, por ejemplo, bFGF y EGF (aplicados individualmente o en combinación).

Las 'células de ensayo' generadas de esta forma, expresan el antigen nervioso A2B5 (Eisenbarth y asociados, proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4913-4917, 1979) y, al momento de la extracción del factor de crecimiento, se diferencian en los astrocitos y oligodendrocitos. Al utilizan métodos inmunohistoquímicos, los antigenes marcadores para oligodendrocitos (por ejemplo, 04) y astrocitos (por ejemplo, GFAP), pueden ser detectados en estas células diferenciadas. Las células de ensayo no diferenciadas, pueden ser congeladas en nitrógeno líquido en un medio libre de suero, sin perder su potencial de proliferación y diferenciación. Las células precursoras gliales, generadas de esta forma, también pueden ser utilizadas para el transplante en el sistema nervioso. La diferenciación de los precursores gliales derivados de la célula "ES", pueden ser influenciados mediante la adición de factores simples. La adición ligera de CNTF (factor neurotrófico ciliario) antes y durante la extracción del factor de crecimiento, promoverá la diferenciación astrocítica. La adición de la hormona tiroide T3 durante esta etapa, dará como resultado una diferenciación de oligodendrocitos aumentada. La adición del medio que contiene suero durante o después del tratamiento de factor de crecimiento, da como resultado un fuerte aumento en el número de células astrocíticas en estos cultivos. Para un especialista, es obvio que las células precursoras neurológicas congeladas, también pueden ser usadas, después de ser descongeladas, durante el transplante. Las células congeladas en etapas más tempranas al proceso de diferenciación in vitro, pueden ser descongeladas en una forma estándar y adicionalmente propagadas y pasadas hasta una población homogénea de células bi y multipolares que es obtenida. Los métodos mencionados en la presente descripción, pueden ser combinados adicionalmente con procedimientos establecidos de clasificación celular de separación de células. Por ejemplo, las subpoblaciones neurológicas pueden estar separadas en puntos de tiempo definidos, utilizando la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), inmunoextracción o métodos similares. Un clasificación y subclasificación detallada, puede permitir la generación de células de reemplazo (incluyendo las células de reemplazo modificadas en forma genética), hecha a la medida de las necesidades de cada paciente. Ya que tanto las células es como las células precursoras neurológicas derivadas de la célula "ES" mencionadas en la presente descripción pueden ser congeladas y descongeladas sin perder sus propiedades, es posible establecer bancos de células, incluyendo bancos de células autologas. La metodología aquí descrita, permite la generación de células precursoras neurológicas, por ejemplo, células neurológicas, astrocíticas y oligodendogliales, en una pureza y cantidades requeridas, por ejemplo, para reparar defectos en el sistema nervioso. Las células generadas con la metodología aquí descrita, contiene por ejemplo, únicamente algunas o ninguna de las células embrionarias primitivas y no neurológicas. La pureza de las células precursoras neurológicas aquí descritas, excede por mucho una pureza de aproximadamente el 85%, la cual ya se describió previamente por Okabe y asociados (Mech. Dev. 59:89-102, 1996). La metodología aquí descrita, permite la generación de células precursoras neurológicas en una pureza de hasta el 100%. Además, la metodología aquí descrita, permite la generación de un gran número de células precursoras neurológicas sin depender del tejido cerebral. Las células precursoras neuroíógicas aquí descritas, pueden ser obtenidas a partir de células "ES" de varias especies, por ejemplo, ratón, rata, hámster, pájaros, peces, cerdos, ganado, primates o seres humanos. Ambas, tanto las líneas celulares "ES" como las células "ES" derivadas de embriones, pueden ser usadas. Además, las células "ES" pueden ser derivadas a partir oocites proliferados. Los occites puede ser enucleado e implantado con un núcleo celular derivados, por ejemplos, de tejido diferenciado, permitiendo la generación de occites autologos y células "ES". Las células "ES" o células similares a "ES", también pueden ser obtenidas a partir de células de germen embrionario. Las células "ES", pueden ser genéticamente modificados con procedimientos estándar. Por ejemplo, un gen defectuoso puede ser reemplazado por su contraparte 'normal', utilizando una recombinación homologa. Además, los genes pueden ser retrasados utilizando métodos estándar. Estos procedimientos han sido ampliamente usados en ratones y son por lo tanto, una manifestación del arte. La rápida proliferación de las células "ES" y su sensibilidad a la modificación genética, permite la generación de grandes cantidades de células precursoras neurológicas y gliales modificadas en forma genética. Combinadas con el extenso potencial de migración de las células precursoras neurológicas y gliales, se permite la población de grandes áreas del sistema nervioso con células precursoras modificadas en forma genética, las cuales pueden substituir la falta de factores o polipéptidos escondidos, diseñados para la neuroprotección de otras aplicaciones. La modificación genética de las células, también puede ser usada para remover genes que codifican antigenes de la superficie, los cuales están involucrados en la rechazo del trasplante. Dicha estrategia, puede permitir una amplia aplicación clínica de células precursoras derivadas de la célula "ES", sin la necesidad de ¡nmonosupresión . Las células precursoras neurológicas mencionadas en la presente descripción, también pueden ser utilizadas como herramientas médicas terapéuticas para el tratamiento de defectos nerviosos. Un ejemplo típico para la aplicación de las células precursoras neurológicas mencionadas en la presente descripción, es la reconstitución de la pérdida o neuronas funcionalmente disparejas, mediante las células precursoras neurológicas trasplantadas. Con el objeto de reemplazar las neuronas perdidas y de mejorar los déficits neurológicos asociados con esta pérdida, las esferas neurológicas aquí descritas pueden, por ejemplo, ser desarrolladas en un lapso de 4 hasta 7 días en suspensión y, posteriormente implantadas en regiones del cerebro que exhiben una pérdida neurológica. Seis semanas después del transplante, se pueden observar las neuronas diferenciadas que enervan el cerebro hospedero. Los axons derivados de donantes que se extienden en el tejido cerebral hospedero, pueden, por ejemplo, ser detectados con anticuerpos para antigenes nerviosos específicos del donante. La reconstitución nerviosa, también conduce a una mejora funcional. Esto puede ser demostrado en las pruebas de comportamiento en ralas lesionadas por ácido iboténico, antes y después del transplante. En este punto, grandes cantidades de neuronas estriatales son destruidas por inyección estereotáxica del ácido iboténico de neurotoxina. El defecto resultante, muestra similitudes con el mal de Huntingtons. Este modelo experimental es, por lo tanto, utilizando frecuentemente como un modelo animal de esta enfermedad. Después de la lesión de ácido iboténico unilateral, los animales operados exhiben una asimetría funcional y un comportamiento de rotación anormal cuantificable, el cual puede ser inducido por ciertos medicamentos, por ejemplo anfetamina. Un trasplante rico en células neurológicas, puede normalizar el comportamiento de rotación. Esta normalización parece depender particularmente del número de neuronas GABAergicas dentro del trasplante. El modelo de lesión de ácido iboténico y la evaluación funcional de los trasplantes nerviosos mediante análisis del comportamiento de rotación, han sido descritos ampliamente (Bjórklund y asociados, en: Funcional Neural Transplantation, Seiten 157-195, Raven Press, New York, 1994). El trasplante de esferas neurológicas mencionadas en la presente descripción, dentro del cerebro de ratas lesionadas por ácido iboténico, da como resultado una mejoría postoperativa significativa del comportamiento de rotación anormal, inducido por la lesión de ácido iboténico. Ya se están llevando a cabo en paciente, los trasplantes de, por ejemplo, células neurológicas en el sistema nervioso humano (Olanow y asociados, TINS 19: 102-109, 1996). Las células precursoras gliales mencionadas en la presente descripción, obtenidas ya de esferas neurológicas o de cultivos de monocapa, también pueden ser usadas como una herramienta para la terapia de defectos nerviosos. Un ejemplo típico de la aplicación de las células precursoras gliales aquí descritas, es la remielinación de regiones del cerebros desmielinadas, mediante el trasplante celular. Ya que las células precursoras gliales aquí descritas pueden exhibir un potencial migratorio pronunciado, estas células pueden ser utilizadas para el tratamiento de enfermedades de desmielinación comprendidas en grandes áreas del CNS. En este caso, una inyección localizada de las células puede bastar para poblar y remielinar grandes áreas del CNS. Un ejemplo típico de una enfermedad, la cual podría ser tratada de esta forma, es la esclerosis múltiple (MS), una enfermedad de origen desconocido, la cual normalmente se asocia con foci múltiple de desmielinación en diferentes regiones del CNS. El transplante de los precursores nerviosos aquí descritos, pueden ser utilizados para remielinar dichos defectos. En este caso, el potencial de migración pronunciado de las células precursoras neurológicas, puede ser explotado para atacar y reparar numerosas áreas de desmielinación de varios o de un solo sitio de implante. Con el objeto de mielinar las regiones cerebrales con deficiencia de mielina, las células derivadas de cultivos de monocapas o de esferas neurológicas derivadas de la célula "ES", pueden ser propagadas en un medio que contiene el factor de crecimiento, recogidas en forma mecánica y trituradas hasta una suspensión celular simple. El trasplante de dichas suspensiones celulares en las regios cerebrales con deficiencia de mielina, normalmente produce astrocitos y oligodendrocitos derivados de un donante, los cuales son fácilmente detectables en aproximadamente tres semanas después del trasplante. Las células trasplantadas, generalmente son axons hospederos envueltos con fundas de mielina. Al utilizar métodos inmunohistoquímicos, las proteínas de mielina, tales como proteína básica de mielina (MBP) y la protetína proteolípida (PLP), pueden ser detectadas en estas fundas de mielina. Los precursores nerviosos derivados de la célula "ES" aquí descritos, también pueden ser utilizados para la generación in vitro de polipéptidos para aplicaciones clínicas o comerciales. Los ejemplos que se encuentran a continuación, muestran como la presente invención puede ser utilizada durante la generación y trasplante de precursores nerviosos derivados de la célula "ES". Ejemplo 1 1 .1 . Proliferación de la célula "ES" Las células "ES" (Línea J 1 ; Li y asociados, Cell 69:915-926, 1992), son proliferadas en una capa de flbroblasts embrionarios de ratón no mitótico en un medio DMEM (Life Technologies No. 1 1965), que contiene el 20% de suero de becerro fetal (FBS, Life Technologies No. 101 19) y 1 .000 U/ml LIF (Life Technologies No. 13275), de acuerdo con métodos estándar (Hogan y asociados, Manipulatin the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Press, New York, 1994). Además del FBS y LI F, este medio contiene concentraciones estándar de aminoácidos no esenciales (Life Technologies No.1 1 140; Okabe y asociados, Mech. Dev. 59:89-102, 1996), adenosina (Sigma No. A-4036), guanosina (Signa No. G-6264), citidina (Sigma No. C-4654), uridina (Sigma No. U-3003), timidina (Sigma No. T-1895), así como 0.1 mM 2-mercaptoetano! (Sigma No. M-7522), 10 mM L-glutamina (Sigma No. G-5763) y 25 mM HEPES (Sigma No. H-0763). Durante esta y todas las etapas siguientes, las células son cultivadas en un incubador humidificado (humedad >85%) a una temperatura de 37°C en CO2 al 5%. 1.2 Remoción de células de alimentación Tan pronto como las células "ES" alcanzan una subconfluencia, estas son lavadas una vez con EDTA a 0.04% en PBS y, subsecuentemente recogidas mediante la adición de tripsin al 0.05% (Life Technologies No. 35400) y EDTA al 0.04% en PBS. Las células son trituradas varias veces a través de una pipeta de Pasteur para obtener una suspensión celular simple. El tripsin es neutralizado mediante la adición de una cantidad igual del medio que contiene suero utilizado durante la proliferación de las células "ES". Después de la centrifugación a 300 x g durante 5 minutos en RT, las células son plaqueadas en platos de cultivo celular cubiertos por gelatina (Sigma No. G-2500) a una densidad de aproximadamente células de 6 x 10ß /plato de 6 cm y proliferadas adicionalmente en el medio utilizado en la etapa 1 .1 . 1 .3 Generación de cuerpo embrionario Tan pronto como las células se han vuelto subconfluentes (por ejemplo, después de aproximadamente de 2 a 3 días), estas células son separadas de la gelatina, mediante la adición de tripsin a 0.05% y EDTA al 0.04% en PBS (por ejemplo, 1 .5 ml por plato de 6 cm). Después de la separación, el tripsin es neutralizado mediante la adición de FBS al 10% en DMEM (por ejemplo, 6.5 ml por plato de 6 cm; este medio equivale al medio utilizado en 1 .2, pero únicamente contiene FBS al 10% y no LI F). Posteriormente la suspensión celular es plaqueda, por ejemplo en 8 platos de Petri no cubiertos (Nunc No. 240045) y propagada adicionalmente en DMEM/FBS al 10% (por ejemplo, 4 ml por plato de 6 cm). 1 .4 Plaqueo de cuerpos embrionarios Después de 3 ó 4 días, los cuerpos embrionarios son transferidos en un tubo de 50 ml y recolectados mediante sedimentación (1 x g; 5 minutos). El flotante es descartado y los cuerpos embrionarios son plaqueados en platos de cultivo celular de 10 cm. Los cuerpos embrionarios plaqueados, deben cubrir aproximadamente el 50% de la superficie del plato de cultivo celular.

Normalmente, los cuerpos embrionarios recolectados de 4 a 6 platos de Petri, bastarán para plaquear un plato de 10 cm. Los cuerpos embrionarios son cultivados durante la noche en DME/FBS al 10% (10 ml por plato de 10 cm). 1 .5 Transferencia en el medio ITSFn Un día después del plaqueo, los cuerpos embrionarios adheridos al plato de cultivo celular, son lavados 3 veces en DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Médium / Nutritent Mix F12 (1 : 1 ); Life Technologies, No. 1 1320). 10 ml del medio ITSFn son agregados a cada plato de 10 cm. Este medio contiene DMEM/F12, 5 µg/ml de insulina (Intergen No. 540101 ), 50 µg/ml de apo-transferrin (Inergen No. 445275), 30 nM de cloruro de selenio (Sigma No. S-5261 ), 5 µg/ml de fibronectin (Life Technologies No. 330.10) y penicilina/estreptomicina (100 l U/ml / 100 µg/ml; Life Technologies No. 15140). Las células son propagadas en este medio en un periodo de 4 a 7 días y, el medio es reemplazado cada dos días. Durante este tiempo, se puede observar la muerte celular masiva, entre células no neurológicas. Además, las células precursoras neurológicas perecerán y formarán pequeñas acumulaciones de células. Este método de establecimiento de cultivos ITSFn, ya ha sido descrito previamente (Okabe y asociados, Mech. Dev. 59:89-102, 1996). 1.6 Transferencia en el medio N3FL Los cultivos celulares en el medio ITSFn, son recogidos con tripsin al 0.05% y EDTA al 0.04% en PBS. El tripsin es neutralizado mediante la adición de una cantidad equivalente del medio que contiene suero (DMEM/ FBS al 10%). Después de la configuración (300 x g; 5 minutos, RT), las células son suspendidas nuevamente en una Solución de Sal Regulada de Hanks libre de calcio y magnesio (CMF-HBSS, Life Technologies No. 14180), que contiene DNasa al 0.1 % (Worthington No. 2139). Un pildora celular obtenida de un plato de 10 cm, puede ser suspendida nuevamente en un volumen total de 3 ml. Posteriormente las células son trituradas hasta una suspensión celular simple, utilizando pipetas de Pasteur pulidas por flama, con un tamaño de poro disminuido (por ejemplo, 0.8 mm, 0.5 mm y 0.2 mm). Las acumulaciones celulares restantes son recogidas mediante sedimentación (1 x g, 5 minutos) y desechadas. Después de la centrifugación (300 x g, 5 minutos, RT), las células son plaqueadas a una densidad de aproximadamente 30.000 celulas/cm2 en platos de cultivo celular cubiertas con poliornitna en DMEM/F12 (1 : 1 ; Life Technologies No.1 1320), 25 µM putrescina (Sigma No. P-5780), 30 nM cloruro de selenio, 1 µg/ml de laminin (Life Technologies No.23107), penicilina/estreptomicina (100 lU/ml / 100 µg/ml) y 10 ng/ml recombinante bFGF humano (R&D Systems No. 233-FB). Este medio es equivalente al medio descrito por Okabe y asociados, (Okabe y asociados, Mech. Dev. 59:89-102, 1996). Durante la cubierta con poliornitina, los platos de cultivo celular son llenados dentro de 15 µg/ml de poliornitina (Sigma No. P3655) en H2O durante por lo menos 2 horas. La solución de poliornitina es removida y los platos fueron lavados 3 veces con PBS. Durante el cultivo en el medio N3FL, se agregó diariamente bFGF hasta una concentración final de 10 ng/ml. El medio es reemplazado cada dos días. Ejemplo 2: Generación de células precursoras neurológicas 2.1 Transferencia en el medio N3EFL Después de 4 ó 5 días en el medio N3FL, las célula son recogidas en forma mecánica utilizando un raspador celular (Costar Nr. 3008). Antes del raspado, las células fueron lavadas 3 veces con CMF-HBSS, conteniendo el último lavado DNasa al 0.1 %. Estas células fueron trituradas hasta una suspensión celular simple con pipetas de Pasteur pulidas por flama, tal como se describió en el Ejemplo 1 .6. Después de la configuración (300 x g, 5 minutos, RT), las células recogidas de un plato de 10 cm, fueron plaqueadas en aproximadamente 5 platos de 10 cm cubiertos con poliornitin en el medio N3EFL. Este medio contiene DMEM/F12 (1 : 1 ), 25 µg/ml de insulina, 100 µg/ml de transferrina, 20 nM de progesterona, 100 µM de putrescina, 30 nM de cloruro de selenio, 1 µg/ml de laminina, penicilina/estreptomicina (100 lU/ml / 100 µg/ml), 10 ng/ml de recombinante bFGF humano y 20 ng/ml de recombinante EGF humano (R&D Systems No. 236-EG). Los bFGF y EGF son agregados diariamente hasta una concentración final de 10 ng/ml y 20 ng/ml, respectivamente. Se puede omitir la adición de laminina, después del cambio al segundo medio. 2.2 Transferencia en elmedio N2FP Tan pronto como las células son confluentes al 90%, (por ejemplo, después de 1 a 2 semanas), estas células son recogidas con un raspador celular sin el uso de tripsina y trituradas hasta una suspensión simple, utilizando pipetas de Pasteur pulidas por flama. Después de la centrifugación (300 x g, 5 minutos RT), las células recogidas de un plato de 10 cm, son plaqueadas en aproximadamente 5 platos de 10 cm cubiertos con poliornitin en el medio N2FP. Este medio contiene DMEM/F12 (1 : 1 ), 25 µg/ml de insulina, 100 µg/ml de transferrina, 20 nM de progesterona, 100 µM de putrescina, 30 nM de cloruro de selenio, penicilina/estreptomicina (100 l U/ml / 100 µg/ml), 10 ng/ml de recombinante bFGF humano y 10 ng/ml de recombinante PDGF-AA humano (R&D Systems No. 221 -AA). Los bFGF y EGF so agregados diariamente y el medio es reemplazado cada dos días. 2.3 Paso de células en el medio N2FP Tan pronto como las células se han vueíto subconfluentes, son recogidas con un raspador celular sin el uso de tripsin y pasadas en una proporción de 1 :5. Usualmente, no se requiere de un paso de trituración adicional para obtener una suspensión celular simple. Después de por lo menos 2 pasadas en el medio que contiene bFGF y PDGF, las células representan una población de precursores que pueden ser utilizados para los trasplantes de remielinación. De manera alternativa, las células pueden ser recogidas con un raspador celular sin el uso de tripsin y crioconservadas en el medio de congelación libre de suero (Sigma No. C-6295) para usarse posteriormente. Los precursores nerviosos purificados, pueden ser aislados y transferidos en un medio adecuado para inyección, por ejemplo, CMF-HBSS (Life Technologies, Nr 14180). 2.4 Diferenciación in vitro de células precursoras neurológicas Durante una diferenciación in vitro, las células precursoras neurológicas son recogidas con un raspador celular sin el uso de tripsin y son plaqueadas en platos de cultivo celular cubierto con políornitin, para alcanzar una confluencia de aproximadamente el 50%. Las células son propagadas durante otros de 4 a 7 días en el medio descrito en el Ejemplo 2.2, pero sin la adición de bFGF y PDGF. El medio es reemplazado cada dos días. Los cultivos son fijados en paraformaldehido al 4% (Sigma No. P-6148) en PBS y sometidos a análisis de inmunofluorescencia, utilizando anticuerpos del antigen oligodendroglial 04 (Boehringer No.1518925, dilución 1 : 10), y el antigen astrocito GFAP (Chemicon No. AB 1980, dilución 1 :100). Al realizar esto, se observó que hasta el 32% de las células exhibieron una morfología oligodendroglial con la expresión de 04 después de cuatro días de la extracción del factor de crecimiento. Al mismo tiempo, hasta el 49% de las células expresaron GFAP. Además, estos cultivos contenían células ¡nmunoreactivas con un anticuerpo para el antigen nervioso beta-l l l-tubulin (BabCO, No. MMS-435P-250, dilución 1 :500). Ejemplo 3: Generación de esferas neurológicas v precursores neviosos de las mismas. 3.1 Generación de esferas neurológicas en el medio N2EF Después de permanecer de 4 a 5 días en el medio N3FL (s.1 .6), las células fueron recogidas en forma mecánica utilizando un raspador celular (Costar Nr. 3008). Antes del raspado, las células fueron lavadas 3 veces con CMF-HBSS, conteniendo el último lavado DNasa al 0.1 %. Estas células fueron trituradas hasta una suspensión celular simple con pipetas de Pasteur pulidas con flama, tal como se describió en el Ejemplo 1 .6 Después de la centrifugación (300 x g, 5 minutos, RT), las células fueron plaqueadas en platos de cultivo celular a una densidad de 1 .200 -12.000 células/cm2 en el medio N2EF. Este medio contiene DMEM/F12 (1 : 1 ), 25 µg/ml de insulina, 100 µg/ml de transferrina, 20 nM de progesterona, 100 µM de putrescina, 30 nM de cloruro de selenio, penicilina/estreptomicina (100 l U/ml / 100 µg/ml), 20 ng/ml de recombinante bFGF humano y 20 ng/ml de recombinante EGF humano (R&D Systems No. 236-EG). Los bFGF y EGF son agregados diariamente hasta una concentración final de 20 ng/ml cada uno, y el medio es reemplazado cada dos días. Para evitar la pérdida de esferas flotantes durante los cambios de medio, las células son sedimentadas en 150 x g durante 3 minutos en RT. La pildora es suspendida nuevamente en un medio fresco y plaqueadas nuevamente en platos de cultivo celular no cubiertos nuevos. 3.2 Diferenciación in vitro de esferas neurolóaicas derivadas de la célula "ES" Durante la diferenciación in vitro, las esferas neurológicas de cinco días de edad derivadas de la célula "ES", pueden ser sedimentadas a 150 x g durante 3 minutos en RT, plaquedas en platos de cultivo celular con poliornitin y fibronectin y cultivados en el medio descrito en el Ejemplo 3.1 , pero sin la adición de bFGF y EGF. Se llevaron a cabo dos cubiertas con poliornitin y fibronectin, cubriendo primero los platos con poliornitin, tal como se describió en el Ejemplo 1 .6. Posteriormente los platos fueron lavados 3 veces con PBS e incubados adicionalmente durante de 2 a 12 horas, con PBS que contiene 1 µg/ml de fibronectin . Las esferas pueden ser plaqueadas inmediatamente después de la remoción de la solución de fibronectin. Normalmente un día después del plaqueado, las esferas neurológicas se han adherido al plato de cultivo celular. Después de la remoción del flotante, las esferas adheridas son lavadas 3 veces con un medio fresco o CMF-HBSS-. Posteriormente, se agrega un medio nuevo a los cultivos, y es reemplazado subsecuentemente cada dos días. Se llevó a cabo un análisis de inmunofluorescencia en las esferas fijadas, cinco días después del plaqueo que produjo el siguiente perfil de expresión de antigenes nerviosos (significa el porcentaje de células marcadas + Sem): células precursoras neurológicas positivas por nestina: 66+3% (anticuerpo de M. Marvin und R.D.G. McKay, NIH, Bethesda, USA, dilución 1 : 1 .000); neuronas positivas por beta-l l l-tubulin: 34+3% (anticuerpo de BabCO, No.MMS-435P-250, dilución 1 :500); atrocitos positivos por GFAP: 30±2% (anticuerpo de Chemicon, No.AB 1980, dilución 1 : 100); células positivas por O4 con morfología oligodendroglial: 6.2±1 .7% (anticuerpo de Boehringer, No. 1518925, dilución 1 : 10). Además, las neuronas generadas a partir de esferas neurológicas diferenciadas durante 5 días derivadas de la célula "ES", expresaron proteína 2 (MAP-2, anticuerpos de Sigma, No. M 4403 y No. M 1406, dilución 1 :200) asociada con microtúbulos y los neurotransmisores GABA (anticuerpo de Sigma No. A-2052, dilución 1 :700) y glutamato (anticuerpo de Sigma No. G-6642, dilución 1 :700). En algunas preparaciones de hasta el 60% de neuronas, exhibieron un fenotipo GABAserfic. Los análisis de inmunofluorescencia de las esferas neurológicas derivadas de la célula "ES", diferenciadas en la ausencia de factores de crecimiento durante más de 10 días, también mostraron neuronas que expresan hidroxilasa de tirosina (anticuerpo de Eugene, No. TE 101 , dilución 1 :200), colinacetiltransferasa (anticuerpo de Chemicon No. MAB305, dilución 1 :250), serotonin (anticuerpo de Eugene No. NT102, dilución 1 :200=, sinapsin (anticuerpo de DR. M. B. Kennedy, Pasadena, CA, USA, dilución de 1 : 1 .000), periferin (anticuerpo de Chemicon No. AB15330, dilución 1 : 1 .000) y calbindin (anticuerpo de Sigma, No.C-8666, dilución 1 : 100). La diferenciación y supervivencia de las neuronas derivadas de esferas, podrían ser promovidas mediante la adición factor neurotrofico derivado de neutrofinas cerebrales (BDNF; 20 ng/ml; Pepro Tech Inc. No. 450-02) y/o neutrofin 3 (NT-3; Pepro Tech Inc. No. 450-03). Las esferas neurológicas derivadas de la célula "ES", diferenciadas durante 10 y más días, también contenían diferenciación de inmunoreactivos de oligodendrocitos con un anticuerpo para el 3-fosfodiesterasa nucleótida cíclica (CNPasa; anticuerpo de Sigma No. C-5922, dilución 1 :200). 3.3 Generación de precursores gliales de esferas neurológicas derivadas de la célula "ES" ('cultivos de ensavoV Con el objeto de generar células precursoras gliales, se mantienen las esferas propagadas en el factor de crecimiento que contiene el medio que se describió en el Ejemplo 3.1 , hasta que estas células comienzas a adherirse a la superficie no cubierta de los platos de cultivo celular. Esto generalmente ocurre entre los días 10 y 14 del cultivo de la esfera. Tan pronto como se detecta alrededor de las esferas individuales un crecimiento exterior en forma de anillo , las esferas son separadas del plato de cultivo celular, mediante agitación suave y son removidas de los cultivos utilizando una pipeta. Estas esferas separadas pueden ser plaqueadas en platos nuevos de cultivo celular no cubierto, para generar colonias adicionales de células precursoras gliales en forma de anillo. Las colonias de células gliales obtenidas de este modo, son proliferadas adicionalmente en el mismo factor de crecimiento que contiene el medio. Al alcanzar una confluencia del 80%, las células son recogidas con un raspador celular sin el uso de tripsin y son replaqueadas en una proporción de 1 :5. Un análisis de inmunofluorescencia reveló que las células precursoras gliales generadas de esta forma, muestran una fuerte expresión del antigen nervioso A2B5 (anticuerpo de Boehringe, No. 1300 016, dilución 1 :200). Estas células pueden ser congeladas en nitrógeno líquido en el medio de congelación libre de suero (Sigma No. C-6295), y sometidas adicionalmente proliferación, trasplante, o diferenciación de último momento. 3.4 Diferenciación enfocada de los precursores gliales derivados de la célula "ES". Mediante el siguiente experimento, se verificó la diferenciación enfocada de los precursores gliales derivados de la célula "ES" mediante factores simples: Precursores gliales proliferando en la presencia de bFGF (20 ng/ml) y EGF (20 ng/ml), tal como se describió en el Ejemplo 3.3, fueron recolectados en forma mecánicamente, pasados en platos de cultivo celular cubierto con poliornitin y propagados hasta que alcanzaron una confluencia de aproximadamente del 50%. Posteriormente las células fueron propagadas durante otros dos días en las siguientes condiciones: 1 . cultivo continuo en la presencia de EGF y bFGF 2. cultivo continuo en la presencia de EGF y bFGF 3. cultivo continuo en la presencia de EGF y bFGF con adiciones diarias de CNTF (Regeneron, Inc.; concentración final de 10 ng/ml). 4. Cultivo continuo en la presencia de DGF y bFGF con adiciones diarias de T3 (Sigma No. T 6397; concentración final de 3 ng/ml). Después de dos días, se extrajeron bFGF y EGF de los grupos 2, 3 y 4, y las células fueron propagadas adicionalmente durante de 5 a 7 días con cambios de medio cada dos días. Todos los cultivos fueron fijados en paraformaldehido al 4% (Sigma No. P-6148) en PBS, y sometidos a un anáisis de inmunofluorescencia con anticuerpo para el antigen 04 marcador oligodendroglial y antigen astrocítico GFAP. Los siguientes perfiles de expresión fueron obtenidos para los grupos individuales (significado de ± Sem): 1 . células positivas 04 con morfología oligdendroglial >1 % células positivas GFAP: >1 % 2. células positivas 04 con morfología oligodendroglial: 8.2+2.6% células positivas GFAP: 28+6% 3. células positivas 04 con morfología oligodendroglial: 2.6±1 .8% células positivas GFAP: 78±2.5% 4. células positivas 04 con morfología oligodendroglial: 17±3.6% células positivas GFAP: 39+5.7% Estos datos indican que CNTF y T3, pueden ser utilizados para guiar la diferenciación de precursores gliales derivados de la célula "ES", hacia el número de líneas astrocítico y oligdendroglial, respectivamente.

Ejemplo 4: Transplante de precursores ligodendrogliares/astrocíticos 4.1 . Generación de una suspensión celular para el transplante.

El potencial de mielinación de los precursores gliales derivados de la célula "ES" se verificó mediante el siguiente experimento: Cultivos subconfluentes obtenidos tal como se describió en el Ejemplo 2.3, fueron recogidos con un raspador celular sin el uso de tripsin, fueron sedimentados mediante centrifugación a 300 x g durante 5 minutos y suspendidos nuevamente en CMF-HBSS que contiene DNasa al 0.1 %. las células fueron trituradas hasta una suspensión celular simple, utilizando pipetas de Pasteur pulidas con flama, contadas en un hemocitómetro, nuevamente sedimentadas mediante centrifugación y suspendidas nuevamente a una concentración de aproximadamente desde 50.000 hasta 100.000 células/µl en CMF-HBSS, que contiene 2 g/L de glucosa (Sigma No. G-7021 ). Esta suspensión celular se mantuvo en hielo hasta el termino del experimento de trasplante (por ejemplo, de 4 a 6 horas). 4.2 Transplante intraventricular en el cerebro de rata Las ratas con deficiencia de mielina (lan Duncan, Department of Medical Sciences, School of Veterinary Medicine, University of Wisconsin-Madison, 2015 Linden Drive West, Madison, Wisconsin 53706, EUA), fueron usadas como receptoras del trasplante. Una ventaja clave del trasplante embrionario es que los xenotrasplantes pueden ser llevados a cabo sin provocar el rechazo al trasplante. Los animales receptores con deficiencia de mielina, ofrecen la ventaja de que la mielina derivada del donante, puede ser fácilmente detectada. Una ventaja del paradigma de xenoinjerto, es que la células trasplantadas pueden ser fácil y confiablemente identificadas con muestras de ADN específica de la especie (Brüstle y asociados, Neuron 15: 1275-1285, 1995). Está bien establecido el método de transplante intrauterino en el cerebro embrionario (Brüstle y asociados, Neuron 15: 1275-1285, 1995; Brüstle y asociados, en: Current Protocols in Neurosience.John Wiley, New York, 1997). Durante el trasplante, las ratas embarazadas fueron anestesiadas mediante la inyección intraperitoneal de quetamina ( 80 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) con una gestación de 16 ó 17 días. Después de la parotomía, los embriones individuales fueron identificados bajo transiluminación con una fuente de luz de fibra óptica. Las células donantes fueron cargadas en una capilaridad de vidrio pequeña (tamaño de poro 50-100 µm), y la capilaridad avanzó a través de la pared uterina y el del cráneo embrionario en el ventrículo lateral del embrión receptor, tal como se describió (Brüstle y asociados, Current protocols in neuroscience, John Wiley, New York, 1997). De dos a nueve µl de la suspensión celular (que contiene de 100.000 a 900.000 células), fueron inyectadas en el sistema . ventricular. Después del transplante de varios o de todos los embriones, el abdomen fue cerrado con suturas quirúrgicas y el animal mama se dejó para tener un nacimiento vaginal espontáneo. Ya que la deficiencia de mielina en este modelo de animal es un desorden recesivo enlazado por X, aproximadamente el 50% de los cachorros machos son afectados. Los animales afectados desarrollan un fuerte temblor durante la tercera semana de edad y, normalmente muere dentro de sus cuatro semanas postnatales. 4.3 Análisis histológico de los receptores del trasplante Con el objeto de detectar la formación de mielina derivada del donante, los animales receptores fueron anestesiados en la tercera o cuarta semana postnatal e, inundadas en forma transcardiaca con paraformaldehido al 4% (Sigma No. P-6148) en PBS, de acuerdo con métodos estándar. Los cerebros fueron removidos del cráneo, postfijados durante la noche a una temperatura de 4°C en la misma fijación y subsecuentemente cortados en sección de 50µm, utilizando un vibrátomo. Las células del donante fueron detectadas mediante ADN en hibridación in situ, con una muestra para ADN de satélite de ratón (Hórz & Altenburgen, Nucí. Acids Res. 9:683-696, 1981 ; Brüstle y asociados, Neuron 15: 1275-12875, 1995). La mielina derivada de las células del donante, fue visualizada con anticuerpos para proteínas de mielina, tal como proteína de mielina básica (MBP; Boehringer No.1 1 18099) o proteína de proteolípidos (PLP; un obsequio de lan Griffiths, Department of Veterinaty Clinical Studies, University of Glagow, Bearsden, Scotland). Las secciones marcadas con anticuerpos para proteínas de mielina, fueron subsecuentemente sometidas a hibridación de ADN in situ, con una muestra de ADN de satélite de ratón (Brüstle y asociados, Neuron 15: 1275-1285, 1995). Este procedimiento de marcación doble permite la identificación inequívoca de la mielina derivada de la célula del donante. Los experimentos mostraron que las células del donante implantadas en el ventrículo, emigran en una gran variedad de regiones cerebrales telencefálícas, denencefálicas y mesencefálicas (14 animales receptores analizados). Las células hibridadas fueron encontradas por ejemplo, en la corteza, hipocampo, septum, estriatum, bulbo del olfato, tálamo, hipotálamo, tectum, cerebelo, así como en el corpus callosum, comisura anterior, tractus opticus y el nervio óptico. Las acumulaciones de células del donante que no ocupan espacio, fueron observadas después del transplante en el sistema ventricular. De los 35 embriones trasplantados, 1 1 cachorros machos exhibieron síntomas de deficiencia de mielina. Ocho de estos habían recibido trasplantes intraventriculares con éxito. En seis de estos animales, la formación de mielina derivada del donante, se verificó mediante la marcación doble de las células hibridadas con anticuerpos MBP o PLP. En los 2 animales restantes, el número de células incorporadas fue muy bajo para poder realizar una evaluación confiable de la formación de mielina derivada del donante, mediante procedimientos de marcación doble. Sin embargo, la revisión inmunohistoquímica de secciones de estos animales con el anticuerpo específico de ratón M2 (Zhou y asociados, J. Comp. Neurol. 292:320-330, 1990), también mostró células gliales derivadas de donante incorporadas en el tejido hospedero. La formación de mielina derivada del donante, fue la más pronunciada en los tractos fibrosos tales como, corpus callosum, la comisura anterior y las fibras comisurales en tectum. Además, se detectó mielinización de las células del donante en regiones de materia gris, tal como corteza, septum, tálamo, hipotálamo y tectum. Siete de los ocho animales transplantes en forma exitosa, también mostraron astrocitos derivados de la célula "ES" incorporados. Los astrocidos derivados del donante, se detectaron mediante inmunohistoquímica con anticuerpos para los antigenes M2 específicos de ratón (Zhou y asoicados.J .Comp. neurol. 292:320-330, 1990), y M6 (Lund y asociados, Neurosci. Lett. 61 :221 -226, 1985) o mediante marcación doble de la células hibridadas con una muestra de ADN específíco de ratón, con un anticuerpo para la proteína acídica fibrilaria glial (GFAP, ICN No. 69-1 10). Ejemplo 5: Transplante de esferas neurológicas derivadas de la célula "ES" 5.1 . transplante de esferas neurológicas derivadas de la célula "ES" en ratas lesionadas por ácido iboténico Para evaluar el potencial de los precursores derivados de la célula "ES" mencionados en la presente descripción, para la reconstitución anatómica y funcional de las células neurológicas, las esferas neurológicas de 5 días de edad fueron generadas a partir de la línea celular "ES" J 1 , tal como se describió en el Ejemplo 3.1 . Estas esferas fueron implantadas en el estriato de ratas Sprague-Dawly adultas, las cuales habían sido sometidas previamente a una inyección estereotáxica del ácido iboténico de neurotoxin, para inducir una degeneración neurológica unilateral en el estriatum. El modelo de lesión está bien caracterizado y el protocolo de lesión utilizado durante estos experimentos, ya ha sido publicado previamente (Brüstle y asociados, Current Protocols in Neuroscience, Unit 3.10, John Wiley, New York, 1997). Durante el trasplante, las esferas flotantes fueron removidas del plato de cultivo celular y fueron transferidas en un tubo de prueba de 50 ml. Después de la adición de DNasa para una concentración final de 0.1 %, las esferas fueron sedimentadas a 150 x g durante 5 minutos en RT y fueron transferidas subsecuentemente en un tubo de prueba que contiene 2 gl/L de glucosa (Sigma No. G-7021 ), en CMG-HBSS. Las esferas suspendidas de esta forma se mantuvieron en hielo hasta la terminación del experimento de transplante (hasta 4 horas). Los animales receptores fueron anestesiados y las esferas fueron inyectadas en forma estereotáxica en el estriatum. Se utilizó una capilaridad de vidrio con un tamaño de poro de 0.25 - 0.75 mm, para la inyección. Este protocolo de trasplante está bien caracterizado y ya ha sido publicado con detalle (Brüstle y asociados en Current Protocols in Neuroscience, Unit 3.10 John Wiley, New York, 1997). Se utilizó un total de 6 animales receptores para el experimento. Las esferas que se habían acumulado en el fondo de tubo de prueba, fueron cargadas en la capilaridad de vidrio. Se inyectaron las células en el estriatum, utilizando una estructura estereotáxica (Stoelting No. 51600). Las esferas fueron suministradas a 2 (n=3) ó (n=3) diferentes sitios dentro del estriato lesionado. Las siguientes coordenadas estereotáxicas fueron usadas para la inyección: Para 2 sitios de implante: Sitio 1 : sujetador con dientes: -2.3 mm orientación anteposterior: +0.2 mm (de bregma) orientación mediolateral: 3.0 mm ( de sutura sagittal) profundidad de inyección: 5.5 mm(de dura) Sitio 2: sujetador con dientes: -2.3 mm orientación anteposterior: +0.2 mm (de bregma) orientación mediolateral: 3.0 mmf de sutura sagittal) profundidad de inyección: 4.0 mm(de dura) Para 5 sitios de implante: Sitio 1 : sujetador con dientes: -2.3 mm orientación anteposterior: +0.2 mm (de bregma) orientación mediolateral: 3.0 mm ( de sutura sagittal) profundidad de inyección: 6.5 mm (de dura) Sitio 2: sujetador con dientes: -2.3 mm orientación anteposterior: +0.2 mm (de bregma) orientación mediolateral: 3.0 mm ( de sutura sagittal) profundidad de inyección: 5.3 mm (de dura) Sitio 3: sujetador con dientes: -2.3 mm orientación anteposterior: + 0.2 mm (de bregma) orientación mediolateral: 3.0 mm ( de sutura sagittal) profundidad de inyección: 4.0 mm (de dura) Sitio 4: sujetador con dientes: -2.3 mm orientación anteposterior: + 0.2 mm (de bregma) orientación mediolateral: 3.0 mm ( de sutura sagittal) profundidad de inyección: 6.0 mm (de dura) Sitio 5: sujetador con dientes: -2.3 mm orientación anteposterior: + 0.2 mm (de bregma) orientación mediolateral: 3.0 mm ( de sutura sagittal) profundidad de inyección: 4.5 mm (de dura) Se trasplantaron 10 µl de suspensión a base de esferas en cada sitio. Para evitar el rechazo de los xenoinjertos, los animales receptores fueron sometidos a inmunosupresión. Comenzando un día antes del trasplante, los animales receptores recibieron diariamente inyecciones intraperitoneales de ciclosporin (Sandimmun, Sandoz; 20 mg/kg de peso corporal). Para evitar infecciones oportunistas durante la inmunosupresión, el agua para beber fue suplementada con tetraclclin (Achromycin, Lederle; concentración final de 100 mg/L). 5.2 Análisis del mejoramiento funcional de los receptores del trasplante De los 6 animales injertados, 4 sobrevivieron durante más de 4 semanas después del trasplante. El análisis del comportamiento de rotación inducido por anfetamina en estos animales, produjo los siguientes valores (significa el número de rotaciones por minuto): Animal No. 200: 34 días antes del trasplante: 9.7 37 días después del trasplante: 1 3.9 Animal No. 201 24 días antes del trasplante: 13.5 37 días después del trasplante 1 .3 Animal No. 204: 43 días antes del trasplante: 12.7 50 días después del trasplante: 0.5 Animal No. 205: 86 días antes del trasplante: 9.0 42 días después del trasplante: 1 .0 Durante la evaluación del comportamiento de rotación, los animales receptores recibieron una inyección intraperitoneal de sulfato de D-anfetamina (Sigma No. A-3278; 5 mg/kg de peso corporal). Comenzando a los 5 minutos después de la inyección, el número de rotaciones inducidas fue cuantificado durante un período de 90 minutos. La evaluación del comportamiento de rotación inducido por anfetamina, es un método establecido durante el análisis funcional de trasplantes estriatales y ya ha sido ampliamente publicado (Brüstle y aociados, en: Current Protocols in Neuroscience, Unit 3.10, John Wiley, New York, 1997). Los datos mostraron que 3 de cada 4 animales mostraron una clara reducción de las rotaciones inducidas por lesiones. 5.3 Análisis histológico de los receptores del trasplante Durante el análisis histológico, los animales receptores fueron anestesiados de 5 a 9 semanas posteriores al trasplante y fueron inundados transcardiacamente con paraformaldehido al 4% en PBS, de acuerdo con métodos estándares. Los cerebros fueron removidos el cráneo, postfijados durante la noche a una temperatura de 4°C en el mismo corte de fijación y cortados en forma subsecuente en secciones de 50 µm, utilizando un vibratomo. Las células del donante fueron detectadas por hibridación in situ de ADN con una muestra de ADN de satélite de ratón (Horz & Altenburgen, Nucí. Acids Res. 9:683-696, 1981 ; Brüstle y asociados, Neuron 15: 1275-1285, 1995). Las células donantes hibridadas, fueron detectadas en los sitios de implante de los cuatro animales que habían sido sometidos a análisis de comportamiento (Ejemplo 5.2). Algunas de las células del donante habían emigrado de los sitios de implante en forma adyacente a las regios del cerebro hospedero, particularmente dentro del corpus callosum. En el animal No. 200, el trasplante fue localizado dentro del ventrículo lateral alargado. En este animal, la inyección de ácido iboténico tuvo como resultado una atrofia estríatal pronunciada con el consecutivo alargamiento del ventrículo lateral. Debido a estos cambios anatómicos en las células transplantadas, se han proporcionado al ventrículo en lugar de al estriatum. La localización incorrecta del trasplante, explica la carencia del mejoramiento funcional en el análisis de rotación observado en este animal. Además de la señal de hibridación positiva, las células trasplantadas también mostraron una fuerte expresión del antigen nervioso M6 específico de ratón. La expresión de este antigen, está particularmente pronunciada en axons (Lund y asociados, Neurosci. Lett. 61 :221 -226, 1985; el anticuerpo M6 fue suministrado generosamente por C. Lagenaur, Department of Neurobiologia, University of Pittsburgh School of Medicien, 818A Scaife Hali, Pittsburgh, Pennsylvania 15261 , EUA, , y se utilizó en una dilución de 1 : 10). En los cerebros recipientes, numerosos axon positivos M6 derivados del donante, fueron encontrados para proyectarse desde el injerto en el tejido del cerebro hospedero adyacente. Estas observaciones indican que las neuronas derivadas de las esferas neurológicas injertadas derivadas de la célula "ES", enervan el cerebro hospedero.

Claims (38)

R E I V I N D I C A C I O N E S Habiendo descrito la presente invención , se considera como novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVI NDICACIONES:

1 . Células precursoras aisladas, purificadas derivadas de célula troncal embrionaria, con propiedades neurológicas y gliales, en donde dichas células precursoras no son tumorígenas después del trasplante en el sistema nervioso.

2. Células precursoras aisladas, purificados y no tumorígenas, con propiedades neurológicas y gliales, obtenidas de células troncales embrionarias y que contienen no más del 15% de células embrionarias primitivas y no neurológicas, las cuales pueden ser obtenidas mediante: (a) proliferación de células "ES". (b) cultivo de células "ES" a partir de (a) en células precursoras neurológicas. (c) proliferación de células precursoras neurológicas en un factor de crecimiento que contiene un medio libre de suero. (d) proliferación de células precursoras neurológicas a partir de (c) en otro factor de crecimiento que contiene un medio libre de suero y el aislamiento de las células precursoras neurológicas purificadas y (e) proliferación de células precursoras neurológicas a partir de (d) en otro factor de crecimiento que contiene el medio libre de suero y el aislamiento de las células precursoras purificadas con propiedades neurológicas o gliales.

3. Las células tal y como se describen en la Reivindicación 2, caracterizadas además porque las células "ES" en (a) son proliferadas para agregados celulares, particularmente cuerpos embrionarios.

4. Células precursoras aisladas, purificados y no tumorígenas, con propiedades neurológicas y gliales, obtenidas de células troncales embrionarias y que contienen no más del 15% de células embrionarias primitivas y no neurológicas, las cuales pueden ser obtenidas mediante: (a') proliferación de células "ES". (b') cultivo de células "ES" a partir de (a') en células precursoras neurológicas. (c') proliferación de células precursoras neurológicas en un factor de crecimiento que contiene un medio libre de suero. (d') proliferación de células precursoras neurológicas a partir de (c') en otro factor de crecimiento que contiene un medio libre de suero y el aislamiento de las células precursoras neurológicas purificadas y (e') proliferación de células precursoras neurológicas a partir de (d') en otro factor de crecimiento que contiene el medio libre de suero y el aislamiento de las células precursoras purificadas con propiedades neurológicas o gíiales.

5. Las células tal y como se describen en la Reivindicación 4, caracterizadas además porque las células "ES" en (a'), son proliferadas para agregados celulares, particularmente cuerpos embrionarios.

6. Las células tal y como se describen en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 5, caracterizadas además porque dichas células crecen como una monocapa.

7. Las células tal y como se describen en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 5, caracterizadas además porque dichas células crecen como esferas neurológicas.

8. Las células tal y como se describen en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 5, caracterizadas además porque contienen células con propiedades neurológicas, astrogliales y/o oligodendrogliales.

9. Las células tal y como se describen en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 5, caracterizadas además porque las células "ES" fueron obtenidas después de la transferencia nuclear en oocites.

10. Las células tal y como se describen en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 5, caracterizadas además porque las células "ES" fueron obtenidas a partir de las células germen embrionarias.

1 1 . Las células tal y como se describen en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 5, caracterizadas además porque las células son células de mamíferos.

12, Las células tal y como se describen en la Reivindicación 1 1 , caracterizadas además porque las células fueron aisladas del grupo que comprende ratón, rata, hámster, cerdo, vaca, primate y seres humanos.

13. Las células tal y como se describen en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 10, caracterizadas además porque las células fueron modificadas genéticamente.

14. Las células tal y como se describen en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 13, caracterizadas además porque las células están en una condiciones de congelación.

15. Una biblioteca celular que comprende células autologas y no autologas tal como se describieron en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 14.

16. Las esferas neurológicas que comprenden células neurológicas diferenciadas de las células precursoras, tal como se describió en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 5.

17. Las esferas neurológicas tal y como se describen en la Reivindicación 16, caracterizadas además porque son obtenidas a través de diferenciación in vitro de las células precursoras que se reivindicaron en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 5.

"18. Un método para la generación de células precursoras purificadas con propiedades neurológicas o gliales que comprenden: (a) proliferación de células "ES". (b) cultivo de células "ES" a partir de (a) en células precursoras neurológicas. (c) proliferación de células precursoras neurológicas en un factor de crecimiento que contiene un medio libre de suero. (d) proliferación de células precursoras neurológicas a partir de (c) en otro factor de crecimiento que contiene un medio libre de suero y el aislamiento de las células precursoras neurológicas purificadas y (e) proliferación de células precursoras neurológicas a partir de (d) en otro factor de crecimiento que contiene el medio libre de suero y el aislamiento de las células precursoras purificadas con propiedades neurológicas o gliales.

19. Él método tal y como se describe en la Reivindicación 18, caracterizado además porque las células "ES" en (a) están proliferadas para agregados celulares, particularmente cuerpos embrionarios.

20. El método tal y como se describe en la Reivindicación 18 o 19, caracterizado además porque el factor de crecimiento que contiene un medio libre de suero en (c), comprende bFGF.

21 . El método tal y como se describe en cualesquiera de las Reivindicaciones 18 ó 20, caracterizado además porque el factor de crecimiento que contiene el medio libre de suero en (d) que comprende bFGF y EGF.

22. El método tal y como se describe en cualesquiera de las Reivindicaciones 18 ó 21 , caracterizado además porque el factor de crecimiento que contiene el medio libre de suero en (e), comprende bFGF y PDGF.

23. El método para la generación de células precursoras purificadas con propiedades neurológicas o gliales, el cual comprende: (a') proliferación de células "ES". (b') cultivo de células "ES" a partir de (a') en células precursoras neurológicas. (c') proliferación de células precursoras neurológicas en un factor de crecimiento que contiene un medio libre de suero, (d') proliferación de células precursoras neurológicas a partir de (c') en otro factor de crecimiento que contiene un medio libre de suero y el aislamiento de las células precursoras neurológicas purificadas y (e') proliferación de células precursoras neurológicas a partir de (d') en otro factor de crecimiento que contiene el medio libre de suero y el aislamiento de las células precursoras purificadas con propiedades neurológicas o gliales.

24. El método tal y como se describe en la Reivindicación 23, caracterizado además porque las células "ES" en (a'), está proliferadas para agregados celulares, particularmente cuerpos embrionarios.

25. El método tal y como se describe en la Reivindicación 23 ó 24, caracterizado además porque comprende adicionalmente el paso (f) Manipulación de la diferenciación de las células precursoras gliales a partir del paso (e'), hacia un destino astrocítico o oligodendroglial y el aislamiento de las células precursoras con propiedades astrocíticas o oligodendrogliales.

26. El método tal y como se describe en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 23 a la 25, caracterizado además porque el factor de crecimiento que contiene el medio libre de suero en (c'), comprende bFGF.

27. El método tal y como se describe en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 23 a la 26, caracterizado además porque el factor de crecimiento que contiene el medio libre de suero en (d'), (e') y (f ), comprende bFGF y/o EGF.

28. El método tal y como se describe en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 23 a la 27, caracterizado además porque el medio en (f), comprende ya sea CNTF ó T3.

29. El método tal y como se describe en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 18 a la 28, caracterizado además porque el procedimiento está combinado con las técnicas de separación celular y clasificación celular.

30. El método tal y como se describe en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 18 a la 29, caracterizado además porque las células precursoras purificadas están suspendidas en un medio adecuado para inyección. 10

31 . El uso de las células precursoras tal y como se describe en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 15, durante la terapia de defectos neurológicos. 15

32. El uso de las células precursoras tal y como se describe en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 15, durante la reconstitución de células neurológicas. •

33. El uso de las células precursoras tal y como se describe en 20 cualesquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 15, durante la remielinación de áreas demielinadas del sistema nervioso.

34. El uso de las células precursoras tal y como se describe en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 15, durante la 25 transferencia del gen mediado por célula en el sistema nervioso.

35. El uso de las células precursoras tal y como se describe en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 15, durante la generación in vitro de polipéptidos. •

36. El uso de las células precursoras tal y como se describe en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 15, durante el trasplante en el sistema nervioso. ^ 10

37. El uso de las esferas neurológicas, tal y como se describe • en la Reivindicación 16 ó 17, durante el trasplante en el sistema nervioso. 38, Una composición farmacéutica que contiene las células 15 precursoras tal y como se describen en cualesquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 15, durante la terapia de defectos neurológicos. • R E S U M E N La presente Invención se refiere a células precursoras neurológicas purificadas y aisladas, a un método de producción de las mismas a partir de células troncales embrionarias en cantidades ilimitadas, al uso de células precursoras neurológicas en la terapia para defectos neurológicos, especialmente en mamíferos, preferentemente humanos, y a la obtención de polipéptidos.