CN1325637C - 室管膜神经干细胞及其分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及室管膜神经CNS干细胞，该细胞表达表面蛋白Notch 1以及至少一种选自Notch 2，Notch 3，CAR(结合腺病毒的跨膜蛋白)和CFTR(囊性纤维化跨膜传导调节蛋白)的表面蛋白，而且该细胞还含有至少一个纤毛。本发明还涉及包含室管膜神经CNS干细胞的各种制品包括药物制剂，基于该制品的体内和体外的测定，和本发明的新室管膜细胞的各种其它应用。

Description

室管膜神经干细胞及其分离方法

技术领域

本发明涉及分离未被鉴定未从哺乳动物中枢神经系统分离过的室管膜神经CNS干细胞的方法。本发明还涉及包含这些新细胞本身的制品、含有这些制品的药物组合物和其各种医学用途以及使用这些细胞的测定方法。

背景

基于在成年哺乳动物脑中不能产生新神经元的假设，直到最近几年，中枢神经系统(CNS)中神经细胞命运“静止”的观点仍普遍流行。然而，已报道了在成年CNS的某些区域，例如嗅觉器官神经元的信号到达大脑的部位嗅球(Kaplan等，科学(Science)197：1092)和海马的齿状回(Bayer等，科学216：890)中神经元的更新。因为神经元不能分裂，新神经元的增加提示存在可产生神经元的未成熟细胞，即祖细胞或干细胞。几年前提出了支持成年哺乳动物CNS中存在多能神经干细胞的证据(Reynolds等，科学255：1707)。然而，与其它几种器官中一样，意识到干细胞的存在早于其鉴定和定位。有趣的是，在啮齿类动物的整个成年期均存在成年脑的神经发生(Kuhn PG，神经科学杂志(J.Neurosci.)16：20)，而且这似乎是存在于各种哺乳动物中的一种进化上相当保守的现象(Gould等，神经科学杂志17：2492，Gou1d等，美国科学院院刊(Proc.Natl. Acad.Sci.USA)95：3168)。尽管成年人脑组织培养(Kirschenbaum等Cereb.Cortex 6：576)的实验数据提示在成年人CNS中也可能存在持续的神经发生，但问题是难于证实。

成年哺乳动物CNS中神经干细胞的存在首先是通过培养成年鼠脑和脊髓的细胞来证实的。在一定培养条件下，从分离的成年大鼠脑和脊髓可增殖多能神经干细胞群体(Reynolds等，科学255：1707，发育生物学175：1，Weiss等，神经科学杂志.16：7599)。培养基必需包含促细胞分裂因子如表皮生长因子(EGF)或成纤维细胞生长因子(FGF)，而且必需排除血清。与干细胞相比，大多数其它CNS细胞类型在这些培养基中不能存活。

在这些条件下，单个细胞可体外增殖，后代形成聚集细胞团(Reynolds等，科学255：1707，发育生物学175：1)。体外培养几天后，这些细胞克隆与培养皿脱离。这些细胞继续增殖形成细胞紧密聚集的特征性球状细胞聚集体，称为神经球(neurosphere)，所有这些细胞均来自一个单一细胞。在神经球中大多数细胞表达nestin(Lendahl等.细胞(Cell)，60：585)，但并没有分化细胞的典型标志。如果接种在附着基质上或向培养基添加血清，这些未分化细胞迅速分化。重要的是，来自单个细胞的细胞克隆可产生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，提示至少初始细胞是多能的(Reynolds等.科学255：1707，ibid.发育生物学175：1)。而且，如果细胞克隆被解离，许多细胞将形成新的未分化多能细胞团(Reynolds等，发育生物学175：1)，因此满足作为干细胞的标准。

因此，上述方法存在严重缺陷，即所用细胞群体具有复杂的混合组成。即使可以增强某些类型细胞的生长，对所获细胞的原始定位不可能得出任何结论。

因此，提出了其它方法来确定成年CNS干细胞的定位，其中仔细分离和培养成年啮齿类动物前脑的不同部分以测定神经发生的能力。这些研究证实干细胞在侧脑室壁和海马中最为丰富(Lois等，美国科学院院刊，90：2074，Morsehead等，神经元(Neuron)13：1071，Palmer等，分子细胞神经科学(Mol.Cell.Neurosci.)6：474，ibid，8：389)。而且，可从第三和第四脑室以及成年脊髓中分离干细胞，提示整个脑脊髓的室系统附近存在干细胞(Weiss等，神经科学杂志16：7599)。

然而，神经干细胞的确切定位和本质仍然是个迷。侧脑室壁一直是深入形态学研究的对象(Doetsch等，神经科学杂志17：5046)。脑室系统覆盖了单层室管膜细胞。哺乳动物室管膜细胞传统上被认为是高度特化的细胞，其主要功能是在神经组织和脑脊液之间形成屏障(Del Bigio，Glia14：1)，这对这些细胞是未分化干细胞的看法提出强烈质疑。室管膜层之下是室管膜下层，即脑室下区(subventricular zone)。该区域含有星形胶质细胞、成神经细胞和祖细胞(Doetsch等，神经科学杂志17：5046)。室管膜下层祖细胞具有很高的增殖速率(Morsehead等，神经科学杂志12：249)。一般地，干细胞增殖非常缓慢，而且当选择性杀死快速增殖的室管膜下层细胞时，干细胞群体并不减少，这对这些细胞是未分化干细胞的看法提出质疑(Morsehead等，神经元13：1071)。

WO 97/44442(Johe)公开了从哺乳动物CNS，更具体地从覆盖侧脑室的纹状体室管膜下区分离干细胞的方法。然而，仅采用了室管膜下细胞，因此对于哺乳动物室管膜细胞的本质和作用没有进一步的改变传统观点的看法。

WO 95/13364(Weiss等)涉及增殖位于哺乳动物CNS脑室附近的CNS前体细胞的方法。然而，仅公开了前体细胞，没有关于其它细胞阶段如干细胞的内容。

在本文中，令人感兴趣的是注意到除了嗅球和海马之外，关于整个成年期哺乳动物脑其它区域中持续神经发生的资料很少。作为神经发生可能是一种更为普遍现象的例子，已从纹状体和隔膜分离了能体外产生神经元的少数细胞(Palmer等，分子细胞神经科学6：474)，尽管未测定过这些细胞是否具有干细胞性质或是否它们是神经元祖细胞。

越来越多的证据说明神经系统损伤可影响成年CNS中的干细胞。在脊髓和脑损伤之后，nestin表达在覆盖中央管的细胞和脑室下区中均增加(Frisen等，细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)131：453，Holmin等.欧洲神经科学杂志(Eur.J.Neurosic.)9：65)。提示这些细胞来源于干细胞。随着时间的推移，可观察到来源于中央管和侧脑室的nestin表达细胞日益增多，而且这些细胞表达星形细胞标志(Frisen等，细胞生物学杂志131：453，Holmin等，欧洲神经科学杂志9：65)。这些数据提示脑室系统附近的干细胞或祖细胞被诱导增殖，向损伤部位迁移并分化成星形细胞。而且，海马损伤促进海马祖细胞的增殖并增加海马颗粒神经元的数目(Gould等，神经科学(Neurosci.)80：427)。然而，由于干细胞一直未获得鉴定或确切定位，所以干细胞是否在损伤过程起作用仍不清楚。

Doetsch等(细胞(Cell)97：703)最近试图分析成年脑侧脑室壁中的神经干细胞的性质。他们提供了几个实验，说明干细胞表达神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)。GFAP在许多星形细胞中表达，Doetsch等得出他们所述的干细胞是星形胶质细胞。然而，他们和其它研究组的大量实验明确地说明GFAP在若干其它细胞类型中也表达，如某些肝细胞、无髓神经膜细胞、伸长细胞和室管膜细胞。这使得不可能根据GFAP的表达得出他们描述的干细胞是星形胶质细胞的结论。Doetsch等或任何其它研究组均未证实神经干细胞表达星形胶质细胞的特异标志。

WO 99/16863公开了从哺乳动物多能神经干细胞产生造血细胞。因此，可给白血病、淋巴瘤或免疫缺陷患者施用神经干细胞，而无需骨髓移植。然而，该文献完全未涉及其它器官的再生。

因此，在哺乳动物成年CNS中发现神经干细胞的存在是重要的，而且使得可开发刺激产生新神经元或神经胶质细胞的策略。然而，几个重要的问题尚未回答，而且需要培养这些细胞和体内定量研究这些细胞的更好方法。最重要的是，在成年CNS中鉴定和定位干细胞是绝对关键的，以便能进一步研究干细胞和从这些细胞刺激产生新神经元。

而且，目前没有在组织培养早期阶段纯化干细胞的方法。尽管已有一些在其它组织中纯化细胞群体的一般方法，但是没有对干细胞真正本质的了解，不可能利用这些方法或开发新方法。为了筛选药物化合物需要进一步研究更好地阐明的细胞群体。而且，需要开发体内标记和跟踪干细胞和其后代的定量方法，以便详细研究例如产生新神经元的调节，以分析不同化合物的作用或对这些干细胞进行遗传操作。尽管本领域已有可用于体内跟踪其它细胞类型的方法，但是不可能利用这些方法或开发新方法跟踪干细胞，因为干细胞的本质仍不清楚。在神经变性疾病和CNS损伤动物模型中跟踪干细胞及其后代的定量方法的开发将开辟在人疾病中筛选新的治疗策略的可能性，目前这些疾病仅可减轻一些症状而不是神经元损伤本身。

因此，本领域的一个问题是即使已知神经干细胞存在，其定位和本质仍然未知。如果回答了该问题，旨在达到上述目标的研究将会获得巨大的进步。

本发明概要

本发明的目标是解决上述问题。根据本发明，这通过鉴定神经干细胞的来源和本质，以及从CNS组织选择性分离这些干细胞来实现。因此，本发明基于在室管膜层中发现的细胞是神经干细胞这一惊人发现。因此，本发明提供权利要求1定义的室管膜神经CNS干细胞。本发明还提供从室管膜层分离这些室管膜神经CNS干细胞的方法。因此，本文首次公开神经干细胞的确切本质和定位，从而使各种有利的用途及其在医学和诊断领域中的应用成为可能。本发明还涉及体外和体内测定方法以及药物组合物，其中有利地使用了根据本发明的新发现。

附图简要说明

图1显示了室管膜细胞的特异性标记，并示意了神经元在成年前脑和侧脑室壁结构中的迁移。

图2显示嗅球神经元和神经球的产生。

图3显示具有室管膜细胞特异标志的神经干细胞的富集。

图4通过显示在持续施用5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)两周(A，B)或施用两周然后停用BrdU一周(C，D)之后侧脑室侧壁中BrdU的免疫组织化学检测，说明室管膜细胞的增殖。

图5公开了损伤如何诱导室管膜细胞增殖。

图6显示脊髓损伤后从室管膜细胞产生星形胶质细胞。

图7显示了转基因动物来源的纯化干细胞的移植。

图8显示成年小鼠干细胞在黑质中产生神经元。

图9说明干细胞或其后代在中脑中的迁移流。

图10显示了定位于室管膜层中的干细胞在海马中产生神经元。

图11显示室管膜CNS干细胞有助于产生多种器官的能力。

图12显示成年神经室管膜干细胞有助于产生胸部特化组织。

图13显示成年神经室管膜干细胞有助于产生腹部特化组织。

定义

在本申请中，术语“分离的”是指从动物或人分离并纯化至至少约10％，优选至少约30％，更优选至少约50％，最优选至少约60％如约80％的细胞部分。在本发明这方面的一个具体实施方案中，分离细胞的纯度是接近100％，如约90％。在纯度约90％的这种细胞群体中，也许仅约4％的干细胞清楚地作为“活跃”干细胞，而其余干细胞是静止的，尽管它们可能具有转化成这种“活跃”干细胞的能力。“活跃”干细胞定义为可自我更新的多能细胞。术语“神经干细胞”涉及在适当条件下如在含有适当促细胞分裂剂的培养基中能产生未分化细胞的聚集体即所谓的神经球的细胞。“室管膜细胞”是指部分或完全存在于CNS脑室系统的室管膜层中的任何细胞或位于别处的相同类型细胞。本文中“室管膜细胞”定义为包括任何具有从出生后CNS组织室管膜细胞层分离的室管膜细胞特征的任何细胞。在本文中应理解，表征本发明干细胞的特征是产生新干细胞、前体细胞或祖细胞以及新神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力。室管膜神经干细胞也表达一些能用于分离和鉴定目的的细胞表面标志，如Notch1(跨膜受体)、Notch2、Notch3、CAR(结合腺病毒的跨膜蛋白，Tomko等，美国国家科学院院刊，94：3352)和CFTR(囊性纤维化跨膜传导调节蛋白，Kunzelmann Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.137：1)。室管膜神经CNS干细胞还包括至少一个纤毛。本文术语“成年”用于区分已在胚胎中鉴定的神经干细胞和来自出生后哺乳动物的本发明神经干细胞。因此，成年干细胞本质上是非胚胎干细胞。

对于本发明，室管膜组织的离解可优选使用选自胶原酶、胰蛋白酶和透明质酸酶的酶以及犬尿酸进行。室管膜组织也可单独通过机械分离或联合一或多个上述酶进行分离。

本发明详细描述

本发明涉及成年神经CNS干细胞室管膜干细胞，换句话说是位于室管膜层的神经干细胞。因此本发明提供神经干细胞，其特征是具有室管膜细胞的特征。更具体地，在第一个方面，本发明涉及室管膜神经CNS干细胞，该细胞表达表面蛋白Notch1和至少一种选自Notch2、Notch3、CAR(结合腺病毒的跨膜蛋白)和CFTR (囊性纤维化跨膜传导调节蛋白)的表面蛋白，而且该细胞还包含至少一个纤毛。

在第二方面，本发明涉及从成年或出生后CNS组织分离室管膜神经CNS干细胞的方法，该方法优选包括解离室管膜组织和从中回收所述室管膜神经CNS干细胞。所述解离可通过本领域技术人员容易选择的任何适当方法进行。细胞通过采用适当技术与存在的任何不需要的物质分离来回收，所述不需要的物质的数量和质量根据获得组织所用程序和条件不同而有不同。

因此，本发明的这一方面依赖于从出生后CNS组织分离特定类型细胞。本领域技术人员将容易理解，这可通过各种方式实现。因此，例如如上所述，室管膜细胞层可从神经组织解剖下来，然后处理以从中分离室管膜细胞。因此，室管膜组织可选择性地解离，并从中分离或回收室管膜干细胞。

此外，室管膜干细胞可从可能含有不同组织类型的CNS组织制品中选择性分离。因此，例如，可解剖含有室管膜细胞层以外组织的较大区域脑组织，并通过例如仅回收具有室管膜细胞特征的细胞从中选择性地分离室管膜细胞。如下文所详述，这可通过例如使用亲和分离技术来实现，其中亲和分离技术使用对室管膜细胞特异细胞表面标志具有特异性的亲和试剂。

因此，室管膜干细胞优选解离成单个细胞，然后分离。这通过从所述方法获得的细胞中筛选显示室管膜神经干细胞至少一个特征或特性的细胞来提供。现有技术中已描述了成年的神经干细胞，本领域技术人员将根据主要条件决定最佳筛选方法。

在本方法的一个有利实施方案中，组织是从所述人或动物脑或脊髓的室系统壁的室管膜层收集的。通过任何适当传统方法，本领域技术人员可容易地进行组织的这种解剖和回收。解离步骤可使用任何适当方法进行，如酶和/或机械处理，而且只要结果获得期望的单个细胞，解离步骤不受任何限制。这些方法的例子是例如研磨、胰蛋白酶处理、胶原酶处理和透明质酸酶处理。最优选地，解离通过用胰蛋白酶处理进行。组织解离也可通过本领域技术人员考虑主要条件容易选择的任何其它方法来进行。

如上所述，所获细胞如单个细胞的筛选可根据所用室管膜细胞的特征、特性或性质按任何适合的方法进行。在本方法的一个实施方案中，筛选使用了特异细胞表面标记例如蛋白质的表达。这种表面蛋白质的表达可以是例如以前曾在文献中公开过但是在其它背景下公开的Notch1、Notch2和/或Notch3受体的表达。在该方法的最优选实施方案中，筛选表达Notch1受体的单个细胞。在本发明该方面的另一个实施方案中，单个细胞的筛选使用了先已标记的室管膜细胞。这种标记可是染料和有利的荧光标记例如实施例1所述的Dil。Dil曾在其它背景中公开过，是本领域技术人员所熟知的。细胞的标记在研究及诊断方法中均有广泛的使用，因此技术人员将容易选择合适的技术。在另一个实施方案，可使用病毒，例如腺病毒或慢病毒。

在另一方面，本发明涉及包含室管膜神经CNS干细胞的制品。这种制品可通过本文中公开的任何分离方法获得。该制品包括神经干细胞，其含量至少约10％，如10-50％，如约35％，或在优选实施方案中高达90％，或最优选基本纯的培养物。优选地，至少约4％的这些细胞是完全活跃干细胞。自然，根据所选择的筛选方法可获得高得多的浓度。以前，在现有技术操作中，分离脑的各部分并加入特定的生长因子以诱导特定细胞类型的生长。这些操作可能最终产生相对高浓度的细胞，然而需要几天的生长。最重要的是，这些操作从未力图在培养过程的早期阶段获得纯的干细胞群体，因为在本发明之前干细胞的本质和特征(例如特异的细胞表面标记的表达)是未知的。因此，事实上，本方法产生了所需浓度的以前未曾鉴定和/或定位的细胞类型，即本文所公开的室管膜干细胞。在一个具体的实施方案中，该产物含有约90-95％的室管膜神经干细胞。在一个有利的实施方案中，该方法的产物是几乎完全由(即约100％的)室管膜神经干细胞组成的细胞部分。因此，本方面还涉及通过根据本发明的方法获得的分离的神经干细胞以及分离的神经干细胞的任何部分。

在另一方面，本方法制备的室管膜神经干细胞可以被遗传修饰。可进行操作以修饰细胞的各种性状，例如使其更适应或抵抗特定的环境条件、诱导其产生一或多种特定物质，例如可改善细胞的生存能力或可用作药物的物质。关于根据本发明的这些被操作细胞的优点和可能性的进一步细节将在以下的“讨论”部分给出。为了使细胞更适合用于移植，例如避免受体对它的排斥可进行一些这样的遗传改变(关于基因治疗操作的论述参见，如Anderson，科学256：808；Nabel和Felgher TIBTECH 11：211；Mitani和Caskey TIBTECH 11：162；Mulligan Science 926；DillonTIBTECH 11：167；Miller自然(Nature)357：455；Van Brunt生物技术(Biotechnology)6(10)：1149；Vigne Restorative Neurology andNeuroscience 8：35；Kremer和Perricaudet英国医学通报(BritishMedical Bulletin)51(1)31；Haddada等，微生物和学和免疫学最新主题(Current Topics in Microbiology and Immunology)，Doerfler和Bhm(编)Springer-Verlag，德国Heidelberg；和Yu等，基因治疗(GeneTherapy)1：13)。因此，本发明还包括基因治疗方法，其中使用神经干细胞以及欲在这些方法中使用的含有根据本发明的细胞的制品。这些基因治疗方法可用于治疗和/或预防CNS神经元或胶质细胞受损伤或缺陷的任何疾病。

在另一方面，本发明涉及含有用于治疗的神经干细胞的组合物，例如作为药物。此外，本发明还涉及神经干细胞在制备治疗制剂如药物中的应用，以调节中枢神经系统如脑的神经发生或神经胶质发生。该调节可是诱导性的或抑制性的，治疗可针对帕金森症、Alzheimer病、中风、脑外伤等。对于神经胶质细胞，该药物可用于治疗多发性硬化症和其它神经胶质细胞相关病症。这些组合物还可用于产生其它组织，例如含有心脏心房和心室壁的心肌膜、背主动脉、和生殖嵴原基和中肾小管。其它可产生的器官例子有眼睛的视柄、视网膜层和晶状体，内耳，肝，胰脏和其它内分泌器官。在本发明的一个具体实施方案中，本发明的这些方面使用由上述方法获得的神经干细胞，甚至为了本目的本发明还包括任何神经干细胞的使用，例如遗传修饰的神经干细胞。

因此，本发明涉及含有至少一种根据本发明的室管膜神经干细胞和药学上可接受的载体的药物制剂。根据本发明的这些制剂可适于注射至中枢神经系统的适合部位。这种药物制剂包括任何适当的载体，例如水性载体如缓冲盐等。该制剂的活性组分一般是无菌的而且没有任何不需要的物质。此外，该制剂可包含为接近生理状态所需要的药物学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂等。该制剂中本发明神经干细胞的浓度将根据应用目的而不同，因此其剂量由病人的医师来决定。所用神经干细胞可通过本方法和任何其它适当方法分离或以任何其它方式获得。在一个优选实施方案中，本发明干细胞可被遗传操作，以特别适用于其目标用途。

在另一方面，本发明的细胞可施用给病人，其中这种施用是治疗上有用的。另外，通过施用本发明的细胞，本发明的细胞可用于替换或补充患者的相应细胞类型。本发明的细胞可用于包被植入物，从而充当植入物和患者之间的屏障。本发明细胞的施用可通过本领域技术人员已知的方法进行。

在另一方面，本发明还涉及包含根据本发明的遗传修饰的室管膜神经干细胞的动物如小鼠。这些动物可用作例如研究或测试新药物的模型。

在另一方面，本发明涉及本发明干细胞用作“药物靶标”，优选用于体外实验，以刺激干细胞产生特定神经元表型或神经胶质细胞亚型。在一个具体实施方案中，本发明涉及所述细胞在新神经元体外培养中的应用。该应用可涉及例如培养分离的神经干细胞，见如下“讨论”部分详述。本发明还涉及通过上述应用获得的物质。

在另一方面，本发明涉及优选在体内实验中用于评价脑的各个区域的神经元发生和干细胞后代的迁移流的无偏定量或定性方法，优选定量方法，以及用于分析迁移至各脑区的干细胞和其后代总数的技术。这可用于开发新的筛选方法，这些方法正如所附权利要求中定义的一样属于本发明的范畴。如果适合正电子扫描断层摄影技术(PET)或其它能以足够分辨率显现活体大脑的成像系统的室管膜细胞标记的开发允许诊断人CNS中干细胞后代的缺陷迁移和/或分化，这可以用于诊断患神经变性疾病的患者。因此，本发明还涉及实施这些方法的试剂盒和分析方法，以及由本发明方法获得的物质。

在最后一个方面，本发明涉及治疗患神经变性疾病的人或动物的方法，该方法包括给所述人或动物施用药物学上有效剂量的室管膜神经干细胞。一般来说，该方法是基于施用具有完整功能并能根据人CNS疾病产生神经元或其它细胞类型的本发明的室管膜神经干细胞。或者，可将体外干细胞产生的神经元或神经胶质细胞施用于CNS。在另一个实施方案中，本发明涉及治疗和/或防止人或动物患者的神经变性病症的方法，其中现有缺陷神经干细胞产生新神经元并迁移至合适目的地的能力被修复。该方法是基于施用可刺激和诱导神经干细胞自身性质和产生神经元能力的物质。或者，该方法可基于施用确实抑制神经元变性过程的物质。

因此，可根据本领域已知的适于移植位点的任何方法将本发明的细胞移植给患者，以治疗疾病或损伤。

本发明细胞的施用方法包括但不限于皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、和硬膜外途径。本发明的细胞可通过任何方便的途径例如输注或大团注射、通过上皮或皮肤粘膜表层(如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)的吸收来施用，也可联合其它生物活性试剂一起施用。施用可是系统的或局部的。此外，可能希望使用任何合适的途径，包括脑室内和鞘内注射，将本发明细胞导入中枢神经系统；脑室内注射可使用例如与储液器例如Ornmaya储液器相连的脑室内导管来进行。

可能希望给需要治疗的位置局部施用本发明的细胞；这可通过例如但不限于手术中的局部注入、局部涂药例如联合手术后的伤口敷料、注射、通过导管或植入物来实现，其中所述植入物是多孔、非多孔或凝胶状物质，包括膜如sialastic膜，或纤维。

以下描述示例性方法，其可被修饰用于转化细胞的移植：分离和移植人胚胎组织的操作已有报道，而且进行了涉及这些研究的临床实验。例如，Lindvall，科学247：574，曾描述过关于移植物和胚胎多巴胺神经元在移植入大脑后的存活的结果。如需要，可通过对Lindvall，Arch.Neurol.46：615中所述方法的改换进行前体细胞的洗涤和部分解离。

作为例子，细胞植入大脑可按如下方法进行。使用立体定向技术在左壳(豆状核)三个位置进行植入(Lindvall，Arch.Neurol. 46：615)。对于每一位置，吸取201的分离细胞加至装置中(外直径，1.0mm)。细胞分别沿10、12和14mm线形道按每15-20秒2.51的量注射。每次注射之间有2分钟间隔，然后将管子后撤1.5-1.7mm。最后一次注射后，管子在原位保持8分钟，然后缓慢将其撤出大脑。手术后，细胞的存活能力按Brundin，Brain.Res.331：251所述方法评价。

另一例子见Caplan等，1993，美国专利5,226,914。简要地说，从骨髓栓和髓间质收获骨髓细胞后，通过离心分离干细胞。干细胞通过选择性粘附于组织培养皿的塑料或玻璃表面来进一步分离。干细胞被允许增殖，但不分化。在轻微真空下将由60％的羟基磷灰石和40％的磷酸三钙构成的多孔陶质立方体加入细胞中。在沿裸鼠背部的切口中植入粘有细胞的立方体。间质干细胞分化成骨。

在治疗特定疾病或症状中有效的移植细胞滴度将依据疾病或症状的性质决定，并可由标准临床技术确定。此外，可任选地使用体外分析来帮助确定最佳剂量范围。在制剂中使用的精确剂量还依赖于给药途径和疾病或病症的严重性，应根据医师的判断和每个病人的环境来决定。

本发明还提供含有一或多个容器的药物包或盒，这些容器中装有一或多种本发明药物组合物的成分和/或制备本发明药物组合物的试剂。按照管理药物或生物产品的生产、使用或销售的政府机构所规定的形式，可任选性地将这些容器与说明放在一起，该说明反映生产、使用或销售管理机构对人体施用的许可。

本发明的细胞还可在培养基中维持以用于研究包括医学研究。例如，细胞可用于筛选具有已知功能的测试化合物是否具有将本发明细胞分化为不同细胞类型的能力。

附图详细说明

图1：室管膜细胞的特异标记

图示成年前脑和侧脑室壁结构中的神经元迁移(A)。脑室(V)被室管膜细胞(E)包被。在室管膜层和纹状体(S)间是脑室下区域(SVZ)，前体细胞(浅蓝色)在此分裂产生未成熟神经元(深蓝色)。神经元迁移至嗅球(蓝箭头)。(B)室管膜细胞的标记。将Dil立体定位注射至侧脑室，导致整个脑室系统的室管膜细胞的标记。在一些动物中，切口(脊髓横截面图中的灰色区域)位于脊髓的背索中。注射后6小时Dil标记了包被侧脑室(C，D)和脊髓中央管(E)的室管膜层。脉络丛(CP)在(C)中被标记。

图2：嗅球神经元和神经球的产生

在Dil(A，C)或表达LacZ的复制缺陷型腺病毒(B，D)注射入对侧侧脑室后10天，在脑室下区域(A，B)和嗅球(C，D)中可见标记的细胞。(C)中的插图显示βIII-微管蛋白-免疫反应性神经元中的Dil。亮视野(E)和荧光(F)显微照相显示来自接受脑室内Dil注射的动物脑的神经球。箭头指示两个非常微弱标记或未被标记的神经球。

图3：具有室管膜细胞特异标志的神经干细胞的富集

侧脑室壁(A)和脊髓(B)中的Notch1免疫荧光定位。Notch1免疫反应性局限于包被侧脑室和中央管的室管膜细胞。Notch1对室管膜细胞的选择性定位使得可以从急性分离的脑和脊髓组织中富集室管膜细胞。在抗Notch1的抗血清中孵育分离的细胞，之后细胞和连有二抗的磁珠一起孵育，然后磁性分离标记的(Notch1部分)和未标记的(洗脱部分)细胞。在对照实验中，省掉了最初的抗血清。计算每一部分的细胞数目，并计数不同培养物中产生的神经球的数目(C)。

图4：室管膜细胞的增殖

持续2周施用BrdU后(A，B)或施用两周BrdU然后停用一周之后(C，D)在侧脑室壁中免疫组化检测BrdU。(B)和(D)分别显示(A)和(C)的细节。(B)和(D)中箭头指示标记的室管膜细胞。

图5：损伤诱导室管膜细胞的增殖

施用BrdU 8小时(A，D-F)或两周(B，C)后在脊髓中免疫组织化学检测BrdU。(G)为吸收处死前最后8小时中所施用BrdU的脊髓室管膜细胞的比例(BrdU标记的核/碘丙锭显示的室管膜细胞核总数，在每一个时间点上n＝3-5只大鼠，误差线显示SEM)。

图6：脊髓损伤后从室管膜细胞产生星形胶质细胞

Dil、nestin和GFAP免疫反应性在脊髓中的分布。(D-F)中动物在分析前4周接受一次背索损伤。损伤前所有动物接受一次脑室内Dil注射。(A-F)中Dil和nestin的免疫反应性显示在相同的区域，GFAP的免疫反应性位于临近区域。(D)中用虚线显示了损伤区域的大概轮廓。(G)显示了损伤后2周背索中的Dil(红色)和GFAP(绿色)的免疫反应性。黄色信号显示了Dil和GFAP免疫反应性的共定位。(H)共聚焦激光扫描显微镜观察损伤后2周瘢痕组织中Dil和GFAP的免疫反应性。楔形符号显示两个GFPA免疫反应性的Dil标记细胞，箭头显示不出现任何可检测GFAP信号的Dil标记细胞。

图7：神经干细胞的移植

来自表达LacZ的转基因小鼠的纯化干细胞移植至成年大鼠的纹状体。箭头指示移植细胞群。(B)显示(A)的细节。

图8

成年大鼠中室管膜层干细胞在黑质中产生神经元。4个月前将荧光染料施用给成年动物后，啮齿类动物中黑质致密部的黑质酪氨酸羟化酶阳性神经元(绿色)的显微照片也标记了Dil(红色)。箭头指示含有标记室管膜神经干细胞的荧光标记的两个黑质多巴胺神经元。

图9

小鼠中脑中室管膜层来源的干细胞或其后代的迁移流。箭头指示Dil标记室管膜细胞的腹侧正中迁移流(红色细胞)，到达中脑黑质致密部(*)。SNR＝黑质网状部，IP＝脚间核。箭头显示侧位(l)和腹位(v)。分别鉴定了到达黑质致密部的吻部、尾部、中部和侧部的几个路径。除了描述的腹侧正中流，还鉴定了背侧和中线流。

图10

定位于室管膜层的干细胞在小鼠海马中产生神经元。显微照片说明Dil标记的室管膜细胞或其后代迁移至海马齿状回的粒细胞层。箭头显示侧位(l)和腹位(v)。

图11

(A)中显示了一个野生型胚龄11天的胚胎(左)和一个嵌合胚胎(右)，该嵌合胚胎由成年Rosa26小鼠来源的脑神经干细胞注射的胚泡产生。在野生型胚胎中有一些与听泡相关的内源性X-gal标记。在注射过的胚胎的几种组织中，包括例如心脏和CNS，成年神经干细胞来源的细胞的贡献是明显的。在(B)中，来源于羊膜(A)、头区(H)、胸区(Th)或尾区(C)的lacZ cDNA通过RT-PCR扩增。说明嵌合性的lacZ mRNA的表达在3个注射过的胚胎中被观察到，而在对照中则设有。针对L19的引物用作内对照。

图12

在经过11天胚龄胚胎胸腔的切片中β-半乳糖苷酶(A，B)结蛋白(C，D)的免疫组织化学检测。(E)和(F)中β-半乳糖苷酶(绿色)和结蛋白免疫标记(红色)显示在一起，说明在心脏中的共定位。

图13

在经过11天胚龄胚胎上腹腔的切片中β-半乳糖苷酶(A)和结蛋白(B)的免疫标记。肝脏显示强β-半乳糖苷酶表达(A)。(C)中β-半乳糖苷酶和结蛋白免疫染色显示在一起，说明在肠中的共定位。(D)显示肠中β-半乳糖苷酶的免疫标记。

实施例

1.室管膜细胞及其后代的体内标记

为检测神经元是否可由室管膜细胞产生，我们将荧光标记Dil或表达LacZ报告基因的复制缺陷型腺病毒注入成年大鼠或小鼠的侧脑室。重280-320g的雄性Sprague-Dawley大鼠或重25-30g的雄性C57BL/6小鼠用水合氯醛(400mg/kg)麻醉。在前囟后0.9mm(大鼠)或0.5mm(小鼠)、前囟旁侧1.4mm(大鼠)或0.7mm(小鼠)处，硬膜下4mm(大鼠)或2mm(小鼠)，单侧立体定位注射10ul(大鼠)或3ul(小鼠)溶于DMSO的0.2％w/v Dil(分子探针)或50ul腺病毒溶液(含有10⁹噬菌斑形成单位)至侧脑室。注射导致整个脑室系统的室管膜层的特异标记；在脑室下区域和脑实质中均未见到标记(图1)。因此，该方法使得可以特异性地跟踪标记的室管膜细胞和其后代的命运。Dil分布的分析显示在吻部迁移流中标记细胞的数目增加(Goidman等，Trends Nerurosci21：108)，而且10天后在嗅球中最初见到Dil标记的神经元，在成年哺乳动物中嗅球中不断增进新神经元(图2)。同样，注射腺病毒的动物中，注射后10天在嗅球中发现LacZ表达细胞，虽然正如预期的那样与Dil注射动物相比细胞数量少得多，因为该腺病毒是复制缺陷的，因此该标记仅遗传至感染细胞后代的一部分(图2)。LacZ表达的检测按文献(Park等，EMBO J.16：3106)所述用X-gal染色进行。

2.通过培养标记的室管膜细胞鉴定和定位神经干细胞

室管膜的体内特异标记可用于检测是否标记细胞具有体外的干细胞性质。(按如上所述)注射Dil后，大鼠用CO₂杀死，取出其大脑并保存在冰冷的PBS中。切割出侧脑室的侧壁。该组织用剪刀剪碎，转移至4ml解离介质(4ml 0.2M PIPES(Sigma)中含有0,075％I型胶原酶(Worthington)，0.075％透明质酸酶(Sigma)以及2000U的DNAse I)中，37℃孵育30分钟。经5ml和1ml巴斯德吸管的温和持续研碎进行机械解离，之后静置悬浮液2分钟，让较大的碎片沉底。然后将上清液通过一个40nm的筛(Falcon)。过滤的上清液中加入4ml冷培养基(DMEM/F12)。以200g离心4分钟沉淀细胞。去掉上清液，沉淀重悬于110ml蔗糖溶液(0.9M，溶解在0.5xHBSS中)，750g离心10分钟。去除上清液，沉淀重悬于2ml培养基中，置于10ml含有4％BSA的EBSS溶液的上部，200g离心7分钟，之后在DMEM/F12中进行洗涤步骤。该培养基组成为：0.5ml L-谷氨酰胺，0.75ml 1M HEPES(15mM)，50ul 20ug/ml EGF(和/或50ul 10ug/mlbFGF)，1ml B27补充物，0.5ml 100×青霉素/链霉素贮存液，以及，最后添加DMEM-F12培养基至总体积50ml。细胞培养物在37％、含有5％C02的潮湿空气中保持。在这些条件下，培养物中形成未分化细胞的特征性球形细胞聚集物。这些细胞聚集物来源于单个干细胞，因此代表一个细胞克隆。分别来自侧脑室和脊髓的这些球中，88.6±1.20％和89.0+1.23％的球具有明显的Dil标记(5个独立实验的平均值±SEM)。收集Dil标记球并解离为单个细胞。许多这些细胞形成新的球，并且当在培养基中加入血清诱导其分化时，大多数这些第二次形成的球产生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。分化后代的产生通过用以下细胞特异抗体进行免疫组织化学标记来说明：针对星形胶质细胞的抗神经胶质原纤维酸性蛋白(Dako)，针对神经元的Tujl(Babco)和针对少突胶质细胞的04(Boehringer Mannheim)。这些实验确立了一种体外研究室管膜细胞的有用方法，并说明室管膜细胞具有自我更新能力，以及其多能性，即它们是真正的干细胞。

3.培养操作和培养基

适合生长和筛选室管膜神经干细胞的培养操作可参见Johansson等，细胞96：25。然而，用于室管膜神经CNS干细胞的组织培养基中最重要的成分是促细胞分裂素，该物质可以是表皮生长因子(EGF)或是成纤维细胞生长因子(FGF)。第二重要的因素是给予充分的辅因子和营养物，优选大家所熟知的补充物B27或N2。以下为使用的特定培养基：

神经球的培养基：

DMEM/F12                      47ml

B27                           1ml

L-谷氨酰胺(贮存液：200mM)     0.5ml

青霉素/练霉素(每种10000U)     0.5ml

HEPES(贮存液：1M)             0.75ml

EGF-受体级(贮存液：20ug/ml)   0.05ml和/或

BFGF(贮存液：10ug/ml)         0.05ml

HBSS-葡萄糖溶液               500ml

HBSS，10X                     50ml

D-葡萄糖(贮存液：300mg/ml)    9.0ml

HEPES(贮存液：1M)             7.5ml

ddH₂O                         433.5ml

**pH至7.5

蔗糖-HBSS溶液                 500ml

HBSS，10X                     25ml

蔗糖                          154g

ddH₂O                         补充至500ml

**pH至7.5

BSA-EBSS-HEPES溶液            500ml

BSA(Sigma产品目录号A4503)     20g

HEPES(贮存液：1M)             10ml

EBSS，IX                      补充至500ml

**pHH至7.5

4.组织的解离

13.3mug胰蛋白酶(Sigma目录号T4665)、7.0mg透明质酸酶(Sigma目录号H3884)和2.0mg犬尿酸(Sigma目录号K3375)一起在37℃溶解于HBSS-蔗糖溶液中。该溶液无菌过滤后加入200ul 4000U/ml DNAse(Sigma目录号D4527)。室管膜组织在该介质中37℃解离15分钟。反应物用5ml吸管温和研碎10次，之后再持续孵育15分钟。在该介质中的孵育不应超过30分钟。

之后迅速地将解离的组织通过一个70um的尼龙细胞过滤器(Falconno.2350)。该混合物在15ml的圆锥形试管中1500rpm离心5分钟，去掉上清液，在10ml蔗糖-HBSS溶液中重悬沉淀。重悬的沉淀以2000rpm离心10分钟，去掉上清液，沉淀重悬于2ml 1×EBSS中。在一个新的15ml的圆锥形试管中装入12ml BSA-EBSS-HEPES溶液。将2ml细胞悬浮液小心地加在这12ml溶液的顶部，将所获混合物以1500rpm离心7分钟，去掉上清液，细胞重悬于神经球培养基中并在10cm培养皿中铺板。

上述程序对于脊髓是理想的，因为该方法去除了大多数髓磷脂。然而，对于从脑室壁分离的细胞和小量组织，悬浮于蔗糖中后使用Eppendorf管更适合，而且将获得更多的细胞。典型地，沉淀重悬在4ml蔗糖-HBSS溶液中，然后这个量分装在4个1.5ml管中。由此下调BSA-EBSS-HEPES溶液的体积。

5.神经球的传代

胰蛋白酶(Life Technologies#45300027)在37℃孵育24小时。然后用PBS(磷酸盐缓冲液)稀释至可在5分钟内神经球完全解离的水平(对每500ml处理物经验确定)。

从10cm平板中收集神经球，并将其温和地置于15ml圆锥形管中。一旦球体聚集到管底尖端，去除上清液。然后将神经球重悬于1×PBS中，转移至1ml eppendorf管中，待其沉淀。去除上清液，向球体加入500ul胰蛋白酶(37℃)。37℃孵育2分钟后，用200ul移液管吸头温和地抽吸研碎球体，然后静置另一个3分钟。再次研碎球体，使任何剩余的块状物或球体沉淀大约30秒。将上部400-500ul胰蛋白酶消化的细胞移出，置于一个新的含有等量体积BSA-EBSS-HEPES溶液的eppendorf管中。然后以1500rpm离心细胞1分钟，细胞沉淀重悬于1×PBS中，之后再次以1500rpm离心1分钟。然后去除上清液，细胞沉淀重悬于50∶50的神经球培养基∶条件培养基中(条件培养基收集自已在培养基中培养至少1周的神经球培养物。通过0.2um滤膜过滤，从培养物中移出培养基，然后与等体积的新鲜制备的神经球培养基混合)。然后将细胞铺在含有相同培养基的细菌平板上(非组织培养处理的平板)，否则大部分细胞最初将附着在平板底部，从而抑制新的球体形成。如果需要，24小时后，可将细胞重新置于组织培养板上。

6.单个室管膜神经干细胞的培养

室管膜细胞形成神经球能力的直接检测方法是体外培养单个室管膜细胞(Johansson等细胞96：25)。为此，我们通过两个标准从解离的侧脑室壁组织分离室管膜细胞。第一，细胞必须具有纤毛，室管膜细胞的一个显著形态学特征，脑室下区域来源的细胞并不具有该特征。第二，从处死前6小时接受Dil注射的动物中取样，并仅收集Dil标记细胞。挑出满足这两个标准的细胞，转移至微孔板。在神经球条件培养基中每孔培养一个细胞。在这些培养物中，58％(192细胞中的111个)室管膜细胞经历了细胞分裂。大多数这些孔(99孔)中，细胞在几天内死亡或形成非常小的细胞群。然而，最初细胞的6.2％(192个中的12个)形成了大的神经球。向这些神经球的培养基中加入血清后，鉴定出表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞细胞类型特异性标志的细胞。这显示了单个室管膜细胞能够形成可产生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的神经球，即它们是真正的神经干细胞。

7.Dil标记方法的证实

因为一些结果决定性地依赖于室管膜细胞的Dil特异标记，而脑室下区域的细胞不标记，所以必须排除Dil转移至脑室下区域的可能性。为了排除室管膜细胞的Dil的直接细胞至细胞的转移，我们将Dil标记的室管膜细胞与遗传标记的ROSA 26小鼠来源的细胞一起共培养。未能观察到Dil向ROSA 26细胞的可检测转移。为了排除随时间发生的Dil从脑脊髓液向脑室下细胞的被动扩散，我们从前一天接受Dil脑室内注射的动物的侧脑室中吸取脑脊髓液，并将其添加给培养细胞。我们仅发现了微弱的标记，说明Dil的浓度非常低。而且，将该脑脊髓液注射入另一动物的侧脑室中，并未导致包被脑室的细胞的任何标记。这些数据暗示了脑室内注射后侧脑室中的Dil浓度的快速降低，而且脑室下区细胞的缓慢被动标记是非常不可能的。

8.通过细胞分选纯化神经干细胞

我们发现胚胎发育过程中在神经系统中表达的细胞表面受体Notch1蛋白(Kopan等，Trends Genet.13：465)在成年大鼠脑和脊髓的室管膜细胞中选择性表达，而不在脑室下区细胞中表达(图3)。通过用Notch1抗血清磁性分选，我们利用Notch1的该选择性表达从急性分离的侧脑室壁和脊髓组织分离室管膜细胞。对于磁性分选，按如上收集细胞，重悬在100ul上面定义组成的细胞培养基中，加入1ul抗Notch1的兔抗血清，并在4℃孵育20分钟。然后，用6ml DMEM/12洗涤细胞，细胞团重悬在100ul培养基中，加入30ul(用0.5％BSA的PBS)预洗涤的磁性珠结合的抗兔抗血清(1.8-2.1×10⁷个珠，Dynal)，间歇摇动于4℃孵育20分钟。孵育后，加入2ml培养基，将悬液转移至2ml Eppendorf管中，置于Dynal磁性分离器中2分钟。将上清收集在35mm未包被的Nunc培养皿中(“洗脱”部分)，然后从分离器取出磁铁，加入2ml(上述定义的)培养基重悬珠-细胞悬液，重复磁性分离步骤。上清又转移至培养板中。取出磁铁后，加入2ml培养基，重悬剩余的细胞并转移至35mm未包被Nunc培养皿中。在整个过程中，所有溶液和细胞悬液均保持冰冷。细胞培养在37℃、5％CO₂的潮湿空气中进行。每3-4天更换培养基(组成如上所述)。然后培养吸附(分选的)或未吸附(洗脱部分)磁珠的细胞，并分析干细胞的存在。在分离后约4-5天开始出现神经球。在用Notch1抗血清分选细胞的实验中，大多数球体在分选部分中形成，但在无Notch1抗血清的实验中则没有(图3)。当在Notch1分选部分中形成的球体解离时它们形成多能的二次球体，证明室管膜细胞是神经干细胞。

在其它实验中，用Dil体内标记室管膜细胞(见上)之后进行荧光激活细胞分选(FACS)或手工挑选荧光细胞，获得室管膜细胞的高度富集培养物。

9.室管膜细胞具有缓慢的增殖速率并产生过渡性扩增性前体细胞群

基于单次或少数几次注射后缺乏标记核苷酸的整合，前人的研究指出室管膜细胞在成年哺乳动物中不增殖。干细胞的一个独特特性是它们增殖缓慢或几乎不增殖，人们已采用长时期施用标记的核苷酸以鉴定其它组织中缓慢循环的干细胞。因此，如果通过单次或少数几次注射标记的核苷酸来分析，室管膜细胞的缓慢增殖速率(如果它们是干细胞的话将是如此)将有可能被遗漏。为了表征室管膜细胞的增殖，我们在长时期内持续提供胸苷类似物5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU，Sigma)。我们没有采用重复注射，而是在分析前通过饮水给成年小鼠施用BrdU 2-6周以上的时间。为了实现小鼠脑的长期标记，我们向小鼠的饮水中加入了1mg/ml的BrdU。一周更换两次水，并用铝箔避光。BrdU通过肠道有效摄取，导致侧脑室外侧壁上覆盖的室管膜细胞被标记。侧脑室顶部和内侧壁上覆盖的室管膜细胞几乎不标记，说明外侧壁是最活跃的神经发生区。BrdU标记细胞的很大部分存在于脑室下区(图4)。脑室下区中标记的细胞常常紧密成群形成细胞聚集体，给人的印象是细胞克隆(图4)。引人注意的是，在许多情况下，这种细胞聚集体靠近标记的室管膜细胞(图4)。在脑室下区中增殖前体细胞紧密一起迁移至侧脑室的前侧端，它们在此进入吻部迁移流。在大多数情况下，标记室管膜细胞和脑室下区细胞聚集体之间的空间关系使得室管膜下细胞向标记的室管膜细胞相关的吻部迁移流转移(图4)。

干细胞增殖速率缓慢的事实已被用于在其它组织中定位干细胞。当标记的核苷酸在长时期内施用时，迅速和缓慢增殖的细胞均会被标记。通过在施用标记核苷酸之后让动物存活一段时间，快速增殖的细胞将有时间通过持续分裂或迁移至别处稀释标记。因此，随着时间的推移，只有缓慢增殖的细胞会保持标记。我们分析了持续2-6周以上接受BrdU然后2周不接受BrdU的动物。在这些动物中，在脑室下区看到的标记细胞非常少，表明大多数细胞已通过重复分裂或迁移至别处稀释了标记(图4)。然而，绝大多数室管膜细胞仍被标记(图4)。

然后我们研究了脊髓室管膜细胞的增殖。在通过饮水长期使用BrdU后绝大多数覆盖中央管的室管膜细胞被标记(图5)。与侧脑室脑室下区相比，靠近中央管室管膜紧外边见到少数标记细胞(图5)。然而，靠近中央管的少数标记细胞常常紧靠标记的室管膜细胞附近，提示该细胞可能来自室管膜(图5)。

10.从成年人脑培养室管膜神经CNS干细胞

从手术除去癫痫病灶过程中的两个成年患者取出侧脑室壁组织。象用于啮齿类组织的详述方法一样，将该组织用酶法解离，以相同方式处理和培养。约1周之后，在培养皿中出现典型的神经球。当通过将神经球接种在聚-L-鸟氨酸上或加入血清诱导分化时，可从单个神经球分化出神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞(象啮齿类实验一样，用相同细胞特异标志研究)。

11.在确定的脑区如中脑黑质致密部中体内分析神经发生的定量方法

本发明人的一些未发表数据使它们假定帕金森病中多巴胺神经元坏死的脑区即黑质(Date，Brain Res.Bull.40：1)代表了存在神经元持续更新的新区。已采用和进一步开发最新原位立体定位细胞计数技术(Gundersen等，APMIS 96：857；Janson等，神经科学57：931)，并分析了幼年和老年小鼠中黑质神经元的总数和相同区域凋亡神经元的总数。简而言之，本发明人的未发表结果(Janson等)表明幼年和老年小鼠具有相同数量的黑质多巴胺神经元，尽管少数通过凋亡自然死亡。同时本发明人发现如上所述的神经元祖细胞的标志nestin存在于黑质神经元一个亚群中(未发表数据，Janson等)。这些数据综合起来表明持续神经发生和神经凋亡之间可能存在平衡，即神经元更新(见下文)。定量方法允许体内筛选增强神经发生和/或神经元迁移的物质。

如上述实施例所述，通过脑室内注射给成年大鼠和小鼠施用Dil。在注射后不同时间间隔(数小时至数月)，给动物穿心灌注15ml 0.9％生理盐水，然后在5分钟内灌注50ml+4℃含4％(w/v)多聚甲醛和0.4％(V/v)苦味酸的0.1M pH6.9的磷酸缓冲盐水。取脑后，将组织在相同固定液中再固定90分钟，并在缓冲蔗糖中+4℃防冻处理(10％24小时，30％2天)。采用系统均匀随机抽样设计，用恒冷切片机对整个中脑切片，其中将40um厚的额切片分成6个平行吻尾系列。一个系列切片保持在0.1MPBS中，使用前人描述过的修改程序(Slngleton等，Neurosci.Meth.64：47)将荧光信号迅速转换成持久的二氨基联苯胺(DAB)信号。这样，取样的新切的自由漂浮切片浸泡在含1％H₂O₂的0.1M Tris(pH8.2)中10分钟，然后在不含H₂O₂的缓冲液中洗涤。然后将组织在黑暗中与过滤的DAB(溶解于pH8.2的Tris缓冲液，浓度1.5mg/ml)于4℃孵育60分钟，在Tris缓冲液中洗涤，之后放置在玻璃载片上，用新鲜DAB溶液覆盖，在光转换过程中该溶液每30分钟用新鲜溶液替换。在每个取样载片上鉴定黑质，在表面荧光显微镜(Nikon)下使用10×物镜和若丹明滤光片用紫外光照射切片。仔细评价光转换过程，当用褐色DAB产物显现了黑质中所有信号时，采用抗生物素蛋白-生物素-免疫过氧化酶系统(Vector)(Janson等，神经科学57：931)用多巴胺神经元标志(酪氨酸羟化酶)(Vector SG，Vector)对切片进行免疫组织化学标记。相反，5个平行系列切片贮存在含30％蔗糖的0.1M PBS中，保存于-20℃，直到它们用免疫组织化学方法处理和用数个神经胶质细胞和神经元(和适当对照)标志在共聚焦激光扫描显微镜中分析以测定黑质致密部Dil标记的细胞的神经元表型(图8)。在双侧SNc中对用间甲酚紫反染的TH免疫反应细胞体(TH/CV+神经元)和含有Dil标记的TH免疫反应细胞体的总数进行定性估计。神经元计数通过编码切片和立体化逻辑技术、光学分离器(Janson等，神经科学57：931)来进行测定。简而言之，吻尾部的无偏取样切片用CAST-Grid系统(Computer Assisted Stereological Toolbox，Olympus，Albertslund，Denmark)进行分析，它在带有一个机动标本台的Olympus BH2显微镜上包括一个摄影机和一个指针测微计以监测z-轴上的运动(Heidenhain，Traunreut，德国)；二者均与带有GRID软件和高分辨显示器的PC机相连。在低放大倍数对准每个取样切片的SNc区域后，在高放大倍数(100×浸油，数值孔径1.4)进行分析。这使得当焦点在组织中移动时能在密集生长的观察区域清楚地观察到单个细胞，所述组织凭视觉切成薄片并用分辨率为0.5μm的指针测微计来测定。进行计算机化、均一的系统随机小量取样(切片厚度6-9um)；在完整黑质区的已知部分中对满足立体学标准的取样量中的有核神经元进行计数。正如以前的报道所述(Chan等，J.Pharmacol.Exp.Ther.280：439)，如果在细胞体和/或其树突中显示Nissi染色的核周质和TH免疫反应性，则对黑质神经元计数。在光转换Dil信号的系列切片中，对含有Dil的TH+神经元计数(在3,600×评价)。确定在不同类别中每次估计标记神经元总数的误差系数。获得的计数独立于处理过程中组织的任何二维变化，如收缩，其在z轴测定。将不同时间点(几小时到60天)以黑质多巴胺神经元的总数对时间作图，从回归曲线(r²＝0.97)发现每周该脑区产生175个新神经元，这是小鼠中黑质多巴胺神经元总数的约1％。

表征了数个到达黑质致密部不同部分的Dil标记细胞的迁移流(以前未知，图9)。采用荧光显微镜细胞计数的修改程序，测定了每个确定迁移流中细胞的总数。在饮水长期给药(1mg/mL见上述实施例，或通过重复腹膜注射BrdU)动物中的BrdU标记，证实了Dil标记神经元的确是新产生的这一解释。而且，在一些同时显示从纹状体中神经末端区逆行转运的细胞体标记(FluoroGold)的TH+黑质神经元中发现Dil和/或BrdU，支持了“新”神经元是有功能的并对投射神经元产生适当神经元突起的证据。

12.标记室管膜干细胞的后代包括数个脑区中不同表型的神经元

使用上述体内荧光标记程序，我们鉴定了Dil标记细胞鉴定为神经元的数个脑区。这些区域包括海马的数部分(包括齿状回的颗粒层(图10))、皮层和皮层下结构如丘脑下区和黑质网状部中推测的含有γ-氨基丁酸(GABA)的神经元以及缝脑核中5-羟色氨神经元和蓝斑中去甲肾上腺素能神经元。

13.体外产生遗传修饰的干细胞

遗传修饰的干细胞通过如上培养干细胞然后用表达质粒或病毒载体转染这些干细胞来产生。对于每次转染，在含有200ul培养基(见上)的12×75mm圆锥形管(15ml)中加入4ug DNA(该方法用Clontech的质粒CMV-GFP建立，以绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因)，并轻轻混合。在含有200ul培养基的第二个圆锥形管中加入15ul脂转染胺试剂并轻轻振荡混合。然后将第二溶液加入第一溶液中使两溶液混合，于室温孵育45分钟以形成DNA-脂质体复合物。然后向含DNA-脂质体复合物的管中加入1.6ml培养基，并将该溶液铺在细胞(已小心除去大部分培养基)上。将细胞孵育12小时，然后将培养基用无DNA的正常培养基更换。转染后48-72小时在荧光显微镜下检测GFP。这些干细胞可克隆化扩增产生遗传修饰的未分化干细胞球。

14.在干细胞中体内表达改变的基因

如上所述，通过向侧脑室注射携带处于RSV启动子控制下的报告基因LacZ的复制缺陷腺病毒，来进行在干细胞中表达改变的基因。X-gal染色(见上)显示在室管膜干细胞中表达报告基因，因此证明在干细胞中表达改变的基因的可行性。现在正在产生携带启动神经生长因子、神经胶质细胞系来源的神经营养因子(神经元存活因子)、bc1-2(一个改善干细胞存活的基因)和nurr1(可促进从干细胞产生多巴胺能神经元)的干细胞。

15.来自转基因动物的干细胞的应用

我们发现可从转基因动物培养干细胞。对于这些研究，我们使用基因组中含有LacZ基因的小鼠(Zambrowicz等，美国科学院院刊，94：3789)。这些小鼠在所有组织中全都表达转基因(Zambrowicz等，美国科学院院刊，94：3789)。按如上所述从这些小鼠纯化和培养干细胞。X-gal染色(见上)揭示转基因的强表达。

16.外伤引起的干细胞增殖和分化的操作

在成年大鼠的中胸水平进行椎板切除以暴露脊髓，用小手术剪横截切断背索，然后在背索上切一表面纵向切口以嘴状扩大该损伤。在其它动物中，在头盖骨上钻一洞，用钟头插入脑组织以产生损伤。在一些动物中，在损伤之前1-10天已通过注射Dil(见上)标记了室管膜细胞。在背索切口之后不同时间点增殖的室管膜细胞的比例的定量揭示，与未损伤的动物相比损伤后第一天增加几乎50倍(图5)。第1天后，在一个月内增殖逐渐降低至正常水平(图5)。同样，在脑损伤后侧脑室壁的室管膜细胞增殖也极大增加。

在脊髓或脑损伤前通过注射Dil标记了室管膜细胞的动物中，在损伤后头4周内室管膜层外观察到Dil标记细胞数进一步持续增加(图6)。在损伤后1周内Dil标记细胞在形成中的瘢痕组织中丰富，并在此保持至少1年。在损伤中形成的瘢痕组织中，绝大多数Dil标记细胞显示对神经胶质原纤维酸性蛋白(一种星形细胞标志)的免疫反应性，表明大多数室管膜细胞后代已分化成星形细胞(图6)。然而，在Dil标记细胞中没有发现神经元标志，说明干细胞转化成神经元所需信号在该动物中不存在。

17.增加中脑黑质致密部中神经发生的化合物

给不同小鼠施用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP，RBI，Natick，MA，美国)(用生理盐水稀释，用量为40mg/kg，sc.)。该物质已知对中脑多巴胺神经元有选择性神经毒性，在人类和实验动物中引起帕金森氏综合征(Langston等，科学219：979，Heikkila等.科学224：1451)。然而，该分子也具有已知在帕金森病动物模型中充当神经保护剂的化合物如尼古丁的共同结构(Janson等，神经科学57：931)。

在我们的实验中，给动物施用MPTP或载体，并分析Dil+黑质多巴胺细胞数或向该脑区移动的Dil+细胞迁移流的染色模式在时间过程中的改变(见上，研究标记室管膜细胞后中脑黑质致密部神经发生的定量方法)。该处理导致更高的TH+/Dil+和TH+/BrdU+黑质神经元数目，表明神经发生增加。而且，在用MPTP处理的动物中，中脑中Dil+细胞的迁移流似乎更显著，这可用上述修改的立体定位法来定量分析。

18.室管膜干细胞的移植

按如上所述从Rosa26转基因小鼠脑或脊髓纯化和培养室管膜干细胞。通过立体定位注射15ul培养基中的干细胞球(见上)将这些小鼠的未分化干细胞球移植至成年大鼠的纹状体。两天后杀死动物，将脑切片，并通过上述X-gal染色分析来自Rosa26小鼠的表达LacZ的细胞的存在。移植的细胞在插入孔附近的组织中扩散。这些细胞常常具有数个突起(图7)。

19.开发高通量筛选影响神经干细胞分化的物质的检测方法

开发了有效检测各种物质促进室管膜神经干细胞分化成特定神经胶质细胞或神经元表型的能力的测试系统。然后这些物质可按如上简述方法进行体内测定。

20.成年脑神经干细胞产生所有胚层组织的广阔潜能

20 a.NSC培养

按如上所述用酶法解离侧脑室的外侧壁(Johansson等，细胞，96：25)。培养基是含有20ng/ml EGF(Collaborative BiomedicalProducts)、B27补充物(Life Technologies)、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的DMEM-F12培养基(Life Technologies)。首次接种细胞之后每48小时向培养基中加入EGF(20ng/ml)。

20b.RNA分析

使用RNeasy(Qiagen)提取组织RNA，在制造商推荐的条件下使用SuperscriptII(Life Technologies)和随机六聚物(Phannacia)在50ul反应体积中将500ng总RNA逆转录成cDNA。PCR反应在存在2.5mM MgCl₂10mM Tris-HCl(25℃时pH 8.8)、50mM KCl、0.08％Nonidet P40、每种dNTP各0.2mM、5U Taq DNA聚合酶(Fermentas)、0.1mg/ml BSA、50pmole各寡核苷酸引物和α-³²P-dCTP时进行。为使cDNA产量标准化，使用β-半乳糖苷酶编码cDNA特异的引物和核糖体蛋白L19特异的引物进行一个半定量PCR反应。40个循环，每个循环包括94℃(1分钟)，64℃(1分钟)和72℃(1分钟)，用下列引物对扩增β-半乳糖苷酶：正义寡核苷酸5’-TTG GAG TGA CGG CAG TTA TCT GGA-3’(SEQ.ID.NO.1)和反义寡核苷酸5’-TCA ACC ACC GCA CGA TAG AGA TTC-3’(SEQ.ID.NO.2)。25个循环后，向反应物中加入5U Taq DNA聚合酶，并加入L19特异的寡核苷酸引物作为内对照：正义寡核苷酸5’--CCT TGG ACA GAG TCT TGATGA TCT CCT-3’(SEQ.ID.NO.3)和反义寡核苷酸5"-CTT CTC AGG AGA TACCGG GAA TCT AAG-3’(SEQ.ID.NO.4)。

20c.免疫组织化学

恒冷切片机切片和培养细胞与第一抗体在37℃孵育1小时或4℃过夜，PBS洗涤，与第二抗体室温孵育45分钟。

20d.桑葚胚聚集和胚泡注射

初次分离后4至6天内用胰蛋白酶消化增殖的细胞球，并在1×PBS中重悬，用于聚集和显微注射。

采用标准技术和程序，神经干细胞与CD-1桑葚胚聚集或者注射至来自C57BL小鼠的胚泡中，并将其移植至代孕母体内。

20e.神经干细胞在胚泡内细胞团中的整合

为了分析成年神经干细胞的分化潜能，通过将成年神经干细胞导入早期胚胎环境中并跟踪其后代的命运，我们检测了这些细胞形成不同组织的能力。

来自分离的成年脑和脊髓组织的多能干细胞可在一定培养条件下增殖。在这些条件下单个细胞增殖，其后代形成聚集细胞团。体外培养几天后，这些细胞克隆与培养皿脱离。当存在促细胞分裂素如表皮生长因子(EGF)或成纤维细胞生长因子(FGF)时，这些细胞持续增殖并形成特征性紧密聚集的球形细胞聚集体，称为神经球，所有这些细胞聚集体均来自单个细胞(Reynolds等，科学255：1707)。

为了最初检测成年动物来源的神经干细胞是否能在极早期胚胎发生微环境中存活，首先将单个神经干细胞球或许多酶法解离的单个细胞与8细胞致密桑葚胚聚集，并使其在体外继续发育至早期胚泡期。因为神经干细胞是从全部表达来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶的Rosa26小鼠培养的，所以这些细胞在固定和染色之后可容易地鉴定。在早期胚泡中许多神经干细胞表现出在滋养外胚层上的附着和增殖(图11A)。然而，少许细胞能掺入桑葚胚细胞中，并且可在发育中的胚泡内细胞团中发现(图11B)。由于这些细胞能成功地与8细胞期桑葚胚集聚并在内细胞团中存活至发育的早期胚泡期，所以可合理地推测这些细胞可能，至少部分地，对胚胎中枢神经系统的形成有贡献，也可能对其他组织有贡献。通过将神经干细胞直接显微注射至早期胚泡中可获得这些细胞对内细胞团更有效的贡献。

20f.成年神经干细胞可有助于产生嵌合小鼠胚胎

为了测试成年神经干细胞产生不同组织的能力，将注射了10-20个单个神经干细胞的C57/BL6胚泡转移至代孕母体中，并使其发育至胚胎第11天。胚胎在多聚甲醛中固定，然后用X-gal组织化学和β-半乳糖苷酶抗体的免疫组化分析lacZ表达。其他胚胎用RT-PCR检测β-半乳糖苷酶mRNA的存在。

检查染色的E11胚胎全样载片，以检测来自Rosa26小鼠成年神经干细胞的β-半乳糖苷酶的存在，结果显示所分析的胚胎中存在不同程度的嵌合。同窝幼崽中，嵌合程度有很大的变异，在所有幼崽中总是有几个胚胎完全没有表达lacZ的细胞。嵌合胚胎与未嵌合胚胎大小相似，而且没有出现明显的解剖异常。图11给出了一个显示高度嵌合的胚胎和一个未注射的野生型C57/BL6对照。初步检查来自注射胚泡的胚胎揭示了来自Rosa26的神经干细胞对腹侧脊髓、中脑、眼、心脏和许多其他内脏器官和组织有显著的贡献。显示来自Rosa26的神经干细胞较少贡献的胚胎主要在中肠-后肠连接区域或心脏中出现染色。在野生型胚胎中常常在听泡和脐静脉区域观察到相对低水平的内源性染色。然而，在所检查的野生型胚胎的其他区域没有观察到另外的内源性活性。免疫组织化学标记与β-半乳糖苷酶抗血清区域的重叠证实了嵌合胚胎中的X-gal染色特异性。野生型胚胎中显示内源性β-半乳糖苷酶样活性的区域并不被β-半乳糖苷酶抗血清标记。

另外，为了用另一种独立的方法测试来自Rosa26的细胞的贡献，使用RT-PCR在从注射了成年神经干细胞的E11胚胎或从未注射的野生型对照分离的总RNA中分析β-半乳糖苷酶mRNA的存在。该分析中所用的胚胎横向切开成三部分：胚胎的头部(包括鳃弓)，胸部(鳃弓以下，脐带以上)和尾部(包括脐带区、后肢和尾)。使用β-半乳糖苷酶基因特异的寡核苷酸引物扩增每个胚胎部分的cDNA。在PCR反应中还加入两个检测L19mRNA(一种核糖体蛋白)特异的其他寡核苷酸引物作为内对照。在来自未注射胚胎的样品中没有检测到β-半乳糖苷酶mRNA，而注射胚胎主要在头部和含有心脏和中肠的胸区中观察到中等信号。lacZ表达的这种分布与其他胚胎全样载片染色检测到的β-半乳糖苷酶基因产物表达模式一致。

20g.成年神经干细胞可参与所有胚层组织的产生

图12和13分别显示在注射了成年神经干细胞的胚胎组织中观察到最大嵌合程度的嵌合胚胎切片的例子。成年神经干细胞对E11小鼠胚胎中一些外胚层来源的组织有重要贡献。颅区内，在脊髓的腹侧和中间区域、端脑终板、间脑漏斗、眼睛的视柄、视网膜层和晶状体、内耳蜗、和鼻板中贡献最为明显。然而相比之下胸部区域内，在来自外胚层的组织中很少能观察到成年神经干细胞的贡献，尤其是表皮中。

在来自限定的胚胎内胚层的组织中也可观察到成年神经干细胞对高度嵌合的贡献。这主要在咽部中观察到，包括前肠、舌、口腔、咽囊和甲状腺。在胸区中，对来源于内胚层的组织的贡献也主要在食道、气管、肺芽、胃、肠、胰脏和肝中明显。

几个中胚层来源的组织也显示成年神经干细胞的高水平贡献。这些组织包括脊索、包含心脏心房和心室壁的心肌膜、背主动脉、生殖嵴原基和中肾小管。然而，同样重要的是，注意到成年神经干细胞对发育中的骨骼肌和骨骼的贡献相对低。

20h.组织特异性细胞类型的分化

为了分析嵌合胚胎中发现的来自成年神经干细胞的lacZ表达细胞是否分化成它们所整合组织的典型细胞类型，我们研究了正常组成这些组织的细胞的区别细胞标志的表达。采用Tuj1、HB9、酪氨酸羟化酶(TH)、Sonic hedgehog(Shh)、平滑肌肌动蛋白和结蛋白特异的单克隆抗体，我们使用双免疫组化染色显示β-半乳糖苷酶的重叠表达(图12和13)。这些抗体分别检测β-微管蛋白III(特异于轴突微管蛋白)、运动神经元、多巴胺神经元、在腹侧脊髓中发现的产生Shh的细胞、衬在许多动静脉内的平滑肌、和心肌及骨骼肌中发现的中间纤维。可使用其他抗体检测胰腺的分泌胰岛素或胰高血糖素的细胞与β-半乳糖苷酶的共定位。

讨论

细胞的死亡是许多神经系统疾病中的共同因素。不同疾病影响不同的细胞类型，例如帕金森症中的多巴胺神经元、肌萎缩性侧索硬化症中的运动神经元、多发性硬化症中的少突胶质细胞。在其他情况下，例如中风或脑外伤，可影响特定的区域几种不同细胞类型。目前，临床实践中还没有在神经系统中刺激产生新细胞的方法。已临床检测了人胚或动物细胞的移植，取得了一些令人鼓舞的结果。然而，这些方法有若干问题，主要是在伦理和免疫学方面，这使得它们非常不可能在更多的患者中应用。最近认识到，成年中枢神经系统中存在多能干细胞群体，从而点燃了可在成年中枢神经系统中从患者自身干细胞刺激产生新细胞的希望。然而本领域中一些关键问题仍需回答，使其难于进展。现在本发明干细胞的鉴定使得可以开发纯化、体内定量研究、遗传修饰这些细胞和体内及体外用各种药物化合物刺激这些细胞的方法。而且，本发明证明干细胞在CNS中沿着新的路径迁移至各种神经解剖细胞群体中，而且它们能在体内转化为神经元。本发明还包括在不同脑区评价神经发生的无偏定性方法，以及分析迁移至不同脑区的干细胞和其后代总数的技术。总而言之，本发明提供的进展大大地增加了在中枢神经系统中刺激产生新细胞的方法的可能性。

改变细胞中基因表达可使这些细胞产生特定蛋白或可防止不需要的蛋白的产生。根据本发明，在体内和体外操作细胞基因在很多情况下是有益的。例如可将表达生长因子、细胞因子、激素或任何其他蛋白质的工程细胞移植至需要持续施用这种蛋白的个体中，以刺激例如细胞的信号传导或细胞存活。因此这些细胞可用作药物物质的持续给药者。用于该用途的细胞可通过例如质粒或病毒载体的转染进行遗传修饰，或者这些细胞可来自转基因生物。含有根据本发明的细胞的转基因生物也包括在本发明的范围内。而且，通过使用质粒或病毒载体以及反义DNA或RNA片段诱导异常基因表达，可在生物体中原位改变基因表达。在某些情况下，使用缺乏某种基因或产生更低水平该基因产物的细胞可能是有价值的。例如在不同个体之间移植细胞或组织受到细胞表面某些蛋白表达的限制，这些蛋白可诱导宿主免疫系统排斥移植物。这是一个主要问题，尤其是两个个体是不同物种时。解决该问题的一个方法是产生缺乏诱导宿主免疫系统排斥之基因的遗传修饰细胞或动物。在体内或体外操作细胞基因表达的其他重要意义包括诱导未分化细胞向某种细胞命运分化或通过抑制内在或外在的细胞死亡信号刺激该细胞的存活。而且，通过导入某些基因有可能使细胞永生化，并产生具有特定特征的克隆细胞系。因为成年中枢神经系统中神经干细胞的本质和定位不清楚，所以以前难于遗传修饰这些细胞，特别是在体内。在细胞培养物中纯化干细胞方法的发明可允许进行各种遗传操作，例如用质粒或病毒表达载体转染这些细胞，或从转基因生物中纯化细胞，或用例如反义DNA或RNA片段抑制基因表达。干细胞的体内定位允许在这些细胞中用例如病毒载体原位改变基因表达。

上文还显示成年脑的干细胞可有助于在嵌合小鼠胚胎中形成来自所有胚层的多种组织。这些神经干细胞的后代表达它们所整合组织的特异性标志，而且这些标志在神经系统中不表达。它们以有功能的方式整合和分化。也许最令人震惊的例子是神经干细胞后代常常对心脏有巨大贡献；明显解剖正常的跳动的心脏展示了这些细胞的功能性。

细胞分化的后生控制

特异组织中这些干细胞来源的祖细胞的细胞命运可能不是自身决定的，而是由这些细胞暴露于可重复的一组外部信号来决定的，事实上，在描述神经干细胞后代的特征时，有越来越多的证据说明外来生长因子可直接改变神经干细胞的命运，从而改变之后的分化。如果来自啮齿类动物海马的克隆干细胞群体瞬时暴露于睫状神经营养因子(CNTF)之中，它们将以神经元为代价产生星形胶质细胞；如果它们瞬时暴露于甲状腺素(T3)中，它们将以神经元为代价产生少突胶质细胞。用胚胎或成年神经干细胞得到相同结果(Johe等.Genes Dev.10：3129)。这些数据提示生长因子直接影响干细胞的命运导致可形成神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞的前体细胞的产生。使用克隆培养的神经脊细胞可观察到类似的结果；BMP2诱导自主神经元的产生；胶质细胞生长因子诱导神经膜细胞命运，而转化生长因子β(TGF-β)诱导平滑肌分化(Shah等，细胞77：349；Shah等.细胞85：331)。这些数据提示基因表达的区域差别可能不导致分子水平不同的神经干细胞群体，而且神经干细胞命运内在的不同可通过暴露于外部信号中容易地被改变。

成年神经干细胞是缺乏谱系限制还是脱分化？

在早期胚胎中的移植实验已确定了细胞限制于某种谱系的时间点。特定基因组合的表达确定了特定的命运。体外实验已证明成年神经干细胞产生神经元和神经胶质细胞的潜能。因此在最初考虑时自然会推测成年神经干细胞为了产生不同的细胞系需经过脱分化。然而，值得注意的是，在赋予细胞某种谱系标识和限制性所涉及的许多基因在胚胎发育过程中瞬时表达。在组织发育之后，谱系决定基因的表达可能不是必须的，因为干细胞群体可被物理限制于该特定组织中，而且该分子环境可赋予新细胞组织特异性命运。因此，成年中枢神经干细胞可能已丧失其神经定向。对定位于成年中枢神经系统中的干细胞全能性的阐明可帮助我们开始理解成年神经干细胞或一般干细胞离开其静止状态进入增殖期以产生具有确定细胞命运的后代所必需的复杂分子事件。有迹象表明其它干细胞群体在成年动物中比在胚胎中可能具有更宽的分化潜能。例如，移植至脑的造血干细胞可产生星形胶质细胞。这就产生了这种可能性，不同成年组织中的干细胞可能十分相似并具有接近胚胎干细胞的潜能。事实上，在成年生物中可能仅存在一种基本的干细胞群体。

为了更直接地说明来自成年脑侧脑室壁的神经干细胞的细胞潜能，我们将这些细胞置于早期胚泡微环境中，发现这些细胞对胚胎发育过程中最初来自所有三个胚层的多种器官和组织有贡献。

综上所述，本发明将使得在CNS不同疾病中开发新的治疗策略成为可能，这些疾病不仅包括具有神经变性缓慢进程的疾病(包括Alzheimer病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化症)，也包括头和脊髓急性外伤的临床表现以及脑血管疾病。我们发现干细胞可转化成数种不同的神经元表型(多巴胺神经元、GABA神经元、5-羟色氨能神经元)以及完全不同的组织类型，除了细胞损失是疾病发生关键的上述疾病之外，这还开辟了可能的新应用领域，包括抑郁症和其它精神病，以及心脏手术。

本文引用了各种出版物，其公开内容以参考文献方式完整并入本文。本发明不限于旨在阐明本发明各个方面的具体实施方案的范围，功能上等同的方法和组成成分均包括在本文的范围内。的确除了本文显示和描述的之外，根据以上的描述和附图，本发明的各种修饰对于本领域技术人员是明显的。这些修饰应当包括在所附权利要求范围内。

序列表

<110>Neuronova AB

<120>纯化细胞的方法

<130>neuronovapct

<140>9802264-3

<141>1999-06-24

<160>4

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因的PCR引物

<400>1

ttggagtgac ggcagttatc tgga

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因的PCR引物

<400>2

tcaaccaccg cacgatagag attc

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因的PCR引物

<400>3

ccttggacag agtcttgatg atctcct

<210>4

<211>27

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：大肠杆菌β-半乳糖基因的PCR引物

<400>4

cttctcagga gataccggga atctaag

Claims (25)

1.分离的室管膜神经CNS干细胞，该细胞表达表面蛋白Notch 1以及至少一种选自Notch 2，Notch 3，结合腺病毒的跨膜蛋白CAR和囊性纤维化跨膜传导调节蛋白CFTR的表面蛋白，而且该细胞还含有至少一个纤毛。

2.根据权利要求1的分离的室管膜神经CNS干细胞，其来源于哺乳动物。

3.根据权利要求2的分离的室管膜神经CNS干细胞，其来源于啮齿类动物或人。

4.从出生后CNS组织中分离室管膜神经CNS干细胞的方法，该方法包括从所述CNS组织选择性分离室管膜细胞。

5.根据权利要求4的分离室管膜神经CNS干细胞的方法，其特征在于解离室管膜组织并从该组织回收室管膜神经CNS干细胞。

6.根据权利要求5的方法，其特征在于室管膜组织用水解酶解离，或用犬尿酸解离。

7.根据权利要求6的方法，其特征在于室管膜组织用胶原酶、胰蛋白酶或透明质酸酶解离。

8.根据权利要求5的方法，其特征在于解离室管膜组织所释放的细胞在含有EGF和/或FGF的培养基中保持。

9.根据权利要求6的方法，其特征在于解离室管膜组织所释放的细胞在含有EGF和/或FGF的培养基中保持。

10.根据权利要求4-9之任一项的方法，其特征在于室管膜神经CNS干细胞的回收是通过针对至少一种室管膜神经CNS干细胞特征筛选单个细胞来实现。

11.根据权利要求10的方法，其特征在于筛选存在Notch 1、至少一个纤毛并表达至少一种选自Notch 2，Notch 3，CAR和CFTR的表面蛋白的单个细胞。

12.根据权利要求10的方法，其特征在于室管膜神经CNS干细胞的所述特征是室管膜细胞的体内预先标记。

13.含有室管膜神经CNS干细胞的细胞制品，该制品含有至少50％的室管膜神经CNS干细胞。

14.权利要求13的细胞制品，其含有至少80％的室管膜神经CNS干细胞。

15.权利要求14的细胞制品，其含有至少90％的室管膜神经CNS干细胞。

16.根据权利要求13的细胞制品，其特征在于至少4％的干细胞是活性干细胞，即该细胞经历自我更新并是多能性的。

17.根据权利要求13-16任一项的细胞制品，其特征在于它含有根据权利要求4-12之任一项的方法制备的室管膜神经CNS干细胞。

18.根据权利要求13-16之任一项的细胞制品，其包含遗传操作的室管膜神经CNS干细胞。

19.根据权利要求17的细胞制品，其包含遗传操作的室管膜神经CNS干细胞。

20.根据权利要求1-3中任一项的室管膜神经CNS干细胞用于制备药物中的用途。

21.包含根据权利要求1-3中任一项的室管膜神经CNS干细胞和药学上可接受载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。

22.根据权利要求1-3中任一项的室管膜神经CNS干细胞在制备用于产生神经组织的药物组合物中的应用。

23.根据权利要求1-3中任一项的室管膜神经CNS干细胞在制备用于产生非神经组织的药物组合物中的应用。

24.根据权利要求23的应用，其中所述非神经组织是心脏、眼睛、内耳、肝、肾、胰脏或其它内分泌器官的组织。

25.根据权利要求1-3中任一项的室管膜神经CNS干细胞在制备用于治疗Alzheimer病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化症、头和脊髓急性外伤、脑血管疾病、肌肉疾病、心脏疾病、或眼、耳、肝、肾、胰脏或其它内分泌器官的疾病的药物组合物中的应用。

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