JP5294635B2 - コポリマー１と組み合わせた、神経発生の誘発及び幹細胞治療 - Google Patents

コポリマー１と組み合わせた、神経発生の誘発及び幹細胞治療 Download PDF

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Description

本発明は、内因性の神経発生及び／又はオリゴデンドロジェネシスを、誘発及び／又は増強するための、並びに、特に中枢神経系（ＣＮＳ）又は末梢神経系（ＰＮＳ）に関連する傷害、疾患、障害、又は病状における幹細胞治療のための、特にコポリマー１を用いる方法及び組成物に関する。
略語：Ａβ、β−アミロイド；ＡＤ、アルツハイマー病；ＢＤＮＦ、脳由来神経栄養因子；ＢＭＳ、Ｂａｓｓｏ運動スコア；ＢｒｄＵ、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン；ＣＦＡ、完全フロインドアジュバント；ＣＮＳ、中枢神経系；Ｃｏｐ１、コポリマー１、ＧＡに同じ；ＤＣＸ、ダブルコルチン；ＤＧ、歯状回；ＥＡＥ、実験上の自己免疫性脳脊髄炎；ＥＧＦ、上皮成長因子；ＦＣＳ、ウシ胎児血清；ＦＧＦ、線維芽細胞成長因子；ｉ．ｃ．ｖ．、脳室内の；ＧＡ、酢酸グラチラマー；ＧＦＡＰ、グリア線維性酸性タンパク質；ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質；ＩＢ４、イソレクチンＢ４；ＩＦＡ、不完全フロインドアジュバント；ＩＧＦ−Ｉ、インスリン様成長因子１；ＩＦＮ、インターフェロン：ＩＬ、インターロイキン；ＬＰＳ、リポ多糖；ＭＢＰ、ミエリン塩基性タンパク質；ＭＧ、ミクログリア；ＭＨＣ−ＩＩ、クラスＩＩ主要組織適合複合体分子；ＭＯＧ、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質；ＭＳ、多発性硬化症；ＭＷＭ、モーリス水迷路；ＮｅｕＮ、ニューロンの核抗原；ＮＰＣ、神経幹／前駆体細胞；ＯＢ、嗅球；ＰＢＳ、リン酸緩衝食塩水；ＰＤＬ、ポリ−Ｄ−リシン；ＰＮＳ、末梢神経系；ＲＭＳ、吻側細胞移動路；ＳＣＩ、脊髄損傷；ＳＧＺ、顆粒細胞下帯；ＳＶＺ、脳室下帯；ＴＧＦ−β、トランスフォーミング成長因子−β、ＴＮＦ、腫瘍壊死因子。
中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞の修復能力は限られているので、ＣＮＳは細胞死又は部分的な損傷をもたらす発作に特に弱い。損傷を受けた脳組織は再生しないので、残りの無傷の脳から修復が生じなければならない。
ＣＮＳにおける急性の発作又は慢性の変性障害からの回復が悪いのは、神経発生がなく、傷害を受けた神経の再生が限られており、変性の状態に特に脆弱であるためである。神経発生がないことは、生後すぐにＣＮＳは永久に安定な状態に到達し、脳の複雑な組織回路の平衡を維持する必要があるという仮定によって説明された。しかし、過去１０年間の研究で、脳は、限られた程度ではあるが、生涯を通して神経発生することができることが示された（Ｍｏｒｓｈｅａｄら、１９９４年）。炎症を起こした脳では、神経発生は阻止される（Ｅｋｄａｈｌら、２００３年；Ｍｏｎｊｅら、２００３年）。この後者の発見は、ＣＮＳにおける局所の免疫細胞は神経発生に有害作用があるという、伝統的な見解を強化するものであった。同様に、炎症状態下又は急性発作後では、ＣＮＳニューロンの再生が限られ、過剰に脆弱であることは、ＣＮＳが、局所の炎症、及び、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α又は一酸化窒素が媒介する細胞毒性にしばしば関連する、免疫由来の防御的な活性に耐える能力に乏しいことによる（Ｍｅｒｒｉｌｌら、１９９３年）。しかし、より最近の研究では、非制御の局所の免疫反応は実際に神経の生存を損ない、修復プロセスを阻止するが、適切に制御されている局所の免疫反応は生存を支え、修復を促進することができることが示されている（Ｈａｕｂｅｎ及びＳｃｈｗａｒｔｚ、２００３年；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、２００３年）。ＣＮＳに対する傷害の後では、末梢の適応免疫のプロセス（ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞が病変部位にある自己抗原に対して向けられる）により時間、空間及び強度の点で良く制御されている局所の免疫反応が、外傷後のニューロンの生存及び修復に決定的な必要用件であることがさらに示された（Ｍｏａｌｅｍら、１９９９年；Ｂｕｔｏｖｓｋｙら、２００１年；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、２００３年；Ｓｈａｋｅｄら、２００４年）。これらの結果及び他の結果により、本発明者のＭ Ｓｃｈｗａｒｔｚ及び同僚らは、保護的な自己免疫の概念を構築するに至った（Ｍｏａｌｅｍら、１９９９年）。
神経発生は、限られた程度であるが、生涯を通して成年個体で起こる。新規に形成された細胞のほとんどは、増殖後最初の２〜３週間以内に死滅し、ほんの少数が成熟ニューロンとして生存する。成人の脳におけるニューロンの幹／前駆細胞（ＮＰＣ）の存在の根底を成すメカニズムについて、並びにこれらの細胞の量が限られており、ある部位に制限されている理由は、あまり知られていない。さらに、内因性のＮＰＣプールからの神経発生が生理学的にどのように増大することができるかについては、ほとんど知られていない。成人個体において、このような幹細胞を存在させ、増殖させ、分化させる要因についての知見は、ＣＮＳ修復伝導性の条件を理解し、促進するための必要条件である。これは、次に、内因性の幹細胞プールからの、又は外因性に適用される幹細胞からの神経細胞の再生を高めることを狙いとした介入の開発をもたらすことが期待され得る。
本発明者らの研究室におけるラット及びマウスモデルでの実験では、特異的に活性化した血液由来のマクロファージ（Ｒａｐａｌｉｎｏら、１９９８年）又は樹状細胞（Ｈａｕｂｅｎら、２００３年）を十分に制御して移植すると、脊髄損傷（ＳＣＩ）からの回復を促進することが示されていた。他の研究で、病変部位にあるＣＮＳ抗原に反応性の自己免疫Ｔ細胞の活性を良好に制御すると、軸索の侵襲からの回復を促進できることが示された（Ｈａｕｂｅｎら、２０００年；Ｍｏａｌｅｍら、１９９９年）。特にＣＮＳ関連の自己抗原に対するＴ細胞が媒介する神経保護は、ＣＮＳ傷害に対する身体の生理学的反応であることも示された（Ｙｏｌｅｓら、２００１年ａ、２００１年ｂ）。
成人の脳における通常の条件下では、新しいニューロンは、側脳室の脳室下帯、及び海馬の歯状回の顆粒細胞下帯の、神経原性のニッチで形成される（Ｋｅｍｐｅｒｍａｎｎら、２００４年）。病理学的条件下では、非神経原性の脳の部位において、ある程度の神経発生も誘発され得る。例えば、いくつかの研究では、動物ではＣＮＳへの傷害後に、内因性のＮＰＣが動員され、内因性のＮＰＣは傷害の部位でニューロン及びグリアへの分化を経験することができる（Ｎａｋａｔｏｍｉら、２００２年；Ｉｍｉｔｏｌａ、２００４年ａ）。しかし、内因性の前駆体からの、傷害により誘発された細胞の再生は、程度が限られており、損傷を受けた組織を完全に交換するのに十分ではない。この欠点を克服するために、科学者たちは、現在、培養した成人のＮＰＣ（ａＮＰＣ）を移植することにより回復を促進するための方法を模索している（ＭｃＤｏｎａｌｄら、２００４年）。外因性のａＮＰＣは、傷害を受けたＣＮＳにおいて新しいニューロン及びグリアの源として作用することにより（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、２００５年；Ｌｅｐｏｒｅ及びＦｉｓｃｈｅｒ、２００５年）、或いは、直接的又は間接的に神経保護（Ｌｕら、２００５年）及び内因性の幹細胞のプールからの神経発生（Ｅｎｚｍａｎｎら、２００５年）を促進する因子を分泌することにより、回復に貢献し得る。
現在の意見は、神経発生が成人の脳で存続することに一致しており、この場合、これは傷害後の修復及び回復に貢献することができる。脳虚血（Ｊｉｎら、２００３年）、アポトーシス（Ｍａｇａｖｉら、２０００年）、又は自己免疫性の炎症性脱髄（Ｐｉｃａｒｄ−Ｒｉｅｒａら、２００２年）などの脳の発作は、神経発生を増強する。したがって、側脳室の海馬門部及び脳室下帯（ＳＶＺ）に位置する多能性細胞により、病理学的状態における増殖及び遊走の増大が明らかになる。さらに、吻側細胞移動路（ＲＭＳ）を通って嗅球（ＯＢ）へ遊走するＳＶＺからの前駆細胞は、星状細胞及びニューロンへの分化を引き起こすことができる（Ｐｉｃａｒｄ−Ｒｉｅｒａら、２００４年）。それでも、損傷を埋め合わせる機能的なニューロンを再生することができないので、ＣＮＳの病理における自己神経発生の治療的意義は限られている。
多発性硬化症（ＭＳ）及びその動物モデルの実験上の自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）では、免疫系が、自己免疫性の炎症性のメカニズムにより有害なプロセスを引き起こす（Ｈｅｌｌｉｎｇｓら、２００２年；Ｂｅｈｉら、２００５年）。それでも、疾患の発症時に始まり、代償性のＣＮＳ源が消耗した場合に表れるニューロン及び軸索の変性は、特にミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）誘発性モデルにおける、不可逆性の神経学的能力障害の（Ｂｊａｒｔｍａｒら、２００３年）主な決定要因である（Ｈｏｂｏｍら、２００３年）。ＭＳに対する現在の処置は、免疫の炎症プロセスを回復させるのに効果的であるが、内在性のＣＮＳ修復メカニズムを増強し、効果的な神経保護及び神経発生を誘発するその能力は示されていなかった。
ＣＮＳ損傷を処置するための可能な取組みには、成人の神経幹細胞又はあらゆるタイプの幹細胞の使用が含まれる。成人の神経幹細胞は、自己複製の能力を有する成熟した哺乳動物の脳に存在する前駆体細胞であり、適切な刺激を与えると、脳のニューロン、星状細胞、及びオリゴデンドロサイトに分化することができる。幹細胞（他の組織からの）は、古典的には多能性と定義されており、自己再生し、増殖し、複数の様々な表現型の系列に分化する能力がある。造血幹細胞は、可能性が同等の娘細胞を生成するほかに、少なくとも１つの主要な造血性の系列の細胞を生じることができる幹細胞と定義されている。３つの主要な血液細胞の系列には、リンパ系列、例えば、Ｂ細胞及びＴ細胞、骨髄系列、例えば、単球、顆粒球、及び巨核球、並びに赤血球系列、例えば、赤血球が含まれる。ある種の造血幹細胞は、脳細胞を含む、他の細胞型に分化することができる。
多能性（幹）前駆細胞の移植は、単一又は少数の細胞型の喪失又は機能不全により引き起こされる様々な障害の治療に対する有望な戦略である。これらには、脊髄損傷などの神経学的障害、ハンチントン及びパーキンソンなどの皮質下の神経変性、並びにＭＳなどの脱髄性疾患、並びに糖尿病、心不全の心筋梗塞、組織傷害、及び創傷治癒不全など、他の病理学的状態が含まれる。特に、ＭＳ及びその動物モデルのＥＡＥでは、オリゴデンドロサイト及びニューロンに分化する幹細胞は、ミエリンの損傷の修復、及び変性するニューロンの置換をもたらすことができる。しかし、今まで、これらの系における幹細胞移植は治療の結果が良くない結果に終わっていた。したがって、このようにしてＥＡＥマウス中に移植した幹細胞は、主に注射部位周辺（局所投与の場合）、又は血管周囲位置（全身投与を用いた場合）に見られ、その増殖、遊走、及び分化は、疾患によりもたらされた損傷を埋め合わせるのに不十分であった（Ｇｏｌｄｍａｎ、２００５年；Ｐｌｕｃｈｉｎｏ及びＭａｒｔｉｎｉ、２００５年）。ＭＳ患者の脱髄した脳の部位中に幹細胞を移植する臨床試験では、移植を受けた患者に幹細胞が生存する証拠が見られなかったので、２００３年に中止された（Ｐｌｕｃｈｉｎｏ及びＭａｒｔｉｎｉ、２００５年）。これらの結果は、移植された細胞及び常在の細胞を破壊する慢性の炎症プロセスに関連していた。幹細胞ベースの治療戦略、特にＭＳを意図した治療戦略は、細胞を送達するための疾患修飾の補助薬を必要とすることが示唆されていた。幹細胞治療は、神経学的障害に関連しない、多くの他の医学上の適用としても考慮されている。
ネズミ科動物及びヒトの脳の両方からの神経幹細胞系統の分離及びクローニングが、報告されている。ヒトＣＮＳの神経幹細胞は、ネズミ科動物のホモログ同様、マイトジェン含有の（典型的には上皮成長因子、又は上皮成長因子プラス基本の線維芽細胞成長因子）無血清培地で維持すると、懸濁培地中で成長してニューロスフェアとして知られる細胞の凝集塊を形成する。マイトジェンを除去し基質を供給すると、幹細胞はニューロン、星状細胞、及びオリゴデンドロサイトに分化する。このような幹細胞を発達中の、又は成熟した脳の中に再導入した場合、これらは分裂、遊走、及び成長のプロセスを通して経験することができ、通常ニューロンが産生する神経伝達物質及び成長因子の発現を含めた、神経の表現型を呈する。したがって、神経幹細胞を使用すると、少なくとも２つの方法で：（１）死滅した部位に部分的に再び住み着き、ＣＮＳ損傷により失われた神経の連結を再確立する幹細胞により、並びに（２）ＣＮＳ損傷後、配線し直すために脳が必要とする重要な神経伝達物質、及び成長因子を分泌することにより、ＣＮＳ損傷の回復に有利であり得る。
最近、ヒト成人の脳で、再生可能な神経幹細胞の源が発見された。これらの細胞は、神経系の障害に対する細胞補充療法の候補であり得る。これらの細胞をヒト成人の脳から単離する能力により、神経幹細胞の自家移植を行う可能性が生じる。パーキンソン病の患者を処置するために、ヒト成人の神経幹細胞で行う臨床試験が始まったと報告されている。成人の神経幹細胞を臨床試験で使用しようとする場合、これらは臨床上意義深い量に拡張するのに適さなければならない。残念なことに、これらの細胞の培養皿での寿命は限られているようであり、後の継代で安定であるか否か、及び有用な数のニューロンを産生することができるか否かはまだ決定されていない。
脳は、長い間、免疫学的特権部位であると考えられてきた。しかし、自己免疫性のＴ細胞（その活性の開始、期間、及び強度に関して制御されている）は、ＣＮＳ傷害後（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、２００３年）、及び精神機能障害の場合に（Ｋｉｐｎｉｓら、２００４年）、ニューロンの生存に有益な効果を及ぼすことが最近示された。さらに、変性の神経組織に対するＴ細胞の有益な効果の根底を成すメカニズムを徹底的に理解すると、傷害部位でＴ細胞が神経組織の表現型の支持を獲得するようにミクログリアに指示していることが示された。さらに、いくつかの免疫ベースの介入がこの保護反応を高めることができる様子であり、そのすべてがミクログリアの活性化に変換する（Ｓｈａｋｅｄら、２００４年）。損傷のタイプが取組みの選択を決定するのではなく、取組みの選択を決定するのは部位である。抗原の中には多くの抗原と交差反応するものがあり、そうして組織特異性のバリアを克服することができる。本発明により、本発明者らは、ニューロンの生存をもたらす同じ操作が、神経発生及びオリゴデンドロジェネシスをもたらすことを示している。同じミクログリアが、Ｔ細胞により、又はそれらのサイトカインにより活性化され、ニューロンの生存を支持するだけでなく、オリゴデンドロジェネシス及び神経発生も支持するようである。これらの結果は、Ｔ細胞ベースの操作が、内因性の幹細胞の源からだけではなく外因性に適用される幹細胞からの細胞の再生に好都合である、損傷を受けた神経組織における状態を作り出すであろうということを指摘している。
コポリマー１、即ちＣｏｐ１は、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｌａ、及びＬ−Ｔｙｒの４つのアミノ酸から構成される非病原性の合成のランダムのコポリマーである。Ｃｏｐ１の１形態である酢酸グラチラマー（ＧＡ）は、Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）（Ｔｅｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｌｔｄ．、Ｐｅｔａｃｈ Ｔｉｋｖａ、イスラエルの登録商標）の名称のもとに多発性硬化症の処置に現在認可されている薬物である。これは、いくつかの種で様々な脳炎誘発物質が誘発するＥＡＥに対して顕著な抑制効果を発揮する（Ａｒｍｏｎ及びＳｅｌａ、２００３年）。
Ｃｏｐ１は、大変耐容性のよい物質であり、有害作用が少なく、安全プロフィールが高い。経口摂取又は吸入によるＣｏｐ１での処置は、米国特許第６２１４７９１号に開示されている。
最近、動物モデルにおいて、Ｃｏｐ１はいくつかのさらなる障害に有益な効果をもたらすことが見出された。このように、Ｃｏｐ１は、骨髄移植の場合の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）で（Ｓｃｈｌｅｇｅｌら、１９９６年；Ａｈａｒｏｎｉら、１９９７年；米国特許第５８５８９６４号）、並びに実質臓器移植の場合の移植片拒絶で（Ａｈａｒｏｎｉら、２００１年、２００４年）、並びに出願者の特許出願で（ＷＯ００／２７４１７及びＷＯ／００９３３３Ａ２）顕在化する免疫拒絶反応を抑制する。
同出願者のＷＯ０１／５２８７８及びＷＯ０１／９３８９３は、Ｃｏｐ１、Ｃｏｐ１関連ペプチド及びポリペプチド、並びにそれらで活性化したＴ細胞は、ＣＮＳ細胞をグルタミン酸塩の毒性から保護し、ＣＮＳ及びＰＮＳにおいてニューロンの変性を防ぎ、又は阻害し、或いは神経の再生を促進することを開示している。したがって、例えば、Ｃｏｐ１は、視神経症及び緑内障などの神経変性疾患に対する治療用ワクチンとして評価にかけられている（Ｋｉｐｎｉｓ及びＳｃｈｗａｒｔｚ、２００２年）。
Ｃｏｐ１は、広範囲の自己反応性Ｔ細胞を活性化し、ＣＮＳの白質及び灰白質の両方の変性に対して効果的である神経保護の自己免疫をもたらす低親和性の抗原として作用することが示されていた（Ｓｃｈｗａｒｔｚ及びＫｉｐｎｉｓ、２００２年）。Ｃｏｐ１ワクチン接種の神経保護効果は、視神経傷害（Ｋｉｐｎｉｓら、２０００年）、頭部外傷（Ｋｉｐｎｉｓら、２００３年）、緑内障（Ｓｃｈｏｒｉら、２００１年；Ｂａｋａｌａｓｈら、２００３年）、筋萎縮性側索硬化症（Ａｎｇｅｌｏｖら、２００３年）などの急性及び慢性の神経学的障害の動物モデルにおいて、並びに本出願者らの特許出願ＷＯ０１／５２８７８、ＷＯ０１／９３８９３、及びＷＯ０３／０４７５００において実証されていた。
プリオン関連疾患を処置するためにコポリマー１を使用することは、ＷＯ０１／９７７８５に開示されている。Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ及び同僚たちは、Ｃｏｐ１で免疫化したマウスの脾細胞で受動免疫をすると、ＭＰＴＰ処置マウスにドパミン作動性の神経保護を付与することを開示している（Ｂｅｎｎｅｒら、２００４年）。
Ｃｏｐ１及び関連のコポリマー及びペプチドは、自己免疫疾患を処置するためにＷＯ００／０５２５０で（Ａｈａｒｏｎｉら、２０００年）、及び炎症性腸疾患を処置するためにＷＯ２００４／０６４７１７で（Ａｈａｒｏｎｉら、２００４年）開示されていた。
ＧＡの免疫調節効果は、高レベルの抗炎症性サイトカインを分泌するＴｈ２／３細胞を誘発するその能力に起因するものであった（Ａｈａｒｏｎｉら、１９９８年；Ｄｕｄａら、２０００年）。これらの細胞は血液脳関門（ＢＢＢ）を越え、ＣＮＳに蓄積し（Ａｈａｒｏｎｉら、２０００年、２００２年）、ｉｎ ｓｉｔｕでインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、及び脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を発現する（Ａｈａｒｏｎｉら、２００３年）。さらに、ＧＡに特異的な細胞は、隣接するＣＮＳ細胞に対する傍観者効果を誘発してこれらの有益な因子を発現させ、インターフェロン（ＩＦＮ）−γの発現を低減させる。ＧＡが病理学的プロセスに対抗する能力における重要な問題は、病理学的プロセスの実際の標的であるニューロン系統に対するその効果である。
上記に記載した参照のいずれも、ＧＡがＣＮＳで神経発生を誘発することを特に開示しておらず、ＣＮＳにおける神経発生を誘発する上でのＧＡの効果の試験についてデータもプロトコールも発表されていない。
本発明は、内因性の、及び外因性に投与される幹細胞からの神経発生及び／又はオリゴデンドロジェネシスを誘発し、増強するための方法に関し、この方法は、それを必要とする個体に、コポリマー１、コポリマー１関連ポリペプチド、コポリマー１関連ペプチド、及びコポリマー１、コポリマー１関連ポリペプチド、又はコポリマー１関連ペプチドによって活性化された活性化Ｔ細胞からなる群から選択される物質を投与することを含む。
本発明はさらに、幹細胞を神経保護物質と組み合わせてそれを必要とする個体に移植することを含む幹細胞治療の方法に関し、前記神経保護物質は、コポリマー１、コポリマー１関連ポリペプチド、コポリマー１関連ペプチド、及びコポリマー１、コポリマー１関連ポリペプチド、又はコポリマー１関連ペプチドによって活性化された活性化Ｔ細胞からなる群から選択される。
本発明は、内因性の、及び患者に投与される外因性の幹細胞からの神経発生及び／又はオリゴデンドロジェネシスを誘発し、増強するための薬剤組成物を調製するための、コポリマー１、コポリマー１関連ポリペプチド、コポリマー１関連ペプチド、及びコポリマー１、コポリマー１関連ポリペプチド、又はコポリマー１関連ペプチドによって活性化された活性化Ｔ細胞からなる群から選択される神経保護物質の使用にも関する。
好ましい一実施形態では、この物質は、幹細胞治療と組み合わせて使用するためのコポリマー１である。
神経発生、及び神経系統への分化に対するＥＡＥ誘発の効果を解明し、疾患の様々な段階におけるＧＡ注射での末梢の免疫調節性の処置が神経発生及び神経保護のプロセスに何らかの効果があるか否かを調査しようとしていたが、本発明者らの何名かが、ＥＡＥマウスの神経増殖は疾患の出現後に増大するが、引き続きナイーブのマウスの神経増殖を下回って低下することを見出した。それとは対照的に、ＧＡ処置によりニューロン／軸索の損傷の低下の持続、並びに神経前駆体の増殖及び動員の増強がもたらされた。新生仔の神経前駆体は、興奮中及び休止中の遊走経路を通って、通常は神経発生を経験しない脳の領域における傷害部位中への大量の遊走を現し、成熟したニューロンの表現型に分化したが、これはＣＮＳにおける免疫調節、神経発生、及び治療上の結果の間の直接の関連を裏付けるものであった。
過去１０年間の研究により、脳は、限られた程度ではあるが、生涯を通して細胞を再生することが潜在的に可能であることが明らかになっていた（Ｍｏｒｓｈｅａｄら、１９９４年）。しかし、成人の神経細胞の再生を制限し、又は有利に働くことができる機序は、知られていない。本発明者らの研究室からの最近の研究は、ＣＮＳに対する傷害の後、時間、空間、及び強度において末梢の適応免疫が適切に制御する局所の免疫反応が、外傷後のニューロンの生存にとって中心的な必要要件であることを示していた（Ｍｏａｌｅｍら、１９９９年；Ｂｕｔｏｖｓｋｙら、２００１年；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、２００３年；Ｓｈａｋｅｄら、２００４年）。したがって、本発明者らは、神経発生の欠如、及び回復の制限は、ひいては局所の免疫反応に関連するかもしれない共通の因子に起因し得る可能性を想定した。
本発明は、脳における細胞の再生には良く制御された適応免疫が必要とされるという、本発明者らの何名かの仮定に基づくものである。したがって、神経発生及びオリゴデンドロジェネシスは、適応免疫に関連するサイトカインに出くわしたミクログリアによって誘発され、支持されるが、ナイーブのミクログリアによっては支持されず、内毒素に出くわしたミクログリアによって阻止されると仮定された。
実際に、本明細書では、ある種の特異的に活性化されたミクログリアは神経細胞の再生を誘発し支持することができることを示している。したがって、神経再生もオリゴデンドロジェネシスも、両方とも適応免疫に関連するサイトカインであるＩＬ−４及びＩＦＮ−γによって活性化されたミクログリアと同時培養したＮＰＣで誘発され、支持された。これとは対照的に、ＭＧ（ＬＰＳ）は細胞の再生を阻止するという以前の報告と一致して、ＬＰＳに曝したミクログリアは、神経再生及びオリゴデンドロジェネシスの両方を阻止した（Ｍｏｎｊｅら、２００３年）。
活性化したミクログリアの形態の防御メカニズムは、急性及び慢性の神経変性状態にしばしば見られ、ＣＮＳはそれらを耐容するには備えが乏しい（Ｄｉｊｋｓｔｒａら、１９９２年）。その結果、活性化したミクログリアは、炎症を起こし、細胞の生存を妨げ（Ｐｏｐｏｖｉｃｈら、２００２年）、細胞の再生を阻止する（Ｍｏｎｊｅら、２００２年、２００３年）一様に敵対する細胞の集団と、一般に考えられていた。
しかし、最近の研究では、活性化のタイプがミクログリアの活性を決定し、ある環境ではこれらの効果が細胞の生存に対立的であり得るように、これらは他の環境では保護的であり得る。したがって、例えば、適応免疫に出くわしたミクログリア（ＣＤ４＋Ｔ細胞）は、保護的な表現型を獲得することが示された（Ｂｕｔｏｖｓｋｙら、２００１年）。このようなＴ細胞により生成されミクログリアに神経保護の表現型を与えることができるサイトカインの中には、Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞に特徴的な、それぞれＩＦＮ−γ及びＩＬ−４がある。したがって、活性化されたＴｈ１細胞又はＩＦＮ−γに曝されたミクログリアは、神経変性障害における中心的存在であるグルタミン酸塩の取り込みの増大を示すが（Ｓｈａｋｅｄら、未発表の知見）、これらをＩＬ−４に曝すと、破壊的なミクログリアの表現型における一般的存在であるＴＮＦ−αの下方制御、及び、多分化能の成人神経前駆細胞からオリゴデンドロサイトの分化を促進するインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）の上方制御をもたらす（本明細書の実施例に示す）（Ｈｓｉｅｈら、２００４年）。さらに、ＩＧＦ−１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでオリゴデンドロサイトに対するグルタミン酸塩が媒介する毒性の急性の破壊的効果を妨げ（Ｎｅｓｓら、２００２年）、一次性の脱髄の間の成熟オリゴデンドロサイトのアポトーシスを阻害する（Ｍａｓｏｎら、２０００年）。これら及び他の所見は、損傷を受けたＣＮＳにおける局所の免疫反応（ミクログリアに対するその効果の面で）の結果は、ミクログリアが兆しをどのように解釈するかによって、有益でも有害でもある。
一般的に、組織の修復は、時間及び空間において良好に同調したプロセスであり、そのプロセスでは、病変部位を明らかにし、再生のための前駆体細胞の遊走、増殖、及び分化の状態を作り出すために免疫の活性が必要とされている。建設的な細胞の再生はＣＮＳでは限られているというよく知られた事実、並びに、ＭＧ（ＬＰＳ）で処置をするとニューロンの喪失を引き起こし（Ｂｏｊｅら、１９９２年）ＮＰＣのホーミング及び分化を妨害する（Ｍｏｎｊｅら、２００３年）という報告された知見、並びに順応して活性化したミクログリアはニューロンの生存を支持することができるという報告された知見に照らして考えると、ニューロンの生存に有利に働く免疫の状態は細胞の再生も支持することを見出しても、驚くことではない。ＭＧ（ＬＰＳ）は、過量のＮＯ（酸化ストレスを引き起こす）及びＴＮＦ−α、並びに他の細胞毒性要素を生成し、悪化する神経毒性のスパイラルをもたらす（Ｂｏｊｅら、１９９２年）。ＮＯは、成年哺乳動物の脳において細胞の増殖及び神経発生の重要な負の調節物質として働き（Ｐａｃｋｅｒら、２００３年）、ＴＮＦ−αはオリゴデンドロジェネシスに対して阻害効果を有することが見出された（Ｃａｍｍｅｒら、１９９９年）。
本発明の結果は、ＭＧ（ＬＰＳ）はＮＰＳの生存及び分化に実際に有害であるが、適応免疫の機能を有する細胞又はサイトカインによってミクログリアが活性化される場合、それらは細胞毒性でないだけでなくＮＰＣの増殖に対してむしろ正の効果を発揮し、それらがニューロン又はオリゴデンドロサイトへ分化するのを誘発し、且つ支持することを示している。ｉｎ ｖｉｖｏでは、ラット脳の側脳室中にＭＧ（ＩＬ−４）を注射すると、ニューロンの喪失をもたらさず、ミクログリアのＣＮＳ実質への遊走は最小となり、新しいニューロン及びオリゴデンドロサイトの出現をもたらす（ニューロン又はオリゴデンドロサイトのマーカーでＢｒｄＵ＋細胞を２重染色することにより示される）。ミクログリアに対して染色すると、ＭＧ（ＬＰＳ）により健常ＣＮＳが著しく侵襲されることが明らかになり、ＭＧ（ＩＬ−４）又はＭＧ（−）の場合と異なり、大量の組織が喪失する結果となった。興味深いことに、注射しなかった海馬では、常在のミクログリアが脳室下帯に隣接して見出された。神経発生を制御し、それらが静止期にある場合にそれを抑制するが（ＭＧ（−）を用いた現在の研究で見出されたように）、適切に活性化された場合にそれを誘発し支持するのを担うのは細胞であり得るということを推測するのは魅力的である。
本発明者らの所見は、実験上の自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を有するマウスでは、ＮＰＣはＣＮＳ損傷の部位に遊走するという知見により支持されている（Ｐｌｕｃｈｉｎｏら、２００３年）。これは、傷害が存在しなければ再生に有利に働く状態は存在しないことを意味しているので、傷害は細胞の再生に有利に働くという一般の経験とやはり一致している。
細胞の再生、及び新しい増殖によるその補充は、身体のほとんどの組織における組織の修復に一般的な手順である。これらのプロセスは脳では起こらず、したがっていかなるニューロンの喪失も取替え不可能であり、軽症から壊滅的な範囲の機能的欠損をもたらすと考えられていた。急性でも慢性でもＣＮＳに対する発作の後に傷害後のニューロンの損傷が広がることが多いので、できるだけ多くのニューロンを救済することによりこの２次性の変性を最小にする方法を見出すことに多くの研究がささげられてきた。
本発明の結果により、本発明者らは興味深い結果に導かれた。第１に、病理学的条件下では（細胞の再生が重大な場合）ミクログリアは細胞の再生に有利に働かないだけでなく、それを妨害する。第２に、この逆説的な状況は、ミクログリアの活性が細胞毒性ではなく保護的であり再生伝導性である方法でミクログリアを形作る、良く制御された適応免疫によって治療することができる。これは、保護的な自己免疫が回復の改善をもたらす場合には、神経発生及びグリア細胞産生の両方が起こる可能性があることを示している。これらのデータは、自己免疫疾患において細胞の再生がないことも説明することができ、このような場合には、循環している自己免疫性のＴ細胞の量は、過剰のＩＦＮ−γにより、それを上回ったＴＮＦ−αの生成がミクログリアに保護的な表現型を獲得させない閾値を超える可能性がある。これらのデータはまた、ステロイドが有益でない理由を説明することもできる、というのは、これらの抗炎症の活性が、破壊的であるだけでなく有益でもある適応免疫をマスクするからである。したがって、自己免疫疾患及び神経変性状態の両方に選択される治療は、疾患の急性期の後、生存している組織が比較的少量のＴ細胞によって維持され得る免疫調節であると思われる。
本発明の発見は、成人の脳における自発的な、内因性の神経発生及びオリゴデンドロジェネシスの限界は、少なくとも部分的には、局所的な免疫活性の結果であり、免疫抑制よりもむしろ適応免疫を利用することは、ＣＮＳにおける細胞の再生を促進するための設計方法において選択すべき道であることを指摘している。
成年の哺乳動物のＣＮＳにおける細胞の再生は限られている。最近の研究では、炎症によってそれが抑止されることが示唆されている。環境の刺激に応じてミクログリアがこのような再生を誘発し、支持し、又は阻止することができるという本発明の発見は、この見識に挑戦するものである。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、神経前駆細胞からの神経発生及びオリゴデンドロジェネシスは、本明細書では、Ｔ細胞関連性のサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４）に出くわしたマウスのミクログリアによって促進されるが、内毒素に出くわしたミクログリアによって阻止されることが示された。抗−ＩＧＦ−１抗体はＩＬ−４効果を中和し、抗−ＴＮＦ−α抗体はＩＦＮ−γの効果を増強した。成年ラットの脳室中にＩＬ−４で活性化したミクログリアを注射すると、著しい海馬の神経発生及び皮質のオリゴデンドロジェネシスを誘発し、一方、内毒素で活性化したミクログリアはニューロンの喪失、並びに神経発生及びオリゴデンドロジェネシスの阻止を引き起こした。これらの結果は、制御された適応免疫は、非制御の（例えば、内毒素誘発性の）炎症と異なり、ミクログリアを活性化して、ニューロン及びオリゴデンドロサイトの生存及び再生を誘発し支持するという本発明者らの仮定を強化するものである。したがって、ＣＮＳで細胞の再生を促進するために、良く制御された免疫が必要とされ、これを抑制してはならない。
傷害後の生存及び修復には、ＣＮＳにおいて自己抗原に向けたＴ細胞の活性を制御することが必要であると報告されていた（Ｍｏａｌｅｍら、１９９９年；Ｙｏｌｅｓら、２００１年；Ｋｉｐｎｉｓら、２００２年）。これらの結果により、健常個体に存在することが知られている自己免疫性のＴ細胞の根本的役割は、ＣＮＳの完全性を維持するのを助けることであり、神経変性の環境におけるその治療効果は、極端な条件下における同様の回復性の役割の現れであると、本発明者らは考えるようになった。さらに、このような自己免疫性のＴ細胞が傷害後のニューロンの生存に関与することを証明する証拠を蓄積することで、これらが健常のＣＮＳで同様の役割を有する場合、おそらくはそのような細胞の再生に必要とされる条件を維持することにより、成年期における神経発生と何か関係があってもよいという仮定に本発明者らは導かれた。
本発明に従って、本発明者らは、脳の炎症に関連した生理学的及び病理学的条件下で、成年ラットの海馬におけるミクログリアの活性化の性質が神経変性にどのように影響を及ぼすかを試験した。ミエリンに特異的なＴｈ１細胞の一過性の蓄積に関連した一過性の炎症状態が、神経発生を促進した。ＩＦＮ−γ（ＭＧ（ＩＦＮ−γ））又はＩＬ−４（ＭＧ（ＩＬ−４））により活性化したミクログリア（ＭＧ）を健常ラットの脳の側脳室中に注射すると神経発生を促進した。単相性の（一過性の）ＥＡＥを発症したラットでは、誘発された神経発生は、ＭＧ（ＩＬ−４）によりさらに促進された。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける本発明者らの結果は、ＭＧ（ＩＦＮ−γ）は、ＩＦＮ−γ濃度が低い限りは、成年ラットのＮＰＣからの神経発生を支持することを示していた。高用量のＩＦＮ−γが課す神経発生に対する妨害は、ＩＬ−４により対抗され得る。しかし、ＩＬ−４が誘発する神経発生は、低用量のＩＦＮ−γにより、又はＩＬ−４と組み合わせて投与した高用量のＩＦＮ−γにより誘発されるものよりも弱かった。
本明細書では、本発明者らは、局所の環境の変化及び必要性に反応することができ、その結果として成年ＮＰＣからの新しい細胞の形成を支持することができるＣＮＳにおける細胞の要素を同定した。本発明者らは、ミクログリアは、循環しているＴ細胞由来のサイトカインにより適切に活性化された後、ＮＰＣからのニューロン及びオリゴデンドログリアの分化を誘発することができることを実証した。この知見、及び、齧歯動物ではＴ細胞ベースのワクチン接種が挫傷性の脊髄損傷（ＳＣＩ）からの回復を促進するという本発明者らの以前の実証を考慮すると、これらの発見を治療上の取組みに転換することは、傷害部位でニッチ様の神経発生／グリア細胞発生の環境を作り出すことにより修復のプロセスに有益であり得ると、本発明者らは仮定した。したがって、本発明者らは、相同のａＮＰＣを移植することによりワクチン接種を補うことで、ＳＣＩ後の機能回復をさらに促進することを見出すことを期待した。本発明では、本発明者らは実際に、マウスモデルを用いて、脊髄の挫傷性の損傷後に機能的な運動の回復を促進する上で、Ｔ細胞ベースの免疫活性化と移植したａＮＰＣとの間の相乗的な相互作用を実証した。
本発明者であるＭ．Ｓｃｈｗａｒｔｚによる以前の研究では、自己抗原の弱い作用物質に向けたＴ細胞の数を増大することに基づく免疫系の全身性の操作は、ニューロンの生存を促進することにより神経変性の状態に有益な効果を及ぼすことが示されていた（Ｍｏａｌｅｍら、１９９９年；Ｈａｕｂｅｎら、２００１年：Ｓｃｈｗａｒｔｚ及びＫｉｐｎｉｓ、２００２年）。同様の操作、例えばＴ細胞ベースのワクチン接種が、神経発生を増大させるためにここで提唱され、加齢する脳及び病める心の統一性を維持する新規な方法をもたらしている。
したがって、脳細胞の維持及び修復は、ＣＮＳ−自己反応性Ｔ細胞と脳に常在するミクログリアとの間の対話を必要とするようである。しかし、ミクログリアがＡＰＣとして作用することができ、関連する抗原をホーミングＴ細胞に提示しない限り、この対話は行われ得ない。したがって、本発明者らは、アルツハイマー病（ＡＤ）の進行を停止させるためには、凝集したアミロイド−β（Ａβ）以外のＣＮＳに特異的な抗原を認識するＴ細胞が、脳で凝集したＡβプラークの部位を標的としなければならないと仮定した。Ｔ細胞はこれらの部位に到達すると、これらに特異的な抗原に遭遇することにより活性化され、ＡＰＣとして作用するミクログリアによりこれらに提示される。このように活性化されることにより、これらのＴ細胞は局所的に常在するミクログリア上の凝集したＡβの負の効果を相殺することができるようになり、したがってＡβがニューロンに対して細胞毒性となり、神経発生を阻止するのを妨げる。本発明者らは、多発性硬化症の処置にＦＤＡが認可した合成コポリマーであり、広範囲のＣＮＳ常在の自己抗原と弱く交差反応することができる酢酸グラチラマー（ＧＡ、コポリマー１又はＣｏｐ−１としても知られる）をＡＤマウスにワクチン接種することにより、この仮説を試験した（Ｋｉｐｎｉｓら、２０００年）。ＧＡで活性化したＴ細胞は、ＣＮＳに浸潤した後、自己免疫疾患を引き起こすと思われる圧倒的な増殖の危険性なしに、局所的に活性化される可能性を有する。本発明者ら及び他者による研究では、ＧＡは自己反応性Ｔ細胞の保護効果及び修復効果を擬し得ることが示されていた（Ｋｉｐｎｉｓら、２０００年；Ｂｅｎｎｅｒら、２００４年）。
本発明では、認知の低下及びＡβプラークの蓄積に罹患しているＡＰＰ／ＰＳ１ダブルトランスジェニックＡＤマウス（変異型のヒトプレセニリン１及びアミロイド−β前駆体タンパク質を同時発現する）において、Ｔ細胞ベースのワクチン接種は、ミクログリアの表現型を変更することにより、認知能力を回復し、プラーク形成を低減し、皮質及び海馬のニューロンを救済し、及び海馬の神経発生を誘導した。
本発明者らは、ＴｇマウスをＧＡでワクチン接種すると、認知のいくらかの喪失及びプラークのいくらかの形成がすでに起こった後にワクチン接種を与えた場合でも、プラークの形成を低減し、認知の低下を防ぎ、部分的に逆転さえしたことを本明細書に示している。ＧＡでワクチン接種すると、疾患の進行を妨げるのに効果的であるだけではなく、学習／記憶の喪失という臨床症状及びプラークの病理学的出現が始まった後に投与した場合に組織の修復を促進するのにも効果的であることに留意すべきである。上記の発見は、ＣＮＳ−自己反応性Ｔ細胞の欠損したマウスでは、認知活性及び細胞の再生の両方に関連することが知られている脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の発現が損なわれるという本発明者らの知見と一致する。これは、Ｔ細胞は健常の、及び罹患している脳における認知機能を維持するために必要とされているという本発明者らの知見とも一致している（Ｋｉｐｎｉｓら、２００４年）。凝集したＡβは、ミクログリアがＴ細胞との対話に従事する能力を明らかに妨害するので、脳に凝集したＡβが存在することは認知能力の喪失及び神経発生の機能障害を引き起こすと予想することができる。このような場合では疾患又は損傷の部位へのＣＮＳ−自己反応性Ｔ細胞のホーミングは決定的であるが、これらＴ細胞が凝集したＡβの破壊的な活性を相殺することができる場合にのみ効果的である。ミエリンに特異的なＴ細胞がそれと容易に対話を持つことができるミエリン提示性ミクログリアは、豊富に存在する様子である。したがってミエリンに関連する抗原、又はミエリンと弱い交差反応性のある抗原（例えばＧＡ）は、治療的なワクチン接種に選択される抗原であると思われる。次いで、ミエリンに特異的なＴ細胞はＣＮＳに戻り、そこでそれらに関連するＡＰＣに遭遇すると局所的に活性化されて、凝集したＡβにより活性化されたもののような有害なミクログリアを好適に調節するのに必要とされるサイトカイン及び成長因子を供給する。Ｔ細胞とミクログリアの間に得られたシナプスは、成人幹細胞のプールから神経発生を促進することにより細胞の再生を支持するニッチを作り出し、それにより炎症を起こした脳で誘発される年齢に関連した機能障害を克服する。
酢酸グラチラマー（ＧＡ、コポリマー１）の知られている特徴は、神経学的障害及び他の障害を処置するための幹細胞移植に関しても大変重要である。したがって、神経学的疾患、特にＭＳを含む様々な疾患に対する幹細胞移植の治療上の結果を改善するためにＧＡを使用することが提唱されている。この目的のためにＧＡを使用する根本的理由は、本発明者らであるＲ．Ａｈａｒｏｎｉ及びＲ．Ａｒｎｏｎのその作用機序に関する以前の結果に、並びに移植片と骨髄の拒絶反応、及び自己神経発生性の効果を低減するその有効性の発見に基づくものである。したがって、ＧＡは自己ニューロン前駆細胞の内因性の神経発生だけではなく、移植された多分化能の（幹）前駆細胞の外因性の神経発生も増強するのに効果的であることが想像される。その非常に高度に安全なプロファイルとともにＧＡの機能のこれらの現れは、神経学的障害に特に関連するものの他に、多くの臨床上の適用のための前駆幹細胞移植を改善するための組合せ治療におけるその適用を支持している。
したがって、本発明は、一態様では、内因性の、及び外因性に投与される幹細胞からの神経発生及び／又はオリゴデンドロジェネシスを誘発し、増強するための方法に関し、この方法は、それを必要とする個体に、コポリマー１、コポリマー１関連ポリペプチド、コポリマー１関連ペプチド、及びコポリマー１、コポリマー１関連ポリペプチド、又はコポリマー１関連ペプチドによって活性化された活性化Ｔ細胞からなる群から選択される物質を投与することを含む。
本発明の方法は、新規に形成したニューロン又はオリゴデンドロサイトの増殖、分化、及び生存をさらに含み、ニューロン前駆体の増殖、ニューロンの遊走、及び／又は新規に形成したニューロンの成熟ニューロンへのニューロンの分化を含む。
一実施形態では、本発明は、内因性の、又は外因性に適用される幹細胞からの神経発生を誘発し、増強するための方法に関する。別の一実施形態では、この方法は、通常神経発生を経験する脳の領域、並びに線条体、側坐核、及び／又は皮質など、通常神経発生を経験しない脳の領域の両方において、損傷又は傷害を受けた脳の領域における自己神経発生を誘発し、増強するためのものである。
別の一実施形態では、本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）における、ニューロンの前駆体の増殖、ニューロンの遊走、及び／又は新規に形成したニューロンの成熟ニューロンへのニューロンの分化を含む自己神経発生を誘発し、増強するための方法に関し、この方法は、必要とする個体に、コポリマー１、コポリマー１関連ポリペプチド、コポリマー１関連ペプチドからなる群から選択される物質を投与することを含む。
別の一実施形態では、本発明は、内因性の、又は外因性に適用される幹細胞からのオリゴデンドロジェネシスを誘発し、増強するための方法に関する。
別の一実施形態では、本発明は、免疫調節により、内因性の、又は外因性に適用される幹細胞からのオリゴデンドロジェネシスを誘導し、増強するための方法に関し、この方法は、必要とする個体に、コポリマー１、コポリマー１関連ポリペプチド、コポリマー１関連ペプチド、及びコポリマー１、コポリマー１関連ポリペプチド、又はコポリマー１関連ペプチドによって活性化された活性化Ｔ細胞からなる群から選択される神経保護物質を投与することを含む。
別の一実施形態では、本発明で使用するための物質は、コポリマー１、コポリマー１関連ポリペプチド、又はコポリマー１関連ペプチドによって活性化されたＴ細胞である。このＴ細胞は、内因性であり、抗原又はペプチドの投与によりｉｎ ｖｉｖｏで活性化することができ、それによってＣＮＳ又はＰＮＳの傷害又は疾患の部位に蓄積するＴ細胞の集団を生成し、或いはＴ細胞を、血液から単離し、次いで抗原に感作させたＴリンパ球から調製する。Ｔ細胞は自己由来であることが好ましく、ＣＤ４及び／又はＣＤ８表現型であることが最も好ましいが、例えば、同胞、両親、子供、又はＨＬＡ適合の若しくは部分的に適合した、半同種異系の、若しくは完全な同種異系のドナーなど、関連するドナーからの異質遺伝子型Ｔ細胞であってもよい。前記Ｔ細胞を調製するための方法は、上記に記載したＷＯ９９／６００２１に記載されている。
本発明の方法は、内因性の、及び外因性に投与される幹細胞両方からの神経発生及び／又はオリゴデンドロジェネシスを誘発し、増強するのに有用であり、今日見出される、幹細胞移植、特にＣＮＳ及びＰＮＳ両方の神経系の傷害、疾患、障害、及び病状の場合に結果の悪い問題を解決する助けとなり得る。
一実施形態では、本発明の方法を、神経幹／前駆細胞の内因性のプールからの神経発生及び／又はオリゴデンドロジェネシスを誘発し、増強するために適用する。したがって、コポリマー１、コポリマー１関連ポリペプチド、コポリマー１関連ペプチド、及びこれらで活性化されたＴ細胞は、損傷を受けた組織において、独力で内因性の神経発生及びオリゴデンドロジェネシスを高め、新しいニューロン及びオリゴデンドロサイトの生存も支持する。
別の一実施形態では、本発明の方法を、内因性の、及び患者に投与される外因性の幹細胞の両方からの神経発生及び／又はオリゴデンドロジェネシスを誘発し、増強するために適用する。前記神経保護物質の投与は、移植した幹細胞の上首尾の生着、細胞の再生、並びに幹細胞のニューロン及び／又はオリゴデンドロサイトへの分化の増強を助け、同時に損傷を受けた組織における内因性の神経発生及びオリゴデンドロジェネシスを誘発し、新しいニューロン及びオリゴデンドロサイトの生存を支持する。
したがって、別の一態様では、本発明は、幹細胞を神経保護物質と組み合わせてそれを必要とする個体に移植することを含む幹細胞治療の方法を提供し、前記神経保護物質は、コポリマー１、コポリマー１関連ポリペプチド、コポリマー１関連ペプチド、及びコポリマー１、コポリマー１関連ポリペプチド、又はコポリマー１関連ペプチドにより活性化された活性化Ｔ細胞からなる群から選択される。
一実施形態では、本発明の方法を、中枢神経系（ＣＮＳ）、又は末梢神経系（ＰＮＳ）の傷害、疾患、障害、又は病状に罹患している個体に適用する。
本発明の方法に従って、好ましくは幹細胞治療により処置するＣＮＳ又はＰＮＳの傷害には、脊髄損傷、閉鎖性頭部外傷、鈍的外傷、穿通性外傷、出血性脳卒中、虚血性発作、脳虚血、視神経障害、心筋梗塞、又は腫瘍切除により引き起こされる傷害が含まれる。移植した幹細胞は、細胞が死滅した（例えば、虚血により）傷害の領域に遊走し、ニューロン及び／又はオリゴデンドロサイトに分化する。
本発明の方法により、好ましくは幹細胞治療により処置するＣＮＳ又はＰＮＳ疾患、障害、又は病状には、パーキンソン病及びパーキンソン病様障害、ハンチントン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）が含まれる。他の疾患、障害、又は病状には、顔面神経（ベル）麻痺、緑内障、アルパース病、バッテン病、コケイン症候群、ギランバレー症候群、レビー小体病、クロイツフェルトヤコブ病；又はアデノミエロニューロパチー、アルコール性神経障害、アミロイドニューロパチー若しくはポリニューロパチー、軸索神経障害、シェーグレン症候群に関連する慢性感覚失調性ニューロパチー、糖尿病性神経障害、絞扼性神経障害神経圧迫症候群、手根管症候群、頚部若しくは腰椎の椎間板のヘルニア形成に続くことがある神経根圧迫、巨大軸索神経障害、肝臓性神経障害、虚血性神経障害、ビタミン欠乏による栄養性多発神経障害、吸収不良症候群若しくはアルコール依存症、ポルフィリン症ポリニューロパチー、有機リン剤により引き起こされる中毒性ニューロパチー、尿毒症性多発神経障害；末端肥大症、血管拡張性失調症、シャルコーマリートゥース病、慢性閉塞性肺疾患、ファブリー病、フリードライヒ失調症、ギランバレー症候群、低血糖症、ＩｇＧ若しくはＩｇＡモノクローナル免疫グロブリン異常症（非悪性の、又は多発性骨髄腫若しくは骨硬化性骨髄腫に関連した）、リポ蛋白血症、真性赤血球増加症、レフサム症候群、ライ症候群、及びシェーングレンラルソン症候群からなる群から選択される疾患又は障害に関連する神経障害；様々な薬物に、低血糖症に、ＨＩＶ感染症などの感染症に、若しくは癌に関連する多発神経障害からなる群から選択される単神経障害若しくは多発神経障害などの末梢神経障害；てんかん、健忘症、不安、痛覚過敏、精神病、てんかん発作、酸化ストレス、アヘン剤耐性及び依存が含まれ、並びに不安障害、気分障害、統合失調症若しくは統合失調に関連する障害、薬物使用及び依存及び離脱、並びに記憶喪失若しくは認知障害からなる群から選択される精神病又は精神障害の処置のためである。
別の一実施形態では、本発明の細胞治療の方法を、神経系に無関係の傷害、疾患、障害、又は病状に適用する。好ましい一実施形態では、この方法は、糖尿病、組織修復の不全、心筋梗塞、腎不全、肝硬変、筋ジストロフィー、皮膚の火傷、白血病、関節炎傷害、又は骨粗鬆症傷害から選択される傷害、疾患、障害、又は病状を処置するための骨髄由来の幹細胞移植に適している。
本発明の方法で使用するための幹細胞には、それだけには限定されないが、成人の幹細胞、胎児の幹細胞、臍帯血の幹細胞、造血幹細胞、末梢血幹細胞、間葉系幹細胞、多機能幹細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、間質幹細胞、前駆細胞、又はこれらの前駆体、又は遺伝子改変した幹細胞、及び本発明の方法に適することが見出され得るあらゆる他の幹細胞が含まれる。このような細胞の例には、米国特許第６７７７２３３号、及び米国特許第６６８０１９８号に開示されているＣＮＳ神経幹細胞、神経の刺激薬と投与するために米国特許第６７４９８５０号に開示されている神経幹細胞及び造血細胞、並びにＣＮＳ疾患を処置するために米国特許第６６５３１３４号に開示されている間質細胞が含まれる。
本明細書で用いられる語である「神経幹細胞」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで少なくとも１つの以下：ニューロン（多くのタイプの）、オリゴデンドログリア、及びアストログリア、並びに同様の可能性の新しい神経幹細胞、の基本的な神経系統を生じることができる、中枢神経系、又は発達中の神経系の組織に由来する由来の単一の細胞を述べるのに用いられる。「多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）の」又は「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）の」神経幹細胞は、すべての上記の神経系統及び発生の可能性が等しい細胞を生じることができる。
より好ましい一実施形態では、神経幹細胞は、発達中のＣＮＳ及び成人のＣＮＳ両方から単離することができ、培地中で上首尾に成長させることができるヒトの神経幹細胞であり、自己再生可能であり、成熟ニューロンの及びグリアの子孫を産生することができる。胎児性のヒト神経幹細胞を誘発して、特定のニューロンの表現型に分化させることができる。ヒト神経幹細胞は、発達中のＣＮＳ及び成人のＣＮＳ中に移植した後、ホストの環境中に統合する。パーキンソン病及び脊髄損傷の動物モデル中に移植されたヒトの神経幹細胞は、機能の回復を誘発した。しかし、前記細胞の生着には未だに問題があり、本発明は、上首尾の生着、生存、及び移植した細胞のさらなる分化を増強するものである。最も好ましい一実施形態では、神経幹細胞は自己由来である。
本明細書で用いられる語である「造血幹細胞」は、可能性の等しい娘細胞を生成する他に、少なくとも１つの主要な造血系統の細胞を生じることができる幹細胞を意味する。ある種の造血幹細胞は、脳細胞を含む他の多くの細胞型を生じることができる。
幹細胞を単離した後、当技術分野では周知の方法により、例えば、これらの特許はすべてその全文が本明細書に開示されているように参照として組み入れられる、米国特許第５９５８７６７号、米国特許第５２７０１９１号、米国特許第５７５３５０６号に記載されているように培養する。
本発明による処置レジメンを、投与の様式、投与のタイミング、及び用量に関して、傷害、疾患、又は障害のタイプ及び重症度、並びに患者の年齢及び病状に応じて実行する。免疫調節薬を、細胞の注射又は移植と同時に、その前に、又はその後に投与することができる。
細胞の投与は、様々な方法により行うことができる。ある実施形態では、細胞を直接、脳卒中の空洞中に、髄液に、例えば、脳室内に、くも膜下腔内に、又は大槽内に投与することが好ましい。幹細胞を、コポリマー１又はＴ細胞も含むことができる薬学的に許容できる液体培地に配合することができる。細胞を、脳の損傷を受けた部位の周囲の領域中に注射してもよく、また、ある種の幹細胞が脳における好適な位置に遊走する能力を想定して、細胞を全身に投与してもよい。
好ましい一実施形態では、本発明の方法は、幹細胞をコポリマー１と組み合わせて投与することによる幹細胞治療を含む。一実施形態では、幹細胞を患者に注射／移植し、その後コポリマー１でワクチン接種を行う。別の一実施形態では、幹細胞のコポリマー１との組合せを患者に注射／移植する。さらなる一実施形態では、幹細胞をコポリマー１とｉｎ ｖｉｔｒｏで（人工的に）培養し、移植前に分化させることができる。
本出願における本明細書で用いられる語である、「Ｃｏｐ１」、「コポリマー１」、「酢酸グラチラマー」、及び「ＧＡ」は、交換可能に用いられる。
本発明の目的では、「コポリマー１、又はコポリマー１関連ペプチド若しくはポリペプチド」は、ＭＢＰと機能的に交差反応し、抗原提示におけるＭＨＣクラスＩＩ上でＭＢＰと競合することができるランダムコポリマーを含む、あらゆるペプチド又はポリペプチドを含むものとされる。
本発明で用いるための組成物は、有効物質として、グルタミン酸又はアスパラギン酸などの負に荷電したアミノ酸（好ましくはより少ない量で）と組み合わせて、フィラーとして働く、アラニン又はグリシンなどの非荷電の中性アミノ酸と場合により組み合わせて、並びにコポリマーに免疫原性の特質を与えるように適応されたアミノ酸、例えば、チロシン又はトリプトファンなどの芳香族アミノ酸と場合により組み合わせて、リシン又はアルギニンなどの正に荷電したアミノ酸の適切な割合からなる、ランダムコポリマーによって表されるＣｏｐ１、又はＣｏｐ１関連ペプチド若しくはポリペプチドを含むことができる。このような組成物は、その内容すべてが本明細書に参照として組み入れられるＷＯ００／０５２５０に開示されているコポリマーのあらゆるものを含むことができる。
より詳しくは、本発明で用いるための組成物は、以下の基：（ａ）リシン及びアルギニン、（ｂ）グルタミン酸及びアスパラギン酸、（ｃ）アラニン及びグリシン、並びに（ｄ）チロシン及びトリプトファンの少なくとも３つの各々から選択されるアミノ酸を１つ含むランダムコポリマーからなる群から選択される少なくとも１つのコポリマーを含む。
本発明で用いるためのコポリマーは、Ｌ−若しくはＤ−アミノ酸、又はそれらの混合物から構成され得る。当業者であれば知っているように、Ｌ−アミノ酸はほとんどの天然のタンパク質に生じる。しかし、Ｄ−アミノ酸は市販されており、用いられるいくつか又はすべてのアミノ酸に置き換えて本発明で用いられるコポリマーを作ることができる。本発明は、Ｄ−及びＬ−アミノ酸の両方を含むコポリマー、並びにＬ−又はＤ−アミノ酸のいずれかから本質的になるコポリマーの使用を企図するものである。
本発明の一態様では、コポリマーは各々（ａ）から（ｄ）の異なる１群からの、４つの異なるアミノ酸を含む。
より好ましい一実施形態では、本発明の薬剤組成物又はワクチンは、１．５：４．８：１：３．６の好適な比率のＬ−グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ−アラニン（Ａ）、Ｌ−チロシン（Ｙ）、及びＬ−リシン（Ｋ）のアミノ酸から実質的になるランダムポリペプチドの混合物であるコポリマー１を含み、全体的に正の実行電荷を有し、分子量が約２ＫＤａから約４０ＫＤａである。
好ましい一実施形態では、Ｃｏｐ１の平均分子量は約２ＫＤａから約２０ＫＤａであり、より好ましくは約４，７ＫＤａから約１３ＫＤａであり、さらにより好ましくは約４ＫＤａから約８．６ＫＤａ、約５ＫＤａから９ＫＤａ、又は約６．２５ＫＤａから８．４ＫＤａである。別の好ましい一実施形態では、Ｃｏｐ１の平均分子量は、約１３ＫＤａから約２０ＫＤａ、より好ましくは約１３，５ＫＤａから約１８ＫＤａで、平均約１５ＫＤａから約１６ＫＤ、好ましくは１６ＫＤａである。本発明は、４０ＫＤａより低いＣｏｐ１に対する他の平均分子量も包含する。前記の分子量の範囲のコポリマー１は、当技術分野では周知の方法により、例えば、その全文が本明細書に参照として組み入れられる米国特許第５８００８０８号に記載されている方法により調製することができる。コポリマー１は、約１５個から約１００個の、好ましくは約４０個から約８０個のアミノ酸の長さを含むポリペプチドであることができる。
本発明の好ましい一実施形態では、物質は、酢酸グラチラマーという一般名、又はＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）（イスラエル、Ｐｅｔａｃｈ Ｔｉｋｖａ、Ｔｅｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｌｔｄ．の登録商標）という商品名のもとで知られる、その酢酸塩の形態のＣｏｐ１である。
本明細書に開示した組成物に対するコポリマー１の活性は、１つ又は複数の以下の置換が行われる場合に残存すると思われる：グルタミン酸をアスパラギン酸で、アラニンをグリシンで、リシンをアルギニンで、チロシンをトリプトファンで置換。
本発明の別の一実施形態では、Ｃｏｐ１関連ペプチド又はポリペプチドは、（ａ）から（ｄ）群の３つの異なる群の１つから各々１個の、異なる３個のアミノ酸のコポリマーである。これらのコポリマーを、本明細書ではターポリマーと呼ぶ。
一実施形態では、Ｃｏｐ１関連ペプチド又はポリペプチドは、以後ＹＡＫと呼ぶ、チロシン、アラニン、及びリシンを含むターポリマーであり、ＹＡＫではアミノ酸の平均モル分率は異なることができ、チロシンは約０．０５〜０．０２５０のモル分率で、アラニンは約０．３〜０．６のモル分率で、及びリシンは約０．１〜０．５のモル分率で存在することができる。より好ましくは、チロシン、アラニン、及びリシンのモル比は、それぞれ約０．１０：０．５４：０．３５である。リシンをアルギニンで、アラニンをグリシンで、且つ／又はチロシンをトリプトファンで置換することが可能である。
別の一実施形態では、Ｃｏｐ１関連ペプチド又はポリペプチドは、以後ＹＥＫと呼ぶ、チロシン、グルタミン酸、及びリシンを含むターポリマーであり、ＹＥＫではアミノ酸の平均モル分率は異なることができ、グルタミン酸は約０．００５〜０．３００のモル分率で存在することができ、チロシンは約０．００５〜０．２５０のモル分率で存在することができ、リシンは約０．３〜０．７のモル分率で存在することができる。より好ましくは、グルタミン酸、チロシン、及びリシンのモル比は、それぞれ約０．２６：０．１６：０．５８である。グルタミン酸をアスパラギン酸で、リシンをアルギニンで、且つ／又はチロシンをトリプトファンで置換することが可能である。
別の一実施形態では、Ｃｏｐ１関連ペプチド又はポリペプチドは、以後ＫＥＡと呼ぶ、リシン、グルタミン酸、及びアラニンを含むターポリマーであり、ＫＥＡではアミノ酸の平均モル分率は異なることができ、グルタミン酸は約０．００５〜０．３００のモル分率で存在することができ、アラニンは約０．００５〜０．６００のモル分率で、及びリシンは約０．２〜０．７のモル分率で存在することができる。より好ましくは、グルタミン酸、アラニン、及びリシンのモル比は、それぞれ約０．１５：０．４８：０．３６である。グルタミン酸をアスパラギン酸で、アラニンをグリシンで、且つ／又はリシンをアルギニンで置換することが可能である。
好ましい一実施形態では、Ｃｏｐ１関連ペプチド又はポリペプチドは、以後ＹＥＡと呼ぶ、チロシン、グルタミン酸、及びアラニンを含むターポリマーであり、ＹＥＡではアミノ酸の平均モル分率は異なることができ、チロシンは約０．００５〜０．２５０のモル分率で、グルタミン酸は約０．００５〜０．３００のモル分率で、アラニンは約０．００５〜０．８００のモル分率で存在することができる。より好ましくは、グルタミン酸、アラニン、及びチロシンのモル比は、それぞれ約０．２１：０．６５：０．１４である。チロシンをトリプトファンで、グルタミン酸をアスパラギン酸で、且つ／又はアラニンをグリシンで置換することが可能である。
ターポリマーＹＡＫ、ＹＥＫ、ＫＥＡ、及びＹＥＡの平均分子量は、約２ＫＤａから４０ＫＤａの間、好ましくは約３ＫＤａから３５ＫＤａの間、より好ましくは約５ＫＤａから２５ＫＤａの間で変化することができる。
コポリマー１、並びに関連のペプチド及びポリペプチドは、当技術分野では周知の方法、例えば、縮合条件下で、望ましいモル比のアミノ酸の溶液を用いて、又は、固相合成手順により調製することができる。縮合条件には、あるアミノ酸のカルボキシル基と別のアミノ酸のアミノ基を縮合してペプチド結合を形成するのに適切な温度、ｐＨ、及び溶媒の条件が含まれる。縮合剤、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドを用いて、ペプチド結合の形成を促進することができる。ブロッキング基を用いて、官能基、例えば側鎖部分、及びいくつかのアミノ基又はカルボキシル基を望ましくない副反応に対して保護することができる。
例えば、コポリマーを、米国特許第３８４９５５０号に開示されたプロセスにより調製することができ、この場合、チロシンのＮ−カルボキシ無水物、アラニン、γ−ベンジルグルタミン酸塩、及びＮε−トリフルオロアセチル−リシンを、阻害剤としてのジエチルアミンと無水ジオキサン中、外界温度（２０℃〜２６℃）で重合する。グルタミン酸のγ−カルボキシル基を、氷酢酸中の臭化水素酸により脱ブロックすることができる。１Ｍピペリジンにより、トリフルオロアセチル基をリシンから除去する。当業者であれば、望ましいアミノ酸、即ちグルタミン酸、アラニン、チロシン、又はリシンの任意の１つに関する反応を選択的に除くことにより、コポリマー１における４個のアミノ酸のうち３個を含むペプチド及びポリペプチドを作成するためにこのプロセスを調節することができることを容易に理解する。
コポリマーの分子量を、ポリペプチド合成の間に、又はコポリマーを作成した後に調節することができる。ポリペプチド合成の間に分子量を調節するには、ポリペプチドが望ましい好適な長さに達したときに合成が停止するように、合成条件又はアミノ酸の量を調節する。合成後、望ましい分子量のポリペプチドを、分子量サイジングカラム又はゲル上でポリペプチドをクロマトグラフィーにかけ、望ましい分子量の範囲を収集するなど、あらゆる利用可能なサイズ選択手順により得ることができる。例えば、酸又は酵素の加水分解を行い、次いで精製して酸又は酵素を除去することにより、コポリマーを部分的に加水分解して高分子量の種を取り除くこともできる。
一実施形態では、保護されたポリペプチドを臭化水素酸と反応させて望ましい分子量プロファイルを有するトリフルオロアセチル−ポリペプチドを形成することを含むプロセスにより、望ましい分子量のコポリマーを調製することができる。この反応は、１つ又は複数の試験反応により予め決定された時間及び温度で行われる。試験反応の間、時間及び温度は変動し、試験ポリペプチドの所与のバッチの分子量の範囲が決定される。そのバッチのポリペプチドに最適の分子量の範囲をもたらす試験条件を、そのバッチに用いる。このように、望ましい分子量プロファイルを有するトリフルオロアセチル−ポリペプチドを、試験反応により予め決定した時間及び温度で、保護されたポリペプチドを臭化水素酸と反応させることを含むプロセスにより生成することができる。次いで、望ましい分子量プロファイルのトリフルオロアセチル−ポリペプチドをピペリジン水溶液でさらに処理して、望ましい分子量を有する毒性の低いポリペプチドを形成させる。
好ましい一実施形態では、所与のバッチから保護されたポリペプチドの試験サンプルを、約２０〜２８℃の温度で約１０〜５０時間、臭化水素酸と反応させる。そのバッチに最良の条件を、いくつかの試験反応を行うことにより決定する。例えば、一実施形態では、保護されたポリペプチドを、約２６℃の温度で約１７時間、臭化水素酸と反応させる。
Ｃｏｐ１のＭＳ関連ＨＬＡ−ＤＲ分子に対する結合モチーフは知られているので（Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、１９９９年）、規定された配列を有するＣｏｐ１由来のポリペプチドは、Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら（１９９９年）の出版物に記載されているように、容易に調製し、ＨＬＡ−ＤＲ分子のペプチド収容溝に対する結合性を試験することができる。このようなペプチドの例は、その内容すべてが本明細書に参照として組み込まれるＷＯ００／０５２４９及びＷＯ００／０５２５０に開示されているようなペプチドであり、以下の配列番号１〜３２のペプチドが含まれる。
このようなペプチド、及びＣｏｐ１に由来する他の類似のペプチドは、Ｃｏｐ１と同様の活性を有することが予想される。このようなペプチド、及び他の類似のペプチドは、また、Ｃｏｐ１関連ペプチド若しくはポリペプチドの定義内にあると考えられ、これらの使用は本発明の一部分であると考えられる。
本発明による「Ｃｏｐ１関連ペプチド又はポリペプチド」の定義は、Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉら、２００２年が（多発性硬化症の処置の候補として）記載した、ランダムのアミノ酸４個のコポリマー、即ち、アミノ酸であるフェニルアラニン、グルタミン酸、アラニン、及びリシン（ポリＦＥＡＫ）、又はチロシン、フェニルアラニン、アラニン、及びリシン（ポリＹＦＡＫ）、並びにＣｏｐ１に類似の普遍的な抗原とみなすことができる発見されたあらゆる他の類似のコポリマーを含むコポリマー（１４−、３５−、及び５０−アミノ酸長）などの他の合成のアミノ酸のコポリマーを包含することを意味する。
投与すべきＣｏｐ１の用量は、患者の年齢及び疾患の段階に従って医師が決定し、１〜８０ｍｇの範囲から選択されることができ、好ましくは２０ｍｇであるが、本発明はあらゆる他の適切な投与量を包含する。処置は、処置すべき神経変性疾患、患者の年齢及び病状に従って、適切な時間間隔で繰り返し用量を投与することにより行うのが好ましい。一実施形態では、Ｃｏｐ１を毎日投与してもよい。別の一実施形態では、免疫化に適するレジメンに従って、例えば、少なくとも１カ月に１回、又は少なくとも２若しくは３カ月毎に１回、又はより少ない頻度で投与を行うことができるが、本発明は、患者の病状に従って免疫化の間のあらゆる他の適切な間隔を想定するものである。
本発明に従って使用するための薬剤組成物は、１つ又は複数の生理学的に許容される担体又は賦形剤を用いて従来の様式で配合することができる。担体は、組成物の他の成分と耐容性があるという意味において「許容でき」なければならず、その受容者に有害であってはならない。
投与方法には、それだけには限定されないが、例えば、アジュバントと一緒又はそれなしで、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、粘膜（例えば、経口、鼻腔内、バッカル、膣内、直腸内、眼内）、くも膜下腔内、局所、及び、皮内の経路が含まれる。投与は全身的又は局所的であることができる。
本発明を、次に、以下の非限定的な実施例により説明する。
（実施例１）
ミクログリアは神経細胞の再生を誘発する−ＩＬ−４又はＩＦＮ−γにより活性化されたミクログリアは成人の幹／前駆細胞からの神経発生及びオリゴデンドロジェネシスを様々に誘発する
材料と方法
（ｉ）動物
新生仔（Ｐ０〜Ｐ１）Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスは、Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＳｃｉｅｎｃｅのＡｎｉｍａｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）により供給された。動物はすべて、Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅが構築した規則に従って扱った。
（ｉｉ）試薬
リポ多糖（ＬＰＳ）（混入タンパク質＜１％含有）は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）０１２７：Ｂ８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）から入手した。組換えのマウス腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α及びインスリン様成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ（両方とも、サイトカイン１μｇあたり１ＥＵ未満の濃度の内毒素を含む）、組換えのラット及びマウスのインターフェロン（ＩＦＮ）−γ及びインターロイキン（ＩＬ）−４（両方とも、サイトカイン１μｇあたり０．１ｎｇ未満の濃度の内毒素を含む）、ヤギ抗マウス中和抗−ＴＮＦ−α抗体（ａＴＮＦ−α；Ａｂ１μｇあたり０．００１ＥＵ未満の濃度の内毒素を含む）、及びヤギ抗−マウス中和抗−ＩＧＦ−Ｉ（ａＩＧＦ−Ｉ；Ａｂ１μｇあたり０．１ＥＵ未満の濃度の内毒素を含む）をＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州）から入手した。
（ｉｉｉ）神経前駆細胞（ＮＰＣ）の培養
側脳室の脳室下帯を含む組織の冠状切片（厚さ２ｍｍ）を、成年Ｃ５７Ｂ１６／Ｊマウスの脳から得た。組織を細分し、次いで消化のために、パパイン０．９４ｍｇ／ｍｌ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ニュージャージー州）、並びにＬ−システイン及びＥＤＴＡ０．１８ｍｇ／ｍｌを含むＥａｒｌｅの平衡塩類溶液中３７℃、５％ＣＯ２で４５分間インキュベートした。１１０×ｇで１５分間室温で遠心分離した後、組織をピペット粉砕により機械的に解離させた。単一の細胞懸濁液から得られた細胞を、７５ｃｍ２Ｆａｌｃｏｎ組織培養フラスコ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ニュージャージー州）中、ＮＰＣ培地［Ｌ−グルタミン２ｍＭ、グルコース０．６％、プトレシン９．６μｇ／ｍｌ、プロゲステロン６．３ｎｇ／ｍｌ、亜セレン酸ナトリウム５．２ｎｇ／ｍｌ、インスリン０．０２ｍｇ／ｍｌ、トランスフェリン０．１ｍｇ／ｍｌ、ヘパリン２μｇ／ｍｌ（すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエルから）、線維芽細胞成長因子−２（ヒト組換え、２０ｎｇ／ｍｌ）、及び上皮成長因子（ヒト組換え、２０ｎｇ／ｍｌ、両方ともＰｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ニュージャージー州）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）］に塗抹した（３５００細胞／ｃｍ２）。４〜６日毎に球を通過させ、単一細胞として再び塗抹した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現性神経前駆細胞（ＮＰＣ）を、以前に記載されている通りに得た（Ｐｌｕｃｈｉｎｏら、２００３年）。
（ｉｖ）ミクログリアの初代培養
新生仔（Ｐ０〜Ｐ１）Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスからの脳を、その髄膜をはぎ取り、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ−１５培地中（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ Ｈａ−Ｅｍｅｋ、イスラエル）、手術用顕微鏡下（Ｚｅｉｓｓ、Ｓｔｅｍｉ、ＤＶ４、ドイツ）、はさみで、細分した。トリプシン処理（トリプシン０．５％、１０分間、３７℃／５％ＣＯ２）後、組織を粉砕した。細胞懸濁液をグリア細胞用培地［１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔ）、Ｌ−グルタミン（１ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、及びストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を補ったＤＭＥＭ］で洗浄し、ポリ−Ｄ−リシン（ＰＤＬ）（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔ）のホウ酸塩バッファ（ホウ砂２．３７ｇ及びホウ酸１．５５ｇを滅菌水５００ｍｌに溶解したもの、ｐＨ８．４）溶液でコーティングした７５ｃｍ２Ｆａｌｃｏｎ組織培養フラスコ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で３７℃／５％ＣＯ２で１時間培養し、次いで、滅菌の、ガラス蒸留した水で完全にすすいだ。６時間培養後、培地の半分を交換し、２日目に開始して１０〜１４日の全培養時間の間、２日毎に交換した。ミクログリアを、１０日目と１４日目の間で収量が最大である最初に混合した脳のグリア細胞培養物から振り落とし（１５０ｒｐｍ、３７℃、６時間）、ＰＤＬで予め処置した２４ウェルプレート（１ｍｌ／ウェル、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州）上に接種し（１０５細胞／ｍｌ）、ミクログリア用培地［ＦＣＳ１０％、Ｌ−グルタミン（１ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、β−メルカプトエタノール（５０ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、及びストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を補ったＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔ）］で増殖させた。細胞を、ＰＤＬコーティングした培養フラスコの表面に接着させ（１時間、３７℃／５％ＣＯ２）、非接着の細胞をすすぎ落とした。
（ｖ）神経前駆細胞（ＮＰＣ）及びマウスのミクログリアの同時培養
ミクログリアを、サイトカイン（ＩＦＮ−γ、２０ｎｇ／ｍｌ；ＩＬ−４、１０ｎｇ／ｍｌ）又はＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処置した。処置した、又は非処置のミクログリアを、新しいＮＰＣ分化培地（ＮＰＣ用培地と同じであるが、成長因子を含まず、２．５％ＦＣＳを含む）で２回洗浄して試験した試薬の痕跡をすべて除去し、次いで氷上で１５分間インキュベートし、室温で２０分間、３５０ｒｐｍで振盪した。ミクログリアをフラスコから除去し、直ちにＮＰＣ（５×１０４細胞／ウェル）とともに、インスリンと、又はそれなしで、ＮＰＣ分化培地の存在下で、２４ウェルプレート中Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングしたカバーガラス上で５又は１０日間同時培養（５×１０４細胞／ウェル）した。次いで培養物を、２．５％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液で３０分間室温で固定し、ニューロン及びグリア細胞のマーカーに対して染色した。ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞増殖速度及び細胞の生存を、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ、２．５μＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）で染色することにより判定した。生存細胞及び死細胞を定量化するために、生の培養物を１μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）及び１μｇ／ｍｌＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）で染色し、記載されているように、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ、メリーランド州）を用いて計数した（Ｈｓｉｅｈら、２００４年）。
（ｖｉ）免疫細胞化学
ＮＰＣとマウスのミクログリアとの同時培養物からのカバーガラスをＰＢＳで洗浄し、上記に記載したように固定し、１０％ＦＣＳ、２％ウシ血清アルブミン、１％グリシン、及び０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔ）を含む透過処理／ブロッキング溶液で処置し、マウス又はウサギ抗チューブリンβ−ＩＩＩ−イソ型Ｃ終端抗体（β−ＩＩＩ−チューブリン；１：５００）、ウサギ抗−ＮＧ２コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＮＧ２；１：５００）、マウス抗−ＲＩＰ（ＲＩＰ；１：２０００）、マウス抗−ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ；１：２５０）、マウス抗−グルタミン酸デカルボキシラーゼ６７（ＧＡＤ；１：１０００）、マウス抗−ネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ；１：１０００）、ラット抗−ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ；１：３００）（すべてＣｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、カリフォルニア州より）、ヤギ抗−ダブルコルチン（ＤＣＸ；１：４００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、カリフォルニア州）、及びマウス抗−グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；１：１００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）の組合せで染色した。ミクログリアを標識するために、我々はラットａｎｄｉ−ＣＤ１１ｂ（ＭＡＣ１；１：５０、ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ニュージャージー州）又はＦＩＴＣ−複合バンデイラエアシンプリシフォリア（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）イソレクチンＢ４（ＩＢ４；１：５０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔ）のいずれかを使用した。ＩＧＦ−１の発現を、ヤギ抗−ＩＧＦ−１（１：２０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により検出した。
（ｖｉｉ）ＲＮＡ精製、ｃＤＮＡ合成、及び逆転写ＰＣＲ分析
細胞をＴＲＩ試薬（ＭＲＣ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、オハイオ州）で溶解し、細胞性のＲＮＡすべてを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を用いて製造元の指示に従って溶解物から精製した。残留するゲノムのＤＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）とインキュベートすることにより精製プロセスの間に除去した。ＲＮＡをＲＮａｓｅを含まない水（Ｑｉａｇｅｎ）に−８０℃で貯蔵した。ＲＮＡ（１μｇ）を、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）を用いて、製造元による推奨通りにｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡ混合物を、ＰＣＲグレードの水で１：５に希釈した。
我々は、半定量的な逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、ＯＬＩＧＯｖ６．４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ、Ｃａｓｃａｄｅ、コロラド州）を用いて選択された遺伝子に特異的なプライマー対で特定のｍＲＮＡの発現をアッセイした。
用いたプライマーは：
ＴＮＦ−α、センス５’−ＡＧＧＡＧＧＣＧＣＴＣＣＣＣＡＡＡＡＡＧＡＴＧＧＧ−３’（配列番号３３）、
アンチセンス５’−ＧＴＡＣＡＴＧＧＧＣＴＣＡＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＴＧ−３’（標的サイズ、５５１ｂｐ）（配列番号３４）；
ＩＧＦ−Ｉ、センス５’−ＣＡＧＧＣＴＣＣＴＡＧＣＡＴＡＣＣＴＧＣ−３’（配列番号３５）、
アンチセンス５’−ＧＣＴＧＧＴＡＡＡＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＣ−３’（標的サイズ、２４４ｂｐ）（配列番号３６）、及び
β−アクチン、センス５’−ＴＴＧＴＡＡＣＣＡＡＣＴＧＧＧＡＣＧＡＴＡＴＧＧ−３’（配列番号３７）、
アンチセンス５’−ＧＡＴＣＴＴＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧＧＴＧＣＴＡＧＧ−３’（標的サイズ、７６４ｂｐ）（配列番号３８）
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、ｃＤＮＡ１μｇ、各プライマー３５ｎｍｏｌ、及びＲｅａｄｙＭｉｘ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡＢｇｅｎｅ、Ｅｐｓｏｍ、英国）の３０μｌ反応液を用いて行った。ＰＣＲ反応は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＰＣＲシステムで、９５℃で３０秒間、６０℃で１分間、７２℃で１分間のサイクル（通常２５〜３０サイクル）、及び７２℃で５分間であり、次いで４℃に保った。合成されたｃＤＮＡの量に対する内部標準として、我々は、β−アクチンのｍＲＮＡを用いた。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル分析にかけ、エチジウムブロマイド染色により可視化した。シグナルを、Ｇｅｌ−Ｐｒｏアナライザー３．１（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を用いて定量化した。すべての場合で、１つの産物が各プライマーセットとともに観察され、観察された産物は、公表されているｃＤＮＡ配列から予測されたサイズにマッチした単位複製配列のサイズを有していた。
（ｖｉｉｉ）定量
顕微鏡の分析では、我々は、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０共焦点レーザー顕微鏡（倍率４０×）を用いた。ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験では、各実験群に対して、我々は０．０５３ｍｍ２の視野をスキャンした（ｎ＝少なくとも２つの異なるカバーガラスから８〜１６）。各マーカーに対して、５００〜１０００個の細胞をサンプリングした。ＧＦＰ及びβ−ＩＩＩ−チューブリン、ＮＧ２、ＲＩＰ、ＧａｌＣ、及びＧＦＡＰを同時発現する細胞を計数した。
（ｉｘ）統計学的分析
結果を、Ｔｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒの多重比較検定（分散分析）により分析し、平均値±ＳＤで表す（別段の記載がない限り）。
（実施例１（１））
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるミクログリアの神経発生に対する効果−ＩＬ−４又はＩＦＮ−γで予め処置したミクログリアはｉｎ ｖｉｔｒｏで神経前駆細胞（ＮＰＣ）からのニューロンの分化を誘発し、支持する
ＣＮＳの発作に対する良好に制御されたＴｈ１又はＴｈ２の反応の形態の適応免疫により、ミクログリア（ＭＧ）は、ニューロンの保護及びニューロンの組織修復を促進する表現型をとるように誘発される（Ｂｕｔｏｖｓｋｙら、２００１年）。ここでは、我々は、ミクログリアを活性化することにより、ＮＰＣの分化を誘発し、又は支持する適応免疫の能力を試験した。神経発生は、内毒素（例えば、リポ多糖、ＬＰＳ）で活性化されたミクログリアが引き起こす炎症によって阻止されると報告されている（Ｅｋｄａｈｌら、２００３年）。したがって、我々は、ＬＰＳに曝されたミクログリア（ＭＧ（ＬＰＳ））のＮＰＣに対する効果を、本明細書でニューロンの生存に支持的であることが示されている低レベルの特徴的な、それぞれＴｈ１（炎症促進性）及びＴｈ２（抗炎症性）サイトカインである、ＩＦＮ−γに曝したミクログリア（ＭＧ（ＩＦＮ−γ））、及びＩＬ−４に曝したミクログリア（ＭＧ（ＩＬ−４））の効果と比較した。我々は、ＮＰＣ発現性の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を用いて、培養物に見られたあらゆる神経細胞の分化は、ミクログリアの初代培養物の汚染に由来していたというよりむしろ、ＮＰＣに由来していたことを検証した。
ミクログリアを、その最適な増殖培地で増殖させ、（Ｚｉｅｌａｓｅｋら、１９９２年）、次いで、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ（低レベル）、又はＬＰＳで２４時間処置した。増殖培地の残留物及びサイトカインを洗い流し、処置したミクログリアの調製物の各々、及び非処置のミクログリアの調製物（ＭＧ（−））を、分化培地の存在下で解離したＮＰＣ球と新たに同時培養した。我々は、ＩＦＮ−γが活性化したミクログリア、及びＩＬ−４が活性化したミクログリアの両方の効果を調べた。５日培養後、ニューロンのマーカーであるβ−ＩＩＩチューブリンを発現したＧＦＰ＋細胞を、ニューロンと同定した。
最近、我々は、ＩＬ−４が活性化したミクログリア（ＭＧ（ＩＬ−４））は高レベルのＩＧＦ−１を生成することを示したので（Ｂｕｔｏｖｓｋｙら、２００５年）、またＩＧＦ−１は神経細胞の再生の重要な因子であることが報告されているので（Ｏ’Ｋｕｓｋｙら、２０００年）、ＩＧＦ−１が、ＩＬ−４が活性化したミクログリアの効果における因子の１つかもしれないという状況を想定した。したがって、以下の実験を、インスリンを含まない（活性化されたミクログリアが分泌するインスリン関連因子の効果が存在するとすれば、それを検出するために）、及びインスリンを含有する分化培地の両方で行った。
定量分析により、インスリンの非存在下では、神経発生はＭＧ（ＩＦＮ−γ）により最低限に支持されるにすぎず、ＭＧ（ＬＰＳ）により損なわれるが、ＭＧ（ＩＬ−４）で同時培養したＮＰＣではコントロールよりもほぼ３倍高かった（図１Ａ）。インスリンの存在下では、像は幾分異なり、神経発生を誘発するのにＭＧ（ＩＦＮ−γ）はＭＧ（−）よりも有意に効果的であったが、神経発生に対するＭＧ（ＩＬ−４）の誘導効果及びＭＧ（ＬＰＳ）の阻止効果はインスリン非存在下のそれらの効果に類似していた（図１Ｂを比較されたい）。ミクログリアの非存在下では、インスリンを添加（０．０２ｍｇ／ｍｌ）しても、ＮＰＣ培養物中のＧＦＰ＋／β−ＩＩＩ−チューブリン＋細胞の数は増加しなかった（図１Ａ）。
しかし、ＮＰＣのＭＧ（−）との同時培養では、インスリンなしのこのような同時培養における（図１Ｂ）、又はインスリン含有培地におけるコントロール（ミクログリアを含まない）培養物における（図１Ｂ）それらのパーセント値に比べてインスリンの添加によりＧＦＰ＋／β−ＩＩＩ−チューブリン＋細胞のパーセント値は増加した（図１Ｂ）。インスリンの存在下では、ＭＧ（ＩＦＮ−γ）と同時培養したＮＰＣにおけるニューロンの数は（図１Ｂ）、ＭＧ（−）と同時培養したＮＰＣにおけるよりも多く（図１Ｂ）、ＮＰＣを抗−ＴＮＦ−α中和抗体（ａＴＮＦ−α）を含むＭＧ（ＩＦＮ−γ）と同時培養した場合よりも多かった（図１Ｂ）。観察されたＭＧ（ＩＦＮ−γ）同時培養物におけるａＴＮＦ−αの有益な効果（図１Ｂ）は、神経発生に対するＴＮＦ−αの有害作用を中和することによるものであったということを検証するために、我々は、ＭＧ（ＩＦＮ−γ）と新たに同時培養したＮＰＣに組換えのマウスＴＮＦ−α（ｒＴＮＦ−α）を加えた。図１Ｃは、ｒＴＮＦ−αの存在下では、ＧＦＰ＋／β−ＩＩＩ−チューブリン＋細胞の数は、コントロールの（非処置の）ＮＰＣ培養物における数と類似していたことを示している。
ＭＧ（ＩＦＮ−γ）と同時培養したＮＰＣにおいて新規に分化するニューロンと、ＭＧ（ＩＬ−４）との同時培養で産生された新規に分化するニューロンとの間に、形態学的な相違が観察された（図１Ｄ）。ＧＦＰのβ−ＩＩＩ−チューブリンとの同時発現を、図１Ｅに示す。新規に分化するニューロンは、より高次の脳の領域における主要な阻害性の伝達物質であるＧＡＢＡの合成を担う酵素であるＧＡＤ６７（グルタミン酸デカルボキシラーゼ６７）に対してポジティブに標識され、また、ＧＦＰで同時標識されていることも見出された（β−ＩＩＩ−チューブリン＋／ＧＦＰ＋／ＧＡＤ＋）（図１Ｆ）。別の１セットの実験では、我々は、上記に記載したのと類似の培養物を調製し、ニューロンの系統の初期の分化のマーカーであるダブルコルチン（ＤＣＸ、図２）でそれを染色した。この染色により、β−ＩＩＩ−チューブリンに対する染色で見られた様々なミクログリアの調製物の類似の効果が明らかになった。新規に分化するニューロンの形態における顕著な違いが、ＭＧ（ＩＬ−４）と同時培養したＮＰＣと、ＭＧ（ＩＦＮ−γ）と同時培養したＮＰＣとの間に見られ（図２Ａ）、前者は著しい枝分れを示したが、後者ではニューロンは極性化し、長い突起があった（図２Ａ）。これらの相違は、２つのサイトカインによりミクログリアで活性化されるメカニズムは同一ではないことを示唆していた。ＧＦＰのＤＣＸとの同時発現を図２Ｂに示す。ＤＣＸ及びβ−ＩＩＩ−チューブリンの両方に対して染色した培養物に、これら２つのニューロンのマーカーが共存することが見出された（図２Ｃ）。上記の実験すべてにおいて、生細胞をヨウ化プロピジウムで染色することによりアッセイすると、ミクログリアの生存率は（Ｈｓｈｉｅｈら、２００４年）、同時培養の条件による影響を受けなかった。図２Ｄに示した、ＧＦＰ＋／ＤＣＸ＋染色した細胞の定量分析では、β−ＩＩＩ−チューブリンをニューロンのマーカーとして用いた場合に得られた結果と同様の結果がもたらされた（図１Ａ、１Ｂ）。
（実施例１（２））
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるミクログリアのオリゴデンドロジェネシスに対する効果−ＮＰＣのオリゴデンドロサイトへの分化は、ＩＬ−４で予め処置したミクログリア（ＭＧ（ＩＬ−４））と同時培養することにより誘発される
次に、我々は、同じ実験条件下で、ミクログリアがＮＰＣのオリゴデンドロサイトへの分化も誘発するか否かを調べた。高倍率下で、我々は、新規に形成したオリゴデンドロサイトを検出することができた。ＮＰＣのオリゴデンドロサイトへの起こり得る分化を検出しようと、我々は、最初に、オリゴデンドロサイト前駆体のマーカーであるＮＧ２を同時発現するＧＦＰ標識された細胞を探した。定量分析によりＭＧ（ＩＬ−４）及び（より少ない程度で）ＭＧ（ＩＦＮ−γ）は、同時培養したＮＰＣからＮＧ２＋細胞の分化を誘発した（図３Ａ、３Ｂ）。ＮＰＣと同時培養したＭＧ（−）及びＭＧ（ＩＦＮ−γ）の両方に、インスリンの非存在下で（図３Ａ）、その存在下よりも（図３Ｂ）有意に少ないＮＧ２＋発現性細胞が見られた。神経発生の場合（図１）と異なり、ＭＧ（ＩＦＮ−γ）はインスリンの存在下でも、新規に分化するオリゴデンドロサイト（ＮＧ２＋）の出現を誘発する上で、ＭＧ（ＩＬ−４）よりも大幅に有効性が劣っていた。かなりの割合のＮＧ２＋細胞を、また、ＭＧ（ＩＦＮ−γ）及びＭＧ（ＩＬ−４）の同時培養物の両方におけるＲＩＰ［細胞体の細胞質、並びに鞘で覆う前の段階で未熟なオリゴデンドロサイト及び成熟したオリゴデンドロサイトの突起を特異的に標識するモノクローナル抗体（Ｈｓｉｅｈら、２００４年）］に対して標識した（図３Ａ、３Ｂ）。インスリンの非存在下では、ミクログリアを含まないコントロールの培地には、ＧＦＰ＋／ＮＧ２＋細胞はほとんど見られなかった（図３Ａ）。ＮＰＣのＭＧ（−）との同時培養物では、少数のＧＦＰ＋／ＮＧ２＋細胞が見られたが（図３Ａ）、ＭＧ（ＬＰＳ）との同時培養物にはなかった（図３Ａ）。ＭＧ（ＩＬ−４）との同時培養物で、これらの細胞の数における劇的な増大が見られた（図３Ａ、３Ｃ）。
ＮＰＣ培養物にインスリンを添加しても、ミクログリアの非存在下ではＮＧ２＋細胞の発生率に影響を及ぼさなかった（コントロール；図３Ｂ）が、ＭＧ（−）と同時培養したＮＰＣにおけるＮＧ２＋細胞の数の増大を引き起こした（図３Ｂ）。さらに、インスリンの存在下では、新規に分化するＮＧ２＋細胞に対するＭＧ（ＬＰＳ）の阻止効果は変更されなかったが（図３Ｂ）、ＭＧ（ＩＦＮ−γ）との同時培養物におけるＮＧ２＋細胞の数は増大した（図３Ｂ、３Ｃ）。各同時培養物では、ＮＧ２＋細胞はすべてＧＦＰで標識されることも見出された（図３Ｄ）。ミクログリアと新規に分化するオリゴデンドロサイトとの間に密接な空間的関連があるという知見は興味深かった（図３Ｅ）。
神経発生及びオリゴデンドロジェネシスの両方に関して、ＭＧ（ＩＬ−４）とＭＧ（ＩＦＮ−γ）との効果の間で観察される初期の相違を考慮して、サイトカインが活性化するミクログリアで同時培養したＮＰＣを、同時培養１０日後に調べた。５日目、ミクログリアの非存在下ではＮＧ２＋細胞はほとんど見られなかった（図４Ａ）。これらの培養物を定量分析すると、顕著な相違が明らかになった。サイトカインが活性化したミクログリアの調製物は両方とも、オリゴデンドロサイト（ＮＧ２＋、ＲＩＰ＋、ＧａｌＣ＋）及びニューロン（β−ＩＩＩ−チューブリン＋）の両方への分化を誘発し、ＭＧ（ＩＬ−４）は成熟オリゴデンドロサイトに向けた、ＭＧ（ＩＦＮ−γ）は成熟ニューロンに向けた正の偏りを示した。これらの培養物における星状細胞（ＧＦＡＰ＋細胞）の発生率の分析（同時培養１０日後）では、ＮＰＣのＭＧ（ＩＬ−４）との同時培養物と、ＮＰＣのＭＧ（ＩＦＮ−γ）との同時培養物の間に、著しい相違は現れなかったが、両方においてＧＦＡＰ＋細胞は、ミクログリアのないＮＰＣ培養物におけるよりも多数であった（図４Ａ）。結果は、これら２タイプのサイトカインが活性化したミクログリアはニューロン細胞の３系統に影響を及ぼすこと、並びに、これらはニューロン系統及びオリゴデンドロサイト系統に様々な効果を有するが星状細胞系統には効果がないことを示唆していた（図４Ａ）。
ＭＧ（ＩＬ−４）の存在下では、ＧＦＰ＋／ＮＧ２＋細胞は、５日目におけるよりも（図３Ｃ）１０日目における方が（図４Ｂ）より枝分れしていた。枝分れした細胞は、ニューロンのように見える細胞と接触を形成している様子であった（図４Ｂ）。これらの培養物を、成熟したオリゴデンドロサイトのマーカーであるガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）に対して、及びニューロンのマーカーであるβ−ＩＩＩ−チューブリンに対して染色すると、接触形成性の細胞は、新規に形成されたオリゴデンドロサイト及びニューロンであることが検証された（図４Ｃ）。同じ培養物をＤＣＸ及びＲＩＰに対して分析すると（図４Ｄ）、新規に分化する細胞には、これらのマーカーの両方を一緒に発現するものはないことが明らかになった。さらに、星状細胞のマーカーのグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）とＮＧ２と（図４Ｅ）、又はＧＦＡＰとＤＣＸと（図４Ｆ）の発現には重複がなかった。サイトカインが活性化するミクログリアが誘発する神経突起の長さを分析すると（同時培養１０日後）、ＭＧ（ＩＦＮ−γ）と同時培養したＮＰＣで新規に形成したニューロンの神経突起は、ＭＧ（ＩＬ−４）と同時培養したＮＰＣにおけるよりも、又はＮＰＣ単独におけるよりも著しく長く、後２者における神経突起の長さの間には著しい相違はなかったことが明らかになった（図４Ｇ）。興味深いことに、これらの３群で計数されたＧＦＰ＋細胞の絶対数の間には有意な差がなかった（ＮＰＣ単独：９０．２±３２．０、ＭＧ（ＩＦＮ−γ）との同時培養：７０．５±２３．０、ＭＧ（ＩＬ−４）との同時培養：６６．１±１０．４）。これにより疑問が生じる：活性化したミクログリアは、分化に影響を及ぼす他に、ＮＰＣの増殖及び／又は生存にも影響を及ぼすのだろうか？
表１は、非活性化の、ＩＬ−４で活性化した、又はＩＦＮ−γが活性化したミクログリアと同時培養したＮＰＣの増殖を記録したものである。インスリンと、又はそれなしで、非処置のＮＰＣ（コントロール）、又は、ＭＧ（−）、若しくはＭＧ（ＩＬ−４）、若しくはＭＧ（ＩＦＮ−γ）、若しくはＭＧ（ＬＰＳ）と同時培養したＮＰＣを、塗抹２４、４８、又は７２時間後に増殖及び細胞死について分析した。増殖のアッセイでは、各時間点の１２時間前にＢｒｄＵのパルス投与を適用した。ＢｒｄＵ＋細胞の数を、ＧＦＰ＋細胞のパーセント値として表し（３つの独立した実験を２回ずつ行ったものからの平均値±ＳＥＭ）、分散分析により分析する。インスリンと、又はそれなしでの細胞死を、ヨウ化プロピジウム１μｇ／ｍｌ及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２ １μｇ／ｍｌで生染色することにより判定した（２つの独立した実験を２回ずつ行ったものからの平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１；分散分析）。
表１に示すように、培養物の２４時間及び４８時間での増殖を比較したものでは、相違は明らかにならなかった。７２時間後、わずかではあるが有意ではない相違が、ＮＰＣ単独と、ＭＧ（−）又はＭＧ（ＩＦＮ−γ）と同時培養したＮＰＣとの間に見られたが、これはおそらく、同時培養物におけるいかなる増大によるよりむしろ、ＮＰＣ単独の培養物で増殖が減少したからである。インスリンの非存在下では、ＮＰＣ単独と、ＭＧ（−）又はＭＧ（ＩＬ−４）と同時培養したＮＰＣとの培養物の間に、いかなるときも有意差はなかった。インスリンと、又はそれなしでＭＧＬＰＳと同時培養したＮＰＣに増殖の低減が観察された。５日後、いずれの同時培養物にも増殖は検出されなかった（データは示さず）。死細胞又は死滅する細胞を判定するために、我々は、死細胞を染色するヨウ化プロピジウム１μｇ／ｍｌ、及び生細胞も死細胞も染色するＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２ １μｇ／ｍｌで生の培養物を染色した（Ｈｓｉｅｈら、２００４年）。インスリンの非存在下、及びインスリンの存在下の両方で、ＭＧ（ＬＰＳ）と同時培養したＮＰＣで著しい細胞死が観察されたが、単独で、又はＭＧ（ＩＦＮ−γ）又はＭＧ（ＩＬ−４）と培養したＮＰＣでは、細胞死のパーセント値は低く、ＮＰＣ単独の培養物で見られたものと著しく違わなかった（表１）。これらの結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＮＰＣの運命に対する、サイトカインが活性化したミクログリアの主要な効果は、選択的というよりむしろ教示的なメカニズムによって生じることを示唆していた。

ミクログリアとの同時培養物における神経前駆細胞（ＮＰＣ）の増殖及び生存。インスリンと、又はそれなしで、非処置のＮＰＣ（コントロール）の、又はＭＧ（−）、若しくはＭＧ（ＩＬ−４）、若しくはＭＧ（ＩＦＮ−γ）、若しくはＭＧ（ＬＰＳ）と同時培養したＮＰＣの培養物を、塗抹２４、４８、又は７２時間後に増殖及び細胞死について分析した。増殖アッセイでは、各時間点の１２時間前にＢｒｄＵのパルスを適用した。ＢｒｄＵ＋細胞の数をＧＦＰ＋細胞のパーセント値として表し（３つの独立した実験を２回ずつ行ったものからの平均値±ＳＥＭ）、分散分析により分析した。インスリンと、又はそれなしでの細胞死を、ヨウ化プロピジウム１μｇ／ｍｌ及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２ １μｇ／ｍｌで生染色することにより判定した（２つの独立した実験を２回ずつ行ったものからの平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１；分散分析）。
（実施例１（３））
ＩＬ−４及びＩＦＮ−γが活性化したミクログリアが誘発するオリゴデンドロジェネシスの可能なメカニズム
インスリン様成長因子（ＩＧＦ）−Ｉは、神経発生及びオリゴデンドロジェネシスにおける重要な因子であると報告されている（Ｃａｒｓｏｎら、１９９３年；Ａｂｅｒｇら、２０００年；Ｏ’Ｋｕｓｋｙら、２０００年；Ｈｓｉｅｈら、２００４年）。サイトカインが活性化する、ミクログリアのＮＰＣの分化に対する有益な効果は、ミクログリアがＩＧＦ−１を生成する能力によって少なくとも部分的に媒介されるのか否かを決定するために、我々は、ＩＧＦ−Ｉに特異的な中和抗体（ａＩＧＦ−Ｉ）を、活性化したミクログリアと同時培養したＮＰＣに加えた。ａＩＧＦ−Ｉは、オリゴデンドロジェネシスに対するＭＧ（ＩＬ−４）誘発性の効果を阻止したが（図５Ａ）、これはオリゴデンドロジェネシスに対するＩＬ−４が活性化したミクログリアの効果はＩＧＦ−Ｉに依存することを指摘するものであった。組換えのＩＧＦ−Ｉ（ｒＩＧＦ−Ｉ、５００ｎｇ／ｍｌ）をＮＰＣに直接加えると、それらのＮＧ２発現性細胞への顕著な分化をもたらした（図５Ｂ）。しかし、このような分化は、ＭＧ（ＩＬ−４）と同時培養したＮＰＣに観察されるものほど幅広くなく（図５Ａ）、ＭＧ（ＩＬ−４）効果はさらなる（おそらく可溶性の）因子により、又は細胞−細胞相互作用により、又は両方により媒介されることを示唆していた。ａＩＧＦ−Ｉは、ＭＧ（ＩＦＮ−γ）によって誘発されるオリゴデンドロジェネシスには効果がなかった（データは示さず）。我々は、β−ＩＩＩ−チューブリンの発現を評価することにより、ＭＧ（ＩＬ−４）が誘発する神経発生に対するａＩＧＦ−Ｉの効果も調べた。ＧＦＰ＋／β−ＩＩＩ−チューブリン＋細胞のパーセント値はＭＧ（ＩＬ−４）と同時培養したＮＰＣでは２１．９±２．９％であり、これらの同時培養物にａＩＧＦ−Ｉを加えた場合は１９．７±４．５％（Ｐ＝０．３）であった。これらの結果は、ＭＧ（ＩＬ−４）はＩＧＦ−Ｉの他にさらなる有力な神経発生の因子を生成することを示唆していた。
ＭＧ（ＩＦＮ−γ）が誘発する神経発生の結果に対する、観察されたａＴＮＦ−αの有益な効果を考慮して（図１）、我々は、ＴＮＦ−αの中和はＭＧ（ＩＦＮ−γ）誘発性のオリゴデンドロジェネシスも促進するか否かを調べた。実際に、オリゴデンドロジェネシスは、ＭＧ（ＩＦＮ−γ）と同時培養したＮＰＣにおいて、ａＴＮＦ−αにより増強された（図５Ｃ）。ＴＮＦ−αのほのめかされた負の効果は、ＭＧ（ＩＦＮ−γ）と同時培養したＮＰＣにＴＮＦ−αを直接加えることにより確証された（図５Ｄ）。
ミクログリアのｍＲＮＡのコンパラティブ（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ）ＲＴ−ＰＣＲ分析で、活性化の非存在下ではミクログリアはＩＧＦ−Ｉ及び低レベルのＴＮＦ−αの両方を生成したことが明らかになった。時間の関数としての、ＴＮＦ−α及びＩＧＦ−Ｉの生成の分析では、ＩＦＮ−γは、ＩＬ−４と異なり、ＴＮＦ−α生成の一過性の増大、及びＩＧＦ−Ｉの下方制御をもたらすことが明らかになった（図６Ａ、６Ｂ）。タンパク質レベルでは、定量的な免疫細胞化学分析により、ＭＧ（ＩＬ−４）によるＩＧＦ−Ｉの発現の上方制御も明らかになった。ＬＰＳは、ＩＧＦ−Ｉの生成を完全に阻止した（図６Ｃ）。
考察
この研究の結果は、ミクログリアを特異的に活性化するあるものは、成人ＣＮＳにおいてニューロン細胞の再生を誘発することができることを強力に示唆している。この発見は、ミクログリアが分化する成人ＮＰＣの運命を決定し得ることを示していた。神経発生もオリゴデンドロジェネシスも、ＭＧ（ＩＬ−４）及びＭＧ（ＩＦＮ−γ）と同時培養したＮＰＣで誘発され、ＬＰＳに関連する炎症は成人の神経発生を阻止するという報告に一致して、両方ともＭＧ（ＬＰＳ）により阻止された（Ｅｋｄａｈｌら、２００３年；Ｍｏｎｊｅら、２００３年）。ＭＧ（ＩＬ−４）と同時培養したＮＰＣは、オリゴデンドロジェネシスに向いた偏りを示し、ＭＧ（ＩＦＮ−γ）と同時培養したＮＰＣは、神経発生に向いて偏っていた。
（実施例２）
Ｔ細胞と成人神経前駆細胞との間の相乗作用は脊髄損傷からの機能回復を促進する
脊髄損傷からの回復は、傷害部位でミエリン関連抗原を認識するＴリンパ球で免疫化することにより良好に制御された増強を受け入れることができる局所の免疫反応を明らかに必要とする。関連するＴ細胞は、局所のミクログリアを活性化して、ニューロンの生存及び再生を支持する表現型を発現させることができる。我々は、脊髄の挫傷からのマウスの回復は、ミエリン由来のペプチドとのＴ細胞ベースのワクチン接種、及び成人のニューロンの幹／前駆細胞（ａＮＰＣ）の脳脊髄液中への注射により、相乗的に促進されることを示している。顕著なことに、ワクチン接種したマウスでは、ワクチン接種をしなかったマウスよりも、より多くのＮＰＣが病変部位を標的としていた。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのａＮＰＣとＴ細胞との間の相乗的な相互作用は、Ｔ細胞の特異性及び表現型に、決定的に依存していた。この結果は、制御された免疫活性が幹細胞のニッチの効率的な制御の根底をなし、幹細胞治療は、脊髄修復に対する免疫細胞のあらゆる有益な効果を排除する免疫抑制性の抗−拒絶反応薬物の代わりに、自己の、又は組織適合性にマッチしたドナーを必要とすることを示唆している。
材料と方法
（ｘ）動物
近交系の成年野生型Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスは、Ｔｈｅ Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＳｃｉｅｎｃｅのＡｎｉｍａｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒにより供給された。動物はすべて、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）が構築した規則に従って取り扱った。
（ｘｉ）抗原
以下のペプチドを、Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）でＳｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｕｎｉｔにより合成した：ＭＯＧ、残基３５〜５５ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ（配列番号３９）、及び変更したＭＯＧペプチド（４５Ｄ）ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＤＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ（配列番号４０）、示したようなアスパラギン酸の置換に対してセリンを含むＭＯＧ３５〜５５ペプチドの類似体。ＯＶＡはＳｉｇｍａから購入した。
（ｘｉｉ）免疫化
成年マウスを、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（５ｍｇ／ｍｌ）を含む等体積のＣＦＡ（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ミシガン州）又はＩＦＡに、各々乳化した、ＭＯＧ、４５Ｄ、又はＯＶＡ（すべて１００μｇ）で免疫化した。乳剤を（総体積０．１５ｍｌ）、側腹部の片側にｓ．ｃ．注射した。コントロールのマウスにはＰＢＳを注射した。
（ｘｉｉｉ）脊椎損傷
マウスを麻酔し、その脊髄をＴ１２で椎弓切除術することにより曝露し、良くキャリブレートされた脊髄の挫傷性の傷害を与えることが示されている装置である、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｈｏｒｉｚｏｎ脊髄インパクター（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ケンタッキー州）を用いて椎弓切除術した脊髄上に２００ｋｄｙｎの力を１秒間課した。
（ｘｉｖ）脊髄挫傷からの機能回復の評価
マウスにおける脊髄挫傷からの機能回復を、後肢歩行運動の成績により判定した。回復は、最近、マウスに対して特に開発されたスケールであり、スコアの範囲が０（完全な麻痺）から９（正常の移動性）である、Ｂａｓｓｏ Ｍｏｕｓｅ Ｓｃａｌｅ（ＢＭＳ）オープンフィールド運動評点スケールにより得点付けた（Ｅｎｇｅｓｓｅｒ−Ｃｅｓａｒら、２００５年）。ブラインドのスコア付けにより、確実に観察者が、各マウスが受けた処置に気付かないようにした。週２回、滑らかで、床の滑らない、成型したプラスチックでできた円形の囲い（直径９０ｃｍ、壁の高さ７ｃｍ）の中心にマウスを４分間配置することにより、オープンフィールドにおけるマウスの歩行運動活性をモニターした。各評価の前には、会陰の感染症、後肢の傷、並びに尾及び足の自咬についてマウスを注意深く観察した。
（ｘｖ）神経前駆細胞の定位固定注射
マウスを麻酔し、定位固定装置に配置した。頭蓋を曝露し、乾燥且つ清潔に保った。十字縫合を確認し、印をつけた。指定された注射点は脳の表面から２ｍｍの深さで、前後軸における十字縫合の０．４ｍｍ後ろで、正中線に対して１．０ｍｍ外側であった。神経前駆細胞を、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジで適用し（３μｌ中に５×１０５細胞、１μｌ／分の速度）、傷上の皮膚を縫合した。
（ｘｖｉ）神経前駆細胞の培養物
成年神経前駆細胞（ａＮＰＣ）の培養物を、先の実施例１に記載したように得た。
（ｘｖｉｉ）神経前駆細胞及びＴ細胞の同時培養
以前に記載したように、８週齢のＣ５７Ｂ１６／Ｊマウスのリンパ節からＣＤ４＋Ｔ細胞を精製した（Ｋｉｐｎｉｓら、２００４年）。Ｔ細胞を、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５Ｍ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、非必須アミノ酸（１ｍｌ／１００ｍｌ）、及び自家血清２％（ｖ／ｖ）を補ったＲＰＭＩ培地で、マウス組換えＩＬ−２（ｍｒＩＬ−２；５ｎｇ／ｍｌ）、並びに可溶性抗−ＣＤ２８及び抗−ＣＤ３抗体（１ｎｇ／ｍｌ）の存在下で活性化した。Ｔ細胞を、２４ウェルのプレートで、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングしたカバーガラス上、５日間、ａＮＰＣ（５×１０４細胞／ウェル）と同時培養した（５×１０４細胞／ウェル）。次いで、培養物をパラホルムアルデヒド２．５％のＰＢＳ溶液で３０分間、室温で固定し、ニューロンのマーカーに対して染色した。
（ｘｖｉｉｉ）免疫組織化学
ＳＣＩを受けさせたマウスを１４日後又は６０日後に再び麻酔し、冷ＰＢＳで潅流した。その脊髄を除去し、ブアン固定液（飽和ピクリン酸７５％、ホルムアルデヒド２５％、氷酢酸５％；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で４８時間、後固定し、次いで７０％ＥｔＯＨに移した。組織を、キシレン及びパラフィン中７０％、９５％、及び１００％のＥｔＯＨのグラジエントに通して水和させ、次いで、パラフィンに包埋した。各染色に対して、各々６μｍの厚さの組織切片５個を各マウスから取った。スライドを１５分間、以下の各々：キシレン、ＥｔＯＨ１００％、９５％、７０％、５０％、及びＰＢＳで連続的にすすぐことによりパラフィンを除去した。スライドの抗原への曝露は、１０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ６．０中、電子レンジでそれを沸点に加熱し、次いでさらなる１０分間、２０％のマイクロ波の電力で加熱することにより最大にした。スライドを２０％正常ウマ血清で６０分間ブロックし、その後、モノクローナル抗体の２％ウマ血清溶液と、室温で一夜（ＧＦＡＰ、神経フィラメント、及びＢＤＮＦ）、又は４℃で４８時間（ＣＤ３）インキュベートした。我々は、ＧＦＡＰに対してウサギ抗−マウスＧＦＡＰ（１：２００）（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）を、神経フィラメントに対してウサギ抗−神経フィラメント（１：２００）を、低分子量及び高分子量（Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｏｘｆｏｒｄ、英国）を、並びにＣＤ３に対してラット抗−ヒトＣＤ３（１：５０）（Ｓｅｒｏｔｅｃ）を用いた。ＢＤＮＦに対しては、我々は、モノクローナル抗体ニワトリ抗−ヒトＢＤＮＦ（１：１００）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）をサポニン０．０５％とともに用いた。
すすいだ後、切片を、２次抗体Ｃｙ３ロバ抗−ラット（１：３００）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ペンシルベニア州）（ＣＤ３に対する染色）、Ｃｙ３ロバ抗−ニワトリ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）（１：２５０）（ＢＤＮＦに対する染色）、又はＣｙ３ロバ抗−ウサギ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）（１：２５０）（ＧＦＡＰ及び神経フィラメントに対する染色）とともに、室温で１時間インキュベートした。ＩＢ４染色に対しては、切片を２０％ウマ血清で１時間ブロックし、次いで、Ｃｙ２−ＩＢ４（１：５０）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と室温で１時間インキュベートした。切片をすべて、Ｈｏｅｃｈｓｔ（１：２０００）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）で染色した。次いで、これらをＮｉｃｏｎ Ｅ−６００蛍光顕微鏡下の検査用に作成した。傷害の部位における細胞（ＣＤ３−標識した）を計数することにより、又は密度（ＩＢ４−標識した、又はＢＤＮＦ−標識した）を決定することにより、又は非染色の部位（ＧＦＡＰ、神経フィラメント）を測定することにより結果を分析した。各パラメータは、マウスが受けた処置に対してブラインドの観察者が測定した。
（実施例２（１））
成年神経前駆細胞は運動の回復を促進するために局所の免疫活性を必要とする
この研究における我々の作業仮説は、Ｔ細胞ベースの免疫化が傷害の部位で誘起した保護的な免疫反応は、細胞の生存だけでなく、組織の修復も支持するニッチを作り出すということであった。我々は、局所のＴ細胞が媒介する免疫反応は、外来性に送達されるａＮＰＣを引き付け、それらが回復に貢献するのを支援し得ることをさらに疑った。この仮説を試すために、我々は、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスを、ＳＣＩの直後に、結核菌０．５％を含むＣＦＡに乳化した脳炎惹起性のペプチドであるｐＭＯＧ３５〜５５（配列番号３９）でワクチン接種し（ＭＯＧ／ＣＦＡ）、１週間後、脳室内の（ｉ．ｃ．ｖ．）経路によりａＮＰＣを投与した。この２重の処置プロトコール（ＭＯＧ／ＣＦＡ／ａＮＰＣ）を受けさせたマウスを、同じアジュバントで乳化した同じＭＯＧペプチドで免疫化したがａＮＰＣを移植せずその代わりにＰＢＳでｉ．ｃ．ｖ．注射したコントロール群のマウス（ＭＯＧ／ＣＦＡ／ＰＢＳ）と、又は、ＰＢＳ及びＣＦＡ（０．５％）を注射しａＮＰＣをｉ．ｃ．ｖ．移植したマウス（ＰＢＳ／ＣＦＡ／ＰＢＳ）と、又はＰＢＳ／ＣＦＡを注射し次いでＰＢＳをｉ．ｃ．ｖ．注射したコントロール群のマウス（ＰＢＳ／ＣＦＡ／ＰＢＳ）と比較した。ＳＣＩ後の行動の結果を評価するために、我々は、Ｂａｓｓｏ運動スコア（ＢＭＳ）評点スケールを用いたが（Ｅｎｇｅｓｓｅｒ−Ｃｅｓａｒら、２００５年）、このスケールでは０は後肢の完全な麻痺を示し、９は完全な運動性を表す。ＭＯＧ／ＣＦＡ／ａＮＰＣを受けたマウスの、平均運動回復（ＢＭＳ）スコア（４．２１±０．４５、値はすべて平均値±ＳＥＭ）は、ＭＯＧ／ＣＦＡ／ＰＢＳで処置したマウスのスコアよりも高かった。ＰＢＳ／ＣＦＡ／ａＮＰＣで処置したマウスでは、回復はＰＢＳ／ＣＦＡ／ＰＢＳで処置したコントロールのマウスほど良好ではなかった（１．５±０．２７）。４．２１というＢＭＳは、肢の足首及び足底の広範囲の運動を示し（３匹の動物が示したもの、その他に時々体重を支え、足底で歩行）、１．５というスコアは軽微から広範囲の範囲の足首の運動を示す。ＭＯＧ／ＣＦＡ／ＰＢＳで処置したマウスは、コントロールのＰＢＳ／ＣＦＡ／ａＮＰＣ処置したマウスのスコア（１．５±０．４）、又はＰＢＳ／ＣＦＡ／ＰＢＳ処置したコントロールのマウスのスコアよりも有意に高いスコアである２．７１±０．５をスコアした（図７Ａ）。このように、これらの結果は、投与したａＮＰＣとＴ細胞ベースの免疫反応との間の相乗的な相互作用を実証している。移植されたａＮＰＣが、単独で（即ち、ＭＯＧ／ＣＦＡ免疫化の非存在下で）運動の回復を改善できないことは、部位特異的な免疫反応がａＮＰＣ活性に必要であったことを示唆していた。図７Ｂは、傷害後２８日目の、全試験群における個々のマウスのＢＭＳを示す。免疫化の非存在下でのａＮＰＣの移植はＳＣＩからの回復を改善しなかったので、このコントロール群（ＰＢＳ／ＣＦＡ／ａＮＰＣ）は後の実験に含まなかった。
ＳＣＩからの回復を促進するのに必要とされるＴ細胞の量を増大すれば、脳炎惹起性ペプチドの使用を必要としないことを、我々は以前に実証しており、脳炎惹起性ペプチドの弱い作用物質は効果的であり、ＥＡＥを誘発する危険性を有していない。このような「安全な」ワクチン接種を、ａＮＰＣ移植と組み合わせて利用することができるか否かを試すために、我々はＭＯＧ由来の変更された、アスパラギン酸がセリンの代わりになっているペプチドリガンド（ｐＭＯＧ３３〜５５ＡＰＬ；４５Ｄペプチド、（配列番号４０））を使用した。マウスを、結核菌２．５％を含むＣＦＡで乳化した４５Ｄペプチドでワクチン接種した。１週間後、免疫化したマウスに挫傷性のＳＣＩを受けさせ、さらに１週間後、ａＮＰＣをｉ．ｃ．ｖ．移植した。運動活性の上昇（平均値±ＳＥＭの、ＢＭＳにより表して）が、ＰＢＳ／ＣＦＡ／ａＮＰＣでｉ．ｃ．ｖ．処置したコントロールのマウスよりもこれらのマウスに見られた（１．９４±０．２２に比べて、４．１１±０．２７；図７Ｃ）。ａＮＰＣ移植なしで、ＣＦＡ中のペプチド４５Ｄで免疫化したところ、ＰＢＳ処置のコントロールに比べてほんのわずかな運動の回復の上昇をもたらした（２．５７±０．２４）。図７Ｄは、傷害後２８日目における個々のマウスのＢＭＳ値を示す。上記の発見は、挫傷性のＳＣＩ後の運動の回復に対する移植したａＮＰＣの寄与は、脳炎惹起性ペプチドの弱い作用物質の使用により、やはり促進され得ることを示していた。
ａＮＰＣとの相乗的な相互作用に必要とされるＴ細胞の表現型及び特異性を決定するために、我々は、様々な免疫化のプロトコールを用いて上記の実験を繰り返した。不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）はＣＦＡと異なり、細菌を含まず、脳炎惹起性ペプチドに対してＴｈ２様反応を誘発することが知られている。我々は、ＩＦＡに乳化したＭＯＧ類似体（ペプチド４５Ｄ）で免疫化すると何らかの有益な効果があるが、引き続きａＮＰＣを移植しても相乗作用を示さなかったことを見出した（ＭＯＧ／ＩＦＡ／ＰＢＳ処置マウスに対するＢＭＳが２．９３±１．０３、ＰＢＳ／ＣＦＡ／ＰＢＳ処置マウスでは２．０７±０．５３であったのに比べ、ＭＯＧ／ＩＦＡ／ａＮＰＣ処置マウスでは３．２±０．７６、図７Ｅ）。これらの発見は、ＭＯＧ／ＩＦＡ／ａＮＰＣ処置マウスでは、ワクチン接種したＴ細胞とａＮＰＣとの間の傷害部位における相乗的な相互作用に好ましいＴ細胞はＴｈ１であることを示唆している。
ＣＮＳ抗原に対する特異性がワクチン接種の相乗効果及び幹細胞移植に必要であることを検証するために、ＣＦＡ（結核菌２．５％を含む）に乳化した非自己のタンパク質であるオバルブミン（ＯＶＡ）でマウスを免疫化し、１週間後に、ａＮＰＣを、又はコントロールとしてＰＢＳをｉ．ｃ．ｖ．注射した。ＯＶＡ／ＣＦＡでの免疫化により、ＢＭＳにおけるわずかな、有意でない上昇がもたらされ、ａＮＰＣを移植してもＢＭＳをそれ以上上昇させなかった（ＯＶＡ／ＣＦＡ／ＰＢＳ処置マウスでは２．２±０．６８、及びＰＢＳ／ＣＦＡ／ＰＢＳ処置のコントロール群では１．５±０．２９であったのに比べ、ＯＶＡ／ＣＦＡ／ａＮＰＣ処置マウスでは２．４３±１．７８であった、図７Ｆ）。上記の結果をすべてまとめると、ａＮＰＣ移植後に有益な効果がないことは、Ｔ細胞とａＮＰＣとの間の相乗作用は、Ｔ細胞の抗原特異性及び表現型の両方の関数であることを示唆している。
傷害を受けたＣＮＳ、特に脊髄における免疫の活性化は、近年における研究の主な注目の的であった（Ｓｃｈｗａｒｔｚ及びＨａｕｂｅｎ、２００２年）。いくつかの試験では、Ｔ細胞ベースの免疫反応は、その強度及び持続時間が良く制御されている場合のみ、保護的であることが示された。過度に強力な免疫化は過剰な免疫活性を生じ、この活性は損傷を受けた脊髄に対する免疫反応の潜在的な利点を中和し、有害な効果さえあった。我々は、ａＮＰＣが損傷部位へ戻る場合に、過剰な免疫活性という負の効果を相殺し、そうして回復に寄与し得る可能性を考えた。したがって、我々は、局所の免疫活性が過剰である場合でも、ａＮＰＣの投与が機能回復に寄与することができるか否かを決定することに着手した。ＳＣＩの１週間前、我々は、結核菌２．５％を含むＣＦＡに乳化したＭＯＧペプチド３５〜５５でマウスを免疫化した。ＳＣＩからの運動の回復が、ＰＢＳ／ＣＦＡ注射後よりもＭＯＧ／ＣＦＡでの免疫化後の方が悪い条件下で（ＢＭＳがそれぞれ１．９４±０．３２、及び０．３５±０．２）、ａＮＰＣを投与すると回復が改善することを、我々は見出した（ＢＭＳ２．６８±０．５１、図７Ｇ、７Ｈ）。したがって、ａＮＰＣをｉ．ｃ．ｖ．投与すると、局所の適応免疫反応が有害である場合でも、ＳＣＩからの機能回復に貢献し得ると思われる。
（実施例２（２））
組織の統合性は局所の免疫活性に相関する
ａＮＰＣと常在の免疫細胞との間の明らかな相乗作用の根底を成すメカニズムについての見識を得ようと、我々は、注射したａＮＰＣのいずれかが傷害を受けた脊髄への道を見つけるか否かを試験した。我々は、図７Ａに示した実験を、ＧＦＰ標識したａＮＰＣを用いて繰り返した。抗−ＧＦＰ抗体で染色すると、ＭＯＧ−ＣＦＡ／ａＮＰＣで処置したマウスにおいてのみ、傷害を受けた脊髄の実質でＧＦＰ＋細胞が明らかになった（図８）。注射されたＧＦＰ＋ａＮＰＣが、病変の中心を取り囲んで、且つ、ＳＣＩ ７日後という早期に髄膜に隣接した脊髄実質の外側に見ることができ（図８Ａ〜８Ｃ）、試験した最後の時間点である傷害６０日後という後期でも依然として検出できた（図８Ｄ〜８Ｆ）。
ＳＣＩからの回復を特徴付ける形態学的特徴の１つは、病変部のサイズである。傷害の部位を描くために、我々は、脊髄の縦方向の切片を、グリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に対する抗体で染色した。我々は、ＧＦＡＰによって染色されなかった部位を測定することにより、病変部のサイズを評価した。この分析により、ＭＯＧ／ＣＦＡでワクチン接種したラットにａＮＰＣ移植後７日という早期に、傷害の部位の平均サイズが、ワクチンだけを接種した、又はａＮＰＣだけを接種したマウスにおけるよりも、ワクチン接種及びａＮＰＣ移植の両方を受けたマウスにおける方が有意に小さくなっていたことが明らかになった（図９Ａ、９Ｂ）。
次に、我々は、回復の範囲で観察された相違は、局所の免疫学的変化に相関し得るか否かを試験した。脊髄組織の切片を、Ｔ細胞のマーカーに対して（ＣＤ３）、また活性化したミクログリア／マクロファージの蓄積に対して（ＩＢ４）染色した（図９Ｃ〜９Ｆ）。切片すべてを、核マーカーとしてのＨｏｅｃｈｓｔでも染色した。細胞移植７日後に組織を切除した。ＩＢ４で染色すると、他の実験群におけるよりも、２重処置のプロトコールを受けた（０．５％ＣＦＡ中ｐＭＯＧ３５〜５５）マウスでは、ミクログリア／マクロファージが少なかったことが明らかになった（図９Ｃ、９Ｄ）。定量分析により、ＭＯＧ／ＣＦＡ／ＰＢＳ処置の、又はＰＢＳ／ＣＦＡ／ＰＢＳ処置のコントロールにおけるよりも２重処置を受けたマウスにおける傷害部位を取り囲む部位に、ＣＤ３＋Ｔ細胞が著しく多いことが明らかになった。顕著なことに、ａＮＰＣ移植をせずに脳炎惹起性のｐＭＯＧ３５〜５５で免疫化すると、コントロールにおけるよりも、傷害部位でＣＤ３＋細胞がほんのわずかに多いという結果になった（図９Ｅ、９Ｆ）。したがって、ａＮＰＣの移植は、傷害部位における局所的な免疫反応を調節すると思われる。
活性化したＴ細胞も、Ｔ細胞が活性化したミクログリアも、脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）などの成長因子の源として働くことができる。ＢＤＮＦの免疫反応性は、他の群におけるよりもＭＯＧ／ＣＦＡ／ａＮＰＣで処置したマウスの脊髄における方が強力であった（図１０Ａ）。ＢＤＮＦ及びＩＢ４に対する２重染色により、傷害部位におけるＢＤＮＦの細胞の源は、ミクログリア／マクロファージの集団であったことが示された（図１０Ｂ）。
最近の研究で、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害物質であるノギンは、傷害を受けた脊髄でａＮＰＣからのニューロンの分化を誘発することができることが示されている（Ｓｅｔｏｇｕｃｈｉら、２００４年）。このタンパク質は、脳室下帯でニューロン発生性の環境を提供することが必要とされていることも示されている。そこで我々は、様々な実験群においてノギンの免疫反応性をアッセイし、これが２重処置のプロトコールを受けたマウスで著しく増大したが、ＭＯＧ免疫化単独では影響がなく、ａＮＰＣ移植単独ではわずかに低減したことを見出した（図１０Ｃ）。傷害部位で生成されたＢＤＮＦの場合と同様に、ノギンもＩＢ４＋細胞に局在していた（図１０Ｄ）。
（実施例２（３））
内因性幹細胞の局所的な分化
上記の結果は、重要な疑問を生じた：Ｔ細胞ベースのワクチン接種を、ａＮＰＣ移植と組み合わせて与えた場合、内因性又は外因性のａＮＰＣのニューロンの分化に好ましい条件をつくり得るだろうか？ この可能性を試験するために、我々は図７に記載した実験を繰り返し、また、細胞増殖のマーカーであるＢｒｄＵをａＮＰＣ移植後７日目（即ち、ＳＣＩ１４日後）に開始して３日間、１日２回注射した。最後のＢｒｄＵ注射の７日後に、ＢｒｄＵに対する染色、及び初期の分化のマーカーであるダブルコルチン（ＤＣＸ）により、２重の処置を受けたマウスに、新規に形成したニューロンが有意に多いことが明らかになった（図１１Ａ〜１１Ｅ）。図１１Ｂは、傷害を受けた部位の環境／付近におけるＤＣＸ＋細胞の分布を実証している。ＢｒｄＵとＧＦＰとの組合せ、及びＧＦＰとＤＣＸとの組合せに対して染色すると、ダブルポジティブな細胞は実質的に現れず、傷害を受けた脊髄におけるほとんどのＤＣＸ＋細胞は内因性のａＮＰＣに由来したこと指摘された。顕著なことに、ａＮＰＣ移植をせずにワクチン接種をしても、傷害を受けた脊髄において新規のニューロンの形成を増大しなかった。
（実施例２（４））
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける成人神経前駆細胞とＴ細胞との相互作用
上記の結果は、免疫細胞とａＮＰＣとの間のクロストークが傷害の部位で行われていることを指摘していた。我々は、それぞれＴｈ１−及びＴｈ２−関連のサイトカインである、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４で予め活性化したミクログリアは、ａＮＰＣからニューロンの分化を誘発することができることを上記で示した。そこで、我々は、ａＮＰＣとＴ細胞との間の直接の相互作用が、ａＮＰＣの分化のパターンの変更ももたらすか否かを決定しようとした。この疑問に対処するために、我々は、（抗−ＣＤ３抗体、抗−ＣＤ２８抗体、及びＩＬ−２での）同源のプロトコールによりｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ４＋Ｔ細胞を２４時間活性化し、次いで、トランスウェル培養系でａＮＰＣとの同時培養においてその活性化を継続させた。コントロールとして、我々は、ａＮＰＣ単独（抗−ＣＤ３抗体、抗−ＣＤ２８抗体、及びＩＬ−２の存在下で）、又は静止期のＣＤ４＋Ｔ細胞と培養したａＮＰＣ（ＩＬ−２だけを補った）の培養を用いた。５日後、培養物では、低い方のチャンバーにおけるａＮＰＣを固定し、新規に形成したニューロンの出現について分析した。初期のニューロンのマーカーであるβ−ＩＩＩ−チューブリンに対して染色すると、ニューロンの分化に対するＴ細胞の劇的な効果が明らかになった（図１２Ａ）。約７％の細胞だけがβ−ＩＩＩ−チューブリンに陽性であったａＮＰＣ単独のコントロールの培養物に比べると、活性化したＴ細胞とのａＮＰＣの同時培養では約９０％の細胞がβ−ＩＩＩ−チューブリンを発現した（図１２Ａ、１２Ｂ）。顕著なことに、β−ＩＩＩ−チューブリン染色は、ａＮＰＣの非活性化Ｔ細胞との同時培養物におけるコントロールに対して、３倍の増大（１８％）を示した。したがって、Ｔ細胞は可溶性の因子によりニューロンの分化を誘発していると思われる。図１２Ｂは、ａＮＰＣ単独（コントロール）の、又は活性化したＴ細胞との同時培養物のβ−ＩＩＩ−チューブリン染色した培養物の代表的な画像を示している。これらの発見が意味するのは、Ｔ細胞由来の可溶性の因子は、ニューロンの分化の経路の１つを引き起こし得るということである。
Ｔ細胞は、ＮＰＣ由来の化合物に遭遇した結果としてＮＰＣの分化に影響を及ぼした可能性を排除するために、また、観察された効果はＴ細胞由来の可溶性の物質により引き起こされたという我々の発見をさらに実証するために、我々は、活性化したＴ細胞によって訓化した培地の存在下でａＮＰＣを分化させた。５日後、これらの培養物をβ−ＩＩＩ−チューブリンに対して染色したところ、同時培養系で得られた結果と同様の結果が明らかになり（図１２Ｃ）、ニューロンの分化は静止のＴ細胞により、また、活性化したＴ細胞によりさらに誘発されることが確認された。数々の分化する細胞に対するこれらの効果の他に、枝分れし伸長したβ−ＩＩＩ−チューブリン標識された線維で明らかであるように、Ｔ細胞由来の可溶性の因子も、また、明らかに細胞の形態に影響を及ぼしていた（図１２Ｄ）。
我々は、次に、Ｔ細胞誘発性の神経発生が、活性化したＴ細胞が分泌するサイトカインにより媒介されるか否かを決定しようとした。ａＮＰＣを、様々な濃度の、特徴的なＴ細胞由来のサイトカインＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の存在下で培養した。分析により、５日培養後、ＩＦＮ−γは１ｎｇ／ｍｌほどの低濃度でβ−ＩＩＩ−チューブリンの発現の増大を引き起こし得ることが明らかになった（図１２Ｅ）。本明細書に記載した実験で、我々は、ＩＦＮ−γに短時間曝露（２４ｈ）したのではこのような効果を達成するのに十分ではないことを見出した。しかし、ＩＦＮ−γを補充した培養物におけるβ−ＩＩＩ−チューブリン発現性の細胞の形態は、活性化したＴ細胞で、又はＴ細胞で訓化した培地で培養したａＮＰＣに見られたものほど発達しなかったことに留意すべきである。ＩＦＮ−γの効果とは対照的に、ＩＬ−４で処置したａＮＰＣには、β−ＩＩＩ−チューブリン発現における変化は観察されなかった。
これらの発見は、ＩＦＮ−γはＩＬ−４と異なり、Ｔ細胞誘導性の神経発生を部分的に説明できることを示唆していた。しかし、ＩＦＮ−γの効果でさえ、Ｔ細胞の効果、又はＴ細胞由来の可溶性因子に比べて制限されている。ａＮＰＣに対するＩＦＮ−γ受容体−１の発現のＰＣＲ分析では、この受容体は、ここで試験したすべての条件下でａＮＰＣにより発現されることが明らかになった（データは示さず）。
ノッチ経路の活性化はａＮＰＣの維持に不可欠であり、この経路、及びその下流の転写因子であるＨｅｓ遺伝子ファミリーの遮断は、ニューロンの分化における最初の事象の根底を成すものである。Ｔ細胞介在性のニューロンの分化がノッチのシグナリングにおける変化を誘発するか否かを決定するために、我々はＴ細胞由来の物質との相互作用後の、ａＮＰＣにおけるＨｅｓ遺伝子の発現における可能な変化を探し求めた。コントロールの培養物に比べると、Ｔ細胞で訓化した培地の存在下で２４時間培養したａＮＰＣは、Ｈｅｓ−５発現において５倍の減少を経験したことが、リアルタイムＰＣＲにより明らかになった（図１２Ｆ）。したがって、Ｔ細胞が誘発する分化は、ノッチ経路の阻害を伴う様子である。ａＮＰＣによるノッチ１〜４の発現は、Ｔ細胞で訓化した培地の存在下では変更されず、阻害は、ノッチの発現における変化に起因し得ないことを示していた（データは示さず）。
ａＮＰＣがＩＦＮ−γ受容体を発現するという我々の知見を、これらの細胞は、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との間のダイアログに参加することが知られているＢ−７（Ｉｍｉｔｏｌａら、２００４年ｂ）及びＣＤ４４（Ｐｌｕｃｈｉｎｏら、２００３年）などの免疫関連分子を発現することを示す最近の研究とまとめて考えることにより、ａＮＰＣはＴ細胞の機能に影響を及ぼし得るか否かを試験することに我々は駆り立てられた。最初に我々は、Ｔ細胞による［３Ｈ］チミジンの取り込みをアッセイすることにより、ａＮＰＣのＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対する効果を試験した。Ｔ細胞をａＮＰＣ及びＡＰＣ（致死的に照射した脾細胞）と３日間同時培養すると、Ｔ細胞の増殖の有意な用量依存性の阻害がもたらされた（図１３Ａ）。これらの条件下では、ａＮＰＣの制限された増殖だけが存在することを留意することが重要である。Ｔ細胞の増殖に対する阻害効果が可溶性の因子により媒介されるのか、又は細胞同士の接触を必要とするのかを決定するために、我々はトランスウェル系を利用し、ａＮＰＣを上部のウェルに塗抹した。Ｔ細胞とａＮＰＣとを同じウェルで同時培養することで、Ｔ細胞の増殖の２倍の低減がもたらされたが、トランスウェルで２つの細胞の集団が分離された場合にこの効果は低減した。したがって、細胞同士の接触は、ａＮＰＣがＴ細胞の増殖を阻害するのに必要であると思われる。ａＮＰＣは、Ｔ細胞によるサイトカインの生成に影響を及ぼし得るか否かを決定するために、ａＮＰＣとＴ細胞とを同時培養した培地で、６種の炎症性サイトカインの濃度を測定した。ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、及びＴＮＦ−αの濃度は、ａＮＰＣと、及びそれなしのＴ細胞の培養物で類似していたが、ＩＬ−１０の濃度は同時培養物でわずかに上昇（４０％）した。Ｔ細胞培養物単独に比べると、ＩＬ−６の濃度はａＮＰＣとの同時培養物で２倍高く、ＭＣＰ−１濃度に顕著な違いが見られ、ＭＣＰ−１濃度は同時培養物で２桁高かった（図１３Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ａＮＰＣはＴ細胞に直接作用することができ、その増殖活性を阻害し、そのサイトカイン／ケモカイン生成性のプロファイルを変更することを示している。
考察
免疫細胞とａＮＰＣとの間の局所の相互作用は、機能回復の根底を成す。現在の研究で、我々は、ＳＣＩに対する２つの異なる治療上の取組み：Ｔ細胞ベースのワクチン接種、及び神経前駆細胞のＣＳＦ中への移植、を組み合わせた。これらの取組みは、各々、ＳＣＩからの機能回復を促進することが潜在的にできることが示されており、我々は、これらを組み合わせた場合に相乗的に機能することをここに示している。我々の実験は、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでも、免疫細胞とａＮＰＣとの間のクロストークが病変部位で行われ得ることを実証した。ワクチン接種が局所の免疫反応を引き出し、免疫反応が良く制御されている場合は、変性を減弱し修復を促進するのに必要とされる細胞及び分子の因子を提供する。同じ反応が、また、ａＮＰＣを傷害部位に動員し、内因性のａＮＰＣからの神経発生を支持するニッチ様の区画を作り出すのに、役割を果たしている。ａＮＰＣと免疫細胞との間の相互作用は、相反することが見出され、ａＮＰＣは傷害後の免疫活性を調節することができ、免疫活性が過剰である条件下（ａＮＰＣの非存在下で、回復に有害な効果を有する）でも機能回復を確実にしていた。
（実施例３）
Ｔ細胞ベースのワクチン接種は、アルツハイマー病のマウスモデルで認識を回復し、プラークを除去し、神経発生を誘発する
β−アミロイドの沈着（Ａβ）の蓄積、ニューロンの喪失、認知低下、及びミクログリアの活性化は、アルツハイマー病（ＡＤ）に特有の特徴である。プレセニリン１、及びキメラのマウス／ヒトのアミロイド前駆体タンパク質をコードする変異のヒト遺伝子を発現するＡＤダブルトランスジェニックマウスを用いて、我々は、モーリス水迷路（ＭＷＭ）における成績により評価して、酢酸グラチラマーのワクチン接種は認知低下を防ぎ、回復したことを示している。ワクチン接種はミクログリアの活性化を調節し、プラークの形成を除去し、ニューロンの生存及び神経発生を誘発した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、Ａβにより活性化したミクログリアが、成人の神経幹／前駆細胞からの神経発生を妨げた。これはＩＬ−４により対抗され、ＩＦＮ−γを加えた場合により対抗されたが、ＩＦＮ−γ単独では対抗されなかった。
材料と方法
（ｘｉｘ）動物
Ｂ６Ｃ３−Ｔｇ（ＡＰＰｓｗｅ、ＰＳＥＮ１ｄＥ９）８５Ｄｂｏ／Ｊ系統の成年ダブルトランスジェニックＡＰＰＫ６７０Ｎ，Ｍ６７１Ｌ＋ＰＳＩΔＥ９マウス１９匹をＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、メイン州）から購入し、Ｔｈｅ Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＳｃｉｅｎｃｅのＡｎｉｍａｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒで育て、維持した。動物はすべて、Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅが策定した規則に従って取り扱った。Ｔｇ ＡＤマウスを、記載されているように、キメラのマウス／ヒトＡＰＰｓｗｅ（Ｓｗｅｄｉｓｈ「Ｋ５９４Ｍ／Ｎ５９５Ｌ」変異を内部に持つＡＰＰ６９５［ヒト化Ａβドメイン］）、及び独立したマウスプリオンタンパク質プロモーター（ＭｏＰｒＰ）因子が制御するヒトＰＳ１ｄＥ９（エキソン９の欠失）ベクターを同時注射することにより生成した（Ｂｏｒｃｈｅｌｔら、１９９７年）。
（ｘｘ）試薬
組換えのマウスＩＦＮ−γ及びＩＬ−４（両方とも、サイトカイン１μｇあたり０．１ｎｇ未満の濃度の内毒素を含む）を、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州）から入手した。β−アミロイドペプチド［アミロイドタンパク質フラグメント１〜４０及び１〜４２（Ａβ１〜４０／１〜４２）］をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州から購入した。Ａβペプチドを、内毒素を含まない水に溶解し、記載されているように、ＡβをインキュベートすることによりＡβ凝集物を形成させた（Ｉｓｈｉｉら、２０００年）。
（ｘｘｉ）遺伝子型同定
この実験で用いたマウスはすべて、尾を１ｃｍ切り落としたものから抽出したゲノムのＤＮＡをＰＣＲ増幅することにより、導入遺伝子の存在に関して、遺伝子型の同定をした（Ｊａｎｋｏｗｓｋｙら、２００４年）。反応は４つのプライマー：マウスのゲノムのＰｒＰにも存在するベクター内のアンチセンスプライマーにマッチする１配列（５’−ＧＴＧ ＧＡＴ ＡＣＣ ＣＣＣ ＴＣＣ ＣＣＣ ＡＧＣ ＣＴＡ ＧＡＣ Ｃ）（配列番号４１）；ゲノムのＰｒＰコード領域に特異的な第２のセンスのプライマー（ＭｏＰｒＰベクターから除去したもの）（５’−ＣＣＴ ＣＴＴ ＴＧＴ ＧＡＣ ＴＡＴ ＧＴＧ ＧＡＣ ＴＧＡ ＴＧＴ ＣＧＧ）（配列番号４２）；及びＰＳ１導入遺伝子ｃＤＮＡに特異的な２つのセンス及びアンチセンスプライマー（ＰＳ１−ａ：５’−ＡＡＴ ＡＧＡ ＧＡＡ ＣＧＧ ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＡ）（配列番号４３）、及びＰＳ１−ｂ：５’−ＧＣＣ ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＣＡ ＣＴＡ ＡＴＣ ＡＴ（配列番号４４）を含んでいた。すべての反応により、ＤＮＡの完全性、及び増幅が成功したことに対するコントロールとして内因性ＰｒＰ遺伝子の７５０ｂｐ生成物が得られ、ＰＳ１導入遺伝子陽性のサンプルでは、約６０８ｂｐにさらなるバンドがある。
（ｘｘｉｉ）酢酸グラチラマーワクチン接種
各マウスに、ＰＢＳ×１ ２００μｌに乳化した酢酸グラチラマー（ＧＡ（ＴＶ−５０１０）、ＭＷ１３．５〜１８．５ｋＤａ、平均１６ｋＤａ、Ｔｅｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｌｔｄ．、Ｐｅｔａｃｈ Ｔｉｋｖａ、イスラエル）の全量１００μｇを、実験０日目から２４日目まで、第１週の間に２回、以後１週間に１回の５回皮下注射した。
（ｘｘｉｉｉ）行動試験
空間学習／記憶を、モーリスの水迷路（ＭＷＭ）における海馬依存の視空間の学習課題に対する成績により評価した（Ｍｏｒｒｉｓ、１９８４年）。マウスに、連続４日、１日あたり４回の試験を行い、その間、マウスは、直径１．４ｍのプールの水の表面の１．５ｃｍ下に位置した隠れたプラットホームを見つけることが必要とされる。試験室内では、水浸状態のプラットホームの位置に対する、遠位の視空間の手がかりだけが利用可能であった。回避の潜伏期、即ち、マウスがプラットホームを見つけ、その上に上るのに必要とされた時間を、６０秒を上限として記録した。各マウスは、プラットホーム上に３０秒間留まることができ、次いで、迷路から各自のホームケージへ移された。マウスが６０秒以内にプラットホームを見つけなかった場合は、手操作でプラットホーム上に配置し、３０秒後に各自のホームケージに戻した。試験間の間隔は３００秒であった。５日目に、プラットホームをプールから取り除き、各マウスを６０秒間のプローブトライアルにより試験した。６日目及び７日目に、プラットホームを、１〜４日目に選択した場所の４分円反対側に配置し、次いで、マウスを、１日あたり４セッションで再訓練した。Ｅｔｈｏ Ｖｉｓｉｏｎ自動化トラッキングシステム（Ｎｏｌｄｕｓ）を用いて、データを記録した。
（ｘｘｉｖ）ＢｒｄＵの投与及び組織標本
ＢｒｄＵを超音波処理によりＰＢＳに溶解し、各マウス中にｉ．ｐ．注射した（５０ｍｇ／ｋｇ体重；ＰＢＳ×１ ２００μｌ中ＢｒｄＵ１．２５ｍｇ）。実験２２日目から開始して、最初のＧＡワクチン接種後、ＢｒｄＵを２．５日間、１日２回１２時間毎にｉ．ｐ．注射して増殖している細胞を標識した。最初のＢｒｄＵ注射の３週間後、マウスを深く麻酔し、経心的に、最初にＰＢＳで、次いで４％パラホルムアルデヒドで潅流した。脳を全部取り除き、一夜、後固定し、次いで、リン酸緩衝３０％ショ糖で平衡にした。浮遊性の３０μｍの切片を凍結ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ ＳＭ２０００Ｒ）上で回収し、４℃で貯蔵した後、免疫組織化学検査を行った。
（ｘｘｖ）神経前駆細胞培養
側脳室の脳室下帯を含む組織の冠状切片（厚さ２ｍｍ）を、成年Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスの脳から得た。組織を細分し、次いで、パパイン０．９４ｍｇ／ｍｌ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ニュージャージー州）並びにＬ−システイン及びＥＤＴＡを０．１８ｍｇ／ｍｌ含むＥａｒｌｅの平衡塩類溶液に、３７℃、５％ＣＯ２で４５分間、消化させるためにインキュベートした。室温で１５分間、１１０×ｇで遠心した後、ピペット粉砕により組織を機械的に解離した。単一の細胞懸濁液から得た細胞を、ＮＰＣ培地［Ｌ−グルタミン２ｍＭ、グルコース０．６％、プトレシン９．６μｇ／ｍｌ、プロゲステロン６．３ｎｇ／ｍｌ、亜セレン酸ナトリウム５．２ｎｇ／ｍｌ、インスリン０．０２ｍｇ／ｍｌ、トランスフェリン０．１ｍｇ／ｍｌ、ヘパリン２μｇ／ｍｌ（すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエルから）、線維芽細胞成長因子−２（ヒト組換え、２０ｎｇ／ｍｌ）、及び上皮成長因子（ヒト組換え、２０ｎｇ／ｍｌ、両方ともＰｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ニュージャージー州から）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）］入り、７５ｃｍ２Ｆａｌｃｏｎ組織培養フラスコ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）に塗抹（３５００細胞／ｃｍ２）した。４〜６日毎に球を通過させ、単一の細胞として再塗抹した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現性ＮＰＣを、先に記載された通りに得た（Ｐｌｕｃｈｉｎｏら、２００３年）。
（ｘｘｖｉ）ミクログリアの一実施形態培養物
新生仔の（Ｐ０〜Ｐ１）Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスからの脳の髄膜をはぎ取り、手術用顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ＳｔｅｍｉＤＶ４、ドイツ）下Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ−１５培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｏｒｉｅｓ、Ｋｉｂｂｕｔｚ Ｂｅｉｔ Ｈａ−Ｅｍｅｋ、イスラエル）中、はさみで細分した。トリプシン処理後（０．５％トリプシン、１０分間、３７℃／５％ＣＯ２）、組織を粉砕した。細胞懸濁液を、グリア細胞に対して培地で洗浄し［ウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔ）１０％、Ｌ−グルタミン（１ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、及びストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ］、ポリ−Ｄ−リシン（ＰＤＬ）（１０ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔ）でコーティングした７５ｃｍ２Ｆａｌｃｏｎ組織培養フラスコ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、ホウ酸バッファ（ホウ砂２．３７ｇ及びホウ酸１．５５ｇを滅菌水５００ｍｌに溶解したもの、ｐＨ８．４）で３７℃／５％ＣＯ２で１時間培養し、次いで、滅菌の、ガラス蒸留した水で徹底的にすすいだ。培養６時間後、及びその後２日目に開始して全培養時間の１０〜１４日間、２日毎に培地の半分を交換した。ミクログリアを、１０日目と１４日目の間に最高の収量であった始めの混合した脳のグリア細胞培養物から振り落とし（１５０ｒｐｍ、３７℃、６時間）、ＰＤＬで予め処置した２４ウェルプレート（１ｍｌ／ウェル、Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に接種し（１０５細胞／ｍｌ）、ミクログリア用の培地［ＦＣＳ１０％、Ｌ−グルタミン酸塩（１ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、β−メルカプトエタノール（５０ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、及びストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を補ったＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）］で増殖させた。細胞を、ＰＤＬコーティングした培養フラスコの表面に接着させ（３０分、３７℃／５％ＣＯ２）、非接着の細胞をすすぎ落とした。
（ｘｘｖｉｉ）マウス神経前駆細胞とマウスミクログリアの同時培養
処置した、又は非処置のミクログリアの培養物を、新しいＮＰＣ分化培地（ＮＰＣ用の培地と同じであるが、成長因子を含まず、２．５％ＦＣＳを含む）で２回洗浄して試験した試薬の痕跡をすべて除去し、次いで、氷上で１５分間インキュベートし、室温で２０分間３５０ｒｐｍで振盪した。ミクログリアをフラスコから除去し、直ちにＮＰＣと１０日間、ＮＰＣ分化培地の存在下で、２４ウェルのプレートで、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングしたカバーガラス上、ＮＰＣ（５×１０４細胞／ウェル）と同時培養（５×１０４細胞／ウェル）した。次いで、培養物を２．５％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液で３０分間室温で固定し、ニューロンのマーカー及びグリアのマーカーに対して染色した。
（ｘｘｖｉｉｉ）免疫細胞化学及び免疫組織化学
ＮＰＣとマウスミクログリアとの同時培養物からのカバーガラスをＰＢＳで洗浄し、上記に記載したように固定し、１０％ＦＣＳ、２％ウシ血清アルブミン、１％グリシン、及び０．１％トリトンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔ）を含む透過処理／ブロッキング溶液で処置し、マウス抗−チューブリンβ−ＩＩＩ−イソ型Ｃ−末端抗体（β−ＩＩＩ−チューブリン；１：５００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍａｃｕｌａ、カリフォルニア州）とＣＤ１１ｂ（ＭＡＣ１；１：５０；ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ニュージャージー州）の組合せで染色した。
ＢｒｄＵ染色では、切片をＰＢＳで洗浄し、２Ｎ ＨＣｌで、３７℃で３０分間インキュベートした。切片を、ブロッキング溶液（２０％正常ウマ血清及び０．１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳ、又はＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、カリフォルニア州）から得たマウス免疫グロブリンブロッキング試薬を含むＰＢＳ）で１時間ブロックした。
免疫組織化学検査用に、組織切片を、１０％ＦＣＳ、２％ウシ血清アルブミン、１％グリシン、及び０．０５％トリトンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を含む透過処理／ブロッキング溶液で処置した。組織切片を、以下の１次抗体の特定の組合せで、４℃で一夜染色した：ラット抗−ＢｒｄＵ（１：２００ Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、英国）、ヤギ抗−ＤＣＸ［ダブルコルチン］（１：４００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、及びマウス抗−ＮｅｕＮ［ニューロンの核タンパク質］（１：２００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ、カリフォルニア州）。２次抗体は、ＦＩＴＣ複合したロバ抗−ヤギ、Ｃｙ３複合したロバ抗−マウス、及びＣｙ３又はＣｙ５複合したロバ抗−ラット（１：２００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ペンシルベニア州）であった。ミクログリアを標識するために、我々は、ＣＤ１１ｂ（ＭＡＣ１；１：５０；ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、又はＦＩＴＣ複合したバンデイラエアシンプリシフォリア（Ｂａｎｄｅｉｒａｅｒａ Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）イソレクチンＢ４（ＩＢ４、１：５０；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔ）のいずれかを使用した。細胞表面のＭＨＣ−ＩＩタンパク質の発現を検出するために、我々は、抗−ＭＨＣ−ＩＩ抗体（ラット、クローンＩＢＬ−５／２２；１：５０；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、カリフォルニア州）を用いた。ヒトＡβの発現を検出するために、我々は、抗−Ａβ（ヒトアミノ酸残基１〜１７）（マウス、クローン６Ｅ１０、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、カリフォルニア州）を用いた。ＩＧＦ−Ｉの発現を、ヤギ抗−ＩＧＦ−Ｉ抗体（１：２０；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により検出した。ＴＮＦ−αの発現を、ヤギ抗−ＴＮＦ−α抗体（１：１００；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により検出した。Ｔ細胞を抗−ＣＤ３ポリクローナル抗体（ウサギ、１：１００；ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、カリフォルニア州）で検出した。核を染色するのに、ヨウ化プロピジウム（１μｇ／ｍｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）を用いた。
特異的な染色を、非特異性の抗体又は自己蛍光成分の染色から区別するために、コントロールの切片（１次抗体で処置していないもの）を用いた。次いで切片をＰＢＳで洗浄し、抗退色剤としてのジアザビシクロオクタンとともに、ポリビニルアルコール中でカバーガラスをかけた。
（ｘｘｉｘ）定量化及び立体解析学的計数手順
顕微鏡の分析では、我々は、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０共焦点レーザー顕微鏡（倍率４０×）を使用した。ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験では、我々は、各実験群に対して、０．０５３ｍｍ２（少なくとも２枚の異なるカバーガラスからｎ＝８〜１６）の視野をスキャンした。各マーカーに対して、５００〜１０００個の細胞をサンプリングした。ＧＦＰとβ−ＩＩＩ−チューブリンを同時発現する細胞を計数した。
ｉｎ ｖｉｖｏの実験では、海馬におけるＡβ＋のプラーク及びＣＤ１１ｂ＋／ＩＢ−４＋ミクログリアの数を、各マウスからの６〜８個の冠状切片（３０μｍ）から、３００μｍの間隔で計数した。ＤＧの神経発生を、各マウスからの６個の冠状切片（３０μｍ）において、未熟なニューロン（ＤＣＸ＋）、増殖している細胞（ＢｒｄＵ＋）、及び新規に形成した成熟ニューロン（ＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋）を計数することにより評価した。ＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋の同時発現の特異性を、光学的な切片で１μｍの間隔で、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０）を用いてアッセイした。細胞数、Ａβ＋プラークの数、プラークの面積、及びＤＧにおける単位面積あたりのＮｅｕＮ染色の強度を、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ４．５ソフトウェアを用いて自動的に評価した（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）。
（ｘｘｘ）統計学的分析
ＭＷＭ行動スコアを、処置群及びトライアルブロックを変動の源として、３要因の分散分析を用いて分析し、ＭＷＭにおいてトライアルブロックを獲得している間の平均スコア間の差の有意性を評価した。得られたＰ値が有意であった場合、２個１組のフィッシャーの最小有意差法の多重比較検定を行って、どの群に有意差があるかを決定した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏの結果を、Ｔｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒの多重比較検定（分散分析）により分析し、平均値±ＳＥＭで表した。ｉｎ ｖｉｖｏの結果を、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、又は１要因の分散分析により分析し、平均値±ＳＥＭで表した。
（実施例３（１））
Ｔ細胞ベースのワクチン接種はＡＤにおける認知低下に対抗する
我々は、変異のヒトプレセニリン１遺伝子（ＰＳ１ｄＥ９）を発現するＡＤダブルトランスジェニックマウス（Ｔｇマウス）におけるＧＡの効果、及び、両方とも、早期発症の家族性ＡＤに特有な特徴である、学習／記憶障害、及び主に皮質及び海馬におけるＡβプラークの蓄積をもたらす、キメラのマウス／ヒトのアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰｓｗｅ）を試験した（Ｂｏｒｃｈｅｌｔら、１９９７年）。各マウスにおける両方の導入遺伝子の発現を、ゲノムのＤＮＡのＰＣＲ増幅により検証した。次いで、約８月齢のＡＰＰ／ＰＳ１ Ｔｇマウスを、第１週目の間に２回、その後週１回、ＧＡを皮下にワクチン接種した（ｎ＝６）。年齢をマッチさせたＴｇマウス（ｎ＝７）、及び導入遺伝子を保有しない非−Ｔｇの同腹仔（ｎ＝６）は処置せず、それぞれ、非処置のＴｇ、及び野生型の非−Ｔｇコントロールとした。最初のＧＡ注射の５週間後、マウスをすべて、海馬依存性の空間学習／記憶の課題の成績を反映する、認知活動に対するモーリスの水迷路（ＭＷＭ）で評価した（ｖａｎ Ｐｒａａｇら、２０００年に再考）。非処置のＴｇマウスのＭＷＭ成績は、平均して、年齢にマッチさせた非−Ｔｇの同腹仔の成績よりも有意に悪かった（図１４）。しかし、ＧＡでワクチン接種したＴｇマウスの成績は非処置のＴｇマウスの成績よりも優れており、非−Ｔｇの同腹仔の成績と有意差がなく（図１４）、ＧＡでのワクチン接種は、さらなる認知の喪失を防ぎ、早期の機能欠損の部分を逆転さえすることを示していた。認知の喪失又は改善は、獲得及び逆転の課題の両方で明らかであった（図１４Ａ〜１４Ｃ）。
（実施例３（２））
Ｔ細胞ベースのワクチン接種は、ミクログリアの免疫活性を調節し、β−アミロイドプラークの形成を除去し、ニューロンの生存を支持し、神経発生を誘発する
我々は上記の結果に駆り立てられて、観察された認知の喪失の停止及び反転は、Ａβプラークの減少、及び海馬におけるニューロンの生存に関連していた可能性について試験した。ヒトＡβに特異的な抗体を有するＴｇマウスからの脳の凍結切片を染色したところ、非処置のＴｇマウスでは多数のプラークが明らかになったが、ＧＡでワクチン接種したものにはほとんどなかった（図１５Ａ）。それぞれの非−Ｔｇの同腹仔では、プラークは見られなかった（図１５Ａ）。ＮｅｕＮの免疫活性を試験すると、非処置のＴｇマウスではニューロンの喪失が明らかになったが、ＧＡでワクチン接種したＴｇマウスではニューロンが保存されていたことが明らかになった（図１５Ａ）。
活性化されたミクログリアは、ＡＤの病原性で役割を果たしていることが知られている。我々は、上記の実施例で、炎症性疾患及び神経変性疾患に関連して見られるミクログリアと異なり、神経組織の生存に関連しているミクログリアは、ＭＨＣ−ＩＩを発現し、ＩＧＦ−Ｉを生成し、ほとんど又はまったくＴＮＦ−αを発現しないことを示してきた。そこで、我々は、ＧＡでワクチン接種したＴｇマウス、及び非処置のＴｇマウスからの脳の切片を、ＣＤ１１ｂ又はＴＮＦ−α（細胞毒性の炎症性の表現型に関連する活性化のマーカー）に対してポジティブに染色するミクログリアの存在について試験した。プラークの存在は、ＴＮＦ−αを発現するＣＤ１１ｂ＋ミクログリア（図１５Ｂ）の出現に相関することが見出され、（図１５Ｃ及びＡβプラーク及びＴＮＦ−αを発現するＣＤ１１ｂ＋ミクログリアの３−Ｄ再構築を描く、動画Ｓ１（本発明者らが作成したが、ここには示していない）。この動画は、図１５Ｃに示した非処置のＴｇマウスの海馬におけるＡβプラーク内に埋め込まれたミクログリア細胞の３−Ｄの共焦点画像の代表を表しているが、図１５ではＴＮＦ−αの高い免疫反応性及び細胞質で貪食されたＡβが注目できる）、非処置のＴｇマウスに豊富であった。ＧＡでワクチン接種したＴｇマウスでは、検出可能なＣＤ１１ｂ＋ミクログリアは著しく少なかった（図１５Ｂ）。抗−ＭＨＣ−ＩＩ抗体で染色すると、非処置のＴｇマウスにはＭＨＣ−２を発現するミクログリアはほとんどないが（それらがＡＰＣとして作用する能力がないことを示している、データは示さず）、ＧＡでワクチン接種したＴｇマウスでは、残留のＡβ＋プラークに近接するミクログリアのほとんどがＭＨＣ−ＩＩを発現し、それらの中にはＴＮＦ−αを発現するものはほとんどなかったことが明らかになった（図１５Ｄ、及びＧＡでワクチン接種したＴｇマウスにおけるＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリアに関連したＡβ−免疫反応性の３Ｄ−再構築を描いた動画Ｓ２（本発明者らが作成したが、ここには示していない）。この動画は、また、図１５Ｄに示した、限界のレベルのＴＮＦ−α及び高レベルのＭＨＣ−ＩＩを発現するミクログリアの代表的な３−Ｄの共焦点画像を示している）。これらの後者のミクログリアもＩＧＦ−Ｉを発現し（図１５Ｅ、及び、ＩＧＦ−１及びＭＨＣ−ＩＩ＋を同時発現するミクログリア細胞の３−Ｄの再構築を描いた動画Ｓ３（本発明者らが作成したが、ここには示していない）。この動画は、図１５Ｅに示したＩＧＦ−Ｉ−発現性のＧＡでワクチン接種したＴｇマウスからのＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリアの代表的な３−Ｄ共焦点画像を示すものである）、神経保護及び神経発生を促進するそれらの可能性、並びに学習及び記憶に有益に影響を及ぼすそれらの可能性を指摘していた。ＭＨＣ−ＩＩ＋細胞はすべて、ＩＢ４で同時標識され、それらがミクログリアであると同定された（データは示さず）。ＣＤ１１ｂ＋ミクログリア（主に非処置のＴｇマウスで見られる）は、比較的少数の分岐した突起を示したが、これらの突起はＧＡでワクチン接種したＴｇマウスにおけるＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリアでは豊富であり、ふさふさした外見を与えていた（動画Ｓ１及びＳ２に描く、示していない）ことに注目するのが重要である。
さらに、非処置のＴｇマウスと異なり、ＧＡでワクチン接種したＴｇマウスでは多くのＴ細胞（抗−ＣＤ３抗体により同定して）が、ＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリアの極めて近くに見られた。これらのマウスに見られたあらゆるＡβ−免疫反応性は、ＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリアと関連があるようであり、ＣＤ３＋Ｔ細胞と免疫シナプスを作り出している（図１５Ｆ、及びＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリアの極めて近くのＣＤ３＋細胞（Ｔ細胞）に関連したＡβプラークの３−Ｄ再構築を描いた動画Ｓ４（本発明者らが作成したが、示していない）。この動画は、ＣＤ３＋細胞と、ＭＧＣ−ＩＩ及びＡβの複合体との間の免疫学的シナプスの、図１５Ｆに示した、ＧＡでワクチン接種したＴｇマウスからのＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリアの代表的な３−Ｄ共焦点画像を示すものである）。
ＧＡでワクチン接種したマウスは、６週間後に試験した場合、非処置のＴｇマウスよりも有意に少ないプラークを示し（図１５Ｇ）、プラークによって占められた面積は、年齢にマッチさせた非処置の相対物よりも有意に小さかった（図１５Ｈ）ことが定量分析で確認された。さらに、ＧＡでワクチン接種したＴｇマウスは、非処置のＴｇマウスの対応する群よりも、有意に少ないＣＤ１１ｂ＋ミクログリア、及びＮｅｕＮに対して有意に強力な染色性を示した（図１５Ｉ、１５Ｊ）。
ＭＨＣ−ＩＩ−発現性のミクログリアは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで神経発生とも関連しているので、我々は、海馬の歯状回（ＤＧ）における新規のニューロンの形成について、同じ切片を試験した。マウスにはすべて、組織を切除する３週間前に、増殖する細胞のマーカーであるＢｒｄＵを注射してあったのでこれは可能であった。定量分析により、ＧＡでワクチン接種したＴｇマウスでは（図１６Ａ）非処置の相対物におけるよりもＢｒｄＵ＋細胞が有意に多かったことが明らかになった。さらに、それぞれの非−Ｔｇの同腹仔における新規に形成した成熟ニューロン（ＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋）の数に比べると、非処置のＴｇ群では数は有意に少なかったが、ワクチン接種した群では類似しており、ニューロンは、ＧＡのワクチン接種により少なくとも部分的に回復したことを指摘するものであった（図１６Ｂ）。対応する切片を、成年ＤＧで新規に産生された未成熟のニューロンの絶対数を分析するのに有用なマーカーであるダブルコルチン（ＤＣＸ）に対して分析すると、非−Ｔｇの同腹仔に比べて、非処置のＴｇマウスのＤＧに存在するＤＣＸ＋細胞は有意に少なかったが、ＧＡでワクチン接種したＴｇマウスのＤＧではわずかであるが有意に多かったことが明らかになった（図１６Ｃ）。共焦点顕微鏡写真は、ＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋細胞の数、又はＤＣＸ＋細胞の数における相違、並びに、非−Ｔｇの同腹仔、非処置のＴｇマウス、及びＧＡでワクチン接種したＴｇマウスの間のそれらの樹状突起を示している（図１６Ｄ）。神経発生は、非処置のＴｇマウスにおけるよりもＧＡでワクチン接種したマウスにおける方が実際に豊富であったことを、結果は示していた。しかし、興味深いことに、ＤＣＸ＋細胞がＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリアに隣接して位置する、ＧＡでワクチン接種したマウスにおけるもの以外では、非処置のＴｇマウス及びＧＡでワクチン接種したＴｇマウスの両方で、ＤＧの顆粒細胞下帯におけるＤＣＸ＋−染色したニューロンの突起は短かった（図１６Ｅ）。
（実施例３（３））
凝集したβ−アミロイドは、ミクログリアを誘発して神経発生を阻止する表現型を発現させ、この阻止はＩＬ−４によって対抗される
上記に示したｉｎ ｖｉｖｏの結果は、神経発生の停止、Ａβの凝集、及び活性化したミクログリアの表現型の間の関係を指摘している。凝集したＡβで活性化したミクログリアが神経発生を阻止するか否か、及びＴ細胞由来のサイトカインが阻害効果に対抗することができるか否かを決定するために、我々は、ＧＦＰ発現性のＮＰＣを、凝集したＡβペプチド１〜４０／１〜４２（Ａβ（１〜４０／１〜４２）；５μＭ）の存在下又は非存在下でそれらに最適の増殖培地で４８時間プレインキュベートしたＧＦＰミクログリアと同時培養し、引き続き、ＩＦＮ−γ（１０ｎｇ／ｍｌ）と、又はＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）とＩＦＮ−γ（１０ｎｇ／ｍｌ）と、さらなる４８時間処置した。次いで、増殖培地及びサイトカインの残渣を洗い流し、処置したミクログリアの調製物の各々を、分化培地の存在下で、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングしたカバーガラス上で、解離したＮＰＣ球と新たに同時培養した（図１７Ａ）。ＮＰＣによるＧＦＰの発現により、培養物に見られたあらゆる分化しつつあるニューロンは、ミクログリアの一次培養物の汚染に由来するというよりも、むしろＮＰＣに由来することが確認された。１０日後、我々は、ニューロンのマーカーであるβ−ＩＩＩ−チューブリン（βＩＩＩＴ）を発現するＧＦＰ陽性のＮＰＣを識別することができた（図１７Ｂ、１７Ｃ）。βＩＩＩＴ＋細胞は、ＮＰＣなしで培養したミクログリアには見られなかった。ミクログリアなしで（コントロール）培養したコントロールのＮＰＣでは、著しく少ないＧＦＰ＋／βＩＩＩＴ＋細胞が見られた。しかし、ＮＰＣの、ＩＦＮ−γ（１０ｎｇ／ｍｌ）とのインキュベートにより予め活性化したミクログリアとの同時培養では、ＧＦＰ＋／βＩＩＩＴ＋細胞の数の増加は劇的であった。それとは対照的に、凝集したＡβ（１〜４０）（５μＭ）によって活性化されたミクログリアは、神経発生を阻止し、ＮＰＣの数を低下させた。この負の効果は、５μＭのＡβ（１〜４２）によって活性化されたミクログリアでは表れなかった（データは示さず）。興味深いことに、凝集したＡβ（１〜４０）で予め処置したミクログリアにＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）を加えると、凝集したＡβの、ＮＰＣの生存及び分化に対する有害作用に部分的に対抗し、これらのミクログリアはＮＰＣを誘発してニューロンに分化させることができるという結果となった（図１７Ｄ）。したがって、凝集したＡβ（１〜４０）は神経発生を支持する能力を損ない、その効果はＩＬ−４によりある程度、またＩＬ−４とＩＦＮ−γとの組合せによりさらに強力に、対抗され得る様子である。
考察
認知の低下、及びＡβプラークの蓄積に冒されているＡＰＰ／ＰＳ１ダブルトランスジェニックＡＤマウスのこの試験では、Ｔ細胞ベースのワクチン接種は、ミクログリアの表現型を変更することにより、認知の成績を改善し、プラークの形成を低減し、皮質及び海馬のニューロンを救済し、海馬の神経発生を誘発した。
（実施例４）
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の動物モデルにおける酢酸グラチラマーのワクチン接種と幹細胞との組合せ
材料と方法
（ｘｘｘｉ）動物
Ｇｌｙ９３→Ａｌａ（Ｇ９３Ａ）遺伝子を含む、欠損したヒト変異体ＳＯＤ１対立遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウス（Ｂ６ＳＪＬ−ＴｇＮ（ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ（本明細書では「ＡＬＳ」マウス）を、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、メイン州、米国）から購入した。
（ｘｘｘｉｉ）免疫化
成年マウスを、Ｃｏｐ−１、１００μｇの２００μｌＰＢＳ溶液のｓ．ｃ．で免疫化した。
（ｘｘｘｉｉｉ）神経前駆細胞培養
成人神経前駆細胞（ａＮＰＣ）の培養物を、先の実施例で記載したように入手した。
（ｘｘｘｉｖ）神経前駆細胞の定位注射
マウスに、最初の免疫化の１週間後に麻酔をし、定位固定装置に配置した。頭蓋を露出し、乾燥且つ清浄に保った。十字縫合を確認し、印をつけた。指定した注射点は脳の表面から２ｍｍの深さで、前後軸における十字縫合の０．４ｍｍ後方で、正中線に対して１．０ｍｍ外側であった。神経前駆細胞を、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジ（３μｌ中５×１０５細胞、１μｌ／分の速度）で適用し、傷上の皮膚を縫合した。
（ｘｘｘｖ）運動機能障害
マウスの運動機能障害を、日齢６０日以降、週２回、ロータロッドタスクを用いて評価した。動物を、水平方向に加速する桿状体［マウス用の加速する桿状体７６５０（Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ）］上に配置し、各マウスが桿から落下するのに要する時間を記録した。我々は、各動物に対して各時間点に３回試験を行い、要した最長の時間を記録した。カットオフ時間点を１８０秒に設定し、少なくとも１８０秒間桿の上に留まっていたマウスを無症候とみなした。疾患の症状の開始を、毎週の時間点の間のロータロッドの成績の低下と決定した。動物が、配置された側に３０秒以内に立ち直ることができなくなった場合に、安楽死により屠殺した。
（実施例４）
動物を、５９日目に開始してＣｏｐ−１で処置し、最初の２週間は、Ｃｏｐ−１を週２回、以後、Ｃｏｐ−１の注射を週１回投与した。幹細胞を、ＣＳＦ中に、５０００００細胞投与した（成年神経幹細胞の１回注射）。
Ｃｏｐ−１のワクチン接種と幹細胞の組合せの投与が、ＡＬＳマウスモデル（本明細書では「ＡＬＳマウス」）に有益な効果を有するか否かを探索するために、実験を行った。この目的では、５９日齢のＡＬＳマウスを、以下のように処置した：群１（図１８、Ｃｏｐ−１＋ＮＰＣ）オス４匹を、Ｃｏｐ−１／ＰＢＳ １００μｇ／２００μｌを週２回、２週間ｓ．ｃ．して免疫化し（最初の免疫化は５９日齢のとき）、その後、安楽死まで１週間に１回免疫化した。第３回目の免疫化とともに、右の脳室中に１０００００ＮＰＣＧＦＰのｉ．ｃ．ｖ．（ＣＳＦ）をマウスに投与した；群２（図１８、Ｃｏｐ−１）オス５匹をＣｏｐ−１／ＰＢＳ １００μｇ／２００μｌで週２回、２週間免疫化し、その後、安楽死まで１週間に１回免疫化を受けさせた；群３（図１８、コントロール）オス５匹をＰＢＳ２００μｌで週２回、２週間免疫化し、その後、安楽死まで１週間に１回免疫化を受けさせた。
各群からのマウスの体重を量り（週２回）、生命徴候について、及び運動機能障害の徴候について日常的に調べた。図１８における得られた結果は、各群のＡＬＳマウスの生存の可能性を示している。結果は、Ｃｏｐ−１でのワクチン接種とＮＰＣとの併用処置はＡＬＳマウスの生存の増大をもたらしたことを示している。
（実施例５）
酢酸グラチラマーでのＥＡＥの末梢の免疫調節性の処置により誘発される神経発生及び神経保護
材料と方法
（ｘｘｘｖｉ）動物
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｈａｒｌａｎ（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）から購入した。運動及び感覚のニューロンの集団上に黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を選択的に発現する、ＹＦＰ２．２遺伝子導入マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＣＢＡのハイブリッドから生じた）（Ｆｅｎｇら、２０００年）は、Ｊ．Ｒ．Ｓａｎｅｓ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）より快く提供された。すべての実験で、８〜１０週齢のメスマウスを用いた。
（ｘｘｘｖｉｉ）ＥＡＥ
ラットＭＯＧ（配列番号３９）のペプチドｐ３５〜５５で免疫化することにより、疾患を誘発した（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）。マウスの側腹部に、ＣＦＡ中ＭＯＧ３００μｇ、及び熱不活性化した結核菌５００μｇ（Ｓｉｇｍａ）を含むＣＦＡの乳濁液２００μｌを皮下注射した。１週間後、他方の側腹部に同一のブースターを投与した。最初のＭＯＧ注射の直後、及び４８時間後に百日咳毒素（Ｓｉｇｍａ）をマウス１匹あたり３００μｇ静脈注射した。マウスを毎日検査した。以下のようにＥＡＥをスコア付けた：０、疾患なし；１、だらりとした尾；２、後肢の麻痺；３、すべての四肢の麻痺；４、瀕死状態；５、死亡。
（ｘｘｘｖｉｉｉ）酢酸グラチラマー（ＧＡ、Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）、コポリマー１）は、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リシン、及びＬ−チロシンの４つのアミノ酸を含む合成ポリペプチドの酢酸塩からなる。Ｔｅｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｐｅｔａｃｈ Ｔｉｋｖａ、イスラエル）から得た、平均分子量７３００ｋＤａの、バッチ２４２９９０５９９からのＧＡを、試験を通して使用した。様々な疾患の時期［即ち（１）ＥＡＥ誘発の直後に開始（予防処置）、（２）２０日目に疾患の徴候が出現した後に開始（抑制処置）、又は（３）誘発４５日後の慢性期の間に開始（遅延型抑制）］に、５〜８回連続した毎日の皮下注射（２ｍｇ／マウス）によりＧＡ処置を適用した。
（ｘｘｘｉｘ）ＢｒｄＵ
分裂する細胞のＤＮＡ中に組み込まれるチミジン類似体である５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ、Ｓｉｇｍａ）を、ＧＡ処置と同時に（毎日１回）、又はＧＡ注射の完了直後（毎日２回）のいずれかに、腹腔内注射（５０ｍｇ／ｋｇ）した。
（ｘｌ）潅流
動物をＮｅｍｂｕｔａｌで深く麻酔をかけ、２．５％パラホルムアルデヒドで経心的に潅流した。脳を取り除き、１％パラホルムアルデヒドで後固定し、１５％ショ糖のＰＢＳ溶液で凍結保護した。浮遊切片（厚さ１６μｍ）を、滑走式ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ ＳＭ ２０００ｒ）で、脳全体にわたり、冠状又は球欠的に切断し、連続的にＰＢＳに回収した。
（ｘｌｉ）免疫組織化学
ＢｒｄＵの組み込まれた細胞を検出するために、切片を２Ｍ ＨＣｌのＰＢＳ溶液で、３７℃で３０分間変性させ、次いで、室温で１０分間、０．１Ｍホウ酸バッファ（ｐＨ８．５）で中和した。特定の細胞型を検出するために、切片を、血清２０％及びＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１０００．５％を含むＰＢＳ溶液で１時間プレインキュベートし、次いで、１次抗体と室温で一夜インキュベートした。以下の１次抗体を用いた：ヤギ抗−ダブルコルチン（ＤＣＸ）Ｃ−１８（１：２００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、カリフォルニア州）、マウス抗−ＮｅｕＮ（１：３００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、カリフォルニア州）、マウス抗−ＧＦＡＰ（１：１００、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州）、ウサギ抗−ホスホ−ヒストン（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｈｉｓｔｏｎｅ）（１：２００、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、バージニア州）、ラット抗−ＢｒｄＵ（１：２００、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、インディアナ州）、ラット抗−Ｃｄ１１ｂ（１：５０、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、及びニワトリ抗−ＢＤＮＦ（１：５０、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）。第２の抗体のステップは、交差反応性を避けるために、高度に交差吸収されたＣｙ２−又はＣｙ３−複合したラット、マウス、ウサギ、ヤギ、又はニワトリに対する抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ペンシルベニア州）で標識することにより（１：２００、２０〜４０分）行った。コントロールのスライドは、２次抗体単独でインキュベートした。いくつかの場合では、シグナルを増強するために、我々はビオチン化した２次抗体を９０分間使用し、その後Ｃｙ２−又はＣｙ３−複合したストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いた。核を標識するために、切片をＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。アポトーシスを検出するために、我々は、ウサギアンチクリーブド（ａｎｔｉ−ｃｌｅａｖｅｄ）カスパーゼ３（１：７５、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、マサチューセッツ州）、又はＴＵＮＥＬアッセイ（Ａｐｏｐｔａｇ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｉｎｔｅｒｇｅｎ、Ｐｕｒｃｈａｓｅ、ニューヨーク州）のいずれかを用いた。さらに、我々は、変性するニューロンに特異的に結合するＦｌｕｏｒｏ−ＪａｄｅＢ誘導体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を使用した。
（ｘｌｉｉ）顕微鏡
染色した切片を、ＣＣＤカメラ（ＤＭＸ１２００Ｆ、Ｎｉｋｏｎ、東京、日本）に接続したＰｌａｎ Ｆｌｕｏｒ対物レンズを装着した、共焦点顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ １００Ｍ、Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、ドイツ）により、又は蛍光顕微鏡（Ｅ６００、Ｎｉｋｏｎ）により調べ、写真撮影した。デジタル画像を収集し、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ＋ソフトウェアを用いて分析した。画像は、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州）を用いて組み立てた。
（ｘｌｉｉｉ）定量
神経前駆細胞を、ＢｒｄＵ＋細胞（ＢｒｄＵ／ＤＣＸ２重染色したもの）を計数することにより、及びＤＣＸ＋細胞（ＳＧ７における）を計数することにより、又はＤＣＸ染色した部位（ＳＶＺ及びＲＭＳにおける、この場合密度により個々の細胞が計数できなかった）を測定することにより定量した。定量は、冠状切片で、ＳＶＺでは内側中隔のレベルで開始して６４０μｍ後方へ、また海馬のＤＧ（ＢｒｄＵ／ＤＣＸに対する両方のブレード、又はＤＣＸに対する上部のブレードにおける）においてその中隔側頭軸を通って行った。ＲＭＳにおける定量を、脳の中央線から１ｍｍで開始して、６４０μｍ外側の矢状切片で行った。各脳の構造に対する結果を、マウス１匹あたりの８個の片側のレベル（８０μｍ離れて、各処置群でマウス３〜４匹）から平均し、ナイーブのコントロールからの変化の倍数で表す。皮質におけるＢｒｄＵ／ＮｅｕＮのダブルポジティブ細胞の定量を、無作為に選択した０．１５ｍｍ２の面積で行った（マウス１匹あたり１０切片を計数、各処置群でマウス３匹）。
（ｘｌｉｖ）統計学的分析
ＢｒｄＵ及びＤＣＸの分析では、平均値±ＳＥＭ（マウス１匹あたり８個の片側レベルからの平均、各処置群でマウス３〜４匹）を一元配置の分散分析（ＡＮＯＶＡ）にかけ、その後、必要に応じて、比較法の誤り率０．０５でフィッシャーの最小有意差法（ＬＳＤ）を行った。ＢｒｄＵの組み込みに対するコントロール値は、時間の関数として低下したので、結果はＢｒｄＵを同時に注射したナイーブのコントロールからの変化の倍数として表した。皮質におけるＢｒｄＵ／ＮｅｕＮダブルポジティブの細胞数を、マウス１匹あたり１０個の切片から平均し（各処置群でマウス３匹）、１ｍｍ３あたりの細胞数として表した。
（ｘｌｖ）幹細胞の調製
ＲＯＳＡ２６マウスは、胎児のすべての組織において、及び成年マウスのほとんどの組織において、ｌａｃＺを発現する。ＲＯＳＡ２６マウスから、大腿骨及び脛骨を、１０％ウシ胎児血清を含むハンクス平衡塩類溶液で洗い流すことにより、骨髄（ＢＭ）細胞を単離した。単一の細胞の懸濁液を、移植用に調製した。
（実施例５（１））
実験モデルの記載
ＥＡＥの出現、及びＣＮＳにおけるＧＡ処置を試験するために、我々は、Ｃ５７ＢＬ／６の感受性系統、並びに、その運動及び感覚のニューロンの集団上にＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）を選択的に発現し、したがって軸索／ニューロンの損傷を追跡する単純な手段を提供している、ＹＦＰ２．２トランスジェニックマウスのマウスの２系統のＭＯＧ３５〜５５ペプチド誘発性のＥＡＥモデルを用いた（Ｆｅｎｇら、２０００年）。ＹＦＰ２．２マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス同様、ＭＯＧ誘導性ＥＡＥに感受性であった（図１９Ａ）。両方の系統で、ＥＡＥの誘発は、１６〜２０日目に開始して（重症度を増し、２０〜２４日目までに平均スコアが３に到達した）慢性の（非緩解性の）疾患をもたらし、潅流するまでグレード２〜２．５の慢性期を維持した。ＧＡ処置は、様々な段階、即ち（１）疾患誘発の直後に開始（予防処置）、（２）２０日目に疾患の徴候が出現した後に開始（抑制処置）、又は（３）誘発４５日後、慢性期の間に開始（遅延型抑制）において毎日の注射を５〜８回することにより適用した。ＧＡは、それが投与された段階に関わらず、ＥＡＥの臨床徴候を改善した（図１９Ｂ）。有益な効果は、時を経ても安定しており、マウスを屠殺するまで持続した。ＥＡＥを与えたマウス（ＥＡＥマウス）対、ＧＡで処置したＥＡＥ誘発性マウス（ＥＡＥ＋ＧＡ）の脳における、ｉｎ ｓｉｔｕの徴候を、ナイーブのマウス（コントロール）の脳と比較して試験した。
（実施例５（２））
神経学的損傷の特徴付け
ＹＦＰ２．２マウスでは、ＹＦＰは、主に軸索及び樹状突起により発現された。大脳皮質及び海馬における部分的な集団は、細胞体でもＹＦＰを発現した。グレード２〜４のＥＡＥに罹患したマウスからの脳切片におけるＹＦＰ発現は、軸索の横断面に現れた多数のニューロンの形成異常、まばらな突起、及び線維の変性が明らかだった（図２０Ａ）。様々な脳の領域で、複数の広範な病変部が高頻度に観察され（図２０Ｂ）、かなりのニューロン及び軸索の喪失を示していた。ＥＡＥマウスにおける細胞の形態学におけるさらなる変形は、膨張する中空のＨｏｅｃｈｓｔ染色された核により明らかなように、核の辺縁趨向を伴うニューロンの細胞体の拡大及び膨張であった（図２０Ｃ）。これらの欠点は、ニューロンのマーカーであるＮｅｕＮにより染色したＥＡＥ誘導性のＣ５７ＢＬ／６マウスで類似の現象が観察されたので（データは示さず）、遺伝子導入系統の異常に起因するものではなかった。変性するニューロンに結合するＦｌｕｒｏ−ｊａｄｅＢで染色すると、疾患誘発２５日後に、皮質においてポジティブに染色される細胞が明らかになったが、これが臨床上の徴候のピークである（図２０Ｄ）。しかし、我々は、切断されたカスパーゼ−３抗体、又はＴＵＮＥＬアッセイのいずれを用いても両系統の皮質及び線条体における著しい量のアポトーシスを見ることはできず、アポトーシスのメカニズムは、このモデルにおける損傷の程度を説明することができなかったことを示していた。ＣＤ３で染色した細胞の血管周囲の浸潤は、異常な領域に隣接して、又はその内部に見出され、浸潤するＴ細胞の有害な役割を示していた（図２０Ａ）。ナイーブのコントロール、及びＧＡを注射したがＥＡＥで誘発しなかったマウスでは、我々は、ニューロンの形成異常、又は血管周囲の浸潤を見ることはなかった（示さず）。
ＥＡＥ＋ＧＡマウスの脳（予防処置、又は抑制処置のいずれか）では、ＥＡＥマウスの脳よりも検出された損傷は著しく少なく、変性する線維の量が減少し（図２０Ａ）、病変部の数及びサイズが低減し（図２Ｂ）、細胞核の膨潤（図２０Ｃ）が減少したことが明らかになった。ＹＦＰポジティブの線維の薄層が、ＧＡ処置した動物の病変部にわたって高頻度に見出され、損傷を受けた領域における生存するフィラメントの生存、又は軸索の出芽を示唆していた。ＧＡ処置マウスの脳にも、Ｔ細胞の浸潤が見られたが、少量であり、その位置は損傷とは関連がなかった（図２０Ａ）。
（実施例５（３））
ミクログリアの活性化
ＭＡＣ−１に対する免疫染色（ＣＤ１１ｂ、マクロファージ及びミクログリア上に発現され、これらの活性化の後上方制御される）は、ＥＡＥマウスにおけるニューロンの傷害の程度と相関していた（小脳で示す、図２１Ａ）。したがって、活性化したミクログリアで占められる部位では、線維が低密度であり、軸索の喪失が一般に明らかであったが（ボックスＩ）、非活性化のミクログリアの隣接部位では、ニューロンの構造はそのままの様子であった（ボックスＩＩ）。活性化したＭＡＣ−１＋細胞の血管周囲の浸潤は、傷害部位で見られ、末梢を起源とするマクロファージも、病理学的プロセスに関与していたことを示唆していた。図２１Ｂに示すように、ＥＡＥマウスに見られたＭＡＣ−１染色強度における莫大な増大が、線条体、視床、及び海馬などのさらなる脳の領域において実証された。コントロールのマウスの脳におけるＭＡＣ−１＋細胞は、比較的小さい細胞体を有し、静止のミクログリアを示す長い枝分れした突起を有していた。それとは対照的に、ＥＡＥマウスの脳は、サイズの増大した丸い細胞体、及び多くの後退した短い突起が表れ、高度に活性化したミクログリアを指摘するものであった（挿入部分）。ＥＡＥ＋ＧＡマウスの脳では、ＭＡＣ−１の発現が著しく低減し、中程度の活性化を示していた。ＧＡ処置したマウスにおけるＭＡＣ−１＋細胞の細胞形態は、ナイーブのマウスにおける非活性化のミクログリアの形態と類似していた（挿入部分）。この、ＥＡＥ＋ＧＡマウスにおけるミクログリアの活性化の停止は、ＧＡ注射中止後最高３０日の様々な時間で見られた。
（実施例５（４））
神経前駆細胞の増殖
ＥＡＥの病理学的プロセス後、及びＧＡ処置後の神経前駆細胞の発生及び増殖を評価するために、我々は、ＧＡ処置と同時に注射した２つのマーカー：未成熟なニューロンのマーカーであるＤＣＸ（胎児及び成人の脳の遊走し、分化するニューロンに関連する）、並びにＢｒｄＵ（分裂する細胞のＤＮＡ中に組み込まれるチミジン類似体）を使用した。したがって、ＤＣＸの発現は、動物を屠殺する１０〜１４日前に産生された新規のニューロンの量を示し、ＢｒｄＵを組み込んだ細胞の数（ＢｒｄＵ／ＤＣＸで２重染色されたもの）はＢｒｄＵ注射期間の間に表れたニューロン前駆細胞の数を示すものであった。ニューロン増殖を、ニューロン増殖性地帯即ち脳室下帯（ＳＶＺ）で、並びに、海馬の顆粒細胞下帯（ＳＧＺ）及び顆粒細胞層（ＧＣＬ）で試験した。ＢｒｄＵ及びＤＣＸは、重複するパターンを表した。
ＥＡＥマウスのＳＶＺでは、疾患の出現後、コントロールに比べてニューロン前駆細胞の増殖が増大した（ＥＡＥ誘発２５日後、最後のＢｒｄＵ注射１日後）（図２２Ａ、２２ＢＩ）。これは、ＢｒｄＵ及びＤＣＸの発現において、それぞれ２．１倍及び１．４倍の増大により明らかだった（図２２Ｄ、ＳＶＺ、Ｉ、赤色のカラム）。それでも、１０日後及び２０日後、ＥＡＥマウスとナイーブのコントロールとの間には、ＢｒｄＵ及びＤＣＸの発現における有意差はなかった（図２２Ｂ、２２Ｄ、ＩＩ、ＩＩＩ）。さらに、長期間（３５日間及び６０日間）疾患に持ちこたえているマウスにおいて、ＢｒｄＵをＥＡＥの誘発と同時に注射し１カ月後に試験した場合（図２２Ｄ、最初の赤色のカラム）、又は潅流前の慢性状態の間（図２２Ｄ、最後の赤色のカラム）の場合のいずれかに、ＢｒｄＤＵの組み入れにより表れた増殖は、コントロールの増殖よりも低かった。ＥＡＥマウスにおけるＧＡ処置（投与スケジュールを図２２Ｅに示す）は、非処置のＥＡＥマウス及びコントロールに比べて、ＳＶＺにおけるニューロンの増殖を増強した（図２２Ａ、２２Ｂ）。この増加は、ＧＡ注射終了１日後及び１０日後に、抑制処置によるＢｒｄＵ及びＤＣＸの両方について、コントロール及びＥＡＥを上回る統計学的有意性に到達した（図２２Ｄ）。遅延型抑制処置は、ＥＡＥを上回る有意な上昇をもたらしたが、コントロールを上回らなかった。予防処置では、ＤＣＸについてのみ、ＥＡＥ及びコントロールを上回る実質的な上昇が観察された（４倍）が、ＢｒｄＵを組み入れても、ＥＡＥに比べて有意な上昇が示された。
海馬のＳＧＺでは、ニューロンの増殖は疾患の出現後に増大したが、ナイーブのコントロールの増殖を下回って実質的に低下した（図２２Ｃ、２２Ｄ、海馬、赤色のカラム）。海馬におけるＧＡ処置の効果は、ＳＶＺにおけるその効果と類似していた、即ち、増殖の増大は、ＢｒｄＵの組み入れ、及び抑制処置の終了後に持続しないＤＣＸ発現の両方により表れた。予防処置、及び遅延型抑制処置は、ＧＡ／ＢｒｄＵ注射が終了し、それぞれ１カ月後及び１日後に、ＥＡＥマウスよりも高いニューロン増殖をもたらした。とりわけ、ＥＡＥマウスの海馬では、また、より大きい程度でＥＡＥ＋ＧＡマウスでは（図２２Ｃ）、ＢｒｄＵ＋／ＤＣＸ＋細胞がＳＧＺ及びＧＣＬに隣接して見られた。ＤＣＸ発現性の細胞は、内側の分子層を横切り、外側の分子層中に拡張した、発達の良好な尖端樹状突起を伴う高密度で枝分れした樹状突起の木を表していた。
潅流前、又は１カ月前に、ナイーブのマウス（ＥＡＥなしの）にＧＡを注射しても、ＳＶＺ及びＤＧの両方で、ＢｒｄＵ又はＤＣＸの発現の著しい増大をもたらさなかった（図２２Ｄ、灰色のカラム）。
（実施例５（５））
神経前駆細胞の遊走
誘発された前駆細胞の密度を試験するために、我々は、最初に、成年マウスにおいてＳＶＺ細胞が通常遊走する経路である吻側細胞移動路（ＲＭＳ、図２３Ａに示す）中への前駆細胞の動員を追跡した。ＳＶＺに隣接する切片に（図２３Ｄ）、及びより中央の切片で示したように（図２３Ｅ）、ＥＡＥマウスのＲＭＳに沿って遊走するＢｒｄＵ、及びＤＣＸ標識した細胞の量は（疾患誘発２５日後、ＢｒｄＵ注射１日後）、コントロールに比べて上昇した。これは、ＢｒｄＵ＋／ＤＣＸ＋細胞の数において、及びＤＣＸ染色された面積において、それぞれ３．１倍及び１．６倍の上昇により明らかだった（図２３Ｆ、２３Ｇ、赤色のカラム）。ＧＡ処置後（２０〜２５日目、抑制）、ＲＭＳにおけるニューロン前駆体の量はより多く、ＢｒｄＵ／ＤＣＸ発現性細胞の広範な流れを示していた（図２３Ｂ、２３Ｄ、２３Ｅ）。したがって、ＢｒｄＵ及びＤＣＸの発現におけるコントロールを７．８倍及び２．６倍上回った上昇、並びにＥＡＥマウスを２．２倍及び１．６倍上回った上昇が、ＧＡ処置後に得られた（図２３Ｆ、２３Ｇ、青色のカラム）。とりわけ、ＧＡ単独の注射も、前駆体のＲＭＳ中への動員を強化したが、より低い程度であった（図２３Ｆ、２３Ｇ、灰色のカラム）。
ニューロン前駆体の同様の動員のパターンが、後の時間点で見られた（ＥＡＥ誘発３５日後、ＧＡ処置を予防処置として与えた場合、即ちＥＡＥ対コントロールのマウスのＲＭＳにおけるＤＣＸ発現の上昇、及びＥＡＥ＋ＧＡマウスにおけるより頑強な遊走）（図２３Ｈ）。興味深いことに、（１３匹のマウス中）１匹のＥＡＥマウスで、我々は、ＧＡ処置マウスの遊走に類似したニューロンの遊走の強化を見出した。このマウス（ＥＡＥ−ｒｅｃと表す）は、ほんのわずかな、短期間の疾患を表し（スコア２、誘発後２４〜２６日目）、潅流の日までに完全に回復した。
ＥＡＥマウスのＧＡでの処置は、ＲＭＳを介したニューロン前駆体の動員の強化をもたらしただけではなく、発達中の前脳に自然に見られるニューロンの遊走の側方皮質経路（ＬＣＳ）に対応する領域内へのそれらの遊走ももたらした（図２３Ａに示す）。したがって、ＤＣＸ＋細胞は、脳梁及び海馬−脳梁（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｏ−ｃａｌｌｏｓａｌ）の界面に沿った鎖において、様々な皮質の領域、主に後頭部の皮質に向かってＳＶＺから尾側に移動する様子であった（図２３Ｃ）。我々は、ＧＡで処置しなかったＥＡＥマウスの対応する切片では、このような動員のパターンを追跡することはできなかった。さらに、ＥＡＥ＋ＧＡマウスでは、ニューロン前駆体は古典的なニューロン増殖性地帯及び遊走流から分岐し、線条体、側坐核、及び皮質などの非定型的な領域に広がった（図２４）。ＤＣＸ＋細胞は、ＹＦＰ発現性フィラメントにごく近接したＲＭＳから遠ざかる様子であり、神経線維に沿ったそれらの遊走を示唆していた（図２４Ａ）。これらの方向及び配向によって見ると、これらはＲＭＳ及びＳＶＺの両方から離れて遊走するが、幾匹かのマウスでは、ほとんどの細胞はＳＶＺから伸長し（図２４Ｂ）、他のマウスではＲＭＳはそれらの主要な起源と思われた（図２４Ｃ）。ＤＣＸ＋細胞は、ＲＭＳから前頭部の皮質中に（図２３Ｂ、２４Ｄ）、またＬＣＳから後頭部の皮質（図２３Ｃ）に到達している様子であった。これらは、先導する及び引きずる突起を有する紡錘状の細胞体など（Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅら、１９９５年）遊走するニューロンに特徴的な形態学的特徴を表し、これらの配向は、遊走流から神経線維に沿って皮質の内部部分中への遊走と一致していた（層５及び層６で示す、図２４Ｅ、２４Ｆ）。我々は、ニューロン増殖性地帯、並びに小脳及び橋などの遊走流から離れた部位ではニューロン前駆細胞を検出しなかった。
ＧＡ処置及びＢｒｄＵ注射後の早期の時間点では（１〜１０日）、ＲＭＳから遊走して出た神経前駆細胞は、線条体（図２５Ａ）及び側坐核（図２５Ｂ）で示されるように、ＢｒｄＵとＤＣＸとの同時発現を表し、これらがＧＡ処置と同時に分裂を経験していたことを指摘していた。いくつかの場合では、これらのダブルポジティブの細胞は小集団で出現し、局所の分裂も示唆するものであった。さらに、Ｍ期における細胞の内因性のマーカーであるリン酸化ヒストンＨ３で染色すると、図２５Ｃにおける側坐核に蓄積したニューロン前駆細胞に対して見られるように、いくつかのＤＣＸ＋細胞は潅流の前に増殖したことを示していた。
後の時間点では（ＧＡ処置完了１カ月後）、ニューロンの核の抗原（ＮｅｕＮ）を同時発現するＢｒｄＵ＋細胞が、線条体（図２５Ｄ、２５Ｆ）、側坐核（図２５Ｅ）、及び皮質（図２５Ｇ、帯状の皮質層５）に見られ、いくつかのニューロン前駆細胞は、成熟ニューロンの表現型に向けてさらに分化していたことを指摘していた。ＹＦＰマウスの皮質では（図２５Ｈ、２５Ｉ、帯状、図２５Ｊ、後頭部、図２５Ｋ、運動）、ＢｒｄＵ及びＹＦＰを尖端樹状突起及び軸索と同時発現する錐体細胞が観察され、成熟した機能性のニューロンを指摘するものであった。平均１２８±４６／ｍｍ３のＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋で２重標識した細胞が、ＥＡＥ＋ＧＡマウスの皮質に見られ、全ＮｅｕＮ＋細胞の１．３％を構成していた。ＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋細胞は、ＧＡで処置しなかったＥＡＥマウスの皮質にも、より少数ではあるが（４８±２５／ｍｍ３、ＮｅｕＮ＋細胞から０．５８％）見出されたことに留意されたい。ナイーブのマウスの皮質では、ＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋細胞は見られなかった。
（実施例５（６））
病変部位への遊走
新規に産生されたニューロンは、損傷を受けた領域に引き付けられると思われた。したがって、ＤＣＸ／ＢｒｄＵの集団、及びＮｅｕＮ／ＢｒｄＵを同時発現する細胞は、変質するＹＦＰ発現性の線維及び病変部の部位に位置していた（図２４Ｂ、２４Ｃ、２５Ａ〜２５Ｄ）。さらに、ＤＣＸ発現性の細胞は、線条体（図２６Ｂ、２６Ｃ）、皮質（図２６Ｄ、２６Ｅ）、及び側坐核（図２６Ｆ）の、辺縁周辺及び内部の病変部に見られた。ＥＡＥマウス（ＧＡにより処置していない）では、病変部を取り囲む少数のＤＣＸ＋細胞も観察されたが（図２６Ａ）、ＥＡＥ＋ＧＡマウスでは、病変部に遊走する前駆体の量ははるかに多かった。ＤＣＸ＋ニューロン前駆細胞は、ＧＦＡＰを発現する星状細胞で広範囲に占められた部位中に局在しており（図２７Ａ〜２７Ｃ）、グリア性瘢痕の部位中へのこれらの遊走を示唆していた。
ＤＣＸ＋細胞によって占められた病変部で（図２６Ｄ〜２６Ｆ）、我々は、ＹＦＰ発現性の線維が病変部中に伸長していたのを観察し、ニューロン前駆細胞による軸索の再発生又は出芽の誘発が示唆された。新規に産生されたニューロンが、実際に増殖を促進性の環境を誘発することができるか否かを見出すために、我々は、これらがＢＤＮＦを発現する能力を試験した。図２７に示すように、核小体側坐核（図２７Ｄ、２７Ｅ）、及び海馬（図２７Ｆ）では、ＥＡＥ＋ＧＡマウスで、かなりの割合の遊走するＤＣＸ＋細胞が、ＢＤＮＦの広範囲の発現を表していた。
（実施例５（７））
ＥＡＥのマウスモデルにおける、酢酸グラチラマーと前駆幹細胞との併用処置
酢酸グラチラマー（ＧＡ）及び幹細胞の組合せ投与の、ＥＡＥモデルにおける効果を評価するために、以下の実験を行った。我々は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）誘発性ＥＡＥマウスモデルを使用した。ニューロン及び軸索の変性は、ＥＡＥマウスでは広範に明らかであった。ＧＡ処置を、一手技により幹細胞と組み合わせてＥＡＥマウスに適用したが、これは自己神経発生を産生するのに、即ち毎日皮下注射することにより、効果的であることが見出された。
多分化能の幹細胞を、成年マウスのほとんどの組織でＬａｃ−ｚを発現するＲＯＳＡ２６トランスジェニックマウスの骨髄から得た。Ｌａｃ−ｚ遺伝子の発現を、遺伝子産物であるβ−ガラクトシダーゼの酵素活性により検出した。これらの幹細胞を、脳の側脳室中への局所的な定位的な包含により、ＥＡＥＣ５７ＢＬ／６マウス中に移植した。或いは、幹細胞を静脈注射により全身的に投与することが可能である。
ＧＡと幹細胞の併用投与の効果を、ＧＡ及び幹細胞の別々の投与と比較した。非処置のＥＡＥマウス、及びナイーブのマウスをコントロールとした。処置後、マウスを、ニューロンの症状について毎日調べ、疾患の重症度及び／又は臨床上の改善についてスコア付けをした。処置のｉｎ ｓｉｔｕの効果を、上記５（２）に記載したようにニューロンの損傷を特徴付けることにより評価した。移植した細胞の運命を、上記５（４）、５（５）、及び５（６）に記載した免疫組織学的方法を用いてモニターした。例えば、増殖を、移植と同時に注射したＢｒｄＵなどのマーカーを用いて評価し、分化をＤＣＸ及びＮｅｕＮマーカーを検出することによりモニターした。我々は、また、移植した細胞の遊走、及びそれらが病変部位に到達する能力を追跡した。
得られた予備的な結果は、調べた上記のパラメータにより証明されるように、ＧＡ＋幹細胞の併用処置は、各処置の有益な効果を別々に増強したことを示している。同じ有益な効果を、他の実験モデルで、ＧＡ及び幹細胞の併用処置により得ることができる。したがって、ＧＡと幹細胞との併用処置は、さらなる神経学的疾患及び他の疾患の治療で用いることができる。
考察
ここに報告した主な発見は、炎症性の自己免疫性神経変性疾患の、末梢の免疫調節性の処置は、神経保護、及び病理学的プロセスにより誘発される自己神経発生の増強を誘発することである。これは、通常神経発生を経験しない脳の領域において、傷害部位への新規のニューロンの大量の遊走をもたらし、ＥＡＥ及びＭＳにおけるＧＡの有益な効果に対する関連性を示唆するものである。
ＭＯＧ誘発性ＥＡＥの組織病理学的徴候は、Ｃ５７ＢＬ／６及びＹＦＰ２．２両方の系統において、線維の悪化、軸索の喪失、広汎性の病変部位、及び核の辺縁趨向であり、重症の損傷を示すものであった（図２０）。Ｔ細胞（図２０Ａ）及びマクロファージ（図２１Ａ）の血管周囲の浸潤は、この疾患におけるこれらの有害な役割に一致して、異常な領域に極めて近接して見られた（Ｂｅｈｉら、２００５年；Ｓｔｏｌｌｇ及びＪａｎｄｅｒ、１９９９年）。ＧＡの保護効果は、悪化する線維が減少し、より小規模に病変部の量が減り、細胞の核の辺縁趨向が小さくなることから明らかなように、典型的な軸索及びニューロンの損傷を防止するといった形で現れた。ＧＡのさらなる顕著な効果は、様々な計画によりすべての時間点（処置終了後１〜３０日）で表れた、ミクログリアの活性化の低減であった（図２１Ｂ）。ミクログリアは、ＣＮＳ内で抗原提示細胞として機能し、したがって脳炎惹起性のＴ細胞を活性化し、炎症性の毒性メディエーターを生成するが、これらが神経栄養因子を発現する能力による２重の機能も実証された（Ｓｔｏｌｌｇ及びＪａｎｄｅｒ、１９９９年）。現在のモデルでは、ミクログリアの活性化は、ＥＡＥを罹患したマウスで様々な脳の領域で顕著に増大し、この活性化はニューロンの傷害の量と相関していた。
ＧＡ処置は、ニューロンの損傷の低下をもたらすだけでなく、ニューロンの増殖の増大ももたらした。２つの検出マーカーの組合せにより、我々は、未成熟なニューロンのマーカーであるＤＣＸの全体の発現により、我々は、動物を屠殺する１０〜１４日前に産生された新規のニューロンの量（Ｂａｙｅｒら、１９９１年）、及びＢｒｄＵ／ＧＡの同時注射期間の間に現れたニューロン前駆細胞（分化してニューロン系列になり、したがってＢｒｄＵ／ＤＣＸの２重染色性を表したもの）の数の両方を評価することができた。両方の系統により、ＥＡＥの病理学的プロセスの効果、及びＧＡ処置の効果に関して、比較可能な結果が得られた。それゆえ、ＥＡＥの誘発は、ニューロン増殖性地帯（ＳＶＺ及びＳＧＺ）で傷害後に細胞増殖の増大を実証した以前の試験と一致して、疾患の出現後にニューロン増殖性地帯においてニューロン前駆細胞増殖の増大を引き起こした（図２２）（Ｊｉｎら、２００３年；Ｍｅｇａｖｉら、２０００年；Ｐｉｃａｒｄ−Ｒｉｅｒａら、２００２年）。それでも、このニューロン増殖は、徐々に、且つ引き続きナイーブのマウスのニューロン増殖を下回って低下し、疾患により、及び損傷を補償するための自己神経発生の失敗により罹患した機能障害を示していた。ＥＡＥマウスに対して様々な計画により適用したＧＡ処置は、ＳＶＺ及びＳＧＺの両方でＥＡＥマウスよりもニューロンの増殖を増強し、その期間を延長した。特に意義深いのは、疾患の慢性期に開始したＧＡ処置の神経保護の結果である（遅延型抑制）、というのは、この時期はＥＡＥ／ＭＳでは、消耗した自己補償性の神経発生が失敗し、広範な神経変性が打ち勝つ段階とみなされているからである（Ｂｊａｒｔｍａｒら、２００３年；Ｈｏｂｏｍら、２００４年）。
ＳＶＺを起源とするニューロン前駆細胞は、これらが成年において通常遊走する経路である、ＲＭＳ中に動員された。この動員は、ＥＡＥマウスで増大し、ＧＡはそれをさらにさらに増強した（図２３）。この効果の治療上の関連性は、軽微な短期間の疾患及び自発的な回復を表したＥＡＥマウスに見られるニューロンの遊走の増大によりほのめかされる。それでも、ＧＡ処置マウスのニューロン前駆細胞では、遊走はＲＭＳに限定されなかった。我々は、ＤＣＸ発現性細胞が、脳梁及び海馬−脳梁界面に沿って、様々な皮質の領域、主に後頭部の皮質に向かって遊走したときに、天然では胎児の前脳に見られるＬＣＳ−ニューロンの遊走経路の再発を見出した（Ｆｒａｎｃｉｃら、１９９９年）（図２３Ｃ）。さらに、ニューロン前駆体は、古典的なニューロン増殖性地帯、及び遊走流から分岐し、線条体、側坐核、及び皮質など、通常は神経発生を経験しない隣接する非定型の脳の領域に広がった（図２４）。ＥＡＥマウスの海馬では、疾患の出現に続き、より大きな程度で、またＥＡＥ＋ＧＡマウスではより長い期間で、ＢｒｄＵ及びＤＣＸ発現性の細胞は、分岐した樹状突起を内側及び外側の分子層を介して伸長して、ＳＧＺから隣接のＧＣＬ中に遊走した（図２２Ｃ）。しかし、ＳＧＬ起源の細胞の動員は、おそらく海馬に制限されていた、というのは、ニューロン前駆細胞の遊走の源としてＳＧＺよりもむしろＳＶＺを同定した以前の研究と一致して、この領域を越えて遊走する証拠を我々は見出さなかったからである（Ｊｉｎら、２００３年）。
ＧＡ及びＢｒｄＵ注射後の早期の時間点では（これらの最後の注射後１〜１０日）、ＢｒｄＵ＋ニューロン前駆細胞は、遊走し、分化するニューロンに特徴的な、未成熟なニューロンのマーカーであるＤＣＸを発現し（Ｂｅｒｎｉｅｒら、２００２年）、遊走の形態、先導する及び引きずる突起を有する紡錘状の細胞体を表した（Ｏ’Ｒｏｕｋｅら、１９９５年）（図２４）。前駆体が、ニューロン増殖性地帯を離れた後もそれらが増殖する能力を保持するか否かについては疑われていた（Ｇｏｕｌｄ及びＧｒｏｓｓ、２００２年；Ｉｗａｉら、２００２年）。ＥＡＥ＋ＧＡマウスで、我々は、ＢｒｄＵ／ＤＣＸ同時発現性細胞の小集団を線条体及び側坐核で発見したが、これは局所的な分裂を示唆するものであった。さらに、Ｍ期における細胞の内因性のマーカーであるリン酸化ヒストンで染色すると、これらの領域におけるいくつかのＤＣＸ＋細胞は、潅流の前に分裂していたことが示され（図２５）、古典的なニューロン増殖性地帯の外側におけるｉｎ ｓｉｔｕの増殖を示唆していた。後の時間点では（ＧＡ処置完了１カ月後）、枝分れの突起を有するＤＣＸ＋細胞（図２６）、及び成熟ニューロンのマーカーであるＮｅｕＮを発現し、成熟した形態を表すＢｒｄＵ＋細胞が観察された（図２５）。ＥＡＥマウスの皮質における新規のニューロンの量は、損傷誘発性の神経発生の他の場合に見られたものと比較可能であった（Ｍａｇａｖｉら、２０００年；Ｐｉｃａｒｄ−Ｒｉｅｒａら、２００２年；Ａｒｌｏｔｔａら、２００３年）。ＧＡ処置によりこの数は２．６倍増加し、新規に産生されたニューロンの実質的な上昇を示していた。ＢｒｄＵ／ＮｅｕＮ＋細胞は、ナイーブのマウスの皮質には見られず、成年齧歯動物の皮質には神経発生は通常起こらないことが確認された（Ｉｗａｉら、２００２年；Ｊｉｎら、２００３年；Ａｒｌｏｔｔａら、２００３年）。このように、神経発生を構成する３つのプロセスである、細胞の増殖、遊走、及び分化（Ｊｉｎら、２００３年；Ｃｈｅｎら、２００４年）がＧＡ処置後に増大した。
これらの発見により、ＧＡ処置と神経保護及び神経発生の産生との間の相関が確立された。これらの効果は炎症の抑制に起因することが可能であり、即ち、内毒素投与後の抗炎症薬処置で実証されたように、発作が病理学的プロセスを開始し、このように損傷が続く（Ｍｏｎｊｅら、２００３年）。ＧＡがサイトカインの分泌を、Ｔｈ１の炎症性経路からＴｈ２／３の抗炎症性の経路に転換する能力は、マウス及びヒトの末梢で実証された（Ａｈａｒｏｎｉら、１９９８年；Ｄｕｄａら、２０００年）。さらに、ＧＡは、ＢＢＢを越える特異的なＴｈ２／３細胞を誘発し、ＣＮＳに蓄積し（Ａｈａｒｏｎｉら、２０００年、２００２年）、ｉｎ ｓｉｔｕで抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０及びＴＧＦ−βを発現する（Ａｈａｒｏｎｉら、２００３年）。現在の研究でも、Ｔ細胞はＥＡＥ＋ＧＡマウスの脳で見られ、それとは対照的にＥＡＥマウスではそれらの位置は損傷とは関連していなかった（図１９Ｃ）。しかし、ＣＮＳにおけるＧＡ誘導性細胞の効果は、炎症の阻止を越えている。したがって、ＩＬ−１０はグリア細胞の活性化を調節することが示され（Ｌｅｄｅｂｏｅｒら、２０００年）、したがって、そのｉｎ ｓｉｔｕの発現はＧＡ処置マウスにおけるミクログリアの活性化の遮断を説明することができる（図２１）。ＴＧＦ−βについては、その神経保護活性は様々な種で示されており（Ｄｈａｎｄａｐａｎｉ及びＢｒａｎｎ、２００３年）、ニューロン増殖及び分化を誘発するその能力も示されている（Ｎｅｗｍａｎｎ ｅｙａｌ．、２０００年；Ｋａｗａｕｃｈｉら、２００３年）。さらに、脳におけるＧＡに特異的な細胞は、成人の脳においてニューロンの生存及び神経発生の主要な制御因子である（Ｌａｓｓｍａｎｎら、２００３年）、有力な神経栄養因子のＢＤＮＦを発現することが示された（Ａｈａｒｏｎｉら、２００３年）。ＢＤＮＦは、この研究における発見と同様に、ＳＶＺ細胞の補充、成人では神経発生を表さないＲＭＳを介した構造へのそれらの遊走、及びそれらのニューロンへの分化を刺激することが示された（Ｐｅｎｃｅａら、２００１年）。したがって、特に関連があるのは、ＧＡに特異的なＴ細胞の養子移入又はＧＡ注射自体は、ＣＮＳの常在性の細胞、例えば星状細胞及びニューロンに対する傍観者効果を誘発して、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、及びＢＤＮＦを広範囲に発現させ、様々な脳の領域でそれらの著しい上昇をもたらしたという、我々の以前の発見である（Ａｈａｒｏｎｉら、２００３年、２００４年）。
新規に産生されたニューロンは、神経膠症の瘢痕領域中への遊走（図２７）、並びに線維の悪化、ニューロンの喪失、及び病変部を表す領域への遊走（図２４Ｂ、２４Ｃ、２５Ａ〜２５Ｄ、２６）によって明らかなように、損傷を受けた領域に引き付けられ、又は補充されることは特に意義深い。新規のニューロンが傷害部位へ直接遊走することは、脳虚血後（Ｊｉｎら、２００３年）、及びＥＡＥマウスにおけるこの研究で（図２６Ａ）実証された。しかし、ＧＡで処置したＥＡＥマウスにおける病変部はあまり広範囲ではないが、その中に遊走する前駆体の量は強烈に大きい。これらの新規のニューロンは、死滅した、又は機能障害の細胞を置き換えるためのプールを構成し、且つ／又は神経保護及び軸索の成長を支持する成長促進性の環境を誘発することができた。後者の活性は、新規のニューロンのＢＤＮＦ発現によって証明された（図２７Ｄ〜２７Ｆ）。さらに、ニューロン前駆細胞によって占められた病変部では、病変部中に伸長したＹＦＰ発現性の線維が観察され（図２０Ｂ、２６Ｄ〜２６Ｆ）、軸索の再生、又は出芽の誘発を示唆していた。ここに示した蓄積したデータは、免疫調製性の薬物は、神経変性製疾患の経過に対抗する、神経保護及び神経発生を誘発することができるという概念を支持するものである。
ＮＰＣのニューロンへの分化は、ＮＰＣが活性化される方法に応じてミクログリアによって誘発又は阻止され得ることを示す図である。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現性ＮＰＣ（緑色）を、様々に活性化したマウスからのミクログリアと、５日間同時培養した。共焦点画像から得られた、インスリンなし（−Ｉｎｓ）又はあり（＋Ｉｎｓ）の、β−ＩＩＩ−チューブリン＋細胞（ＧＦＰ＋細胞のパーセント値として表した）の定量化を、それぞれ図１Ａ及び１Ｂにまとめてある。図１Ｃは、インスリンの存在下でのＮＰＣとＭＧ（ＩＦＮ−γ）の同時培養物におけるＧＦＰ＋細胞のパーセント値で表した、数々のβ−ＩＩＩ−チューブリン＋細胞に対するｒＴＮＦ−αの効果の結果を示す。エラーバーは、平均値±ＳＤを表す。データは、同型培養での、少なくとも３つの独立した実験のうちの１つからである。バー上のアステリスクは、非処置の（コントロールの）ＮＰＣに対する差を表す（＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１；分散分析）。図１Ｄは、インスリン非存在でミクログリアなし（コントロール）；非処置のミクログリアと（ＭＧ（−））；ＬＰＳ活性化したミクログリアと（ＭＧ（ＬＰＳ））；ＩＬ−４活性化したミクログリア（ＭＧ（ＩＬ−４））と；及びインスリン存在下でＩＦＮ−γ活性化したミクログリア（ＭＧ（ＩＦＮ−γ）＋Ｉｎｓ）、又はＩＦＮ−γ活性化したミクログリア（ＭＧ（ＩＦＮ−γ）＋Ｉｎｓ）とａＴＮＦとの、ＧＦＰ発現性ＮＰＣ（緑色）の代表的な共焦点画像を示す。図１Ｅは、β−ＩＩＩ−チューブリンとネスチンとを同時発現するＧＦＰ発現性ＮＰＣを示す。図１Ｆは、ＮＰＣから新規に形成されたニューロンは、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）６７（β−ＩＩＩ−チューブリン＋／ＧＦＰ＋／ＧＡＤ＋）に対してポジティブに染色されることを示す。注意、共焦点チャネルを、別々に表してある。 ＩＦＮ−γ又はＩＬ−４で活性化したミクログリアは、様々な形態のダブルコルチン（ＤＣＸ）発現性ニューロンへの、ＮＰＣの分化を誘発することを示す図である。ＧＦＰ発現性ＮＰＣ（緑色）を、図１で記載したように様々に活性化したミクログリアと同時培養し、ニューロンのマーカーであるＤＣＸに対して染色した。図２Ａは、インスリンの非存在下でＭＧ（ＩＬ−４）と（パネル左）、又はインスリンの存在下でＭＧ（ＩＦＮ−γ）と（ＭＧ（ＩＦＮ−γ）＋Ｉｎｓ、パネル右）５日間同時培養したＧＦＰ発現性ＮＰＣ（緑色）の代表的な２つの共焦点画像を表す。図２Ｂは、ＤＣＸを同時発現するＧＦＰ発現性ＮＰＣの代表的な共焦点画像を示す。図２Ｃは、ＤＣＸを同時発現するβ−ＩＩＩ−チューブリン＋細胞の代表的な共焦点画像を示す。注意、共焦点チャネルを、別々に表してある。図２Ｄは、共焦点画像から得た、インスリンなし、又はそれと一緒のＤＣＸ＋細胞の定量化（ＧＦＰ＋細胞のパーセント値として表した）を示す。エラーバーは、平均値±ＳＤを表す。データは同型培養における少なくとも３つの独立した実験のうち１つからである。バー上のアステリスクは、非処置の（コントロールの）ＮＰＣに対する差を表す（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；分散分析）。 ＮＰＣのオリゴデンドロサイトへの分化は、ＮＰＣが活性化される方法に応じてミクログリアにより誘発又は阻止され得ることを示す図である。図１で記載したように、ＧＦＰ発現性ＮＰＣ（緑色）を、単独で（コントロール）、又は様々に活性化されたミクログリアと同時培養した。ＮＧ２＋又はＲＩＰ＋細胞の定量化を示すヒストグラム（ＧＦＰ＋細胞のパーセント値として表した）は、（３Ａ）インスリンを含まない培地（−Ｉｎｓ）、又は（３Ｂ）インスリン含有培地（＋Ｉｎｓ）で５日間同時培養後の共焦点画像から得た。示したデータは、同型培養における３つの独立した実験のうちの１つからであり、バーは平均値±ＳＤを表している。バー上のアステリスクは、非処置の（コントロールの）ＮＰＣに対する差を表す（＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；分散分析）。図３Ｃは、５日間、ミクログリアなし（コントロール）；非処置のミクログリアと同時培養（ＭＧ（−））；インスリンの存在下でＩＦＮ−γ活性化したミクログリアと同時培養（ＭＧ（ＩＦＮ−γ）＋Ｉｎｓ）；ＩＬ−４活性化したミクログリアと同時培養（ＭＧ（ＩＬ−４））したＧＦＰ発現性ＮＰＣ（緑色）及びＮＧ２＋細胞（赤色）の４つの代表的な共焦点画像を示している。図３Ｄは、ＧＦＰ、ＮＧ２、及びネスチン細胞の共存を示す共焦点画像を示す。注意、共焦点チャネルを、別々に表してある。図３Ｅは、ＮＧ２＋細胞はＭＡＣ１＋細胞に隣接して見られることを示す。 ＭＧ（ＩＦＮ−γ）又はＭＧ（ＩＬ−４）の存在下で１０日間培養後のＮＰＣの分化及び成熟を示す図である。非処置のＮＰＣ（コントロール）の、又はＭＧ（ＩＦＮ−γ）若しくはＭＧ（ＩＬ−４）と同時培養したＮＰＣの培養物を１０日後に分析した。図４Ａは、ＧＦＰ＋細胞のパーセント値として表した、ＮＧ２＋、ＲＩＰ＋、ＧａｌＣ＋、ＧＦＡＰ＋、又はβ−ＩＩＩ−チューブリン＋細胞の数を表す。値は、平均値±ＳＤである（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；分散分析）。図４Ｂ〜４Ｆは、ＭＧ（ＩＬ−４）の存在下で１０日培養後の、ＮＰＣの代表的な共焦点画像である。図４Ｂは、ＮＧ２で染色される突起の枝分れの増大が、１０日後に見られたことを示す（図４Ｂを図３Ｃ、ＭＧ（ＩＬ−４）と比較されたい）。ＮＧ２＋突起と隣接の細胞の間に、接触が形成されたのが見られる（高倍率の四角で囲んだ部位）。図４Ｃは、成熟オリゴデンドロサイト（ＧａｌＣ＋）及びニューロン（β−ＩＩＩ−チューブリン＋）に対して同じ培養物を染色したものは、ニューロンと高度に枝分れしたオリゴデンドロサイトとの間の接触を示すことを示す（高倍率の四角で囲んだ部位）。図４Ｄは、ニューロン（ＤＣＸ＋）に対する標識化とオリゴデンドロサイト（ＲＩＰ＋）に対する標識化との間に重複が見られないことを示す。図４Ｅ及び４Ｆは、ＧＦＡＰとＮＧ２標識化との間に、又はＧＦＡＰとＤＣＸの標識化との間に、それぞれ重複が見られないことを示す。図４Ｇは、ＭＧ（ＩＦＮ−γ）及びＭＧ（ＩＬ−４）細胞の神経突起の長さを示す。値は、平均値±ＳＤである（＊＊＊Ｐ＜０．００１；分散分析）。 ＩＬ−４及びＩＦＮ−γ活性化したミクログリアによるオリゴデンドロジェネシスの誘発における、ＩＧＦ−Ｉ及びＴＮＦ−αの役割を示す図である。（５Ａ）ＧＦＰ発現性ＮＰＣ（緑色）を、単独で（コントロール）、ａＩＧＦ−Ｉの存在下で、ａＩＧＦ−Ｉ（５μｇ／ｍｌ）の非存在下又は存在下でのＭＧ（ＩＬ−４）との同時培養物で、又はａＴＮＦ−α（１ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。（５Ｂ）独立した実験で、ＮＰＣをｒＩＧＦ−Ｉ（５００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。図５Ａ及び５Ｂでは、培地にインスリンは加えなかった。（５Ｃ）ＮＰＣを、単独で（コントロール）、ａＴＮＦ−α（１ｎｇ／ｍｌ）と、又はａＴＮＦ−αの非存在下又は存在下でＭＧ（ＩＦＮ−γ）と培養した。（５Ｄ）独立した実験で、ＮＰＣを、インスリン及びｒＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＭＧ（ＩＦＮ−γ）と培養した。エラーバーは、平均値±ＳＤを表す。バー上のアステリスクは、非処置の（コントロールの）ＮＰＣに対する差を表す（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；分散分析）。 ＩＦＮ−γは、ＩＬ−４と異なり、ミクログリアで一過性にＴＮＦ−αを誘発し、ＩＧＦ−Ｉ発現を低減することを示す図である。（６Ａ）ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＦＮ−γ（２０ｎｇ／ｍｌ）、又はＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）と２４時間処置したミクログリアを、ＴＮＦ−α及びＩＧＦ−ＩのｍＲＮＡに対して、半定量ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。３つの独立した実験のうち１つの代表的な結果を示す。（６Ｂ）ＭＧ（ＩＬ−４）及びＭＧ（ＩＦＮ−γ）によるＴＮＦ−α及びＩＧＦ−ＩのｍＲＮＡ発現の時間経過。各時間点におけるＰＣＲを、すべてのｃＤＮＡ種に対する同じ逆転写混合物で行った。値は、同一サンプルにおけるβ−アクチンに対して標準化した増幅したｍＲＮＡの相対量を表し、コントロールに対する誘発の倍数として表してある（平均値±ＳＤ）。増幅の直線的な作業範囲を確認した後、実験を行った。各サンプルを３回繰り返して試験し、３つの異なるミクログリアの培養物で類似した結果が得られた。（６Ｃ）ＩＧＦ−Ｉ発現の統計学的分析は、ＭＧ（−）（コントロール）に対する強度の増大のパーセント値として計算して、細胞１個あたりの蛍光強度を実証している（各々４回繰り返した、２つの独立した実験で得られた、平均値±ＳＤ）。注意、非処置のコントロールに対して、ＭＧ（ＩＬ−４）はＩＧＦ−Ｉで有意な増大を示した。バー上のアステリスクは、ＭＧ（−）に対する差を表す（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００１；両側のスチューデントのｔ検定）。 ミエリンに特異的な自己免疫反応は、脊髄損傷（ＳＣＩ）からの機能回復を促進するのに、移植したａＮＰＣ移植と相乗的に作動することを示す図である。オスＣ５７Ｂ１／６Ｊマウス（各群におけるｎ＝６〜９匹）における、ＳＣＩ（２００ｋダインで１秒間）後の運動機能の回復。（７Ａ）マウスを、結核菌１％を含むＣＦＡに乳化したＭＯＧペプチド又はＰＢＳで免疫化した（それぞれ、ＭＯＧ−ＣＦＡ、及びＰＢＳ−ＣＦＡ）。ＳＣＩ１週間後、ａＮＰＣをそれらの側脳室中に移植した（ＭＯＧ−ＣＦＡ／ａＮＰＣ、又はＰＢＳ−ＣＦＡ／ａＮＰＣ）。同様に傷害を与え、免疫化したコントロール群におけるマウスの側脳室を、ＰＢＳで処置した（ＭＯＧ−ＣＦＡ／ＰＢＳ又はＰＢＳ−ＣＦＡ／ＰＢＳ）。Ｂａｓｓｏ運動スコア（ＢＭＳ）評点スケールの値を表す。（７Ｂ）実験２８日目に、（７Ａ）に記載した個々のマウスのＢＭＳスコア。（７Ｃ）結核菌２．５％を含む、ＣＦＡで乳化したＭＯＧペプチド４５Ｄで免疫化したオスＣ５７Ｂ１／６Ｊマウス（各群におけるｎ＝６〜９匹）における、ＳＣＩ（２００ｋダインで１秒）後の運動機能の回復。ＳＣＩ１週間後、ａＮＰＣを側脳室中に移植した。ａＮＰＣで移植する代わりに、同様に傷害を与え免疫化したコントロール群にＰＢＳを注射した。ＢＭＳ値を示す。（７Ｄ）実験２８日目における、（７Ｃ）に記載した個々のマウスのＢＭＳスコアの記録。（７Ｅ）傷害及びａＮＰＣ移植は（７Ａ）と同じであったが、免疫化をＳＣＩの７日前に行い、マウスをＭＯＧ−ＩＦＡで免疫化し、又はＰＢＳを注射した（コントロール）。（７Ｆ）傷害及びａＮＰＣ移植は（７Ａ）と同じであったが、免疫化をＳＣＩの７日前に行い、マウスをＯＶＡ／ＣＦＡで免疫化した。（７Ｇ、７Ｈ）傷害及びａＮＰＣ移植は（７Ａ）におけるのと同じであったが、免疫化をＳＣＩの７日前に行い、マウスをＭＯＧペプチド、及び結核菌２．５％を含むＣＦＡで免疫化した。全群における結果は、平均値±ＳＥＭである。アステリスクは、両側のスチューデントのｔ検定により分析して、指摘された時間点における差を示す（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。 ＧＦＰ標識したａＮＰＣが、ＭＯＧ免疫化及びａＮＰＣ移植で２重処置した後、脊髄の実質に見られることを示す図である。ａＮＰＣを側脳室に移植し７日又は６０日後に切除した脊髄の、縦方向のパラフィン切片の免疫組織化学的染色。切片を抗−ＧＦＰ抗体で染色し、Ｈｏｅｃｈｓｔで対比染色して核を検出した。次いで、これを蛍光顕微鏡でＧＦＰ＋細胞の存在に対してスキャンした。ａＮＰＣの移植７日後（８Ａ〜８Ｆ）及び移植６０日後（８Ａ〜８Ｆ）の病変部に隣接した部位における、ＧＦＰで免疫標識した細胞の代表的な顕微鏡写真を示す。 ＭＯＧ／ＣＦＡ免疫化及びａＮＰＣ移植で２重処置した後に傷害を与えたＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスからの脊髄の組織学的分析を示す図である。細胞移植１週間後に脊髄を切除した。ＳＣＩ Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウス（各群におけるｎ＝３〜４匹）にＳＣＩ（２００ｋダインで１秒）を受けさせ、ＳＣＩの日に、結核菌１％を含むＣＦＡに乳化したＭＯＧペプチドで免疫化した。ＳＣＩ１週間後、ａＮＰＣを移植し、又はＰＢＳを注射した、ＭＯＧ−ＣＦＡで免疫化したマウスの側脳室。（９Ａ、９Ｂ）、傷害を与えた脊髄の縦方向の切片のＧＦＡＰ染色は、あらゆる他の群におけるよりも、ＭＯＧ−ＣＦＡ／ａＮＰＣでの処置後の瘢痕組織の面積が著しく小さいことを示している。（９Ａ）ＭＯＧ−ＣＦＡ／ａＮＰＣ、ＭＯＧ−ＣＦＡ／ＰＢＳ、ＰＢＳ−ＣＦＡ／ａＮＰＣ、又はＰＢＳ−ＣＦＡ／ＰＢＳで処置したマウスからの脊髄の代表的な顕微鏡写真を示す。（９Ｂ）ＧＦＡＰ染色により規定された部位の定量化（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、両側のスチューデントのｔ検定；各マウスからの分析したスライスのｎ＝４）。（９Ｃ、９Ｄ）細胞移植７日後、及び挫傷性のＳＣＩ１４日後に切除しＩＢ４に対して染色した脊髄の、縦方向のパラフィン切片は、あらゆる他の群における染色よりも、ＭＯＧ／ＣＦＡ／ａＮＰＣ処置マウスにおける染色が有意に少ないことを示す。（９Ｄ）ＩＢ４染色により占められた部位の定量化（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、両側のスチューデントのｔ検定）。（９Ｅ、９Ｆ）傷害部位で浸潤するＴ細胞を同定するための、抗−ＣＤ３抗体での染色。（９Ｅ）ＭＯＧ−ＣＦＡ／ａＮＰＣ、ＭＯＧ−ＣＦＡ／ＰＢＳ、ＰＢＳ−ＣＦＡ／ａＮＰＣ、又はＰＢＳ−ＣＦＡ／ＰＢＳで処置したマウスからの脊髄の代表的な顕微鏡写真。傷害部位の周囲の４つの領域から得た、各マウスからの４枚のスライスにおける細胞をマニュアルで計数することにより、あらゆる他の群におけるよりも、ＭＯＧ−ＣＦＡ／ａＮＰＣで処置した群におけるＣＤ３＋細胞は有意に多いことが明らかになった（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；両側のスチューデントのｔ検定）。 ＭＯＧ／ＣＦＡ免疫化及びａＮＰＣ移植で２重処置した後の、傷害を与えたＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスからの脊髄におけるＢＤＮＦ及びノギンの発現の組織学的分析を示す図である。Ｃ５７Ｂ１／６ＪマウスにＳＣＩ（各群のｎ＝３〜４匹）を受けさせ、ＳＣＩの日に、ＣＦＡ（結核菌１％）に乳化したｐＭＯＧ３５〜５５で免疫化した。ＳＣＩ１週間後、ａＮＰＣを移植し、又はＰＢＳを注射した、ＭＯＧ−ＣＦＡで免疫化したマウスの側脳室。細胞移植７日後、及びＳＣＩ１４日後に切除した脊髄の縦方向の切片を（各群のｎ＝３〜４匹）、ＢＤＮＦに対して染色した。（１０Ａ）ＢＤＮＦに対して染色した部位の定量化（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；両側のスチューデントのｔ検定）。ＢＤＮＦに対する染色は、あらゆる他の群におけるよりも、ＭＯＧ−ＣＦＡ／ａＮＰＣで処置したマウスで有意に強力である。（１０Ｂ）ＢＤＮＦ及びＩＢ４に対する２重染色により、ＩＢ４＋ミクログリア／マクロファージはＢＤＮＦの主要な源であることが示される。（１０Ｃ）あらゆる他の群におけるよりもＭＯＧ／ＣＦＡ／ａＮＰＣで処置したマウスで、ノギンに対する有意に強力な染色が見られた。（１０Ｄ）ノギンで染色した部位の定量化（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；両側のスチューデントのｔ検定）。ノギン及びＩＢ４に対する２重染色により、ＩＢ４＋ミクログリアはノギンの主要な源であることが示されている。 免疫化及びａＮＰＣ移植で２重処置した後、傷害部位の近傍でＢｒｄＵ／ＤＣＸの２重染色が増大することを示す図である。図７におけるのと同じ、ＳＣＩ及びａＮＰＣ移植。ａＮＰＣ移植１週間後、マウスにＢｒｄＵを、１日２回３日間注射した。細胞移植１４日後、及び挫傷性のＳＣＩの２８日後（各群のｎ＝３〜４匹）に切除した脊髄の縦方向の切片を、ＢｒｄＵ及びＤＣＸに対して染色した。あらゆる他の群におけるよりもＭＯＧ−ＣＦＡ／ａＮＰＣで処置したマウスに、有意に多くのＢｒｄＵ＋／ＤＣＸ＋細胞が見られた。 Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでａＮＰＣからニューロンの分化を誘発することを示す図である。（図１２Ａ）単独で培養（コントロール）、又は予め活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞と、若しくは静止中のＣＤ４＋Ｔ細胞と同時培養し、５日後のβ−ＩＩＩ−チューブリン＋細胞の定量（ＤＡＰＩ細胞のパーセント値として表す）（＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；分散分析）。（図１２Ｂ）単独で培養（コントロール）、又は予め活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞と同時培養し、５日後のａＮＰＣにおけるβ−ＩＩＩ−チューブリンの発現を示す代表的な画像。（図１２Ｃ）活性化したＴ細胞で訓化した培地の存在下でａＮＰＣを培養し、５日後のβ−ＩＩＩ−チューブリン＋細胞の定量化（ＤＡＰＩ細胞のパーセント値として表す）。（図１２Ｄ）枝分れし、伸長したβ−ＩＩＩ−チューブリンのレベルド（ｌｅｂｅｌｅｄ）線維を示す代表的な画像。（図１２Ｅ）様々な濃度のＩＦＮ−γ又はＩＬ−４と培養し５日後の、ａＮＰＣにおけるβ−ＩＩＩ−チューブリン＋細胞の定量化（＊＊＊Ｐ＜０．００１；分散分析）。（図１２Ｆ）活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞により２４時間訓化した培地で培養したａＮＰＣにおいて、Ｈｅｓ−５発現が５倍低減したことを示す定量的ＲＴ−ＰＣＲ。 ａＮＰＣはＴ細胞の増殖を阻害し、サイトカインの生成を調節することを示す図である。（図１３Ａ）［３Ｈ］−チミジンを、ａＮＰＣと同時培養したＣＤ４＋Ｔ細胞中に組み入れることにより活性化し、９６時間後に増殖をアッセイした。３つの代表的な実験のうちの１つからの値を記録し、４回の繰り返しの平均値±ＳＤとして表してある。（図１３Ｂ）単独で、又はａＮＰＣの存在下で（同時培養）、又はトランスウェルの上部チャンバーでａＮＰＣと培養したＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖（図１３Ｃ）。単独、又はａＮＰＣと同時培養した、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化７２時間後の増殖培地におけるサイトカイン濃度（ｐｇ／ｍｌ）。 酢酸グラチラマー（ＧＡ）のワクチン接種は、アルツハイマー病（ＡＤ）のＡＰＰ／ＰＳ１ Ｔｇマウスモデルにおける認知の喪失に対抗することを示す図である。海馬依存性の認知活性を、ＭＷＭで試験した。（図１４Ａ〜１４Ｃ）ＧＡでワクチン接種したＴｇマウス（ダイアモンド型、ｎ＝６）は、獲得及び逆転の段階の間、非処置のＴｇマウス（四角、ｎ＝７）よりも有意に優れた学習／記憶能力を示したが、試験の消衰段階では示さなかった。非処置のＴｇマウスは、空間記憶課題において、一貫した長時間継続性の機能障害を示した。それとは対照的に、ＧＡでワクチン接種したＴｇマウスによるＭＷＭ試験の成績は、年齢にマッチさせたナイーブの非Ｔｇのそれらの同腹仔の成績に、平均して類似していた（三角、ｎ＝６）（３元配置分散分析、反復測定：獲得段階に対して、群、ｄｆ（２，１６）、Ｆ＝２２．３、Ｐ＜０．０００２；試験、ｄｆ（３，４８）、Ｆ＝６７．９、Ｐ＜０．０００１；日数ｄｆ（３，４８）、Ｆ＝３．１、Ｐ＜０．０３５；及び、逆転段階に対して、群、ｄｆ（２，１６）、Ｆ＝１４．９、Ｐ＜０．０００３；試験、ｄｆ（３，４８）、Ｆ＝２１．７、Ｐ＜０．０００１；日数、ｄｆ（１，１６）、Ｆ＝１６．９、Ｐ＜０．０００８）。 Ｔ細胞ベースのＧＡのワクチン接種は、β−アミロイド（Ａβ）の減少をもたらし、Ｔｇマウスの脳で海馬のニューロンの喪失に対抗するという、ミクログリアの重要な役割を示す図である。（図１５Ａ）ＮｅｕＮ（成熟ニューロン）及びヒトＡβに対して染色した、非−Ｔｇ、非処置−Ｔｇ、及びＧＡでワクチン接種したＴｇ同腹仔からの脳の海馬のスライスの、代表的な共焦点顕微鏡画像。非−Ｔｇマウスは、ヒトＡβに対する染色を示さない。非処置−Ｔｇマウスは、細胞外Ａβプラークが豊富であるが、ＧＡでワクチン接種したＴｇマウスではＡβ−免疫反応性が低いことを示す。その非−Ｔｇの同腹仔に比較して非処置のＴｇマウスの海馬のＣＡ１及びＤＧ領域には弱いＮｅｕＮ＋染色が見られるが、ＧＡでワクチン接種したＴｇマウスにおけるＮｅｕＮ＋染色はほとんど正常である。（図１５Ｂ）抗−ＣＤ１１ｂ抗体を用いた、活性化したミクログリアに対する染色。低倍率及び高倍率での画像により、非処置のＴｇマウスの海馬のＣＡ１及びＤＧ領域にＡβ及びＣＤ１１ｂに対して２重免疫染色された細胞の発生率が高いことが示されるが、ＧＡでワクチン接種したＴｇマウスではＣＤ１１ｂ＋ミクログリアがほんの少し存在するにすぎない。矢印は、下に示す高倍率の領域を示す。（図１５Ｃ）非処置のＴｇマウスで高レベルのＴＮＦ−αを発現するＡβ−プラークに関連するＣＤ１１ｂ＋ミクログリア。（図１５Ｄ）Ａβに対してポジティブに染色した部位で、ＧＡでワクチン接種したＴｇマウスから採取した凍結切片におけるＭＨＣ−ＩＩ（抗原提示のマーカー）に対する染色は、ＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリアの発生率が高く、ＴＮＦ−α＋のミクログリアはほとんどないことを示している。（図１５Ｅ）ＧＡでワクチン接種したマウスにおけるＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリアは、ＩＧＦ−Ｉを同時発現する。（図１５Ｆ）ＣＤ３＋Ｔ細胞が、Ａβ−免疫反応性に関連するＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリアにごく近接して見られる。四角で囲んだ部位は、高倍率の、Ｔ細胞（ＣＤ３＋）とＭＨＣ−ＩＩを発現するミクログリア細胞との間の免疫学的シナプスを示す。（図１５Ｇ）Ａβ−プラークの総数を示すヒストグラム（３０μｍの海馬のスライスにおける）。（図１５Ｈ）染色したＡβ−免疫反応性の全細胞を示すヒストグラム。ＧＡでワクチン接種したＴｇマウスと非処置のＴｇマウスとの間の有意差に留意されたく、また、ワクチン接種したＴｇマウスにおけるＡβ−プラークの存在が低減したことも検証している。（図１５Ｉ）非処置のＴｇマウスと比較した、ＧＡでワクチン接種したＴｇマウスにおける、活性化したミクログリア及び炎症を示す、ＣＤ１１ｂに対して染色した細胞における顕著な低減を示すヒストグラム。非−Ｔｇの同腹仔において、年齢とともにＣＤ１１ｂ＋ミクログリアが増大することに留意されたい。（図１５Ｊ）非処置のＴｇマウスに比較すると、ＧＡでワクチン接種したＴｇマウスのＤＧにおけるＮｅｕＮ＋ニューロンの生存率が増大することを示すヒストグラム。エラーバーは、平均値±ＳＥＭを示す。バー上のアステリスクは、免疫染色における有意差を表す（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；両側のスチューデントのｔ検定）。この試験におけるマウスはすべて、分析に含まれることに留意されたい（マウス１匹あたり６〜８切片）。 成年Ｔｇマウスの海馬で、Ｔ細胞ベースの酢酸グラチラマー（ＧＡ）のワクチン接種により誘発される細胞の再生の増強を示す図である。ＧＡでの最初のワクチン接種の３週間後、各実験群のマウスに、ＢｒｄＵを、１日２回２．５日間、ｉ．ｐ．注射した。最後の注射の３週間後に、これらの脳を切除し、海馬を、ＢｒｄＵ、ＤＣＸ、及びＮｅｕＮに対して分析した。（図１６Ａ〜１６Ｃ）増殖する細胞（ＢｒｄＵ＋）の定量化（図１６Ａ）、新規に形成された成熟ニューロン（ＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋）（図１６Ｂ）、及びすべての未成熟（ＤＣＸ＋染色された）ニューロン（図１６Ｃ）を示すヒストグラム。この研究で試験したすべてのマウスの脳の両側からの、６つの等間隔の皮質の切片（３０μｍ）から計算した、ＤＧあたりのＢｒｄＵ＋、ＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋、及びＤＣＸ＋細胞の数。エラーバーは、平均値±ＳＥＭを表す。バー上のアステリスクは、非−Ｔｇの同腹仔に対する有意差を示す（＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；両側のスチューデントのｔ検定）。それらの上の、Ｐ値のある水平な線は、指摘した群間の差を示す（分散分析）。（図１６Ｄ）非処置のＴｇマウスにおけるものに対する、ＧＡでワクチン接種したＴｇマウス及び非−Ｔｇ同腹仔における、ＢｒｄＵ／ＤＣＸ／ＮｅｕＮに対する免疫染色を示すＤＧの代表的な共焦点顕微鏡画像。（図１６Ｅ）枝分れしたＤＣＸ＋細胞が、ＧＡでワクチン接種したＴｇマウスの海馬のＤＧの細胞顆粒下帯に位置するＭＨＣ−ＩＩ＋ミクログリア付近に見られる。 ＩＬ−４は、ミクログリアの毒性及び神経発生の促進に対する、凝集したＡβの有害作用に対抗することができることを示す図である。（図１７Ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ処置の実例。（図１７Ｂ）ミクログリアなしで（コントロール）、又は非処置のミクログリアと、又はＡβ（１〜４０）（５μＭ）で４８時間予め活性化し（ＭＧ（Ａβ１〜４０））、引き続きＩＦＮ−γ（１０ｎｇ／ｍｌ）で（ＭＧ（Ａβ１〜４０／ＩＦＮγ、１０ｎｇ／ｍｌ））、若しくはＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）で（ＭＧ（Ａβ１〜４０／ＩＬ−４））、若しくはＩＦＮ−γ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）の両方で（ＭＧ（Ａβ１〜４０／ＩＦＮγ＋ＩＬ−４））活性化したミクログリアと１０日間同時培養した、ＧＦＰ及びβ−ＩＩＩ−チューブリンを発現するＮＰＣの代表的な共焦点画像。凝集したＡβは、ミクログリアを誘発してアメーバ状の形態に適応させるが、ＩＬ−４を加えた後は、これらのミクログリアは分枝型様構造を表したことに留意されたい。（図１７Ｃ）ＣＤ１１ｂ＋ミクログリアに隣接してＧＦＰ及びβ−ＩＩＩ−チューブリンを同時発現するＮＰＣの別々の共焦点画像。（図１７Ｄ）共焦点画像から得た、ＧＦＰ及びβ−ＩＩＩ−チューブリンで２重標識した細胞の定量化（ＧＦＰ＋細胞のパーセント値として表した）。結果は、同型培養における、３つの独立した実験のものであり、バーは平均値±ＳＥＭを表す。バー上のアステリスクは、非処置（コントロール）のＮＰＣに対する有意差を示す（＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１；両側のスチューデントのｔ検定）。上にＰ値を付けた水平の線は、指摘した群間の差を示す（分散分析）。 筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のマウスモデルに対する、酢酸グラチラマーと組み合わせた幹細胞の投与の効果を示す図である。 ＭＯＧペプチド３５〜５５によって誘発されるＥＡＥの臨床徴候を示す図である。（図１９Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６及びＹＦＰ２．２マウス。（図１９Ｂ）疾患の様々な段階で、即ち、疾患の誘導後直ちに開始して−予防処置、２０日目に疾患の徴候の出現後に開始して−抑制処置、又は疾患出現の６週間後の慢性期の間に−遅延型抑制、毎日のＧＡ注射を５〜８回行うことにより処置したＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＧＡ処置の効果。各処置の注射期間を、ｘ軸に沿って示してある（ｎ＝６）。 ＭＯＧペプチド３５〜５５によって誘発されるＥＡＥの組織学的徴候を示す図である。（図２０Ａ〜２０Ｄ）そのニューロンの集団上にＹＦＰ（緑色）を発現するＹＦＰ２．２マウスの脳の矢状切片におけるＧＡ処置の効果。（図２０Ａ）小脳におけるＹＦＰ発現性線維の劣化及びトランザクション（ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ）、並びに血管周囲の浸潤との相関。挿入部分は、Ｔ細胞のマーカーであるＣＤ３に対する抗体で染色することにより実証された、血管周囲の浸潤の部位を示す。（図２０Ｂ）線条体における病変部の線維の排除。（図２０Ｃ）大脳皮質の層５における錐体細胞の典型的な形態。矢印及び挿入部分は、ＥＡＥマウスにおいて核が辺縁に追いやられた異常なニューロンの細胞体を示す。非処置のＥＡＥマウスの脳よりも、ＥＡＥ＋ＧＡマウスの脳に見られる損傷はかなり少なく、即ち、繊維の劣化は少なく、病変部の数は少なく、より小さい程度であり、細胞核の膨潤は少なかった。ＹＦＰポジティブの線維の薄層が、ＧＡ処置マウスの病変部にわたって頻繁に見られたことに留意されたい。（図２０Ｄ）疾患誘発２５日後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの皮質における、変性するニューロンに結合するＦｌｕｏｒｏ−ＪａｄｅＢ（緑色）での染色。スケールバーは、（図２０Ａ）では５００μｍ、（図２０Ｂ、２０Ｃ）では５０μｍ、及び（図２０Ｅ）では２０μｍを示す。Ｌ−２、Ｌ−５、及びＬ−６、大脳皮質の層２、５、及び６。 ＥＡＥ ＹＦＰ２．２マウスにおけるミクログリアの活性化を示す図である。（図２１Ａ）小脳の白質における、ミクログリア及びマクロファージのマーカーであるＭＡＣ−１（赤色）の、ＹＦＰ発現性線維（緑色）の変性及び傷害との相関。ボックスＩでは、線維密度の低下を伴った、高度に活性化したミクログリア細胞が観察されるが、ボックスＩＩの近くの部位では、低ＭＡＣ−１発現、及び正常の線維の出現が存在する。（図２１Ｂ）ＥＡＥマウスの様々な脳の領域、即ち線条体、視床、（背側の側面の膝状の核）、及び海馬（顆粒及び分子の層）におけるＭＡＣ−１発現に対する、及びミクログリア細胞の形態に対するＧＡの効果。ＥＡＥマウスの脳に、ＭＡＣ−１染色の増大、及び活性化したミクログリアに典型的な細胞の形態が示された（挿入部分）。それとは対照的に、ＥＡＥ＋ＧＡマウスの脳におけるＭＡＣ−１の発現は、広範に減少し、ナイーブのマウスにおける非活性化のミクログリアの形態に類似の細胞形態を表していた。ＥＡＥは、潅流３５日前に、ＹＦＰ２．２マウスで誘発された。ＧＡ処置を、ＥＡＥ誘発直後に開始して、毎日の注射を８回行うことにより適用した。矢状切片。スケールバーは、（図２１Ａ）５００μｍ、（図２１Ｂ）線条体及び視床では１００μｍ、海馬では５０μｍを示す。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスのニューロン増殖性地帯における増殖マーカーであるＢｒｄＵ（赤色）、及び未成熟なニューロンのマーカーであるＤＣＸ（緑色）に対する免疫染色により可視化した、新規に産生されたニューロンの増殖を示す図である。ＥＡＥ誘導２５日後、最終のＧＡ注射の１日後、（図２２Ａ）ＳＶＺにおける、共焦点画像及び（図２２Ｃ）海馬のＳＧＺにおける、ＥＡＥマウスで、及びより大きい程度でＥＡＥ＋ＧＡマウスでの、ＢｒｄＵ及びＤＣＸの発現の増大。ＧＣＬ中に遊走した、海馬におけるＤＣＸ＋細胞に留意されたく、密度の濃い枝分れした樹状の木が表れている。（図２２Ｂ）最終のＧＡ注射後１日（Ｉ）、１０日（ＩＩ）、及び３０日（ＩＩＩ）の様々な時間点における、ＳＶＺにおけるＤＣＸ発現。ニューロン増殖は時間とともに低下するが、ＧＡ処置マウスにおけるＤＣＸ発現は、処置１日及び１０日後、ＥＡＥマウスにおけるより高かった。冠状切片。スケールバーは、（図２２Ａ）では５０μｍ、（図２２Ｂ）及び（図２２Ｃ）では２００μｍ、並びに（図２２Ｃ）の右のパネルでは２０μｍを示す。ｓｔ、線条体；ＬＶ、側脳室；ＳＧＺ、顆粒細胞下帯；ＧＣＬ、顆粒細胞層；ＩＭＬ、ＯＭＬ、内部の、及び外部の分子層。（図２２Ｄ）ＥＡＥ誘発及びＧＡ処置の後の様々な時間点における、ＥＡＥ（赤色）及びＥＡＥ＋ＧＡ（青色）マウスにおけるＢｒｄＵ組み込み及びＤＣＸ発現の定量分析。疾患の出現後、両方のニューロン増殖性地帯にニューロンの増殖の増大が観察され、引き続き、ナイーブのマウスを下回って低下し、様々なＧＡ処置の計画によりニューロン増殖が増強する。内側中隔のレベルで開始して６４０μｍ後方に（ＢｒｄＵ／ＤＣＸの２重染色で）ＢｒｄＵポジティブの細胞を計数し、ＤＣＸ染色された面積を測定することにより、及び、海馬のＤＧにおいてＢｒｄＵ＋／ＤＣＸ＋細胞（両ブレードで）、及びＤＣＸ＋細胞（鋸歯における上方のブレードで）を、その中隔側頭の軸を介して計数することによりＳＶＺで定量化を行った。各脳構造に対するＢｒｄＵ／ＤＣＸ染色した細胞の数は、マウス１匹あたり８つの片側レベルから、８０μｍ離れて、処置群に対し３〜４匹のマウスについて平均した。結果は、ナイーブのコントロールからの、変化の倍数として表した。ＢｒｄＵの組み込みに対するコントロールの値は、最後のＢｒｄＵ注射１日後、及び１カ月後のＢｒｄＵ／ＤＣＸ＋細胞はそれぞれ、ＳＶＺでは２１１±３１及び２３±６、海馬では４５±１３及び１７±８、ＤＣＸ染色では、１０匹のナイーブのマウスから平均したポジティブの細胞は、ＳＶＺでは１９，４６４±３５５０μｍ２及び海馬では７８±１２μｍ２であった。統計学的分析を、分散分析により、その後、適宜、フィッシャーのＬＳＤにより行った。＊ナイーブのコントロールを上回る有意な効果、＃ＥＡＥ非処置マウスを上回る有意な効果、（ｐ＜０．０５）。（図２２Ｅ）実験スケジュール：ＥＡＥ誘発（０日目）から潅流までの時間の長さ；予防（Ｐ）、抑制（Ｓ）、又は遅延型抑制（ＤＳ）の処置としてのＧＡ注射、及びＢｒｄＵ接種−ＧＡ処置と同時に、又は直後に。 ＧＡ処置したＥＡＥマウスにおけるニューロンの前駆細胞の、遊走流を介した動員及び遊走の促進を示す図である。（図２３Ａ）脳室下帯（ＳＶＺ）から吻側細胞移動路（ＲＭＳ−赤色）及び外側皮質流（ＬＣＳ−黄色）の両方を通る遊走経路の矢状方向の模式図。（図２３Ｂ）ＳＶＺからＯＢまでのＤＣＸポジティブの細胞（赤色）の経路を示すＲＭＳを通る矢状切片。（図２３Ｃ）胎児の前脳で一般的に機能的であり、ＥＡＥ成年マウスにおいてＧＡ処置後に再度出現するＬＣＳにおけるニューロン前駆細胞。ＤＣＸポジティブの細胞（赤色）は、海馬と脳梁の間の界面のＹＦＰ発現性線維（緑色）に沿って、様々な皮質の領域に、主に後頭部の皮質に向かって遊走する。（図２３Ｄ〜２３Ｅ）ＥＡＥマウス及びナイーブのコントロールと比較した、ＥＡＥ＋ＧＡマウスのＲＭＳにおける、ＳＶＺに隣接したＲＭＳ切片における（図２３Ｄ）、及びＲＭＳ弧のより内側の切片における（図２３Ｅ）、ＢｒｄＵ（橙色）及びＤＣＸ（緑色）免疫染色で可視化した新規に産生されたニューロンの動員の増大。矢状切片。スケールバーは、（図２３Ｂ）では１０００μｍ、（図２３Ｃ）では２５、（図２３Ｄ）では５００、及び（図２３Ｅ）では５０μｍを示す。ＬＶ、側脳室；Ｃｔｘ、皮質；Ｓｔ、線条体；ＯＢ、嗅球；ＡＣ、前交連；ｃｃ、脳梁；Ｈｉｐ、海馬；Ｌ−５及びＬ−６、大脳皮質の層５及び層６。（図２３Ｆ〜２３Ｈ）ＢｒｄＵ及びＧＡ注射終了１日後（図２３Ｆ、２３Ｇ）及び１カ月後（図２３Ｈ）における、ＲＭＳにおけるＢｒｄＵ（ＤＣＸを同時発現する）又はＤＣＸの定量分析であり、ＥＡＥマウスのＲＭＳではコントロールを超えたニューロン前駆細胞の有意な増大、及びＥＡＥ＋ＧＡマウスにおいてより高い上昇を示している。軽微な、短期の疾患、及び自発的な回復を示した１匹のＥＡＥマウスでは（ＥＡＥ−ｒｅｃ、図２３Ｈ）ニューロンの遊走の強化が観察されたことに留意されたい。線条体の縁に沿って、ＢｒｄＵ＋／ＤＣＸ＋細胞を計数し、ＤＣＸ染色された領域（０．２２ｍｍにおける）を計算することにより定量化を行った。ＢｒｄＵ／ＤＣＸ染色した細胞の量を、８０μｍ離れて、マウス１匹あたり８切片から平均した。１匹のマウスを示すＥＡＥｒｅｃを除いて、処置群あたり３匹のマウスを計数した。結果をナイーブのコントロールからの変化の倍数として表す。ＢｒｄＵ組み込みに対するコントロール値：最終のＢｒｄＵ注射の１日後、及びＤＣＸ染色に対して、ＢｒｄＵ＋／ＤＣＸ＋細胞１４６±３１：６匹のナイーブのマウスから平均して２１９３±３０５μｍ２。ナイーブのコントロールに対して＊ｐ＜０．０５。（図２３Ｂ、２３Ｃ、２３Ｈ）ではＥＡＥマウスを、疾患の誘発に引き続き、潅流の１カ月前にＧＡで処置した−予防、（図２３Ｄ、２３Ｅ、及び２３Ｆ、２３Ｇ）ではＥＡＥ誘発マウスに、疾患誘発２０日後、潅流１〜５日前、ＧＡ及びＢｒｄＵを注射した−抑制。 ＧＡ処置したＥＡＥ誘発マウスにおけるニューロン前駆細胞の遊走を示す図である。ＤＣＸ発現性のニューロン前駆体（橙色）は、古典的なニューロン増殖性地帯又は遊走流から分岐し、ＹＦＰ発現性線維（緑色）に沿って非定型の領域に広がる。（図２４Ａ）ＲＭＳから線条体中へ。（図２４Ｂ、２４Ｃ）側坐核の領域へ、ＳＶＺから（図２４Ｂ）、及びＲＭＳから（図２４Ｃ）。（図２４Ｄ）ＲＭＳから、皮質の内部へ、（図２４Ｅ）、層５、及び（図２４Ｆ）、層６。ＤＣＸ発現性細胞の形態学的特徴、即ち、遊走するニューロンに特徴的な、先導する及び引きずる突起を有する紡錘状の細胞体（図２４Ｃ挿入部分、及び図２４Ｅ、２４Ｆ）、並びにそれらの配向、即ち、神経線維に沿って遊走流から遊走して離れる（図２４Ａ、２４Ｄ〜２４Ｆ）に留意されたい。矢状切片。スケールバーは、図２４Ａ〜２４Ｄでは２００μｍ、図２４Ｅでは１００μｍ、及び、図２４Ｆでは１０μｍを示す。図２４Ａ〜２４Ｃでは、ボックスの部位の拡大を、右のパネルに示す。ＲＭＳ、吻側細胞移動路；ＳＶＺ、脳室下帯；Ｓｔ、線条体；ＡＣ、前交連；ｃｃ、脳梁；Ｌ−５及びＬ−６、大脳皮質の層５及び層６。 ＥＡＥマウスでＧＡ処置の経過に産生されたニューロン前駆細胞の運命の追跡を示す図である。ＢｒｄＵ及びＧＡの同時注射中に生まれた、ＢｒｄＵを組み込んだ細胞（赤色）は、様々な脳の領域に遊走し、ニューロンのマーカーを発現した。（図２５Ａ、２５Ｂ）最後の注射の１０日後、線条体（図２５Ａ）、及び側坐核（図２５Ｂ）における、未成熟のニューロンのマーカーであるＤＣＸを同時発現するＢｒｄＵポジティブ細胞（緑色）。局所の分裂を示唆する、ダブルポジティブの細胞の集団に留意されたい。（図２５Ｃ）マウスを屠殺する前にｉｎ ｓｉｔｕで増殖したＤＣＸポジティブの細胞を示す、内因性の増殖マーカーであるホスホヒストン（ｐｈｏｓｐｈｏｈｉｓｔｏｎ）での、側坐核におけるＤＣＸ発現性細胞の染色（青色）。（図２５Ｄ〜２５Ｇ）成熟ニューロンのマーカーであるＮｅｕＮを同時発現するＢｒｄＵポジティブ細胞（緑色）、ＧＡ／ＢｒｄＵ注射完了１カ月後、線条体における（図２５Ｄ、２５Ｆ）、側坐核における（図２５Ｅ）、及び帯状の皮質層５における共焦点画像（図２５Ｇ）。矢印は、代表的なＢｒｄＵ／ＮｅｕＮ同時発現性の細胞を示す。（図２５Ｈ、２５Ｋ）ＹＦＰマウスにＧＡ／ＢｒｄＵを注射し１カ月後、帯状の層５において（図２５Ｈ、２５Ｉ）、後頭部の層６において（図２５Ｊ）、及び皮質の運動層５（図２５Ｋ）においてＹＦＰを同時発現する（緑色）ＢｒｄＵポジティブ細胞。成熟した機能上のニューロンを示す、尖端樹状突起及び軸索が特徴的に伸長した錐体の細胞を見ることができる。図２５Ｇ及び図２５Ｋは共焦点画像である。矢状切片。スケールバーは、（図２５Ａ、２５Ｂ、２５Ｈ）では２００μｍ、図２５Ｃ、２５Ｄでは１００μｍ、図２５Ｅ、図２５Ｉ〜２５Ｋでは５０μｍ、図２５Ｆ、２５Ｇでは１５μｍを示す。 ニューロン前駆体の病変部位への遊走を示す図である。ＤＣＸ発現性細胞（橙色）が、ＹＦＰ発現性線維（緑色）の変質のある傷害領域に見られた。（図２６Ａ）、ＥＡＥマウス（ＧＡにより処置していない）において、疾患の誘発３５日後、線条体における。（図２６Ｂ〜２６Ｆ）ＥＡＥマウスにおいて、疾患誘発３５日後、ＧＡにより処置（疾患誘発直後に開始して、毎日の注射を８回−予防）。ＲＭＳから線条体における病変部に向かって分岐するＤＣＸ発現性細胞（図２６Ｂ）、線条体の病変部を取り囲んで（図２６Ｃ）、前頭部の皮質層５／６における病変部の内側（図２６Ｄ、２６Ｅ）、及び側坐核における病変部を取り囲む集団における（図２６Ｆ）。ＧＡ処置したマウスにおける病変部は、非処置のマウスにおけるほど広範ではなかったが、これらの病変部と隣り合う前駆体の量は広範に高かった。病変部中に伸長するＹＦＰ発現性線維、及びＤＣＸ発現性細胞により占められる病変部における軸索の出芽に留意されたい（図２６Ｄ〜２６Ｆ）。矢状切片。スケールバーは、図２６Ａ、２６Ｂでは１００μｍ、図２６Ｃ、２６Ｄ、２６Ｆでは５０μｍ、及び図２６Ｅでは２０μｍを示す。 ＧＡ誘発性のニューロンの前駆体は神経膠症の瘢痕領域に遊走し、ｉｎ ｓｉｔｕでＢＤＮＦを発現することを示す図である。図２７Ａ〜２７Ｃ、線条体においてＧＦＡＰ発現性星状細胞（赤色）が定住する領域における、ＤＣＸ発現性細胞（緑色）。図２７Ｄ〜２７Ｆ、ＤＣＸ発現性細胞（緑色）は、側坐核（図２７Ｄ、２７Ｅ）及び海馬の歯状回（図２７Ｆ）において、ＢＤＮＦ（橙色）の広範な発現を表している。冠状切片。スケールバーは、図２７Ａ〜２７Ｃでは１００μｍ、図２７Ｄでは５０μｍ、図２７Ｅでは１２μｍ、及び図２７Ｆでは３０μｍを示す。

Claims (11)

  1. 神経幹細胞又は神経前駆細胞の移植による幹細胞治療と組み合わせて、中枢神経系（ＣＮＳ）の傷害、疾患、障害、又は病状を治療するための薬剤組成物を調製するための、コポリマー１の使用。
  2. 前記ＣＮＳの傷害が、脊髄損傷、閉鎖性頭部外傷、鈍的外傷、穿通性外傷、出血性脳卒中、虚血性発作、脳虚血、視神経障害、心筋梗塞、及び腫瘍切除により引き起こされる傷害からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
  3. 前記疾患、障害、又は病状が、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項１に記載の使用。
  4. 前記薬剤組成物は、個体に、該個体への前記細胞の移植の前に、それと同時に、又はその後に投与される、請求項１から３の何れか１項に記載の使用。
  5. 前記薬剤組成物は、前記細胞の移植と同時に投与される、請求項４に記載の使用。
  6. コポリマー１を含む、神経幹細胞又は神経前駆細胞の移植による幹細胞治療と組み合わせて、中枢神経系（ＣＮＳ）の傷害、疾患、障害、又は病状を治療するための薬剤組成物。
  7. コポリマー１と組み合わせて、中枢神経系（ＣＮＳ）の傷害、疾患、障害、又は病状を治療するための、神経幹細胞又は神経前駆細胞を含む薬剤組成物。
  8. 前記ＣＮＳの傷害が、脊髄損傷、閉鎖性頭部外傷、鈍的外傷、穿通性外傷、出血性脳卒中、虚血性発作、脳虚血、視神経障害、心筋梗塞、及び腫瘍切除により引き起こされる傷害からなる群から選択される、請求項６又は７に記載の薬剤組成物。
  9. 前記疾患、障害、又は病状が、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項６又は７に記載の薬剤組成物。
  10. 個体に、該個体への前記細胞の移植の前に、それと同時に、又はその後に投与される、請求項７から９の何れか１項に記載の薬剤組成物。
  11. 前記細胞の移植と同時に投与される、請求項１０に記載の薬剤組成物。
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