JP2022537920A - 改良されたワクチン製剤 - Google Patents

Abstract

改良されたワクチン製剤に関し、具体的には、不要な免疫応答の治療又は予防に用いる、医薬的に適合可能な抗酸化剤、その医薬組成物及びワクチン組成物、並びにその臨床的適用及び生体外適用に関する。

Description

本発明は、自己免疫疾患及び慢性組織炎症に関連する疾患の治療に有用な、又は補充療法に用いられる生物学的ペプチドと併用投与される、還元性化合物が濃縮された、新規なワクチン組成物に関する。

自己免疫疾患は、自己抗原に指向する抗体の産生とリンパ球の活性化を特徴とし、標的臓器の機能が徐々に失われる。

自己免疫疾患の発症と継続には、自己抗体と自己反応性免疫細胞が関与していることが明らかになっており、非特異的な免疫抑制やサイトカインを標的とした抗体の投与による治療法が比較的有効であることも裏付けられているものの、当該疾患の治療法は確立されていない。このことは、自己免疫疾患の発生率が着実に上昇していることに加えて、極めて重大なアンメットメディカルニーズである。そのため、免疫システム全体に影響を与えずに自己免疫反応を抑制できる戦略が望まれている。

現在、自己免疫反応を選択的に抑制する戦略の定義は限定されている。
しかし、これらのアプローチは実際には非常に複雑で、一過性の効果しか得られない場合もあり、その有用性を示すことができない場合もある。

特許文献１（免疫原性ペプチド及び免疫疾患におけるその使用）は、レドックス（チオレダクターゼ）モチーフＣ－Ｘ－Ｘ－Ｃ（ここで、Ｃはシステインを表し、Ｘはいかなるアミノ酸を示す）を含むクラスＩＩ ＭＨＣエピトープが、細胞溶解特性を有するエピトープ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導に用いられるペプチド及び方法を記載する。活性化ＡＰＣ及びバイスタンダーＴ細胞の細胞溶解による除去は、免疫疾患、特に自己免疫疾患及びアレルギー疾患の治療に有効といわれる。これらのペプチドは、アミノ酸リンカーの有無にかかわらず、エピトープ配列の両側に共有結合アミド結合（ペプチド結合）により結合されたチオレダクターゼモチーフを含む。ＭＨＣクラスＩＩ分子の開放末端構造のため、クラスＩＩ制限因子の間隙配列を挿入する場合に制限される長さよりも、実際にはるかに長いペプチドを用いることができる。

顕性自己免疫疾患の分野では、慢性炎症を特徴とする多くの病態が存在するが、特異的自己抗原は説得力のある形では証明されていない。その一例が肥満である。当該病態では、脂肪組織の慢性炎症が顕著であり、最近では、当該炎症が抑制性Ｔ細胞の存在と逆相関していることが強く示唆されている。
自己免疫疾患以外にも、（注入された）生体分子に対する免疫反応も大きな問題であり、今のところ完全には解決されていない。

Ｔリンパ球は、自己免疫反応や組織特異的な炎症が発症する場合の重要な細胞である。抗原特異的Ｔ細胞は３つの系統に分かれており、活性化される制限因子によって定義される。ＣＤ４＋Ｔ細胞はＭＨＣクラスＩＩ複合体による提示の際に誘導され、ＣＤ８＋Ｔ細胞はＭＨＣクラスＩを介して活性化され、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞はＭＨＣ様ＣＤ１分子による提示によって活性化される。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、抗原又はそのエピトープにさらされると、抗原を処理してその表面に露出させ、特異的なＴ細胞の活性化させるというシナリオがあり、それは：（１）抗原特異的受容体（ＣＤ３）を介したＴ細胞が、ＡＰＣによって処理され、ＭＨＣ分子の関連で提示された抗原エピトープと接触すること（シグナル１）、（２）ＡＰＣ表面に発現したコスティミュレーショナルシグナルと、Ｔ細胞表面のそれぞれのリガンドまたは受容体との相互作用（シグナル２）、かつ、（３）ＡＰＣによるサイトカインやケモカイン等の可溶性因子の産生（シグナル３）；という３つの工程で構成される。

自己免疫疾患又は組織関連の慢性炎症の場合、不要な反応を抑制することを目的としたワクチン接種戦略は、これらのシグナルを考慮に入れている。つまり、内在性寛容は主にアジュバントを用いない場合に得られ、外在性寛容は活性化が起こるサイトカイン環境を操作することで得られる。
しかし、これらの方法には、複雑な疾患を治療するのに十分な汎用性や効力がない。

ますます多くの疾患の治療として投与される生物学的物質の有効性は、治療効果の中和、クリアランス速度の増加、並びに／又は血清病、アナフィラキシー反応及び皮膚発疹等の多様な過敏性反応の原因である免疫反応の出現によって制限されることが多い。このような反応を阻害することで、副作用が軽減され、生物学的物質の投与量が減り、したがって生物学的物質のコストが軽減され、より多くの患者が当該生物学的物質の恩恵を受けることができる。

特許文献２は、自己免疫疾患を治療するために自己抗原ペプチドを含むグルタチオン－コロネート化ナノ粒子を開示する。しかし、本文献から明らかなように、グルタチオンが当該粒子に取り込まれた場合、遊離の－ＳＨ基が当該粒子と反応し、共有結合によって埋め込まれるため、もはや抗酸化剤として適格ではない。
非特許文献１は、組織のコンパートメントの機能や、炎症性疾患との関係における、ＴＩＧＩＴの発現を開示する。しかしながら、本文献には、還元条件下で特定の抗原と接触した後のＴリンパ球のＴＩＧＩＴ発現の変動（すなわち、より高い表面発現）についての開示はない。
非特許文献２は、ミリモル濃度のグルタチオンを備える系を開示するが、ワクチン製剤の文脈ではない。

国際公開第２００８／０１７５１７号 国際公開第２０１６／１６２４９５号

Ｂｌｅｓｓｉｎ Ｎ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．， ２０１９， "Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ＴＩＧＩＴ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ Ｔｉｓｓｕｅ， Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ" ＤＩＳＥＡＳＥ ＭＡＲＫＥＲＳ， ｖｏｌ． ２０１９， ＩＳＳＮ： ０２７８－０２４０ Ｑｕｉｎｎ Ｊ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， ２０１７， "Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ" ＰＯＬＹＭＥＲ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ

本特許出願は、不要な免疫応答の治療又は予防に用いる医薬的に適合可能な抗酸化剤に関する。

前記医薬的に適合可能な抗酸化剤は、さらに、医薬用（注射可能な）ペプチド分子を含む医薬組成物（又は医薬キットの部分）中に存在する（組み込まれている）。前記医薬用（注射可能な）ペプチド分子は、好ましくは、自己免疫疾患及び／又は慢性炎症性疾患に関連する抗原エピトープ、抗体、補充療法用の生物学的物質（リソソーム酵素、サイトカイン、ホルモン、凝固因子）並びに補充療法用の前記生物学的物質の部分であるエピトープの群から選択される。

医薬用ペプチドが抗酸化剤の影響を受けるリスクがある場合、例えば、前記医薬用ペプチドが重要なジスルフィド結合を含む場合、前記医薬用ペプチドに不可逆的な影響を与えないように、前記医薬用抗酸化剤を穏和な条件下で取り込む。これを達成する1つの方法は、抗酸化剤を医薬キットの部分に組み込み、医薬用ペプチドと医薬用抗酸化剤を、患者への投与の直前に混合することである。

好ましくは、この医薬的に適合可能な抗酸化剤（場合によっては、前記医薬用ペプチド分子とともに）は、自己免疫疾患の治療や、補充療法で用いられるペプチド系の生物学的物質に対する耐性を誘導するのに用いられる。

有利には、前記医薬的に適合可能な抗酸化剤、又は前記医薬組成物は、皮下投与用である。

本発明に関する態様は、ペプチド系抗原及び医薬的に適合可能な抗酸化剤を含むワクチン組成物である。

本発明に関する態様は、前記ワクチン組成物は、さらに、ワクチンアジュバントを含み、より好ましくは、細菌性リポ多糖類、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ及び水酸化アルミニウムからなる群から選択されるワクチンアジュバントを含む。

有利には、前記ワクチン組成物（ペプチド系抗原及び医薬的に適合可能な抗酸化剤を含む）は、１型糖尿病、慢性炎症性脱髄性多発性神経炎（例えば、多発性硬化症）、神経筋接合部の疾患（例えば、重症筋無力症）、甲状腺の疾患（例えば、橋本病及びグレーブス病）、クローン病、潰瘍性直腸結腸炎、及びセリアック病を含む腸の炎症性疾患からなる群から選択される自己免疫疾患の治療に用いられる。

好ましくは、前記ワクチン組成物は局所注射用である。

好ましくは、（前記ワクチン組成物中に存在する）医薬的に適合可能な抗酸化剤は、（局所）注射部位の細胞外媒体を還元状態にするのに十分な量である。

本発明に関する態様は、生体外で（ｅｘ ｖｉｖｏ）Ｔリンパ球を特異的抗原に接触させる工程を含む、ＣＤ４、ＣＤ８及び／又はＮＫＴである抑制性抗原特異的Ｔリンパ球を誘発する、生体外方法であって、還元条件下で、好ましくは、ＴＩＧＩＴ、ＤＬＬ４及びＣＴＬＡ２からなる群から選択される分子の表面発現が高くなるように、及び／又はＩＬ－１３、ＩＬ－１０、プロスタグランジンＥ２、ＴＧＦ－β、アンフィレグリン、ＭＭＰ９及びＡＤＡＭ３３からなる群から選択される分子の高い分泌が高くなるように、処理されたリンパ球を選択する工程を含む。

逆に、本発明はまた、好ましくは医薬組成物の形態で、前記生体外方法で得られるＴリンパ球をも包含する。

本発明に関する他の態様は、哺乳類の被験体に影響を及ぼす自己免疫疾患又は慢性炎症性疾患（特定の組織の）を治療する方法であって、好ましくは、１型糖尿病、慢性炎症性脱髄性多発性神経炎（例えば、多発性硬化症）、神経筋接合部の疾患（例えば、重症筋無力症）、甲状腺の疾患（例えば、橋本病及びグレーブス病）、クローン病、潰瘍性直腸結腸炎、及びセリアック病等の腸の炎症性疾患、肥満、または患者に投与されたペプチド性生物学的分子に対する不要な免疫反応からなる群から選択され、前記自己免疫疾患又は前記ペプチド性生物学的分子から設計されたエピトープとともに、抗酸化性化合物（医薬的に許容される抗酸化性化合物）を、前記哺乳動物の被験体に局所投与する工程を含む。

本発明に関する他の態様は、生物学的製剤が必要な被験体に投与された前記生物学的製剤に対する、前記被験体の有害な免疫応答を予防及び／又は治療する方法であって、以下の：
－ 生物学的製剤に対して有害な免疫反応をおこしている被験体、又は生物学的製剤に対する有害な免疫反応を起こす危険性のある被験体を同定する工程；
－ 前記有害な免疫反応を引き起こす、または引き起こす可能性のある生物学的製剤のエピトープを同定する工程；
－ 前記エピトープを、抗酸化性化合物を含む医薬組成物に組み込む工程；
－ 前記抗酸化性化合物を含む前記医薬組成物を前記被験体に投与する工程であって、場合によっては、前記抗酸化性化合物を含む前記医薬組成物を前記被験体に投与する工程を繰り返す；かつ、
－ 前記生物学的製剤を前記被験体に投与する工程；
工程を含む、方法である。

好ましくは、ワクチンアジュバントが医薬組成物に添加される。

好ましくは、前記（医薬的に適合可能な）抗酸化性化合物は、０．１μＭ～５ｍＭ、好ましくは０．３μＭ～１ｍＭ、より好ましくは１μＭ～０．３ｍＭ、さらに好ましくは３μＭ～１００μＭ、又は５μＭ～５０μＭの濃度で存在する。

好ましくは、前記（医薬的に適合可能な）抗酸化性化合物は、Ｎ－アセチルシステイン（その塩を含む）、グルタチオン、チオレドキシン、チオレドキシン誘導体、グルタレドキシン、ペルオキシレドキシン、及びガンマインターフェロン誘導性リソソームチオールレダクターゼ（ＧＩＬＴ）及びそれらの混合物からなる群より選択され、好ましくは、前記抗酸化剤は、さらに、ＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨを含み、有利には、さらに、チオレダクターゼを、０．１μＭ～５ｍＭ、好ましくは０．３μＭ～１ｍＭ、より好ましくは１μＭ～０．３ｍＭ、さらに好ましくは３μＭ～１００μＭ、又は５μＭ～５０μＭ含む。

本発明者は、特にＴ細胞系ＣＤ４、ＣＤ８、及び／又はＮＫＴを特異的に標的とすることにより、免疫反応を微調整するいくつかの方法を初めて開発した。

本発明者は、ペプチド、さらにはワクチンアジュバントを含む局所注射用組成物に還元性化合物（少なくともジスルフィド結合を還元するのに十分な強度を有する）を加えることで、本発明の効果を高めることができるという予想外の発見をしたが、これは、自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の治療、又は、補充療法におけるペプチド性生物学的物質の併用、に特に有利である。驚くべきことに、補充療法用の生物学的ペプチド（ここでは、アジュバント非含有）（したがって、抗酸化剤）の局所注射は、皮下で行うことができる。アジュバントがない場合であっても、皮下空間に抗原提示細胞（ＡＰＣ）が高密度で存在するため、免疫応答を誘発するリスクが現実に存在する。つまり、本発明により、被験体への生物学的物質（ペプチドの形態）の投与がより簡便になり、及び／又は、経時的な効果が向上し、自己免疫疾患及び炎症性疾患を、副作用をほとんど伴わずに、さらに特異的に治療をすることができる。

従って、本発明の第一の態様は、不要な免疫応答の治療又は予防に用いる、医薬的に適合可能な抗酸化剤（少なくともペプチドのジスルフィド架橋を還元することができる）である。

好ましくは、当該医薬的に適合可能な抗酸化剤は、０．１μＭ～５ｍＭ、好ましくは０．３μＭ～１ｍＭ、より好ましくは１μＭ～０．３ｍＭ、さらに好ましくは３μＭ～１００μＭ、又は５μＭ～５０μＭの濃度で存在する（被験体に投与される）。

当該抗酸化剤は、好ましくは、Ｎ－アセチルシステイン、グルタチオン、チオレドキシン、チオレドキシン誘導体、グルタレドキシン、ペルオキシレドキシン、及びガンマインターフェロン誘導性リソソームチオールレダクターゼ（ＧＩＬＴ）及びそれらの混合物からなる群から選択される。

好ましくは、さらに、ＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨが存在し、有利には、さらに、チオレダクターゼを、０．１μＭ～５ｍＭ、好ましくは０．３μＭ～１ｍＭ、より好ましくは１μＭ～０．３ｍＭ、さらに好ましくは３μＭ～１００μＭ、又は５μＭ～５０μＭ含み、当該抗酸化性化合物の効果を高める。

特に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが存在する場合、チオレダクターゼ酵素をさらに添加することができる。

好ましくは、当該医薬的に適合可能な抗酸化剤は、医薬用ペプチド分子をさらに含む組成物中又は医薬キット中に存在するか、又は医薬用ペプチド分子を含む当該組成物と併用投与される。

当該医薬用ペプチド分子は、好ましくは、エピトープ（不要な免疫応答を阻害するワクチン接種等に用いられる、例えば自己抗原、又は肥満を含む慢性炎症性疾患（例えば、特定の組織に関連する）に関連する抗原）、抗体、補充療法用の生物学的物質（リソソーム酵素、サイトカイン、ホルモン、凝固因子等）の群から選択される。

ペプチドのサイズの範囲は、数個のアミノ酸から１０００個をはるかに超えるアミノ酸までである。実際、本発明のペプチドのいくつかは、通常７～５０個のアミノ酸のサイズの範囲を意味するエピトープ、又は２３００個のアミノ酸のサイズである凝固第ＶＩＩＩ因子や抗体等の生物学的分子である。

この薬学的に適合する抗酸化剤および／またはこの医薬組成物は、有利には、皮下経路（皮下）による投与に適するか、及び／又は適合する。

当該医薬的に適合可能な抗酸化剤は、自己免疫疾患の治療における使用、又は補充療法で用いられるペプチド系生物学的物質に対する耐性を誘導するのに有利である。

この方法では、有利なことに、ワクチンアジュバントを加えて寛容性の誘導と相乗効果を得られるものの、ワクチンアジュバントは免疫反応を高めるために使用されるため、本発明を用いない場合には、それは矛盾する。

本発明の抗酸化剤（（注射可能な）医薬組成物）により治療される自己免疫疾患としては、１型糖尿病、慢性炎症性脱髄性（多発性）神経炎（例えば、多発性硬化症）、神経筋接合部の疾患（例えば、重症筋無力症）、甲状腺の疾患（例えば、橋本病及びグレーブス病）、クローン病、潰瘍性直腸結腸炎、及びセリアック病を含む腸の炎症性疾患があげられる。また、本発明はまた、外傷又は虚血事象後の不要な炎症状態、並びに肥満を含む抗原に対する不要な応答に関連する慢性炎症（特定の組織の）の治療を包含する。

より一般的には、本発明の抗酸化剤（（注射可能な）医薬組成物）によって治療される自己免疫疾患としては、以下の:
－ 多臓器疾患：関節リウマチ、多発性筋炎、皮膚筋炎；
－ 内分泌系疾患：甲状腺炎、１型糖尿病、副腎炎、多発性内分泌症候群、下垂体炎；
－ 血液疾患：溶血性貧血、血小板減少性紫斑病、好中球減少症、再生不良性貧血、抗リン脂質症候群、血液凝固障害；
－ 神経系疾患：多発性硬化症、末梢神経障害、眼疾患、内耳疾患、重症筋無力症；
－ 腸疾患：クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、胃炎、悪性貧血等；
－ 皮膚疾患：天疱瘡、類天疱瘡、脱毛症、白斑、乾癬、蕁麻疹；
－ 腎疾患 グッドパスチャー病、ＡＮＣＡ関連糸球体腎炎；
－ 心肺疾患：心筋炎、壊死性動脈炎、血管拡張症；
－ 腫瘍随伴疾患（パラネオプラティック疾患）；
があげられる。

逆に、多数の疾患で用いられる生物学的物質の数は増加しているが、かなりの数の患者コホートが、遅かれ早かれ、当該ペプチド性生物学的物質に対する免疫反応を構築し、治療の効果が低下したり、治療を中止せざるを得なくなる。

本発明者の知見の結果として、本発明の抗酸化剤は、当該生物学的ペプチド分子に対する被験体患のこのような有害な免疫反応を阻害する場合、当該生物学的物質と相乗効果を発揮する。

これに関する態様では、本発明は、皮下又は筋肉内の経路で投与される生物学的物質にも適用しうる。

生物学的物質と抗酸化剤の併用は、２つの方法で実現できる。すなわち、両者を併用投与するか、又は最初にワクチンを接種し、つまり、生物学的物質のエピトープ（例えば、アミノ酸が７個のといった短いもの、又は、２０個、５０個、１００個、２００個、５００個、あるいは１０００個のアミノ酸よりもはるかに大きな分子のバグ）を抗酸化剤と併用投与して、当該生物学的物質に対する（確立された）有害な免疫反応を抑制した後、当該生物学的物質を投与する（有害な免疫反応を確実にできるだけ低下させるため、抗酸化剤と併用投与する場合もある）。ジスルフィド結合がある生物学的物質は、医薬品である抗酸化剤がジスルフィド結合を不可逆的に破壊しないように留意する。そのため、これを避ける便利な方法は、患者に投与するまで２つの化合物を分離しておく（例えば、キット中の部品の２つの異なるバイアルに入れておくなど）のが便利な方法である。

本発明の抗酸化性化合物と併用する生物学的物質、すなわち注射可能な生物学的物質としては、以下の：
－ 第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、スタフィロキナーゼ等の凝固・線溶系障害の補充療法；
－ 成長ホルモンやインスリン等のホルモン類；
－ サイトカイン類及びインターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ等の成長因子；
－ 抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ２０抗体、抗サイトカイン又はサイトカイン受容体抗体、並びに抗チェックポイント阻害剤等の免疫応答を調節する抗体；
－ 腎不全時のエリスロポエチン；
－ リソソーム蓄積疾患用リソソーム酵素；
－ 遺伝子治療用ウイルスベクター；
－ 遺伝子編集用ヌクレアーゼ；
があげられる。

本発明に関する他の態様は、ペプチド系抗原及び医薬的に適合可能な抗酸化剤（少なくともジスルフィド架橋を還元できる）を含むワクチン組成物である。

当該ワクチン組成物は、好ましくは１型糖尿病、慢性炎症性脱髄性（多発性）神経炎（例えば、多発性硬化症）、神経筋接合部の疾患（例えば、重症筋無力症）、甲状腺の疾患（例えば、橋本病及びグレーブス病）、クローン病、潰瘍性直腸結腸炎、及びセリアック病を含む腸の炎症性疾患からなる群から選択される特定の組織の慢性炎症性疾患を含む慢性炎症性疾患の治療用に有利である。

当該ワクチン組成物は、局所（皮下）注射用であるのが好ましく、すなわち、医薬的に適合可能な抗酸化剤は、注射部位の細胞外媒体を還元状態にするのに十分な量、及び／又は免疫シナプス中の遊離チオール残基を維持するのに十分な量である。

好ましくは、医薬的に適合可能な抗酸化剤の濃度は、当該ワクチン組成物中に、０．１μＭ～５ｍＭ、好ましくは０．３μＭ～１ｍＭ、より好ましくは１μＭ～０．３ｍＭ、さらに好ましくは３μＭ～１００μＭ、又は５μＭ～５０μＭで存在する。

当該抗酸化剤は、好ましくは、グルタチオン、チオレドキシン、チオレドキシン誘導体、グルタレドキシン、ペルオキシレドキシン及びガンマインターフェロン誘導性リソソームチオールレダクターゼ（ＧＩＬＴ）及びそれらの混合物からなる群から選択される。

好ましくは、ＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨが、有利には０．１μＭ～５ｍＭ、好ましくは０．３μｍ～１ｍＭ、より好ましくは１μＭ～０．３ｍＭ、さらに好ましくは３μＭ～１００μＭ、又は５μＭ～５０μＭの濃度で含む濃度で、当該組成物に添加され、上記の抗酸化剤の効果を高める。

ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが存在する場合、チオレダクターゼ酵素が当該組成物に添加されることができる。

好ましくは、当該ワクチン組成物は、さらに、ワクチンアジュバントを含む。

本発明の文脈では、用語「ワクチンアジュバント」は、好ましくは、免疫細胞の受容体、例えば、パターン認識受容体に作用する分子をいう。好ましいワクチンアジュバントとしては、水酸化アルミニウムや尿素等のクリスタル、リポ多糖類（ＬＰＳ）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡを含むＲＮＡ、あるいはＤＮＡ等のＴｏｌｌ様受容体活性化剤があげられる。好ましくは、ワクチン接種用の油及び乳化剤は、本発明の文脈ではワクチンアジュバントとはみなされない。より好ましくは、本発明の組成物は、油中水エマルジョン又は水中油エマルジョンの形態ではない。

本発明のさらなる他の態様は、ＣＤ４、ＣＤ８及び／又はＮＫＴである抑制性抗原特異的Ｔリンパ球を誘発する、生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）方法であって、生体外のＴリンパ球を、還元条件下で、特異的抗原、並びに当該方法で得られるTリンパ球、又は当該Tリンパ球を含む医薬組成物、に接触させる工程を含む、方法、である。

本発明によって（生体内ワクチン接種又は生体外により）得られる細胞の特性の一例を示す。

本発明によるワクチン接種によって得られるＣＤ４＋Ｔ細胞は、１の還元剤又は当該薬剤の組み合わせを添加しても、ＦｏｘＰ３転写因子を発現せず、以下の特性：
－ 単球に作用して、ＩＬ－６、ＩＬ－１α、ＬＩＦの産生を抑制するＩＬ－１３の産生による炎症の抑制；
－ 転写因子ＲＯＲα（ＮＲ１Ｆ１）の発現による、ＩＬ－１β、ＴＮＦ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１等の炎症誘発性サイトカインの産生の抑制；
－ アルギニン１の産生による、調節機能を備える骨髄系細胞の惹起及び調整；
－ ＩＬ－１０、プロスタグランジンＥ２、ＴＧＦ－βの産生による調節性Ｔ細胞の産生；
－ プロスタグランジンＥ２を基質とした、調節性Ｔ細胞による、従来のＴ細胞の活性化抑制機能の発揮；
－ アンフィレグリンの産生による組織修復への関与；
－ ＭＭＰ９等のメタロプロテアーゼやＡＤＡＭ３３等のＡＤＡＭを産生することによる、抗炎症作用、血管新生促進作用、組織修復作用の発揮；
－ キチナーゼ３様３等のキチナーゼ様タンパク質の産生又はヒトの同等の遺伝子の産物による、マクロファージへの抗炎症作用（Ｍ２化）を発揮することによる、修復機構及び組織再生の活性化；
－ 神経発生や軸索伸長のための前駆細胞、筋細胞修復のための筋細胞、軟骨再構築のための軟骨細胞の分化を促進するメテオリンの産生；
のうちの１つ以上（好ましくは、少なくとも２つ）を付与する多くの特性を示す。

さらに、当該細胞は、ＴＩＧＩＴ、ＤＬＬ４、ＣＴＬＡ２等の抑制機能に関与する様々な表面分子を発現する。
〔実施例〕

慢性炎症性脱髄性多発性神経炎（ＣＩＤＰ）の治療用の抑制性ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導
ミエリンタンパク質ゼロ（０）（ミエリン０）は、末梢神経系で発現する。ミエリン０に対する自己免疫反応は、慢性炎症性脱髄性多発性神経炎（ＣＩＤＰ）の発症の原因であり、自己反応性ＣＤ４＋Ｔリンパ球が関与する。

ＮＯＤ系統のマウス（主に雌）は、Ｂ７．２ ＫＯ亜系統のヒト病理を模倣した自然発生ＣＩＰＤに感受性であるが、能動免疫が行われると数週間以内に発症する。ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化に関連する主要なミエリン０エピトープの１つは、タンパク質の１８０－１９９カルボキシ末端に位置している。

配列ＳＳＫＲＧＲＱＴＰＶＬＹＡＭＬＤＨＳＲＳ（配列番号１）をペプチドは、化学合成により作製される。
配列番号１のペプチド１００μｇを水酸化アルミニウムと混合し、５０μＭのグルタチオンを添加して、ワクチン接種用製剤を調製する。
当該製剤を、Ｂ７．２ ＫＯ雌ＮＯＤマウスの群において、１週間間隔で４回皮下注射する。Ｂ７．２ ＫＯ雌ＮＯＤマウスの対照群には、水酸化アルミニウムと混合したペプチド１００μｇを注射する。
マウスを定期的に観察し、弛緩性尾部の発生、麻痺の範囲と強度等の神経障害の兆候を確認する。最終注射から６週間後に神経障害の徴候について最終評価を行い、神経障害の組織学的徴候の評価及びＴリンパ球の特性評価のためにマウスを屠殺する。

その結果、グルタチオンを含むペプチド製剤を接種したマウスには神経障害の兆候が見られず、グルタチオンを添加せずに接種した対照マウスの１００％に神経障害の兆候が見られたことが示された。

坐骨神経の切片を、ホルムアルデヒドで固定した後、組織学的検査用に調製する。ヘマトキシリン及びエオシンで染色すると、神経末端に濃縮後、細胞の浸潤が見られた。浸潤の強度に応じて０～３のスコアを設定する。抗ＣＤ３抗体で染色すると、Ｔリンパ球が同定される。驚くべきことに、グルタチオンを含む製剤で治療したマウスの細胞浸潤の平均スコアは１と算出されたが、グルタチオンを含まないワクチン製剤で治療したすべてのマウスのスコアは、３となった。

脱髄はＬｕｘｏｌ ｆａｓｔ ｂｌｕｅで染色した切片で評価した。グルタチオン投与群では実質的なミエリンの分節化は見られなかったが、対照マウスから得られたすべての神経切片で当該分節化が観察された。

各群からＣＤ４＋脾細胞Ｔ細胞を調製し、配列番号１のペプチドによる培養物中で活性化試験を行った。対照群では、ＩＦＮ－の産生及びＴｂｅｔ （Ｔｂｘ２１）転写因子の発現によって特徴づけられるように、ペプチドに特異的なＴｈ１細胞が得られた。一方、グルタチオンを投与したマウス群では、得られたＴ細胞は、エフェクターメモリー細胞（ＣＤ６２Ｌ（－））とＡＲＥＧ（アンフォレグリン）、ＴＩＧＩＴ及びＤＬＬ４を含む表面マーカーを発現していることが特徴付けられる。転写レベルでは、細胞はＦｏｘｐ３（－）、ＩＬ－１０＋、ＩＬ－１３＋、ＰＧＥ２＋である。

したがって、ワクチン製剤にグルタチオンを添加するのは、組織に蓄積して抗炎症作用と治癒作用を発揮することができる、抗炎症作用と抑制作用を備えるＴ細胞の集団を誘発するのに十分である、と結論づけられた。

１型糖尿病モデルにおける抑制性ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導
ヒトの１型糖尿病は、インスリンエピトープの提示により活性化されたクラスＩ制限のＣＤ８＋Ｔ細胞が存在し、膵島のβ細胞を破壊する細胞傷害活性を発揮することが特徴である。マウスの１型糖尿病自然発症モデル（ＮＯＤ系統）は、基本的にクラスＩＩ制限のＣＤ４＋Ｔ細胞によって駆動されるため、ラットプロインスリン（ＲＩＰ）のプロモーター下で膵島にオボアルブミンを発現させた動物モデルを用いた。そして、クラスＩ制限のあるオボアルブミンエピトープの受容体を導入したＯＴ－Ｉ細胞（これによりＣＤ８＋Ｔ細胞に分類される）を用いて、β細胞の破壊と糖尿病を誘発する。

オボアルブミンのクラスＩ制限エピトープに対するＣＤ８＋Ｔ細胞を保有するＯＴ－Ｉ Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、エピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ、配列番号２）を投与して処置した。試験群では、水酸化アルミニウム中に１００μｇのペプチドを含む製剤、並びにグルタチオン（５０μＭ）及びＮＡＤＰＨ（５０μＭ）をで作製された還元性化合物とを含む製剤を用いて、当該投与を皮下（ＳＣ）経路で行った。対照群では，グルタチオン及びＮＡＤＰＨを用いない以外は同じ手順を用いた。

１０日間隔で３回の注射を行った後、マウスを屠殺し、個々の脾臓細胞集団を調製した。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、２サイクルの刺激後にインビトロで調製し、特徴付けた。対照群から得られた細胞は、ＣＤ１０３の発現、グランザイムＢ及びパーフォリンに対する陽性細胞内染色を含む活性化及び細胞毒性の徴候を示した。一方、グルタチオン及びＮＡＤＰＨの存在下で免疫化したマウス由来の細胞は、ＣＴＬＡ２及びＴＩＧＩＴ等のマーカーを発現し、抑制表現型を示した。

膵島でＯＶＡを発現するＲＩＰ‐ＯＶＡマウスにＣＤ８＋Ｔ細胞の各調製物を静脈内（ＩＶ）投与した（５０×１０^３細胞）。対照群のＣＤ８＋Ｔ細胞で再構成したマウスは全て、血糖値で評価される糖尿病を急速に発症した。グルタチオンとＮＡＤＰＨを含む製剤で処理したＯＴ－１マウス由来のＣＤ８＋Ｔ細胞を投与された少数のマウスは、軽度の糖尿病を遅延して発症した。

したがって、グルタチオン及びNADPHの混合物の存在下でＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することは、インスリン依存性糖尿病との関連で、当該細胞の細胞毒性能を劇的に低下させるのに十分であると結論された。

マウスモデルにおける重症筋無力症の予防
重症筋無力症（ＭＧ）は、進行性の筋力低下と呼吸困難をもたらす神経筋接合部の自己免疫発作を特徴とする。自己免疫反応の枠組みの中で産生される病原性抗体は、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡｃｈＲ）、ＬＲＰ４、Ｍｕｓｋ、及びアグリンを含む神経筋接合部の様々な構成要素に指向される。

実験的には、当該受容体に対して産生された抗体がラット又はマウスの受容体と交差反応する限り、Ｔｏｒｐｅｄｏ魚類のアセチルコリン受容体を免疫することで、ＭＧをラット又はマウスにおいて誘導することができる。
マウスｎＡｃｈＲの配列は、ＭＨＣ様ＣＤ１ｄ分子によって提示されるエピトープを含む。当該エピトープの配列は、ＦＡＩ ＶＫＦ ＴＫＶ ＬＬ（１００－１１０：配列番号３）である。
対照のＣ５７ＢＬ／６マウス群は、水酸化アルミニウムに吸着させた配列番号３のペプチド１００μｇを、１０日の間隔をおいて、腹腔内（ＩＰ）経路（ＮＫＴ細胞が豊富に存在する体部）で２回注射して処置する。第２群は、同じプロトコールで処置するが、製剤にＧＩＬＴ（ガンマインターフェロン誘導性リソソームチオールレダクターゼ、５０μＭ）を加える。
最終ＩＰ注射の１０日後に、両グループのマウスに、両群のマウスをフロイントアジュバントで乳化したＴｏｒｐｅｄｏ ＡｃｈＲ ２０μｇで皮下投与で免疫化する。４週間後、不完全フロイントアジュバントを用いて、さらに２０μｇを１回注射する。

最後にＴｏｒｐｅｄｏ ＡｃｈＲを注射してから６週間後、筋力低下の最初の兆候が観察され、０（正常）、１（運動後の脱力感、運動能力の低下）、２（安静時の脱力感）、３（衰弱、脱水、麻痺）のスコアに従って等級付けされる。対照製剤を投与したマウスのスコアは２から３の間に広がるが、ＧＩＬＴを含む製剤を投与したマウスのスコアは０又は１であることが示された。
観察期間終了時（３ヶ月、ただしスコア３のマウスはそのスコアに達した時点で屠殺）に個々のマウスから血清を採取し、ＡｃｈＲに対する特異的抗体を評価した。これは、Ｔｏｒｐｅｄｏ ＡｃｈＲをポリスチレンプレートにコーティングし、個々の血清の連続希釈液を用いてインキュベートして、ＥＬＩＳＡで実施される。血清１ｍｌ当たりの総ＩｇＧ抗体の平均濃度は、対照群で２００μｇであることが観察されるのに対し、ＧＩＬＴの存在下で配列番号３のペプチドで事前免疫したマウス群では１２μｇの総ＩｇＧが観察される。

試験的セリアック病における抗グリアジン免疫応答の予防
セリアック病は、グルテンの成分であるグリアジンのエピトープに対する自己免疫反応に起因する。特に、α－グリアジン断片α－１／α－２（ＱＬＱ ＰＦＰ ＱＰＥ ＬＰＹ ＰＱＰ ＱＳ；配列番号４）のエピトープ５７－７３は、カルシウムの存在下でトランスグルタミナーゼにより４位（下線が引かれたコア配列）で脱アミド化され、ヒトＤＱ２．５のＨＬＡ分子との親和性が高くなる。これにより、クラスＩＩ制限Ｔ細胞が活性化され、セリアック病の症状の起点となる腸管粘膜に炎症が発生する。

セリアック病の直接的なモデルマウスは存在しない。しかし、免疫病理学の少なくとも一部を解明し、新しい治療法の可能性を見出すのに適したトランスジェニックモデルがいくつか報告されている。ヒトヒトＤＲ３－ＤＱ２．５ ＭＨＣハプロタイプを発現するトランスジェニックマウスを用いて、グリアジンエピトープに対する耐性が得られるか否かを実証できる。

７位でグルタミン（Ｑ）が荷電グルタミン酸残基（Ｅ）に置換されたペプチドの脱アミド化バージョンを用いて、配列番号４のペプチドが組織トランスグルタミナーゼという酵素によって天然に脱アミド化されるというヒトの状況を模倣する。

配列番号５：ＱＬＱ ＰＦＰ ＥＰＥ ＬＰＹ ＰＱＰ ＱＳ
Ｃ５７ＢＬ／６ ＤＲ３－ＤＱ２トランスジェニックマウスを、フロイントアジュバント中で乳化された配列番号５のペプチド５０μｇを用いて免疫化し、足蹠に注射する。不完全フロイントアジュバント５０μｇを２週間後に再度注射する。１ヵ月後、マウスを屠殺し、Ｔ細胞刺激アッセイのために脾細胞を調製する。このため、脾細胞集団由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を、特異的抗ＣＤ４＋抗体を用いるＦＡＣＳソーティングで調製する。次いで、これらを、免疫化に用いるペプチド（配列番号５）を負荷した樹状細胞の存在下でインキュベートし、培養１週間後に、ペプチド特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在を検出する。第２群のマウスも同様に処理するが、免疫期間終期に、ペプチドを耳下注射し、３日後の局所腫脹反応の発現を遅延型過敏反応の存在として読み取る。

実験群のマウスには、まず、水酸化アルミニウム及び１００μＭのグルタチオンを混合した１００μｇを用いて、配列番号５のペプチドを皮下注射する。当該注射を１０日間隔で４回行う。最終注射から１５日後に、対照群と同様の足蹠（そくせき）免疫法を開始する。脾細胞由来のＣＤ４＋細胞は、配列番号５のペプチドの脱アミド化バージョンの存在下では増殖しないことが示された。さらに、遅延型反応の検査はこの群では陰性のままである。

したがって、還元剤の存在下でグリアジンエピトープを免疫化すると、強力なアジュバントを用いた能動的全身（フットパス）免疫化と関連してさえ、当該エピトープに対する耐性を誘導するのに十分であると結論された。

皮下投与された血液凝固第ＶＩＩＩ因子に対する免疫の阻害
凝固第ＶＩＩＩ因子に対する抗体の発現は、依然として血友病Ａ患者の治療における主要な副作用である。当該抗体は、第ＶＩＩＩ因子の機能的活性を中和する可能性があり（インヒビター抗体という）、それによって患者は重度の出血リスクにさらされる。
第ＶＩＩＩ因子は、自然免疫反応と適応免疫反応の両方で特徴づけられるように、免疫原性がある。国際公開第２０１２／０６９５７５号は、ＭＨＣ様ＣＤ１ｄ分子が提示する第ＶＩＩＩ因子エピトープを欠失させて、インヒビター抗体を誘発するリスクを排除する方法を記載する。
しかし、最近の血友病Ａ患者の治療では、静脈内投与ではなく皮下投与用の第ＶＩＩＩ因子製剤が用いられている。皮下投与は、マクロファージや樹状細胞等の抗原提示細胞が高密度に存在するため、静脈内投与よりも免疫原性が高いとされている。

ペグ化したヒト遺伝子組み換え（ｒ）第ＶＩＩＩ因子を、第ＶＩＩＩ因子ＫＯマウスに、１００ＩＵ／ｋｇの用量で週２回、計６週間皮下投与した。

血友病Ａマウスの対照群には、第ＶＩＩＩ因子製剤（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号 ＡＡＡ５２４８４．１；配列番号６）を投与し、被験群には、２００μＭのグルタチオンを添加した同じ製剤を投与した。６週間後、マウスを採血し、固相ＥＬＩＳＡ法により抗因子ＶＩＩＩ抗体の濃度を測定し、市販の発色性アッセイを用いてインヒビターの濃度を測定する。抗体の測定結果は、第ＶＩＩＩ因子特異的モノクローナル抗体を連続希釈して得られた蛍光のレベルを参考にして、任意単位／ｍｌで表される。インヒビターアッセイの結果は、ベセスダ単位／ｍｌで表される。
ｒ第ＶＩＩＩ因子を注射したマウスでは、平均７５０μｇ／ｍｌの抗第ＶＩＩＩ因子抗体及び平均１２００ＢＵ／ｍｌのインヒビター力価が生じたことが示された。グルタチオン含有第ＶＩＩＩ因子製剤を投与されたマウスでは、平均１５０μｇ／ｍｌの抗第ＶＩＩＩ因子抗体のインヒビター力価平均２２５ＢＵ／ｍｌのインヒビター力価が生じたことが示された。

したがって、第ＶＩＩＩ因子製剤に還元性化合物を添加すると、第ＶＩＩＩ因子特異的な免疫反応が十分著しく低下すると結論づけられた。第ＶＩＩＩ因子に対する免疫反応は、特定のＮＫＴ細胞の連続的な活性化を含むので、還元性化合物には、特定のＮＫＴ細胞の活性化を防止する機能があることがさらに結論付けられた。

マウスモデルにおけるＴＮＦ－αに対する抗体の毒性の長期的評価
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αに対する抗体は、関節リウマチ等の多くの慢性炎症性疾患の治療に一般的に用いられる（重鎖Ｆａｂ断片、配列番号７；軽鎖Ｆａｂ断片、配列番号８）。大多数の患者には有効であるが、当該抗体を反復投与すると、感染症や腫瘍の発生のリスクが高まる。市販の抗ＴＮＦα抗体は、ＴＮＦαの全活性を抑制するわけではないが、調節性Ｔ細胞の活性化に必要なＴＮＦ受容体２（ＴＮＦＲ２）へのＴＮＦの結合を抑制するという事実から、今日では、当該合併症を発症するリスクのある患者を特定することはできない。さらに、ＴＮＦ－αの濃度は、抗体の有無にかかわらず、ＴＮＦ－α／抗ＴＮＦ－α複合体が残存するため、患者間でかなりのばらつきがある。

抗ＴＮＦα抗体を投与した場合の長期的な経過を予測することができる動物モデルがあれば、単一の標的に対するＴＮＦαを評価するために遺伝子操作を行うことができる等、非常に有用であろう。しかし、動物に抗ＴＮＦα抗体を投与すると、すぐに免疫反応が起こり、効果の長期的な評価ができない。このことは、臨床使用を模した皮下投与の場合に特に重要である。

Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスに、５０μｇの抗ＴＮＦα抗体を１週間間隔で４回注射した。対照群には臨床で用いられる抗体製剤を投与し、もう１つのマウス群には同じ製剤を投与したが、注射ごとに５０μＭのグルタチオンを加えた。

最終注射から４週間後、グルタチオン含有製剤を投与したマウス群では、ＴＮＦ－αと抗ＴＮＦ－α抗体の循環複合体のレベルが高水準（平均２００ｎｇ／ｍｌ）に保たれているのに対し、対照群ではＴＮＦ－α／抗ＴＮＦ－α抗体の濃度が大幅に低下（平均７ｎｇ／ｍｌ）したことが示された。

この結果は、対照群では、抗体が誘導されることにより、循環系から抗ＴＮＦ－α／ＴＮＦ－α複合体が速やかにクリアランスされていることを示していると解釈される。この結論は、抗ＴＮＦα抗体を用いてプレートをコーティングした後、マウス血清で希釈し、ヒト抗ＴＮＦα抗体に結合したマウス抗体を検出する固相ＥＬＩＳＡ法で確認された。グルタチオン製剤を投与した群では平均６個／ｍｌの任意単位が見られ、対照群では平均１４５個／ｍｌが算出される。

したがって、抗ＴＮＦ－α抗体製剤に還元性化合物を添加すると、その免疫原性を大幅に低下させるのに有効である。

Claims (15)

1. 不要な免疫応答の治療又は予防に用いる医薬的に適合可能な抗酸化剤。
2. 医薬用ペプチド分子をさらに含む、医薬組成物中に存在するか、又は医薬キットの部分に組み込まれている、請求項１に記載の医薬的に適合可能な抗酸化剤であって、前記医薬用ペプチド分子は、好ましくは、自己免疫疾患及び／又は慢性炎症性疾患に関連する抗原、注射可能な生物学的物質及び前記生物学的物質の部分であるエピトープの群から選択される、医薬的に適合可能な抗酸化剤。
3. 自己免疫疾患の治療に、好ましくはワクチンアジュバントとともに、又はペプチド系の生物学的物質に対する耐性の誘導に、用いる、請求項１又は請求項２に記載の医薬的に適合可能な抗酸化剤。
4. 皮下経路で投与される、請求項１に記載の医薬的に適合可能な抗酸化剤、請求項２又は請求項３に記載の医薬組成物又は医薬キットの部分。
5. ペプチド系抗原及び医薬的に適合可能な抗酸化剤を含む、ワクチン組成物。
6. 好ましくは、１型糖尿病、慢性炎症性脱髄性多発性神経炎（例えば、多発性硬化症）、神経筋接合部の疾患（例えば、重症筋無力症）、甲状腺の疾患（例えば、橋本病及びグレーブス病）、クローン病、潰瘍性直腸結腸炎、及びセリアック病を含む腸の炎症性疾患からなる群から選択される自己免疫疾患の治療に用いる、請求項５に記載のワクチン組成物。
7. 局所注射用である、請求項５又は６に記載のワクチン組成物であって、ここで、前記医薬的に適合可能な抗酸化剤は、注射部位の細胞外媒体を還元状態にするのに十分な量である、ワクチン組成物。
8. さらに、好ましくは、細菌性リポ多糖類、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ及び水酸化アルミニウムからなる群から選択されるワクチンアジュバントを含む、請求項５～７のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
9. 生体外で（ｅｘ ｖｉｖｏ）Ｔリンパ球を特異的抗原に接触させる工程を含む、ＣＤ４、ＣＤ８及び／又はＮＫＴである抑制性抗原特異的Ｔリンパ球を誘発する、生体外方法であって、還元条件下で、好ましくは、ＴＩＧＩＴ、ＤＬＬ４及びＣＴＬＡ２からなる群から選択される分子の表面発現が高くなるように、及び／又はＩＬ－１３、ＩＬ－１０、プロスタグランジンＥ２、ＴＧＦ－β、アンフィレグリン、ＭＭＰ９及びＡＤＡＭ３３からなる群から選択される分子の高い分泌が高くなるように、処理されたリンパ球を選択する工程を含む、生体外方法。
10. 請求項９記載の方法で得られる、Ｔリンパ球。
11. 請求項１０に記載のＴリンパ球を含む、医薬組成物。
12. 濃度が、０．１μＭ～５ｍＭ、好ましくは０．３μＭ～１ｍＭ、より好ましくは１μＭ～０．３ｍＭ、さらに好ましくは３μＭ～１００μＭ、又は５μＭ～５０μＭで含まれる、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗酸化剤。
13. Ｎ－アセチルシステイン、グルタチオン、チオレドキシン、チオレドキシン誘導体、グルタレドキシン、ペルオキシレドキシン及びガンマインターフェロン誘導性リソソームチオールレダクターゼ（ＧＩＬＴ）及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１～３及び１２のいずれか一項に記載の抗酸化剤。
14. さらに、ＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨを、有利には０．１μＭ～５ｍＭ、好ましくは０．３μｍ～１ｍＭ、より好ましくは１μＭ～０．３ｍＭ、さらに好ましくは３μＭ～１００μＭ、又は５μＭ～５０μＭの濃度で含む、請求項１３に記載の抗酸化剤。
15. さらに、チオレダクターゼを含む、請求項１３又は１４に記載の抗酸化剤。