DE10306075A1 - Neue Antioxidantien, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft neue Antioxidantien mit der Formel I, worin R1 und R2 = Methyl, Ethyl, Propyl oder Butyl und R3, R4 und R5 = H, OH oder OCH¶3¶ bedeuten. Verbindungen der Formel 1 werden durch Fermentation eines Mikroorganismus, des Hyphomyceten Malbranchea cinnamomea DSM 15381, gebildet, durch übliche Methoden aus der Kulturbrühe gewonnen und in reiner Form zur Verfügung gestellt. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung von Verbindungen der Formel 1 für die Herstellung von antiinflammatorisch und antioxidativ wirksamen Arzneimitteln. DOLLAR F1

Description

• Die Erfindung betrifft neue Antioxidantien, die ein Mikroorganismus auf fermentativem Wege produziert und die als solche zur Anwendung gebracht werden.
• Oxidative Prozesse, die entweder im Stoffwechsel selbst stattfinden oder bestimmte Xenobiotika setzen radikalische Sauerstoffspezies, wie Singulett-Sauerstoff, Superoxidanion und Hydroxylradikale frei, die mit biologischen Makromolekülen, wie DNA, Proteinen und Polysacchariden sowie niedermolekularen Zellbestandteilen, reagieren und diese schädigen. Die Entstehung reaktiver Sauerstoffspezies wird ursächlich oder indirekt mit der Entstehung verschiedener Krankheiten, wie z.B. chronischen Entzündungen (Arthritis), Herz-Kreislauferkrankungen (Arteriosklerose), Demenz (z.B. Alzheimer-Syndrom) und Autoimmunerkrankungen (z.B. Asthma bronchiale), in Verbindung gebracht. Reaktive Sauerstoffspezies werden ferner als eine wesentliche Ursache des Alterns angesehen. Antioxidative Substanzen werden daher sowohl als Lebensmittelzusatzstoffe zur Prävention antioxidativer Prozesse als auch zur therapeutischen Behandlung eingesetzt. Zum Einsatz gelangen Präparate aus Pflanzen (Chapman & Hall, Dictionary of Natural Products on CD-ROM, Chapman & Hall, London, Ed. 2002), Mikroorganismen (H. Laatsch, Antibase, Database of Microbial Metabolites) sowie Synthetika. Die bisher verwendeten und bekannten antioxidativ wirksamen Stoffe weisen eine Reihe von Nachteilen auf, wie ungenügende Wirksamkeit, unvorteilhafte Pharmakokinetik, Nebenwirkungen und zu hohe Herstellungskosten. Daher besteht die Notwendigkeit, nach neuen Antioxidantien zu suchen, die potentiell verbesserte Eigenschaften aufweisen.
• Die Erfindung betrifft neue Antioxidantien mit der allgemeinen Formel 1,

  

  worin R₁ und R₂ unabhängig voneinander Methyl, Ethyl, Propyl oder Butyl und R₃, R₄ und R₅ unabhängig voneinander H, OH oder OCH₃ bedeuten.
• Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel 1 durch Fermentation des Hyphomyceten Malbranchea cinnamomea HKI 0286 (DSM 15381) sowie die Gewinnung von Verbindungen der allgemeinen Formel 1 aus der Kulturbrühe durch dem Fachmann bekannte Methoden. Ferner betrifft die Verbindung die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel 1 als pharmakologisch wirksame Stoffe und Lebensmittelzusätze, insbesondere Antioxidantien. Arzneimittel, die eine oder mehrere Verbindungen der allgemeinen Formel 1 enthalten, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
• Als Kulturbrühe wird das Nährmedium, welches das darin gewachsene Pilzmyzel enthält, bezeichnet. Der Mikroorganismus wurde nach den Vorschriften des Budapester Vertrages unter der Bezeichnung Malbranchea cinnamomea HKI 0286 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) in Braunschweig, Mascheroder Weg 1b, am 20. 12. 2002 hinterlegt. Er trägt die Hinterlegungsnummer DSM 15381.
• In einem Medium mit einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffqulle und den üblichen Mineralsalzen produziert Malbranchea cinnamomea DSM 15381 die erfindungsgemäßen Substanzen der allgemeinen Formel 1. Anstelle des Stammes Malbranchea cinnamomea DSM 15381 können auch dessen Mutanten und Varianten eingesetzt werden. Als Mutanten und Varianten gelten alle jene Mikroorganismen der Spezies, die in der Lage sind, die erfindungsgemäßen Verbindungen zu synthetisieren. Solche Mutanten können in an sich bekannter Weise durch physikalische Mittel, beispielsweise Bestrahlung mit Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen, oder chemische Mutagene erzeugt werden.
• Das Screening nach Mutanten und Varianten, die die erfindungsgemäßen Verbindungen synthetisieren, kann durch Bestimmung der biologischen Aktivität der in der Kulturbrühe angehäuften Wirkstoffe durch Austesten der antioxidativen Wirkung mittels Bestimmung der Inhibitionswirkung auf die polymorphonucleare Lymphozyten-generierte Freisetzung von Sauerstoffradikalen anhand der dem Fachmann bekannten Methoden durchgeführt werden.
• Als bevorzugte Kohlenstoffquelle für die aerobe Fermentation eignen sich assimilierbare Kohlenhydrate und Zuckeralkohole, wie z.B. Glucose, Lactose, Glycerol, Mannitol oder deren Gemische sowie kohlenhydrathaltige Naturprodukte, wie Malzextrakt.
• Als Stickstoffquelle eignen sich Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Tryptone oder Peptone, ferner Fleischextrakte, gemahlene Samen, beispielsweise von Mais, Weizen, Bohnen, Soja oder der Baumwollpflanze, Destillations rückstände der Alkoholherstellung, Fischmehle oder Hefeextrakte, aber auch Ammoniumsalze und Nitrate.
• Die Bildung der Substanzen entsprechend der allgemeinen Strukturformel 1 erfolgt gut in Nährmedien, die 0,2–6 % Glycerol, bevorzugt 2–4 % Glycerol, 1 % Glucose, 0,01–1 % Pepton, bevorzugt 0,1–0,6 % Pepton, enthalten.
• Die Kultivierung erfolgt aerob, beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren im Schüttelkolben oder Fermentoren, gegebenenfalls unter Einleiten von Luft oder Sauerstoff oder unter Verwendung von Standkulturen in Glasflaschen. Die Fermentation kann beispielsweise in Steilbrustflaschen, Erlenmeyer- oder Rundkolben verschiedener Volumina erfolgen. Sie wird in einem Temperaturbereich zwischen 25–50 °C, besonders bevorzugt zwischen 30–45 °C, durchgeführt. Der pH-Wert liegt zwischen 4 und 7, bevorzugt zwischen 4,5 und 6,5. Der Mikroorganismus wird unter diesen Bedingungen 5–28 Tage, bevorzugt 7–18 Tage, kultiviert. Die Fermentation kann im Labormaßstab (Kulturvolumina zwischen 100 ml und 250 ml) durchgeführt werden.
• Vorteilhafter kultiviert man in mehreren Stufen, d.h. zunächst werden eine oder mehrere Vorkulturen in einem flüssigen Nährmedium hergestellt, die dann in das eigentliche Produktionsmedium, die Hauptkultur, beispielsweise im Verhältnis 1:5–1:20, überimpft werden.
• Die Vorkultur erhält man, indem man ein versportes Myzel von z.B. Malzagar-Nährböden in eine Nährlösung, die Malzextrakt und Hefeextrakt enthält, überführt, beispielsweise durch Einimpfen von Myzel-bewachsenen Agarstücken, und die 7–28 Tage, vorzugsweise 7 Tage, inkubiert.
• Das Pilzmyzel kann beispielsweise erhalten werden, indem man den Stamm etwa 7–28 Tage, bevorzugt 7 Tage, auf einem Nährboden, wie z.B. Malz-Agar oder Kartoffel-Glucose-Agar, wachsen läßt.
• Die erfindungsgemäßen Substanzen der allgemeinen Formel 1 sind in wechselnden Anteilen in der Kulturbrühe, im Myzel und im Kulturfiltrat enthalten.
• Zum Testen der Wirkstoffkonzentration im Kulturmedium oder in den einzelnen Isolierungsstufen können die üblichen, dem Fachmann vertrauten Methoden der biologischen Aktivitätsbestimmung, die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, beispielsweise an Kieselgel RP₁₈ mit Acetonitril/Wasser/Trifluoressigsäure 0,1 %-Mischungen als Laufmittel verwendet werden. Die Detektion bei der dünnschichtchromatographischen Auftrennung kann durch Eigenfärbung, Iod-Dampf oder durch Färbeagentien, z.B. Vanillin/H₂SO₄ (konz.) erfolgen.
• Die Isolierung der Substanzen mit der Formel 1 aus der Kulturbrühe erfolgt nach bekannten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der Produkte. Zur Isolierung der Substanzen mit der Formel 1 wird am Ende der Fermentation im Labormaßstab wasserunlösliches organisches Lösungsmittel, wie z.B. Essigsäureethylester, zur Kulturlösung zugesetzt und damit die Kulturbrühe vollständig extrahiert. Zur Isolierung aus submersen Kulturansätzen wird am Ende der Fermentation fermentativ Kulturmedium und Myzel getrennt und das Myzel mit organischen Lösungsmitteln, wie Methanol oder Aceton, vorzugsweise Methanol, extrahiert.
• Weitere Mengen an Inhibitoren der allgemeinen Formel 1 werden durch Extraktion der vom Myzel abgetrennten Kulturlösung mit wasserunlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie z.B. Essigsäureethylester, gewonnen.
• Nach Einengen der Extrakte und gegebenenfalls Reextraktion des Methanolextraktes des Myzels mit wasserunlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie z.B. Essigsäureethylester oder Dichlormethan, erfolgt die Isolierung unter Einsatz üblicher chromatographischer Adsorbentien bzw. Trägermaterialien, wie z.B. Kieselgel oder organophile Dextrangele. Durch sequentielle Anwendung der Säulenchromatographie an Kieselgel, der Gelpermeations-Chromatographie an organophilen Dextrangelen unter Verwendung von polaren organischen Lösungsmitteln, wie z.B. Methanol, der Mitteldruckchromatographie an Kieselgel RP₁₈ unter Verwendung von Acetonitril/Wasser-Gemischen sowie der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung von Methanol/Wasser- und Acetonitril/Wasser-Gemischen, ferner Umkristallisieren aus Acetonitril oder Hexan/Chloroform-Gemischen werden schließlich reine Substanzen mit der Formel 1 erhalten.
• Die chemische Identität der Substanzen mit der allgemeinen Formel 1 wurde durch die Ergebnisse der hochauflösenden Massenspektrometrie (EI-MS, Quadrupol-Electrospray-CID-MS/MS) sowie durch hochauflösende 500 MHz-¹³C-, 1D und 2 D NMR-Spektroskopie bewiesen.
• Die antioxidativen Eigenschaften werden durch Inhibiton der Xanthin-Oxidase (Pierce et al., J. Clin. Lab. Res. 25, 93–98, 1995), der Meerettich-Peroxidase (HKI-Hausvorschrift, 1995) und der polymorphonuclearen Lymphozytenreaktion (C. Czuprinsky, Vet. Immunol. Immunopathol. 50, 29–42, 1996) nachgewiesen.
• Die erfindungsgemäßen Substanzen der allgemeinen Formel 1 sind stark antioxidativ, aber auch moderat gegen grampositive Bakterien wirksam. Sie sind für die therapeutische Anwendung als Radikalfänger in der Behandlung und Prävention inflammatorischer und autoimmunologischer Erkrankungen sowie als Lebensmittelzusätze sehr gut geeignet.
• Die erfindungsgemäßen Substanzen der allgemeinen Formel 1 können als solche in Reinsubstanz, als Gesamtextrakt des Mikroorganismus Malbranchea cinnamomea DSM 15381 oder in Mischung mit geeigneten Hilfsstoffen oder Trägermaterialien vereinbreicht werden.
• Die so hergestellten erfindungsgemäßen Arzneimittel werden im allgemeinen oral oder parenteral appliziert, aber auch eine rektale Anwendung ist möglich. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Tabletten, Dragees.
• Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert.
• Ausführungsbeispiele:
• 1a. Herstellung von Vorkulturen des Stammes Malbranchea cinnamomea DSM 15381 Zur Gewinnung eines versporten Myzels wird der Stamm Malbranchea cinnamomea DSM 15381 15 Tage bei 37 °C auf einem Nährboden folgender Zusammensetzung (g/l) kultiviert: Malzextrakt 40, Hefeextrakt 4, Agar 15, destilliertes Wasser pH 6.0 (Sterilisation 25 min bei 110 °C).
• 1b. Die Herstellung einer emersen Standkultur bzw. einer Vorkultur des Stammes Malbranchea cinnamomea DSM 15381 erfolgt in 11 Erlenmeyerkolben mit 250 ml Nährmedium folgender Zusammensetzung (g/l). D-Glucose 20, Glycerin 10, Pepton 5, NaCl 2, Agar 1. Die Beimpfung erfolgt mit 2 cm²-Aeralen von Oberflächenkulturen des Stammes Malbranchea cinnamomea DSM 15381, die auf Agarmedium entsprechend Beispiel 1a angezogen wurden.
• 1c. Herstellung von Schüttelkulturen des Stammes Malbranchea cinnamomea DSM 15381. Es werden 11 Erlenmeyerkolben mit eingebauten Schikanen mit jeweils 250 ml Nährmedium, wie unter 1b angegeben, verwendet. Die Beimpfung erfolgt wie unter 1a und 1b beschrieben. Es kann als Vorkulturmedium auch Kartoffel-Glucose-Agar (Difco) verwendet werden.
• 2. Gewinnung von Substanzen mit der Formel 1 Die gesamte Kultur wird im Verhältnis 2:1 (Kulturbrühe/Lösungsmittel) mit Ethy lacetat extrahiert, und der Extrakt wurde nach Trocknen über Natriumsulfat bis zum Rückstand im Vakuum eingeengt.
• 3. Chromatographische Aufreinigung der Substanzen mit der Formel 1 Substanzen mit der Formel 1, wie z.B. R₁, R₂ = CH₃, R₃ = OCH₃, R₄, R₅ = H, werden aus dem eingeengten Ethylacetatextrakt von 201 Fermentationsbrühe durch die nachfolgenden chromatographischen Aufarbeitungsschritte erhalten. Zunächst wird der Rückstand des eingeengten Extraktes auf eine Chromatographiesäule, gefüllt mit Dextrangelen, wie z.B. Sephadex LH-20, in Methanol gegeben. Mit dem gleichen Lösungsmittel werden zunächst ölige Begleitkomponenten eluiert, danach eluiert man die Hauptmenge Substanz 1. Ausbeute: 0,8 g. In einer zweiten säulenchromatographischen Reinigungsstufe erfolgt die Chromatographie an Kieselgel 60 unter Verwendung von Chloroform/Methanol (95:5, v/v) als Eluent. Ausbeute: 0,3 g. Eine weitere Anreicherung kann durch nochmalige Säulenchromatographie an organophilen Dextrangelen, wie Sephadex LH-20, in Methanol oder präparative Dünnschichtchromatographie erfolgen. Auf diese Weise werden aus 141 Kulturbrühe 25 mg 1a entsprechend der allgemeinen Formel 1 mit R₁, R₂ = CH₃, R₃ = OCH₃, R₄, R₅ = H erhalten.
  
• 4. Strukturaufklärung Die Struktur von Verbindungen der allgemeinen Formel 1, insbesondere beispielhaft 1a mit R₁, R₂ = CH₃, R₃ = OCH₃, R₄, R₅ = H, wird durch die Ergebnisse der optischen Spektroskopie (UV-VIS, Polarimetrie, FTIR), Massenspektrometrie und 1D/2D NMR Spektroskopie bewiesen. Eigenschaften: 1a: semikristalliner Feststoff, Schmp. 108–110 °C; Molekulargewicht (HREI-MS); m/z 192.0780 (M⁺, ber. 192.0786 für C₁₁ H₁₂O₃); UV-VIS (λ_max nm): 215, 312; FTIR (Film, cm^–1: 751, 836, 966, 1049, 1118, 1126, 1188, 1216, 1248, 1292, 1364, 1399, 1439, 1493, 1555, 1599, 1633, 2920, 3428. R_f-Wert (DC, Kieselgel 60 Alumiumfolie F₂₅₄, CHCl₃/MeOH, 95:5): 0.9 Zuordnung der Protonen und Kohlenstoffatome im ¹H und ¹³C-NMR Spektrum von 1 (R₁ = Me, R₂ = Me, R₃ = OCH₃, R₄ = H, R₅ = H, siehe Formel 1a, in CDCl₃, 500 MHz Broker Avance DRX 500). ¹H-NMR (δ in ppm): 2.04 (H-9, s, 3H), 2.33 (H-8, s, 3H), 3.92 (H-10, s, 3H), 6.30 (H-6, d, 1H), 6.39 (H-4, d, 1H), 8.29 (5-OH, br, 1H). ¹³C-NMR (δ in ppm): 8.0 (C-9, q), 11.8 (C-8, q), 56.0 (C-10, q), 95.7 (C-6, d), 97.0 (C-4, d), 110.0 (C-3, s), 132.1 (C-3a, s), 137.8 (C-5, s), 144.8 (C-7, s), 151.5 (C-2, s), 151.8 (C-7a, s).
• Die Bestimmung der Inhibitionswirkung der Verbindung 1a als Beispiel für Verbindungen mit der allgemeinen Formel 1 (R₁ = Me, R₂ = Me, R₃ = OMe, R₄ = H, R₅ = H) erfolgt gegenüber Xanthin-Oxidase erfolgte nach Pierce, L.A., Tarnow-Mordi, W.O., Cree, I.A.: Antibiotics effects on phagocyte chemiluminescence in vitro. J. Clin. Lab. Res. 25, 93–98 (1995), gegenüber Meerettich-Peroxidase nach A. Härtl et al., Hans-Knöll-Institut für Naturstoff-Forschung, Beutenbergstrasse 11a, 07745 Jena, nach Pei-Wen-Yu und C. Czuprynski: Regulation of Cummol-dependent chemiluminescence and degranulation by bovine neutrophils stimulated with opsonized zymosan. Veterinary Immunology and immunopathology 50, 29–42 (1996).
• Dabei wurden folgende IC₅₀-Werte unter Verwendung von Verbindung 1 a gefunden.
  Xanthin-Oxidase IC₅₀ = 20 μg/ml
  Meerettich-Peroxidase IC₅₀ = 15 μg/ml

Claims (4)

1. Verbindungen der Formel 1

   

   worin R₁ und R₂ unabhängig voneinander Methyl, Ethyl, Propyl oder Butyl und R₃, R₄ und R₅ unabhängig voneinander H, OH oder OCH₃ bedeuten.
2. Eine Verbindung der Formel 1 gemäß Anspruch 1, worin R₁ und R₂ Methyl bedeuten, R₃ OCH₃ bedeutet und R₄ und R₅ für H stehen.
3. Verwendung von Verbindungen der Formel 1 gemäß Anspruch 1 zur Behandlung und Prävention inflammatorischer und autoimmunologischer Erkrankungen.
4. Pharmazeutisches Präparat enthaltend eine Verbindung der Formel 1 gemäß Anspruch 1 nebst üblichen Trägermaterialien und Hilfsstoffen.