DE4129616A1

DE4129616A1 - Mikroorganismus

Info

Publication number: DE4129616A1
Application number: DE4129616A
Authority: DE
Inventors: Johannes Paul Dr Pachlatko; Hans Prof Dr Zaehner
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1990-09-10
Filing date: 1991-09-06
Publication date: 1992-03-12

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den neuen Mikroorganismus Streptomyces hygros copicus Tü-2474 und davon abgeleitete Mutanten, Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung zur Herstellung des Herbizids Hydantocidin

und das
Bakterizid Homomycin (II) (5-Deoxy-5-[[3-[4-[6-deoxy-β-D-arabino-hexafuranos-5-ulos- 1-yloxy]3-hydroxyphenyl]-2-methyl-1-oxo-2-propenyl]amino]-1,2-O-meth-ylen-D-neo inositol (CAS Reg. No. 6379-56-2)).

Aus der japanischen Offenlegungsschrift JP-A-0 20 85 287 ist ein sechsstufiges Verfahren zur Herstellung von Hydantocidin bekannt geworden. Diese Verbindung ist erstmals als Isolat einer Streptomyces hygroscopicus-Kultur (SANK 63 584) in der EP-A-02 32 572 und der dazu konkordanten US 49 52 234 beschrieben worden.

Es wurde nun gefunden, daß Hydantocytidin (I) ebenfalls von einem bisher unbekannten, aus einer Bodenprobe aus Kanchanbari (Thailand) isolierten, Streptomyceten (Streptomyces hygroscopicus Tü-2474) produziert wird. Aufgrund der taxonomischen Analyse ist sichergestellt, daß es sich bei dem erfindungsgemäßen Streptomyces hygros copicus Tü-2474 um einen von dem vorbekannten Streptomyces hygroscopicus SANK 63 584 verschiedenen Stamm handelt.

Der neue Stamm Streptomyces hygroscopicus Tü-2474 ist bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen, Mascheroderweg 1B, D-3300 Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, am 5. September 1990 unter der Hinterlegungsnummer DSM 6157 hinterlegt.

Der herbizide Wirkstoff Hydantocidin (I) kann hergestellt werden durch die Kultivierung des neuen Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus Tü-2474 (von nun an nur noch Stamm Tü-2474 genannt) in einem Nährmedium unter aeroben Bedingungen. Es wird im folgenden ein Beispiel zur Herstellung von Hydantocidin (I) angegeben, die die Fermentation des Hydantocidin (I) produzierenden Stammes Tü-2474 beinhaltet, unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Milieu, das assimilierbare Stickstoff- und Kohlenstoffquellen enthält. Die Isolierung von Hydantocidin (I) aus der Kultur wird ebenfalls beschrieben.

Stammbeschreibung

Der neue Stamm Tü-2474 hat folgende mikrobiologische Merkmale:

Morphologische Merkmale

Es wird reichlich Luftmycel und Sporen gebildet auf Medien wie Hafermehl-Agar und Hefe-Malz-Agar. Das Luftmycel ist einfach verzweigt und bildet keine Knäuel. Ge schlossene, kompakte Spiralen werden an den Spitzen der Luft-Hyphen gebildet. Die elektronen-mikroskopische Untersuchung zeigt, daß die Sporenoberfläche glatt ist, daß die Sporen keinerlei Fortsätze besitzen, und die Sporenketten in engen, geschlossenen Spiralen angeordnet sind. Die Sporen haben eine elliptische bis ovale Form, und 10 oder mehr Sporen sind normalerweise miteinander verknüpft. Was die Farbe des Luftmycels betrifft, so stellt man nach etwa 10 Tagen sowohl weiße wie auch aschgraue Kolonien zu etwa gleichen Teilen fest. Nach 20 Tagen überwiegen die aschgrauen Kolonien. Nach längerer Zeit verklebt das Luftmycel autolytisch unter Bildung einer schwarz pigmentierten Masse.

Physiologische Merkmale Pigmentbildung

Eine Bildung von löslichen Pigmenten wird weder auf synthetischen noch auf organischen Medien beobachtet, das heißt, der Stamm Tü-2474 ist nicht chromogen. Auf Peptone- Eisen-Agar (PIA) bildet der Stamm Tü-2474 kein Melanin.

C-Quellenverwertung

Der Stamm Tü-2474 wäscht gut und sporuliert unter Verwendung folgender C-Quellen: D-Glucose, L-Arabinose, L-Rhamnose, D-Fructose, Raffinose, D-Xylose, D-Maltose, D-Mannose.

Mit D-Saccharose als C-Quelle wächst der Stamm Tü-2474 schlecht und sporuliert kaum.

Mit Sorbit als C-Quelle wächst der Stamm Tü-2474 nicht.

Antibiotika-Resistenz

Im Plattendiffusionstest nach Waksman wurden Papierrondellen mit 6 mm Durchmesser in Lösungen definierter Konzentration (mg/ml, siehe Resultate unten) von antibiotisch wirk samen Agenzien getaucht und auf die Oberfläche von Hefe-Malz-Agar-Platten gebracht, die mit dem Stamm Tü-2474 angeimpft waren. Nach Bebrüten der Platten bei 28°C wird Wachstumshemmung in Form von Hemmhöfen beobachtet.

Eine partielle Wachstumshemmung des Stammes Tü-2474 bewirken bei 0,1 mg/ml, jedoch nicht bei 0,01 mg/ml: Novobiocin, Antinomycin.

Nicht gehemmt wird das Wachstum des Stammes Tü-2474 bei 1 mg/ml durch: Kanamycin, Tetracylin, Streptomycin, Botran, Metalaxyl, Benlate.

Metabolitenproduktion

Außer dem herbiziden Wirkstoff Hydantocidin (I) stellt der Stamm Tü-2474 außerdem noch den bakterizid wirksamen Metaboliten Homomycin (II) her.

Taxonomie

Vergleicht man die obigen Merkmale des Stammes Tü-2474 mit denjenigen des Spezies-Clusters von Streptomyces hygroscopicus, wie sie von Hütter in "Systematik der Streptomyceten" (R. Hütter, Bibliotheca Microbiologica Fasc. 6 (S. Karger, Basel/New York 1967) beschrieben werden, so stellt man fest, daß fünf Merkmale auf diesen Spezies-Cluster zutreffen:

1. Die Sporenoberfläche ist glatt.
2. Das Luftmycel nimmt eine aschgraue Farbe an.
3. Die Sporenketten bilden enge, geschlossene Spiralen.
4. Auf PI-Agar wird kein Melanin gebildet.
5. Das Luftmycel autolysiert mit der Zeit unter Bildung eines schwarzen Pigmentes.

In anderen Merkmalen, wie z. B. C-Quellenverwertung und Metabolitenproduktion unterscheidet sich Tü-2474 jedoch von Hütter's Beschreibung. Deshalb bezeichnen wir Tü-2474 als Streptomyces hygroscopicus Tü-2474.

Der Stamm Tü-2474 hat Eigenschaften, die durchaus variieren können, wie gewöhnlich beobachtet bei anderen Streptomyceten. So kann der Stamm Tü-2474 eine Variante oder eine Mutante produzieren, wenn er mit verschiedenen Mutagenen wie ultravioletter Strahlung, Röntgenstrahlen, radioaktiver Strahlung, hochfrequenten elektromagnetischen Feldern und chemischen Mutagenen behandelt wird. Irgendeine natürliche oder künstliche Variante oder Mutante des Stammes Tü-2474 kann gemäß dieser Erfindung für die Herstellung des herbiziden Wirkstoffes Hydantocidin (I) verwendet werden.

Fermentation

Eine Stammkultur des Stammes Tü-2474 wird verwendet für die Inoculierung von 9 500-ml-Schüttelkolben mit Einstich, die je 100 ml wäßriges Medium bestehend aus Glucose 22 g/Liter, Oxoid Lab. Lemco 5 g/Liter, Peptone-C 5 g/Liter, Hefeextrakt 0,5 g/Liter, Casitone 3 g/Liter, Natriumchlorid 1,5 g/Liter enthalten, bei einem Wert vor der Sterilisation von 7,3.

Die Fermentation dieser Vorkulturen erfolgt auf dem Schütteltisch bei 250 rpm, 28°C während 48 h. Je 3 dieser Vorkulturen werden verwendet für die Inoculierung von je einem Fermenter, die je 3 Liter wäßriges Medium bestehend aus Mannit 20 g/Liter und entfettetem Soyamehl 20 g/Liter enthalten, bei einem pH-Wert vor der Sterilisation von 7,8. Die Fermentation dieser 3 3-Liter-Kulturen erfolgte bei 28°C, einer Belüftungsrate von 1,5 vvm, einer Rührerdrehzahl von 300 rpm während 48 h. Jede dieser 3-Liter-Kulturen wird verwendet für die Inoculierung je eines Fermenters, die je 30 Liter desselben wäßrigen Mediums enthalten. Die Fermentation dieser 30-Liter-Kulturen erfolgt bei 28°C, einer Belüftungsrate von 1,5 vvm, einer Rührerdrehzahl von 250 rpm während 72 h. Es resultieren total 81 Liter Kulturbrühe.

Aufarbeitung und Isolierung

Nach jedem Aufarbeitungs- und Trennschritt werden die erhaltenen Fraktionen auf herbizide Wirkung gegen Nasturtium officinalis und Agrostis tenuis geprüft. Beide Pflanzen werden auf Vermiculite gesät, das vorher mit Probenlösungen durchtränkt worden war. Die Bonitur erfolgte 10 Tage nach Aussaat.

81 Liter Kulturbrühe werden mit 5n H₂SO₄ auf pH 6,0 gestellt und dann mit 81 Liter Ethylacetat durch turbulentes Rühren extrahiert. Die Trennung der Phasen erfolgt mit einem Schlammseparator MEM-1254 von Westphalia. Die aktive wäßrige Phase, 88 Liter, wird im Vakuum bis auf 13 Liter aufkonzentriert und dann auf einer Säule, 135 cm×15 cm, von 25 Liter in Wasser aufgezogenem Trennmaterial, XAD-1180-Harz von Röhm+Haas, chromatographiert. Nach dem Probenauftrag werden erst 25 Liter Wasser und dann 20% wäßriges Methanol durch die Säule gepumpt. Der Lösungsmitteldurchfluß beträgt 25 Liter/Std. Es werden folgende Fraktionen gesammelt:
Fraktion 1 = 13 Liter Wasser von Probenauftrag + 25 Liter Wasser,
Fraktion 2 = 10 Liter Wasser bis zur Front der 20% wäßrigen Methanol-Fraktion 3,
Fraktion 3 = 25 Liter 20% wäßriges Methanol.

Die herbizide Aktivität befindet sich zu mindestens 80% in Fraktion 2 und der Rest in Fraktion 3. Fraktion 1 wird verworfen.

Die Fraktionen 2 und 3 werden am Vakuum eingeengt und dann lyophilisiert. Man erhält bei Fraktion 2 41,5 g und bei Fraktion 3 46,5 g Festmaterial.

Fraktion 2 (41,5 g) wird nun in 4 Portionen an einer Säule, 7,5 cm×78 cm, von 3,5 Liter mit 20% wäßrigem Methanol aufgezogenem Trennmaterial, Sephadex LH-20 der Firma Pharmacia (Uppsala, Schweden) mit 20% wäßrigem Methanol chromatographiert. Weitere Auftrennung der dabei erhaltenen herbiziden Fraktionen (6,3 g) auf der gleichen Säule ergeben 4,5 g herbizides Material.

Aus diesem Material kann Hydantocidin (I) an einer Free Flow Elektrophoreseapparatur der Firma Bender+Hobein (München, BRD) weiter angereichert werden. Die dabei angewendete Feldsprung-elektrophorese (Puffer: Ammoniumacetat/Ammoniak, pH 7,0) ergibt bei einem Materialdurchsatz von 200 mg/Std. 2,0 g herbizides Material. Dieses Material wird weiter gereinigt durch Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC), erst an Reversed-Phase Trennungsmaterial RP-8 (15-25 u) der Firma E. Merck (Darmstdt, BRD) in Stahlsäulen 40 mm×250 mm und 20 mm×250 mm mit Wasser als Laufmittel, wobei 100 mg hoch angereichertes, herbizides Material erhalten werden. Daraus kann mit HPLC an Reversed-Phase Trennmaterial RP-18 (7u) der Firma E. Merck in Stahlsäulen 8 mm×250 mm mit Wasser als Laufmittel in mehreren Schritten 8 mg reiner Wirkstoff Hydanto cidin (I) isoliert werden.

Herbizide Aktivität von Hydantocidin (I)

Der reine Wirkstoff Hydantocidin (I) zeigt gegen Nasturtium und Agrostis auf Vermiculite folgene Wirkung:

Strukturaufklärung

Die Aufklärung der Struktur von Hydantocidin (I) erfolgt aufgrund seiner spektroskopischen Eigenschaften durch Auswertung der Massenspektren, NMR-Spektren und IR-Spektrum.

Massenspektroskopie

Das Massenspektrum des Wirkstoffes Hydantocidin (I) zeigt eine Molmasse von 218. Wird der Wirkstoff Hydantocidin (I) mit Essigsäureanhydrid in Pyridin verestert, so bildet sich hauptsächlich die Tetraacetylverbindung. Das hochauflösende Massenspektrum dieser Verbindung zeigt eine Molmasse von 386 und eine atomare Zusammensetzung von C₁₁H₁₄N₂O₈. Daraus leitet sich für den Wirkstoff Hydantocidin (I) die atomare Zusammensetzung von C₇H₁₀N₂O₆ ab.

Die Untersuchung des Wirkstoffes Hydantocidin (I) mit CI-Massenspektroskopie unter Verwendung von deuteriertem Ammoniak als Reaktantgas ergab einen Basepeak von m/z 245, d. h. den Befund, daß der Wirkstoff Hydantocidin (I) fünf acide Wasserstoffatome besitzt.

NMR-Spektroskopie

Die Untersuchung des Wirkstoffes Hydantocidin (I) bezüglich seiner ¹H-NMR- und ¹³C-NMR-Eigenschaften in Methanol-d4 (siehe Tabellen 1 und 2, wobei δ die chemische Verschiebung in ppm, J die Kopplung in Hz und NOE=Nuclear Overhauser Effekt bedeutet.) führt zur Zuordnung von folgender Struktur:

Tabelle 1

Tabelle 2

Infrarot-Spektroskopie

Das IR-Spektrum des Wirkstoffes Hydantocidin (I) wird in KBr aufgenommen und zeigt bei 3400 cm^-1 eine breite, starke Bande, die auf die Anwesenheit von mehreren OH-Gruppen hinweist. Weiter sind die drei Banden bei 1780 cm^-1 (mittel), 1730 cm^-1 (stark) und 1615 cm^-1 (mittel) in gutem Einklang mit der Hydantoin-Teilstruktur des Wirkstoffes Hydantocidin (I).

Chiroptik

Hydantocidin (I) ist chiral und dreht polarisiertes Licht der Wellenlänge 589 nm (Na_D) unter Standardbedingungen in Methanol um +37°.

Aufgrund vorstehender Daten wird die Struktur des herbiziden Wirkstoffs als

bestimmt.

Claims

1. Streptomyces hygroscopicus Tü-2474 und dessen zur Herstellung von Hydantocidin (I) und/oder Homomycin (II) befähigten Mutanten.

2. Streptomyces hygroscopicus Tü-2474 gemäß Anspruch 1.

3. Die Verwendung von Streptomyces hygroscopicus Tü-2474 oder dessen zur Herstellung von Hydantocidin (I) befähigten Mutanten zur Herstellung von Hydantocidin (I).

4. Die Verwendung von Streptomyces hygroscopicus Tü-2474 oder dessen zur Herstellung von Homomycin (II) befähigten Mutanten zur Herstellung von Homomycin (II).

5. Verfahren zur Herstellung von Hydantocidin (I), dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm des Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus Tü-2474 gemäß Anspruch 1 oder 2 unter anaeroben Bedingungen kultiviert und das Hydantocidin (I) aus der Kulturbrühe isoliert.

6. Verfahren zur Herstellung von Homomycin (II), dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm des Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus Tü-2474 gemäß Anspruch 1 oder 2 unter anaeroben Bedingungen kultiviert und das Homomycin (II) aus der Kulturbrühe isoliert.