DE3786795T2

DE3786795T2 - Antibiotikum yi-hu3 und herstellungsverfahren.

Info

Publication number: DE3786795T2
Application number: DE88900128T
Authority: DE
Inventors: Tetsuji Iwasaki; Toshio Uesaka
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1986-12-23
Filing date: 1987-12-21
Publication date: 1994-03-31
Anticipated expiration: 2007-12-22
Also published as: DE3786795D1; JPS63159389A; WO1988004661A1; JPH0667948B2; EP0294491A4; US4940582A; EP0294491A1; EP0294491B1

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf ein neues Antibiotikum. Mehr im besonderen bezieht sich die Erfindung auf das neue Antibiotikum YI-HU3, das antimikrobielle Aktivität und Antitumor-Aktivität aufweist sowie auf das Verfahren zu dessen Herstellung.

Technologischer Hintergrund

Konventionell sind verschiedene physiologisch aktive Substanzen, die durch Mikroorganismen erzeugt werden, bekannt. Einige von ihnen werden als Medikamente benutzt.
Es gibt jedoch noch einen Bedarf zur Entwicklung physiologisch aktiver Substanzen, die als Medikamente oder Agrochemikalien brauchbarer sind.

Offenbarung der Erfindung

Die vorliegenden Erfinder haben eine Anzahl von Mikroorganismen aus natürlichen Böden isoliert und umfangreiche Untersuchungen des von solchen Mikroorganismen erzeugten Produktes vorgenommen. Als Ergebnis haben die Erfinder festgestellt, daß ein Stamm, der aus einem Boden der Wakayama Präfektur, Japan isoliert wurde, in der Lage ist, das neue Antibiotikum YI-HU3 zu erzeugen, das antimikrobielle und Antitumor-Aktivitäten aufweist. Diese Feststellung hat zur Fertigstellung dieser Erfindung geführt.
Es ist demgemäß eine Aufgabe dieser Erfindung, ein neues Antibiotikum YI-HU3 sowie das Verfahren zu dessen Herstellung zu schaffen.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Antibiotikums YI-HU3 dieser Erfindung und
die Fig. 2, 3 und 4 zeigen das Infrarotspektrum, ¹H-NMR-Spektrum bzw. das ¹³C-NMR-Spektrum der gleichen Substanz.

Die beste Art zur Ausführung der Erfindung

Der Stamm YI-HU, der ein typischer Mikroorganismus ist, der das Antibiotikum YI-HU3 dieser Erfindung erzeugt, hat die folgenden Charakteristika:
(1) Morphologie
Die folgenden Charakteristika wurden durch licht- oder elektronenmikroskopische Beobachtungen des Mikroorganismus des YI-HU-Stammes bestätigt, der in einem Kartoffel-Dextrose-Schrägkulturmedium 3 Tage bei 28ºC kultiviert wurde. Die Zellen hatten eine Größe von 1 bis 5 um ohne Polymorphie. Sie hatten Geißeln und waren mobil. Es wurde keine Sporogenese beobachtet. Die Gram-Färbung war negativ, und der Stamm hatte keine Säurefestigkeit.
(2) Wachstumscharakteristika auf verschiedenen Kulturmedien:
Die Wachstumscharakteristika des YI-HU-Stammes auf verschiedenen Kulturmedien waren, wie an den Mikroorganismen beobachtet, die 3 Tage bei 28ºC kultiviert wurden, die folgenden:
(i) Fleischextrakt-Agarplattenkultivierung
Die Kolonie hatte eine glänzende, erhöhte scheibenartige Gehalt mit Vitellus- bzw. Eidotter-Farbe. Eine Farbdiffusion in das Medium wurde nicht beobachtet.
(ii) Fleischextrakt-Flüssigkeitskultivierung
Das Medium wurde vollständig trübe, und die Bakterien wuchsen in Licht gelb, wobei ein dünner Film gebildet wurde.
(iii) Fleischextrakt-Gelatine-Stichkultivierung
Die Brühe wurde flüssig und wies einen Film auf ihrer Oberfläche auf.
(3) Physiologische Charakteristika
(i) Allgemeine Charakteristika
Nitratreduktion negativ
Indolproduktion negativ
Stärkehydrolyse negativ
Zitronensäurenutzung positiv
Bildung gefärbter Substanz positiv
Urease negativ
Oxidase positiv
Reaktion auf Sauerstoff aerob
Esculinhydrolyse negativ
Lysindecarbonierung positiv
Argeninzersetzung negativ
Ornithindecarbonierung negativ
Acylamylase negativ
(ii) Wachstums-Temperaturbereich bei der Kultivierung für
24 Stunden in einem Kartoffel-Dextrose-Kulturmedium. Temperatur (ºC) Wachstum
(iii) Anaerobe Zuckerzersetzung (auf der Grundlage des Hugh Leifson-Verfahrens bei 30ºC für 7 Tage) Zucker Bedingungen Wachstum Glucose geschlossen offen
(iv) Kohlenstoffquellen-Assimilierung (bei 30ºC für 7 Tage)
Zucker Wachstum
Xylose +
Glucose +
Fructose +
Galactose +
Maltose -
Saccharose -
Lactose -
Mannit +
Stärke -
(v) Fluoreszenztest unter ultraviolettem Licht Negativ
(vi) Akkulumation von Polyhydroxybutyrat (PHB) Positiv
(vii) Anwesenheit von Arginin-Dehydrolase Negativ
Auf der Grundlage der obigen mykologischen Charakteristika, insbesondere auf der Grundlage der Tatsache, daß der Mikroorganismus (i) ein gram-negativer Stab ist, (ii) oxydase-positiv ist, (iii) Geißeln hat und mobil ist, (iv) aerob ist und (v) nicht sporogen ist, wird der YI-HU-Stamm als ein zu Pseudomonas gehörender Stamm angesehen.
Weiter wurden gemäß "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" (8. Auflage) aufgrund der obigen Charakteristika Pseudomonas gladioli und Pseudomonas cepacia als Verwandte des YI-HU-Stammes festgestellt. Pseudomonas cepacia unterscheidet sich jedoch von YI-HU dadurch, daß der erstere Saccharose assimiliert und Nitrat zu Nitrit reduziert. Andererseits unterscheidet sich Pseudomonas gladioli von YI-HU dadurch, daß er Saccharose positiv assimiliert.
Da der YI-HU-Stamm nicht mit irgendeinem bekannten Stamm von Mikroorganismen, wie oben diskutiert, identisch ist, haben die Erfinder diesen Stamm als Pseudomonas sp.
YI-HU bezeichnet, um ihn von anderen bekannten Mikroorganismen zu unterscheiden und haben ihn am 8. November 1986 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (1-1-3, Higashi, Tsukubashi, Ibaraki-ken, Japan) unter der Bezeichnung FERM p-9035 hinterlegt. Am 10. Dezember 1987 wurde die Hinterlegung in eine Internationale Hinterlegung unter der Bezeichnung FERM BP-1610 umgewandelt.
Das Antibiotikum YI-HU3 dieser Erfindung kann hergestellt werden durch Beimpfen eines Kulturmediums, das Nährstoffe enthält, mit dem obigen Stamm von Mikroorganismen, Kultivieren des Stammes unter aeroben Bedingungen und Sammeln desselben aus der Kulturbrühe. Es kann irgendein Stamm von Mikroorganismen zur Herstellung des Antibiotikums YI-HU3 dieser Erfindung benutzt werden, einschließlich des oben erwähnten YI-HU-Stammes und seiner künstlichen oder natürlichen Varianten, solange der Stamm in der Lage ist, das Antibiotikum YI-HU3 zu erzeugen.
Das Kultivieren der Mikroorganismen, die das Antibiotikum YI-HU3 erzeugen, kann in der folgenden Weise ausgeführt werden.
Die Mikroorganismen, die zu dem Stamm Pseudomonas gehören, der das Antibiotikum YI-HU3 dieser Erfindung erzeugt, können nach den gleichen Verfahren kultiviert werden, wie sie für die Kultivierung üblicher Pseudomonas Bakterien benutzt werden.
Wird der YI-HU-Stamm benutzt, dann ist ein bevorzugtes Nährstoff-Kulturmedium ein Kartoffel-Dextrose-Medium, das Kartoffelextrakt und Glucose enthält.
Irgendwelche Kulturverfahren, die üblicherweise für die Herstellung von Antibiotika benutzt werden, können zum Kultivieren des Mikroorganismus des YI-HU-Stammes benutzt werden, obwohl das Flüssigkeitsphasen-Kultivierungsverfahren besonders geeignet ist. Das Kultivieren wird unter aeroben Bedingungen und bei einer Temperatur von 10 bis 40ºC ausgeführt. Im allgemeinen liegt eine bevorzugte Kultivierungstemperatur in der Nähe von 28ºC. Die Produktion des Antibiotikums YI-HU3 erreicht das Maximum in 2 bis 5 Tagen nach dem Beginn des Kultivierens. Erreicht die Menge des Antibiotikums YI-HU3, das sich in der Kulturbrühe angesammelt hat, das Maximum, dann wird das Kultivieren beendet und die Zielsubstanz von der Brühe abgetrennt und gereinigt.
Die Abtrennung und Reinigung des Antibiotikums YI- HU3 kann durch Anwendung verschiedener Verfahren erfolgen, die entweder allein oder in geeigneter Weise zu zweien oder mehreren kombiniert sind, wobei man die physikochemischen Charakteristika der Substanzen, wie im folgenden diskutiert, in Betracht zieht. Mehr im besonderen werden die kultivierten Bakterien, da die Substanz üblicherweise in Kulturbrühe und Bakterien enthalten ist, zuerst durch Filtration abgetrennt, und dann trennt man aus den Bakterien und dem Kulturfiltrat das Antibiotikum YI-HU3 ab und reinigt es unter Anwendung eines oder mehrerer der konventionellen Mittel, wie zum Beispiel Lösungsmittelextraktion, eines Verfahrens unter Anwendung von Ionenaustauscherharzen, Gelfiltration, Absorptions- oder Verteilungs-Säulenchromatografie, Dialyse und Ausfällung.
Eines der bevorzugten Verfahren des Abtrennens und Reinigens des Antibiotikums YI-HU3 kann folgendermaßen veranschaulicht werden: Die Kulturbrühe wird durch Zentrifugieren in das Überstehende der Brühe und die Bakterien getrennt. Das Überstehende der Brühe wird mit einem in Wasser unlöslichen Lösungsmittel, wie Chloroform, extrahiert. Der Extrakt wird kondensiert und der Rest der Siliziumdioxidgel-Säulenchromatografie unterwerfen. Nachdem die Säule mit einem geeigneten Elutionsmittel, wie Chloroform, eluiert worden ist, werden die aktiven Fraktionen gesammelt und konzentriert. Der erhaltene Rest wird in einem geeigneten Lösungsmittel, wie einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform und Methanol, gelöst. Durch Zugabe von n-Hexan zu der Lösung werden nadelartige hellgelbe Kristalle des Antibiotikums YI-HU3 erhalten.
Das wie oben erhaltene Antibiotikum YI-HU3 hat die folgenden physikochemische Eigenschaften:
(a) Molekulargewicht
469
(b) Schmelzpunkt
180 bis 190ºC
(c) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (in Chloroform)
Die maximale Absorption findet sich in der Nähe von 312 nm, wobei sich die zweitgrößte Absorption in der Nähe von 300 nm befindet (siehe Fig. 1).
(d) Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr-Verfahren)
Siehe Fig. 2
(e) ¹H-NMR-Spektrum (CDCl&sub3;/CD&sub3;OH)
Siehe Fig. 3
(f) ¹³C-NMR-Spektrum (CDCl&sub3;/CD&sub3;OH)
Siehe Fig. 4
(g) Löslichkeit in Lösungsmitteln
Löslich in Methanol und Chloroform und nicht löslich in n-Hexan.
(h) Farbe und Zustand der Substanz
Hellgelbe Kristalle
(m) Dünnschicht-Chromatografie
Träger: Siliziumdioxidgel Entwickelndes Lösungsmittel Chloroform/Methanol Benzol/Methanol
Das Antibiotikum YI-HU3 dieser Erfindung hat die folgenden biologischen Charakteristika:
(a) Aktivität auf pathogene Pflanzenpilze
Die Aktivität des Antibiotikums YI-HU3 dieser Erfindung auf pathogene Pflanzenpilze wurde unter Anwendung des Papierscheiben-Plattenverfahrens untersucht. Es wurde ein Kartoffel/Glucose-Agarmedium als das Medium für den Test benutzt, und Botrycis cinera und Collethotricum groeosporioides wurden als Testpilze benutzt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Pilze Minimalkonzentration (mg/ml) zur Wachstumsverhinderung Botrycis cinera Collethotricum groeosporioides
(b) Antitumor-Aktivität
S-180 Ascites-Tumorzellen wurden intraperitoneal in dd-Y Mäuse (1 · 10&sup6; pro Maus) geimpft. Beginnend vom nächstfolgenden Tage und für 10 Tage wurden jeweils 3 ug/Tag von YI-HU3 intraperitoneal in jede Maus injiziert, um das Überleben der Mäuse zu beobachten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Überlebensrate (%) der Mäuse Verlauf der Zeit (Tage) Gruppe, der YI-HU3 verabreicht wurde Gruppe, der physiologische Salzlösung verabreicht wurde
(c) Aktivität auf allgemeine Mikroorganismen
Die Aktivität des Antibiotikums YI-HU3 auf die Bakterien, Pilze und Hefen, die in Tabelle 3 aufgeführt sind, wurde unter Anwendung des Papierscheiben-Plattenverfahrens getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3
Minimalkonzentration (mg/ml)
Mikroorganismus zur Wachstumsverhinderung
Escherichia coli 0,01
Pseudcmonas aureofaciens 0,01
Bacillus subtilis 0,02
Aspergillus niger 0,05
Saccharomyces cerevisiae 0,03
Wie oben beschrieben, hat das Antibiotikum YI-HU3 dieser Erfindung breite antimikrobielle und Antitumor- Aktivitäten und ist daher brauchbar als ein Medikament und eine Agrochemikalie.
Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Beispiels beschrieben.

Beispiel

Pseudomonas sp. YI-HU-Stamm (FERM P-9035) wurde in 1000 ml eines flüssigen Mediums (pH 6,8) geimpft, das 24 g von Kartoffel-Dextrose-Medium (hergestellt durch Difco Co.) pro Liter enthielt und unter Schütteln bei 28ºC 4 Tage lang kultiviert. Nach Beendigung der Kultivierung wurde die Brühe zentrifugiert und Chloroform zum Überstehenden hinzugegeben, um eine Phasentrennung zu bewirken. Die Chloroformschicht wurde kondensiert und das Kondensat einer Siliziumdioxidgel (Wacohgel C-200)-Säulenchromatografie unterworfen, wobei man Chloroform als ein Elutionsmittel benutzte, um aktive Fraktionen zu erhalten. Nach der Kondensation und dem Trocknen der Fraktionen wurde die Zielverbindung in einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform und Methanol gelöst. Durch Zugabe von n-Hexan zu der Lösung wurden 10 mg nadelartiger hellgelber Kristalle von YI-HU3 erhalten.
Diese Substanz wies die oben erwähnten physikochemischen Eigenschaften auf.

Claims

1. Antibiotikum YI-HU3 mit den folgenden physikochemischen Eigenschaften:

(a) Molekulargewicht

469

(b) Schmelzpunkt

180 bis 190ºC

(c) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (in Chloroform)

Die maximale Absorption findet sich in der Nähe von 312 nm, wobei sich die zweitgrößte Absorption in der Nähe von 300 nm befindet (siehe Fig. 1).

(d) Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr-Verfahren)

Siehe Fig. 2

(e) ¹H-NMR-Spektrum (CDCl&sub3;/CD&sub3;OH)

Siehe Fig. 3

(f) ¹³C-NMR-Spektrum (CDCl&sub3;/CD&sub3;OH)

Siehe Fig. 4

(g) Löslichkeit in Lösungsmitteln

Löslich in Methanol und Chloroform und nicht löslich in n-Hexan.

(h) Farbe und Zustand der Substanz

Hellgelbe Kristalle.

2. Ein Verfahren zum Herstellen des Antibiotikums YI- HU3 umfassend das Kultivieren eines das Antibiotikum YI- HU3 erzeugenden Mikroorganismus, der zur Gattung Pseudomonas gehört und Sammeln des Antibiotikums YI-HU3 aus der Kulturbrühe.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin der genannte, das Antibiotikum YI-HU3 erzeugende Mikroorganismus Pseudomonas sp. YI-HU ist.