DE2019838B2 - 4-Hydroxy-5(3)-ribofuranosylpyrazol-3(5)-carboxamid und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents
4-Hydroxy-5(3)-ribofuranosylpyrazol-3(5)-carboxamid und Verfahren zu seiner HerstellungInfo
- Publication number
- DE2019838B2 DE2019838B2 DE2019838A DE2019838A DE2019838B2 DE 2019838 B2 DE2019838 B2 DE 2019838B2 DE 2019838 A DE2019838 A DE 2019838A DE 2019838 A DE2019838 A DE 2019838A DE 2019838 B2 DE2019838 B2 DE 2019838B2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- medium
- virus
- growth
- compound
- antibiotic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D407/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00
- C07D407/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings
- C07D407/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07G—COMPOUNDS OF UNKNOWN CONSTITUTION
- C07G11/00—Antibiotics
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/886—Streptomyces
- Y10S435/892—Streptomyces candidus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft die antibiotische Verbindung 4-Hydroxy-5(3)-ribofuranosylpyrazol-3(5)-carboxamid
und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Das neue Antibiotikum hat die Formel
H2N
HOH2C
OFI
und wird dadurch hergestellt, daß man Streptomyces candidus NRRL 3601 in einem Kulturmedium, das
assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submers-aeroben
Bedingungen bei einer Temperatur von 25 bis 370C und während einer Dauer von etwa 24 bis etwa 72 Stunden
züchtet und die gebildete Verbindung nach Anspruch 1 aus dem Kulturmedium isoliert.
Die erfindungsgemäße Verbindung ist eine farblose kristalline Substanz vom Schmelzpunkt 108 bis 113° C,
die in Wasser, Methanol, Äthanol, Propanol und Butanol löslich, in Äthylacetat wenig löslich und in Kohlenwasserstofflösungsmitteln
und Diäthyläther unlöslich ist. Sie besitzt einen optischen Drehwert [λ] S" von -45,5°
[C = 0,78% (Gew./Vol.), Wasser], eine ungefähre Zusammensetzung von 41,56% Kohlenstoff, 5,25% Wasserstoff,
16,0% Stickstoff und 36,25% Sauerstoff, eine titrierbare Gruppe von pKa' = 6,9, ein massenspektroskopisch
berechnetes Molekulargewicht von 259 und eine empirische Formel GtHuNA,. Bei Messung als
Kaliumbromidpreßling im Infrarotabsorptionsspektrum über den Bereich von 2,0 bis 15,0 Mikron weist die
"> Verbindung folgende unterscheidbare Banden auf: 3,10;
3,40; 6,04; 6,21; 6,51; 6,80; 7,00; 8,50; 9,00; 9,30; 9,80; 11,20;
11,70; 12,90; 13,60 und 14,00 Mikron.
Der spezifische optische Drehwert [λ] 1 der kristallinen
erfindungsgemäßen Verbindung ist an einer Probe
κι bestimmt, die vorher etwa 15 Stunden bei Raumtemperatur
im Vakuum über wasserfreiem Calciumchlorid getrocknet wird. Die Gegenwart der einen titerbaren
Gruppe vom pKa' = 6,9 ist durch elektrometrische Titration in wäßriger Lösung ermittelt. Das Infrarotab-
i") Sorptionsspektrum der Verbindung als Kaliumbromidpreßling
ist in F i g. 1 dargestellt. Das in saurem und neutralem Äthanol erhaltene Ultraviolettspektrum der
erfindungsgemäßen Verbindung zeigt folgende Maxima: 232 ηιμ (ε = 7,4 · ΙΟ3) und 263 πιμ (ε = 6,2 · 103). Bei
:<> 213 und 242 rr^sind Minima vorhanden. Bei Zusatz von
Ba.se verschiebt sich das Spektrum zu Maxima bei 235 ιτιμ (ε = 5,1 · ΙΟ3) und 207 ιτιμ (ε = 5,1 · ΙΟ3) und
einem Minimum bei 257 ΐημ. Ein Röntgenbeugungspulverdiagramm
dieser Verbindung unter Verwendung von
r> ungefilterter Chromstrahlung und einer Wellenlänge von 2,2896 A zur Berechnung der Netzebenenabstände
liefert die in der DE-OS 20 19 838 auf Seite 4 angegebenen Werte.
Die erfindungsgemäße Verbindung weist antifungale
i" Aktivität gegenüber Neurosporaarten auf und kann
daher, wenn sie in Waschlösungen und dergleichen eingebracht wird, mit Vorteil dazu verwendet werden,
Wände und andere Oberflächen in Krankenhäusern, Schwimmbädern und dergleichen frei von Befall durch
π solche Pilze zu halten.
Die erfindungsgemäße Verbindung ist in vivo gegen Kuhpocken und Herpes simplex wirksam und zur
Behandlung von Vireninfektionen, zum Beispiel Pocken und Gesichfiherpes, in Tagesdosen von 0,5 bis
•io 250 mg/kg vorteilhaft. Sie kann an Warmblüter, zum
Beispiel Mäuse, Ratten, Hunde und dergleichen, entweder oral oder parenteral verabreicht werden. Die
In-Vitro-Aktivität dieses Stoffs gegen Virenwachstum in Gewebekulturen wurde an einer Reihe von Viren,
■4") darunter Masernviren, Herpes-simplex-Viren, Kuhpokken-Viren
und Coxsackie-Viren, nachgewiesen.
Die Fähigkeit der Bekämpfung des Viruswachstums in vitro läßt sich leicht mit Hilfe eines ähnlichen
Fleckensuppressionstests nachweisen, wie er von S i m i η ο f f, Applied Microbiology, 9,66 -72 (1961) und
von De Long et al., »Biological Evaluation of A 10598«, Annual of N. Y. Academy of Science 130,
44-48 (1965) beschrieben worden ist. Bei der Prüfung auf antivirale Aktivität sind Flecken in den Gebieten der
Platte zu sehen, in denen das Virus die Zellen infiziert und sich in den Zellen reproduziert hat. Toxizitätszonen,
deren Durchmesser in mm gemessen wird, werden ebenfalls beobachtet, wenn die Testverbindung eine
letale cytologische Wirkung auf Wirtzellen unterhalb und um die Filterpapierscheibe hat. Antivirale Aktivität
der Testverbindung wird Fehlen von Flecken und eines stärkeren Wachstums von Zellen in einer Zone unter
und um eine Filterpapierscheibe nachgewiesen. Der Durchmesser dieser Zone wird in mm gemessen. Die
Zellen in einer Aktivitätszone werden mit einem Mikroskop untersucht, um das Auftreten und das
Ausmaß von Schaden durch Wirkstoff und/oder Virus zu ermitteln. Die Färbung wird nach einer abgestuften
Skala mil 1 +,2 + ,3 + ,4+ und negativ folgendermaßen
bewertet:
4 + Dunkelgefärbte Gebiete, die bei mikroskopischer Untersuchung gesunde Zellen ohne sichtbare
Virus- oder Wirkstoffschäden zeigen.
3 + Weniger dunkel gefärbte Gebiete, die keine Virusoder Wirkstoffschäden zeigen, aber weniger
gesund aussehen.
2+ Gebiete, die gesunde Zellen mit mäßigem Virusdurchbruch zeigen.
1 + Gebiete, die gesunde Zellen mit stärkerem Virusdurchbruch zeigen.
— Keine lebenden Zellen.
Die folgende Tabelle I zeigt die Ergebnisse der Prüfung von Salzen der erfindungsgemäßen Verbindung
gegen Masern-Viren (Edmondston-Stamm), Kuhpokken-Viren
(Vl Lindeman), Coxsackie-Viren und Herpessimplex-Viren.
Spalte ί der Tabelle gibt die Konzentration in Mikrogramm/Milliliter an, in der der Wirkstoff
auf die Filterpapierscheiben aufgebracht wird, Spalte 2 den Durchmesser der Zone der Virusinhibierung durch
die Testverbindung in mm, Spalte 3 die Bewertung von gefärbten Gebieten und Spalte 4 den Namen des Virus,
gegen das die Verbindung getestet wird.
Antivirale Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindung in vitro
Kon z.
(mcg/ml)
Zone
(mm)
Mikroskopische Untersuchung
Virus
3,5
60
50
50
50
50
40
25
22
20
28
35
33
30
30
25
22
50
50
50
50
40
25
22
20
28
35
33
30
30
25
22
4+
4+
4+
4+
4+
4+
4+
4+
4+
3+
3+
3+
3+
3+
3+
2+
Kuhpocken Kuhpocken Kuhpocken Kuhpocken Kuhpocken Kuhpocken Kuhpocken
Kuhpocken Kuhpocken Herpes simplex Herpes simplex Herpes simplex Herpes simplex Herpes simplex
Herpes simplex Herpes simplex Kon/.
(mcg/ml)
Zone
(mm)
Mikroskopische Untersuchung
Virus
3,5
1000
500
250
125
3,5
1,5
0,75
1000
500
250
125
62
31
15
7
3,5
1,5
0,75
1000
500
250
125
62
31
15
7
3,5
12 10 50 43 43 37 30 37 30 22 20 15 11 33 35 33 30 30 30 15 15 11
2+ 2 + 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 1 + 1 +
1 + 1 +
Herpes simplex
Herpes simplex
Masern
Masern
Masern
Masern
Masern
Masern
Masern
Masern
Masern
Masern
Masern
Coxsackie
Coxsackie
Coxsackie
Coxsackie
Coxsackie
Coxsackie
Coxsackie
Coxsackie
Coxsackie
Die antiviralen Aktivitäten der erfindungsgemäßen Verbindung und des dem nächstvergleichbaren Stand
der Technik angehörenden Antibiotikums Formycin werden gegenüber einer Anzahl von Viren verglichen.
j-, Hierzu sind in der folgenden Tabelle die Konzentrationen
in mcg/ml, die akuten Toxizitäten der zu untersuchenden Verbindungen bei den angegebenen
Konzentrationen, die Durchmesser der Zonen der Virusinhibierung durch die Testverbindungen in mm als
Maß für die Aktivität sowie - die Ergebnisse der mikroskopischen Untersuchung der behandelten Zellen
in Form der nachfolgenden qualitativen Bewertung wiedergegeben:
4+ Gesunde Zellen ohne Virus- oder Wirkstoffschä-
den.
3 + Gesunde Zellen mit vermindertem Stoffwechsel.
2+ Hauptanteil der Zellen gesund mit leichtem Virusdurchbruch.
I + Geringer Teil der Zellen gesund mit stärkerem
)0 Virusdurchbruch.
Je höher der numerische Wert, um so größer die antivirale Aktivität.
Vergleich der antiviralen Aktivitäten in vitro von Formycin und der erfindungsgemäßen Verbindung
Kon z.
(mcg/ml)
Gegenüber Toxizität
Formycin erf. Verbindung
Aktivität, Zone (mm)
Formycin erf.Verbindung
Mikroskopische Untersuchung
Formycin
erf. Verbindung
Kuhpocken
1000 500
14 12 32 30
60 50
4+ 4+
Fortsetzung
Kon/.
(mcg/nil)
Gegenüber Toxiziliit
Formycin erf. Verbindung
Aktivität, /one (mm)
l-ormycin erf.Vcrbindung
Mikroskopische Untersuchung
Formycin
erf. Verbindung
250 | 10 |
125 | - |
1000 | 14 |
500 | 10 |
250 | 7 |
125 | - |
1000 | 22 |
500 | 18 |
250 | 13 |
125 | 11 |
1000 | 23 |
500 | 15 |
250 | 10 |
125 | - |
1000 | 23 |
500 | 20 |
250 | 14 |
125 | 11 |
2. Coxsackie A 21
3. Virus 5 AP 305
4. Virus Adeno (SA-7)
5. Virus Maryland B
Diese Versuche erfolgten in vitro an Gewebekulturen. Bei der Untersuchung betreffend die Viren Nr. 1
und 4 wurde eine Affennierengewebekultur verwendet, die mit der Abkürzung BSC-I bezeichnet wird. Der
Virus Nr. 2 wurde in menschlichem Fruchtwasser (als AV2 bezeichnet) untersucht, während die Viren Nr. 3
und 5 an Zellen von Hundenieren (als MCDK bezeichnet) untersucht wurden. Die bei den verschiedenen
Konzentrationen angegebenen Toxizitatswertc wurden im Anschluß an die Untersuchungen durch
mikroskopische Bewertung der Gewebekulturcn ermittelt.
Die angegebenen Werte stehen für den Durchmesser der toxischen Zone in Millimeter, so daß die
Toxizität um so günstiger ist, je kleiner die angegebene Zahl ist.
Au:; den angegebenen Toxi/.itätswerten ist ersichtlich,
daß das erfindungsgemäße Antibiotikum eine geringere Toxizität als das Verglcichsantibiotikum Formycin
besitzt. Weiterhin entfaltet das erfindungsgemäße Antibiotikum eine erheblich größere Wirkung, was aus
den Aktivitätszahlcn und den Ergebnissen der mikroskopischen Untersuchung ersichtlich ist. Zum Beispiel
betragen für den Virus Nr. I die bei der mikroskopischen Untersuchung erhaltenen Werte für die erfindungsgemäße
Verbindung bei allen Konzentrationen 4+, während die mit Formycin erhaltenen Ergebnisse
nichtsignifikant waren, was durch das in der Tabelle des Vcrsuchsbcrichts angegebenen Pluszeichen verdeutlicht
ist. Weiterhin ergibt sich ein erheblicher Aktivitiitsunterschied im Full des Virus Nr. 2, nämlich des
(oxsuekie· Virus A 21, der gegenüber der erfindtingsgemäßen
Verbindung eine Aktivität von 2+ entfaltet, während l'ormycin wiederum /11 nichlsignifikuntun
24
20
20
24
20
14
14
20
14
14
34
30
24
20
30
24
20
40
35
24
20
35
24
20
40
35
24
20
35
24
20
50
50
50
33
35
33
30
35
33
30
50
40
30
30
40
30
30
50
40
30
30
40
30
30
50
40
30
30
40
30
30
2+ 2+ 2+ 2+
3+ 3+ 3+ 3+
3+ 3+ 3+ 3+
4+ 4 +
2+ 2 + 2 + 2 +
4+ 4+ 4+ 4+
4+ 4+ 4+ 4+
4+ 4+ 4+ 4+
Ergebnissen führt (+). Selbst im Fall der Viren Nr. 4 und 5 zeigt sich das erfindungsgemäße Antibiotikum bei
allen Konzentrationen erheblich aktiver als Formycin.
Der Mikroorganismus Streptomyces candidus wurde erstmals aus aus Indien stammenden Bodenproben
folgendermaßen isoliert.
Anteile der Bodenproben wurden in sterilem destilliertem Wasser suspendiert, und die Suspensionen
wurden in Streifen auf Nähragarplatten aufgetragen. Die angeimpften Nähragarplatten wurden mehrere
Tage bei etwa 300C inkubiert. Am Ende der Inkubatiotisdauer wurden Kolonien der die erfindungsgemäße
Verbindung produzierenden Organismen mit Hilfe einer sterilen Platinschlingc auf Schrägagar
überführt. Die inokulierten Agarschrägkulturen wurden dann zur Erzielung größerer Mengen Inokulum für die
Produktion der Substanz inkubierl.
Der neue Mikroorganismus wurde ohne Beschränkung bei der Kultursammlung der Northern Utilization
Research and Development Division, Agricultural Research Service, U. S. Department of Agriculture
(früher Northern Regional Research Laboratories) Pcoria, Illinois hinterlegt und ist für jedermann unter der
Kulturnummcr NRRL 3601 erhältlich.
Wegen der Schwierigkeiten von Uixonomischen
Bestimmungen bei Mikroorganismen der Gruppe Strcplomyccs ist die Klassifizierung eines neu aufgefundenen
Organismus stets mit einer gewissen Unsicherheit behaftet. Der die crfindungsgemäße Verbindung
produzierende Organismus steht jedoch offenbar in seinen wichtigsten Merkmalen dem Mikroorganismus
Sireptomyces candidus ( K r a s s i I η i k ο ν ) Waksman
iiulf-'πιικΐ einer veröffentlichten Beschreibung dieses
Mikroorganismus von Waksman, The Actionmycetes,
Bd. 2, Classification, Identification and Description of Genera and Species, The Williams and Wilkins Co.,
Baltimore, Maryland (1963) am nächsten.
Die Kultur NRRL 3601 wird der Sektion Rectus-flexibilis,
Weiß-Serie nach Pridham et al. (Pridham
et al., »Α Guide for the Classification of Slreplomycetes According to Selected Groups«, Applied Microbiol. 6:
52—79 [1958]) sowie ferner entweder der Weiß-Serie oder der Gelb-Scrie des Systems nach Tresner and
Backus (»System of Color Wheels for Streptomycele
Taxonomy«, Applied Microbiol. 11: 335-338 [1963]) zugeordnet. Wie oben angegeben, wurde der Mikroorganismus
als Stamm von Streptomyces candidus klassifiziert. Es wird jedoch darauf hingewiesen, daß
andere Spezies, nämlich Streptomyces alboflavus und Streptomyces longissimus ebenfalls Streptomyces candidus
NRRL 3601 ähnlich sind. Generell bildet Streptomyces candidus NRRL 3601 gewellte Sporophoren
und zylindrische glatte Sporen, die en masse weiß bis blaßgelb sind. Das vegetative Mycel ist gelb bis
orangegelb. Ein hellgelbes bis hellbraunes lösliches Pigment ist in zwei Medien vorhanden und fehlt in allen
anderen Medien. Auf den meisten Medien kommen Büsche! von Luftmycel und sclerotische Bildungen vor.
Für die taxonomischen Untersuchungen des die
Beschreibung der Kultur NRRL 3601
erfindungsgemäße Verbindung produzierenden Stamms von S. cancidus wurden die Methoden, die für das
internationale Streptomycesprojekt, beschrieben von S h i r 1 i η g und G ο 111 i e b, »Methods for Characterization
of Streptomyces Species«, Intern. Bull. Systemic Bacteriol.: 16, 313-340 (1966), empfohlen werden,
zusammen mit weiteren Hilfstests angewandt. Kohlenstoffverwertungstests wurden nach der Methode
durchgeführt, die von Pridham und G ο 111 i e b,
J. Bac. 56:107 (1948) beschrieben wurde. Die Ergebnisse
der taxonomischen Bestimmungen sind nachstehend in Tabelle III angegeben. Farbnamen wurden nach der
ISCC-NBS-Methode ( K e 11 y und J u d d, »The ISCC-NBS-Method
of Designating Colors and a Dictionary of Color Names«, U. S. Dept. of Commerce Circ. 553,
Washington, D. C.) zugeordnet. Angaben in runden Klammern beziehen sich auf die Farbreihe nach
Tresner und Backus (Tresner und Backus, »System of Color Wheels for Streptomyces Taxonomy«,
Appld. Microbiol. 11: 335-338 [1966]), Farbblocks nach
Maerz und Paul (Maerz und Paul, Dictionary
of Color, McGraw-Hill, New York [1950]) sind in eckigen Klammern angegeben. Wenn nichts anderes
angegeben ist, wurden die Kulturen 14 Tage bei 300C gezüchtet.
Beobachtete Eigenschaft
Charakteristika von NRRL 3601
Morphologie
Kulturmerkmalc auf:
Ilefe-Malz-Agrar
Ilefe-Malz-Agrar
Hafermehl-Agrar
Inorganische Salze und Stärke
Inorganische Salze und Stärke
Glyccrin-Asparagin-Agar
Czapeks Agar
Czapeks Agar
Tabelle III (Fortsetzung)
Beschreibung der Kultur NRRL 3601
Beschreibung der Kultur NRRL 3601
gewellte Sporophoren werden auf gebüscheltcm Luftmycel gebildet; die
Sporen sind cyclindrisch. Abmessungen 0,67-1,0 μ · 1,7-2,7 μ, mit glatten
Sporenoberflächen (elektronenmikroskopische Aufnahme)
Wachstum reichlich, Revers mittelgelb [11J6]; Luftmycel und Sporulation
mäßig, weiß (W) a; kein lösliches Pigment; Sclerotiabildung
Wachstum mäßig, Revers gelblichweiß [9Cl]; Luftmycel und Sporulation
mäßig, weiß (W) a; kein lösliches Pigment; Sclerotiabildung
Wachstum mäßig, Revers mittelgelb [10H4]; Luftmycel mäßig, Sporulation
mittel, gelblichweiß (Y) 2ba [9D2]; lösliches Pigment spärlich braun;
Sclerotia vorhanden Wachstum mäßig, Revers lcbhaftgelb [9J5]; Luftmycel und Sporulation
mittel, weiß (W) a; kein lösliches Pigment
Wachstum reichlich, Revers lebhaftgelb [11J5]; Luftmycel mittel, weiß
(W) a, keine Sporulation; kein lösliches Pigment
Bcobiichtctc Eigenschaft
Charakteristika von NRRL 3601
Glucosc-Asparagin
Tyrosin-Agar
Tyrosin-Agar
Nühr-Agur
Ciilciummnhit
Ciilciummnhit
Wachstum reichlich, Revers mittclgclb [1IJ6]; Luftmycel reichlich, Sporulation
mittel, blaßgclb (Y) 2ba [9D2]; kein lösliches Pigment
Wachstum mäßig, Revers hcllgräulichbraun [11B2]; Luftmyccl mäßig,
weiß (W) a, Sporulation gering, kein lösliches Pigment; Sclerotia vorhanden
Wachstum mäßig, Revers blaßgclbgrün | K)BI]; Luftmyccl spärlich, keine
Sporulation; kein lösliches Pigment; Sclerotia vorhanden
Wachstum reichlich, Revers mittclgclb |I()J5|; Luftmyccl und Sporulation
mäßig, blaßoningcgclb (R) 3cn |9K3|; lösliches Pigment hellgelb
Foitsel/imu
ίο
Beobachtete Eigenschaft
Charakteristika von NRRL 3601
Glycerin-Glycin
Tomatenpaste-IIalermehl
Tomatenpaste-IIalermehl
Emersons Agar
Bennetts Agar
Bennetts Agar
Wirkung auf Milch
Nitratreduktion
Nitratreduktion
Melaninbildung auf:
Pepton-Eisen-Agar
Trypton-Hefeextrakt-Brühe
Gelatineverflüssigung
Temperaturanforderungen
Trypton-Hefeextrakt-Brühe
Gelatineverflüssigung
Temperaturanforderungen
Reaktion der Substratfarbe auf
pH-Änderung
pH-Änderung
C-Quellcnverwertung
L-Arabinose
Saccharose
D-Xylose
D-Fructose
i-Inosit
D-Mannit
D-Dcxtrose
Maltose
Melizitose
Cellulose
Kein Kohlenstoff (Kontrolle)
L-Arabinose
Saccharose
D-Xylose
D-Fructose
i-Inosit
D-Mannit
D-Dcxtrose
Maltose
Melizitose
Cellulose
Kein Kohlenstoff (Kontrolle)
Wachstum reichlich, Revers mittelgelb [11J6J; Luftmycel mäßig, Sporulation
mittel, weiß (W) a; kein lösliches Pigment
Wachstum reichlich, Revers mitttclorange bis mittelorangegelb [10J7];
Luftmycel und Sporulation reichlich, blaßgelb (Y) 2ba [9D2J; kein lösliches
Pigment
Wachstum reichlich, Revers hellgelb [I0G3); Luftmycel spärlich, keine
Sporulation; kein lösliches Pigment
Wachstum reichlich, Revers mittelorangegelb [1016]; Luftmycel reichlich,
Sporulation mittel, weiß (W) a; kein lösliches Pigment
schwache Koagulation und gewisse Klärung in 14 Tagen
schwache Reduktion in 14 Tagen
schwache Reduktion in 14 Tagen
negativ
negativ
vollständig in 14 Tagen
Wachstum auf Hefe-Malz-Agar von 26 C bis 37 C; kein Wachstum bei
43 C
unbeeinflußt
Erläuterung: + Verwertung positiv. (+) Verwertung wahrscheinlich. (-) Verwertung fraglich. - keine Verwertung.
Zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Verbindung durch Züchtung des oben beschriebenen Mikroorganismus
können zahlreiche Medien verwendet werden, da, wie aus den vorstehenden Verwertungs tests zu ersehen
ist, der Organismus verschiedene Energiequellen zu verwerten vermag. Zur Erzielung einer wirtschaftlichen Ti
Produktion, einer maximalen Ausbeute an Antibiotikum und einer leichten Isolierung des Antibiotikums sind
jedoch einige verhältnismäßig einfache Nährmedien vorzuziehen. Beispielsweise enthalten die Medien, die
für die Produktion des Antibiotikums vorteilhaft sind, ω> eine assimilierbare Kohlenstoffquelle wie Dextrose,
Dextrin, Glycerin und dergleichen. Die bevorzugte Kohlenstoffquelle ist Dextrose. Ferner enthalten verwendbare
Medien eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, z. B. Soyabohnenmehl, Maisquellwasscrfcst- M
stoffe, Hefe, Baumwollsamenmehl, Rindfleischexlrakt. Peptone (aus Fleisch oder Soyabohncn), Casein,
Aminosäuregemische und dergleichen. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Peptone, Hefeextrakte, Aminosäuregemische
und dergleichen. Zu den anorganischen Nährsalzen, die in die Züchtungsmedien eingebracht
werden können, gehören die üblichen Salze, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-,
Sulfat-, Chlorid- und Carbonationen und ähnliche Ionen liefern.
Spurenelemente, die für ein optimales Wachstum und eine optimale Entwicklung des zur Produktion der
erfindungsgemäßen Verbindung verwendeten Organismus erforderlich sind, sollen ebenfalls in dem Kulturmedium
enthalten sein. Solche Spurenelemente sind gewöhnlich in den anderen Bestandteilen des Mediums
als Verunreinigungen in genügenden Mengen enthalten, um den Wachstumsbedari des für die erfindungsgemäßen
Zwecke verwendeten Actinomyceten zu erfüllen.
Der Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums kann schwanken. Ais zweckmäßig hat sich jedoch ein
Anfangs-pH-Wert des Mediums zwischen etwa 6,0 und
etwa 7,5 erwiesen. Wie bei anderen Actinoinyceten steigt der pH-Wert des Mediums während der
Wachstumperiode des Organismus, in der das Antibiotikum erzeugt wird, allmählich an und kann einen Wert
von etwa 6,5 bis 8,0 oder darüber erreichen, wobei der i End-pH-Wert wenigstens zum Teil von dem AnfangspH-Wert
des Mediums, den in dem Medium enthaltenen Puffern und der Zeitdauer abhängt, während der
Organismus wachsengelassen wird.
Submers-aerobe Züchtungsbedingungen sind die Bedingungen der Wahl zur Produktion des gewünschten
Antibiotikums. Zur Erzeugung verhältnismäßig kleiner Mengen können Schüttelkolbenkulturen und Oberflächenkulturen
in Flaschen angewandt werden. Zur Herstellung großer Mengen dagegen wird eine ii
submers-aerobe Züchtung in sterilen Tanks bevorzugt. Das Medium in dem sterilen Tank kann mit einer
Sporensuspension inokuliert werden. Wegen der Wachstumsverzögerung, die bei Verwendung einer
Sporensuspension als Inokulum beobachtet wird, wird 2<i jedoch die vegetative Form der Kultur bevorzugt.
Indem so die Wachstumsverzögerung vermieden wird, wird die Fermentationsvorrichtung besser ausgenutzt.
Es ist daher zweckmäßig, zuerst durch Inokulieren einer verhältnismäßig kleinen Menge Kulturmedium mit der 2>
Sporenform des Organismus ein vegetatives Inokulum zu erzeugen, und, wenn ein junges, vegetatives
Inokulum erhalten worden ist, das vegetative Inokulum
aseptisch in den großen Tank zu überführen. Das Med'um, in dem das vegetative Inokulum erzeugt wird, m
kann entweder das gleiche Medium oder ein anderes Medium als das Medium sein, das zur Produktion der
erfindungsgemäßen Verbindung in großem Maßstab verwendet wird.
Der eingesetzte Organismus wächst innerhalb eines r> weiten Temperaturbereichs von 25 bis 37°C. Optimale
Produktion an erfindungsgemäßer Verbindung erfolgt offenbar bei Temperaturen von 25 bis 3O0C. Im
allgemeinen erfolgt eine maximale Produktion des Antibiotikums innerhalb etwa 48 bis 72 Stunden nach
dem Inokulieren des Kulturmediums.
Wie es bei aeroben Submers-Kulturverfahren üblich ist, wird durch das Kulturmedium sterile Luft geblasen.
Zur Erzielung eines wirksamen Wachstums des Organismus und einer entsprechenden Wirkstoffpro- 4>
duktion wird bei der Tankproduktion ein Luftvolumen von 0,35 bis 0,80 Volumenteilen Luft pro Minute und pro
Volumenteil Kultur angewandt. Bevorzugt werden 0,40 Volumenteile Luft pro Minute und pro Volumenteil
Kulturmedium. so
Die Konzentration an antibiotischer Aktivität in dem Kulturmedium kann während der Fermentationsdauer
leicht durch Prüfung von Proben des Kulturmediums auf ihre inhibierende Wirkung auf das Wachstum von
Organismen, die durch Anwesenheit der erfindungsgemäßen Verbindung inhibiert werden, leicht verfolgt
werden. Der Organismus Neurospora spp. hat sich für diesen Zweck als geeignet erwiesen. Die Prüfung der
Proben kann nach dem bekannten Diffusionsverfahren mit Agarnäpfchen erfolgen. t>o
Bei submers·aeroben Kulturen oder Schüttelkolbcnkullurcn
erfolgt im allgemeinen eine maximale Produktion an gewünschter Substanz innerhalb etwa 2 bis 3
Tagen nach Inokulieren des Kulturmediums.
Die während der Fermentation der Verbindung (,5
erzeugte antibiotische Aktivität kann entweder in der anlibiolischen Brühe und/oder im Myccl vorliegen.
Dnhcr sind die bei der Produktion des Wirkstoffs angewandten Isoiierungsmethoden so ausgelegt, daß
eine maximale Gewinnung des Antibioiikums aus jeder der beiden Quellen oder beiden Quellen ermöglicht
wird. So kann beispielsweise die Fermentationsbrühe, so wie sie erhalten wird, filtriert und das Antibiotikum
durch Adsorption aus dem Filtrat mit einem geeigneten Adsorptionsmittel, zum Beispiel Kohle, und Eluieren der
Aktivität aus dem Adsorptionsmittel, beispielsweise mit Aceton/Wasser als Eluiermittel, gewonnen werden. Das
rohe Antibiotikum wird durch lonenaustauschchromatographie und Gelfiltration weiter gereinigt. Außerdem
kann das restliche Antibiotikum, das in dem Mycelkuchen enthalten ist, durch gründliche Extraktion mit
einem geeigneten Lösungsmittel, zum Beispiel Methanol, gewonnen werden. 75 bis 95% der Aktivität wurden
jedoch in der Brühe gefunden.
Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung näher erläutert.
Schüttelkolbenproduktion
der erfindungsgemäßen Verbindung
der erfindungsgemäßen Verbindung
Sporen von Streptomyces candidus NRRL 3601 werden auf Nähragarschrägkulturen inokuliert. Das
Nähragarmedium besteht aus 10 g Dextrin, 2 g enzymatisch abgebautem Casein, 1 g Rindfleischextrakt, 1 g
Hefeextrakt, 20 g Agar und destilliertem Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 1 Liter. Die Schrägkulturen
werden mit Sporen von Streptomyces candidus NRRL 3601 inokuliert und 4 bis 6 Tage bei 300C inkubiert. Die
reifen Schrägkulturen werden mit sterilem destilliertem Wasser bedeckt und vorsichtig mit einer Schlinge
abgeschabt, um die Sporen abzulösen und eine wäßrige Sporensuspension zu erzeugen. 1 ml der erhaltenen
Sporensuspension wird zum Inokulieren von jeweils 100 ml vegetativem Medium verwendet.
Das vegetative Kulturmedium wird aus 15 g Glucose,
15 g Sojabohnenmehl, 5 g Maisquellwasserfeststoffen, 2 g Calciumcarbonat, 5 g Natriumchlorid und Leitungswasser
bis zu einem Gesamtvolumen von 1 Liter bereitet.
Das vegetative Inokulum wird 48 Stunden bei 300C
auf einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung mit einem Ausschlag von 5 cm (2") bei 108UpM geschüttelt.
Das so bereitete Inokulum wird dann wie folgt für die Produktion des gewünschten Antibiotikums verwendet.
Es wird ein Produktionsmedium mit folgender Zusammensetzung bereitet:
Sojabohnenmehl | 15 g/l |
Casein | lg/l |
NaNO3 | 3 g/l |
Glucosesirup | 20 g/l |
CaCO3 | 2,5 g/l |
Leitungswasser |
Anteile des Produktionsmediums von 100 ml werden in 500-inl-Erlenmeyer-Kolbcn gegeben, die dann 30
Minuten bei 1200C sterilisiert werden, Nach dem Abkühlen wird jeder Kolben mit 5% eines wie oben
bereiteten vegetativen Inokuliims inokuliert.
Die Produktionskolbcn werden 48 Stunden bei 300C
auf einer Rotationssehüttelvorrichtung mit einem Bogenausschlag von 5 cm (2") geschüttelt, die mit 250
UpM betrieben wird. Der pH-Wert des nichtinokulierten Mediums reicht von 6,0 bis 7,5. Der pH-Wert am
Ende des Fermentationszyklus liegt zwischen 6,5 und 8,0. Die antifunealc und antivirale Wirkstoffaktivität
wird sowohl in der Brühe als auch im Myccl gefunden.
Die Aktivität wird durch Prvfung der Brühe und des Mycel gegen Neurospora spp. nachgewiesen. Die
Isolierung der Substanz wird wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt.
Beispiel 2
Halbtechnische Produktion des Antibiotikums
Halbtechnische Produktion des Antibiotikums
Die Produktion des erfindungsgemäßen Antibiotikums durch Submers-Fermentation in halbtechnischem
Maßstab zeigt das folgende Beispiel:
In einen 250-ml-Kolben, der 50 ml eines vegetativen
Mediums aus 10 g/l Dextrose, 25 g/l Dextrin, 20 g/l Sojapepton, 5 g/l lösliche Anteile von Destillationsrückständen
bei der Alkoholherstellung und Leitungswasser mit einem pH-Wert von 6,6 enthält, wird ein lyophiles
Kügelchen gegeben, das aus den in Beispiel 1 beschriebenen reifen Nähragarschrägkulturen hergestellt
ist.
Das inokulierte vegetative Medium wird 48 Stunden bei etwa 30°C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung
mit einem Bodendurchmesser von 5 cm (2") inkubiert, die mit 250 UpM betrieben wird. Der End-pH-Wert des
Mediums wird mit 7,0 bestimmt. Ein Anteil der so erhaltenen vegetativen Kultur von 20 ml wird zum
Inokulieren eines 1-Liter-Kolbens verwendet, der 100 ml des vegetativen Mediums enthält. Das inokulierte
vegetative Medium wird 48 Stunden bei etwa 30°C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung mit einem
Bogendurchmesser von 5 cm (2") inkubiert, die mit 250 UpM betrieben wird.
Der End-pH-Wert am Ende der zweiten Stufe beträgt 7,4. Ein Anteil der so erhaltenen vegetativen Kultur von
500 ml wird zum Inokulieren eines 40-Liter-Fermenters verwendet, der 25 Liter sterilisiertes wäßriges Fermentationsmedium
aus 0,2 g/l Entschäumer, 20 g/l Glycerin, 5 g/l Sojapeption, 2 g/l Calciumnitrat, 0,5 g/l Natriumchlorid,
3 g/l lösliche Anteile von Destillationsrückständen bei der Alkoholherstellung und Leitungswasser bis
zu einem Volumen von 25 Liter enthält. Nach dem Inokulieren wird die Fermentation 42 Stunden bei einer
Temperatur von 3O0C durchgeführt. Während der Fermentation wird mit einer Geschwindigkeit von 42(
UpM gerührt. Die Belüftung während der Fermentaiior erfolgt mit 0,4 Kubikmeter Luft pro Kubikmetei
Medium und pro Minute. Der End-pH-Wert beträgt 7,6. Ί Die Fermentationsmischung wird geerntet, und die
gesamte Brühe wird filtriert. Zu 25 Liter filtrierter Brühe werden 10% (Gewicht/Volumen) 1,68 χ 0.42 mm Ak
tiv-Kohle gegeben. Nach 30 Minuten langem Rührer wird die Mischung filtriert und mit Wasser gewaschen
κι Die Aktivität wird aus der Kohle durch drei
aufeinanderfolgende Behandlungen mit 9 Liter 1:1-Aceton-Wasser-Lösungsmiuelmischung
eluiert. Die Aceton-Wasser-Eluate werden vereinigt und auf eir
Volumen von etwa 500 ml eingeengt. Dann wird da*
π Konzentrat durch eine Kolonne mit 250 ecm stark
saurem lonenaustauscherharz (H+ -Form) geleitet, unc
die Kolonne wird mit Wasser gewaschen. Die Aklivitäi
wird an dem Harz nicht ausgetauscht und daher in deir abfließenden Volumen und in dem anschließenden
2(i Waschwasser aufgefangen. Der Abfluß und das Waschwasser werden vereinigt, und der pH-Wert wird
auf etwa 7,0 eingestellt. Dann wird die Lösung eingeengt und auf eine 5,0 χ 80-cm-Kolonne mit Dextrangel in
Wasser aufgegeben.
2i Die Kolonne wird mit Wasser eluiert. Die aktiven
Fraktionen (durch Prüfung gegen Neurospora spp X-846 nach dem Agar-Näpfchen-Diffusionsverfahren
ermittelt) werden vereinigt, eingeengt und gefriergetrocknet. Die Endreinigung erfolgt durch Säulenchro-
)(> matographie an einer Cellulose-Kolonne, die mil
70%igem Propanol equilibriert und eluiert wird. Das gefriergetrocknete aktive Präparat aus der Dextrangel-Kolonne
wird in der Mindestmenge 70%igem Propanoi gelöst und auf eine 2,2 χ 60-cm-Cellulose-Kolonne
j! aufgegeben. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt
und zu einer wäßrigen Lösung eingeengt und kristallisierengelassen, wodurch 850 mg erfindungsgemäße
Verbindung vom Schmelzpunkt 108 bis 113°C erhalten
werden, pKa' = 6,9 (Wasser).
Analyse für C9H13N3O6:
Ben: C 41,70, H 5,00, N 16,20, 0 37,10%;
gef.: C 41,56, H 5,25, N 16,02, O 36,25%.
gef.: C 41,56, H 5,25, N 16,02, O 36,25%.
Hierzu I Bhilt
Claims (2)
1.4-Hydroxy-5(3)-ribofuranosylpyrazol-3(5)-carboxamidder
Formel
HOCH,
HO
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
Streptomyces candidus NRRL 3601 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für
Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submers-aeroben Bedingungen bei
einer Temperatur von 25 bis 37°C und während einer Dauer von etwa 24 bis etwa 72 Stunden züchtet
und die gebildete Verbindung nach Anspruch 1 aus dem Kulturmedium isoliert.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US81867669A | 1969-04-23 | 1969-04-23 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2019838A1 DE2019838A1 (de) | 1970-10-29 |
DE2019838B2 true DE2019838B2 (de) | 1978-04-20 |
DE2019838C3 DE2019838C3 (de) | 1978-12-14 |
Family
ID=25226129
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2019838A Expired DE2019838C3 (de) | 1969-04-23 | 1970-04-23 | 4-Hydroxy-5(3)-ribofuranosylpyrazol-3(5)-carboxamid und Verfahren zu seiner Herstellung |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US3674774A (de) |
JP (1) | JPS496677B1 (de) |
BR (1) | BR6915071D0 (de) |
DE (1) | DE2019838C3 (de) |
DK (1) | DK128458B (de) |
FR (1) | FR2042367B1 (de) |
GB (1) | GB1281452A (de) |
NL (1) | NL7005784A (de) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3937822A (en) * | 1974-07-22 | 1976-02-10 | Eli Lilly And Company | Method for treating psoriasis |
US3960836A (en) * | 1974-07-22 | 1976-06-01 | Eli Lilly And Company | Acylated derivatives of pyrazofurin and process for their preparation |
US4074042A (en) * | 1975-08-07 | 1978-02-14 | Research Corporation | Pseudo-isocytidine |
US3998999A (en) * | 1975-10-20 | 1976-12-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Process for preparing pyrazomycin and pyrazomycin B |
JPS56110965U (de) * | 1980-01-29 | 1981-08-27 | ||
TW515841B (en) | 1998-01-16 | 2003-01-01 | Dev Center Biotechnology | Novel strain of Streptomyces candidus, and relevant uses thereof |
CA3094324A1 (en) | 2018-03-26 | 2019-10-03 | Clear Creek Bio, Inc. | Compositions and methods for inhibiting dihydroorotate dehydrogenase |
US12076315B2 (en) | 2020-03-20 | 2024-09-03 | Clear Creek Bio, Inc. | Stable polymorphic compositions of brequinar sodium and methods of use and manufacture thereof |
-
1969
- 1969-04-23 US US818676A patent/US3674774A/en not_active Expired - Lifetime
- 1969-12-12 BR BR215071/69A patent/BR6915071D0/pt unknown
-
1970
- 1970-04-21 NL NL7005784A patent/NL7005784A/xx not_active Application Discontinuation
- 1970-04-22 DK DK202970AA patent/DK128458B/da unknown
- 1970-04-22 JP JP45033942A patent/JPS496677B1/ja active Pending
- 1970-04-23 GB GB09669/70A patent/GB1281452A/en not_active Expired
- 1970-04-23 DE DE2019838A patent/DE2019838C3/de not_active Expired
- 1970-04-23 FR FR7014809A patent/FR2042367B1/fr not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR2042367A1 (de) | 1971-02-12 |
US3674774A (en) | 1972-07-04 |
NL7005784A (de) | 1970-10-27 |
BR6915071D0 (pt) | 1973-04-19 |
DE2019838C3 (de) | 1978-12-14 |
DK128458B (da) | 1974-05-06 |
GB1281452A (en) | 1972-07-12 |
DE2019838A1 (de) | 1970-10-29 |
JPS496677B1 (de) | 1974-02-15 |
FR2042367B1 (de) | 1974-05-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE2019838C3 (de) | 4-Hydroxy-5(3)-ribofuranosylpyrazol-3(5)-carboxamid und Verfahren zu seiner Herstellung | |
DE2167325C2 (de) | Antibiotikum A-201B und Verfahren zu seiner Herstellung | |
DD247023A5 (de) | Verfahren zur herstellung des cyclopeptidantibiotikumkomplexes a-21978c oder von faktoren hiervon | |
DE3012565A1 (de) | Antitumor-antibakterielle mittel | |
DE2004686C3 (de) | Makrolid-Antibioticum SF-837 und dessen Diacetylderivat und deren pharmakologisch nichtgiftige Säureanlagerungssalze sowie Verfahren zur Herstellung des Antibioticums SF-837 | |
DE3012014C2 (de) | Istamycine, Verfahren zu deren Herstellung sowie Verwendung derselben als antibakterielle Mittel | |
DE2839668C2 (de) | ||
DE2040141C3 (de) | Dipeptide und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
DE2455683A1 (de) | Verfahren zur herstellung von deacetoxycephalosporin c | |
DE2402956A1 (de) | Antibioticum a-287 und verfahren zu seiner herstellung | |
DE2725163C2 (de) | ||
DE1770441C2 (de) | Neue Antibiotika und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
CH622823A5 (en) | Process for the preparation of antibiotics, namely mimosamycin and chlorcarcins A, B and C | |
DE2946793C2 (de) | 4-O-Desmethyl-11-desoxy-anthracyclinglycoside, Verfahren zu deren Herstellung sowie diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen | |
DE1924431C2 (de) | Antibiotikum 17967RP und seine mikrobiologische Herstellung | |
DE1792819C2 (de) | Tenebrimycin-Antibiotikum VI und ein Verfahren zu dessen Herstellung | |
DE1929107C3 (de) | Antibiotika Axenomycin A und B, Verfahren zu deren Herstellung und ein die Antibiotika enthaltendes Arzneimittel | |
DE2830856A1 (de) | Neue antibiotisch wirksame verbindungen, verfahren zu deren herstellung und arzneimittel | |
DE1795154C3 (de) | Verfahren zur Herstellung eines neuen, Tuberactin genannten antibiotischen Wirkstoffes | |
DE2039990C2 (de) | Neue Antibiotika B-5050 A bis F (Maridomycin I bis VI), Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre pharmazeutische Zubereitung | |
DE1792817C2 (de) | Tenebrimycin-Antibiotikum II und Verfahren zu dessen Herstellung | |
DD202589A5 (de) | Verfahren zur herstellung von narasin | |
DE1792818C2 (de) | Tenebrimycin-Antibiotikum IV und ein Verfahren zu dessen Herstellung | |
AT221713B (de) | Verfahren zur Herstellung zweier neuer Antibiotika und ihrer Gemische | |
DE2637545A1 (de) | Antibiotica bm123 und ihre herstellung |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |