DE2019838B2

DE2019838B2 - 4-Hydroxy-5(3)-ribofuranosylpyrazol-3(5)-carboxamid und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE2019838B2
Application number: DE2019838A
Authority: DE
Inventors: Marvin Martin Hoehn; Robert Howard Williams
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1969-04-23
Filing date: 1970-04-23
Publication date: 1978-04-20
Also published as: DE2019838C3; US3674774A; NL7005784A; GB1281452A; DE2019838A1; BR6915071D0; JPS496677B1; FR2042367A1; DK128458B; FR2042367B1

Description

Die Erfindung betrifft die antibiotische Verbindung 4-Hydroxy-5(3)-ribofuranosylpyrazol-3(5)-carboxamid und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Das neue Antibiotikum hat die Formel

H₂N

HOH₂C

OFI

und wird dadurch hergestellt, daß man Streptomyces candidus NRRL 3601 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submers-aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 25 bis 37⁰C und während einer Dauer von etwa 24 bis etwa 72 Stunden züchtet und die gebildete Verbindung nach Anspruch 1 aus dem Kulturmedium isoliert.

Die erfindungsgemäße Verbindung ist eine farblose kristalline Substanz vom Schmelzpunkt 108 bis 113° C, die in Wasser, Methanol, Äthanol, Propanol und Butanol löslich, in Äthylacetat wenig löslich und in Kohlenwasserstofflösungsmitteln und Diäthyläther unlöslich ist. Sie besitzt einen optischen Drehwert [λ] S" von -45,5° [C = 0,78% (Gew./Vol.), Wasser], eine ungefähre Zusammensetzung von 41,56% Kohlenstoff, 5,25% Wasserstoff, 16,0% Stickstoff und 36,25% Sauerstoff, eine titrierbare Gruppe von pK_a' = 6,9, ein massenspektroskopisch berechnetes Molekulargewicht von 259 und eine empirische Formel GtHuNA,. Bei Messung als Kaliumbromidpreßling im Infrarotabsorptionsspektrum über den Bereich von 2,0 bis 15,0 Mikron weist die

"> Verbindung folgende unterscheidbare Banden auf: 3,10; 3,40; 6,04; 6,21; 6,51; 6,80; 7,00; 8,50; 9,00; 9,30; 9,80; 11,20; 11,70; 12,90; 13,60 und 14,00 Mikron.

Der spezifische optische Drehwert [λ] 1 der kristallinen erfindungsgemäßen Verbindung ist an einer Probe

κι bestimmt, die vorher etwa 15 Stunden bei Raumtemperatur im Vakuum über wasserfreiem Calciumchlorid getrocknet wird. Die Gegenwart der einen titerbaren Gruppe vom pK_a' = 6,9 ist durch elektrometrische Titration in wäßriger Lösung ermittelt. Das Infrarotab-

i") Sorptionsspektrum der Verbindung als Kaliumbromidpreßling ist in F i g. 1 dargestellt. Das in saurem und neutralem Äthanol erhaltene Ultraviolettspektrum der erfindungsgemäßen Verbindung zeigt folgende Maxima: 232 ηιμ (ε = 7,4 · ΙΟ³) und 263 πιμ (ε = 6,2 · 10³). Bei

:<> 213 und 242 rr^sind Minima vorhanden. Bei Zusatz von Ba.se verschiebt sich das Spektrum zu Maxima bei 235 ιτιμ (ε = 5,1 · ΙΟ³) und 207 ιτιμ (ε = 5,1 · ΙΟ³) und einem Minimum bei 257 ΐημ. Ein Röntgenbeugungspulverdiagramm dieser Verbindung unter Verwendung von

r> ungefilterter Chromstrahlung und einer Wellenlänge von 2,2896 A zur Berechnung der Netzebenenabstände liefert die in der DE-OS 20 19 838 auf Seite 4 angegebenen Werte.

Die erfindungsgemäße Verbindung weist antifungale

i" Aktivität gegenüber Neurosporaarten auf und kann daher, wenn sie in Waschlösungen und dergleichen eingebracht wird, mit Vorteil dazu verwendet werden, Wände und andere Oberflächen in Krankenhäusern, Schwimmbädern und dergleichen frei von Befall durch

π solche Pilze zu halten.

Die erfindungsgemäße Verbindung ist in vivo gegen Kuhpocken und Herpes simplex wirksam und zur Behandlung von Vireninfektionen, zum Beispiel Pocken und Gesichfiherpes, in Tagesdosen von 0,5 bis

•io 250 mg/kg vorteilhaft. Sie kann an Warmblüter, zum Beispiel Mäuse, Ratten, Hunde und dergleichen, entweder oral oder parenteral verabreicht werden. Die In-Vitro-Aktivität dieses Stoffs gegen Virenwachstum in Gewebekulturen wurde an einer Reihe von Viren,

■4") darunter Masernviren, Herpes-simplex-Viren, Kuhpokken-Viren und Coxsackie-Viren, nachgewiesen.

Die Fähigkeit der Bekämpfung des Viruswachstums in vitro läßt sich leicht mit Hilfe eines ähnlichen Fleckensuppressionstests nachweisen, wie er von S i m i η ο f f, Applied Microbiology, 9,66 -72 (1961) und von De Long et al., »Biological Evaluation of A 10598«, Annual of N. Y. Academy of Science 130, 44-48 (1965) beschrieben worden ist. Bei der Prüfung auf antivirale Aktivität sind Flecken in den Gebieten der Platte zu sehen, in denen das Virus die Zellen infiziert und sich in den Zellen reproduziert hat. Toxizitätszonen, deren Durchmesser in mm gemessen wird, werden ebenfalls beobachtet, wenn die Testverbindung eine letale cytologische Wirkung auf Wirtzellen unterhalb und um die Filterpapierscheibe hat. Antivirale Aktivität der Testverbindung wird Fehlen von Flecken und eines stärkeren Wachstums von Zellen in einer Zone unter und um eine Filterpapierscheibe nachgewiesen. Der Durchmesser dieser Zone wird in mm gemessen. Die Zellen in einer Aktivitätszone werden mit einem Mikroskop untersucht, um das Auftreten und das Ausmaß von Schaden durch Wirkstoff und/oder Virus zu ermitteln. Die Färbung wird nach einer abgestuften

Skala mil 1 +,2 + ,3 + ,4+ und negativ folgendermaßen bewertet:

4 + Dunkelgefärbte Gebiete, die bei mikroskopischer Untersuchung gesunde Zellen ohne sichtbare Virus- oder Wirkstoffschäden zeigen.

3 + Weniger dunkel gefärbte Gebiete, die keine Virusoder Wirkstoffschäden zeigen, aber weniger gesund aussehen.

2+ Gebiete, die gesunde Zellen mit mäßigem Virusdurchbruch zeigen.

1 + Gebiete, die gesunde Zellen mit stärkerem Virusdurchbruch zeigen.

— Keine lebenden Zellen.

Die folgende Tabelle I zeigt die Ergebnisse der Prüfung von Salzen der erfindungsgemäßen Verbindung gegen Masern-Viren (Edmondston-Stamm), Kuhpokken-Viren (Vl Lindeman), Coxsackie-Viren und Herpessimplex-Viren. Spalte ί der Tabelle gibt die Konzentration in Mikrogramm/Milliliter an, in der der Wirkstoff auf die Filterpapierscheiben aufgebracht wird, Spalte 2 den Durchmesser der Zone der Virusinhibierung durch die Testverbindung in mm, Spalte 3 die Bewertung von gefärbten Gebieten und Spalte 4 den Namen des Virus, gegen das die Verbindung getestet wird.

Tabelle I

Antivirale Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindung in vitro

Kon z.

(mcg/ml)

Zone

(mm)

Mikroskopische Untersuchung

Virus

3,5

60
50
50
50
50
40
25
22
20
28
35
33
30
30
25
22

4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 2+

Kuhpocken Kuhpocken Kuhpocken Kuhpocken Kuhpocken Kuhpocken Kuhpocken Kuhpocken Kuhpocken Herpes simplex Herpes simplex Herpes simplex Herpes simplex Herpes simplex Herpes simplex Herpes simplex Kon/.

(mcg/ml)

Zone

(mm)

Mikroskopische Untersuchung

Virus

3,5

1000

500

250

125

3,5
1,5
0,75
1000
500
250
125
62
31
15
7
3,5

12 10 50 43 43 37 30 37 30 22 20 15 11 33 35 33 30 30 30 15 15 11

2+ 2 + 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 1 + 1 + 1 + 1 +

Herpes simplex

Masern

Coxsackie

Die antiviralen Aktivitäten der erfindungsgemäßen Verbindung und des dem nächstvergleichbaren Stand der Technik angehörenden Antibiotikums Formycin werden gegenüber einer Anzahl von Viren verglichen.

j-, Hierzu sind in der folgenden Tabelle die Konzentrationen in mcg/ml, die akuten Toxizitäten der zu untersuchenden Verbindungen bei den angegebenen Konzentrationen, die Durchmesser der Zonen der Virusinhibierung durch die Testverbindungen in mm als Maß für die Aktivität sowie - die Ergebnisse der mikroskopischen Untersuchung der behandelten Zellen in Form der nachfolgenden qualitativen Bewertung wiedergegeben:

4+ Gesunde Zellen ohne Virus- oder Wirkstoffschä-

den.

3 + Gesunde Zellen mit vermindertem Stoffwechsel.

2+ Hauptanteil der Zellen gesund mit leichtem Virusdurchbruch.

I + Geringer Teil der Zellen gesund mit stärkerem

⁾⁰ Virusdurchbruch.

Je höher der numerische Wert, um so größer die antivirale Aktivität.

Tabelle II

Vergleich der antiviralen Aktivitäten in vitro von Formycin und der erfindungsgemäßen Verbindung

Kon z.

(mcg/ml)

Gegenüber Toxizität

Formycin erf. Verbindung

Aktivität, Zone (mm)

Formycin erf.Verbindung

Mikroskopische Untersuchung

Formycin

erf. Verbindung

Kuhpocken

1000 500

14 12 32 30

60 50

4+ 4+

Fortsetzung

Kon/.

(mcg/nil)

Gegenüber Toxiziliit

Formycin erf. Verbindung

Aktivität, /one (mm)

l-ormycin erf.Vcrbindung

Mikroskopische Untersuchung

Formycin

erf. Verbindung

250	10
125	-
1000	14
500	10
250	7
125	-
1000	22
500	18
250	13
125	11
1000	23
500	15
250	10
125	-
1000	23
500	20
250	14
125	11

2. Coxsackie A 21

3. Virus 5 AP 305

4. Virus Adeno (SA-7)

5. Virus Maryland B

Diese Versuche erfolgten in vitro an Gewebekulturen. Bei der Untersuchung betreffend die Viren Nr. 1 und 4 wurde eine Affennierengewebekultur verwendet, die mit der Abkürzung BSC-I bezeichnet wird. Der Virus Nr. 2 wurde in menschlichem Fruchtwasser (als AV2 bezeichnet) untersucht, während die Viren Nr. 3 und 5 an Zellen von Hundenieren (als MCDK bezeichnet) untersucht wurden. Die bei den verschiedenen Konzentrationen angegebenen Toxizitatswertc wurden im Anschluß an die Untersuchungen durch mikroskopische Bewertung der Gewebekulturcn ermittelt. Die angegebenen Werte stehen für den Durchmesser der toxischen Zone in Millimeter, so daß die Toxizität um so günstiger ist, je kleiner die angegebene Zahl ist.

Au:; den angegebenen Toxi/.itätswerten ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäße Antibiotikum eine geringere Toxizität als das Verglcichsantibiotikum Formycin besitzt. Weiterhin entfaltet das erfindungsgemäße Antibiotikum eine erheblich größere Wirkung, was aus den Aktivitätszahlcn und den Ergebnissen der mikroskopischen Untersuchung ersichtlich ist. Zum Beispiel betragen für den Virus Nr. I die bei der mikroskopischen Untersuchung erhaltenen Werte für die erfindungsgemäße Verbindung bei allen Konzentrationen 4+, während die mit Formycin erhaltenen Ergebnisse nichtsignifikant waren, was durch das in der Tabelle des Vcrsuchsbcrichts angegebenen Pluszeichen verdeutlicht ist. Weiterhin ergibt sich ein erheblicher Aktivitiitsunterschied im Full des Virus Nr. 2, nämlich des (oxsuekie· Virus A 21, der gegenüber der erfindtingsgemäßen Verbindung eine Aktivität von 2+ entfaltet, während l'ormycin wiederum /11 nichlsignifikuntun

24
20

24
20
14
14

34
30
24
20

40
35
24
20

50
50

33
35
33
30

50
40
30
30

2+ 2+ 2+ 2+

3+ 3+ 3+ 3+

4+ 4 +

2+ 2 + 2 + 2 +

4+ 4+ 4+ 4+

Ergebnissen führt (+). Selbst im Fall der Viren Nr. 4 und 5 zeigt sich das erfindungsgemäße Antibiotikum bei allen Konzentrationen erheblich aktiver als Formycin.

Der Mikroorganismus Streptomyces candidus wurde erstmals aus aus Indien stammenden Bodenproben folgendermaßen isoliert.

Anteile der Bodenproben wurden in sterilem destilliertem Wasser suspendiert, und die Suspensionen wurden in Streifen auf Nähragarplatten aufgetragen. Die angeimpften Nähragarplatten wurden mehrere Tage bei etwa 30⁰C inkubiert. Am Ende der Inkubatiotisdauer wurden Kolonien der die erfindungsgemäße Verbindung produzierenden Organismen mit Hilfe einer sterilen Platinschlingc auf Schrägagar überführt. Die inokulierten Agarschrägkulturen wurden dann zur Erzielung größerer Mengen Inokulum für die Produktion der Substanz inkubierl.

Der neue Mikroorganismus wurde ohne Beschränkung bei der Kultursammlung der Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U. S. Department of Agriculture (früher Northern Regional Research Laboratories) Pcoria, Illinois hinterlegt und ist für jedermann unter der Kulturnummcr NRRL 3601 erhältlich.

Wegen der Schwierigkeiten von Uixonomischen Bestimmungen bei Mikroorganismen der Gruppe Strcplomyccs ist die Klassifizierung eines neu aufgefundenen Organismus stets mit einer gewissen Unsicherheit behaftet. Der die crfindungsgemäße Verbindung produzierende Organismus steht jedoch offenbar in seinen wichtigsten Merkmalen dem Mikroorganismus Sireptomyces candidus ( K r a s s i I η i k ο ν ) Waksman iiulf-'πιικΐ einer veröffentlichten Beschreibung dieses

Mikroorganismus von Waksman, The Actionmycetes, Bd. 2, Classification, Identification and Description of Genera and Species, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Maryland (1963) am nächsten.

Die Kultur NRRL 3601 wird der Sektion Rectus-flexibilis, Weiß-Serie nach Pridham et al. (Pridham et al., »Α Guide for the Classification of Slreplomycetes According to Selected Groups«, Applied Microbiol. 6: 52—79 [1958]) sowie ferner entweder der Weiß-Serie oder der Gelb-Scrie des Systems nach Tresner and Backus (»System of Color Wheels for Streptomycele Taxonomy«, Applied Microbiol. 11: 335-338 [1963]) zugeordnet. Wie oben angegeben, wurde der Mikroorganismus als Stamm von Streptomyces candidus klassifiziert. Es wird jedoch darauf hingewiesen, daß andere Spezies, nämlich Streptomyces alboflavus und Streptomyces longissimus ebenfalls Streptomyces candidus NRRL 3601 ähnlich sind. Generell bildet Streptomyces candidus NRRL 3601 gewellte Sporophoren und zylindrische glatte Sporen, die en masse weiß bis blaßgelb sind. Das vegetative Mycel ist gelb bis orangegelb. Ein hellgelbes bis hellbraunes lösliches Pigment ist in zwei Medien vorhanden und fehlt in allen anderen Medien. Auf den meisten Medien kommen Büsche! von Luftmycel und sclerotische Bildungen vor.

Für die taxonomischen Untersuchungen des die

Tabelle III

Beschreibung der Kultur NRRL 3601

erfindungsgemäße Verbindung produzierenden Stamms von S. cancidus wurden die Methoden, die für das internationale Streptomycesprojekt, beschrieben von S h i r 1 i η g und G ο 111 i e b, »Methods for Characterization of Streptomyces Species«, Intern. Bull. Systemic Bacteriol.: 16, 313-340 (1966), empfohlen werden, zusammen mit weiteren Hilfstests angewandt. Kohlenstoffverwertungstests wurden nach der Methode durchgeführt, die von Pridham und G ο 111 i e b, J. Bac. 56:107 (1948) beschrieben wurde. Die Ergebnisse der taxonomischen Bestimmungen sind nachstehend in Tabelle III angegeben. Farbnamen wurden nach der ISCC-NBS-Methode ( K e 11 y und J u d d, »The ISCC-NBS-Method of Designating Colors and a Dictionary of Color Names«, U. S. Dept. of Commerce Circ. 553, Washington, D. C.) zugeordnet. Angaben in runden Klammern beziehen sich auf die Farbreihe nach Tresner und Backus (Tresner und Backus, »System of Color Wheels for Streptomyces Taxonomy«, Appld. Microbiol. 11: 335-338 [1966]), Farbblocks nach Maerz und Paul (Maerz und Paul, Dictionary of Color, McGraw-Hill, New York [1950]) sind in eckigen Klammern angegeben. Wenn nichts anderes angegeben ist, wurden die Kulturen 14 Tage bei 30⁰C gezüchtet.

Beobachtete Eigenschaft

Charakteristika von NRRL 3601

Morphologie

Kulturmerkmalc auf:
Ilefe-Malz-Agrar

Hafermehl-Agrar
Inorganische Salze und Stärke

Glyccrin-Asparagin-Agar
Czapeks Agar

Tabelle III (Fortsetzung)
Beschreibung der Kultur NRRL 3601

gewellte Sporophoren werden auf gebüscheltcm Luftmycel gebildet; die Sporen sind cyclindrisch. Abmessungen 0,67-1,0 μ · 1,7-2,7 μ, mit glatten Sporenoberflächen (elektronenmikroskopische Aufnahme)

Wachstum reichlich, Revers mittelgelb [11J6]; Luftmycel und Sporulation mäßig, weiß (W) a; kein lösliches Pigment; Sclerotiabildung

Wachstum mäßig, Revers gelblichweiß [9Cl]; Luftmycel und Sporulation mäßig, weiß (W) a; kein lösliches Pigment; Sclerotiabildung

Wachstum mäßig, Revers mittelgelb [10H4]; Luftmycel mäßig, Sporulation mittel, gelblichweiß (Y) 2ba [9D2]; lösliches Pigment spärlich braun;

Sclerotia vorhanden Wachstum mäßig, Revers lcbhaftgelb [9J5]; Luftmycel und Sporulation mittel, weiß (W) a; kein lösliches Pigment

Wachstum reichlich, Revers lebhaftgelb [11J5]; Luftmycel mittel, weiß (W) a, keine Sporulation; kein lösliches Pigment

Bcobiichtctc Eigenschaft

Charakteristika von NRRL 3601

Glucosc-Asparagin
Tyrosin-Agar

Nühr-Agur
Ciilciummnhit

Wachstum reichlich, Revers mittclgclb [1IJ6]; Luftmycel reichlich, Sporulation mittel, blaßgclb (Y) 2ba [9D2]; kein lösliches Pigment

Wachstum mäßig, Revers hcllgräulichbraun [11B2]; Luftmyccl mäßig, weiß (W) a, Sporulation gering, kein lösliches Pigment; Sclerotia vorhanden

Wachstum mäßig, Revers blaßgclbgrün | K)BI]; Luftmyccl spärlich, keine Sporulation; kein lösliches Pigment; Sclerotia vorhanden

Wachstum reichlich, Revers mittclgclb |I()J5|; Luftmyccl und Sporulation mäßig, blaßoningcgclb (R) 3cn |9K3|; lösliches Pigment hellgelb

Foitsel/imu

ίο

Beobachtete Eigenschaft

Charakteristika von NRRL 3601

Glycerin-Glycin
Tomatenpaste-IIalermehl

Emersons Agar
Bennetts Agar

Wirkung auf Milch
Nitratreduktion

Melaninbildung auf:

Pepton-Eisen-Agar
Trypton-Hefeextrakt-Brühe
Gelatineverflüssigung
Temperaturanforderungen

Reaktion der Substratfarbe auf
pH-Änderung

C-Quellcnverwertung
L-Arabinose
Saccharose
D-Xylose
D-Fructose
i-Inosit
D-Mannit
D-Dcxtrose
Maltose
Melizitose
Cellulose
Kein Kohlenstoff (Kontrolle)

Wachstum reichlich, Revers mittelgelb [11J6J; Luftmycel mäßig, Sporulation mittel, weiß (W) a; kein lösliches Pigment

Wachstum reichlich, Revers mitttclorange bis mittelorangegelb [10J7]; Luftmycel und Sporulation reichlich, blaßgelb (Y) 2ba [9D2J; kein lösliches Pigment

Wachstum reichlich, Revers hellgelb [I0G3); Luftmycel spärlich, keine Sporulation; kein lösliches Pigment

Wachstum reichlich, Revers mittelorangegelb [1016]; Luftmycel reichlich, Sporulation mittel, weiß (W) a; kein lösliches Pigment

schwache Koagulation und gewisse Klärung in 14 Tagen
schwache Reduktion in 14 Tagen

negativ

vollständig in 14 Tagen

Wachstum auf Hefe-Malz-Agar von 26 C bis 37 C; kein Wachstum bei

43 C

unbeeinflußt

Erläuterung: + Verwertung positiv. (+) Verwertung wahrscheinlich. (-) Verwertung fraglich. - keine Verwertung.

Zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Verbindung durch Züchtung des oben beschriebenen Mikroorganismus können zahlreiche Medien verwendet werden, da, wie aus den vorstehenden Verwertungs tests zu ersehen ist, der Organismus verschiedene Energiequellen zu verwerten vermag. Zur Erzielung einer wirtschaftlichen Ti Produktion, einer maximalen Ausbeute an Antibiotikum und einer leichten Isolierung des Antibiotikums sind jedoch einige verhältnismäßig einfache Nährmedien vorzuziehen. Beispielsweise enthalten die Medien, die für die Produktion des Antibiotikums vorteilhaft sind, ω> eine assimilierbare Kohlenstoffquelle wie Dextrose, Dextrin, Glycerin und dergleichen. Die bevorzugte Kohlenstoffquelle ist Dextrose. Ferner enthalten verwendbare Medien eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, z. B. Soyabohnenmehl, Maisquellwasscrfcst- M stoffe, Hefe, Baumwollsamenmehl, Rindfleischexlrakt. Peptone (aus Fleisch oder Soyabohncn), Casein, Aminosäuregemische und dergleichen. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Peptone, Hefeextrakte, Aminosäuregemische und dergleichen. Zu den anorganischen Nährsalzen, die in die Züchtungsmedien eingebracht werden können, gehören die üblichen Salze, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid- und Carbonationen und ähnliche Ionen liefern.

Spurenelemente, die für ein optimales Wachstum und eine optimale Entwicklung des zur Produktion der erfindungsgemäßen Verbindung verwendeten Organismus erforderlich sind, sollen ebenfalls in dem Kulturmedium enthalten sein. Solche Spurenelemente sind gewöhnlich in den anderen Bestandteilen des Mediums als Verunreinigungen in genügenden Mengen enthalten, um den Wachstumsbedari des für die erfindungsgemäßen Zwecke verwendeten Actinomyceten zu erfüllen.

Der Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums kann schwanken. Ais zweckmäßig hat sich jedoch ein Anfangs-pH-Wert des Mediums zwischen etwa 6,0 und

etwa 7,5 erwiesen. Wie bei anderen Actinoinyceten steigt der pH-Wert des Mediums während der Wachstumperiode des Organismus, in der das Antibiotikum erzeugt wird, allmählich an und kann einen Wert von etwa 6,5 bis 8,0 oder darüber erreichen, wobei der i End-pH-Wert wenigstens zum Teil von dem AnfangspH-Wert des Mediums, den in dem Medium enthaltenen Puffern und der Zeitdauer abhängt, während der Organismus wachsengelassen wird.

Submers-aerobe Züchtungsbedingungen sind die Bedingungen der Wahl zur Produktion des gewünschten Antibiotikums. Zur Erzeugung verhältnismäßig kleiner Mengen können Schüttelkolbenkulturen und Oberflächenkulturen in Flaschen angewandt werden. Zur Herstellung großer Mengen dagegen wird eine ii submers-aerobe Züchtung in sterilen Tanks bevorzugt. Das Medium in dem sterilen Tank kann mit einer Sporensuspension inokuliert werden. Wegen der Wachstumsverzögerung, die bei Verwendung einer Sporensuspension als Inokulum beobachtet wird, wird 2<i jedoch die vegetative Form der Kultur bevorzugt. Indem so die Wachstumsverzögerung vermieden wird, wird die Fermentationsvorrichtung besser ausgenutzt. Es ist daher zweckmäßig, zuerst durch Inokulieren einer verhältnismäßig kleinen Menge Kulturmedium mit der 2> Sporenform des Organismus ein vegetatives Inokulum zu erzeugen, und, wenn ein junges, vegetatives Inokulum erhalten worden ist, das vegetative Inokulum aseptisch in den großen Tank zu überführen. Das Med'um, in dem das vegetative Inokulum erzeugt wird, m kann entweder das gleiche Medium oder ein anderes Medium als das Medium sein, das zur Produktion der erfindungsgemäßen Verbindung in großem Maßstab verwendet wird.

Der eingesetzte Organismus wächst innerhalb eines r> weiten Temperaturbereichs von 25 bis 37°C. Optimale Produktion an erfindungsgemäßer Verbindung erfolgt offenbar bei Temperaturen von 25 bis 3O⁰C. Im allgemeinen erfolgt eine maximale Produktion des Antibiotikums innerhalb etwa 48 bis 72 Stunden nach dem Inokulieren des Kulturmediums.

Wie es bei aeroben Submers-Kulturverfahren üblich ist, wird durch das Kulturmedium sterile Luft geblasen. Zur Erzielung eines wirksamen Wachstums des Organismus und einer entsprechenden Wirkstoffpro- 4> duktion wird bei der Tankproduktion ein Luftvolumen von 0,35 bis 0,80 Volumenteilen Luft pro Minute und pro Volumenteil Kultur angewandt. Bevorzugt werden 0,40 Volumenteile Luft pro Minute und pro Volumenteil Kulturmedium. so

Die Konzentration an antibiotischer Aktivität in dem Kulturmedium kann während der Fermentationsdauer leicht durch Prüfung von Proben des Kulturmediums auf ihre inhibierende Wirkung auf das Wachstum von Organismen, die durch Anwesenheit der erfindungsgemäßen Verbindung inhibiert werden, leicht verfolgt werden. Der Organismus Neurospora spp. hat sich für diesen Zweck als geeignet erwiesen. Die Prüfung der Proben kann nach dem bekannten Diffusionsverfahren mit Agarnäpfchen erfolgen. t>o

Bei submers·aeroben Kulturen oder Schüttelkolbcnkullurcn erfolgt im allgemeinen eine maximale Produktion an gewünschter Substanz innerhalb etwa 2 bis 3 Tagen nach Inokulieren des Kulturmediums.

Die während der Fermentation der Verbindung (,5 erzeugte antibiotische Aktivität kann entweder in der anlibiolischen Brühe und/oder im Myccl vorliegen. Dnhcr sind die bei der Produktion des Wirkstoffs angewandten Isoiierungsmethoden so ausgelegt, daß eine maximale Gewinnung des Antibioiikums aus jeder der beiden Quellen oder beiden Quellen ermöglicht wird. So kann beispielsweise die Fermentationsbrühe, so wie sie erhalten wird, filtriert und das Antibiotikum durch Adsorption aus dem Filtrat mit einem geeigneten Adsorptionsmittel, zum Beispiel Kohle, und Eluieren der Aktivität aus dem Adsorptionsmittel, beispielsweise mit Aceton/Wasser als Eluiermittel, gewonnen werden. Das rohe Antibiotikum wird durch lonenaustauschchromatographie und Gelfiltration weiter gereinigt. Außerdem kann das restliche Antibiotikum, das in dem Mycelkuchen enthalten ist, durch gründliche Extraktion mit einem geeigneten Lösungsmittel, zum Beispiel Methanol, gewonnen werden. 75 bis 95% der Aktivität wurden jedoch in der Brühe gefunden.

Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung näher erläutert.

Beispiel 1

Schüttelkolbenproduktion
der erfindungsgemäßen Verbindung

Sporen von Streptomyces candidus NRRL 3601 werden auf Nähragarschrägkulturen inokuliert. Das Nähragarmedium besteht aus 10 g Dextrin, 2 g enzymatisch abgebautem Casein, 1 g Rindfleischextrakt, 1 g Hefeextrakt, 20 g Agar und destilliertem Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 1 Liter. Die Schrägkulturen werden mit Sporen von Streptomyces candidus NRRL 3601 inokuliert und 4 bis 6 Tage bei 30⁰C inkubiert. Die reifen Schrägkulturen werden mit sterilem destilliertem Wasser bedeckt und vorsichtig mit einer Schlinge abgeschabt, um die Sporen abzulösen und eine wäßrige Sporensuspension zu erzeugen. 1 ml der erhaltenen Sporensuspension wird zum Inokulieren von jeweils 100 ml vegetativem Medium verwendet.

Das vegetative Kulturmedium wird aus 15 g Glucose, 15 g Sojabohnenmehl, 5 g Maisquellwasserfeststoffen, 2 g Calciumcarbonat, 5 g Natriumchlorid und Leitungswasser bis zu einem Gesamtvolumen von 1 Liter bereitet.

Das vegetative Inokulum wird 48 Stunden bei 30⁰C auf einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung mit einem Ausschlag von 5 cm (2") bei 108UpM geschüttelt. Das so bereitete Inokulum wird dann wie folgt für die Produktion des gewünschten Antibiotikums verwendet.

Es wird ein Produktionsmedium mit folgender Zusammensetzung bereitet:

Sojabohnenmehl	15 g/l
Casein	lg/l
NaNO₃	3 g/l
Glucosesirup	20 g/l
CaCO₃	2,5 g/l
Leitungswasser

Anteile des Produktionsmediums von 100 ml werden in 500-inl-Erlenmeyer-Kolbcn gegeben, die dann 30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert werden, Nach dem Abkühlen wird jeder Kolben mit 5% eines wie oben bereiteten vegetativen Inokuliims inokuliert.

Die Produktionskolbcn werden 48 Stunden bei 30⁰C auf einer Rotationssehüttelvorrichtung mit einem Bogenausschlag von 5 cm (2") geschüttelt, die mit 250 UpM betrieben wird. Der pH-Wert des nichtinokulierten Mediums reicht von 6,0 bis 7,5. Der pH-Wert am Ende des Fermentationszyklus liegt zwischen 6,5 und 8,0. Die antifunealc und antivirale Wirkstoffaktivität

wird sowohl in der Brühe als auch im Myccl gefunden. Die Aktivität wird durch Prvfung der Brühe und des Mycel gegen Neurospora spp. nachgewiesen. Die Isolierung der Substanz wird wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt.

Beispiel 2
Halbtechnische Produktion des Antibiotikums

Die Produktion des erfindungsgemäßen Antibiotikums durch Submers-Fermentation in halbtechnischem Maßstab zeigt das folgende Beispiel:

In einen 250-ml-Kolben, der 50 ml eines vegetativen Mediums aus 10 g/l Dextrose, 25 g/l Dextrin, 20 g/l Sojapepton, 5 g/l lösliche Anteile von Destillationsrückständen bei der Alkoholherstellung und Leitungswasser mit einem pH-Wert von 6,6 enthält, wird ein lyophiles Kügelchen gegeben, das aus den in Beispiel 1 beschriebenen reifen Nähragarschrägkulturen hergestellt ist.

Das inokulierte vegetative Medium wird 48 Stunden bei etwa 30°C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung mit einem Bodendurchmesser von 5 cm (2") inkubiert, die mit 250 UpM betrieben wird. Der End-pH-Wert des Mediums wird mit 7,0 bestimmt. Ein Anteil der so erhaltenen vegetativen Kultur von 20 ml wird zum Inokulieren eines 1-Liter-Kolbens verwendet, der 100 ml des vegetativen Mediums enthält. Das inokulierte vegetative Medium wird 48 Stunden bei etwa 30°C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung mit einem Bogendurchmesser von 5 cm (2") inkubiert, die mit 250 UpM betrieben wird.

Der End-pH-Wert am Ende der zweiten Stufe beträgt 7,4. Ein Anteil der so erhaltenen vegetativen Kultur von 500 ml wird zum Inokulieren eines 40-Liter-Fermenters verwendet, der 25 Liter sterilisiertes wäßriges Fermentationsmedium aus 0,2 g/l Entschäumer, 20 g/l Glycerin, 5 g/l Sojapeption, 2 g/l Calciumnitrat, 0,5 g/l Natriumchlorid, 3 g/l lösliche Anteile von Destillationsrückständen bei der Alkoholherstellung und Leitungswasser bis zu einem Volumen von 25 Liter enthält. Nach dem Inokulieren wird die Fermentation 42 Stunden bei einer Temperatur von 3O⁰C durchgeführt. Während der Fermentation wird mit einer Geschwindigkeit von 42( UpM gerührt. Die Belüftung während der Fermentaiior erfolgt mit 0,4 Kubikmeter Luft pro Kubikmetei Medium und pro Minute. Der End-pH-Wert beträgt 7,6. Ί Die Fermentationsmischung wird geerntet, und die gesamte Brühe wird filtriert. Zu 25 Liter filtrierter Brühe werden 10% (Gewicht/Volumen) 1,68 χ 0.42 mm Ak tiv-Kohle gegeben. Nach 30 Minuten langem Rührer wird die Mischung filtriert und mit Wasser gewaschen

κι Die Aktivität wird aus der Kohle durch drei aufeinanderfolgende Behandlungen mit 9 Liter 1:1-Aceton-Wasser-Lösungsmiuelmischung eluiert. Die Aceton-Wasser-Eluate werden vereinigt und auf eir Volumen von etwa 500 ml eingeengt. Dann wird da*

π Konzentrat durch eine Kolonne mit 250 ecm stark saurem lonenaustauscherharz (H+ -Form) geleitet, unc die Kolonne wird mit Wasser gewaschen. Die Aklivitäi wird an dem Harz nicht ausgetauscht und daher in deir abfließenden Volumen und in dem anschließenden

2(i Waschwasser aufgefangen. Der Abfluß und das Waschwasser werden vereinigt, und der pH-Wert wird auf etwa 7,0 eingestellt. Dann wird die Lösung eingeengt und auf eine 5,0 χ 80-cm-Kolonne mit Dextrangel in Wasser aufgegeben.

2i Die Kolonne wird mit Wasser eluiert. Die aktiven Fraktionen (durch Prüfung gegen Neurospora spp X-846 nach dem Agar-Näpfchen-Diffusionsverfahren ermittelt) werden vereinigt, eingeengt und gefriergetrocknet. Die Endreinigung erfolgt durch Säulenchro-

)(> matographie an einer Cellulose-Kolonne, die mil 70%igem Propanol equilibriert und eluiert wird. Das gefriergetrocknete aktive Präparat aus der Dextrangel-Kolonne wird in der Mindestmenge 70%igem Propanoi gelöst und auf eine 2,2 χ 60-cm-Cellulose-Kolonne

j! aufgegeben. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und zu einer wäßrigen Lösung eingeengt und kristallisierengelassen, wodurch 850 mg erfindungsgemäße Verbindung vom Schmelzpunkt 108 bis 113°C erhalten werden, pK_a' = 6,9 (Wasser).

Analyse für C₉H₁₃N₃O₆:

Ben: C 41,70, H 5,00, N 16,20, 0 37,10%;
gef.: C 41,56, H 5,25, N 16,02, O 36,25%.

Hierzu I Bhilt

Claims

Patentansprüche:

1.4-Hydroxy-5(3)-ribofuranosylpyrazol-3(5)-carboxamidder Formel

HOCH,

HO

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces candidus NRRL 3601 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submers-aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 25 bis 37°C und während einer Dauer von etwa 24 bis etwa 72 Stunden züchtet und die gebildete Verbindung nach Anspruch 1 aus dem Kulturmedium isoliert.