DE2040141C3 - Dipeptide und Verfahren zu ihrer Herstellung

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Description

Claims

DE2040141C3

Publication number: DE2040141C3
Application number: DE2040141A
Authority: DE
Inventors: Marvin Gorman; Calvin Eugene Higgens; Ramakrishnan Nagarajan
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1969-08-12
Filing date: 1970-08-12
Publication date: 1973-12-06
Also published as: BE754693A; PH12529A; JPS4945594B1; ES393985A1; CS184312B2; CH602759A5; DK128341B; NL7011805A; BR6915079D0; ES382658A1; DE2040141A1; FI45990C; CH594050A5; YU205470A; OA03599A; DK128017B; FI45990B; IL35065A0; IL35065A; NO132242C

COOH

O=

Γ f

CH-(CH₂J₃-C-NH
COOH

O
J— CH₂ — O — C — NH₂

COOH

= A168861

O = A 16886II

- C — NH₂

COOH

und deren Salze.

2. Verfahren zur Herstellung von wie in Anspruch 1 definiertem A 16 8861 und/oder A 16 886 II, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submers aeroben Bedingungen züchtet, bis von dem Mikroorganismus in dem Kulturmedium eine beträchtliche Menge A 16 8861 und/oder A 16 886 II produziert worden ist.

3. Hortikulturmittel, dadurch gekennzeichnet, daß es (1) wie im Anspruch 1 definiertes Antibioticum A 16 886 I oder ein Salz davon und/ oder Antibioticum A 16 88611 oder ein Salz davon und (2) ein oberflächenaktives Mittel enthält.

Die Erfindung betrifft die neuen Dipeptide
NH₂ O ^0CH3

CH — (CH₂)₃—C — NH —
COOH O

Γ' f

CH-(CH₂)₃—C —NH
COOH 0=1

, . Il

L-N J-CH₂-O-C-NH₂ COOH

-N /-CHj-O-C-NH,

COOH
die nachstehend als A 16 886 1 und A

zeichnet werden und ihre Salze, die antibakterielle und anthelmintische Aktivität aufweisen, und ihre Herstellung durch Fermentation von Streptomyces clavuligerus NRRL 3585.

Bei Fermentation von Streptomyces clavuligerus entstehen neue antibiotische Substanzen, die hierin als A 16 886 I und Il bezeichnet werden. Die Salze von A 16 886 I und II sind leicht durch Umsetzung von A 16 886 1 und Il mit einer geeigneten Säure oder Base erhältlich. A 16886 I und II und ihre Salze weisen antibakterielle und anthelmintische Aktivität auf. Die antihakterielle Aktivität besteht hauptsächlich gegen grammnegative Mikroorganismen; eine gewisse Aktivität wird aber auch gegen grampositive Mikroorganismen beobachtet. A 16 886 I und Il sind ferner zur Bekämpfung von Krankheiten, die durch pflanzenpathogene Bakterien verursacht werden, wirksam.

Das Monoammoniumsalz des A 16 886 I ist folgendermaßen gekennzeichnet: schwach gefärbte weiße flockige amorphe Festsubstanz, erweicht zwischen 190 und 30O⁰C mit einem Farbwechsel zu dunkelbraun; sehr löslich in Wasser, schwach löslich in niederen Alkanolen und unlöslich in Acetonitril; amphoter, vier titrierbare Gruppen mit pK'a, =4.1, pK'a₂ = 5,2, pK'a₃ = 9,3 und pK'a₄ = 10,5; aus Titrationswerten ermitteltes scheinbares Molekulargewicht von etwa 530; ungefähre Zusammensetzung:

40,26% Kohlenstoff, 5,91% Wasserstoff, 13,98% Stickstoff, 33,37% Sauerstoff und 7,21% Schwefel; spezifischer optischer Drehwert [«]:->' +153.6 (c = 1%, Gew./Vol., in Wasser); im Infrarolabsorptionsspektrum einer Mineralölsuspension davon folgende unterscheidbare Banden bei folgenden Wellenlängen, angegeben in Mikron: 3,10, 5,68, 6,30, 6.60, 7,20, 7,60, 8,83, 9,35, 9,60, 9,85, 11,60 und 12,90.

Das Ammoniumsalz des A 16 886 II ist folgendermaßen gekennzeichnet: schwach gefärbte weiße flokkige amorphe Festsubstanz, erweicht zwischen 190 und 300⁰C unter Farbwechsel nach dunkelbraun, sehr löslich in Wasser, schwach löslich in niederen be- Alkanolen und unlöslich in Acetonitril; amphoter.

vier titrierbare Gruppen mit pK'aj = 4,0, pK'a, = 5,3, pK'a₃ = 9,2 und pK'a₄ = 10,5; aus Titrationswerten ermitteltes scheinbares Molekulargewicht von etwa 528; ungefähre Zusammensetzung: 41,01% Kohlenstoff, 5,64% Wasserstoff, 15,75% Stickstoff, 29,28% Sauerstoff und 7,04% Schwefel; spezifischer optischer Drehwert: [α]? +86,2° (c = 1%, Gew. Vol., in Wasser); im Infrarotabsorptionsspektrum einer Mineralölsuspension davon folgende unterscheidbare Banden bei folgenden Wellenlängen, angegeben in Mikron: 3,15, 5,70, 6,30, 7,22, 7,64, 9,05, 9,40, 9,65 und 11,60.

Gegenstind der Erfindung ist weiter ein Verfahren zur Herstellung von A 16 886 I und/cder A 16 886 11, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submers aeroben Bedingungen züchtet, bis eine beträchtliche Menge A 16886 I und/oder A 16886 II von dem Mikroorganismus in dem Kulturmedium produziert worden ist.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Mittel, das durch einen Gehalt an (1) an A 16 886 1 oder einem Salz davon und/oder A 16 88611 oder einem Salz davon und einen Gehalt an (2) eines oberflächenaktiven Mittels gekennzeichnet ist.

Wie bei vielen Antibiotica produzierenden Kulturen führt die Fermentation von Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 zur Bildung einer Reihe von antibiotischen Substanzen, die »Faktoren« genannt werden. Antibioticum A 16 886, wie es zur Zeit aus dem Fermenter erhalten wird, besteht aus zwei antibiotischen Hauptsubstanzen, die hierin als A 16 886 1 und A 16 886 II oder als Faktor I und Il bezeichnet werden. Außerdem wurden kleinere Mengen anderer antibiotischer Substanzen bei einigen Fermentationen beobachtet; diese wurden bisher jedoch nicht identifiziert, da sie nur in sehr kleinen Mengen vorhanden sind. Daher wird der Begriff »Antibioticum A 16 886« ohne Zusatz zur Bezeichnung des Antibioticums verwendet, wie es aus dem Fermenter erhalten wird, und das gewöhnlich 1 bis 99% Faktor I und 99 bis 1% Faktor II neben anderen Faktoren in geringen Mengen enthält, wobei die Gesamtmenge 100% beträgt.

Antibioticum A 16 886 kann als solches oder als Salz, z. B. als Säureadditionssalz oder als Salz mit einem Kation, verwendet werden. Bei Salzen mit einem Kation kann das Salz entweder ein Mono- oder ein Disalz sein. Häufig wird es bevorzugt. Salze direkt im Reinigungsverfahrer, herzustellen, so daß das Antibioticum, so wie es abgetrennt wird, in Salzform vorliegt. Antibioticum A 16 886 wurde in dieser Weise als Monoammoniumsalz abgetrennt und wird aus diesem Grund im folgenden als Monoammoniumsalz gekennzeichnet.

Mit der Mischung aus Faktor I und II wurden verschiedene Prüfungen durchgeführt. Beispielsweise wurde eine Reihe von qualitativen chemischen Tests mit einer Mischung des Monoammoniumsalzes von Faktor I und des Monoammoniumsalzes von Faktor Il vorgenommen: Positive Teslreaktionen liefer ten Ninhydrin-, Pan-Dutscher-, Benedict-, Molisch-. Fehling-, Dansylchlorid-, Jod- und Ferrichlorid-Reagens; negative Testreaktionen dagegen wurden mit Biuret- und Sakaguchi-Reagens beobachtet. Eine Mischung der Monoammoniumsalze von Antibioticum A 16 886 Faktor 1 und 11 ist bei pH 3 bis 8 bei 6 C 8 Tage lang stabil und bei pH 3 bis 8 bei 25°C 2 Tage verhältnismäßig stabil. Die biologische Aktivität geht bei pH 3 bis 8 bei einer Temperatur von 25" C langsam verloren, wobei die Hälfte nach 4 Tagen verschwunden ist.

Außerdem wurden die Monoammoniumsalze von Faktor I und II, wie oben angegeben, getrennt gekennzeichnet. Die oben angegebenen Werte für den spezifischen optischen Drehwert der Monoammoniumsalze von A 16 886 I und A 16 886 II beziehen sich auf die bei Raumtemperatur im Vakuum über wasserfreiem Calciumchlorid etwa 15 Stunden lang getrockneten Salze. Die elektrometrische Titration wurde mit dem Monoammoniumsalz von A 16 886 I in einer 66%igen Dimethylformamid - Wasser - Lösung mit einem Anfangs-pH-Wert von 6,50 durchgeführt.

Die Elementaranalysen wurden mit den im Vakuum bei etwa 80" C über Phosphorpentoxid getrockneten Monoammoniumsalzen von A !68861 und A 16886II durchgeführt. Die Analyse des Monoammoniumsalzes von A 168861 ergibt einen Methoxylgehalt von 5,02%. Das Vorliegen der Methoxylgruppe wurde durch ein Singulett bei 3,53 ppm im NMR-Spektrum bestätigt. Ein Van Slyke-Test auf Aminostickstoff des Monoammoniumsalzes von A 16 886 1 ergab 5,3%.

Das NMR-Spektrum von A 16 886 I in D₂O zeigte folgende Merkmale: 5,19 ppm (1 H. Singulett); 4,94, 4,74 ppm (2 H. AB Quartett. J = 13 Hz); 4,0 bis 4,2 ppm (1 H. Multiplen); 3,68, 3,32 ppm (2 H, AB Quartett, J = 18 Hz); 3,53 ppm (3 H, Singulett): 2,6 bis 2,4 ppm (2 H, Multiplen); 2,1 bis 1,6 ppm (4 H, Multiplen).

Das Infrarotabsorptionsspektrum des Monoammoniumsalzes von A 16 886 1 als Mineralölsuspension ist in F i g. I der Zeichnungen dargestellt.

Das Ultraviolettabsorptiot$>spektrum des Monoammoniumsalzes von A 16 886 I in wäßriger Lösung zeigte Absorptionsmaxima bei 242 πΐμ (E!*_m = 132) und 264 rm (EJ*_m = 165); der Cirkulardichroismus wurde ebenfalls in wäßriger Lösung gemessen und ergab einen positiven CottonetTekt bei 263 ηΐμ und einen negativen Cottoneffekt bei 236 πΐμ.

Die Papierchromatographie des Ammoniumsalzes von A 16 886 I auf Whatman-Papier Nr. 1 ergab einen R_f-Wert von 0,41 in einem Lösungsmittelsystem aus Propanol, Acetonitril und Wasser in einem Volumenverhältnis von 1:1:1. Bioaulogramme wurden durch Aunegen des Papieren romatogramms auf Agarplatten erhalten, die mit Salmonella gallinarum als Testorganismus beimpft waren.

Bei Dünnschichtchromatographie des Monoammoniumsalzes von A 16 886 I auf Kieselgelplatten in 70%igem wäßrigem Acetonitril wurde mit einer Ninhydrinsprühung als Nachweis ein R_r-Wert von etwa 0,51 und auf Celluloseplatten in Acetonitril, Isopropanol und Wasser (1:1:1) mit der gleichen Nachweismethode ein Rf-Wert von 0,36 gefunden.

Eine nach der Spackman-Moore-Stein-Technik durchgerührte Aminosäureanalyse eines Säurehydrolysats von Antibioticum A 16 886 1 ergab zwei ninhydrinreaktive Banden, von denen die eine mit Glycin identisch eluiert wurde (0,61 μΜοΙ/mg), während die andere unmittelbar vor Glycin eluiert und als alpha-Aminoadipinsäure identifiziert wurde (1,97 μΜοΙ/mg).

Die elektromelrische Titration des Monoammoniumsalzes von A 16 886 Il in einer 66%igen Di-

methylformamid-Wasser-Lösung mit einem Anfangs-

pH-Wert von 7,7 ergab die Anwesenheit von vier Lösungsmiitelsystem

litrierbaren Gruppen: pK'a, = 4,4, pK'a₂ = 5,7.

pK'a_? = 9,6, pK'a₄ = 10,4. ^:

Bei einer Titration mit einer späteren Probe, die 5 Papier-Chromatographie

in ähnlicher Weise, jedoch mit einem Anfangs- Äthanol · Wasser (80 ■ ?0)

pH-Wert von 6.8 durchgeführt wurde, betrugen die _mi, , ₅o_/o Natriumchlorid,

entsprechenden Werte pK a, = 4,0, pK a₂ = 5,3, _{p ier mit} , _n._Natrium.

pKa₃ = 9,2 und pK a₄ = 10,5. _{sulfat imprägnierl}

Die Analyse des Monoammoniumsalzes von io . ... .. .

A 16 88611 ergab keinen Melhoxylgehalt. und im mit Wasser gesättigtes

Unterschied zu Faktor I war im NMR-Spektrum des üutanoi

Monoammoniumsalzes von A 16 886 II kein Signal ^mt Wasser gesättigtes

zu sehen, daß der Methoxylgruppe zuzuschreiben Butanol plus 2% p-Toluol-

war. Ein mit dem Monoammoniumsalzvon A 16886 II 15 sulfonsäure

durchgeführter Van Slyke-Test auf Aminostickstoff mit Wasser gesättigtes

ergab 5,1%. Melhylisobutylketon

Das NMR-Spektrum von A 16 886 11 in D₂O mit Wasser gesättigtes

zeigte folgende Merkmale: 5,67 ppm (1 H. Dublett. Methylisobutylketon plus

J = 5 Hz): 5,15 ppm (1 H, Dublett, J = 5 Hz): 4,90, 20 2% p-Toluols'ulfonsäure .

4.68 ppm (2 H, AB Quartett, J = 13 Hz); 3,9 bis 3.7 _{; w ges}ättigtes

(IH, Multiplen); 3.69, 3,39 (2 H AB Quartett Methylisobutylketon plus

J= 18 Hz); 2,6 bis 2,3 (2 H, Multiple«); 2,1 bis 1.5 _{20/ PiDeridin}

(4 H, Multiple»). A 1 Ί

Das Infrarotabsorptionsspektrum einer Mineral- 25 Acetonitril

ölsuspension des Monoammoniumsalzes von Propanol: Acetonitril

A 16 886 II ist in Fig. 2 der Zeichnungen darge- : Methanol: Wasser

stellt. (4:3:2:1)

Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Mono- Propanol: Pyridin: Essigammoniumsalzes von A 16886 11 in wäßriger Lö- 30 säure:Wasser(15:10:3:12) sung zeigte ein Absorptionsmaximum bei 260 πΐμ Propanol · Pyridin · Essig-(Ei* = 148); der Circulardichroismus wurde eben- säure:Acetonitril: Wasser falls in wäßriger Lösung gemessen und ergab einen (45 30-9-40-36)

positiven Cottoneffekt bei 258 ηΐμ und einen nega- _ß ' ',. _Essigsäure

tiven Cottoneffekt bei 228 mμ. 35 . „, (V I-11

Die Papierchromatographie des Monoammonium- ' ^{as er} ' ^-

salzes von A 16 886 II auf Whatman-Papier Nr. 1 Äthylacetat: Essigsaure

liefert einen R_rWert von 0,33 in einem Lösungs- : Wasser (3:1:1)

mittelsystem aus Propanol, Acetonitril und Wasser Propanol: Wasser (70:30)

in einem Volumenverhältnis von 1:1:1. Bioauto- 40 Acetonitril: Wasser

gramme wurden durch Auflegen des Papierchromato- (70:30)

gramms auf Agarplatten erhalten, die mit Salmonella Wasser: Äthanol: Essiggallinarum als Testorganismus angeimpft waren. säure (70-42:6)

Durch Dünnschichtchroroaiographie des Monoammoniumsalzes von A 16 886 II auf Kieselgelplat- 45 Dünnschicht-Chromatoten in 70%igcm wäßrigem Acetonitril wurde mit graphie einer Ninhydrinsprühung oder einer bioautographi- Acetonitril: Wasser (7:3) sehen Methode als Nachweis ein R_f von etwa 0,42 auf Celluloseplatten.. und auf Celluloseplatten in Acetonitril, Isopropanol und Wasser (1:1:1) mit der gleichen Nachweis- 50 methode ein Rf-Wert von 0,29 gefunden. Antibioticum A 16 886 und seme Salze weisen

Eine nach der Spackman-Moore-Stein-Technik hemmende Wirkung auf das Wachstum von gramdurchgeführte Aminosäureanalyse eines sauren Hy- positiven und gramnegativen Bakterien auf. Die drolysats von A 16886 II lieferte hauptsächlich nur Mengen, in denen Antibioticum A 16 886 als pareine ninhydrinreaktive Bande, die unmittelbar vor 55 tiell gereinigte Mischung der Monoammoniumsalze Glycin eluiert und wie im Fall von A 16 886 1 der Faktoren I und Il hemmende Wirkung auf das als alpha-Aminoadipinsäure identifiziert wurde Wachstum beispielhafter Organismen aufweist, zeigt (Zl μΜοΙ/mg). Tabelle I. Die Hemmkonzentrationen wurden nach

Es war jedoch außerdem noch eine sehr schwache dem Agar-Verdünnungstest oder nach dem Brühe-Bande vorhanden, die identisch mit Glycin eluierl 60 Verdünnungstest (in der Tabelle durch die Buchwurde. Eine spätere Probe wurde in der gleichen stäben »a. d.« bzw. »b. d.« bezeichnet) ermittelt. Weise analysiert und ergab Werte von Zl bzw Bei dem Agar-Verdünnungstest wurde der Test-0.13 μΜοΙ/mg. Zusätzlich wurde jeder der Faktoren I Organismus auf eine Reihe von Agarplatten, die ver- und H des Monoammoniumsalzes von Antibioticum schiedene Konzentrationen der Monoammoniurn-A 16 886 papierchromatographisch und dünnschicht- 6s salze von Faktor I und II von Antibioticum A 16 chromatographisch in verschiedenen anderen Lö- enthielten, aufgestrichen, um die minimalen Konzensungsmittelsystemen mit folgenden Ergebnissen unter- trationen in mcg'ml (Mikrogramm pro Milliliter) sucht: 'ⁿ ^^em Agarsubstrat zu ermitteln, die das Wachstum

Faktor 1	Faktor 11
0,38	0,33
immobil	immobil
0,39	0,32
immobil	immobil
immobil	immobil
immobil	immobil
immobil	immobil
immobil	immobil
0.32	0,27
0,21	0,15
0,20	0,17
0,29	0.22
0,17	0,17
0,72	0,65
0,82	0.82
0,35	0,29

040

des Mikroorganismus 48 Stunden lang (bei den pilanzenpathogenen Mikroorganismen 72 Stunden lang) hemmten.

Bei dem Brühe-Verdünnungstest wurde eine Reihe von Reagensgläsern, die verschiedene Konzentrationen der Monoammoniumsalze von Faktor I und II des Antibioticums A 16 886 enthielten, mit den Testorganismen inokuliert, um die minimale Konzentration in mcg/ml in dem Brühesubstrat zu ermitteln, die das Wachstum des Mikroorganismus etwa 20 Stunden lang hemmt.

Tabelle 1

Testorganismus

Escherichia coli 0127

Proteus PR-6

Salmonella typhimurium S-4

Klebsieila sp. K-I

Pseudomonas sp. X 239

Salmonella typhosa T-63

Hemmkonzentration mcg/ml

0,39 b.d. 0,78 a.d. 0,78 a.d. 1,56 a.d. > 100 a.d. 0,78 b.d.

Testorganismus	Hemmkonzentration mcg/ml
Slraphylococcus aureus 3055 .... Streptococcus pyogenes C ,103 ... Bacillus subtilis X 12,1 Staphylococcus aureus 3150 ....	25,00 a.d. 6,25 a.d. 1,56 a.d. 50,00 a.d.

Bei keinem der vorstehenden Tests wurde eine Bindung durch Pferdeserum festgestellt. Wie aus der Tabelle hervorgeht, weist Antibioticum A 16 886 als Mischung der Monoammoniumsalze von Faktor I und Il Aktivität gegen gramposilive und gramnegative Bakterien auf.

Antibioticum A 16 886 wurde ferner in einem Ί est mit Hilfe der Bauer-Kirhy-Scheibendiffusionsmethode auf antibakterielle Aktivität geprüft. Die Prüfung erfolgte getrennt mit den Monoammoniumsaizen von Faktor I und II. Die Ergebnisse, angegeben in Millimeter Durchmesser der Hemmzone bei der angegebenen Antibioticumkonzentration, zeigt die folgende Tabelle II.

Tabelle

Testorganismus

Escherichia coli 0127

Escherichia coli EC 25

Proteus sp. PR 6

Proteus sp. PR 7

Salmonella typhosa SA 12 ...
Salmonella typhosa SA 16..
Klebsiella aerobacter KA 14
Klebsiella aerobacter KA 25

Pseudomonas sp. Ps 24

Pseudiminas sp. Ps 30

Staphyiococcus aureus 3055
Staphylococcus aureus 3074

Escherichia coli 0127

Escherichia coli EC 25

Proteus sp. PR 6

Proteus sp. PR 7

Salmonella typhosa SA 12...
Salmonella typhosa SA 16... Klebsiella aerobacter KA 14. Klebsie'la aerobacter KA 25 .

Pseudomonas sp. Ps 24 Pseudomonas sp. Ps 30

Staphylococcus aureus 3055 . Staphylococcus aureus 3074 .

30

25,6 19,6 23,2 14,0 27,2 24,2 23,0 22,1 23,0

19,7 11,9 22,2

7.1 23,8 19.3 20,1 15,6 20.2

12.4 10,1

Faktor 1
Hg/Schcibe

20,7	18,6
15,1	12,5
19,0	16,7
10,4	0
22,8	19,9
19,6	16,2
18,8	15,4
15,8	12,3
18,2	15,7
0	0
0	0
0	0
15,9	12,9
7.7	0
16,7	13,6
0	0
18,7	15,6
13,4	11,0
13,7	10,8
10,1	7,4
15,4	*12,3)**
0	0
0	0
0	0

2.5	1.0	0.5
15,9	12,7	8,4
9,1	0	0
13,6	9,9	0
0	0	0
16,9	11,3	8,0
13,1	9,3	0
11,4	,· 7,6	0
9.0	0	0
13,2	10,1	0
0	0	0
0	0	0
0	0	0
9,4	0	0
0	0	0
10,4	0	0
0	0	0
12,3	7,5	0
7,5	0	0
0	0	0
0	0	0
9,3*)	0	0
0	0	0
0	0	0
0	0	0

*) Satellitenkolnnien in der Hemmzone

Antibioticum A 16886 und seine Salze weisen femer Aktivität in vivo gegen eine Reihe der obengenannten Mikroorganismen auf und sind daher zur Bekämpfung von Infektioner, vorteilhaft, die ν
solchen Mikroorganismen in tierischen Wirten ν
ursacht werden. Die Toxizität fur Säugetiere

niedrig. Der LD₅₀-Wert beträgt > 5 g/kg, und die tägliche subkutane Verabreichung von 350 mg/kg an eine Gruppe von 10 Ratten während einer Zeit von 14 Tagen ergab keine Todesfälle und vernachlässigbare Anzeichen für Toxizilät. Antibioticum A 16 886 als Mischung der Monoammoniumsalze von Faktor 1 und 11 zeigte folgende ED₅₀-Werte in Mäusen, die mit dem betreffenden Mikroorganismus infiziert waren.

Tabelle UI

Organismus

Escherichia coli 0127 ...
Salmonella typhosa T-63

Klebsiella K-I

Proteus PR-6

ED₅₀ (subcutan)

13,8 15,6 10,2

7,3

Außerdem zeichnen sich Antibioticum A 16 996 und seine Salze durch Aktivität gegen pflanzenpathogene Bakterien aus. So lassen sich beispielsweise mit Antibioticum A 16 886 und seinen Salzen solche Infektionen mit pflanzenpathogenen Bakterien wie Bakterienwelkkrankheit, Bakterienfleckfäule und Bakterienbrand bekämpfen.

Auf die besondere Art des Auftrags von Antibioticum A 16 886 oder eines Salzes davon auf Pflanzen kommt es nicht wesentlich an. Im allgemeinen erfolgt der erste Kontakt des Erregerorganismus mit dem Pflanzenblattwerk. Aus diesem Grund wird häufig ein Auftrag von Antibioticum A 16 886 oder eines Falzes davon auf das Blattwerk bevorzugt. Antibioticum A 16 886 und seine Salze werden jedoch von den Pflanzen transportiert. Daher kann der Auftrag auch auf Stengel, Blüten, Samen, Wurzeln oder andere Pflanzenteile zur Erzielung einer bacterieiden Wirkung in den Pflanzen erfolgen.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bekämpfung von pflanzenpathogenen Bakterien wird auf Pflanzen, die einem Befall durch die Bakterien ausgesetzt sind, eine wirksame Menge von Antibioticum A 16 886 oder eines Salzes davon aufgebracht. Es ist für diese Methode nicht wesentlich, daß das Antibioticum in Form eines einzelnen Faktors angewandt wird. Jeder der Faktoren 1 und Il kann allein verwendet werden und liefert gute Ergebnisse. Antibioticum A 16 886 oder ein Salz davon können ohne Modifizierung angewandt werden; im allgemeinen wird zur Pflanzenbehandlung jedoch vorzugsweise eine Zubereitung verwendet, die das Antibioticum A 16 886 oder ein Salz davon und einen oder mehrere Hilfsstoffe enthält. Zur Herstellung solcher Zubereitungen können Antibioticum A 16 886 oder seine Salze mit Wasser oder anderen flüssigen Trägern, organischen Lösungsmitteln, oberflächenaktiven Mitteln, darunter festen oberflächenaktiven Mitteln, oder inerten feinteiligen Feststoffen oder inerten körnigen Feststoffen modifiziert werden. Die genaue Konzentration von Antibioticum A 16886 oder eines Salzes davon in einer solchen Zubereitung ist nicht kritisch und hängt von dem jeweiligen Anwendungszweck ab, für den die Zubereitung bestimmt ist. Im allgemeinen liefern für den Auftrag auf Blattwerk zur Bekämpfung von Infektionen durch typische pflanzenpathogene Bakterien Konzentrationen von Antibioticum A 16 886 oder eines Salzes davon von 10 bis 1000 ppm oder mehr gute Ergebnisse. Bei Stäubemitleln zum Auftrag auf Blattwerk weiden Antibioticumkonzentrationen von 0,1 bis 10.0% bevorzugt.

Zur Herstellung flüssiger Zubereitungen kann Antibioticum A 16886 oder ein Salz davon mit einer geeigneten Flüssigkeit und einem oberflächenaktiven Dispergiermittel zu emulgierbaren Konzentraten vereinigt werden, die mit Wasser oder einer anderen Flüssigkeit zu Sprühmischungen weiter verdünnt werden können. Zu bevorzugten Dispergiermitteln, die in diesen Zusammensetzungen verwendet werden können, gehören die nichtionischen Emulgatoren, z. B. die Kondensationrprodukte von Alkylenoxiden mit anorganischen öäuren, Polyoxyäthylenderivate von Sorbitanestern, komplexe Ätheralkohole. Geeignete organische Flüssigkeiten, die in der Zusammensetzung verwendet werden können, sind beispielsweise Erdöle und Erdöldestillate, Toluol und synthetische organische öle. Die oberflächenaktiven Dispergiermittel werden in flüssigen Zusammensetzungen gewöhnlich in Mengen von 0,1 bis 20 Gewichtsprozent, bezogen auf die gesamte Gewichtsmertge aus Dispergiermittel und aktiver Verbindung, verwendet. Zur Herstellung von Stäubemitteln können Antibioticum A 16 886 oder ein Salz davon mit einem der typischen feinteiligen Feststoffe oder Granulate, wie sie in chemischen Zubereitungen für landwirtschaftliche Zwecke Verwendung finden, vereinigt werden.

Durch die folgenden Beispiele 1 bis 6 wird diese Ausfuhrungsform der Erfindung näher erläutert. In jedem dieser Beispiele wird Antibioticum A 16 886 als Mischung des Monoammoniumsalzes von Faktor I und des Monoammoniumsalzes von Faktor Il verwendet.

Beispiel 1

Erwinia amylovora und Pseudomonas solanacearum, in vitro

Antibioticum A 16 886 wurde in vitro auf seine hemmende Wirkung auf Erwinia amylovora und Pseudomonas solanacearum geprüft. Jeder MikroJ Organismus wurde getrennt in Standardnähragar ein] gebracht, und die erhaltenen Agarkulturen wurden in mehrere Schalen gegossen und festwerden gelassen Dann wurde die Behandlung verschiedener Platter mit verschiedenen Methoden durchgeführt. Bei eine Behandlungsmethode wurden jeweils 0,1 ml Test lösung in zwei kleine Stahlzylinder pipettiert, di aufrecht auf einer Agaroberfläche standen. Bei di anderen Methode wurden zwei Filterprüfscheibe die auf eine Agaroberfläche gelegt wurden, mit jewel 0,1 ml Tesllösung imprägniert. Die Testlösung beide Behandlungsmethoden wurde durch Auflö der entsprechenden Menge Antibioticum A 16 in Wasser, das in einer Glasapparatur destillid worden war, hergestellt Die Ergebnisse, angegeb« als Durchmesser der Hemmzone, zeigt die folgen] Tabelle:

Behandlung

Tabelle IV

A 16 886 — 10 ppm

A 16 886 — 50 ppm

A 16 886 — 100 ppm

Kontrolle (destilliertes Wasser)....

Ilemmzoiicndurchmesser in mm Slahlzylindcr A

V.. amvlovora P. solunacearum

6-6
12-14
15-16

6-6

16-17

25^25

30-30

6-6

Filterscheiben B
E. amvlovora P. solanacearum

13-13
16-17
20-20
13 13

20-21
30-30
34-35
13-13

A - einschließlich der Größe des Zylinders ft mm: eine /onengröBe von ft mm gibt daher keine Wachstumshemmung an.

B — einschließlich der Größe der Filterscheibe 13 mm: eine Zonengröße von 13 mm gibt daher keine Wachstumshemmung an.

Beispiel 2
Pseudomonas solanacearum, Blattsprühung

Antibioticum A 16 886 wurde ferner in vivo zur Bekämpfung von Pseudomonas solanacearum auf Tomatenpflanzen geprüft. Bei dieser Prüfung wurde Antibioticum A 16886 Monoammoniumsalz in Form verschiedener wäßriger Zubereitungen verwendet, die sämtlich 1% Äthanol und 0,1% eines oberflächenaktiven Mittels (ein Polyoxyäthylenderivat eines Fettsäureparlialesters von Sorbitanhydrid), jedoch verschiedene Konzentrationen an Antibioticum A 16886 enthielten. Für die Prüfung wurden 30 Tage alle Tomatenpflanzen mit 2 Pflanzen/Topf/Behandlung verwendet, üie Pflanzen in jedem Topf wurden mit einer der Behandlungslösungen behandelt, an der Luft trocknen gelassen und dann mit einem Medium, das ein aktives Wachstum von Pseudomonas solanacearum aufrechterhielt, inokuliert. Alle Pflanzen wurden 24 Stunden in einer feuchten Kammer gehalten, dann herausgenommen und 7 Tage unter guten Agrikulturbedingungen gehallen. Nach Ablauf dieser 7 Tage wurden alle Pflanzen auf das Vorliegen und, falls vorhanden, das Ausmaß der Infektion untersucht. Die Krankheitssymptome wurden nach einer Skala von 0 bis 4 bewertet, wobei 0 keine Bekämpfung und 4 vollständige Bekämpfung bedeutet. Jede Pflanze wurde getrennt bewertet. Die Ergebnisse zeigt die folgende Tabelle:

45

Tabelle V

Kontrolle (1% ElOH + 0,1%
oberflächenaktives Mittel) ..

A 16886 — 400 ppm

A 16886 — 200 ppm

Pseudomonas
solanacearum

Bewertung
der Erkrankung

2 + 2 +

3 + 2 +

A 16 886 und die andere 400 Teile pro Million Antibioticum A 16 886 enthielt. 10 Tage alte Sojabohnenpflanzen wurden mit Pseudomonas glycinia inoculiert, und die Wurzeln aller Pflanzen wurden während der Prüfung in wäßrigen Lösungen gehalten. Die inoculierten Pflanzen wurden zunächst in 50 ml Lösung gestellt. Eine Gruppe von Pflanzen wurde in die 200-ppm-Lösung, eine zweite Gruppe von Pflanzen in die 400-ppm-Lösung und eine dritte Gruppe von Pflanzen als Kontrolle in Wasser gestellt. Die Wurzeln wurden 24 Stunden lang eingetaucht und während dieser Zeit belüftet. Dann wurden die Pflanzen, deren Wurzeln sich weiter in den verschiedenen Lösungen befanden, 24 Stunden lang incubiert. Danach wurden die Pflanzen aus der Incubationskammer herausgenommen und 1 Woche lang stehengelassen. Etwa zu Beginn der Incubationsdauer und von da an während der gesamten Woche wurde den Wurzeln nach Bedarf eine nährstoffhaltige Lösung zugeführt, um die Pflanzen in lebensfähigem Zustand zu halten. Nach Ablauf der Woche wurden die Pflanzen untersucht, um die Ausbildung einer Pseudomonas glycinia-lnfektion festzustellen. Die Krankheitsbewertung erfolgte nach einer Skala von 0 bis 4, wobei 0 keine Bekämpfung und 4 vollständige Bekämpfung bedeutet. Die Ergebnisse zeigt die folgende Tabelle:

60

Die Kontrollpflanzen zeigten eine schwere Pseudomonas solanacearam-Infektion.

Beispiel 3
Pseudomonas glycinia, Wurzeltränkung

Antibioticum A 16 886. wurde zur Bekämpfung von Pseudonionas glycinia mit Hilfe von A 16886 enthaltenden Lösungen für die bloßen Wurzeln geprüft. Es wurden 2 Tränklösungen verwendet, von denen eine 200 Teile pro Million Antibioticum

Tabelle Vl

Pseudomonas glycinia
Bewertung der Erkrankung

55 Xanthomonas phaseoli var. sojensis,
Blattsprühung

In einem ersten Test wurden 10 Tage alte Sojabohnenpflanzen durch schwaches Befeuchten der unteren Blattoberflächen der Primärblätter mit einer Suspension von Xanthomonas phaseoli var. sojensis inoculiert. 2 Stunden später wurde das Blattwerk mit einer Sprühlösung besprüht.

Eine Gruppe inoculierter Pflanzen wurde mit einer Lösung, die 100 Teile pro Million Antibioticum A 16 886 enthielt, und eine zweite Gruppe mit einer Lösung, die 500 Teile pro Million Antibioticum A 16886 enthielt, behandelt. Antibioticum A J 6 886

hi E
η

wurde in Wasser mit 353 Teilen pro Million einer Mischung aus nichtionischen flüssigen Sulfonatemulgatoren zubereitet.

In einem zweiten Test wurde das Blattwerk von

10 Tage alten Sojabohnenpflanzen mit einer Sprühlösung besprüht, die entweder 100 oder 500 Teile pro Million A 16886 enthielt, und 2 Stunden später in der gleichen Weise wie bei dem ersten Test inoculierL Die Zubereitung von Antibioticum A 16 886 erfolgte in der gleichen Weise wie bei dem ersten Test.

Die Pflanzen wurden etwa 11 Tage lang unter guten Agrikulturbedingungen gehalten und dann auf das Vorliegen oder Fehlen von Xanthomonas phase-

011 var. sojensis untersucht. Die Bewertung erfolgte nach einer Skala von 0 bis 4 wie in den vorhergehenden Beispielen. Die Ergebnisse zeigt die folgende Tabelle.

Tabelle VlI

von denen eine 100 Teile pro Million A 1688 b und die andere 400 Teile pro Million Antibioticum A 16886 und beide jeweils 353 Teile pro Million der Emulgatormischung enthielten. Für die Prüfung wurden Gruppen von 28 Tage alten Tomatenpflanzen verwendet. In einer Prüfreihe wurde die Lösung nur auf die Stengel und in der zweiten Prüfreihe nur auf die Blätter aufgebracht. 2 Stunden nach der Behandlung mit jeder der beiden Methoden wurden die Pflanzen durch Einstechen eines in eine Brühekultur von Pseudomonas solanacearum getauchten Zahnstochers in den Stengel bei den Cotyledonen inoculiert. Die Pflanzen wurden 10 Tage unter guten Agrikulturbedingungen gehalten und dann zur Bestimmung der Krankheitsbekämpfung untersucht. Die Bewertung nach einer Skala von 0 bis 4, wobei 0 keine Kontrolle und 4 vollständige Kontrolle angibt, lieferte folgende Ergebnisse:

Tabelle VIII

Kontrolle (Wasser allein) ..
Kontrolle (Wasser plus
Emulgatormischung)....

A 16 886 — 100 ppm

A 16 886 — 500 ppm

Mittlere Krankheits-

bcwenung pro behandelte

Gruppen von Pflanzen

Xanthomonas phaseoli

var. sojensis

inoculiert,

dann
besprüht

2 3 +

besprüht.

dann
inoculiert

0 4 4

Kontrolle (Wasser plus
353 ppm Emulgatormischung)

A 16 886 — 100 ppm..
A 16 886 — 400 ppm..

Pseudomonas solanacearum K rankheitsbewertung

nur Blätter
behandelt

3 4

1
4
4

35

Beispiel 5

Pseudomonas phaseolicola, Blattsprühu..j

Alle Oberflächen von 20 Tage alten roten F__erbohnenpflanzen wurden mit einer wäßrigen Zubereitung besprüht, die 400 Teile pro Million Antibioticum A 16 886 und 0,1% eines oberflächenaktiver Mittels (ein Polyoxyäthylenderivat eines Fettsäurepartialesters von Sorbitanhydrid) enthielt. Die besprühten Pflanzen wurden trocknen gelassen und dann mit Pseudomonas phaseolicola inoculiert. Das Inoculieren erfolgte durch Befeuchten der unteren Blattoberfläche jeweils eines Blättchens der ersten und zweiten dreiblättrigen Blätter mit einer wäßrigen Bakteriensuspension mit 30% Lichtdurchlässigkeit auf einem Bausch und Lomb Spectronic 20. Die Pflanzen wurden anschließend 24 Stunden in eine feuchte Kammer gestellt, dann herausgenommen und 14 Tage unter guten Agrikulturbedingungen gehalten. Nach Ablauf dieser Zeit wurden alle Pflanzen untersucht. Bei der behandelten Gruppe von Pflanzen wurde eine mäßige Bekämpfung von Pseudomonas phaseocicola festgestellt, während in der Kontrollgruppe schwere Krankheitssymptome gefunden wurden.

Beispiel 6

Pseudomonas solanacearum, getrennte
Besprühung von Blättern oder Stengeln

Antibioticum A 16 886 wurde in Wasser mit einer Mischung aus zwei nichtionischen flüssigen Sulfonatemulgatoren zu zwei Behandlungslösungen zubereitel, Wie oben angegeben wurde, weisen Antibioticum A 16 886 und seine Salze außer antibakterieller Aktivität auch anthelmintische Aktivität auf. Antibioticum A 16886 oder ein Salz davon können daher an Warmblüter zur Bekämpfung verschiedener innerer Parasiten, besonders Magen- und Eingeweidewürmern, z. B. Ascaris lumbricoides var. suum. Nematospiroides dubius, Aspiculuris tetraptera, Syphacia obvelata u. dgl., verabreicht werden. Ebenso wie bactericide Aktivität weist jeder der beiden Hauptfaktoren anthelmintische Aktivität auf. Daher wird eine anthelmintische Wirkung erzielt, wenn jeder der beiden Faktoren getrennt oder wenn eine Mischung der Faktoren verwendet wird.

Die Verabreichung von Antibioticum A 16 886 oder eines Salzes davon erfolgt vorzugsweise auf oralem Wege, beispielsweise durch Einführung von Antibioticum A 16 886 oder eines Salzes davon in Tierfutter, durch Verabreichung von Tabletten, Tränken oder durch andere Maßnahmen. Im allgemeinen sind Dosierungen von 1 bis 500 mg pro Kilogramm Körpergewicht oder mehr bei Verabreichung von Einzeldosen wirksam. Wenn Antibioticum A 16 886 oder ein Salz davon als Bestandteil eines regelmäßigen Futters zugeführt wird, liefern Konzentrationen von 0,0001 bis 0,05% oder mehr gute Ergebnisse. Ein bevorzugter Konzentrationsbereich von Antibioticum A 16 886 oder eines Salzes davon in Futtermitteln beträgt 0,01 bis 0,05%.

Die anthelmintische Aktivität von Antibioticum A 16 886 wird durch die folgenden Beispiele 7 und 9 näher erläutert, in denen jeweils Antibioticum A 16 886 als Mischung des Monoammoniumsalzes von Faktor 1 und des Monoammoniumsalzes von Faktor II verwendet wurde.

nur Stengel	1	I S i
behandelt	4
	4	ί
0
3
4

Beispiel 7

Io

In einem ersten Test wurde Antibioticum A 16 886 als Einzeldosis durch eine Schlundsonde an jeweils 2 Mäuse verabreicht, die mit Aspiculuris tetraptera und Syphacia obvelata (Maden .vürmer) infiziert waren. Die Dosis betrug 500 mg Antibioticum A 16 886 pro Kilogramm Körpergewicht des einzelnen Tiers und wurde als Suspension in physiologischer Kochsalzlösung mit einem Gehalt von 0,125% Methylcellulose als Suspendiermittel verabreicht. Bei dem Versuch wurde ferner eine Kontrollgruppe von 6 Mäusen verwendet, die mit Aspiculuris tetraptera und Syphacia obvelata infiziert waren. Beide Gruppen wurden nach Verabreichung der Dosis an die behandelte Gruppe 48 Stunden unter normalen Laboratoriumsbedingungen gehalten. Dann wurden alle Mäuse abgetötet und auf Gegenwart und Zahl von Madenwürmern untersucht. Die Ergebnisse zeigt die folgende Tabelle: ,0

Gruppe

0,0]% Antibioticum
A 16886

0,05% Antibioticum
A 16 886

Durchschnittliche Zahl

der Lungenschäden

pro Gruppe

0.33
0,0

Beispiel 9

Ein weiterer Versuch wurde wie im Beispiel 8 durchgeführt mit der Ausnahme, daß die Konzentrationen abgeändert wurden. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Tabelle XI

Gruppe

Tabelle IX

Kontrolle

Antibioticum 500 mg/kg
A 16 886

Zahl von Madenwürmern pro Tier (Mittelwert)

Kontrolle

0,0005% Antibioticum A 16 886
0,001% Antibioticum A 16 886 ..
0,1% Antibioticum A Ib 886

Durchschnittliche Zahl der Lungenschäden pro Gruppe

2,2
1.2
0,7
0,2

Aspircularis tetraptera

35
4,5

Syphacia obvelata

41
0,5

30

Beispiel 8

In einem weiteren Versuch wurde \ntibioticum A 16 886 mit Standard-Mäusefuttei zu verschiedenen behandelten Futtermitteln vermischt, die Antibioticum A 16 886 in Konzentrationen von 0,005, 0,01 und 0,05 Gewichtsprozent enthielten. Die Futtermittel dienten als Nahrung für verschiedene Gruppen von Mäusen mit jeweils 5 Mäusen pro Gruppe. Etwa 24 Stunden nach Beginn der Fütterung wurden die Mäuse mit Ascaris lumbricoides var. suum ova. infiziert. Eine weitere Gruppe von 5 Mäusen, die als Kontrolle diente, wurde mit dem Futtermittel ohne Wirkstoff gefüttert, jedoch ebenfalls gleichzeitig mit Ascaris lumbricoides var. suum infiziert. Alle Gruppen erhielten ihr betreffendes Futter und wurden 10 Tage unter normalen Laboratoriumsbedingungen gehalten. Dann wurde allen Mäusen das Futter entzogen. Am 11. Tag wurden alle Mäuse getötet, und die Lungen wurden auf das Vorliegen, und, falls vorhanden, die Zahl von Schäden durch Ascaris lumbricoides var. suum. untersucht. Die Menge an Antibioticum A 16 886 in dem Futter und die durchschnittliche Zahl von Lungenschäden pro Tier in jeder Gruppe zeigt die folgende Tabelle:

60

	Tabelle X
Gruppe
Kontrolle
0,005% Antibioticum A 16 886
Durchschnittliche Zah der Lungenschäden pro Gruppe
2,0 0,166

Für den Mikroorganismus Streptomyces clavuligerus ist die Bildung eines ausgedehnten Netzwerks von kurzen, sympodial verzweigten Lufthyphen, die schließlich in Sporen segmentieren, charakteristisch. Es werden kurze keulenförmige Seitenzweige gebildet, die gewöhnlich jeweils 1 bis 4 Sporen erzeugen. Es werden keine Subsiratconidien erzeugt. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen glattwandige Sporen. Zellwandpräparate enthalten zusätzlich zu den Hauptbestandteilen Asparaginsäure, Glutaminsäure und Alanin das L,L-Isomere von Diaminopimelinsäure und Glycin. Die Sporen sind in Masse grau, und Primärmycel ist blaßgelb bis gelbbraun. Es wird kein lösliches Pigment gebildet. Die Kultur hat einen optimalen Temperaturbereich von 26 bis 3O⁰C. Bei 37 C erfolgt kein Wachstum. Morphologisch ähnelt diese Kultur manchen Stämmen von Thermomonspora und Micromonospora.

Der neue Mikroorganismus, der Antibioticum A 16 886 zu produzieren vermag, wurde bei der Kulturensammlung der Northern Utilization Research and Development Division, Agrikultural Research Servise, U.S. Department of Agriculture (früher Northern Regional Research Laboratories), Peoria, Illinois,. 61604 ständig hinterlegt und ist von dort Tür jedermann unter der Kulturnummer NRRL 3585 erhältlich.

Die Charakteristika von Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 sind in den folgenden Tabellen angegeben. Es wurden die Methoden, die für das Internationale Streptomyces-Projekt (Shirling el al, »Methods for Characterization of Streptomyces Species«, Intern. Bull. Systemic Bacteriol. 16: 313 340) (1966) für die Klassifizierung von Streptomyces-Species empfohlen wurden, zusammen mit einigen zusätzlichen Tests angewandt. Farbnamen wurden nach der ISCC-NBS-Methode, beschrieben von Kelly at al in The ISCC-NBS-Method of Designating Colors and a Distionary of Color Names (U.S. Department of Commerce Circ. 553, Washing-Ion, D. C. 1955), zugeteilt. Die Buchstaben in runden Klammern beziehen sich auf die Farbreihe nach Tresner und Backus (T r e s η c r et al, »System

w A49/369

Γ Color Wheels for Strepiomyces Taxonomy«, Appl. Iicrobiol. 11: 335-338 [1963]). Farbplättchenbejidinungen sind unterstrichen. Die Farbblocks nach laerz und Paul (Maerz et al, Dictionary of Color (McGraw-Hill Book Co., Inc., New York, 1950) sind in eckige Klammern gesetzt. Wenn nichts anderes angegeben ist, wurden die Kulturen 14 Tage bei 30 C gezüchtet.

Tabelle XII Beobachtete Eigenschaü

Morphologie

Kultur-Characteristica auf

ISP No. 2
(Hefe-Malzextr.-Agar)...

ISP No. 3
(Hafermehl-Agar)

ISP No. 4

(Anorganische Salze-Stärke-Agar)

ISP No. 5
(Glycerin-Asparagin-Agar)

Tomatenpaste-Hafermehl-Agar ..

Emerson-Agar

Bennetls-Agar

Czapek-Agar

Glucose-Asparagin-Agar

Tyrosin-Agar

Nähr-Agar

Calciummalat

Wirkung auf Milch

Nitratreduktion

Gelatineverflüssigung

Wachstumsreaktion auf
pH-Änderungen

Melaninbildung

Pepton-Eisen-Agar und
Trypton-Hefeextr.-Brühe

Temperaturanforderungen

Hauptbestandteile von ganzen
Zellhydrolysaten

Characteristic» von NRRL 3585

Sporophoren werden auf einem umfangreichen Luftmycel gebildet und bestehen aus kurzen sympodial verzweigten Hyphen. Gewöhnlich entstehen 1 bis 4 Sporen auf kurzen keulenförmigen Seitenzweigen. Sporophoren segmentieren schließlich unter Bildung von Sporenketten. Sporenabmessungen 0,34 bis 0,85 μ · 0,85 · 3,3 μ, durchschnittlich 0,64 · 1,5 μ. Electronenmicroskopische Aufnahmen zeigen glattwandige Sporen. Im Substratmycel werden keine Sporen gebildet.

Wachstum reichlich, Revers giaugelb [12 K 3]; Luftmycel reichlich, dunkelgrau (G) 3ih [21 B I]; kein lösliches Pigment.

Wachstum mäßig. Revers blaßgelb [HCl]; Luftmycel mittel, weiß (W) b [27 A I]; kein lösliches Pigment.

Wachstum reichlich, Revers graugelb [12 B 2]; Luftmycel mäßig, mittelgrau (GY) 2fe [45 A I]; kein lösliches Pigment.

Wachstum mittel, Revers blaßgelbgriin [1OB I]; Luftmycel mittel, weiß (W) a; kein lösliches Pigment

Wachstum reichlich, Revers graugelb [11 E 4]; LuiYmycel mäßig, hellgrauolive (GN) 1-1/2ig [21 B I]; kein lösliches Pigment.

Wachstum reichlich, Revers blaßgelb [11 C I]; Luftmycel spärlich, kein lösliches Pigment.

Wachstum reichlich, Revers hellgelb [11 J 2]; Luftmycel reichlich, dunkelgraugrün (GN) 24 l/2ih [23 A 3]; kein lösliches Pigment.

Wachstum spärlich.

Wachstum mäßig, Revers blaßgelbgrün [10 B I]; Luftmycel mittel, weiß (W) b [27 A I]; kein lösliches Pigment.

Wachstum mäßig, Revers blaßgelb [10 B 2]; Luftmycel mäßig, gelblichgrau, (GY) 2 dc [1OA 2]; kein lösliches Pigment.

Wachstum mittel, Revers blaßgelbgrün [10Bl]; Luftmycel spärlich, weiß; kein lösliches Pigment.

Wachstum reichlich, P.evers blaßgelbgrün [10Bl]; Luftmycel mittel, weiß (W) a.

keine Koagulation; Klärung in 17 Tagen.

negativ

keine pH 5,0 bis 6,0 im optimalen Wachstumsbereich, Wachstum, aber keine Sporulation bei pH 7,5 bis 8,5.

keine Wachstum und Sporulation gut bei 26 bis 30°; kein Wachstum bei 37" oder darüber.

UL-Diaminopimelinsäure, Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure Alanin und Leucin.

Die Ergebnisse von Kohlenstoffverwertungstests, die mit dem Mikroorganismus NRRL 3585 durchgeführt wurden, zeigt Tabelle XlIl.

In dieser Tabelle werden folgende Symbole verwendet:

4- = Wachstum und Verwertung. — = Kein Wachstum, keine Verwertung. (+) = Verwertung wahrscheinlich. (—) = Verwertung fraglich.

Tabelle XIII
Kohlenstoffverwertungsbild Tür NRRL 3585

L-Arabinose
Rhamnose..
Fructose ...
D-Xylose ...
Mele7itose.
Raffinose..
Dextrose ..
Cellobiose.
Maltose...

Saccharose

Cellulose ..

Inosit

Mannit ...

Na-glutamat

ίο reichen. Der Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums kann schwanken. Es wurde jedoch gefunden, daß der Anfangs-pH-Wert des Mediums zweckmäßig zwischc.i 6,5 und 7,2 liegt. Wie schon bei anderen Actinomyceten

beobachtet wurde, nimmt der pH-Wert des Mediums während der Wachstumsperiode des Mikroorganismus, während der Antibioticum erzeugt wird, allmählich zu und kann einen Wert von 6,7 bis 7,5 oder

20 Submers aerobe Ruiiurucuiugui·^.» sind die Bedingungen der Wahl für die Produktion von Antibioticum A 16 886. Zur Erzeugung verhältnismäßig kleiner Mengen können Schüttelkolbenkulturen und Oberflächenkulturen in Flaschen angewandt werden. Für die Herstellung großer Mengen werden dagegen ι submers aerobe Kulturen in sterilen Tanks bevorzugt. Das Medium in dem sterilen Tank kann mit einer Sporensuspension inoculiert werden. Wegen der

Antibioticum A 16886 kann wie oben angegeben durch Züchtung von NRRL 3585 erzeugt werden. Als Kulturmedium zur Erzeugung von Antibioticum A 16 886 durch Züchtung des oben beschriebenen Mikroorganismus können verschiedene Medien verwendet werden, obwohl aus den oben beschriebenen Verwertungstests zu ersehen ist, daß der Mikroorganismus unter künstlichen Kulturbedingungen nur wenige Kohlenstoffquellen zu verwerten vermag. Für den Fachmann ist aber ersichtlich, daß der Mikroorganismus in einem vollständigen Medium Kohlenstoffquellen verwerten kann, die unter solchen künstlichen Bedingungen nicht verwertet werden. Zur Erzielung einer wirtschaftlichen Produktion, einer maximalen Ausbeute an Antibioticum und einer leichten Isolierung des Antibioticums werden jedoch einige verhältnismäßig einfache Nährquellen bevorzugt. Die Medien, die zur Produktion des Antibioticums geeignet sind, enthalten beispielsweise eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff, z. B. Glucose, Stärke, Glycerin, Melasse, Dextrin.

Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Glucose und Glycerin. Verwendbare Medien enthalten ferner eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, z. B. Sojabohnenmehl, Maisquellwasserfeststoffe, Hefe, Baumwollsamenmehl, Rindfleischextrakt, Peptone (Fleisch oder Soja), Casein, Aminosäuregemische u. dgl. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Peptone, Sojabohnenmehl und Aminosäurengemische. Zu den anorganischen Nährsalzen, die in die Kulturmedien eingebracht werden können, gehören die üblichen Salze, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid- und Carbonationen liefern. einer verhältnismäßig Kieme» ««...,,- -----

mit der Sporenform des Organismus zuers, em vege tatives Inoculum des Organismus zu erzeugen una _· : ,.„,. oWivps veeeta

offenbar bei Temperaturen von 26 bis 30-C. Im allgemeinen erfolgt eine^ m-male 55 Produktion des Antibioticums in etwa 36 bis den nach Inoculieren des Kdtura^jjju

Wie es bei submers aeroben Kulturvertanren ud

»fiSt

21 22

dauer leicht durch Prüfen von Proben des Kultur- und Erdalkalimetallsalze, z. B. mit Calcium, Stron-

mediums auf ihre inhibierende Aktivität für das tium und Barium, sowie Salze mit Kupfer, Zink, Ma-

Wachstum von Mikroorganismen, die in Gegenwart gnesium und Silber. Bei organischen Basen kommt

von Antibioticum A 16 886 inhibiert werden, ver- es nicht auf die Art der Base an; im allgemeinen wird

folgt werden. Es wurde gefunden, daß die Mikro- 5 jedoch eine Base mit einem pH-Wert von 3,0 oder

Organismen E. CoIi, Salmonella gallinarum und darüber in Wasser bevorzugt. Geeignete organische

Pseudomonas solanacearum für diesen Zweck geeig- Basen sind beispielsweise Benzylamin, Methylamin,

net sind. Die Prüfung der Proben kann nach der Diälhylamin, Triäthylamin, Procain, Diisopropyl-

allgemein bekannten lurbidometrischen Methode oder amin, Äthanolamin, Cyclohexylamin, Dicyclohexyl-

Agardiffusionsmethode erfolgen. ic amin, Diphenylamin, Di-n-butylamin, Chinolin und

Im allgemeinen erfolgt eine maximale Produktion Pyridylamin.

von A 16 886 in 1 bis 3 Tagen nach Inoculieren des Für pharmazeutische Anwendungen werden die

Kulturmediums in submers aerober Kultur oder pharmazeutisch annehmbaren Salze von Antibio-

Schüttelkolbenkultur. ticum A 16 886 allgemein bevorzugt. Sämtliche Salze

Die während der Fermentation erzeugte antibio- i₅ sind jedoch als Zwischenprodukte bei der Produktion,

tische Aktivität kommt hauptsächlich in dem flüs- Abtrennung und Reinigung von Antibioticum

sigen Anteil der Fermentationsmischung vor. Die bei A 16 886 vorteilhaft. Für therapeutische Zwecke sind

der Produktion von A 16 886 angewandten Isolier- pharmazeutisch annehmbare Salze dem Antibioticum

methoden sind deshalb so ausgelegt, daß sie eine A 16 886 im allgemeinen gleichwertig. Manchmal

maximale Gewinnung des Antibioticums aus der 20 werden jedoch bestimmte Salze wegen einer vorleil-

Brühe ermöglichen. So werden beispielsweise Mycel haften Eigenschaft, z. B. Löslichkeit, die sie durch

und ungelöste Feststoffe aus der Fermentaiionsbrühe die Salzbildung erhallen, bevorzugt,

durch übliche Maßnahmen, z. B. Filtrieren oder Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläu-

Zentrifugieren, entfernt, und aus der filtrierten oder terung der Erfindung:

zentrifugierlen Brühe kann Antibioticum A 16 886 25

durch eine Extraktions- oder Adsorptionstechnik Beispiel 10

gewonnen werden. _A1,_oo, . . . .. Schüttelkolbenproduktion von Antibioticum

Zur Gewinnung von A 16 886 durch eine Adsorp- ^ 16 886
tionstechnik können verschiedene Adsorbentien, z. B.

Kohle, Kieselgel, Aluminiumoxid oder mikrokri- 30 Eine sporulierte Kultur von Streptomyces cla-

stalline Cellulose A 16 886, wie es aus der Fermen- vuligerus NRRL 3585 wurde durch Züchten des

tation erhalten wird, kann je nach den Fermen- Mikroorganismus auf einem Schrägagarnährmedium

tationsbedingungen entweder in amphoterer Form mit folgender Zusammensetzung erzeugt:

oder in Salzform vorliegen. Unabhängig von seiner Dextrin 1000 2

Form kann es aus einer Lösung in einem geeigneten 35 Hvdrolvsiertes Casein

Lösungsmittel an einem der obengenannten oder (»N-Z Amine-Type A«

ähnlichen Adsorbentien adsorbiert werden. Das Sheffield Chemical Company) ... 2,00 g

adsoroierte Antibioticum A 16 886 oder Salz kann Rindfleischextrakt 100 ti

dann von dem Adsorbens durch eine geeignete _Meer-Agar (3mal gewaschen)'. Y/.T. 20Ό0!

Eluiertechnik, z. B. durch Waschen des Adsorbens, 40 Deionisiertes Wasser... . 11 '
an dem das Antibioticum A 16 886 oder ein Salz

davon adsorbiert ist, mit einem Lösungsmittel, eluiert Der pH-Wert des Mediums wurde mit Natriumwerden. Wenn das Eluieren durch Waschen mit einer hydroxid auf pH 7,0 eingestellt.
Lösung von beispielsweise Aramoniumformiat oder Das Schrägagarmedium wurde mit Sporen von Natriumacetat erfolgt, wird Antibioticum A 16 886 45 Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 inoculiert und als Ammonium- bzw. Natriumsalz eluiert. Solche 4 bis 6 Tage bei 30 C incubiert. Dann wurde die Salze lassen sich durch übliche Methoden leicht Agarschrägkultur mit sterilem destilliertem Wasser wieder in Antibioticum A 16 886 überführen. bedeckt und gelinde abgeschabt, um die Sporen und Andere Salze von Antibioticum A 16 886 als Am- Zellen als wäßrige Suspension zu entfernen. 1 ml der monium- oder Alkalimetallsalze werden Vorzugs- 50 erhaltenen Suspension wurde zum Inoculieren von weise durch Übliche Reaktion von Antibioticum jeweils 100 ml eines vegetativen Mediums mit folgen-A 16 886 in unmodinzierter amphoterer Form mit der Zusammensetzung verwendet, der betreffenden Säure oder Base hergestellt. So wird

Antibioticum A 16 886 zur Herstellung von Säure- Glucose 15,00 g

additionssalzen mit einer anorganischen oder orga- 55 Sojabohnenmehl 15,00 g

nischen Säure umgesetzt. Zu Beispielen für geeignete Maisqueilwasserfeststoffe 5.00 g

Säuren gehören Chlorwasserstoffsäure, Bromwasser- Calciumcarbonat 2,00 g

stcffsäure. Jodwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phos- Natriumchlorid 5,00 g

phorsäure. Essigsäure, Benzoesäure, Sulfaminsäure. Deionisiertes Wasser 11

Weinsäure, Zitronensäure, Maleinsäure, Berr,stein- 60

säure. Ascorbinsäure und Glycolsäure. Der pH-Wert des vegetativen Mediums wurde mit

Antibioticum A 16 886 bildet ferner Salze mit Natriumhydroxid auf pH 6.7 eingestellt. Kationen bei Umsetzung von A 16886 in unmodi- Das vegetative Inoculum wurde 24 bis 48 Stunden fizierter amphoterer Form mit anorganischen und bei 30" C auf einer hin- und hergehenden Schüttelorganischen Basen und Salzen. Solche Salze sind 65 vorrichtung mit einem Ausschlag von 5 cm (2 inch) beispielsweise Ammoniumsalze und substituierte bei 108 UpM geschüttelt. Das so erzeugte Inoculum Ammoniumsalze, Alkalimetallsalze, z. B. mit Na- wurde dann wie folgt für die Produktion von Antitrium. Kalium. Lithium. Caesium und Rubidiutr. bioticum A 16886 verwendet.

2 23

Ein Produktionsmedium mit folgender Zusammensetzung wurde hergestellt:

Sojabohnenmehl 15,00 g

Casein 1,00 g

Natriumnitrat 3,00 g

Glucosesirup (50% Glucose) 20,00 g

Leitungswasser 11

Jeweils 100 ml des Produktionsmediums wurden in 500 ml Erlenmeyerkolben gegeben, die 30 Minuten bei 120' C sterilisiert wurden. Nach dem Abkühlen wurde jeder Kolben mit einem 5%igen vegetativen Inoculum inoculiert. Das Fermentationsmedium wurde 48 bis 72 Stunden bei 25 bis 30⁰C auf einer Rotalionsschüttelvorrichtung mit 250 UpM geschüttelt. Während der Fermentation wurde das Medium mit steriler Luft in einer Menge von 0,4 Vol./Vol./Min. belüftet. Die Isolierung erfolgte im wesentlichen wie im Beispiel 18 angegeben.

Beispiel 11

Antibioticum A 16 886 wurde nach der Arbeitsweise von Beispiel 10, jedoch unter Verwendung eines Produktionsmediums folgender Zusammensetzung und einer mit 108 Ausschlägen pro Minute betriebenen hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung statt einer Rolationsschüttelvorrichtung erzeugt.

Destillierte Lösung (Nadrisol) 5,00 g

Sojabohnenmehl (Nutrisoy 200 D) 5,00 g

Erdnußmehl 5,00 g

Melasse wie für »Blackstrap«,

einen dunklen Likör) 5,00 g

Hafermehl 5,00 g

Glycerin 10,00 g

Leitungswasser 11

Beispiel 12

Antibioticum A 16886 wurde nach der Arbeitsweise von Beispiel 10, jedoch unter Verwendung eines Produklionsmediums folgender Zusammensetzung erzeugt:

Hafermehl 20.00 g

Glycerin 10.00 g

Leitungswasser 11

Beispiel 13

Antibioticum A 16886 wurde nach der Arbeitsweise von Beispiel 10, jedoch unter Verwendung eines Produktionsmediums folgender Zusammensetzung erzeugt:

Baumwollsamenmehl 20,00 g

Glycerin 10,00 g

Glycose 5,00 g

Leitungswasser 11

Beispiel 14 ^₀

Antibioticum A 16886 wurde nach der Arbeitsweise von Beispiel 10, jedoch unter Verwendung eines Produktionsmediums folgender Zusammensetzung, erzeugt:

Glucose 20.00 g

Lösliche Stärke 10.00 g

Pepton (Wilsons 1159) 30.00 g

141

Hydrolysiertes Casein

(»N-Z Aminetype A«,

Sheffield Chemical Company) ... 4,00 g

Magnesiumsulfatheptahydral 5,00 g

Melasse (Blackstrap)..." 5,00 g

Calciumcarbonat 2,00 g

Leitungswasser 1100 ml

Beispiel 15

Antibioticum A 16 886 wurde nach der Arbeitsweise von Beispiel 10, jedoch unter Verwendung eines Produktionsmediums folgender Zusammensetzung erzeugt:

Glycerin 20,00 g

Sojapepton 5,00 g

Calciumnitrat 2,00 g

Natriumchlorid 0,50 g

Nadrisol 3,00 g

Leitungswasser 11

Beispiel 16

Eine weitere sporulierte Kultur von Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 wurde durch Züchten des Organismus auf einem Schrägagarnährmedium erzeugt. Das Medium hatte folgende Zusammensetzung:

Dextrin 10,00 g

Hefeextrakl 1,00 g

Hydrolysiertes Casein

(»N-Z Amine-Type A«,

Sheffield Chemical Company) ... 2,00 g

Rindfleischextrakt 1,00 g

Calciumchloridheptahydrat 0,01 g

Meer-Agar 20,00 g

Deionisiertes Wasser 11

Der pH-Wert des Mediums wurde mit Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt.

Das Schrägagarmedium wurde mit Sporen von Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 inoculiert und bis 10 Tage bei 30^cC incubiert. Dann wurden die Agarschrägkulturen zur Entfernung von Sporen abgeschabt, die zu ZO ml sterilem Rinderserum gegeben wurden. Von der erhaltenen Serumsporensuspension wurden dann 0,1 ml in eine sterile Gefriertrocknungsampulle überführt und zu Pellets gefriergetrocknet.

Die so erhaltenen Pellets wurden zum Inoculieren eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung verwendet:

Glycerin 10.00 g

Saccharose 20.00 g

Sojaschrot (Nutrisoy) 15.00 g

Amber BYF 300 5,00 g

Trypton 5,00 g

Kaliumbiphosphat 0,20 g

Leitungswasser 11

Der pH-Wert des Mediums betrug 6,2 und wurde mit Natriumhydroxid auf 6,5 eingestellt.

Beispiel 17 Pilotproduktion von Antibioticum A 16886

In einen 40-1-Fermenter aus korrosionsbeständigem Stahl wurden 241 eines Mediums folgender ZusammensetTunc gegeben:

309 64906«

25 < ^ 26

Antifoam A (ein Entschäumer der unter magnetischem Rühren 16 Stunden extrahiert.

Firma Dow Corning Company) 5,00 g Die methanolunlöslichen Stoffe wurden abfiltriert, und

.. , ι nsnn der methanollösliche Anteil wurde mit 5 Volumteilen

^biarke -^ ^y Aceton gefällt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und

Nadrisol 125,00 g 5 getrocknet. Die Ausbeute betrug 20,6 g.

ο · , , , , , , _{CAri n}„ Dieses Präparat wurde in einer Mindestmenge

Soiabohnenmeh schrot 500,00 g .,, ,■■ . λ ·. ■ /-. u · j- ι ■. ι ι

^{J &} Wasser gelost und mit einer Geschwindigkeit von 1 ml

Glycerin 187,50 g pro Minute auf eine 5,8 χ 120 cm-Kolonne mit einer

. . ils on > Füllung aus Dextran (Sephadex G-25) aufgegeben. Die

N-Z Amine A -...«w t _I0 Aktivität wurde mit deionisiertem Wasser eluiert, und

Ferrosulfatheptahydral 2,50 g die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und lyophili-

Kaltes Leitungswasser, auf 24 1 ^sie[Jj _{g des go erhaUenen Produkts wurden in 25}6 ml

Acetonitril/Wasser (55:45) gelöst und auf eine 5,5 χ

Der Anfangs-pH-Wert betrug 5,9 und wurde mit 15 85 cm-Kolonne mit einer Füllung aus Kieselgel, das etwa 20 ml 5n-Natriumhydroxid auf pH 6,5 einge- mit Acetonitril/Wasser (7:3) eingefüllt wurde, aufgestellt. Das Medium wurde 30 Minuten bei 120'C und geben. Die Aufgabe erfolgte mit einer Geschwindigkeit 1,05 bis 1,27 atü (15 bis 18 psig) sterilisiert, abgekühlt von 3 ml/Minute. Nach Aufgabe der Probe wurde die und dann mit einem wie im Beispiel 16 erzeugten Kolonne mit Acetonitril/Wasser (7:3) mit einer Strö-5%igen vegetativen Inoculum inoculiert. Die Fer- 20 mungsgeschwindigkcit von 5 ml pro Minute eluiert. mentation wurde 66 Stunden bei 30° C unter Belüften Die aktivsten Fraktionen wurden vereinigt, im Vakuum mit steriler Luft in einer Menge von 0,35 Vol./ zur Trockne eingeengt und lyophilisiert.
Vol./Min. und Durchmischen mit einem mecha- Das so erhaltene Material bestand aus einer Minischen Rührer, der mit 420 Umdrehungen pro schung der Monoammoniumsalze von Faktor I und Minute betrieben wurde, durchgeführt. Der End- 25 II. Es wurde für die oben beschriebenen antibakterielnH-Wert betrug 6,3. len und anthelmintischen Untersuchungen sowie für Antibioticum A 16 886 wurde aus der Brühe nach das folgende Trenn- und Reinigungsverfahren Verwendern in Beispiel 18 beschriebenen Isolierverfahren det.

gewonnen. _o . . , ,_

⁶ ₃₀ Beispiel 19

Beispiel 18

Trennung der Faktoren I und II von

Isolierung von rohem Antibioticum A 16 886 Antiuioticum A 16 886-Monoammoniumsalz
als Monoammoniumsalz

35 10 g eines wie im Beispiel 18 hergestellten Präparats

Etwa 75 1 wie im Beispiel 17 erhaltener Brühe wurden in 197 ml Acetonitril/Wasser (55:45) gelöst wurden mit Hilfe von »Hyflo Super-Cel« (einer Di- und auf eine 4,0 χ 130 cm-Kolonne mit einer Füllung atomeenerde der Firma Johns-Manville Products) in aus 1,6 1 mikrokristalliner Cellulose (Avicel) aufgeeiner Menge von 5 g pro 100 ml filtriert. Das Filtrat geben, die mit Acetonitril/Wasser (7:3) eingefüllt wurde mit einer Geschwindigkeit von 60 ml pro 40 wurde. Die Kolonne wurde mit 1 ml pro Minute beMinute über eine 9,5 χ 130 cm-Kolonne mit einer laden und mit 2 ml pro Minute mit Acetonitril/Wasser Füllung aus 81 Kohle (Pittsburgh 12 χ 40) geleitet. (7:3) eluiert. Die Elution wurde durch Testproben und Die Kolonne wurde mit 10 1 deionisiertem Wasser Papierchromatographie verfolgt. Beim Eluieren wur-(pH 5,2) gewaschen, und die an der Kohle adsor- den zahlreiche Fraktionen erhalten, die jeweils überbierte Aktivität wurde durch Durchleiten von 45 wiegend einen Faktor enthielten. Die Fraktionen mit 50%igem wäßrigem Aceton durch die Kolonne ent- den betreffenden Faktoren wurden vereinigt und lyofernt. Die Fraktionen, die die Aktivität enthielten, philisiert.
wurden vereinigt, zur Entfernung von Aceton im . .
Vakuum eingeengt und auf eine 9,5 x 140 cm-Ko- Beispiel zu
lonne mit einer Füllung aus »Dowex 1-Xl« (stark 5°

basisches Anionaustauschharz der Firma The Dow Herstellung von Antibioticum A 16 886
Chemical Co.) in der Formiatform aufgegeben. Die I-Hydrochlorid
Kolonne wurde mit 101 deionisiertem Wasser gewaschen, und die Aktivität wurde mit 0,1-m Ammo- 200 mg wie in den vorhergehenden Beispielen herniumformiat entfernt. Die aktiven Fraktionen wurden 55 gestelltes und abgetrenntes Antibioticum Α16 88ί vereinigt und mit einer Geschwindigkeit von I Ammoniumsalz wurden in 2 ml Wasser gelöst. Dei 60 ml/Minute über eine 9,5 x 100 cm Kolonne mit pH-Wert der Lösung betrug anfangs 5,30 und wurde Kohlefüllung (Pittsburgh 12 x 40) geleitet. Die Ko- mit 1 n-HCl auf pH 2,0 eingestellt. Dann wurde die lonne wurde mit Wasser gewaschen, und dann wurde Lösung unter vermindertem Druck fast bis zur Trockne die Aktivität mit 1:4 Aceton/Wasser mit einer Ge- &° eingeengt. Nach Zusatz von 0,5 ml Wasser und 1,5 m schwindigkeit von 60 ml pro Minute, wodurch Methanol wurde das gewünschte Hydrochloridsal; 15 Fraktionen mit je 21 ehalten wurden, und an- durch Zugabe von 10 Volumteilen Aceton abgeschie schließend mit 1:1 Aceton/Wasser, wodurch 18 Frak- den. Das ausgefällte Antibioticum A 16 886 I-Hydro tionen mit je 1 1 erhalten wurden, eluiert. Die aktiven chlorid wurde abfiltriert, mit Aceton gewaschen un( Fraktionen wurden vereinigt, zur Entfernung von 65 getrocknet. Die Analyse ergab 4,50% Chlor. Die elek Aceton im Vakuum eingeengt und lyophilisiert. trometrische Titration des Produkts in einer 66%igei

40 g vereinigte lyophilisierte Präparate, die wie oben Dimethylformamid-Wasser-Lösung mit einem An beschrieben erhalten wurden, wurden mit 41 Methanol fangs-pH-Wert von 5,0 ergab die Gegenwart von dre

titrierbaren Gruppen: pK'aj = 3,6, pK'a₂ = 5,2 und

pK'a₃ = 10,8.

Beispiel 21

Herstellung von Antibioticum A 16 886-

Dinatriumsalz

200 mg wie in den vorhergehenden Beispielen hergestelltes und abgetrenntes Antibioticum A 16 386 1-Monoammoniumsalz wurden in 2 ml Wasser gelöst. Der Anfangs-pH-Wert betrug 5,30. Die Lösung wurde mit 2,5 n-NaOH auf pH 10,50 eingestellt und dann unter vermindertem Druck bis fast zur Trockne eingeengt. Nach Zusatz von 1,5 ml Methanol wurde das Salz mit 10 Volumteilen Aceton ausgefällt. Das abgeschiedene Antibioticum A 16 886 I-Dinatriumsalz wurde abfiltriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet. Die Analyse ergab 6,79% Natrium.

IO

Beispiel 22

Herstellung von Antibioticum A 16 886
in Säureform

200 mg einer Mischung des Monoammoniumsalzes von Antibioticum A 16 886 1 und des Monoammoniumsalzes von Antibioticum A 16 886 II wurden in 40 ml Wasser gelöst und mit 6 ml »Dowex 50 W-X12« (H + ) Harz (Produkt der Firma Dow Chemical Co.) versetzt. Die Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt und dann durch einen mittleren Sinterglastrichter filtriert. Das Filtrat (ph 2,65) wurde lyophilisiert.

Die elektrometrische Titration in einer 66%igen Dimethylformamid-Wasser-Lösung mit einem Anfangs-pH-Wert von 4,30 ergab die Gegenwart von drei titrierbaren Gruppen: PtCa₁ = 4,2, pK'a- = 5,6 undpK'a₃ = 10,4.

Hierzu 1 öiatt zeichnungen

Kontrolle ..

A 16 886 —

A 16 886 —

1. Dipeptide der Formel

Patentansprüche:

bzw.

NH₂

OCH₃

CH-(CH₂)₃ —C-NH