Przedmiotem wynalazku jest ogrodniczy srodek bakteriobójczy, zawierajacy jako substancje aktywna nowy antybiotyk Al6886, stanowiacy mieszanine czynnika I i II antybiotyku A16886 ewentualnie w postaci soli.Podczas fermentacji szczep Streptomyces clavu- . ligerus wytwarza nowa substancje antybiotyczna oznaczona w niniejszym opisie jako antybiotyk A16886 skladajacy sie z mieszaniny antybiotyku A16886I i A16886II, zwanych odpowiednio czynni¬ kiem I i II antybiotyku Al6886. Sole wytworzone¬ go antybiotyku A16886 otrzymuje sie bez trudu w reakcji z odpowiednim kwasem lub zasada. Anty¬ biotyk A16886 i jego sole wykazuja aktywnosc przeciwbakteryjna i dzialanie przeciwrobacze. Dzia¬ lanie przeciwbakteryjne dotyczy przede wszystkim bakterii Gram-ujemnych oraz w pewnym stopniu takze Gram-dodatnich. Antybiotyk A16886 jest tak¬ ze skuteczny w zwalczaniu chorób roslin pochodze¬ nia bakteryjnego.Ogrodniczy srodek bakteriobójczy wedlug wyna¬ lazku zawiera srodki powierzchniowe czynne oraz jako substancje aktywna antybiotyk Al6886 ewen¬ tualnie w postaci soli.Antybiotyk Al6886 i jego sole wykazuja dziala¬ nie hamujace wzrost zarówno bakterii Gram-doda¬ tnich, jak i Gram-ujemnych. Stezenia przy któ¬ rych antybiotyk Al6886 w postaci czesciowo oczy¬ szczonej mieszaniny soli jednoamonowych czynnika I i II antybiotyku A16886 wykazuje dzialanie ha¬ lo 2 mujace wzrost róznych drobnoustrojów podano w tablicy 1. Stezenia hamujace oznaczono metoda plytkowa lub metoda rozcienczeniowa, co w tabli¬ cy 1 oznaczono odpowiednio symbolami „m.p" lub „m.r.'\ W metodzie plytkowej badany drobnoustrój na¬ noszono na serie plytek z agarem zawierajacym rózne stezania antybiotyku w postaci soli jedno¬ amonowych A16886I i A16886II i oznaczono mini¬ malne stezenie hamujace wzrost drobnoustroju w mikrogramach na milimetr w podlozu agarowym, w okresie 48 godzin lub w przypadku mikroorga¬ nizmów wywolujacych choroby roslin w czasie 72 godzin.W metodzie rozcienczeniowej serie probówek zawierajacych rózne stezenie soli jednoamonowych czynników I i II antybiotyku A16886 zakazono ba¬ danym drobnoustrojem i oznaczono najmniejsze stezenie hamujace (w mcg/ml) wzrost drobnoustro¬ ju w podlozu plynnym w ciagu okolo 20 godzin.Tablica 1 Badany drobnoustrój Escherichia celi C127 Proteus PR-6 Salmonella typhimu- rium S-4 Klebsiella sp. K-l Pseudomonoss sp. X239 Stezenie hamujace mcg/ml 0,39 m.r. 0,78 m.p. 0,78 m.p. 1,56 m.p. ponad 100 m.p. 84 058TWGISUJft J$ 84 058 Badany drobnoustrój Salmonella typhosa T-63 Staphylococeus aureus 3055 Streptococcus pyegenes C203 Bacillus subtilis X12.1 Staphylococeus aureus | 3150 Stezenie hamujace meg/mi 0,78 m.r. ,00 m.p. 6,25 m.p. ' 1,56 m.p. 50,00 m.p.W zadnym z powyzszych testów nie zaobserwo¬ wano wiazania sie antybiotyku z surowica konska.Jak wynika z tablicy 1 antybiotyk A16886 w posta¬ ci mieszaniny soli jednoamonowych czynnika I i II antybiotyku A16886 wykazuje dzialanie hamujace w stosunku do bakterii Gram-dodatnich i Gram-, -ujemnych.Dzialanie przeciwbakteryjne antybiotyku A16886 oznaczono takze metoda krazkowa dyfuzji w aga¬ rze wedlug Bauera Kirbye'go. Badaniu poddano oddzielnie sole jednoamonowe czynnika I i II anty¬ biotyku A16886. Tablica 2 przedstawia wyniki te¬ stu wyrazone w podanej w milimetrach wielkosci strefy zahamowania dla danego stezenia. cd. tablicy 1 Zwalczanie bakterii wywolujacych choroby roslin polega na podawaniu skutecznych ilosci antybio¬ tyku. Jest przy tym bez znaczenia czy stosuje sie osobno poszczególne czynniki, bowiem zarówno mie- szanina jak i kazdy z czynników I i II antybioty¬ ku A16886 uzyte osobno daja dobre wyniki. Anty¬ biotyk Al6886 lub jego sole mozna stosowac bez¬ posrednio w postaci substancji, na ogól jednak ko¬ rzystnym jest dla zwalczania bakteryjnych chorób roslin stosowanie kompozycji antybiotyku z jed¬ nym lub wiecej adjuwantami. Tak wiec antybio¬ tyk lub jego sole mozna podawac w roztworach z woda lub innymi nosnikami cieklymi, rozpuszczal¬ nikami organicznymi, cieklymi lub stalymi srodka- mi powierzchniowo czynnymi, obojetnymi dobrze sproszkowanymi lub granulowanymi nosnikami sta¬ lymi. Stezenie antybiotyku nie jest wielkoscia kry¬ tyczna i moze zmieniac sie w zaleznosci od prze¬ znaczenia. Na ogól do zwalczania typowych zaka- zen bakteryjnych u roslin przez podawanie anty¬ biotyku do lisci dobre wyniki otrzymuje sie przy stezeniu 10—1000 i wiecej promili. W przypadku uzycia postaci pylistej korzystne stezenie wynosi 0,1—1% wagowych.W celu przygotowania kompozycji plynnych an¬ tybiotyk A16886 lub jego sole mozna mieszac z Szczep Escherichia coli 0127 Escherichia coli EC 25 Proteus sp. PR6 Proteus sp. PR7 Salmonella typhosa SA 12 Salmonella typhosa SA 16 Klebsiella aerobacter KA 14 Klebsiella aerobacter KA 25 Pseudomonas sp. Ps 24 Pseudomonas sp. Ps 30 Staphylococeus aureus 3055 Staphylococeus aureus 3074 Tabli c a 1 Czynnik I antybiotyku Al6886 pig/krazek ,6 19,6 23,2- 14,0 27,2 24,2 23,0 22,1 23,0 0 0 0 ,7 ,1 19,0 ,4 22,8 19^6 18,0 ,8 18,2 0 0 0 18,6 12,5 16,7 0 19,9 16,2 ,4 12,3 ,7 0 0 0 2,5 ,9 9,1 13,6 0 1679 13,1 11,4 9,0 13,2 0 0 0 1,0 12,7 0 9,9 0 11,3 9,3 7,6 0 ,1 0 0 0 0,5 8,4 0 0 0 8,0 0 0 0 0 0 0 0 - Czynnik II antybiotyku A16886 1 \\g/krazek 10 19,7 11,9 22,2 7,1 23,8 19,3 ,1 ,6 ,2 0 12,4 ,1 ,9 7,7 16,7 0 18,7 13,4 13,7 ,1 ,4 0 0 0 12,9 0 13,6 0 ,6 11,0 ,8 7,4 12,3* 0 0 0 2,5 | 1,0 9,4 0 ,4 0 12,3 7,5 0 0 9,3* 0 0 0 0 0 0 0 7,5 0 0 0 0 0 0 0 0,5 0 o 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 * lacznie z koloniami satelitarnymi Antybiotyk A16886 ewentualnie w postaci soli wykazuje dzialanie przeciw bakteriom wywoluja¬ cym choroby roslin i moze byc stosowany do lecze¬ nia takich chorób, jak powodowane przez bakterie wiedniecie i opadanie lisci, sniec oraz bakteryjna choroba plamista lisci.Sposób stosowania antybiotyku w ochronie roslin moze byc rozmaity. Zazwyczaj pierwsze zetkniecie drobnoustroju z roslina odbywa sie za posredni¬ ctwem lisci, stad korzystnym jest czesto podawanie antybiotyku ta wlasnie droga. Antybiotyk Al6886 i jego sole sa jednak wchlaniane przez rosliny i dlatego mozna go podawac do galezi, kwiatów, nasion, korzeni i innych czesci uzyskujac efekt bakteriobójczy w calej roslinie. odpowiednimi nosnikami cieklymi i emulgatorami, otrzymujac w ten sposób dajace sie emulgowac koncentraty, które przed uzyciem rozciencza sie woda lub innymi rozpuszczalnikami, uzyskujac mieszaniny do spryskiwania. Do korzystnych srod¬ ków emulgujacych naleza emulgatory niejonowe, takie jak produkty kondensacji tlenków alkileno- wych z kwasami nieorganicznymi, pochodne polio- ksyetylenowe estrów sorbitolu, kompleksy eterów z alkoholami i podobne. Do rozpuszzcalników or¬ ganicznych stosowanych do przygotowania kompo¬ zycji naleza miedzy innymi oleje mineralne lub ich poszczególne skladniki, toluen lub syntetyczne ole¬ je organiczne. Substancje powierzchniowe czynne sa uzywane zazwyczaj w ilosci 0,1—20% wagowych84 058 6 w stosunku do ciezaru calej mieszaniny. Do mie¬ szanin pylistych mozna wykorzystywac kazda do¬ brze sproszkowana lub granulowana substancje sto¬ sowana do innych srodków chemicznych uzywa¬ nych w rolnictwie.Srodek wedlug wynalazku rozpyla sie w dowol¬ ny sposób, np. przy pomocy rozpylaczy recznych lub wysokocisnieniowych. Srodki stosowane do spryskiwania lisci nie moga zawierac nawet nie¬ znacznych ilosci rozpuszczalników fitotoksycznych.Do spryskiwania duzych obszarów mozna stosowac samoloty.Przyklady I—V ilustruja wynalazek, przy czym w kazdym z przykladów antybiotyk A16886 uzywa¬ ny byl w postaci mieszaniny soli jednoamonowych czynników I i II antybiotyku Al6886.Przyklad I. Dzialanie in vitro na szcz-epy Erwinia amylovora I Pseudomonas solanacearum.Badano dzialanie hamujace in vitro wzrost szcze¬ pów Erwina amylovora i Pseudomonas solanacea¬ rum. Kazdym z drobnoustrojów zakazano osobno standardowa pozywke agarowa, która rozlewano na szereg plytek i pozostawiono do zastygniecia. Ba¬ dania prowadzono róznymi metodami. W pierwszej do dwóch cylinderków stalowych umieszczonych na powierzchni agaru dodawano po 0,1 ml badanego roztworu, w drugiej zas dwa krazki bibulowe na¬ sycone 0,1 ml badanego roztworu nakladano na po¬ wierzchnie agaru. Badany roztwór antybiotyku przygotowywano rozpuszczajac odpowiednia jego ilosc w wodzie destylowanej w aparaturze szkla¬ nej. Wielkosci stref zahamowania podano w tabli¬ cy 3.Tablica 3 Srednica stref zahamowania w mm Stezenie A16886 — 10 czesci na milion A16886 — 50 czesci na milion A16886 — 100 czesci na milion Kontrola (woda | destylowana) Cylinderki stalowe A cd O 6^.6 12—(14 —16 6—16 P. sola¬ nace¬ arum 16^17 —25 —£0 6—6 Krazki bibulowe B a o 13—13 16—17 —20 13—13 CO s ® s 81 y a . ca 7- Oh P? CS —£1 ^30 34—35 13—13 A — lacznie ze srednica cylinderka (6 mm), sre¬ dnica strefy wynoszaca 6 mm wskazuje wiec na brak dzialania hamujacego.B — lacznie ze srednica krazka (13 mm), sredni¬ ca strefy wynoszaca 13 mm wskazuje wiec na brak dzialania hamujacego.Przyklad II. Dzialanie in vivo na Pseudomo¬ nas solanacearum przy spryskiwaniu lisci. Badano dzialanie antybiotyku A16886 in vivo na Pseudo¬ monas solanacearum na plantacji pomidorów. Do badania przygotowano roztwory wodne zawieraja¬ ce 1% etanolu, 0,1% srodka powierzchniowo czyn¬ nego (pochodna polioksyetylenowa czesciowo ze- stryfikowanego kwasem tluszczowym sorbitolu) oraz rózne stezenie antybiotyku po dwie sztuki w donicach. Sadzonki w kazdej donicy opryskiwano jednym z powyzszych roztworów, pozostawiono do wyschniecia na powietrzu i zakazano aktywna ho¬ dowla Pseudomonas solanacearum. Wszystkie ro¬ sliny przetrzymywano w ciagu 24 godzin w komo¬ rze wilgotnej, a nastepnie 7 dni w normalnych wa¬ runkach. Po zakonczeniu tego okresu wszystkie ro¬ sliny przegladano dla oceny stopnia zakazenia. Wy¬ niki przedstawiono w tablicy 4 poslugujac sie ska¬ la ocen od 0 do 4, gdzie 0 oznacza calkowity brak dzialania, a 4 calkowite wyleczenie.Tablica 4 Kontrola (1% etano¬ lu+0,1% srodka po¬ wierzchniowo czyn¬ nego) A16886 — 400 czesci na min A16886 — 200 czesci na 1 min Pseudomonas solanace¬ arum wyniki leczenia 0 0 2+ 3+ 2+ 2+ Jak widac z tablicy 4 w grupie roslin kontrol¬ nych obserwuje sie silne zakazenie Pseudomonas solanacearum.Przyklad III. Dzialanie na Pseudomonas gli- cynia przy podawaniu poprzez korzenie. W przy¬ kladzie tym opisano wyniki badan dzialania anty¬ biotyku A16886 na Pseudomonas glycinia podczas zanurzania korzeni roslin do roztworu zawierajace¬ go antybiotyk. Przygotowano w tym celu dwa roz¬ twory o stezeniu antybiotyku Al6886 wynoszacym odpowiednio 200 i 400 czesci na milion. Zakazano dziesieciodniowe sadzonki soi szczepem Pseudomo¬ nas glycinia, a nastepnie w czasie przeprowadzania doswiadczenia korzenie wszystkich roslin moczo¬ no w wodnych roztworach antybiotyku. Poczatko¬ wo zakazane rosliny moczono w 50 ml roztworu, w tym jedna grupe w roztworze o stezeniu 200 czesci na milion, druga w roztworze o stezeniu 400 czesci na milion oraz trzecia grupe kontrolna w wodzie. Korzenie moczono w ciagu 24 godzin na¬ powietrzajac w tym czasie roztwór. Nastepnie wszystkie rosliny z korzeniami zanurzonymi w roz¬ tworze inkubowano w ciagu 24 godzin. Po wyjeciu z komory inkubacyjnej rosliny przetrzymywano je¬ szcze przez tydzien. Poczawszy od rozpoczecia in¬ kubacji do konca doswiadczenia podawano roslinom roztwór zawierajacy skladniki odzywcze niezbedne dla utrzymania ich przy zyciu. Po zakonczeniu do¬ swiadczenia rosliny obserwowano w celu okreslenia stopnia rozwoju Pseudomonas glycinia. Wyniki przedstawiono w tablicy 5 poslugujac sie skala ocen identyczna jak w przykladzie II.Tablica 5 Kontrola A16886 — 200 czesci na milion A16886 — 400 czesci na milion Pseudomonas glycinia wyniki leczenia 0 3+ 2+ 40 45 50 55 6084 058 ? 8 Przyklad IV. Dzialanie na Xanthomonas phassoli var. sojensis przy spryskiwaniu lisci. Pod¬ czas pierwszego doswiadczenia dziesieciodniowe sa¬ dzonki soi zakazano moczac dolne powierzchnie lisci w zawiesinie zawierajacej Xanthomonas pha- seoli var. sojensis. Dwie godziny pózniej liscie je¬ dnej grupy roslin spryskiwano roztworem zawiera¬ jacym antybiotyk A16886 w stezeniu 100 czesci na milion oraz liscie drugiej grupy roslin roztworem zawierajacym 500 czesci na milion. Roztwór anty¬ biotyku Al6886 przygotowywano w wodzie z 393 czesciami na milion mieszaniny niejonowych cie¬ klych emulgatorów sulfonowych.W drugim doswiadczeniu liscie dziesieciodnio¬ wych sadzonek soi spryskiwano najpierw roztwo¬ rem zawierajacym 100 lub 500 czesci na milion an¬ tybiotyku A16886 przygotowanego jak w doswiad¬ czeniu pierwszym, a dwie godziny pózniej zakaza¬ no równiez w identyczny sposób.Roslinom zapewniono dobre warunki rozwoju w ciagu okolo 11 dni i badano na obecnosc lub brak Xanthomonas phaesoli var. sojensis. Wyniki poda¬ no w tablicy 6, poslugujac sie skala ocen taka sa¬ ma, jak w poprzednich doswiadczeniach.Tablica 6 Kontrola (woda) Kontrola (woda z do¬ datkiem mieszaniny emulgatorów) A16886 — 100 czesci na milion A16886 — 500 czesci na | milion Wyniki leczenia w po¬ szczególnych grupach roslin Xanthomonas phaesoli var. sojensis zakazanie, pózniej spryski¬ wanie 0 0 2 3+ spryski¬ wanie pózniej zakazanie .0 0 4 4 Przyklad V. Dzialanie na Pseudomonas pha- esolica przy spryskiwaniu lisci. Wszystkie powierz¬ chnie dwudziestodniowych sadzonek fasoli czerwo¬ nej spryskiwano wodnym roztworem zawierajacym 400 czesci na milion antybiotyku A16886 oraz 0,1% srodka powierzchniowo czynnego (pochodna polio- ksyetyolonowa czesciowo zestryfikowanego kwasem tluszczowym sorbitolu). Po wyschnieciu rosliny za_ " kazano Pseudomonas phaesolica moczac dolna po¬ wierzchnie jednego listka z kazdego pierwszego i drugiego okólka lisciowego wodna zawiesina ba¬ kterii wykazujaca 30% transmisji mierzonej na spektrofotometrze Spectronic 20 produkcji firmy Bausch i Lomb. Nastepnie rosliny przetrzymywano w ciagu 24 godzin w komorze wilgotnej, a naste¬ pnie w ciagu 14 dni zapewniono im dobre warunki rozwoju. Pod koniec tego okresu badano wszystkie rosliny stwierdzajac w opryskiwanej grupie umiar¬ kowane zakazenie Pseudomonas phaesolica, podczas gdy w grupie kontrolnej zakazenie to bylo inten¬ sywne.Przyklad VI. Dzialanie na Pseudomonas so- lanacearum przez spryskiwanie lisci lub lodyg.Przygotowano wodny roztwór zawierajacy 353 czesci na milion mieszaniny dwóch niejonowych cieklych emulgatorów sulfonowych oraz 100 lub 400 czesci na milion antybiotyku A16886. Badania prowadzo¬ no na dwóch grupach osiemnastodniowych sadzo¬ nek pomidorów. Jednej grupie podawano roztwór tylko do lisci, drugiej tylko do lodyg. W dwie go¬ dziny pózniej obie grupy zakazano wprowadzajac wykalaczke namoczona w hodowli Pseudomonas solanacearum do lodygi przy liscieniu. Roslinom zapewniono dobre warunki rozwojowe w ciagu 10 dni i obserwowano wyniki leczenia, które przed¬ stawiono w tablicy 7, poslugujac sie skala ocen taka sama jak w poprzednich doswiadczeniach.Tablica 7 Kontrola (woda z do¬ datkiem emulgatora') A16886 — 100 czesci na milion Al6886 — 400 czesci na milion Pseudomonas solanace¬ arum wyniki leczenia podawanie liylko do lisci 0 1 3 4 4 4 podawanie tylko do lodyg 0 1 4 4 4 4 PL