DE2040141B2 - Dipeptide und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Dipeptide und verfahren zu ihrer herstellung

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DE2040141B2
DE2040141B2 DE19702040141 DE2040141A DE2040141B2 DE 2040141 B2 DE2040141 B2 DE 2040141B2 DE 19702040141 DE19702040141 DE 19702040141 DE 2040141 A DE2040141 A DE 2040141A DE 2040141 B2 DE2040141 B2 DE 2040141B2
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salts
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
    • C12P35/06—Cephalosporin C; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
    • C12P35/08—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin disubstituted in the 7 position

Description

CW, O C NH,
-.. Λ 16XX6
bzw.
NIl2 O
CiI (('H2I, C COOIl
Nil· O COOM
CH, O ■ ■ C - NH,
r-. A 16SK6 Il
coon
j ι iu ι w ι eil Sal/c.
2. Verfahren zur Herstellung von wie in Anspruch 1 ucüniertem Λ KiSXdI und oder Λ 16X86 11. dadurch gekennzeichnet, dall man Strep torn sees cluvuIigM'us NRRl. 35X5 in einem Kulturmedium, das assimü' :rbare Quellen für Kohlenstoff. Stickstoff und anorganische Salze enthalt, unter submers aeroben Bedingungen züchtet, bis von dem Mikroorganismus in dem Kulturmedium eine beträchtliche Menge Λ 16X86 1 und oder A 16 SSMI produziert worden ist.
3. Hortikuluirmiuel. dadurch gekennzeichnet, daß es (1 ί wie im Anspruch 1 definiertes Antibioticum A 16 XSf-I oder ein Salz davon und oder Antibioticum A 168X6 11 oder ein SaI/ davon und 12) ein oberflächenaktives Mittel einhält.
Die Erfindung betrifft die neuen Dipeptide
NH: O VC;IIj
■' ■
CH - (CH,)., C NII ! ■ S : O
I . I1
COOH 0 J N J ClI, C)-C NIl
Und
NH,
COOH
CH (CH,I, C -NH
COOH
N 'CU, O CNH,
CCjOII die nachstehend als A Hi XX.:. | und Λ 16 SS6 11 bezeichnet werden und ihre Salze, die antibakteriell^ und anihelmintisclie Aktivität aufweisen, und ihn.· Herstellung durch Fermentation von Streptom\ccN
,o clavuligerus NRRl. 35X5.
Bei Fermentation von Streptomyces clavuhgerur, entstehen neue antihiotische Subslunzcn. die hierin als A !6SXM und I! bezeichnet werden. Die Salze von A 16 XS6 1 und 11 sind leicht dur-Λ 1J inset zu ng
;ö von A16XX6I und Il mil einer geeigneten Säure oder Base erhältlich A H)SXt, ! und Il und ihre Salze weisen antibakteriell und anlhelmintische Aktivität auf. Die antibakteiielle Aktivität besteht haupisächlich gegen grair.ninegative Mikroorganismen; eine ge-
.40 wisse Aktivität wird aber auch gegen gramposilive Mikroorganismen beobachtet. A 16 8X6 I und Il sind ferner zur Bekämpfung \on Krankheiten, die durch pflanzenpathogene Bakterien verursacht werden, wirksam.
Das Monoammoniumsalz des A 16XX6I ist folgendermaßen gekennzeichnet: schwach gefärbte weiße flockige amorphe Festsubstanz. erweicht zwischen 190 und ?()() C mi' einem Farbwechsel zu dunkelbraun: sehr loslich in Wasser, schwach löslich in niederen Alkanolen und unlöslich in Acetonitril: amphoter, vier tilrierbare Gruppen lnil pK'a, -- 4.1. pKa, = 5.2. pK'a, = 9.3 und pK'a^ - 10.5: aus Tiiraiionswerten ermitteltes scheinbares Molckulargewicht von etwa 530: ungefähre Zusammensetzung:
5s 40.26"·,, Kohlenstoff. 5.9Γ",, Wasserstoff. l.V)S% Stickstoff. 3.1.37",, Satiersloff und 7.21% Schwefel; spezifischer optischer Drehwert [<i|. t 153.6 (<■ ~ 1 "■«. (iew. Vol.. in Wasser): im lnfrarotabsornlionsspeklrum einer Mineralölsuspensioii davon fol·
(>o gende unteischeidbare Banden bei folgenden Wellenlängen, angegeben in Mikron: 3 10, 5.6X. 6.30. d.(SO. 7.20. 7.60. "x.X3. 9.35. 9.60. 9.S5. 11.60 und 12.90.
Das Ammoniumsa'iz des A 16X86 II ist folgendermaßen gekennzeichnet: schwach gefärbte weiße flokkige amorphe l'estsuhstanz. erweicht zwischen 190 und 300 C unter Farbwcchsel nach dunkelbraun, sehr löslich in Wasser, schwach löslich in niederen Alkanoien und unlöslich in Acetonitril: amphoter.
Wer iitrierhare Gruppen mil pK'a, --■ -4.1). pK a = 5.?. pK'a, - i).2 und pK a4 10.5. ails liirationswerien ermitteltes scheinbares Molekulargew iehl Von eiwa 52X: ungefähre Zusammensetzung: 41.01"., Kohlenstoff. 5.6-1".,, Wasserstoff. 15.75",, Stickstof!. 21>.2N% Sauerstoif und 7.04'Ί, Schwefel: spezifischer optischer Drehwen:\„ | · X6.2 (c ~ 1"». (.lew.. \'ol. Ui Wasseri: im lnlrarotahsorptionsspcktrum einer Mineralölsuspension davon folgende unterscheidbare Banden hei folgenden Wellenlängen, angegeben in MiV.mn: \!5. 5.71). d.30. 7.22. 7.64. 9.05. li.40. 1J.(,5 lind ! 1.60.
(icgensiand der P.rl'mdung ist weitet' em Verfahren im lleraelhmg von Λ id XSd 1 und oder Λ ld XSd II. ila-i dadurch gekennzeichnet ist. daß man Sireptoimccs clavuligerus NRiIL 35N? in eine'.» Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff. Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter siihmers aeroben Bedingungen züchtet, bis eine beträchtliche Menge A 16XKf. I und od-:r AKiXXf)Il von den» Mikroorganismus in dem Kulturmedium produziert worden ist.
( k'L'.ens'aiul der LiTuiduug is! außerdem ein Mittel, das durch einen Gehalt an (1) an A H-. XXCi I oder einem Salz davon und oder A HiXXd Il oder einem Salz davon und einen (iehalt an |2) eines oberflächenaktiven Mittels gekennzeichnet ist.
Wie bei welen Antilnotica produzierenden Kulturen führ! die Fermentation von Slreptomvces cla- \uhgerus NRKl. 35X5 zur Bildung einei Reihe von antibiotischen Substanzen, die ».Faktoren« genannt v. ei '!en. Antibioticum A UiSSCi. wie es /in /eil aus dem 1 ermenter erhallen wird, besteht aus zwei anlibioiischen llauptsuhsianzen. die hierin als A IdNXCi 1 und A UiSSd 11 oder als Faktor I und Il bezeichnet werden. Außerdem wurden kleinere Mengen anderer antibiotischer Substanzen bei einigen Fermentationen beobach'.et; diese wurden bisher jedoch nicht identifiziert, da sie nur in sein" kleinen Mengen vorhanden sind. Daher wird der Begriff »Antibioticum A ld ΧΧ6<· ohne Zusatz zur Bezeichnung des Aiitihioticums verwendet, wie es aus dem Fermenler erhalten wird, und das gewöhnlich 1 bis Wo Faktor I und v>9 bis ΓΊ) Faktor Il neben anderen Faktoren in geringen Mengen ent!.alt. wobei die Gesamtmenge KH)" u betragt.
Antibioticum A IdXXd kann als solches oder als Salz. z. B. als Säureadditioiissalz oder als Salz mn einem Kation, verwendet werden. Bei SaL.:n ir.it einem Kation kann das Salz entweder cn Mono- oder ein Disalz sein, I läufig wird es bevorzugt. Salze direkt im Reinigungsverfahren herzustellen. ·>·.> daß this Antibioiicum, so wie es abyelienni wird, in SaIz-Γοπίι vorliegt. Antibioticum A IdXXd wurde m diesel Weise :t!s Monn;immt>iiiiiinsilz. abgeirennt und v.ird aus diesem Grund im folgenden als Monoamineniunisalz gekennzeichnet.
Mit dei Mischung ;iu·· Faktor I und Il v.urden verschiedene Prüfungen dtirehgelühri. Bcispiclsuei-.c wurde eine Reihe von quaüiair.en chemischen Tests rill einer " lischung des Mouoammoniumsatzes von l'akloi ! und des Mouoammoniumsalzes \on Faktor Il \ oruenommen : P.isitive Tcstreakti< >ncn heleilen Ni;il:\i'iin-. Pan-I )utscher-. Benciliki-, MoIUcIi-. i'ehhng-. nansylchinrid-. Jod- und 1 errichloi id-Reagen.-.: negative Te-slreakiioiiiMi dauegi.'ii wurden mit Hiinx-i- und Sakaguchi-Reageiv beobachtet. \\Wiu Mischuiu1. der Monoammonuimsalze von Anlibi·!- licum A IdXSd Faktor I und Il ist bei pH 3 bis S bei Ci C S lage lang stabil und bei pll ? bis S bei 25 C 2 I agc verhältnismäßig stabil. Die biologische Akii\ität geh.t bei pH 3 bis X bei einer '! eniperaiur von 25 C langsam verloren, wobei die 'lallte nach 4 lagen verschwunden ist.
Außerdem wurden die Monoammoniumsalze \. π Faktor ! und 11, wie oben angegeben, getrennt gekennzeichnet. Die oben angegebenen Werte für den spezifischen optischen Drehwert der Mor.oammoniumsalze um AICiSSC)I und A IdXXd 11 beziehen sich auf die bei Raumtemperatur im Vakuum über wasserfreiem Calciumchlorid etwa 15 Stunden lane getrockneten Salze. Die eleklrometrische Titration wurde mil dem Monoammoniuni>alz. von A IdXXd I in einer MV«igen Dimethylformamid-Wasser- Lösung niii einem Anfangs-pH-Wert von CoO durchgeführt.
Die F.lenieniaranaL. en winden mit den im Vakuum bei etwa XC' C über Pho .phorpentoxid getrockneten Monoammoniumsal/en von Λ ICiSSd 1 und Λ ICiXSC' Il durchgeführt Die Analyse des Monoammoniumsalze.. von AlCiSSC)I ergibt einen Melho.\\lgi-h.alt von 5.02%. Das Vorliegen der Methov,!gruppe wurde durch ein Smgulett bei 5.ς3 ppm im NMR-Spektrum bestätigt. F.in Van Siyke- fest auf Aminosiicksiofl des Monoammoiiiumsilzes von A IdXXd 1 ergab 5.3";,.
Das NMP-Spektrum um A IdXSd I in D O zeigte folgende Merkmale: 5,!1J ppm Il 11. Smgulelt): 454. 4.74 ppm (2il. AB Quarten. J - 13 11z.;: 4.0 bis 4.2 ppm il II.. Multiplen): 3.6X. 3.32 ppm (2 H. AB Quarten. -; IS Hz). 3,53 ppm (3 11. Smgulett): 2.d bis 2.4 ppm (2 H. Multiplen): 2.1 Fis 1.6 ppm (4 Ii. Multiplem.
Das infrarolabsorplionsspukt. .im des Miinoaniim ■-niur/isal/Cs um AICiXSdI als MineraiolsUspcnsion. ist in Fi g. 1 der Zeichnungen dargestellt.
Das L'lln'.vuiletUibMyrpii.onsspeklrum de^ Monoammoniuinsalzes von A Id SX6 1 in wäßriger Lösung zeigte Absorpiionsma.xima bei 242 my. (L: "n P2) und 264 iivj. {\i\"... - \(5): der Cirkulardichroismus wurde ebenfalls in wäßnuer Lösung gemessen und ergab einen positiven Cottoneffeki hei 2d3 n\-i und einen negativen Cotioneffekt bei 23d ma.
Die PapieiChromatographie des Ammomiimsalzes von A IdSXd 1 auf \Vhatm;m-Papier Nr. 1 ergab einen Rr Wert von 0,41 in einem lösungstnittelsystem a'.is Propanol. Acetonitril und Wa^se· m einem Volumenverhältnis von 1:1:1. Bioauiogr.imme wurden durch A''degen des Papicrchromatognüiims auf Auarplatten erhalten, die nit Salmonella galhnarum als I'estorg.i.iismus beimpf! waren.
Bei Düniischichtchromatographie des Muiinammcniumsalzes von A IC)XXd 1 auf Kieseige'piaiten in 70".,igein wäßrigem Acetonitril wurde mit einer Ninhydrinspiiilr.ing als MaclnV-is cm Κ,-Wcn von etwa 0.51 und au Geliulosephr.ieii in Acctonifil. Isopropano! und Wasser (1:1: Il mil del gleichen > achweismethodc ein R1-WeH von 0.3d gelundcn.
hüie n;icii der Spackman- Nloore- Stein -Technik durchgefühlte Aminosäur-..;;ial\se eiiie^· Säureludrohsats von Antibioticum A idXXdl ergab zwei nin- !lydrinreal-.live Banden, vor. denen die cmc mit (ihcm identisch eluierl wurde (<bil ;Λ1ο1 mg ι. während die andere unmittelbar \or (ilvcin eluicl und .ils alpha-Aniinoadipin-.äure identifiziert v\urde (\.iP ;i.Mo! mgi
Die elektrometrische Titration des Monoamnm niums.ilz.es \on A IdXSdII in einer dd",,igen Di
methylformamid-Wasser-Lösung mit einem AnfangspH-Wcrt von 7,7 ergab die Anwesenheit von vier titrierbaren Gruppen: pK'a, = 4.4. pK'a-, = 5.7. pK'a, = 9.6. pK'a^ = 10.4.
Bei einer Titration mit einer späteren Probe, die in ähnlicher Weise, jedoch mit einem AnfanuspH-Wert von 6,8 durchgeführt wurde, betrugen die entsprechenden Werte pK'a, = 4,0. pK'a-, =? 5.3. pK'a., = 9,2 und pK'a4 = 10.5.
Die Analyse des Monoammoniumsalzes von A 16 886 II ergab keinen Methoxylgehalt. und im Unterschied zu Faktor I war im NMR-Spektrum des Monoammoniumsalzes von A 16 886 II kein Signal zu sehen, daß der Methoxylgruppe zuzuschreiben war. Ein mit dem Monoammoniumsalzvon A 16886 Il durchgeführter Van Slyke-Test auf Aminostickstoff ergab 5,1%.
Das NMR-Spektrum von A 16886 11 in D2O zeigte foluende Merkmale: 5,67 ppm (1 H. Dublett. J = 5 HzI; 5,15 ppm (1 H, Dublett. J = 5 Hz): 4.90. 4.68 ppm (2 H. AB Quartett. J = 13 Hz): 3.9 bis 3.7 (IH. Multiplen); 3,69, 3,39 (2 H, AB Quartett. J = 18 Hz): 2,6 bis 2,3 (2 H. MultiplcU): 2.1 bis 1.5 (4 H, Multiplen).
Das Infrarotabsorptionsspektrum einer Mineralölsuspension des Monoammoniumsalzes von A 16 886 11 ist in F i g. 2 der Zeichnungen dargestellt.
Das Ultravioletl-Absorplionsspektrum des Monoammoniumsalzes von A 16 886 II in wäßriger Lösung zeigte ein Absorptionsmaximum bei 260 ni:i (Ej^n, = 148): der Circulardichroismus wurde ebenfalls in wäßriger Lösung gemessen und ergab einen positiven Ccttoneffckt bei 258 mix und einen negativen Cottoneffekt bei 228 ma.
Die Papierchromatographie des Monoammoniumsalzes von A 16886 11 auf Whatman-Papier Nr. 1 liefert einen Rf-Wcrt von 0.33 in einem Lösungsmittelsystem aus Propanol, Acetonitril und Wasser in einem Volumenverhältnis von 1:1:1. Bioautogramme wurden durch Auflegen des Papicrchromatogramms auf Agarplatten erhalten, die mit Salmonella gallinarum als Testorganismus angeimpft waren.
Durch Dünnschichtchromatographie des Monoammoniumsalzes von Λ 16 886 II auf Kieselgclplatten in 70%igem wäßrigem Acetonitril wurde mit einer Ninhydrinsprühung oder einer bioautographischen Methode als Nachweis ein Rf von etwa 0.42 und auf Celluloseplattcn in Acetonitril. Isopropanol und Wasser (1:1:1) mit der gleichen Nachweismethode ein Rf-Wert von 0,29 gefunden.
Eine nach der Spackman-Moorc-S'cin-Technik durchgeführte Aminosäureanalysc eines sauren Hydrolysats von A 16 886 II lieferte hauptsächlich nur eine ninhjdrinreaktivc Bande, die unmittelbar vor Glycin eluiert und wie im Fall von A 16 886 1 als alpha-Aininoadipinsäure identifiziert wurde (2.1 tjlMoI mg).
Es war jedoch außerdem noch eine sehr schwache Bande vorhanden, die identisch mit Glycin eluiert wurde. Eine spätere Probe wurde in der gleichen Weise analysiert und ergab Werte von 2.1 bzw. 0 13 Tj Mol mc. Zusätzlich wurde jeder der Faktoren ! und II des Monoammoniumsalzes von Antibioticum R1 -Won Faktor I ! I aUor Il
A 16
chroma
sungsmitteL
sucht:
Papier-Chromatographie
Äthanol: Wasser (80:20) mit 1,5% Natriumchlorid. Papier mit I n-Natrium-
sulfat imprägniert
mit Wasser gesättigtes
Butanol
mit Wasser gesättigtes Butanol plus 2% p-Toluol-
sulfonsäure
mit Wasser gesättigtes
Mcthylisobutylketon
mit Wasser gesättigtes Methylisobutylkcton plus 2% p-Toluolsulfonsäure .. mit Wasser gesättigtes Methvlisobutylketon plus
2% Piperidin
Acetonitril
Propanol: Acetonitril : Methanol: Wasser 3:2:1
S 886 papierchromatographisch und dünnschicht-■nnatotiraphiseh in verschiedenen anderen Lo-
1)
Propanol: Pyridin: Essigsäure: Wasser (15:10:3:12) Propanol: Pyridin: Essigsäure : Acetonitril: Wasser
(45:30:9:40:36)
Butanol: Essigsäure
:Wasser (3: 1:1)
Äthylacetat: Essigsäure
: Wasser (3: 1 :1)Γ
Propanol: Wasser (70:30) Acetonitril: Wasser
(70:30)
Wasser: Äthanol: Essigsäure (70:42:6)
Dünnschicht-Chromatographie
Acetonitril: Wasser (7:3) auf Celluloseplatten
0,38 0.33
immobil immobi
0,39 0.32
immobil immobi
immobil
0,35
immobil
m mobil immobi
mmobil immobi
mmobil immobi
0.32 0.27
0,21 0.15
0.20 0.17
0.29 0.22
0.17 0.17
0.72 0.65
0.82 0.82
0.29
slemen mit folgenden Ergebnissen unter-Anlibioticiim A 16 886 und seine Salze wc hemmende Wirkung auf das Wachstum von gr positiven und gramnegativen Bakterien auf. Mengen, in denen Antibioticum A 16 886 als liell gereinigte Mischung der Monoammoniunv der Faktoren 1 und Il hemmende Wirkung auf Wachstum beispielhafter Organismen aufweist. Tabelle I. Die Hemmkonzentrationen wurden dem Agar-Verdünnungstest oder nach dem Br Verdünnungstest (in der Tabelle durch die B stäben »a. d.« bzw. »b. d.« bezeichnet) ermittelt.
Bei dem Agar-Verdünnungstest wurde der Organismus auf eine Reihe von Agarplatten. die schiedenc Konzentrationen der Monoammon salze von Faktor I und II von Antibioticum A enthielten, aufgestrirhen. um die minimalen K01 tralionen in meg ml (Miktogramm pro Mill in dem Agarsubstrat zu ermitteln, die das Wach
040
des Mikroorganismus 48 Stunden lang (bei den plum· Xcnpalhogcncu Mikroorganismen 72 Stunden langl hemmten.
Rei dem Brühe-Verdünnungstest wurde eine Reihe Von : .eagensgläsern. die verschiedene Knn/eniralioncn der Monoammoniiiinsalzc von Faktor 1 und «lcs Antibioticum* A 16XSd enthielten, mit dei. Fesiorganismcn inokuliert, um die minimale Konzentration in meg ml in dem Briihcsuhsirat zu ermitteln. die das Wachstum des Mikroorganismus etwa 20 Stunden lang hemmt. ... . ,. . & 1 abelle I
Escherichia coli 0127
Proteus PR-6
Salmonella typhimurium S-4 ....
Klebsiella sp. K-I
Pseudomonas sp. X 239
Salmonella typhosa T-63
liici; ml
0.39 b.d. 0.7S a.d. 0.78 a.d. 1.50 a.d. 100 a.d. 0.7S b.d.
losiot u.u
Sir.ι pin lot'occus aiireus 3055 .
Streptococcus psogcnes C 203 .
Bacillus subtilis X 1 2.Ϊ
Staphylococcus aureus 315»· .
llemmkiMi/cnlratinn nug ml
25.00 a.d.
6.25 a.d.
1.56 a.d. 50.00 a.d.
Bei keinem der vorstehenden Tests wurde eine Bindung durch Pferdeserum festgestellt. Wie aus der Tabelle hervorgellt, weist Antibioticum Λ 16 886 als Mischung der Monoammoniumsalz.e von Faktor 1 und I! Aktivität gegen grampositive und gramncgativc Bakterien auf.
Antibioticum A 16 886 wurde ferner in einem Test mit Hilfe eier Bauer-kiihv-Scheibendiffusionsme'.hode auf antibakteriell Aktivität geprüft. Die Prüfung erfolgte getrennt mit den Monoammoniumsalz.cn von Faktor 1 und 1! Die Ergebnisse, angegeben in Millimeter !Durchmesser der Hemmzone bei der angegebenen Antibioticumkon/entration. zeigt die folgende Tabelle 11.
Tabelle
>Γ I
Tcsiorpanisnni*
Escherichia coli 01 27
Eschcrichia coli EC 25
Proteus sp. PR 6
Proleus sp. PR 7
Salmonella lyphosa SA 12
Salmonella typhosa SA 16
Klebsiella aerobacter KA 14 ...
Klebsiella aerohaelcr KA 25
Pscudomonas sp. Ps 24
Pseudinimas sp. Ps 30
Staphylococcus aurcus 3055 ... Staphylococcus aureus 3074 . . .
tsehcrichia coli 0127
tschcrichia coli EC 25
Proteus sp. PR 6
Proteus sp. PR 7
Salmonella typhosa SA 12
Salmonella typhosa SA 16
Klebsiella aerobacter KA 14 ... Klebsiella aerobacter KA 25 . .. .
Pseudomonas sp. Ps 24
Pseudomonas sp. Ps 30
Staphylococcus aureus 3055
Staphylococcus aureus 3074
M)
25.d 19.6 23.2 14.0 27.2 24.2 23,0 22,1 23.0
I)
19.7 11.9 1I 2
7.1 23.8 19.3 20.1 15.6 20.2
12.4 10.1
II» 5 Ί 15 1 1.0 11.5
20.7 18.6 j 15.9 \ 12.7 8.4
15.1 12.5 ! 9.1 ! 0 0
19.0 16.7 : 13.6 ! 9.9 0
10.4 0 ι 0 0 0
22.S 19.9 i 16.9 j 11.3 8.0
19.6 16.2 i 13.1 ! 9.3 0
18.8 15.4 ι 11.4 j 7.6 0
15.8 12.3 i 9.0 ! 0 0
18.2 15.7 j 13.2 ; 10.1 0
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15.9 1 2,9 9.4 · 0 0
"I ~T 0 i ο I 0 ο
16.7 13.6 ί 10.4 ; 0 0
0 ο ί 0 ί 0 0
18.7 15.6 ι 12.3 : 7.5 0
13,4 11.0 7.5 i 0 0
13.7 10.8 ! ο ; 0 0
10.1 7.4 j 0 ί 0 0
15.4 12.3*1 \ 9.3*1 j 0 0
0 0 j 0 j 0 0
ί) o I 0 '
I 		0 0
0 0 ; 0 ί 0 η
*) Satclülcnlkolorncn in der Hcmm/'inc
Antibioticum Λ 16 8X6 und seine Salze weisen ferner Aktivität in vivo gegen eine Reihe der obengenannten Mikroorganismen auf und sind daher zur Bekämpfung von Infeki-oiien vorteilhaft, die solchen Mikroorganismen in tierischen Wirten ursaein werdcr.. Die :'o::izitat fur Säugetiere
309 si £
niedrig Der L! )M.-V\ ·_·ι ι heirägt - 5 μ kg. und die tägliche subkutane Yeiabreiclumg von 35ti my kg an cmc Gruppe von IO Rallen während einer /eil \c>n 14 i.IL Mi ciüa'i keine Todesfälle und \ernaeh- !.,-.igbarc Au/enhcn für 'low.iläl. Antibioticum Λ 16 SN(i als Mischung der Monoaninioniumsal/.e von Faktor I und Il /eigie folgende UD511-VYeItC in Mäusen, die mit dem betreffenden Mikroorganismus inli/ieii waren.
IO
fabeile III ID1,, (Mihciiliin
Organismus 13.S
15.6
10.2
Kscherichia coli 0127
Salmonella typhosa T
Klebsiclla K-I		 7.3
Proteus PR-6 -63
25
Außerdem zeichnen sieh Antibioticum A 161J1Jd und seine Salze durch Aktivität gegen pflanzenpathogenc Bakterien aus. So lasser, sich beispielsweise mit Antibioticum Λ 16SSd und seinen Salzen soli lic Infektionen mit pflanzenpalhogenen Bakterien w wie Bakterienwclkk rankheit. Bakterienfleck faule und Baklerienbrand bekämpfen.
Auf die besondere Art des Auftrags von Antibioticum A 16 886 oder eines Salzes davon auf Pflanzen kommt es nicht wesentlich an. Im allgemeinen erfolgt der erste Kontakt des Erregerorganismus mit dem Pflanzenblattwerk. Aus diesem Grund wird häufig ein Auftrag von Antibioticum A 16S86 oder eines Salzes davon auf das Blattwerk bevorzugt. Antibioticum A 16 886 und seine Salze werden jedoch von den Pflanzen transportiert. Daher kann der Auftrag auch auf Stengel. Blüten. Samen. Wurzeln oder andere Pflanzenteile zur Erzielung einer bactcriciden Wirkung in den Pflanzen erfolgen.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bc- 4s kämpfung von pflanzenpathogcnen Bakterien wird auf Pflanzen, die einem Befall durch die Bakterien ausgesetzt sind, eine wirksame Menge von Antibioticum A 16 886 oder eines Salzes davon aufgebracht. Es ist Für diese Methode nicht wesentlich. daß das Antibioticum in Form eines einzelnen Faktors angewandt wird. Jeder der Faktoren 1 und II kann allein verwendet werden und liefert gute Ergebnisse. Antibioticum A 16 886 oder ein Salz davon können ohne Modifizierung angewandt werden: im allgemeinen wird zur Pflanzenbehandlung jedoch vorzugsweise eine Zubereitung verwendet, die das Anlibiolieuni A 16 886 oder ein Salz davon und einen oder mehrere Hilfsstoffe enthält. Zur Hc:stellung solcher Zubereitungen können Antibioticum t>o A K) 886 oder seine Salze mit Wasser oder anderen flüssigen Trägern, organischen I ösungsmitleln. oberflächenaktiven Mitteln, darunter festen oberflächenaktiven Mitteln, oder inerten feinteiligen Feststoffen oder inerten körnigen Feststoffen modifiziert werden. f\s Die tienauc Konzentration von Antibioticum A 16886 oder eines Salzes davon in einer solchen Zubereitung ist nicht kritisch und hängt von dem jeweiligen Anwendungs/weck ab. für den die Zubereitung bestimmt ist. Im allgemeinen liefern für den Auftrag auf Blattwerk zur Bekämpfung von Infektionen durch typische pllanzcnpathogcne Bakterien Konzentrationen von Antibioticum A 16 886 oder eines Salzes davon von H) bis 1000 ppm oder mehr gute Ergebnisse. Bei Stäubemittclh zum Auftrag auf Blattwerk weiden Anlibioticumkonzentrationcn von 0,1 bis 10,0% bevorzugt.
Zur Herstellung flüssiger Zubereitungen kann Antibioticum A I6K86 oder ein Salz davon mit einer geeigneten Flüssigkeit und einem oberflächenaktiven Dispergiermittel zu emulgiei baren Konzcn;raten vereinigt werden, die mit Wasser oder cinei anderen Flüssigkeit zu Sprühmischungen weiter verdünnt werden können. Zu bevorzugten Dispergiermitteln, die in diesen Zusammensetzungen verwendet werden können, gehören die nichtionischen Emulgatoren, z. B. die Kondensationsproduklc von Alkylcnoxiden mit anorganischen Säuren. Polyoxyäthylenderivate von Sorbitanestern, komplexe Ätheralkohole. Geeignete organische Flüssigkeilen, die in der Zusammensetzung verwendet werden können, sind beispielsweise Erdöle und Erdöldestillale, Toluol und synthetische organische öle. Die oberflächenaktiven Dispergiermittel werden in flüssigen Zusammensetzungen gewöhnlich in Mengen von 0,1 bis 20 Gewichtsprozent, bc^opon auf die gesamte Gewichtsmenge aus Dispergiermittel und aktiver Verbindung, verwendet. Zur Herstellung von Stäubemitteln können Antibioticum A 16 886 oder ein Salz davon mit einem der t\ pisclien feinteiligen Feststoffe oder Granulate, wie sie in chemischen Zubereitungen für landwirtschaftliche Zwecke Verwendung linden, vereinigt werden.
Durch die folgenden Beispiele I bis 6 wird diese Ausfuhrungsforni der Erfindung näher erläuten. In jedem dieser Beispiele wird Antibioticum A 16 886 als Mischung des Monoaminoniumsalzcs von Faktor 1 und des Monoaminoniumsalzcs von Faktor II verwendet.
Beispiel I
Erwinia amylovora und Pseudomonas solanacearum. in vitro
Antibioticum A 16 886 wurde in vitro auf sein» hemmende Wirkung auf Etwinia amylovora um Pseudomonas solanacearum geprüft. Jeder Mikro Organismus wurde getrennt in Standardnähragar ein gebracht, und die erhaltenen Agarkulluren wurdei in mehrere Schalen gegossen und fest.w erden gelasser Dann wurde die Behandlung verschiedener Plaitei mit verschiedenen Methoden durchgeführt. Bei eine Behandlungsmethode wurden jeweils 0,1 ml Tesi lösung in zwei kleine Stahlzylincter pipcttierl. di aufrecht auf einer Agaroberfläche standen. Bei de anderen Methode wurden zwei Filierprüfscheibei die auf eine Agaroberfläche gelegt wurden, mit jcwci 0,1 ml Tesllösung imprägniert. Die Testlösung fi beide Behandlungsmethoden wurde durch AuHöse der entsprechenden Menge Antibioticum A 16 8t in Wasser, das in einer Giasapparalur destillic worden war. hergestellt. Die Ergebnisse, angegebi als Durchmesser der Hemmzonc. zciet die folueiK Tabelle:
16 886 Behandlung
A 16 886 IO ppm
A 16 886 50 ppm
A 100 ppm
.η, 1 a bei ie IV I lenini/or ι cc; 11 eiulut chnic~ scr in nun 13 ilUTscheihcn 11 cc.i ι um
6 \ 17 I 17 I .iilan. 21
14 Si .ihlAlini ler <olan 25 llll \ Ί
I		 am;. 20 20 30
1 um; 16 ra ι IV 16 30 j
ί 		13 13 30 35
6 6 25 6 I 16 34- 13
η I 30 I 20 13
15 I 6 i 13 i
6 I
Kontrolle (destilliertes Wasser). . .
I ι ' ι
Λ einschließlich ik'r Größe lies /.\liiulers b mm; eine Zoncniiroße von h min üihl daher keine Wachstumshemmung an.
Ii einschließlich der Größe der Fillerscheitv: 13 mm: eine /oncngrölij von 13 mm gibt dalier keine \Vachs:un shemnninu an.
B e i s ρ i e 1 2
Pseudomonas solanuccarum. Blattsprühung
Antibioticum Λ 16 886 wurde ferner in vivo zur
Bekämpfung
von
Pseudomonas solanaccarum auf
Tomatenpflanzen geprüft. Bei dieser Prüfung wurde Antibioticum A 16886 Monoammoniumsalz in Form Verschiedener wäßriger Zubereitungen verwendet, die sämtlich 1% Äthanol und 0.1"» eines oberflächenaktiven Mittels (ein Polyoxyäthylcnderivat eines Fettsäurcpartialesters von Sorbitanhydrid), jedoch verschiedene Konzentrationen an Antibioticum A 16886 enthielten. Für die Prüfung wurden 30 Tage alte TomatcnptUiiizen mit 2 Pflanzen Topf Bell.uiu'ung verwendet. Die Pflanzen in jedem Topf wurden mit einer der Behandlungslösungen behandelt, an der Luft trocknen gelassen und dann mit einem Medium, das ein aktives Wachstum von Pseudomonas solanaccarum aufrechterhielt, inokuliert. Alle Pflanzen wurden 24 Stunden in einer feuchten Kammer geh alten. dann herausgenommen und 7 Tage unter guten Agrikulturbedingungen gehallen. Nach Ablauf dieser 7 Tage wurden alle Pflanzen auf das Vorliegen und. falls vorhanden, das Ausmaß der Infektion untersucht. Die Krankheitssynipiome wurden nach einer Skala von 0 bis 4 bewertet, wobei 0 keine Bekämpfung und 4 vollständige Bekämpfung bedeutet, .!ede Pflanze wurde getrennt bewertet. Die Ergebnisse zeigt die folgende Tabelle:
A 16 886 und die andere 400 Teile pro Million Antibioticum A 16 886 enthielt. 10 Tage alte Sojabohnenpflanzen wurden mit Pseudomonas glycinia inoculiert. und die Wurzeln aller Pflanzen wurden wählend der Prüfung in wäßrigen Lösungen gehallen. Die inoculierten Pflanzen wurden zunächst in 50 ml Lösung gestellt. Eine Gruppe von Pflanzen wurde in die 200-ppni-Lösung. eine zweite Gruppe von Pflanzen in die 400-ppm-l.ösung und eine dritte Gruppe von Pflanzen als Kontrolle in Wasser gestellt. Die Wurzeln wurden 24 Stunden lang eingetaucht und während dieser Zeit belüftet. Dann wurden die Pflanzen, deren Wurzeln sich weiter in den verschiedenen Lösungen befände!1.. 24 Stunden lang incuhiert. Danach wurden die Pflanzen aus der Ineubationskammer herausgenommen und 1 Woche lang stehengelassen. Fitwa zu Beginn der Incubationsdauer unc von da an während der gesamten Woche wurde der Wurzeln nach Bedarf eine nährstoffhaltige I.ösuiu zugeführt um die Pflanzen in lebensfähigem Zustaiu zu halten. Nach Ablauf der Woche wurden dii Pflanzen untersucht, um die Ausbildung einer Pseudo monas glycinia-Infektion festzustellen. Die Krank heitsbcwcrtung erfolgte nach einer Skala von 0 bis 4 wobei 0 keine Bekämpfung und 4 vollständige Be kämpfunu bedeutet. Die Ergebnisse zeigt die folgend Tabelle: "
Tabelle VI Tabelle V
4S
Hewertuiis! der l-'rkrankum:
snUmacearum
Bewertung
der 1 rkr.iukunu
Kontrolle
A 16 886
A 16 886
Kontrolle (I % EtOH +0.1%
oberflächenaktives Mittel) .. ! 0 0
A 16 886 400 ppm ! 2 >■■ 3 ·■
A 16 886 200 ppm \ 2 f 2 -
Die Kontrollpflanzen zeigten eine schwere Pseudomonas sola uacearum-Infektion.
Beispiel 3
Pseudomonas glycinia. WurzeUränkung
Antibioticum A 16 886 wurde zur Bekämpfung von Pseudomonas glycinia mit Hilfe von A 16 886 enthaltenden Lösungen für die bloßen Wurzeln geprüft. Es wurden 2 Tränklösungen verwendet, von denen cine 2(M) Teile pro Million Antibioticum 200 ppm ....
400 ppm ....
T-I-
.S1S
Beispiel 4
Xanthomonas phr.seoli var. sojensis.
Blattsprühung
In einem eisten Test wurden 10 Tage alte Soj bolmcnpllanzen durch schwaches Befeuchten d unteren Blattoberflächcn der Primärblätier mit ein Suspension von Xanthomonas phaseoli var. sojcn; inoculiert. 2 Stunden später wurde das Blattwerk η einer Sprühlösung besprüht.
Eine Gruppe inoculicrter Pflanzen wurde mit ein Lösung, die 100 Teile pro Million Antibiotics A 16 886 enthielt, und eine zweite Gruppe mit eir Lösung, die 500 Teile pro Million Antibiotic! A Ir. XS6 enthielt, behandelt. Antibioticum A 16 8
,iirde in Wasser mit 353 Teilen pro Million einer .'lischung aus nichiioiiischen flüssigen Siillonalcniulaioren zubereitet.
In einem zweiten Test wv/de das Blattwerk von 0 Tage allen Sojahohnenpflan/en mit einer Sprü'niisuug besprüht, die entweder H)O oder 500 Teile -iio Million A IdXXd enthiell. und 2 Stunden späler η der gleichen Weise wie bei dem ersten Test ino-.uliert. Die Zubereitung von Antibioticum A IdNXd „Tl'olüle in der gleichen Weise wie bei dem ersten Test.'
Die l'llinwn wurden etwa 1 1 Tage lang unter guten Agrikuiiurbedingungen gehallen und dann auf das Wirliegen oder Fehlen von Xanthomonas phaseoli \ar sojensis unlcisueht. Die Bev\ertung erfolgte nach einer Skala von 0 bis 4 wie in den vorhergehenden Beispielen. Die Ergebnisse zeigt die folget,de Tabelle.
Tabelle ViI
von denen eine HKi Teile pro Million A IdXXt, und die andere 40(H eile P"1 Million Antibioticum AIdXXd und beide jL-weils 353 Teile pro Million der Emulgatormischung einhielten. Für die Prüfung wurden Gruppen von 2XTage alten Tomaienpflan/cn verwendet. In einer Puifreihe wurde die Losung mn auf die Stengel und in der /weilen Prüfreihe nut .ι.·1 die Blatter aufgebracht. 2 Stunden nach der Behandlung mil jeder der beiden Methoden wurden die Pflanzen durch hinsiechen eines in eine Brühekuliui von Pseudomonas >.olanacearuin getauchten Zahnstochers in den Stengel bei den (Oiyledonen inocuheri. Die Pflanzen wurden 10 Tage unter guten Agrikuiturbedingmigen gehalten und dann zur Bestimmung der Krankheitsbekämpfung untersucht. Die Bewertung nach einer Skala von 0 bis 4. wobei 0 keine Kontrolle und 4 vollständige Kontrolle angibt, helerte folgende Ergebnisse:
Tabelle VIII
Mnikic KmuUkv.·,
v.'Wi-riiiiii: prn bfhiinclcll
C !Rippen \.ui I'll;'.n/Cii
.\.!!:ΐί)ι·Ι!1ι>Ι1.1Λ p!'..lM\>ll
\.ir Mi]L-Ii ii-
dann
χ-ιρ! Uil!
'L'spiuhi.
ihm η
0 ; 0
T ; 4
4
Kontrolle (Wasser allein! ... ; 0 ! 0 jo
Kontrolle (Wasser plus !
Emulgalormisehung)
A IdXXd 100 ppm
A 1 d XXd 5(K) ppm ,
Beispiel 5
Pseudomonas phaseolicola. Blattsprühung
Alle Oberflächen von 20 Tage allen roten Feuerbohnenpflanzen wurden mit einer wäßrigen Zubereitung besprüht, die ^00 Teile pro Million Antibioticum Λ IdXXd und 0.1% eines oberflächenaktiven Mittels (ein Polyoxyälhylenderivat eines Fettsäurepartialesters von Sorbitanhydrid) enthiell Die besprühten Pflanzen wurden trocknen gelassen und dann mit Pseudomonas phaseolicola inoeulieri. Das Inoculieren erfolgte durch Befeuchten der unteren BlaUoberfläehe jeweils eines Blätlchens der ersleu und zweiten dreiblättrigen Blätter mit einer wäßrigen Bakterien- --,0 suspension mit 30% Lichtdurchlässigkeit auf einem Bausch und Lomb Spectronic 20. Die Pflanzen wurden anschließend 24 Stunden in eine leuchte Kammer gestellt, dann herausgenommen und 14 Taue unter guten Agrikulturbedingungen gehalten. Nach Ablauf dieser Zeit wurden Lille Pflanzen untersucht. Bei der behandelten Gruppe von Pflanzen wurde eine mäßige Bekämpfung von Pseudomonas phaseocicola festgestellt, während in der Kontrollgruppe schwere Krankheitssymptome gefunden wurden. u-,
Beispiel d
Pseudomonas solanacearum. getrennte
Bespriihung von Blättern oder Stengeln
Antibioticum A IdXXd wurde in Wasser mit eine: Mischung aus zwei nichiioiiischen flüssigen Sulfonal-•tniiliMitoren zu zwei Behu'idlunuslösuniicn /übereilet.
IV-llilomol!.:·. ■■>>!.111.:.LMlIIMI
K. ΐ;ΗΐΚΠί.·Γι·.1ν\>.υ! ll:i!:' mn Hi.ιItL-I in:1 ^ιοπμυί
Kontroll·:: (Wasser plus
35.1 ppm Kmulgatormischunu)
A IdXXd 100 ppm .
A IdXXd 400 ppm . .
0 1
3 4
4 4
Wie oben angegeben wurde, weisen Antibioticum Λ Io XSd und seine Salze au lter anlihakierieller Aktivität auch anthelmintische Aktivität auf Antibioticum A IdXXd oder ein Salz davon können daher an Warmblüter zur Bekämpfung verschiedener innerer Parasiten, besonders Magen- und Eingeweidewürmern, z. B. Ascaris lumbricoides var. suum. Nematospiroides drbius. Aspiculuris telraptera. Syphacia obvelata u. dgl., verabreicht werden. Ebenso wie bactericide Aktivität weist jeder der beiden llauptfaktoren anthelmintische Aktivität auf. Daher wird eine anihelmintische Wirkung erzielt, wenn leder der beiden Faktoren getrennt oder wenn eine Mischung der Faktoren verwendet wird.
Die Verabreichung von Antibioticum A IdXXd oder eines Salzes davon erfo'g' vorzugsweise auf oralem Wege, beispielsweise durch Einführung von Antibioticum A IdXXd oder eines Salzes davon in Tierfutter, durch Verabreichung von Tabletten. Tränken oder duich andere Maßnahmen. Im allgemeinen sind Dosierungen von I bis 500 mg pro Kilogramm Korpergewicht oder mehr bei Verabreichung von Ein zeldosen wirksam. Wenn Antibioticum AIdXXd oder ein SaI/ davon als Bestandteil eines regelmäßigen Fullers zugeführt wird, liefern Konzentrationen von 0.0001 bis 0.1)5" π oder mehr gule Ergebnisse. Ein bevorzugter Konzentralionsbereich von Antibioticum A IdXXd oder eines Salzes dawm in Futtermitteln beträgt 0.01 bis 0.05".,.
Die aniiielniiiilisclie .Aktivität von Antibioiicum A IdXNd wird dui.ii die folgenden Beispiele 7 und () näher erläutert, in denen jeweils Antibioticum A IdXXd als Mischung des Monoainmonium^.il/c. von Fakloi 1 und des Monoammoniuiiisal/es um Faktor 11 \t-'we;idet w unk·
ι-' 1 s P 1 C
/aiii
in einem ersten lest wurde Antibioticum A 16ΝΧ(. al- Liii/eldosis du:di cine Schluiidsoiide mi icv,ci!s 2 Mause verabreicht, die mit .V.pimlv.i is leiraptei.i ; UndS>p!iaciu obvelata ι Madenw tu mei linli/icn waien I)u Doms betrug ^K) mg Antibioticum A l(>v-<, ρ,,.. Κιί· 'gr.tinni Körpergewicht de- einzelnen Tier- und Vi;rde al·· Suspension in philologischer Ki-,Ts,,l/- |o-ung mit einem Gehalt son 0.125",, .MeilnlcUlulose 'c iii- Suspendiermittel verabreicht. Bei deni Versuch uiiide teiler eine Kontroligruppe \on (· Mäusen λ endet, die mn Aspiculuris letraptera und Svphai.i omelala inli/ierl »aren. Beide (jruppen wurden aJi W-rabreichung der Dosis an die bei-.aiulelle ': H uppe 4X Stunden unter noimalen !.aboraioriumseiiingungen gehalten. ,Japii Aurden edle Mäuse bgri.'nei «ml .ml Gcgv.-uv.an und /ahl \r,r. \5adeiv . urmern unieisuchi. i)ie l-.rüebnissc zeiüi die fohjende :heile: ' :·
laheüe IX
\c
Ci.
O.ii!"' ,ι Antibioticum
Λ ld SXn 0. Vi
11.Os' ,, Antibioticum
λ j., λ ■■(. o.o
Beispiel 1J
Lilt weiterer \ ersuch wurde wie im Beispiels durchgeführt mi! der Ausnahme, daß die Konzentrationen abgeändert wurden. Ls wurden lolgende Li gebiiisse erhallen
I abelle Xl
DiiiJi iini-aliche
<;, uivv· /.liii ilcr I 1!I1i!l-ii-
-.ch.iikn pu> (iiuppc
·. · Ii . ST
mi .'.!.!it ca.'.ii-i:;,··! ; 0.001 A: Antihi Oil cum A
Ik--1\; ülel.-.L-ili O.L',. '!iSiot ICU 1IU A \(
X.'<r>
1.2 0.7 0.2
Knnirolle
\l!'ill iOtlClüll 5OiI mi.' \.,£
Λ 16 SSd
(!er. Mikroorganismus Sueploimees cla\tiiis: du. Bildung eine- ausgedehnten Netzwerks s\mpo
,i! \er/wcit;ieii i.iitili\pheii. die oren egmentieren. charakteristisch.
0.5
Ii ι- ι % π ι c 1 s
In einem v.eiieien Versuch wurde AiHibimii um νς A Ιό SXd im!. Siandard-Niausi. Inner /u verschiedenen behaiuleilen l-iiOermilleln vjiniischi. die Antibioticum A IdSSd in kon/enlr; lioiiL-it u>n o.(H)5. 0.01 uikI 0.05 Ciewichtspro/ent enlhielten. Die 1 utieririttel dienten als Nahrung !'iir \eisc!".iedcne Grup- .t pen von Vläusen mit lev.eils 5 Mausen pro Gruppe liiwa 24 Stunden nach Beginn tier lütter-ing wurden die Mäuse mit Ascaris lumbricoides var. ^tiiim o\a. inli/iert. l-.ine weitere Gruppe von 5 Xiäusen. die als Kontrolle diente, wurde mit dem l'uttermittel ohne 4> Wirkstoff ücfiiUert. jedoch ebenlalls gleichzeitig mit \scaris lumbricoides var. suuiii infi/iert. Alle Gruppen erhielten ihr bctrcHende.s l'uitei und wurden 10 laue unter normalen I aboiatornim'-bedingungen gehalten. Dann wurde allen Mausen das butter so eni/ogen. Am II. lag wurden alle Mause gelotet, und die l.ungeu wurden auf das Vorliegen, und. falls \oihandcn. die /ahl \on Schaden dinch Ascaiis lumbricoides var. suuni. Liniersuchi. Die Memie an Antibioticum A 16SS6 in dem l'uiier und die durch- s schnillliche /ahl von l.ungenschadeii pro ln-r in jvnk'i" Gruppe /eitzl die folgende Tabelle:
Ί abelle X
pi·' ( ·■
Kontiolle
0.005",, Anlihioüciiiii
Λ ld XSd
'.o:i kuiven.
■-chließlich in S]
I- weiden kurze keulenförmige Seitenzwcige gebildet, die iie-Aohnlieh leueii-. I bis 4 Sporen erzeugen. L> ν erden keine Substra'.coiiioicn erzeugt. F.lektionen- :iiiki-oskopisi.ne Aufnalimen zeigen glattwandige Sporen, /eüwaiuipraparate enthalten zusat/hel·! /u den I lauptbestandteilen Asparaginsäure. Glutaminsäure and Alanin das ι j -Isomere von Diaminopimelinsäure und Gh cm. Die Sporen sind in Masse grau. und l'nmamncc! ist blaßgelb bis gelbbraun, hs wird kein lösliches Pigment gebildet. Die Kultur hat einen optimalen Temperaturbereich \on 26 bis ?,() C Bei >Ί G erfolüi kein Wachstum. Morphologisch ähnelt diese Kultur manchen Stammen von Thermomonspora und Micromoimspora.
Der neue Mikroorganismus, der Antibioticum A 16X86 /u produzieren '.ermag. wurde bei der KuI-lurensamniiung der Northern Utilization Research and Development Division. Agricultural Research Servise. Γ. S. iX-partment of Agriculture (früher No: hern Regional Research Laboratories). Peoria. Illinois. 6IdOI ständig hinterlegt und ist von dort für jedermann unter der K ulturnummer NRRL 35X5 c: haltlich.
Die C'haraktcnst:ka \on Streplom\ces clavuligeriis NRRI .isxs sj|U| J11 den folgenden Tabellen angegeben. L.s wurden die Methoden, die tür das Internationale Strepfimsccs-Projekt !Shilling et a!. "Methods Ιοί ( haiaclerizalion of Slreptomvces Speues'< . ln;ern. HuIi. SWeniic Bacteriol. 16: }\} '4Ol lU'ddl fur die Klassih/ierung von Streptomwes-Species empfohlen wurden, zusammen mit einigen zusätzlichen Tests angewandt. 1 arhnamen wurden nach der IS< 'C- NBS - Methode, beschrieben \on Keils at al in The ISCC-NBS-Method of Designating Colors and a Distionan of Color Names (Γ S. Department o| Commerce tire. 55,v Waslungi-in. I). C I'lroi. /ugeieilt. Die Buchslaben in runden Klammern beziehen sich auf die Farbreihe nach Γ r c s η e r und B a c k u s (T r e s η e r et al. »>S\ stern
17 Ir 18
!Color Wliccls for Sir.'|n>'m\LL-s ia\viiiu;n\·.. Λρρ! Color (McGraw-Hill Hook Co.. Inc. New York.
■ licrubiol. II. .-35 .vis j !'/f..\| I larhplattchenhe- p>5!)| sind in eckige Klammern gesetzt Wenn mehl ^
eichnungen sind i'.niersirichen. Die Farbhlocks nach anderes angegeben ist. wurden die Kulturen 14 lage
hier/ unu !"' a li 1 (Maeiz el al. ! )ieiionai \ of bei 3( > C gezüeluet.
Tabelle XIi
Morphologie Sporophoren werden auf einem umfangreichen I.uftmyc! g^biUlci
und bestehen au ^ kurzen s\mpodia! verzweigten Hyphen. Ge...ihn lieh einstehen 1 bis 4 Sporen auf kurzen keulenförmigen Seiler, zweiten. Sporophoren segmeniieren schließlich unter Bildung mm. Sporenketten, .iporenabmessungen 0.34 bis 0.K5 μ · 0.K5 · 3.3 ■ durchsehniltli..h 0.64 ■ \.> v. niecironcnmicroskopische Aufnahme!, zeigen glaltuaiuliue Sporen. Im Subsuatui\eel werden keine Sporen gebildet.
Kuliur-Charaeteiis'iica auf
ISPNo. 2 ■
(I lefe-Malzextr.-Auar) Wachstum reichlich. Revers grauyeib [ ! 2 K 3 |: l.uftmycel reiehlicli
■ dunkelurau ((J) 3ih [21 H 1 |: kein loMiches Piuiiient.
ISP No. 3 :
(Ilafermehl-Auar, Wachstum mäßig. Revers blaBüelb [H(I]: Luftmscel milk·'.
; weiß (W) !■> [27Al]: kein lösliel.e.- Pigment.
ISP No. 4
(Anorganische Salze-Stärke-Agari ... ; Wachstum reichlieh. Re\ers graugelb [12 H 2]: l.uftmycel ιιι;ιΙ>ιμ
!; mittelgrau (CiY) 2 fe [45 A 1 |: kein lösliches Pigment.
ISPNo. 5 ;
(Glycerin-Asparagm-Agarl : Wachstum miilel. Re\eis biaBgelbgrün [ li! Bl]. l.uftmycei mute:.
weiß (Wl a: kein losliches Pigment.
Tomatenpaste-Hafermehl-Agar ■ Wachstum reichlich. Re\ers L'iaugelh [Il 1:4]: Ltiftmycel mäßig.
i hellgrauolre (CiNl 1 1 2ig [21 Bl]: kein lösliches Pigment.
I:merson-Agar i Waclistum reichlich. Revers blaßgelb | 1 I C ! |: l.uftmycel spärlich.
kein lösliches Pigment
Bennetts-Agar ; Wachstum reichlich. Revers hellgelb [ 1 i J 2]: l.ufimycel reichlich.
, dunkelgrtugriin (GNl 24 ! 2 ili [23 A 3]: kein lösliches Pigmcni
Czapek-Agar , Wachstum spiirlieh.
Glucose-Asparagin-Agar ' Wachstum mäßig. Revers blaßgelbgrün [H) B IJ: Lufinncel mittel.
weiß (W) b [27 A IJ: kein lösliches Pigment.
Tyrosin-Aiiar : Wachstum maßig. Revers blaßgelb [K) B 2]: Luflmycel mäßig.
, gelblichgrau. (GY) 2 dc [1OA ?.}: k.in lösliches Pigment.
Nähr-Agar ' Wachstum mittel. Revers blaßgelbgrün [K) BlJ; l.uftmycel spar-
' lieh, weiß: kein lösliches Pigment.
Calciummalat Wachstum reichlieh. Revers blaßgelbgrün [K)BlJ: l.uflrmcel
mittel, weiß (W) a.
Wirkung au! Milch : keine Koagulation: Klärung in 17 Tagen.
Nitratreduktion negativ
Gelatineverfliissigung keine
Wachstumsreaktion auf
pH-Änderungen pH 5.0 bis MI im optimalen Waclniumsbcrcich, Wachstum, aber
: keine Spoiulation bei pH 7.5 bis o.5.
Melaninbildung
Pcpton-Vusen-Agar und
TrYpton-Hefeexlr.-Brühe : keine
Teinperaiu/anforderungen Wachstum und Spoiulation gut bei 26 bis 30 . kein Wachstum bei
37 oder darüber.
Hauptbestandteile von ganzen
Zellhydrolysalen ι .1 -Diaminopimelinsäure, (iluin. Glutaminsäure, Asparaginsäure.
Alanin und leucin.
2 040 Ul
Die Frgebniss.e von K
li:t- mit dem Mikroorganismus NRRL 35s5 "durcli-(Miihrl wurden, zeigt Tabelle XIIl.
In dieser Tabelle werden folgende Svmbole vcr
U endet.
Wachstum und Verwertumi.
- Kein Wachstum, keine Verwertung,
ι Verwertung wahrscheinlich,
i ι Verwertung fraglich.
Tabelle XiII
Kohlenstiiflverwertungsbild für NRiU 35Xs
Verbindung ;
1 abinose i
iiinose !
■ mJ'.iiC
■■.-zilose
ünosi- i
■arose :
.ι ha rose ;
üulose
i
, ulutainal
W ach-l
vr.iihiolicum Λ I6S80 kann wie oben ..ngeueben t ;eh Züchtung von NRRI, 3585 erzeugt werden / ! Kulturmedium /ur F.rz.eugung von Antibioticum / W)XXO durch Züchtung des oben beschriebenen Mikroorganismus können verschiedene Medien vciv.eiulet weiden, obwohl ;uis den oben beschriebenen \ crwertungslesls /u ersehen ist. daß der MikrourgaiiiMinis unter künstlichen .Kulturbedingungen nur wenige KohlensloffLjucüen zu verwerten vermag. Für den I achmann ist aber ersichtlich, daß der Mikroorganismus in einem vollständigen Medium Kohlen-Moffquellen vcrwer'ün kann, die unter solchen künstlichen Bedingungen nicht verwertet werden. Zur |-r/ieh'ng einer wirtschaftlichen Produktion, einer maximalen Ausbeute an Antibioticum uiul einer leichlcn Isolierung des Antibioticums werden jctlcic'u einige verhältnismäßig einfache Nührquellen bevorzugt. Die Medien, die zur Produktion des Antibiolicums geeignet sind, enthalten beispielsweise ein.: assimilierbare Quelle für Kohlenstoff, z. H. Glucose. Stärke. Glycerin. Melasse. Dextrin.
Itevorzuule Kohlcnstoffiiucllen siiul Ghuose und Cilscerin. Verwendbare Medien enthalten lerner eine {Hielle für assimilierbaren Stickstoff. /. Ii. Sojaholinen-Biehl. Maisquellvvasserfeststofl'e. Hefe. Baumwv!!- Simenmehl. Rindlleischexlrakt. Peptone (Fleisch oder Soja), ('äscin. Aminosäuregemische u.dgl. Bevorzugte Slickstoffqi'^llen siiul Peptone. Sojabohnen-Bieh! und Aminosäurcngemische. Zu den anorgani-•chen Nährsal/en. die in die Kulturmedien eingebracht »erden können, ^.diören die üblichen Salze, die Natrium-, Kalium. Ammonium-. Calcium-. Phos-Dhal-. Sulfat-. Chlorid- und C iirbonationen liefern.
Spurenelemente, die für ein optimales Wachstum und eine optimale faltwicklung des für die Produktion von Antibioticum A I6XX6 verwendete:! Mikroorganismus eriordcrlich sind, können ebenlalls m r" dem Kulturmedium enthalten sein. Solche Spurenelemente kommen gewöhnlich als Verunreinu'iin-eii der anderen Bestandteile des Mediums in Mengen \or. die /ur Befriedigung de.-* W'achstumsbedarfs der erlindungsgemäli \erwendeten Aclinoin\ceieii aus-
in reichen.
Der Anlaiigs-pll-Werl des Kulturmediums kann sehwanken. Hs wurde |edoch gefunden, daß dei Anlangs-pl I-Wert des Mediums zwcckmähig /wischen (Ί.5 und 7.2 liegt. Wie schon bei anderen Act ι no m\ ce I en
is beobachtet wurde, nimm; der pH-Wert des Mediumwährend der Wachstumspenode des Mikroorganismus, während der \niibioiicum erzeugt wild, allmählich zu und kann einen NN en von 0.7 Hi-. Ί.5 oder darüber erreichen, wobei 'er Hnd-pl 1-Wert wcnigsiens zum Feil von dem Aal/ngs-pH-W en des Mediums, den m dem Medium vorhandenen Pullern und der Zeitdauer, während der der Mikroorganismus wachsen gelassen wird, abhängt.
Submers aerobe Kuliuibedmgungen sind die liedin-
2s gungen der Wahl (üv die Produktion von Antibioticum Λ 16iXS(i. Zur hr/eugung verhältnismäßig kleiner Mengen können Sclniitelkolbenkuliuren und Oberllächenkullureii in flaschen angewandt werden, l-'iir die Herstellung großer Mengen werden dagegen submers aerobe Kuliuren in sterilen Tanks bevorzugt Das Medium in dem sterilen Tank kann mit einer Sporensuspension inoculiert weiden. Wegen der Wachstumsverzögerung. die bei Verwendung einei Sporensiispension als Inoculum beob 1 biet wird.
vsjrci ledoch die vegetative f-orm der Knmir bevi·:- /uiit. indem so \Vachstumsver/ögeru-lgen vermieden werden, wird tue Fermenlationsvorrichiung bessci ausgenutzt, i.s ist also /weckmäüig. dui\\) Inokulieren einer verhältnismäßig kleinen Menge Kulturmedium mit der Sporenfonn des Organismus zuersi ein \egetati\es lno. ulum des Organismus zu erzeugen und. wenn dai'iii ein junges aktives vcgelatnes Inoculum erhalten worden ist. das vegetative Inoculum aseptisch in den großen Tank zu überführen. Das Medium.
in dem das vegetative Inoculum erzeugt wird, kann entweder das gleiche Medium oder eiii anderes Medium als das für die Produktion von Antibioticum A 16 SSO in großem Maßslab verwendete Medium sein.
y· Der Mikroorganismus, der Antibioticum A 10 NSO produziert, gedeiht in einem weiten 'lempeia'.ur-K-reich vo-i 25 bis 37 C. Optimale Produktion von A !6SSo erfolgt offenbar bei Ί emperaturen von 20 bis 30 ('. Im allgemeinen erfolgt eine maximale
:o Produktion des Antibioticunis in etwa 30 bis 72 Stunden nach iiioculiercn des Kulturmediums.
Wie es bei submers aeroben Kulturveriahren üblich ist. wird durch das Kulturmedium sterile Luft ".eblasen. Zur Hrzielung emes wirksamen Wachstums
'".' des Mikroorganismus und einer wirksamen Produktion v.in /Antibioticum A 10X86 beträgt das I uf:- volumen, das hei der I ankproduktion \o;i A 10 SSO aii'icwandl wird. 0.2 bis 0.4 VolumleiK I ufi pro Minute und pi" Volumteil Kultur. Bevoi/ugi werden
()s 0.40 Vuiumteile Luft pro Minute imd pro Vohimleil Kulturmedium.
Bei Anreicherung von aniibiotischer Aktivität in dem Kulturmedium kann während der Fermentations-
dauer leicht durch Prüfen von Proben des Kulturinediurns auf ihre inhibierende Aktivität für das Wachstum von Mikroorganismen, die in Gegenwart von Antibioticum A 16886 inhibiert weiden, verfolgt werden. Es wurde gefunden, daß die Mikro-Organismen E. CoIi. Salmonella gallinarum und Pseudomonas solanaeearum für diesen Zweck geeignet sind. Die Prüfung der Proben kann nach der allgcmein bekannten lurbidometrisehen Methode oder Agardiffusionsmelhode erfolgen.
Im allgemeinen erfolgt eine maximale Produktion von A 16886 in I bis 3 Tagen nach Inoculieren des Kulturmediums in submcrs aerober Kultur oder Schüüelkolbenkultur.
Die während der Fermentation erzeugte antibiotische Aktivität kommt hauptsächlich in dem flüssigen Anteil der Fermentationsmischung vor. Die bei der Produktion von A 16 886 angewandten Isoliermethoden sind deshalb so ausgelegt, daß sie eine maximale Gewinnung des Antibioticums aus der Brühc ermöglichen. So werden beispielsweise Mycel und ungelöste Feststoffe aus der Fermentationsbrühe durch übliche Maßnahmen, z. B. Filtrieren oder Zentrifugicren. entfernt, und aus der filtrierten oder zentrifugierlen Brühe kann Antibioticum A 16 886 durch eine Extraktions- oder Adsorptionstechnik
gewonnen werden. ..,.,„.. , · ..
Zur Gewinnung von A 16 886 durch eine Adsorpiionsicumik können verschiedene Adsorbentien. ? B Kohle. Kieselgel, Aluminiumoxid oder mikrokrislallinc Cellulose A 16 886. wie es aus der Feimentation erhalten wird, kann je nach den Leimentationsbedingungcn entweder in amphotcrer Form oder in Salzform vorliegen. Unabhängig von seiner Form kann es aus einer Lösung in einem geeigneten Lösungsmittel an einem der obengenannten oder ähnlichen Adsorbentien adsorbiert werden. Das adsorbierte Antibioticum A 16 886 oder Salz kann dann von dem Adsorbens durch emc geeignete Eluiertechnik, z. B. durch Waschen des Adsorbens.
, , , ., . * 1 /■ nil/' 1 "Cl
an dem das Antibioticum A 16 886 oder ein Salz davon adsorbiert ist. mit einem Lösungsmittel, eluiert werden. Wenn das Eluieren durch Waschen mit einer Lösung von beispielsweise Amnioniumformiat oder Natriumacetat erfolgt, wird Antibioticum A 16 886 als Ammonium- bzw. Nalriumsalz eluiert. Solche Salze lassen sich durch übliche Methoden leicht wieder in Antibioticum A 16 886 überführen.
Andere Salze von Antibioticum A 16 886 als Ammonium- oder Alkalimetallsalzc werden Vorzugsweise durch übliche Reaktion von Antibioticum A 16 886 in unmodifizierter amphotercr Form mit der betreffenden Säure oder Base hergestellt. So wird Antibioticum A 16 886 zur Herstellung von Säureadditionssalzen mit einer anorganischen oder organischen Säure umgesetzt. Zu Beispielen für geeignete Säuren gehören Chlorwasserstoffsäurc. Bromwasser stoffsäure. Jodwasscrsloffsäure. Schwefelsäure. Phosphorsäure. Essigsäure. Benzoesäure. Sulfaminsäure. Weinsäure. Zitronensäure. Maleinsäure. Bernsteinsäure. Ascorbinsäure und Glycolsäure.
Antibioticum A 16 886 bildet ferner Salze mil Kationen bei Umsetzung von A 16 886 in unmodifixierter amphotcrer Form mit anorganischen und organischen Basen und Salzen. Solche Salze sind beispielsweise Ammoniumsalze und substituierte Ammoniumsalze. Alkalimetallsalzc z. B. mit Natrium. Kalium. Lithium. Caesium und Rubidium und Erdalkalimetallsalze. /. B. mit Calcium. Strontium und Barium, sowie Salze mil Kupfer. Zink. Magncsium und Silber. Bei organischen Basen kommt es nicht auf die Art der Base an; im allgemeinen wird
s jedoch eine Base mit einem pH-Wert von 3.0 oder darüber in Wasser bevorzugt. Geeignete organische Basen sind beispielsweise Benzylamin. Methylamin. Diätin lamin. Triälhvlamin. Procain. Diisopropylamin. \thanolamin. Cyclohexylamin. Dieyclohexyl-
<o amin. Diphcnylamin. Di-n-bulylamin. Chinolin und Pyiidylamin.
Kür pharmazeutische Anwendungen werden die pharmazeutisch annehmbaren Salze von Antibiolicum A 16 886 allgemein bevorzugt. Sämtliche Salze sind jedoch als Zwischenprodukte bei der Produktion. Abtrennung und Reinigung von Antibioticum A 16 886 vorteilhaft. Für therapeutische Zwecke sind pharmazeutisch annehmbare Salze dem Antibioticum A 16 886 im allgemeinen gleichwertig. Manchmal
:.o werden jedoch bestimmte Salze wegen einer vorteilhaften Eigenschaft, z. B. Löslichkeit, die sie durch die Salzbildung erhalten, bevorzugt.
Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung:
Beispiel IO
Schütlelkolbenproduktion von Antibioticum
Eine sporuliertc Kultur von Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 wurde durch Züchten des Mikroorganismus auf einem Sehrägagarnährmcdium mit folgender Zusammensetzung erzeugt:
Dextrin HK)O
,5 Hvdrolvsierles Casein "
(„N-Z Amine-Type A«.
Sheffield Chemical Company) .. 2 (H) e
R.ndlleischextrakt ..' 1 00 Γ,
Mccr-Aaar (3mal gewaschen). ...'.. 20.(M) u
Deionkiertes W-issnr t 1 "
Der pH-Wert des Mediums wurde mit Natriumhydroxid auf pH 7,0 eingestellt.
Das Schrägagarmedium wurde mit Sporen von Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 inoculiert und 4 bis 6 Tage bei 30 C incubiert. Dann wurde die Agarschrägkultur mit sterilem destilliertem Wasser bedeckt und gelinde abgeschabt, um die Sporen und Zellen als wäßrige Suspension zu entfernen. 1 ml der
so erhaltenen Suspension wurde zum Inoculieren von jeweils 100 ml eines vegetativen Mediums mit folgender Zusammensetzung verwendet.
Glucose 15.00 g
ss Sojabohnenmehl 15.00 g
Maisqucllwasserfeststoffe 5.00 g
Calciumcarbonat 2.00 g
Natriumchlorid 5.00 g
Deionisiertes Wasser 11
Der pH-Wert des vegetativen Mediums wurde mi Natriumhydroxid auf pH 6.7 eingestellt.
Das vegetative Inoculum wurde 24 bis 48 Stundet bei 30 C auf einer hin- und hergehenden Schütte! vorrichtung mit einem Ausschlag von 5 cm (2 incli bei 108 UpM geschüttelt. Das so erzeugte Inoculur wurde dann wie folgt für die Produktion von Anti bioticum A 16 886 verwendet.
2 040 \A 1
Kin Produktionsmedium mil folgender Zusammensel/.unii wunle iicrticsiclll:
15.(10 μ
1.00 μ
3.00 μ
Glucose) 20.00 u
11
Sojabohncnniehl .
Casein
■ ialriumnilrat. . . .
Cmicosesirup (50",
Leitungswasser. . .
Jeweils 100 ml des Produktionsmediums wurden fai 500 ml Erlenmeyerkolben gegeben, die 30 Minuten bei 120 C sterilisiert wurden. Nach dem Abkühlen Wurde jeder Kolben mit einem 5%igen vegetativen Inoculum inoculiert. Das Lcrmcntationsmcdium Wurde 48 bis 72 Stunden bei 25 bis 30 C auf einer Rotationssehüttclvorrichtung mit 250 UpM geschüttelt. Wahrend der Fermentation wurde das Medium luit steriler Luft in einer Menge von 0.4 Vol. WiI. Min belüftet. Die Isolierung erfolgte im wesentlichen wie im Beispiel IS angegeben.
Beispiel Il
Antibioticum A 16 886 wurde nach der Arbeitsweise von Beispiel 10. jedoch unter Verwendung eine* Produktionsmediums folgender Zusammensetzung und einer mit 108 Ausschlagen pro Minute betriebenen hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung statt einer RolalionsschüUelvorrichumg erzeugt.
Destillierte Lösung (Nadrisoij 5.00 g
Sojabohnenmehl (Nutrisoy 200 D) 5.00 g
Erdnußmehl 5.00 g
Melasse wie für ^Blackstraps.
einen dunklen Likör) 5.00 n
Hafermehl 5.00 g
Glycerin 10.00 g
Leitungswasser 11
Beispiel 12
Antibioticum A 16 886 wurde nach der Arbeitsweise von Beispiel 10. jedoch unter Verwendung eines Produklionsmediums folgender Zusammensetzung erzeugt:
Hafermehl 20.00 g
Glycerin 10.00 »
Leitungswasser Il
Beispiel 13
Antibioticum A 16 886 wurde nach der Arbeitsweise von Beispiel 10. jedoch unter Verwendung eines Produktionsmediums folgender Zusammensetzung erzeugt:
Baumwollsamenmehl 20.00 »
Glycerin KUV) g
Glycosc 5.00 g
Leitungswasser Il
Beispiel 14
Antibioticum A 16 886 wurde nach der Arbeit>-
wei.se von Beispiel !0. jedoch unter Verwendung
eines Produktionsmediums folgender Zusammensetzung, erzeugt:
Glucose , 20.00 g
Lösliche Starke 10.00 g
Pcplon (Wilsons 1 j 591 30.00 g
, I hdrolysiertes Casein
i"N-Z Ammeiype Λ«.
Sheffield Chemical Company) . .
Magnesiumsullathepiahydrat
Melasse (Blackstrapi
Caleiumcarhonal
I.eiuinuswas.M?!"
4.00 g 5.00 g 5.00 g 2.00 ü 100 ml'
Beispiel 15
Antibioticum A16KS6 wurde nach der Arbeitsweise von Beispiel 10. jedoch unler Verwendung eines Produktionsmediums folgender Zusammensetzung erzeugt:
Glycerin 20.(X) g
Sojapepton 5.00 g
Calciumnitrat 2.00 g
Natriumchlorid 0.50 g
Nadrisol 3.00 g
Leitungswasser Il
Beispiel 16
Line weitere sporulierte Kultur von Streptoniyces clavuligerus NRRl. 3585 wurde durch Züchten des O1■■_-■ inismus auf einem Schrägagarnahrmedium c:/engt. Das Medium halle folgende Zusammensetzung;
Domrin 10.00 g
u Hefeextraki l.ou g
Hydivlysiertes Casein
(»N-Z Amine-Type A<
Sheflield Chemical Company)
2.00
Rindfleischexirakt 1.00 g
Calciumchloiidheptahydrat 0.01 u
Meer-Agar 2(UH) g
Deionisiertes Wasser 1 ',
Der pll-Werl des Mediums wurde mit Nalriumhydroxid auf 7.0 eingestellt.
D.'.s Schragagarmcdium wurde mit Sporen von Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 inoculiert und bis 10 Tage bei 30 C incubiert. Dann winden die Agaischrägkulturen zur Entfernung von Sporen abgeschabt, die zu 2.0 ml sterilem Rinderserum gegeben wurden. Von der erhaltenen Scrumsporensuspcnsion wurden dann 0.1 ml in eine sterile Gclnerlrocknungsampulle überführt und zu Pellets gefriergetrocknet.
Die so erhaltenen Pellets wurden zum Inoculierei eines vegetativen Mediums folgender Zusammen sctzuiig verwendet:
Glycerin 10,00 si
Saccharose 20.00 y
Sojaschrot (Nutrisoy) 15.00 e
Amber BYF 300. .." 5.00 g
Trypton 5.(X) g
Kaliumbiphosphat 0.20 g
Leitungswasser 11
Der pH-Wert des Mediums betrug 6.2 und wuix mit Natriumhydroxid auf 6.5 cingestelU.
Beispiel 17 Piloiprodiiktion von Antibioticum A 16 886
In einen 40-1-Fermentcr aus korrosionsbeständige Stal.1 wurden 24 1 eines Mediums folgender Zusai menset/.ung gegeben:
109 518':
25 26
Antifoam Λ (ein Entschäumer der unter magnetischem Rühren 16 Stunden extrahiert.
Firma Dow Coining Company ι 5.Ut) μ Die methanolunlöslichcn Stoffe wurden abt'iltrien. und
■ ι -, -,,() (1 der methanollösliche Anteil wurde mit 5 Volumteilen
1 "'" ^ Aceton gelallt. Der Niedcischlag wurde abfiltriert und
Nadrisol 1 25.OU u "> getrocknet. Die Ausbeute betrug 20,6 g.
.... ,, . -/,IMIf1 Dieses Präparat wurde in einer Mindestmemie
Soiabohncnmeh schrot MitUH) ii ... ... ' , . „ . . ,. , . . - .
·' - Wasser gelost und nut einer Geschwindigkeit von 1 ml
Glycerin IS7.5O g pro Minute auf eine 5.S χ 120 cm-Kolonne mit einer
. PSi)Uu Füllung aus Dextran (Scphadcx G-25) aufgegeben. Die
N-Z Amine A — · *- |n Aktivität wurde mit deionisiertem Wasser eluiert. und
F'errosulfathepiahydrat 2.50 g die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und lyophili-
Kiiltcs Leitungswasser, auf 24 1 slc[[j g ^ ^ crha,tencn Produkls wurdcn ln 256 ml
Acetonitril Wasser (55:45) gelöst und auf eine 5.5 χ
Der Anfangs-pH-Wcrt betrug 5,9 und wurde mit 15 85 cm-Kolonnc mil einer Füllung aus Kieselgel, das etwa 20 m! 5n-Nalriumhydroxid auf pH 6.5 cinge- mit Acetonitril Wasser (7:3) eingefüllt wurde, aufgestellt. Das Medium wurde 30 Minuten bei 120 C und geben. Die Aufgabe erfolgte mit einer Geschwindigkeit 1.05 bis 1.27 atü (15 bis IS psig) sterilisiert, abgekühlt von 3 ml Minute. Nach Aufgabe der Probe wurde die und dann mit einem wie im Beispiel 16 erzeugten Kolonne mit Acetonitril Wasser (7:3) mit einer Strö-5%igen vegetativen Inoculum inoculierl. Die Fer- jd mungsgeschwindigkeit von 5 ml pro Minute eluiert. mentation wurde 66 Stunden bei 30 C unter Belüften Die aktivsten Fraktionen wurden vereinigt, im Vakuum mit steriler Luft in einer Menge von 0.35 Vol. zur Trockne eingeengt und lyophilisiert. Vol.'Min. und Durchmischen mit einem mecha- Das so erhaltene Material bestand aus einer Minischcn Rührer, der mit 420 Umdrehungen pro schung der Monoammoniumsalze von Faktor 1 und Minute betrieben wurde, durchgeführt. Der End- 25 II. Es wurde für die oben beschriebenen antibakterielpH Wer! betruu 6.3. len und anthelmintischen Untersuchungen sowie für Antibioticum A 16 886 wurde aus der Brühe nach das folgende Trenn-und Reinigungsverfahren Verwendern iii Beispiel 18 beschriebenen Isolierverfahren det.
gewonnen. D · . ,„
10 B e 1 s ρ 1 c 1 19
Beispiel 18
Trennung der Faktoren 1 und Il von
Isolierung von rohem Antibioticum A 16 886 Antibioticum A 16 8,86-Monoammoniumsalz
als Monoammoniumsalz
35 10 g eines wie im Beispiel 18 hergestellten Präparats
Etwa 75 1 wie im Beispiel 17 erhaltener Brühe wurdcn in 197 ml Acetonitril,Wasser (55:45) gelöst winden mit Hilfe von .>Hyflo Super-Cel« (einer Di- und auf eine 4.0 χ 130 cm-Kolonnc η :t einer Füllung atomeenerdc der Firma Johns-Manville Products) in aus 1.6 1 mikrokristalliner Cellulose (Avicel) aufgecincr Menge von 5 g pro 100 ml filtriert. Das Filtrat geben, die mit Acetonitril/Wasser (7:3) eingefüllt wurde mit einer Geschwindigkeit von 60 ml pro 40 wurde. Die Kolonne wurde mit 1 ml pro Minute beMinute über eine 9.5 χ 130 cm-Kolonne mit einer laden und mit 2 ml pro Minute mit Acetonitril Wasser Füllung aus 81 Kohle (Pittsburgh 12 χ 40) geleilet. (7:3) eluiert. Die Elution wurde durch Testproben und Die Kolonne wurde mit 10 1 deionisiertem Wasser Papierchromatographie verfolgt. Beim Eluieren wur (pH 5,2) gewaschen, und die an der Kohle adsor- den zahlreiche Fraktionen erhalten, die jeweils über bierte Aktivität wurde durch Durchleiten von 45 wiegend einen Faktor enthielten. Die Fraktionen mi 50%igcm wäßrigem Aceton durch die Kolonne ent- den betreffenden Faktoren wurden vereinigt und lyo fernt. Die Fraktionen, die die Aktivität enthielten. philisicrt. wurden vereinim. zur Entfernung von Aceton im . . Vikuum eingeengt und auf eine 9.5 χ 140 cm-Ko Beispiel M lonnc mit einer Füllung aus »Dowex 1-X1« (stark 5°
basisches Anionaustauschharz der Firma The Dow Herstellung von Antibioticum A 16 886
Chemical Co.) in der Formiatform aufgegeben. Die 1-Hydrochlorid
Kolonne wurde mit 101 deionisiertem Wasser gewaschen, und die Aktivität wurde mit 0,1-m Ammo- 200 mg wie in den vorhergehenden Beispielen he
niumformiat entfernt. Die aktiven Fraktionen wurden 55 gestelltes und abgetrenntes Antibioticum A 16 Si
vereinigt und mit einer Geschwindigkeit von I Ammoniumsalz wurden in 2 ml Wasser gelöst. D
60 ml/Minute über eine 9.5 x 100 cm Kolonne mit pH-Wert der Lösung betrug anfangs 5.30 und wur«
Kohlefiillung (Pittsburgh 12 χ 40) geleitet. Die Ko- mit 1 n-HCl auf pH 2.0 eingestellt. Dann wurde d
lonne wurde mit Wasser gewaschen, und dann wurde Lösung unter vermindertem Druck fast bis zur Trock
die Aktivität mit 1 :4 Aceton Wasser rrit einer Ge- f>° eingeengt. Nach Zusatz von 0.5 ml Wasser und 1.5 1
schwindigkeit von 60 ml pro Minute, wodurch Methanol wurde das gewünschte Hydrochlorids;
15 Fraktionen mit je 2 1 erhalten wurden, und an- durch Zugabe von 10 Volumteilen Aceton abgesch
schließend mit 1:1 Aceton Wasser, wodurch Ί8 Frak- den. Das ausgefällte Antibioticum A 16 886 I-Hydi
tionen mit je 1 1 erhalten wurden, eluiert. Die aktiven chlorid wurde abfiltriert. mit Aceton gewaschen u Fraktionen wurden vereinigt, mr Entfernung von fi5 getrocknet. Die Analyse ergab 4.50% Chlor. Die eli
Aceton im Vakuum eingeengt und !yophilisiert. trometrische Titration des Produkts in einer 66%U
40 g vereinigte lyophilisierte Präparate, die wie oben Dimethylformamid-Wasser-Lösung mit einem /
beschrieben erhalten wurden, wurden mit 41 Methanol fangs-pH-Wert von 5,0 ergab die Gegenwart von c
ίtrierbaren Gruppen: pK'a, = 3.6, ρΚΛι, = 5,2 und >K'a3 = 10,8.
Beispiel 21
Herstellung von Antibioticum A 16 886-Dinatriumsalz
200 mg wie in den vorhergehenden Beispielen hergestelltes und abgetrenntes Antibioticum A 16 886 1-Monoammoniumsalz wurden in 2 ml Wasser gelöst. Der Anfangs-pH-Wert betrug 5,30. Die Lösung wurde mit 2 5n-NaOH auf pH 10,50 eingestellt und dann unter vermindertem Druck bis fast zur Trockne eingeengt. Nach Zusatz von 1,5 ml Methanol wurde das Salz mit 10 Volumteilcn Aceton ausgefällt. Das abgeschiedene Antibioticum A 16 886 I-Dinatriumsalz wurde abfiltriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet. Di^ Analyse ergab 6,79% Natrium.
28
Beispiel 22
Herstellung von Antibioticum A 16 886
in Säureforn"
200 mg einer Mischung des Monoamrnoniumsal/es von Antibioticum A 16 886 I und des Monoammoniumsalzcs von Antibioticum A 16 886 II ν, .irden in 40 ml Wasser gelöst und mit 6 ml »Dowex 50 W-X 12« (H + ) Harz (Produkt der Firma Dow Chemical Co.) versetzt. Die Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt und dann durch einen mittleren Sinterglastrichtet filtriert. Das Filtrat (ph 2.65) wurde lyophilisicit.
Die elcktrometrische Titration in einer 66%iger Dimethylforniamid-Wasser-Lösung mit einem An fangs-pH-Wert von 4.30 ergab die Gegenwart vor drei titrierbaren Gruppen: pk'a, = 4,2, pK'a-, = 5.( undpK'a3 = 10,4.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

  1. I. Dipeptide tier Formel
    I'aientansnriiche:
    Nil,
    CU ICi 1,1., C NI!
    C C)OlI
    O ί
    (ι
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