DE2708493C2

DE2708493C2 - Antibiotikum AM-1042

Info

Publication number: DE2708493C2
Application number: DE2708493A
Authority: DE
Inventors: Juichi Soka Saitama Awaya; Chiaki Yokohama Kanagawa Kitao; Akira Fuchu Tokyo Nakagawa; Satoshi Tokyo Omura; Ruiko Yokohama Kanagawa Otwa; Haruo Machida Tokyo Tanaka
Original assignee: Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1976-02-27
Filing date: 1977-02-26
Publication date: 1983-02-17
Also published as: DE2708493A1; US4226879A; GB1541512A; FR2342300B1; FR2342300A1

Description

2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums AM-1042 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die im Anspruch 1 unter Punkt g) genannten Maßnahmen durchführt

3. Mittel zur Verhinderung von Kokzidiose bei Geflügel, dadurch gekennzeichnet, daß es das Antibiotikum AM-1042 gemäß Anspruch 1 als aktiven Bestandteil enthält.

Gegenstand der Erfindung ist zunächst das neue so Antibiotikum AM-1042 gemäß Anspruch 1, das auch Asukamycin genannt wird.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung dieses Antibiotikums, wie es im Anspruch 2 angegeben ist, und ein Mittel gemäß dem Anspruch 3.

Das erfindungsgemäße Antibiotikum besitzt außer den im Patentanspruch 1 genannten Eigenschaften noch folgende:

einer Amino- oder Hydroxy-Gruppe bei δ 13,6, von zwei aromatischen Protonen bei <5 7,41, von neun olefinischen Protonen bei 0 7,0-5,8, einer mit einem Stickstoffatom verbundenen Methylgruppe oder einer solchen mit Doppelbindung bei δ 2,6 und von zwei Methylgruppen bei δ 1,0-0,9 hin.
Farbreaktion:

positiv in den Reaktionen von Ehrlich, Dragendorff und Jod. Negativ in den Reaktionen von Molisch, Fehling, Ninhydrin und Beilstein,
Löslichkeit in verschiedenen Lösungsmitteln:
leicht löslich in Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid; löslich in Aceton, Chloroform, Äthylacetat, Äthanol und Methanol; unlöslich in Petroleumäther, η-Hexan und Wasser,
Rf-Werte durch Chromatographie:
Dünnschicht-Chromatographie unter Verwendung von Kieselgel (03 mm), weiche in herkömmlicher Weise durchgeführt wurde, ergab nachstehende Rf-Werte:

Benzol-Aceton (13:7) 0,40

Chloroform-Methanol (10:1) 0,56
Äthylacetat-Methanol (87 :13) 0,66

Elementaranalyse, Molekulargewicht und Molekularformeln:

Aufgrund verschiedener Versuche wurde festgestellt, daß durch Elementaraiialyse für AM-1042 keine konstanten Werte erzielbar sind. So wurden beispielsweise nachstehende Schwankungen festgestellt, wenn das im nachfolgenden Beispiel 1 erhaltene gereinigte Produkt als Probe für drei Untersuchungen verwendet wurde.

5,71	5,26	23,72
	5,11	21,58
6,03	4,99	23,61

1. Untersuchung 65,31

2. Untersuchung 67,12

3. Untersuchung 65,37

Auch ein definiertes Molekulargewicht von AM-1042 ließ sich kaum durch Massenspektrometrie bestimmen, während nach der Rast-Methode ein Molekulargewicht von 520 bis 580 für AM-1042 feststellbar war.

Unter Berücksichtigung dieser Resultate und verschiedener Faktoren ist daher anzunehmen, daß die empirische Formel für AM-1042

lautet.

a) neutral,

b) Schmelzpunkt; 185 bis 190° C (zerfallen^

c) ultraviolettes Absorptionsspektrum (F ig. 1):
Absorptionen bei 305 und 250 nm (Absatz) in 0,1 N NaOH-90%iger Methanollösung und bei 320 und 280 nm (Absatz) in 0,1 N HCI-9O°/oiger Methanollösung,

d) kernmagnetisches Resonanzspektrum (F i g. 3):
das NMR-Spektrum deutet auf das Vorhandensein Daneben wurde gereinigtes AM-1042 in einer Mischung aus wasserfreier Essigsäure und Pyridin gelöst und anschließend stehen gelassen. Die so erhaltene Substanz dürfte ein Acetyl-Derivat von AM-1042 sein. Diese Substanz ergab einen Wert von m/e 626 durch Massenspektrometrie (C35H26N2O11). Von diesem Wert wurde ein zwei Acetylgruppen entsprechender Wert m/e 542 abgeleitet, welcher als Molekulargewicht von AM-1042 angenommen wurde und aus welchem eine Molekularformel C29H22N2O9 berechnet wurde. Allerdings gab es keinen Beweis für die Vorbedingung, daß m/e 626 tatsächlich dem Acetyl-Derivat von AM-1042 entspricht, wenn man einige Symptome berücksichtigt, welche das Vorhan-

densein anderer Nebenprodukte oder Zerfallprodukte vermuten läßt, welche bei der Herstellung des Acetyl-Derivates vermutlich angefallen sind.

Allerdings wurde eine gleichmäßige Stelle festgestellt, wenn gereinigtes AM-1042 der Dünnschicht-Chromatographie unterworfen wurde.

Aufgrund weiterer, nach dem Anmeldetag durchgeführter Untersuchungen ist zwischenzeitlich festgestellt worden, daß das erfindungsgemäße Antibiotikum AM-1042 die Moiekularformel C31H34N2O7 und vermutlich die nachstehende Struktur besitzt:

Unter den verschiedenen physikalischen und chemischen Merkmalen ist das UV-Absorptionsspektrum besonders hervorstechend, es läßt sich infolgedessen für die Identifizierung einsetzen. Verschiedene bekannte antibiotische Substanzen mit analogen Merkmalen wie AM-1042 wurden überprüft und es wurde festgestellt, daß z. B. Amicetin B (P. Sensi und andere, Antibiotics and Chemotnerapy, 7, 645 (1957) und Azomycin (E-Maeda und andere, J. Antibiotics, A6, 182, (1953)) Antibiotika sind, welche bei 315 nm eine Bande in der UV-Absorptionskurve haben.

Allerdings hat das Spektrum von Amicetin B zusätzlich zu einer Bande bei 321 nm eine weitere Bande bei 249 nm (in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0). Diese Banden werden nach 329 nm und 273 nm (Absatz) unter alkalischen Bedingungen und riach 311 nm und 257 nm unter sauren Bedingungen verschoben. Außerdem liegt in den Molekülen von Amicetin B eine Amid-Kupplung vor, weiche in den Molekülen von AM-1042 nicht vorhanden ist, welche bei der Rydcn-Smith-Colorreaktion negativ ist. Dadurch bestätigt sich, daß Amicetin B nicht mit AM-1042 identisch ist. Azomycin besitzt eine maximale Absorption bei 313—314 nm und seine reinen Kristalle sind weiß gefärbt. Allerdings ist Azomycin optisch inaktiv, d. h. es besitzt keine optische Drehung. Aus diesen Feststellungen ergibt sich, daß auch Azomycin nicht mit AM-1042 identisch ist,

Bekannte antibiotische Substanzen mit analogen Infrarot-Absorptionsspektren sind beispielsweise Manumycin (Pharmaccu. Acta Helvctiae, 38. 871-874 (1961) und Tetrahedron Letters (197J) 4995-4998). Allerdings zeigt Maiiumycin Ultraviolett-Absorptionsbandcn bei 281 nm (log. f. 4,6.3) und bei 325 ηm (log. f 4.59) sowie eine einheitliche optische Drehung von

[«]p= + 124° fc=0,528 in Äthanol) und -185° (c=Q,4 in Chloroform), Diese Merkmale sind ebenfalls nicht mit denen von AM-1042 identisch.

Das erfindungsgemäße Antibiotikum AM-1042 bzw. Asukamycin hat nachstehende biologische Merkmale. Dabei gibt Tabelle 1 die durch die Agar-Agar-Verdünnungsmethode bestimmte antibakterielle und antifungizide Aktivität von AM-1042 als Mindesthemmkonzentration MIC in mcg/ml an.

Tabelle 1

Testorganismus	MIC
	(mcg/ml)
Staphylococcus aureus FDA 209P*)	3,12
S. aureus FDA 209P JC-I*)	0,78
S. aureus FS-1277 (Penicillin-resistent)*)	6,25
S. aureus KB-64 (Tetracylin- und	6,25
Eiythromycin-resistent)*)
S. aibus*)	12p
Micrococcus flavus 16*)	1,56
Sarcina lutea PCI 1001*)	6,25
Bacillus subtilis PCI 219*)	3,12
B. subtilis ATCC 6633*)	6,25
B. subtilis NRRL B-553*)	100
B. cereus T*)	3,12
B. megaterium APF*)	6,25
B. anthracis*)	12,5
B. agri*)	12,5
Corynebacterium paurometabolum*)	1,56
Nocardia asteroides*)	1,56
Aerobacter aerogenes IAM 1183*)	100
Mycobacterium smegmatis ATCC 607*)	>100
Escherchia coli NlHJ*)	100
E. coli NIHJ JC-2*)	>100
E. coti B*)	>100
Klebsieila pneumomiae PCI 602*)	>100
Proteus vulgaris IFO 3163*)	>100
Salmonella typhimuirium*)	>100
Shigella sonnei B-33*)	>100
Pseudomonas aerginosa P-3*)	>100
Candida albicans**)	>100
Sacchromyces cerevisiae**)	>100
Aspergillus niger**)	>100
Cryptococ.cus neoformans**)	>100
Trichophyton mentagrophytes**)	25
Piricularia oryzae**)	>i00
Alternaria kikuchiana**)	>100
Fusarium oxysporum**)	>100
Xanthomonas oryza<j**)	>100
Sclerotinia cinerea**)	100
Botrytis cinerea**)	>;oo
Anmerkung:
*) Pepto" 0.5%: Heischextrakt 0.5%; Agar I	1.2% (pH "Ί»
37⁰C. 1« h.
**) KartofTelextraktmitGlucose 1.0% und Agar 1.2%(pH 6.8).
27°C. 72 h.

Wie Tabelle 1 zeigt, hemmte AM-1042 das Wachstum von grampositiven Bakterien innerhalb einer Konzentration von 0,78 bis 12,5 mcg/ml mit Ausnahme von Aerobacter aerogenes IAM 1183, Mycobacteritim smegmatis ATCC 607 und Bacillus subtilis NRRL B-558. während keine wahrnehmende Wirkung auf gramnegative Bakterien bei Konzentrationen unter 100 mcg/ml feststellbar war. Schwache antifungizide Aktivität wurde gegenüber Trichophyton mentaprophytes bei einer Konzentration von 25 mcg/ml festgestellt, während bei einer Konzentration von unter 100 mcg/ml keine bedeutsame Aktivität bezüglich anderer Fungizide feststellbar war.

Die akute Toxizitäi (LDi₀ ip.) von AM-1042 bei Mäusen, welche nach der Behrcns-Kärber-Methode berechnet wurde, betrug 48,5 mg/kg, doch wurden keinerlei Nebenwirkungen an Mäusen festgestellt, wenn Dosen von 450 mg/kg per os verabfolgt wurden. Infnlgprlp«pn Wann man AM-1042 als Medikament verwenden, um Infektionskrankheiten zu verhindern und zu behandeln, welche durch einen Parasiten der vorgenannten Mikroorganismen verursacht wurden.

Die Herstellung von AM-1042 bzw. Asukamycin ist mit den in Punkt g) des Anspruches 1 genannten Maßnahmen möglich.

Der in den nachstehenden Beispielen zur Erläuterung der Herstellung von AM-1042 verwendete AM-1042-Stamm (NRRL 8185) hat nachstehende mikrobiologische Merkmale:

I. Morphologische Merkmale

Ein weit verzweigtes Substrat-Mycelium wird reichlich auf den meisten Agar-Medien bis auf einige natürliche Medien ausgebildet. Die Sporenketten-Morphologie gehört zur Sektion Retinaculiaperti oder ; Spirales mit kurzen Ketten von Conidiosporen. Die Oberflächen der Sporen sind glatt, zeigen jedoch oftmals Knicke oder Falten; Sporangium. Sclerotium und Zoosporen werden nicht beobachtet. Die Sporen haben eine Abmessung von 0.5-0.8 μ χ 0,8- 1,0 μ. j

2. Kulturmerkmale in verschiedenen Medien

Die in nachstehender Tabelle 2 angegebenen Kulturmerkmale wurden nach einer Kulturzeit von 10 bis 14 Tagen bei 27°C beobachtet. ·<

Tabelle 2

(Es bedeuten: GR = Wachstum, RE = Rückseite.

AM = Luftpilz. SP = lösliches Pigment)

Medien:

Saccharose-Nitrat-Agar

GR: farblose

RE: schiefer-hellbraun (2 ig)

AM: schiefer-hellbraun (2 ig)

SP: ohnebiscreme-farbig(1'/2ca)
Glucose-Nitrat-Agar

GR: farblos

RE: senfbraun (2Ig)

AM: pulverig,schwach, schiefer-hellbraun (2 ig)

SP: senfgold (2 pg)
Giycerin-Calciummalat-Agar

GR: farblos

RE: maisgelb (2 ea) bis helles Senfbraun (2 ie)

AM: pulverig,beige(3 ge)

SP: honiggelb

Glucose-Asparagin-Agar (ISP) GR: farblos RE: senfbraun (2 ni) AM: schiefer-hellbraun(2 ig) SP: senfgold (2 pg) Glycerin-Asparagin-Agar (ISP) GR: farblos RF: honiggelt (2 ic)

bis zimtfarbig () Ie)

AM: pulveng, schiefer-hellbraun (2 ig) SP: goldbraun (3 pg) Stärke-anorganische Salze-Agar (ISP) GR: senfgolu(2 pg) oder senfbraun (2 pi) RE: senfgold (2 pg) oder

kupferbraun (2 pi) AM: schiefer-hellbraun (2 ig) SP: goldbraun (3 pg) Tyrosin-Agar(lSP) GR: leuchtend eelb (2 pa) RE: senffarben"(2 Ie) bis

leuchtend gelb (2 na) am Rande und gedecktes Braun (2 Ii) bis senfbraun (2 Ig) in der Mitte Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP) GR: farblos
RE: senfgold (2 pg) AM: ohne
SP- ohne
Glucose-Pepton-Agar GR: schwach, farblos RE: leicht amber(3 ic) AM: schwach.biskuit(2 ec) SP: senfgold (2 pg) bis

senfgold (4 Ie) Nähr-Agar

GR: biskuit (2 ec) RE: biskuit (2 ec) AM: ohne
SP: ohne

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar(ISP) GR: farblos
RE: senfbraun (2 Ig) AM: schiefer-hellbraun (2 ig) SP: goldbraun (3 pg) Hafermehl-Agar(ISP)

GR: farblos bis blaßgelb (P/2 ca) RE: leuchtend gelb (2 na) bis gedecktes Braun (2 ge) AM: pulverig, gedecktes Braun (2 ge) bis

golden (2 Ic) SP: honiggelb (2 ic) bis

golden (2 Ic)

Trypton- Hefeextraktbrühe GR: farblos
RE: -

AM: weiß bis schiefer-hellbraun (2 ig) SP: ohne

Anmerkung: Es wurde Bezug genommen auf Color Harmony Manual (1958) der Container Corp. of America. ISP = Medien, ausgewählt vom International Streptomyces Projekt.

3. Physiologische Merkmale

1) Wachstumstemperatur i 5 bis 4<r C

2) Bildung von Melanoidpigment

Trypton-Hefeextraktbrühe: negativ

Pepton-HefeextraktFJsenagar:
Tyrosiiiagar:

3) Verflüssigung von Gelatine:

4) Hydrolisiering von Stärke:

5) Koagulation von Magermilch:

6) Peptonisierung von Magermilch:

7) ^p,!dung von Schwefelwasserstoff:

8) Bildung von salpetriger Säure:

9) Hydrolisierung von Zellulose:

4. Assimilierbarkeit verschiedener
Kohlenstoffquellen

Durch Züchtung des Stammes im Pridham-Gottlieb-Medium ergaben sich nachstehende Resultate:

assimilierbar:

D-Giuiruse, D-Xyiu?>e, L-Rlutfiniuse,
mehr oder weniger assimilierbar:

D-Fructose, D-Raffinose. L-Arabinose,
nicht assimilierbar:

D-Mannit. Saccharose, I-Inosit.

Aus diesen Fakten ergibt sich, daß der Stamm eindeutig zum Genus Streptomyces gehört und dem Streptomyces nodosus (International J. Systematic Bacteriology, 8. 353 (1968)) entspricht, was im Hinblick auf verschiedene Stämme gefolgert werden kann, die in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th Ed. (197^ bzw. International |. of Systematic Bacteriology (1968 - 1972) beschrieben sind.

Verglichen mit dem ISP-Standardstamm von S. nodosus ergeben der vorliegende Stamm und S. nodosus farblose oder leicht gefärbte Erzeugnisse, graubraun gefärbte Aero-Mycelien und gelbes lösliches Pigment. Auch andere Merkmale sind fast dieselben wie bei S. nodosus, insbes., wenn die Züchtung in einem Medium aus Stärke und anorganischen Salzen erfolgt. Bezüglich der physiologischen Merkmale ist festzustellen, daß S. nodosus nicht-chromogen ist, negativ in der Bildung von Schwefelwasserstoff und positiv in der Bildung von salpetriger Säure und der Hydrolisierung von Stärke. Diese Merkmale entsprechen genau denen des vorliegenden Stammes. Andererseits ist die Assimilierbarkeit von Zuckern beider Stämme eindeutig verschiedenartig. So werden D-Mannit und I-Inosit durch S. nodosus assimiliert, nicht jedoch durch den Stamm NRRL 8185.

Aus diesem Vergleich erscheint es durchaus gerechtfertigt, den Stamm NRRL 8185 seiner morphologischen und physiologischen Eigenschaften wegen unter S. nodosus einzuordnen, während wegen der Unterschiede in der Assimilierbarkeit von Zuckern des Stammes sicherlich als Subspezies von S. nodosus zu klassifizieren ist Er wurde infolgedessen als »S. nodosus subsp. asukaensis« bezeichnet und als »S. nodosus subsp. AM-1042« bei der ARS Culture Collection, Peoria, USA, unter der Bezeichnung NRRL 8185 hinterlegt Man kann davon auch einen Mutationsstamm in üblicher Weise unter Verwendung von UV-Strahlen, Röntgenstrahlen, anderer Strahlung, Chemikalien und dergleichen erhalten. Ein Mutationsstamm, welcher durch Behandlung von UV-Strahlen in üblicher Weise hergestellt wurde, zeigt eine ausgezeichnete Produktivität von AM-1042 und wurde bei der ARS Culture Collection, Peoria, USA, als »S. nodosus subsp. AM-1042-16« (NRRL 11070) hinterlegt Die AM-1042-erzeugenden Stämme, weiche in den nachstehenden

negativ Beispielen verwendet werden, können AM-1042 in den

negativ Kuluirbrühen bzw. sowohl in der Kulturflüssigkeit wie

positiv in den Körpern sammeln.

positiv Für das Herstellungsverfahren kann irgendein syn-

vermutl. > thetischesoder organisches Medium verwendet werden, positiv wenn es eine geeignete Kohlenstoffquelle, Stickstoff-

positiv quelle, anorganische Substanzen und erforderlichenfalls

negativ verschiedene andere Nährstoffe enthält, welche herpositiv kömmlicherweise zur Züchtung verschiedener Mikroor-

vermutl. io ganismen verwendet werden, die zum Genus Streptopositiv myces gehören. Als Kohlenstoffquelle wird zweckmäßig

Glucose. Maltose, Lactose, Saccharose, Stärke, Dextrin, Glycerin und Melasse verwendet. Die am besten verwendeten Stickstoffquellen sind Sojabohnenmehl, ι ϊ Getreidemaische, Baumwollsaatkuchen, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt. Hefe. Kaseiii-Hydrolysat, Ammoniumsalze und Nitrate. Als anorganische Substanzen können beispielsweise verschiedene Phosphate und Magnesiumsulfat verwendet werden. Man kann auch verschiedene übliche Salze von Kalzium, Natrium, Eisen und Mangan verwenden.

Zur Herstellung einer großen Menge von AM-1042 wird zweckmäßig ein flüssiges Medium verwendet, wenn auch ein lestes Medium brauchbar ist. Es ist 2ϊ möglich, ein Zuchtmedium mi; gleicher Zusammensetzung wie das Hauptkulturmedium zu verwenden und am besten werden die Zuchtkeime durch Fermentierung erhalten, welche aerob bei einer Temperatur von etwa 27°C während eines oder zweier Tage z. B. in einer Sakaguchi-Flasche durchgeführt wird. Die Fermentierung wird unter Schütteln bei einer Temperatur zwischen 15 und 40"C (zweckmäßig zwischen 25 bis 3O⁰C) bei einem pH-Wert von 6 bis 10 (zweckmäßig zwischen 6 und ß) während etwa 2 bis 8 Tagen (zweckmäßig zwischen 70 und 150 h) durchgeführt, wobei eine große Menge an AM-1042 gleichzeitig im Medium und in der Mikrobensubstanz angesammelt wird. Nach Abschluß der Fermentierung wird AM-1042 aus den Kulu'.rbrühen isoliert. Beispielsweise werden die Brühen in die Mikrobensubstanz und das Filtrat getrennt, wenn es auch möglich ist, AM-1042 ohne Trennung der Kulturbrühen zu gewinnen. Wie die vorbeschriebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften zeigen, ist AM-1042 in Fett löslich, so daß AM-1042 bzw. Asukamycin dadurch zurückgewonnen werden kann, daß eine herkömmiicherweise zur Rückgewinnung verschiedener antibiotischer Substanzen dieser Art geeignete Methode, wie beispielsweise die Lösungsmittelextraktionsmethode, angewendet wird. Beispielsweise werden die Kulturbrühen in Feststoffe und Flüssigkeit in herkömmlicher Weise durch Filtern, Zentrifugieren oder dgl. getrennt. Die flüssige Phase, d. h. das Filtrat, wird auf einen sauren pH-Wert von am besten 2 bis 4 mit HCl oder dgl. eingestellt und wird dann mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Äthylacetat oder Butylacetat, extrahiert Andererseits ist es auch möglich, die Säuerung fortzulassen. Der auf diese Weise erhaltene Extrakt wird bis zur Trockenheit konzentriert und das getrocknete Material wird mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie beispielsweise Äthyläther, gewaschen, um fettige Unreinheiten, zu entfernen, woraufhin es dann in einem Lösungsmittel, wie beispielsweise Chloroform, gelöst wird, um die Unreinheiten weiter zu entfernen. Anschließend ergibt eine Säulen-Chromatographie auf Kieselgel mit einem Chloroform-Methanol-System die AM-1042 enthaltenden aktiven Fraktionen, weiche unter vermindertem

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Druck kombiniert und bis zur Trockenheit konzentriert werden, wobei gelblich-orange Rohpulver entstehen. Diese Rohpulver werden in einer kleinen Menge des Chloroform-Methanol-Systems gelöst, aus welchem AM-1042 in Form von Nadelkristallen blaßgelblicher Färbung rekristallisiert wird. Das auf diese Weise erhaltene AM-1042 wird in herkömmlicher Weise, beispielsweise unter Verwendung von Bacillus subtilis als Test-Mikroorganismus, untersucht.

Gegenstand der Erfindung ist insoweit auch das Verfahren gemäß Anspruch 2.

Wenn auch AM-1042 in bezug auf Staphylococcus aureus, Sarcina lutea, Bacillus cereus, Nocardia asteroides usw. aktiv ist, hat sich herausgestellt, daß AM-1042 eine antibiotische Substanz ist, welche aktiv ist gegen Kokzidiose bei Geflügel. Kokzidiose ist eine Infektionskrankheit, welche durch bestimmte Sporentierchen der Ordnung Coccidia verursacht wird und zu Durchfall und Unterernährung bei z. B. Geflügel führt. Diese Infektionskrankheit ist bei Küken und anderem Geflügel weit verbreitet und findet sich auch bei Truthähnen, Hunden, Katzen und anderen Tieren.

Infolge der Notwendigkeit, Kokzidiose zu verhindern, wurden bereits zahlreiche Versuche unternommen, um verschiedene Wirkstoffe zu entwickeln, welche als wirksamen Bestandteil beispielsweise Arsenikverbindungen, Nitrofuran, Bisphenol, Sulfamin, Thiacinderivate, Chinolinderivate, Pyridinderivate und dgl. enthalten. Derartige bekannte Wirkstoffe sind jedoch einerseits nicht wirksam genug und einige Sporozoa-Arten wurden sogar gegenüber diesen bekannten Wirkstoffen gegen Kokzidiose resistent. Flavomycin ist nach bisherigen Erkenntnissen gegenüber Kokzidiose bei Tieren unwirksam.

Es wurde festgestellt, daß AM-1042 bzw. Asukamycin äußerst wirksam ist gegen Kokzidiose. So ist beispielsweise AM-1042 äußerst wirksam bei der Herabsetzung der Sterblichkeit von Küken, welche mit Eimeria tenella infiziert wurden. Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Mittel zur Verhinderung ( = Vorbeugung) von Kokzidiose bei Geflügel, nämlich das gemäß Anspruch 3, welches AM-1042 als aktiven Bestandteil enthält.

Zur Verhinderung von Kokzidiose kann man AM-1042 in flüssiger Form verabfolgen. Andererseits ist es auch möglich, AM-1042 der Nahrung zuzusetzen. Die Menge der zu verabfolgenden Dosen kann je nach der Art sowie den Symptomen der Kokzidiose, dem Alter des zu behandelnden Geflügels und verschiedenen anderen Umständen schwanken. Zweckmäßig wird jedoch AM-1042 vor der Beigabe der Nahrung selbst oder zu einem oder mehreren Bestandteilen derselben verdünnt. Wenn AM-1042 durch Vermischung mit der Nahrung oder dessen Bestandteilen vor der Verabfolgung verdünnt wird, erfolgt diese Verdünnung am besten durch Hafermehl, Weizenmehl, Roggenmehl, Maismehl, Sojabohnenmehl, Sojabohnenkuchen, Rapssaatkuchen, entfettete oder nicht entfettete Reiskleie, Stärke von irischen Kartoffeln, Sojaschrot, Hefe, Fischmehl oder Rückstand von Fermentierungsbrühen. Es ist auch möglich, einer derartigen Nahrung Vitamine, Minerale, Antiseptika, enzymhaltige Präparate, Proteine, Kohlehydrate, Aminosäuren. Antifiebermittel, Sedative, antiphlogistische Mittel. Germicide und verschiedene andere Substanzen zuzusetzen. Wenn auch die Dosierung von AM-1042 zur Verhinderung und zur Heilung von Kokzidiose bei Geflügel je nach den verschiedenen Umständen schwankt, so knnn man AM-1042 in einer Menge zwischen 0,003 bis 0,03 Gew.-% der Nahrung zusetzen. Eine typische Dosierung der Nähr mg für Küken zeigt nachstehende Tabelle 3. Da durch Fermentierung hergestelltes AM-1042 sowohl in der Mikrobensubstanz wie im Filtrat der Kulturbrühen enthalten ist, läßt sich AM-1042 auch in Form von Rohpulvern verwenden, bevor diese gereinigt werden, oder auch in der Form getrockneter Brühen oder getrockneter Mikrobensubstanzen.

Tabelle 3	15	I	Nahrungsmenge	(g/Tag)	Eiern
Alter in Wochen	2		für Küken zur Produktion von	5
	20 J	Fleisch	14
4	15
5	23	30
6	41	36
25 7	53	46
8	60	53
9	66	55
10	79	59
jo Il	93	63
12	101	66
13	111	70
14	-	75
35 15	-	79
	-	85
-
-

Bei einem besonders guten Durchführungsbeispiel wurde AM-1042 durch Zusatz von Sojabohnenmehl, entfettete oder nicht entfettete Reiskleie und Kalziumcarbonai auf eine Konzentration von '/2 bis V200 verdünnt und diese Mischung dann der Nahrung beigegeben, so daß die in vorstehender Tabelle angegebene Konzentration von AM-1042 erreicht wurde.

Durch Verabfolgung des erfindungsgemäßen Mittels läßt sich Kokzidiose bei Geflügel, wie Küken oder Truthähnen, ohne jegliche Nebenwirkungen verhindern. Verschiedene Versuche ergaben, daß AM-1042 nicht nur wirksam gegen Eimeria tenella, selbst wenn eine Resistenz gegenüber verschiedenen chemischen Wirkstoffen, wie beispielsweise Amprolium (HCl), Clopidol und Robenidin (HCl) vorliegt, sondern auch gegenüber anderen Protoctoa-Arten, welche zur Eimeria gehören, wie beispielsweise E. necatrix, E. acerculina, E. brunetti und Eimeria maxima (Amprolium = internationaler Freiname für l-[(4-Amino-2-propyl-5-pyrimidinyl)methyl]-2-methyIpyridinchlorid; Clopidol = internationaler Freiname für 3^-Dichlor-2,6-dimethyl-4-pyridinol; Robenidin= internationaler Freiname für 1 j-Bis[(p-chlorbenzyliden)aminoj-guanidin).

Die Erfindung wird nachstehend anhand einiger Beispiele weiter erläutert

Beispiel 1

Ein Zuchtmedium (pH 7,0; 100 ml), welches Glucose (0,1%), Stärke (2,4%), Pepton (03%), Fleischextrakt (03%), Hefeextrakt (0,5%) und Kaliziumcarbonat (0,4%) enthielt, wurde als Keimmedium in eine 500 ml

Sakagdchi-Flasche gefüllt. Mit einer Piatinschlinge wurde von einer Schrägkultur Streptomyces nodosus subsp. NRRL 8185 entnommen und damit das Keimmedium geimpft, welches dann bei einer Temperatur von 27⁰C 48 h lang unter Schütteln gezüchtet wurde. Mit den auf diese Weise erhaltenen Zuchtkeimen wurde ein Hauptkulturmedium in einem 30 I Fermentierungsstandgefäß, weiches Dextrin (2,0%), Glucose (0,2%), Sojabohnenmehl (1,5%), Hefeextrakt (0.3%) und Kaliumcarbonat (0,3%) enthielt, geimpft. Die Fermentierung wurde bei einer Temperatur von 27°C während 96 h unter Schütteln (250 U/min) und Belüftung (10 l/min) durchgeführt. Beide Medien wurden bei einer Temperatur von 120°C 20 min lang vor Verwendung sterilisiert. Na~h Abschluß der Fermentierung wurden die Mikrobensubstanzen von den Kulturbrühen durch Zentrifugieren entfernt. Das Filtrat (15 1) wurde auf einen pH-Wert 3,0 mittels 6 N-Salzsäure eingestellt, mit Äthylacetat (51) versetzt und während I h bei Kaumtemperatur extrahiert. Die Lösung wurde nochmals in gleicher Weise extrahiert. Die Äthylacetat-Schicht wurde abgenommen und unter vermindertem Druck bis zur Trockenheit konzentriert, wobei sich gelb-oranges Pulver (4,3 g) ergab, welches mit 200 ml Äthyläther gewaschen wurde, um fettige Unreinigkeiten zu entfernen, woraufhin es an einer kalten Stelle eine Nacht lang stehengelassen wurde. Anschließend wurde die Lösung zur Entfernung unlöslicher Substanzen gefiltert und unter vermindertem Druck bis zur Trockenheit konzentriert. Das getrocknete Material wurde in eine Säule übergeführt, welche mit Kieselgel (54 g) gefüllt war, und mit einem Lösungssystem von Chloroform-Meihanol (1,5 I; 60 : 1 v/v) entwickelt. Das Eluat wurde in Einzelfraktionen von jeweils 10 ml aufgefangen. Jede Fraktion wurde dann quantitativ durch Bioversuche unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI 209 bestimmt, wobei man auch mit einem Rf-Wert von 0,56 rechnete, welcher durch eine Dünnschicht-Chromatographie unter Verwendung eines Lösungssystems von Chloroform-Methanol (60 : 1) erhalten wurde. Fraktionen Nr. 111 bis 150 wurden als aktive Fraktionen vereinigt und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei ein gelbes Pulver (350 mg) entstand. Die Pulver wurden in einer geringen Menge (5 ml) einer Mischung aus Chloroform und Methanol (95 :5) gelöst und dann über Nacht an einer kühlen Stelle aufbewahrt, wodurch blaß-gelbe Nadelkristalle (300 mg) mit einem Reinheitsgrad von mehr als 99% und folgenden Merkmalen entstanden:

Schmelzpunkt:

185 bis 190° C (zerfallen)
Spezifische Rotation:

[α]*³ = +175bis 184° (c=0,5inCHCl₃)
UV-Absorptionsspektrum:

90% Methanol: 315 nm und 265 nm (Absatz)
IR-Absorptionsspektrum durch KBr-Methode:

charakteristisch starke Absorption bei 3330 — 3340, 2925,2850,1660,1600und 1365 cm-'.

Beispiel 2

Streptomyces nodosus subsp. NRRL 8185 wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 1 gezüchtet Auch die nachfolgende Behandlung wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 1 mit nachstehenden Ausnahmen durchgeführt Das Filtrai mit einem eingestellten pH-Wert wurde durch zweimaligen Zusatz von Butylacetat (jeweils 61) extrahiert und dann getrocknet, *^robei sich gelblich-orange Pulver (5,5 g) ergaben, welche dann in Chloroform (400 ml) gelöst wurden. Die Säulen-Chromatographie wurde 'inter Verwendung von Kieselgel (65 g) u.id einrs Lösongssystems aus Benzol-Aceton

■■> (2,5 I: "> : I v/v) durchgeführt, wobei sich die Einzelfraktionen von jeweils 15 ml ergaben. Die Fraktionen Nr. 111 bis 150 wurden zu einer aktiven Fraktion vereinigt. Die auf diese Weise erhaltenen gelblich-orangen Pulver (480 mg) wurden in einer Mischung von

in Äthylacetat und Methanol (5 ml insgesamt; 95:5) gelöst. Die schließlich erhaltenen gelblich-orangen Nadelkristalle (360 mg) hatten einen Reinheitsgrad von mehr als 99%. Die das Produkt identifizierenden Eigenschaften waren die gleichen wie im Beispiel I.

B e i s ρ i c I 3

Ein Kulturmedium (pH 7,0: 100 ml), welches Glucose (2%). Sojabohnenmehl (2%) und Tafelsalz (0,2%) enthielt, wurde in eine 500 ml Sakaguchi-I lasche gefüllt

2u und bei einer lemperatur von 120"CJ 20 min lang sterilisiert. Dieses Medium wurde als Keimmedium verwendet und mit Streptomyces nodosus suhsp. NRRL 11070 geimpf!, um anschließend mit einer Temperatur von 27°C 24 h unter Schütteln gezüchtet zu werden. Mi..

2ϊ diesen Keimen wurde dann ein Hauptkulturmedium (pH 7,0; 20 I) geimpft, welches sich in einer 30 I Fcrmentierungs-Standflasche befand. Dieses Hauptkulturmedium enthielt 2% Glycerin, 2Vb Sojabohnenmehl und 0,2% Tafelsalz und wurde bei einer Temperatur von I2O^CC

in 20 min lang vor Verwendung sterilisiert. Die Fermentierung erfolgte bei einer Temperatur von 27⁰C während einer Zeitspanne von 72 h unter Schütteln (250 U/min) und Belüftung (10 i/rnin). Nach Abschluß der Fermentierung wurde die Mikrobensubstanz nicht von der

si Kulturbrühe getrennt, vielmehr wurde diese im Ganzen mit 201 Äthylacetat versetzt. Nach Extraktion bei Raumtemperatur während 1 h unter Umrühren, wurde die Äthvlacetat-Schicht (15 1) durch Zentrifugieren getrennt und unter vermindertem Druck getrocknet.

4n Das auf diese Weise erhaltene gelblich-orange Pulver (25.8 g) wurde dann mit Äthyläther (500 ml) gewaschen, um fettige Unreinheiten zu entfernen und dann in Chloroform (500 ml) gelöst. Anschließend wurde die Chloroformschicht unter vermindertem Druck ,.: f eine Menge von 20 ml konzentriert. Dieses Konzentrat wurde in eine mit Kieselgel (200 g) gefüllte Säule übertragen und mit einem Lösungssystem von Chloroform-Methanol (31; 60:1 v/v) entwickelt. Das Eluat wurde in die Einzelfraktionen von jeweils 20 ml geteilt.

Jede Fraktion wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 1 untersucht. Die Fraktionen 91 bis 150 wurden zusammengefaßt und unter vermindertem Druck getrocknet. Die Trockenmasse (12 g) wurde in einer geringen Menge (20 ml) einer Mischung aus Chloroform und Methanol (95 : 5 v/v) gelöst und über Nacht an einer kühlen Stelle stehengelassen, wobei gelbe Nadelkristalle (10 g) mit einem Reinheitsgrad von mehr als 99% entstanden.

Die Identifikationsmerkmale des Produktes waren die gleichen wie bei dem Produkt in Beispiel 1.

Beispiel 4

Sieben Tage alte Küken wurden in einige Gruppen

aufgeteilt und von 48 h nach der Geburt bis 2 Tage vor Beginn des Versuches mit einer Nahrung gefüttert, welche 0,1% eines Arzneimittels (Sulfadimethoxin) zur Verhinderung der Infektion mit Kokzidiose enthielt

Die Küken eier verschiedenen TesteruDDen wurden

mit einer Nahrung gefüttert, welche die abgelagerten Oocysten von Eimeria tenella K-2 (resistent gegenüber Amprolium, Clopidol und Robenidin) enthielt

Die verwendet Nahrung bestand aus 67% Gelbkorn, 14% Sojapulven 15% Fischmehl, 3% Alfalfa, 0,25% Tafelsalz, 0,25% einer Vitaminmischung, 0,05% einer Mineralmischung, 0,1% Arginin, 0,15% Natriumpropionat und 0,1% Äthoxyquin (=internationaler Freiname für 6-Äthoxy-l,2-dihydro-2^,4-trimethylchinolin). Die der Nahrung zugesetzten Anti-Kokzidiose-Wirkstoffe zeigt nachstehende Tabelle. Jedes Küken erhielt täglich im Durchschnitt 17 g dieser Nahrung. 140 Küken wurden in Gruppen von jeweils 10 Küken aufgeteilt 7 Tage nach der Fütterung mit der die Oocysten (2, SxIO⁴) enthaltenden Nahrung wurde das Gewicht eines jeden Kükens gemessen und wurden alle Küken getötet sowie seziert

Tabelle 4 Ausmaß der krankhaften Veränderung des Blinddarms

(- = ohne; + = leicht; ++ = mittelstark; +++ = schwer)

Anü-Kokzidiose Wirkstoff	Konzen tration	Krankhafte Veränderung des Blinddarms (Anzahl der Küken)	2	2	10	Über lebensrate
AM 1042	0,03		4	5	10	100
	0,02		4	3	10	Ί00
	0,015		2	1	8	100
	0,01		4		3	100
	0,0075					100
	0,005	3	5 2			90
	0,00375	5		2		90
Amprolium (Hydrochlorid)	0,025 0,0125	8 10				70 40
Clopidol	0,025	6			70
	0,0125	10		50
Robenidin (Hydrochlorid)	0,0066 0,0033	3 8	100 80

Ohne

0,0000

10 50

Beispiel 5

In gleicher Weise wie im Beispiel 4 wurde eine Behandlung durchgeführt, mit Ausnahme dessen, daß eine Mischung von abgelagerten Oocysten von Eimeria tenella K-2 (2^xIO⁴), E. acervulina (1,Ox 10⁵) und E maxima (l,0x 10*) geimpft wurde. Die Resultate zeigt

Tabelle 5

nachstehende Tabelle 5, wobei die Zunahmerate des Körpergewichtes (RIW) wie folgt berechnet wurde.

RlW (%) = durchschnittliche Gewichtszunahme der Testküken am Schluß des Testes/Durch-

Schnittsgewicht der unbehandelten Küken χ 100%.

Gruppe

Konzentration von AM-1042

Krankhafte Veränderungen des Blinddarms

RIW

Überlebensrate

Test-1 0,02

Test-2 0,015

Test-3 0,01

Test-4 0,0075

Test-5 0,005

Kontrolle-!*) 0,00

Kontrolle-2 0,00 ¹^) - nicht geimpft.

Die Absorptionsspektren von AM-1042 sind in den beiliegenden Zeichnungen wiedergegeben; es zeigt F i g. 1 das UV-Absorptionsspektrum.

100,2	100
101,5	100
100,8	100
99,9	100
98,7	90
100,0	100
87,6	45

F i g. 2 das IR-Absorptionsspektrum und F i g. 3 das NMR-Absorptionsspektrum.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche;

1. Antibiotikum AM-1042, dadurch gekennzeichnet, daß es in gereinigter kristalliner Form

a) zusammengesetzt ist im wesentlichen aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauer- e) stoff,

b) ein UV-Absorptions-Spektrum mit charakteristischen Absorptionen bei 315 nm und 265 nm (Absatz) in 90%igem Methanol hat, f)

c) eine spezifische Drehung

M ²D⁰ = +175 bis 184°; (c=0£ in CHCl₃) zeigt,

d) sein mit der Kßr-Methode gemessenes IR-Absorptions-Spektrum charakteristische Absorptionen bei 3330-3340, 2925, 2850, 1660, 1600 g) und 1365 cm-' aufweist,

e) seine Reaktion nach der Rydon-Smtth-Farbreaktion negativ ist,

f) sein Molekulargewicht (gemessen nach der Rast-Methode) 520 bis 580 beträgt, und

g) es erhältlich ist durch aerobes Züchten von Streptomyces nodosus subsp. NRRL 8185 oder NRRL 11070 zwischen 15 und 40⁰C und bei pH 6 bis 10, Filtrieren der Kulturbrühe, Extrahieren des Filtrats mit Äthylacetat oder Butylacetat, h) Konzentrieren des Extraktes bis zur Trockenheit, Waschen des Extraktes mit einem Fettlösungsmittel, anschließendes Lösen in Chloroform, Chromatographieren auf Kieselgel mit Chloroform/Methanol 60 :1 (v/v) bzw. Benzol/ Aceton 3 :1 (v/v), Konzentrieren der aktiven Fraktionen unter vermindertem Druck bis zur Trockene, Lösen in einer kleinen Menge des Chloroform/Methancrf-SysOms bzw. in einer Mischung von Äthylacetat und Methanol 95 :5 und Rekristallisieren daraus.