DE2431270C2 - Antibiotische Substanz, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung dieser antibiotischen Substanz als wachstumsförderndes Mittel - Google Patents

Antibiotische Substanz, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung dieser antibiotischen Substanz als wachstumsförderndes Mittel

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DE2431270C2
DE2431270C2 DE2431270A DE2431270A DE2431270C2 DE 2431270 C2 DE2431270 C2 DE 2431270C2 DE 2431270 A DE2431270 A DE 2431270A DE 2431270 A DE2431270 A DE 2431270A DE 2431270 C2 DE2431270 C2 DE 2431270C2
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Description

257 rau (H2O), 245 mp. (0,1 n-HCl) und 258 (0,1 n-NaOH).
E 1* = 142 (H3O), 93 (0,1 n-HCl) und 144 (0,1 n-NaOH),
pKa-Wert 4,37,
unterscheidbare Banden im Infrarot-Absorptionsspektrum (in KBr): 3500, 2980, 1740, 1650, 1565, 1410, 1390, 1340, i240, 1080, 1050, 975, 950, 890, 860, 825, S05, 760,
leichUös'lich in Wasser, löslich in Methanol und n-Butanol, wenig löslich in Aceton, Chloroform und
positive Tollens-Reaklion, vorgetäuscht positive Elson-Morgan-Reaktion, negative Ninhydrin-, Benediet-, Biuret-, Bial-, Ferichlorid- und Anthron-Reaktion,
Rf-Werte von 0,74 und 0,25 bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose und Silicagel in n-Propanol-2n NH4OH (7:3),
und erhältlich durch aerobes, 96 bis 240-stündiges Züchten von Streptomyces lividoclavatus DSMI 2534 bei 25 bis 3O0C in einen üblichen Nährmedium und Gewinnen des Pholipomycins aus der Kulturbruhe.
2 Verfahren zur Herstellung der antibiotisch wirksamen Substanz Pholipomycin gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß lan Streptomyces lividoclavatus DSM 2534 aerob 96 bis 240 Stunden bei 25 bis 300C in einem üblichen Nährmedium züchtet und die antibiotisch wirksame Substanz aus der Kultur-
™. Verwendung der antibiotisch wirksamen Substanz Pholipomycin gemäß Anspruch 1 als Wirkstoff in wachstumsfördernden Mitteln Tür Tiere,
I
Die Erfindung betrifft die Gegenstände der Patentansprüche 1 bis 3. „ , . ...
Es wurde gefunden, daß die neue antibiolisch wirksame Substanz, Pholipomycin, in einer Kulturbruhe von Streptomyces lividoclavatus DSM 2534 gebildet wird, der aus einer in Obana, Tochigi Prefecture, Japan gewonnenen Erdprobe isoliert wurde und daß die so erhaltene neue antibiotische Substanz einen hochwirksamen wachstumsfördernden Effekt auf verschiedene Tiere zeigt, wie Nutztiere, Geflügel, Haustiere und dergleichen. Bisher wurden einige antibiotisch wirksame Substanzen, wie Chloramphenicol, Aureomycin und dergleichen Tieren verabreicht, um eine prophylaktische Behandlung verschiedener Krankheiten, beispielsweise bei Nutztieren Genüget und dergleichen, gleichzeitig mit einer Verbesserung der Mästung, einer Wachstumsforderung und einer Erhöhung der Futterauswertungsrate zu erreichen. Es hat sich jedoch gezeigt, daß diese bisher verwendeten Antibiotika einige Nachteile aufweisen, da sie Neigung haben, in tierischen Produkten, wie Eiern, Fleisch und dergleichen zurückzubleiben und daß Mikroorganismen auftraten, die resistent gegen diese Arzneimittel sind Unter diesen Umständen bestand auf diesem Fachgebiet ein ernsthaftes Bedürfnis nach der Entwicklung eines neuen Arzneimittels, das weniger stark aus dem Gastrointestinaltrakt der Tiere absorbiert wird Die erfindungsgemäß aufgefundene antibiotisch wirksame Substanz ist außerordentlich wertvoll, da es sich gezeigt hat daß sie bei oraler Verabreichung weniger stark in den inneren Organen absorbiert wird. Gegenüber |
Moenomyern besitzt sie den Vorteil, daß sie auch gegenüber gramnegativen Bakterien aurreichend wirksam ist *
(vgl gutachtlich »The Journal of Antibiotics«. Dezember 1977, Seiten 1060 bis 1063).
Der erfindungsgemüß verwendete Pholipomycin bildende Stamm Streptomyces lividoclavatus DSM 25J4 hat folgende morphologische Eigenschaften: j
1 Bei Betrachtung unter dem Mikroskop zeigt sich, daß das Luftmyzel gut verzweigt ist und langgestreckte Lufthyphen aufweist. Die Lufthyphen sind sympodisch verzweigt, es werden jedoch keine Spiralen und Konidienkettcn beobachtet. Die Sporen sind kugelig bis elliptisch und haben eine Größe von 0,6 h"=
0 8 x 0 8 bis I Iu. Die Sporcnobcrflachc ist glatt. Die Sporenketten enthalten 10 bis 50 Sporen pro bporcnk'ctlc und sind durch kurze und am Ende verdickte Scilcn/.wcige gekennzeichnet, die aus 2 bis 3 Sporen Kobildct sind Es bilden sich kcincGcißelsporcn und kein Sporangium und die Sporophoren bclindcn sich
gebildet
auf dem Luflmyzcl.
2. In Tabelle 1 sind die Ergebnisse gezeigt, die bei der Züchtung auf verschiedenen Kukturmedien erhalten wurden. Die Beobachtung erfolgte nach zweiwöchiger Züchtung bei 28° C, wenn nichts anderes angegeben ist.
Tabelle 1
Medium Wachstum Luftmyzel Substratmyzel Rückseite lösliches Pigment
Saccharose- mäßig spärlich, weiß spärlich, weiß weiß keines
Nitrat-Agar
Glucose- gut spärlich, spärlich, weiß bläulich-grau keines
Asparagin-Agar b'iäulich-grau
Glycerin- gut spärlich,- reichlich, dunkel-orange keines
Asparagin-Agar bläulich-grau dunkel-orange
Anorganische gut mäßig, mäßig blaßgelblich- keines
Salze-Stärke- bläulich-grau blaßgelblich- braun
Agar braun
Tyrosinagar gut spärlich, mäßig, hellbräunlich- spf.:,ich,
bläul'ch-gr&u hellbräunlich- grau bräunibh-grau
grau
Nähragar- gut spärlich, weiß spärlich. blaßgelblich- Keines
medium blaßgelblich- braun
braun
Hefeextrakt- reichlich reichlich, reichlich, hellbräunlich- keines
Malzextrakt- bläulich-grau hellbräunlich- grau
Agar grau
Hafermehl- mäßig mäßig. reichlich. blaßbraun keines
agar blaßgelblich- blaßgelblich-
orange orange
3. Die physiologischen Eigenschaften des Stammes DSM 2534 sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
Temperaturbereich für das Wachstum: Gelatine-Verflüssigung (18° C): Stärkehydrolyse:
Koagulation von Milch: Peptonisierung von Milch: Melaninbildung:
Nitratreduktion:
10 bis 37° C
s- hwach
schwach
25° C, -
25° C, + (pH 6,4)
+ (in Tyrosin-Agar-Medium)
- (in Peplon-Hefeextrakt-Eisen-Agar-Medium)
- (in Triptone-Bacto-Hefeextrakt-Brühe)
4. DasTchemader Ausnutzung von Kohlcnstoffquellen des Stammes DSM 2534 auf Pridham-Gottlieb-Agarmedium ist in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
L-Arabinose
D-Xylose
D-Glucose
D-Fruclose
Saccharose
Inosit
L-Rhamnose
Raffinose
D-Mannit
Aus der Gesamtheit der vorstehend angegebenen Eigenschaften zeigt sich, da'i der Stamm DSM 2534 der Gattung Streptomyces angehört, dessen Luftmyzel sympoaisch verzweigt ist und aul den meisten Medien bläulichgrau ist. Auch sind sciii Sporen kugelig bis elliptisch und die Sporenoberfläche ist glatt. Die am stärksten ausgeprägten Eigenschaften sind speziell darin zu sehen, daß er Sporenketten mit kurzen und am Ende verdicktsn Sp.itenzweißen aufweist, die zwei bis drei Sporen bilden.
Die Überprüfung von bekannten Stämmen mit den vorstehenden Eigenschaften zeigte, daß als nächstverwandte Art im Hinblick auf die Sporenbildung Streptomyces clavuligerus zu erwähnen ist, die in dem International Journal ofSyslcmatic Bacteriology, Band 21, Nr. 4, Seite 326 bis 331 (1971) beschrieben ist. Diese bekannte Art unterscheidet sich jedoch darin grundlegend von dem Stamm DSM 2534, dall die bekannte Art rechteckige bis zylindrische Sporen aufweist und dal3 ihr Luftmyzel auf vielen Medien blaßgelblich-grün ist und darin, daß sie Kohlensloffquellcn, wie D-Glucose, D-Fructosc, Saccharose, L-Rhamnose, Raffinose und dergleichen, niccht verwertet. Aus den vorstehenden Verglcichsvcrsuchen kann klar abgeleitet werden, daß sich der erfindungsgemäße Stamm deutlich von Streptomyces ckivuligerus unterscheidet
Aufgrund der vorstehend beschriebenen Kennzeichen wurde der Stamm I)SM 2534 als neue Art identifiziert und als Streptomyces lividoclavatus Stamm DSM 2514 bezeichnet.
Die Züchtung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann nach der allgemein für Streptomyces angewendeten Methode durchgerührt werden. Günstig ist eine Schüttelkultur oder Submerskultur in einem flüssigen Medium.
Als Bestandteile des Mediums können beliebige der gut bekannten Nährstoffe für Streptomyces verwendet werden So können beispielsweise als assimilierbare Kohlenstoffquelle Glucose, Glycerin, Maltose, Dextrin, Starke. Lactose, Saccharose, Messen. Sojahohnenöl. Baumwollsamenöl und dergleichen und als assimilierbare Stickstoffquelle Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Baumwollsamenmehl, Fischmehl, Korn-bzw. Maisquellwasser, Pepton, Fleischextrakt, Hefe, Hefeextrakt, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat und dergleichen verwendet werden. Als anorganisches Salz können Natriumchlorid, Phosphate, Calciumcarbonat und dergleichen eingesetzt werden. Erforderlichenfalls können auch Spurenmengen eines Metallsalzes zugesetzt werden.
Bei der Durchführung der Züchtung in flüssiger Phase unter Belüftung und Rühren kann ein Antischaummittel, beispielsweise Silikonöl, Pflanzenöle, oberflächenaktive Mittel und dergleichen verwendet werden.
Der pH-Wert des Mediums wird auf einen Wert im neutralen Bareich oder in der Nähe des neutralen Bereiches engestellt und die Züchtungstemperatur beträgt 25 bis 30°C insbesonders 27°C.
Die Veränderung der Aktivität des Pholipomycins kann mit HiRe der bekannten Zylinderabdruck-Testmethode unter Verwendung von Staphylococcus aureus 209P als Test-Mikroorganismus bestimmt werden. Die maximale Produktion von Pholipomycin wird während 96- bis 240stündiger Züchtung erreicht.
Pholipomycin kann aus der Kulturbrühe mit Hilfe verschiedener Methoden gewonnen werden, die auf dem Fachgebiet der Gewinnung antibiotischer Substanzen gut bekannt sind. So wird beispielsweise nach Beendigung der Züchtung die Kulturbrühe durch Zugabe einer geeigneten Säure angesäuert, mit einem Filterhilfsmittel, wie Diatomeenerde und dergleichen, filtriert, wobei Myzel und sonstige feste Masse gewonnen werden, die Diatomeenerde enthält, in welcher Pholipomycin aufgrund seiner ziemlich geringen Löslichkeit in Wasser unter sauren Bedingungen enthalten ist, und die so gewonnene Masse wird mit einem wassermischbaren Lösungsmittel, wie beispielsweise Aceton, Methanol oder einem Gemisch solcher Lösungsmittel extrahiert, um das gewünschte Pholipomycin zu gewinnen.
Andererseits kann das Pholipomycin, das in dem Filtrat der Kulturbrühe oder der Restflüssigkeit vorliegt, die nach der Destillation des organischen Lösungsmittels aus dem Myzelextrakt erhalten wird, durch Extraktion ma einem wasserunmischbaren organischen Lösungsmittel, wie n-Butanol, unter sauren Bedingungen gewonnen werden
Der so erhaltene Pholipomycin enthaltende Extrakt wird der Destillation unter vermindertem Druck unterworfen, durch eine Schicht eines Anionenaustauscherharzes geleitet, so daß Pholipomycin aufgrund seiner ihm eigenen Acidität adsorbiert wird, und danach kann das adsorbierte Pholipomycin mit Hilfe eines geeigneten Elutionsmi'ttels eluiert werden In einigen Fällen kann der Extrakt durch eine Schicht eines Kationenaustauscherharzes geleitet werden, um basische Verunreinigungen zu entfernen.
Als Beispiele Tür Anionenaustauscherharze können stark basische Anionenaustauscherharze genannt werden, wie Dowex IxI und dergleichen; zweckmäßig werden jedoch schwach basische Anionenaustauscherharze verwendet, wie Duolite A-2
Zu Beispielen für geeignete Kationenaustauscherharze gehören stark saure Kationenaustauscherharze, beispielsweise Dowex 50W x 4, Amberlile IR-120 und dergleichen.
Zur weiteren Reinigung von Pholipomycin kann die Chromatographie unter Verwendung von Silicage!, mikrokristalliner Cellulose, Diäthyiaminoäthylcellulose und dergleichen durchgerührt werden.
Ferner kann Pholipomycin gereinigt werden durch Dialyse zur Entfernung niedrigmolekularer Verunreinigungen im Hinblick auf die Tatsache, daß Pholipomycin selbst eine hochmolekuiare Substanz ist, durch Gelfiltration mit Sephadex G-50 und dergleichen.
Die wässerige Lösung, die das so extrahierte und gereinigte Pholipomycin enthält, wird danach konzentriert und gefriergetrocknet, oder zu der Lösung wird ein wassermischbarcs organisches Lösungsmittel, wie Aceton und dergleichen, zugesetzt, um die gewünschte antibiotische Substanz auszufällen, wobei reines Pholipomycin in Form eines weißen Pulvers erhalten wird.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Pholipomycin werden nachstehend angegeben.
_ 1. Aussehen:
Weißes Pulver
2. Schmelzpunkt:
allmähliche Braunverfärbung bei 2500C oder darüber.
3. Elementaranalyse:
C 50.15% H : 7,14% N : 5,48% P: 2,33%.
A. Molekulargewicht:
5100, festgestellt durch die üelfillralionsmethode unter Verwendung von Scphadex G-100 in einer 0,05 m PhosphatpulTerlösung vom pH-Wert 7,0.
5. Spezifische Drehung
Ia]2J1'= +6,0° (C= 1,H2O)
6. Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
Die Werte der Absorptionsmaxima sind in F i g. 1 gezeigt und die entsprechenden Werte von Ej.™ sind in Tabelle 4 angegeben.
Tabelle 4
Lösungsmittel
Absorptionsmuxima
0,1 n-HCl
0,1 n-NaOH
257 142
245 93
258 144
7. Infrarot-Absorptionsspektrum:
Das IR-Spektrum ist in Fig. 2 gezeigt (gemessen im KBr-Preßling).
8. Neutralität, Basizität oder Acidität: Es handelt sich um eine saure Substanz (pKa = 4,37; 9,43 H2O)
9. Löslichkeit:
Leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol und n-Butanol, wenig löslich in Aceton, Chloroform und 'Äther.
ΙΟ. Farbreaktion:
Zeigt positive Tollens-Reaktion. Vorgetäuscht positive Elson-Morgan-Reaktion. Negativ gegenüber der Ninhydrin-, Benedict-, Biuret-, Bial-, Ferrichlorid- und Anthron-Reaktion. Beim Erhitzen mit Pyridin wird eine positive Ninhydrin-Reaktion erhalten.
11. Stabilität:
Die wässerige Lösung istaußerordenllich stabil bei pH 4 bis 10. Beim Erhitzen der wässerigen Lösung von Phöiipornycin in einer Konzentration von 2OQ »g/m! während 30 Minuten auf 6O0C bleibt bei einem pH-Wert von 6 bis 8 die Aktivität unverändert bei 100% und selbst bei pH 4 und 6 bleibt eine Aktivität von 90% erhalten.
12. Dünnschichtchromatographie:
Durch Dünnschichtchromatographie (aufsteigende Methode) unter Verwendung einer Cellulose-Chromatographieplatte 6065 und mit Hilfe einer Silicagel-beschichteten Platte (Silicagel Chromatogram 6060 betragen die Rf-Werte 0,74 bzw. 0,25 in n-Propanol/2n NH4OH (7:3). Als Nachweismethode wird die Bioautographie mit Staphilococcus aureus 209P oder eine UV-Absorptionsmethode verwendet.
Die biologische Aktivität von Pholipomycin wird nachstehend aufgezeigt.
1. Antimikrobielles Spektrum.
Die inhibierenden Mindestkonzentrationen gegenüber verschiedenen Mikroorganismen sind in Tabelle 5 angegeben.
Tabelle 5
Testorganismus
Inhibierende Mindestkonzentration,
MlC fog/ml)
Medium A Medium B
Staphylococcus aureus 209P JC-2 S. aureus 56 (mehrfach resistent) S. aureus 193 (mehrfach resistent)
Bacillus subtilis PCI 219 Sarcina lutea PCI 1001 Corynebacterium xerosis B 58-3 Escherichia coli NIHJ JC-2 E. coli K-12
0,39 0,09
0,39 0,19
0,39 0,19
50 0,09
>100 12,5
>100 100
50 25
12,5 12,5
Fortsetzung
Testorganismus
Inhibierende Mindestkonzentration, MIC teg/ml)
Medium A Medium B
E. coli (.ST-resistent) Pseudomonas aeruginosa B-I-1 P. Sp. SC-8328 Proteus vulgaris B-30-8 Klebsieila pneumonia PCI 602 Aeromonas liquefaciens Y-62 Mycobacterium smegmalis ATCC 607
25 25
3,12 0,78
100 25
0,78 3,12
25 12,5
0,78 0,39
50 _
Medium ι
Candida albicans YU-1200 Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 Trichophyton mentagrophytes F 63-9 Fusarim moniliforme IAM 5062 Piricularia oryzae IAM 5087
> 100
> 100
> 100
> 100
> 100
Medium A: Nähragar mit 1% Glycerin Medium B: Herzinfusion-Agar Medium C: Dextrose-Agar nach Sabouraud
Züchtung: Die MIC wurde nach 24-stündiger Inkubation bei 37°C bei Bakterien (48 Stunden bei Mycobacterium smegmatis) und nach 48stündiger Inkubation bei 28°C bei Hefen und Fungi bestimmt.
2. Toxizität:
Der Wert LD50 von Pholipomycin bei der Maus bei Verabreichung durch intravenöse Injektion beträgt 600 bis 800 mg/kg. Beim Test der Fischtoxizitäi mit Kiiiifisch in einem Bad mit 200 ppm Phoiipornycin wurde keine abnormale Erscheinung beobachtet.
3. Schützende Aktivität:
Es wurde festgestellt, daß Pholipomycin Wirksamkeit bei einem mit Staphylococcus aureus an der Maus durchgeführten Schutztest zeigt. Dabei wurden im einzelnen Mäuse des RFVL-Stammes mit einem Durchschnittskörpergewicht von etwa 20 g in Gruppen, die aus je 5 Tieren bestanden, mit Staphylococcus aureus Nr. 42, einem mehrfach resistenten Stamm, in einer Menge von 1 X 107 Zellen pro Maus inokuliert und Pholipomycin wurde subkutan in einer sterilen Natriumchloridlösung in Dosen von 50,100 und 200 mg/kg verabreicht. Die Verabreichung erfolgte zweimal, nämlich unmittelbar nach der Inokulation und 4 Stunden nach der Inokulation. Die Anzahl der überlebenden Mäuse betrug 0,1 bzw. 5.
Wie aus den vorstehenden Angaben 1. bis 3. ersichtlich ist, zeigt Pholipomycin starke antibakterielle Aktivität gegen grampositive und gram-negative Bakterien und ist insbesondere hochwirksam gegen verschiedene resistente Mikroorganismen und zeigt extrem geringe Toxizität. Das erfindungsgemäße Antibiotikum ist daher auch wertvoll als Arzneimittel für den Menschen.
Durch die Ergebnisse von Untersuchungen von bekannten Antibiotika, die die vorstehend beschriebenen physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften zeigen, wurde bestätigt, daß das erfindungsgemäße Pholipomycin wahrscheinlich nahe verwandt mit Antibiotika ist, wie Macarbomycin, Diumycin A und Moenomycin.
Es ist jedoch zu betonen, daß das erfindungsgemäße Antibiotikum Pholipomycin sich von den vorstehend genannten bekannten Antibiotika in den nachstehend genannter. Punkten unterscheidet.
1. Physikalisch-chemische Eigenschaften
Ein Vergleich der physikalisch-chemischen Eigenschaften von Pholipomycin und den vorstehend genannten, bekannten antibiotischen Substanzen wird in Tabelle 6 gegeben.
Tabelle 6
Eigenschaften Fholipomycin Moenomycin 65 AC
Macarbomycin
Diumycin A
F. (Zers.)
2500C
190 bis 200
251 bis 257
Fortsetzung
Eigenschaften Pholipomycin Moenomycin
A C
Macarbomycin
Diumycin
A
An-.lyse (%) H-O -NH4 + 48,6 49,1 -Na
C 0,1 n-NaOH 50,15 - 7,2 7,4 43,7
H 0,1 n-HCI 7,14 - 5,3 5,3 7,1
N Wh 5,48 0,53 1,8 1,7 5,7
P 2,33 C70H124N6 C75H135N; 1,9
Empinsche Glucosamin C50-6S O40P O42P
Formel Chinovosamin Hgs-i 11 -
Glucose N5.5O2s.35P
I 11/
\J ν
DC*) ηνμ z\\m 258 106
257 142 258 106
258 144 246 78
245 93
+ 6,0°(C=l
H2O) + +
+ + +
+ + +
0,61 0,73 +
-NH4 + -Na 7N5
47,35 + 48,65 Na8P
7,25 0,43 5,42 n-KOH
4,90 4,00 120
2,12 1,91 78
Co8-79 C68-72
H|2S-144 H93-]0 '(C=I
N6-7O41-48P O38-40 H2O)
258 0,1
- 259 120 257
246 70 246
-247
+ 15°(C=1 + 8,0c
MeOH)
+
+
0,39
*) EtOH-COnCNHj-H2O (8:1:1)
Viermalige Mehrrachentwicklung auf einer Silicagelchromatographieplatte 6060
Wie aus Tabelle 6 ersichtlich ist, unterscheidet sich Pholipomycin deutlich von Macarbomycin, Diumycin A und Moenomycinen dadurch, daß Pholipomycin keine Glucose als Konstitutions-Zucker enthält, während alle bekannten Antibiotika Glucose als Zucker in ihrer Konstitution enthalten. In anderer Hinsicht ist es jedoch den bekannten Antibiotika ähnlich. Die Analyse der in der Konstitution vorhandenen Zucker erfolgt durch Hydrolyse jeder antibiotjschen Substanz in 2 n-Chlorwasserstoffsäure bei 1050C während 3 Stunden und anschließende Papierchromatographie des Hydrolysats (n-ButanoI-Pyridin-Wasser 6:4:3, absteigende Methode, 20 Stunden).
Als andere bekannte Antibiotika, von denen angenommen wird, daß sie dem erfindungsgemäßen Pholipomycin ähnlich sind, sind Prasinomycine A, B und C, Mocnomycine E, F, G und H, Diumycin B, 19402RP, 8036RP, 11837RP und dergleichen zu nennen. Diese Antibiotika unterscheiden sich jedoch in mehrerer Hinsicht deutlich von Phoüpomycin. So sind im einzelnen die Prasinomycine in Chloroform löslich, das Antibiotikum 19402RP enthält ein Schwefelatom und andere zeigen im UV-Spektrum kein Absorptionsmaxima und unterscheiden sich dadurch deutlich von Pholipomycin.
Vergleichstests der antibakteriellen Aktivität.
Die Aktivität jedes Antibiotikums wurde mit Hilfe der Zylinderabdruck-Methode unter Verwendung von 12,5, 50 bzw. 200 μξ/χη\ des Antibiotikums in m/15 Phosphatpuffer vom pH 7,0 geprüft. Die prozentuale Aktivität wurde unter Verwendung von Pholipomycin als Standard-Antibiotikum berechnet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefaßt.
Tabelle 7
Pholipomycin
Macarbomycin
Diumycin
Moenomycin
(A +C)
S.aureus 209P 100
E. coli NIHJ 100
P. aeruginosa B-I-1 100
164 16,2 35,7
99,3
11,6
27,7
131
37,0
48,3
Wie aus Tabelle 7 ersichtlich ist, unterscheidet sich Pholipomycin von den vorstehend envähnten antibiotischen Susbtanzen. die ähnliche physikalisch-chenv'jche Eigenschaften haben, im Hinblick auf die antibakte-
Helle Aktivität und das antibakterielle Spektrum. So hat speziell Pbolipomycin die charakteristische Eigenschaft einer starken antibakteriellen Aktivität gegen gramnegative Bakterien.
Aus den Vergleichsuntersuchungen, der vorstehend angegebenen pysikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften ist leicht zu schließen, daß das erfindungsgemäße Antibiotikum Pholipomycin klar unterscheidbar oder verschieden ist von anderen bekannten antibiotischen Substanzen und daher eine neue antibiotische Substanz darstellt.
Die vorstehend genannten antibiotischen Substanzen sind in nachstehend aufgeführten Literatursteilen beschrieben·
1. Moenomycin A, C, D, E, F, G und H:
Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1965, S. 734 bis 736 und 737 bis 742 (1966) und
Journal of Antibiotics, 22, S. 12, S. 597 bis 602 (1969).
2. Macarbomycin:
Journal of Antibiotics, 23, S. 1, 48 bis 50 (1970).
3. D'vmycin A und B:
Journal of Antibiotics, 22, S. 10, 490 bis 493 (1969).
4. 19402 RP:
NL-OS 6802093 (1968).
5. Prasinomycin A. B und C:
Nature, 213, S. 1092 bis 1094 (1967).
6. 8036RP:
Südafrikan. PS 65/6204 (1966).
7. 11837RP:
Abstract, The 9th International Congress for Microbiology, 165 (1966).
25
Die Herstellung von Pholipomycin wird nachstehend anhand einiger Beispiele beschrieben.
Beispiel 1
Es wurde ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung verwendet:
Glucose 2,0% Fleischextrakt 0,5%
Stärke 1,0% Calciumcarbonat 0,3%
Bäckerhefe 0,9% Natriumchlorid 0,5%
Polypepton 0,5%
Auf dem vorstehend angegebenen Medium wurde eine Impfkultur des Stammes DSM 2534 während 24 Stunden in einem Tank mit einem Volumen von 1001 gezüchtet. Mit je 301 der so erhaltenen Impfkultur wurden zwei Fermentationstanks mit einem Fassungsvermögen von 600 1 angeimpft, die 300 1 des vorstehenden Mediums enthielten (pH 7,2 vor der Sterilisation). Die Züchtung erfolgte bei einer Temperatur von 28 ± 1°C, 150 Upm und einer Belüftung von 300 l/Minute. Nach 114 Stunden wurde die maximale Bildung von Pholipomycin erreicht.
640 I der so erhaltenen Kulturbrühe wurden mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4v0 eingestellt, dann wurden 40 kg Diatomeenerde zugesetzt und die Filtration erfolgte mit Hilfe einer Filterpresse.
Zu dem mit Diatomenerde vermischten Myzelkuchen wurden 300 1 wasserfreies Aceton zugegeben, wobei eine Acetonkonzentration von 80% erzielt wurde. Auf diese Weise wurde Pholipomycin extrahiert. Der Extraktionsrückstand wurde mit Hilfe einer Filterpresse abgetrennt und erneut mit 300 1 80%igem wäßrigem Aceton extrahiert. 5801 der kombinierten Extrakte (Pholipomycingehalt 57,8 g) wurden unter vermindertem Druck auf 60 I konzentriert und nach dem Abdestillieren des Acetons wurde der pH-Wert des Rückstandes mit Schwefelsäure auf 2.5 eingestellt und der Rückstand wurde zweimal 35 !-Anteilen n-Butanol extrahiert.
Der erhaltene Extrakt (56 I) wurde zweimal mit 37,5 I-Anteilen 0,1 η wäßrigem Ammoniak extrahiert, wobei PholiDomycin in die wäßrig-ammoniakalische Phase übergeführt wurde.
Der so erhaltene Extrakt (79 I) wurde unter vermindertem Druck auf 1,19 1 konzentriert (Pholipomycingehalt S5 22.6 g, Ausbeute 39,1%).
Das so erhaltene Konzentrat wurde an einer Säule adsorbiert, die mit 3 1 Duolite-A-2 (OH-Form) gefüllt war, und, nach dem Waschen mit 6 1 Wasser, wurde Pholipomycin mit 0,1 η wäßrigem Ammoniak extrahiert.
25.5 I des so erhaltenen aktiven Eluats wurden unter vermindertem Druck auf 1,62 1 konzentriert. Dieser Anteil wurde dann gefriergetrocknet, wobei 26,2 g Pholipomycin als rohe pulverförmige Substanz erhalten wurden. Die Reinheit betrug 50,0%, die Ausbeute 22,6%.
Beispiel 2
Es wurde ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung verwendet:
Glucose 4 % NaIl,PO< I 7H3O 0,0.5 %
Fleischextrakt 0,2% MgSO4 71I2O 0,01 %
Sojabohncnmchl 1,5% MnSO., 0,002%
-7H2O 0,002% 24 31 270 0,002%
ZnSO4 -7H2O 0,002% Na2MoO4 ■ 2H2O 0,002%
FeSO4 -7H2O 0,002% CoSO4 · 7H2O 0,1 %
CuSO4 6H2O 0,002% Baumwollsamenöl 0,002%
AlCI3 · Antischaummittel
151 des vorstehend beschriebenen Mediums (pH 7,0 vor der Sterilisation) wurden in einen Fermenter mit 301 Fassungsvermögen gegeben, der Inhalt wurde bei 1200C während 30 Minuten sterilisiert und dann abgekühlt Danach wurden 50 ml der Impfkultur vom Stamm DSM 2534, die auf 500 ml des vorstehend beschriebenen Mediums in einem Erlenmayer-Kolben mit 2-1-Fassungsvermögen während 72 Stunden bei 28°C unter Schütteln auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung gezüchtet worden war, in den Fermenter eingeimpft und die Züchtung erfolgte bei einer Temperatur von 28 ± 1° C, unter Belüftung mit 20 l/Minute, bei 135 Upm und einem Innendruck von 1,1 kg/cm2. Nach 240 Stunden wurde die maximale Bildung von Pholipomycin von 150 ug/ml erreicht.
Die aus 3 Fermentern erhaltene kombinierte Kulturbrühe von 40 1 wurde mit Diatomeenerde als Filterhilfsmittel filtriert und mit dem gleichen Volumen Wasser gewaschen.
8,5 kg des mit Diatomeenerde erhaltenen Myzelkuchens wurden dreimal mit 75%igem wäßrigem Methanol extrahiert, wobei 36 1 Extrakt erhalten wurden.
Der Extrakt wurde durch eine Kolonne geleitet, die mit 1,91 Dowex 50W4 (H*-Form) gefüllt war. Die Kolonne wurde dann mit 70%igern wäßrigem Methanol gewaschen, wobei ein Gesamtvolumen von 40 1 der kombinierten Flüssigkeiten erhalten wurde. Die so erhaltene Flüssigkeit wurde durch eine mit 21 Duolite-A-2 (Essigsäureform) gefüllte Kolonne geleitet, wobei Pholipomycin an der Kolonne adsorbiert wurde. Die Kolonne wvrde dann mit 2 170%igem wäßrigem Methanol und anschließend mit 2 1 Wasser gewaschen und dann mit 0,5 η wäßrigem Ammoniak eluiert.
2,49 1 des aktiven Eluats (Aktivitätsausbeute 58,5%) wurden unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft und unlösliche Verunreinigungen wurden durch Zugabe von Methanol entfernt.
84 ml der in Methanol löslichen Fraktionen wurden tropfenweise in 2 1 Aceton gegeben, um Pholipomycin auszufallen.
Der so erhaltene Niederschlag wurde gewonnen und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 12,7g Pho-Jipomycin in Form einer pulverförmigen Rohsubstanz (Reinheit 27,1%, Ausbeute 56,0%) erhalten wurden.
Das rohe Pulver wurde in Methanol gelöst, die resultierende Lösung wurde an einer mit 160 ml Silicagel gefüllten Säule (Wakogel C-200) in Chloroform-Methanol (6 : 4) adsorbiert. Verunreinigungen wurden mit 3 ! Chloroform-Methanol (6 : 4) entfernt und Pholipomycin wurde dann mit Chloroform-Methanol (5 : 5) eluiert. Die Aktivität der Eluate wurde durch Dünnschichtchromatographie überwacht, wobei 4 1 der Fraktionen mit einem geringeren Gehalt an Verunreinigungen gewonnen wurden, die dann zur Trockene eingedampft wurden. Dabei wurden 2,07 g Pholipomycin in Form eines rohen Pulvers erhalten (Reinheit 75,8%, Ausbeute 25,6%). Die so erhaltene rohe pulverformige Substanz wurde in 9 ml Wasser gelöst und an einer Säule adsorbiert, die mit 200 ml DEAE-Cellulose (OH -Form) gefüllt war. Nach dem Waschen mit 11 wäßrigem Ammoniak vom pH 9 wurde Jie Elution mit 0,01 η wäßrigem Ammoniak durchgeführt, wobei 1,06 1 der aktiven Fraktionen gewonnen wurden, die jeweils einen einzigen Flecken im Dünnschichtchromatogramm ergaben. Die vereinigten Fraktionen wurden unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 955 mg Pholipomycin einer Reinheit von 97,0% erhalten wurden. Die Ausbeute betrug 15,1%. Das Produkt wurde in 5 ml Methanol unter Erhitzen gelöst und die resultierende Lösung wurde abgekühlt. Der Niederschlag wurde abgetrennt und getrocknet, wobei 474 mg reines Pholipomycin erhalten wurden. Ausbeute 7,7%.
Das Pholipomycin. das mit Hilfe des vorstehend beschriebenen Verfahrens hergestellt werden kann, eignet sich als wachstumsförderndes Mittel fur Tiere.
Wie vorstehend erläutert wurde, zeigt Pholipomycin starke antibakterielle Xktivität gegen Bakterien und Brauchbarkeit zum Verhindern und zur Behandlung von Krankheiten bei Tieren, die durch solche Bakterien verursacht werden. Von größerer Bedeutung ist außerdem die Tatsache, daß Pholipomycin in wirksamer Weise zum /weck der Wachstumsförderung verschiedener Tiere verwendet werden kann. Speziell wenn Pholipomycin Tieren oral verabreicht wird, kann das Wachstum von Tieren stark gefördert werden, wahrend extrem geringe Absorption aus dem Gastrointestinaltrakt und geringe Rückstandsbildung in tierischen Geweben beobachtet wenlen Hs wird angenommen, daß diese Tatsache das last vollständige Fehlen von Pholipomycin in tierischen Produkten anzeigt, wie in Eiern, Fleisch unü dergleichen, wodurch ein großer Vorteil im Hinblick auf die Nahrungsmittelhygiene erzielt werden kann
Unter der Bezeichnung »Wachstumsförderung von Tieren« wird eine Erhöhung der Körpergewichtszunahme, eine Verbesserung der Rate des futterumsatzes und eine Erhöhung der Eierlegeleistung und dergleichen verstanden
Tiere, aufweiche die Erfindung angewendet werden kann und denen das erfindungsgemäße Pholipomycin verabreicht werden kann, sind beispielsweise Nutztiere, wie Rinder, Pferde, Schweine, Sehale, Ziegen und dergleichen, Geflügel, wie Hühner, Truthühner, Enten und dergleichen, Haustiere, wie Hunde, Katzen, kleine Vögel und dergleichen.
Die Verabreichung von Pholipomycin erfolgt am besten aur oralem Weg; Pholipomycin kann jedoch auch im Gemisch mit einem Futtermittel oder mit Trinkwasser verabreicht werden. Am zweckmäßigsten erfolgt die Verabreichung von Pholipomycin im Gemisch mit einem Futtermittel. Wenn Pholipomycin als Futtermittelzusatz verwendet werden soll, kann es dem Futter für sich oder in Kombination mit einem Exzipienten oder Streckmitttel niederer Toxizität, mit einem Nahrungsmittel-Zusatzstoff, wie Vitaminen, Mineralstoffen, Aminosäuren und dergleichen, einer antibiotischen Substanz, wie Macarbomycin, Moenomycinen und dergleichen,
einem Antikokzidiosemittel, wie Beciothiamin, Amprolium, Buquinolat, Clopidol Q.S-^ pyridinol) und dergleichen, oder einem Enzym, wie Lysozym und dergleichen, zugemischt werden.
Als wachstumsförderndes Mittel kann Pholipomycin nicht nur in gereinigter Form, sondern auch in Form des gezüchteten Myzels selbst oder in roher Form verwendet werden, wie sie in jeder beliebigen Stufe während der Extraktion und Reinigung der Substanz erhalten wird.
Die Menge des dem Futter einzuverleibenden Pholipomycins beträgt 0,1 bis 10 ppm, bezogen auf das Futter, Wasser oder eine andere Grundlage, die verabreicht werden soll, und die vorstehend angegebene Menge zeigt auch nach langer Dauer der Verabreichung keine nachteilige Wirkung auf die Tiere.
Der überragende wachstumsfördernde Effekt, der erfindungsgemäß erzielt wird, wird nachstehend ausführlicher anhand der Beispiele 3 bis 6 erläutert.
Beispiel 3 Wirkung auf das Wachstum von Fleischhühnern (Hühnerhaus; Floor-pen-test).
1. Küken:
Männliche und weibliche junge Küken eines Fleischhühnerstammes (GOTO 606) wurden in Gruppen von je 15 Küken verwendet Nach dem Ausbrüten wurde ein einzelnes Küken mit einem Flügelband gewogen.
2. Futtermittel: _ _
Die Hauptbestandteile des verwendeten Futtermittels sind in iabeiie S zusäffiuicugeiaut ioS ist zu uoachten, daß das Futter weder wachstumsfördernde Mittel noch antibiotische Substanzen enthält
Tabelle
Gelder Mais 56,98%
Fischmehl 10,00%
Sojabohnenmehl 24,00%
Qualitätstalg 5,00%
Airalfamehl 1,00%
Mineralstoffe*) 2,17%
Vita .in A 20 OOOIE/kg
Vitamin Dj 4 OOOICE/kg
Vitamin E 100IE/kg
Andere Vitamine**) 0,16%
Methionin 0,30%
Lysin 0,20%
Ethoxyquin (Antioxydationsmittel) 10 ppm
Becloihiamine (Antikokzidiosemittel) 100 ppm
Clopidol (Antikokzidiosemittel) 100 ppm
•l Mineralstoffe (in I kg des Futters)
CaC C), «.0 g
CaIIPO1 2M1O 6.n g
Na(I s.O g
KII2PO4 2.0 g
MnSC), 55 mg
MgSO4 500 mg
KJ 0.53 mg
FEC,H,O, HjO 80 mg
CuSO4 5HiO 4 mg
5ZnO 2COj 4H)O 50 mg
Co(Ij 61I;O 0.30 mg
·*) Andere Vitamine (in I kg des Futters)
Vitamin Bi 2.5 mg
Vitamin B> 5.5 mg
Ca-Pantothenat 9.3 mg
Niacin 27.0 mg
Vitamin B6 6,7 mg
Biotin 0,09 mg
Cholinchlorid 1000 mg
Inosit 500 mg
Folsäure 0,55 mg
Vitamin K| 0,53 mg
Vitamin Bn 0,01 mg
Konzentration des zuzusetzenden Pholipomycins:
Dem Futtermittel wurden 2,5 ppm Pholipomycin einer Reinheit von 58,3% einverleibt. Eine Vergleichsprobe ohne Zusatz von Pholipomycin wurde gesondert hergestellt.
10
4. Testmethode:
Junge Küken wurden auf ihren Gesundheitszustand untersucht und gesunde Küken wurden gewogen. Die Küken wurden in mehrere Testgruppen unterteilt, die keinen Unterschied im durchschnittlichen Körpergewicht zeigten und ständig mit einer Starterration für Fleischhühner während eines Monats gefüttert. Jede Gruppe bestand aus 30 Küken und die Küken wurden frei mit dem Futtermittel und Trinkwasser gefuttert Das Körpergewicht der Küken wurde jede Woche bestimmt und die Futtennittelaufhahme wurde stets dann gemessen, wenn neues Futter zugeteilt wurde.
5. Auswertung und Testergebnisse:
Der durch das erfindungsgemäße Pholipomycin erzielte Effekt wurde aus der Zunahme des Körpergewichts und der Futterumsatzrate ausgewertet
Körpergewichtszunahme (g) = End-Körpergewicht - Anfangs-KÖrpergewicht
Futterumsatzrate = Gesamt-Futteraufnahme
Gesamt-Körpergewicht
Dk. Testergebnisse sind in Tabelle 9 zusammengefaßt
Tabelle 9
Pholipomycin-Gruppe Kontroll? Tippe
Durchschnittliches Anfangs-Körpergcwicht (g) 39,0 ± 2,4*) 39,1 ± 2,6*}
Durchschnittliche Körpergewichtszunahme (g) 560,6 ± 67,2*) 529,4 ± 62,5*) ^
Futter-Umsatzrate 1,77 1,92
*) Standardabweichung
Wie aus Tabelle 9 ersichtlich ist, wird bei der Pholipomycingruppe im Vergleich mit der Kontrollgruppe der Effekt einer erhöhten Körpergewichtszunahme und einer verbesserten Futterumsatzrate beobachtet.
Beispiel 4
Wirkung auf das Wachstum von Fleischhühnern (Batterietest).
Der Versuch wurde im wesentlichen nach den gleichen Verfahrensweisen und unter den gleichen Bedingungen wie in dem vorstehenden Beispiel durchgeführt, mit der Ausnahme, daß eine Käfig-Mästung durchgerührt wurde. Dabei wurden die in Tabelle 10 angegebenen Testergebnisse erhalten. Die Käfig-Mästung wurcie dur;hgeführt, in :em die Hühnchen in einem Brüter gehalten wurden, der mit einem elektrisch geheizten Drahtboden ausgestattet war, und kontinuierlich während 4 Wochen gefüttert wurden.
Tabelle 10
Pholipomycin-Gruppe Kontrollgruppe
45
Durchschnittliches Anfangs-Körpergewicht (g) 37,6 ± 1,7*) 37,5 ± 2,1*)
Durchschnittliche Körpergewichtszunahme (g) 490,6 ± 66,5*) 460,2 ± 56,5*) ·
Futter-Umsatzrate 1,61 1,65
*) Siandardabweichung
Beispiel 5
Wirkung auf das Wachstum von Fleischhühnern (Feldtest).
1. Hühnchen:
Es wurden Hühnchen der französischen Spezies Studier verwendet, wobei jede Gruppe aus 100 Hühnchen ohne Trennung nach dem Geschlecht bestand. Nach dem Ausbrüten wu«le ein einzelnes Küken mit einem Flügelband gewogen.
2. Futtermittel: Es wurde eine handelsübliche Futtermittelration verwendet, die keine wachstumsfördernden Mittel und keine Antibiotika enthielt.
3. Konzentration des zuzumischenden Pholipomycins:
2,5 ppm vor Pholipomycin einer Reinheit von 50% wurden dem Futtermittel einverleibt. Gesondert wurde eine Vergleichsprobe ohne Zusatz von Pholipomvcin hergestellt.
4. Testmethode:
In einemBrütcr vom Regenschirmtyp, der sich mit Propangas beheizen ließ, wurden Küken bis zum Alter von 2 Wochen aufgezogen und dann kontinuierlich bis zum Alter von 8 Wochen. Das Futter und das Trink-
wasser wurden frei angeboten und während der Testperiode wurden in üblicher Weise die Impfung mit Geflügelpocken-Vakzine und Vakzine gegen die Newcastle-Krankheit durchgeführt.
5. Auswertung und Testergebnisse:
Die Auswertung erfolgte in gleicher Weise wie im vorstehenden Beispiel 3. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 zusammengefaßt, in der die Bezeichnung Lebensfähigkeit (%) folgende Bedeutung hat:
Anzahl der beim abschließenden Wiegen nach dem anfänglichen Wiegen
überlebenden Küken inn
Anzahl der ursprünglich verwendeten Küken
Tabelle 11
Pholipomycin-Gruppe
Kontrollgruppe
41,0 1869 ± 333*)
1989 ± 269*) 2 ,68
2,32 94
99
Durchschnittliches Anfangs-Körpergewicht (g) Durchschnittliche Körpergewichtszunahme (g) Futter-Umsatzrate Lebensfähigkeit (%)
*) Slandardabwcichung
Wie aus Tabelle 11 ersichtlich ist, wird mit Hilfe des erfindunpsgemäßen Zusatzes nicht nur eine Verbesserung der Körpergewichtszunahme und der Futterumsatzrate erreicht, sondern die Aufzuchtrate wird stark verbessert.
Beispiel 6
Wirkung auf das Wachstum von Schweinen (Feldtest).
Schweine einer ersten Kreuzung (Hump X Rand) wurden in einem Alter von 32 Tagen nach ihrer Geburt in zwei Gruppen unterteilt (Pholipomycin-Gruppe und Kontrollgruppe), wobei die Schweine jeder Gruppe ungefähr gleiches Durchschnittsgewicht und gleiche Zahl haben. Jede Gruppe bestand aus 8 Schweinen. Die angewendete Dosierung von Pholipomycin (in ppm) hatte folgende Werte:
Zeitraum mit synth.
Milch
Futter für die Schweine
Kontrollgruppe Pholipomycin-Gruppe
Als Futter wurde ein handelsübliches Futtermittel verwendet, das frei von wachstumsfördernden Mitteln oder Antibiotika war.
Das Körpergewicht der Schweine wurde zu einem festgelegten Zeitpunkt alle 15 Tage ausgewogen und die Futteraufnahme wurde in gleicher Weise gemessen.
Ergebnisse: Die Testerge'onisse sind nachstehend zusammengefaßt:
1. Änderung des durchschnittlichen Körpergewichts
Wochen
Zeitraum der Fütterung mit synthetischer Milch
anfänglich 2
Mästung (erster Abschnitt)
6 8 10
Vergleichsgrupp e 8,5 14,6 19,6 25,3 33,0 48,9
Pholipomycin-Gruppe 8,4 14,4 20,5 26,9 35,1 52,2
24 31 2. Zunahme des Körpergewichts 270 Index Gew.- Index
Zunahme
I 13 5 I
Zeit der Fütterung
mit synthetischer Milch
100 34,7 100 Zeichnungen 40 1
Gew.- Index
Zunahme
107 37,4 108 10 45 I
Vergleichsgruppe 11,1 100 50 I
i
Pholipomycin-Gruppe 12,1 109 Mästung (erster Abschnitt) Gesamtzeitraum Mästung (erster Abschnitt) 15
3. Futteraufnahme und Futterumsatzrate Gew.-
Zunuhmc
Aufnahme Futterumsatz 55 I
S
Abschnitt der Fütterung
mit synthetischer Milch
23,6 23,6 3,2 20 60 j
25,3 25,3 2,9 I
Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß Phoiipomycin eine hervorragende Wirkung zur Förde
rung des Wachstums von Schweinen zeigt.
25 65 I
Hierzu 2 Blatt, 30 I
Aufnahme Futterumsatz
35
■ Vergleichsgruppe 11,1 2,8
m Pholipomycin-Gmppe 12,1 2,6
I

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Antibiotisch wirksame Substanz Pholipomycin, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften und Kenndaten:
Weißes Pulver mit saurer Reaktion,
Elementaranalyse: C:50,15%, H:7,14%, N:5,48%, P: 2,33%, empirische Formel Csimö Hgs-m Ν>-& Ο25-35Ρ;
durch Gelfiltration bestimmtes Molekulargewicht von 5 100, Schmelzpunkt: bei 250° C oder darüber allmähliche Braunverfärbung,
DE2431270A 1973-06-30 1974-06-28 Antibiotische Substanz, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung dieser antibiotischen Substanz als wachstumsförderndes Mittel Expired DE2431270C2 (de)

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