DE2413720A1

DE2413720A1 - Verwendung von aminozuckerderivaten in der tierernaehrung

Info

Publication number: DE2413720A1
Application number: DE2413720A
Authority: DE
Inventors: Werner Dr Frommer; Horst Gericke; Uwe Dr Keup; Walter Dr Puls; Delf Dr Schmidt; Otto Dr Wagner
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1974-03-21
Filing date: 1974-03-21
Publication date: 1975-10-02
Also published as: BE826899A; IE40866B1; IL46912A; ZA751756B; DK117275A; FR2264490B1; IL46912A0; PH11316A; DE2413720C3; SE7503231L; DE2413720B2; GB1492454A; PL92567B1; AU7931275A; SE403034B; FR2264490A1; JPS511271A; CS184842B2; BR7501671A; IE40866L

Description

Zentralbereich Patente. Marken und Lizenzen

S/Hg 509 Leverkusen. Bayerwerk

, Μ5Ί

Verwendung von Aminozuckerderivaten in der Tierernährung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Aminozuckerderivaten in der Tierernährung zur Beeinflussung des Fleisch : Fettverhältnisses zugunstes des Fleischanteiles.

Es wurde gefunden, daß die Aminozuckerderivate der Formel I

OH OH

(D

CH₂OH

in welcher

R für eine Oligosaccharidkette mit 1 bis 4o Hexoseeinheiten steht,

die Eigenschaften aufweisen, in Tieren unerwünschten Fettansatz zugunsten eines vermehrten Fleischansatzes zu vermeiden.

Dieser Befund ist als außerordentlich überraschend anzusehen, da es bisher nicht bekannt war, daß Verbindungen des Typs der Aminozuckerderivate der Formel I in Tieren das Fleisch-Fettverhältnis zugunsten eines erhöhten Fleischanteils beein-

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flüssen können. In der tierischen Veredelungsproduktion (einschließlich Tiermast) ist fes von sehr großer wirtschaftlicher Bedeutung, Tierkörper zu erzielen, welche sich durch einen möglichst niederen Pettanteil und einen möglichst hohen Anteil an magerem Fleisch (hoher Proteinanteil) auszeichnet. Weiterhin ist es von erheblichem Vorteil, wenn im Tierfutter der Anteil der wertvollen Proteine verringert werden kann, ohne daß das Ergebnis der Fütterung nachteilig beeinflußt wird. Diese Ziele können mit Hilfe der Verbindungen der Formel I in hohem Maße erzielt werden. Bisher sind keine Wirkstoffe bekannt, die in der Tierernährung eingesetzt, die Produktion fettarmer Schlachtkörper ermöglichen bzw. eine bei Tieren unerwünschte Verfettung vermeiden, sofern dies bei verschiedenen Tierarten, z.B. Hunden, und in bestimmten Lebensabschnitten unerwünscht ist. Die erfindungsgemäße Verwendung der Verbindungen der Formel I stellt somit eine echte Bereicherung der Technik dar.

Die Verbindungen der Formel I können als Wirkstoffe einzeln oder in Mischungen untereinander verwendet werden. Die Verbindungen der Formel I können in reiner Form, besonders vorteilhaft jedoch in einer rohen Form ("crude form"), wie sie bei der mikrobiologischen Herstellung anfällt, eingesetzt werden. Die rohen Produkte enthalten keine Nebenkomponenten, die das gewünschte Ergebnis nachteilig beeinflussen und sind durch den Wegfall der aufwendigen Feinreinigung erheblich einfacher zugänglich und somit preisgünstiger als die reinen Wirkstoffe der Formel I.

Die Oligosaccharidkette R kann gleiche oder verschiedene Hexosen enthalten, welche in der D-und/oder L-Form, vorzugsweise in der D-Form vorliegen können. Als Hexosen, die in R enthalten sein können, seien Galaktose, Mannose und Glucose genannt. Bevorzugt enthält der Rest R Glucose (insbesondere D-Glucose).

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Für die niederen Glieder (1 und 2 Hexosereste) der Verbin dungen der Formel I₁ soweit sie Gluoosereste als Hexosen enthalten, werden folgende Strukturformeln vorgeschlagen:

CH₂OH

OH

OH OH

OH

II

OH CH,

1 Hexoserest

τ—\Λ-°

OH OH O

CH₂OH

2 Hexosereste

Analoge bzw.. ähnliche. Strukturen können auch für die höheren Glieder der Verbindungen der Formel I angenommen werden.

Die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen der Formel I können gemäß einem eigenen früheren, noch nicht veröffentlichten Vorschlag auf mikrobiologischem Wege wie folgt hergestellt werden:

Zur Herstellung der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen der Formel T werden demnach Mikroorganismen der zur Ordnung Actinomycetales gehörenden Familie Actinoplanaceae, insbesondere Stämme der Gattung Actinoplanes eingesetzt. Als Beispiele

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seien genannt die Stämme Actinoplanes species SE 5o (CBS 961.7o), SB 18 (CBS 957.7o) und SE 82 (CBS 615.71). Diese Mikroorganismen sind bereits im südafrikanischen Patent Nr. 71/8677 beschrieben und sind unter den in Klammern aufgeführten Nummern im Centralbureau vor Schimmelcultures in Baarn/Holland hinterlegt.

Zur Durchführung des Herstellungsverfahrens können weiterhin - wie auch schon im südafrikanischen Patent Nr. 71/8677 beschrieben - Mutanten oder Varianten aus diesen Stämmen verwendet werden. Besonders geeignet erweisen sich im Hinblick auf die Gesamtausbeute an den erfindungsgemäß verwendbaren Aminozuckerderivaten und/oder im Hinblick auf die Größe des Restes R im Gemisch der bei der Fermentation gebildeten Aminozuckerderivate die Stämme SE 5o/i3 (CBS 614.71) und SE 5o/11o (CBS 674.73). Beide Stämme entsprechen in ihrer Beschreibung weitgehend dem Elternstamm SE 5o. Diese Stämme sind ohne Anwendung von Mutagenen durch natürliche Auslese aus Stamm SE 5ο gewonnen worden.

Zur Durchführung des Verfahrens verwendet man feste und flüssige, ■insbesondere flüssige, wässrige Nährböden, die neben Kohlenstoffquellen Stickstoffquellen, Salze und Antischaummittel in den üblichen Konzentrationen enthalten. Die Konzentrationen können in weiten Grenzen schwanken.

Als Kohlenstoffquellen dienen vorwiegend Kohlenhydrate, insbesondere Stärke, Maltose, Glucose und Gemische von zweien /"oder dreien_7 dieser Stoffe, aber auch komplexe Gemische wie z. B. Malzextrakt.

Als Stickstoffquellen können die in der Mikrobiologie üblichen komplexen Gemische, wie z. B. Kaseinhydrolysat, Hefeextrakt, Pepton, Fischmehl, Fishsolubles, Maisquellwasser, Fleischextrakt und auch Mischungen ebenso wie Aminosäuren und/oder Ammoniumsalze verwendet werden.
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Bei der Durchführung des Herstellungsverfahrens wird im allgemeinen aerob in belüfteten Schüttelkulturen oder in Behäl-.terkulturen gearbeitet. Die Art und die Konzentration der Kohlenstoffquelle beeinflußt in Kombination mit dem Jeweiligen zur Fermentation verwendeten Stamm die Art des Endproduktes im Hinblick auf die Größe des Restes R soweit, daß man einzelne Glieder der homologen Reihe oder zumindest einen sehr engen Bereich von Homologen nahezu selektiv herstellen kann. Es hat sich dabei gezeigt, daß in Nährlösungen, die Stärke über 3,5 % enthalten, vor allem Aminozuckerderivate mit 4 bis 4o Hexoseeinheiten gebildet werden, und daß für diese Produktion insbesondere der Stamm SE 5o/1j5 (CBS 614.71) geeignet ist. Es genügt aber unter Umständen schon, zu Mährlösungen, die z. B. 3,5 % Glucose als Grundkohlenstoffquelle enthalten, o,1 bis 3 %, vorzugsweise o,5 bis 2 %, Stärke zuzugeben, um Gemische von Aminozuckerderivaten mit 4 bis 4o Hexoseeinheiten zu erhalten. Des weiteren hat es sich gezeigt, daß in stärkefreien Nährlösungen und insbesondere bei Zugabe von Maltose zur Nährlösung, insbesondere mit dem Stamm SE 5o (CBS 961.7o) vorwiegend Aminozuckerderivate mit 2 bis 3 Hexoseeinheiten gewonnen werden können. Besonders geeignet zur Herstellung des Aminozuckerderivats mit R = Glucose haben sich Nährlösungen erwiesen, die allein Glucose als Kohlenstoffquelle enthalten. Enthält die Nährlösung Glucoseüberschuß, so werden bei längerer Fermentationsdauer auch die längerkettigen Aminozuckerderivate gebildet. Man kann das in gewissen Grenzen unterbinden, wenn bei der Fermentation die Erschöpfung der Stickstoffquellen zeitlich mit der Erschöpfung der Glucose zusammenfällt. Verzichtet man bei den Nährlösungen ganz auf Glucose und gibt als Kohlenstoffquelle Maltose, so erhält man überwiegend das Aminozuckerderivat mit 2 Hexoseeinheiten. Dabei kann man auch die reine Maltose durch billigere Gemische ersetzen, wie z. B. durch einen natürlichen Malzextrakt. Dem Gehalt an Maltotriose entsprechend wird dann auch das nächst höhere

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Homologe mitgebildet. Besonders geeignet für die Herstellung der niederen Homologen erweist sich der Stamm SE 5o/11o, der in optimalen Nährlösungen etwa die doppelte Ausbeute an niederen Homologen ergibt als der Stamm SE 5o/i3.

Bei den Fermentationen kann die Zusammensetzung der übrigen Nährlösung, insbesondere die Konzentration der Stickstoffquellen und die Salzzusammensetzung in weiten Bereichen schwanken.

Die Nährmedien werden in der üblichen Weise sterilisiert. Die pH-Werte der Nährlösung liegen zwischen 5, ο - 8,5, vorzugsweise zwischen 6,ο - 7,8. Die Bebrütungstemperatüren liegen zwischen 15 und 45⁰C, vorzugsweise zwischen 24 und 32⁰C. Für die Herstellung von höheren Homologen mit den Stämmen SE 5o und SE 5o/i3 ist eine höhere Temperatur,ζ. B. 28⁰C, für die Herstellung der niederen Homologen mit den Stämmen SE 5o und SE 5o/11o eine niedere, z. B. 24⁰C günstiger. Die Kulturdauer beträgt 1-8 Tage, vorzugsweise 2-6 Tage. Längere Kulturdauer, besonders bei Kohlenhydratüberschuß, begünstigt die Bildung der höheren Homologen. Der Endpunkt der Fermentation wird durch dünnschichtchromatographisehe Bestimmung der Zusammensetzung bestimmt. Da die Verbindungen der Formel I auch die Enzyme Amylase und Saccharase zu hemmen vermögen, kann das Ausmaß der Hemmung auch in hervorragender Weise zur Endpunktbestimmung sowie überhaupt zu Konzentrationsbestimmungen herangezogen werden.

Die niederen Homologen der Aminozuckerderivate der Formel I lassen sich auch durch Abspaltung von Hexoseeinheiten aus den höheren Homologen gewinnen. Die Abspaltung geschieht entweder mit wässrigen Säuren, insbesondere mit 1 - 5-normalen Mineralsäuren bei Temperaturen von 5o bis 1oo°C, insbesondere bei Temperaturen von 9o bis 1oo°C, in etwa 1o bis 18o Minuten,

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oder durch Inkubation mit Enzymen (Hydrolasen), insbesondere mit 13-Amylasen oder nicht hemmbaren 06 -Amylasen oder Amyloglucosidasen mikrobiellen Ursprungs, wie z. B. ei -Amylasen aus Bacterium subtilis, oder durch Inkubation mit Mikroorganismen, die in Nährlösungen, welche die höheren Homologen der Aminozuckerderivate in Gehalten von 1 bis 1o %, vorzugsweise 2 bis 5 % inkorporiert vorzugsweise als alleinige Kohlenstoff quelle enthalten, zu wachsen vermögen, wie z. B. Aspergillus niger (ATCC 11.394).

Die Isolierung und Reinigung der Aminozuckerderivate geht aus entweder von mikrobiologischen Kulturbrühen oder von sauren Hydrolysaten oder von Inkubationsgemischen, in denen der enzymatische und/oder mikrobiologische Umbau oder Abbau der höheren Homologen der Aminozuckerderivate durchgeführt wurde.

Je nach dem Molekulargewichtsbereich, dem die zu isolierenden Substanzen zuzuordnen sind, erweisen sich verschiedene Methoden der Aufarbeitung als zweckmäßig. Die Isolierung geschieht z. B. bei den höheren Homologen durch direkte Fällung nach vorheriger Entfärbung und Einengung der Lösungen.

Die niedermolekularen Homologen gewinnt man dagegen vorzugsweise durch Adsorption z. B. an Aktivkohle bei neutralem pH mit anschließender Desorption mit wässrigen Alkoholen_toder Aceton, vorzugsweise 5o-8o96igem Aceton. Besonders vollständig gelingt die Desorption bei sauren pH-Werten im Bereich von pH 1,5 - 4, vorzugsweise pH 2 - 3.

Wenn die Ausgangslösungen sehr dunkel gefärbt sind, werden sie vor der.Adsorption mittels Aktivkohle bei sauren pH-Werten (pH 1 - 3) oder mit einem beliebigen unspe2ifischen Adsorptionsharz im Bereich von pH 2-7, vorzugsweise bei pH 2 - 3, entfärbt. Die Aktivkohle bindet nur im sauren Bereich bevorzugt

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Farbstoffe, während das Harz die Aminozuckerderivate weder im Neutralen noch im Sauren adsorbiert.

Zur Abtrennung der Aminozuckerderivate von inaktiven Sacchariden und anderen Nebenverbindungen nutzt man den schwach basischen Charakter dieser Komponenten aus. Unter geeigneten Bedingungen (pH 1-8, vorzugsweise pH 2 - 4; bei niedriger Ionenstärke, entsprechend einer Leitfähigkeit < 1o mS, vorzugsweise < 2 mS) werden die homologen Aminozuckerderivate von stark sauren Kationenaustauschern in der H -Form gebunden. Besonders gut lassen sich die Aminozuckerderivate aus acetonischer Lösung (5o bis 8o % Aceton, pH 1 bis 5, vorzugsweise pH 2 bis 4) an Kationenaustauscher binden, die unter diesen Bedingungen eine wesentlich höhere Kapazität für die Substanzen zeigen. Unter der Voraussetzung, daß die Lösung mehr als 5o % Aceton enthält, gelingt die Bindung auch an schwach saure Austauscher gut.

Zur Desorption der Aminozuckerderivate der Formel I von den Kationenaustauschern verwendet man am besten wässrige Ammoniaklösungen. Aus den Desorbaten zieht man den Ammoniak im Vakuum ab und gewinnt die Aminozuckerderivate nach Einengen der Lösung durch Lyophilisation oder Fällung mit organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise mit 1o - 2o Volumina Aceton.

Zur Reindarstellung der einzelnen Glieder aus der homologen Reihe der Aminozuckerderivate der Formel I, vorzugsweise solcher, in welchen R 1 bis 7 Hexoseeinheiten enthält, chromatographiert man die vorgereinigten Präparate über ein geeignetes Molekularsieb, z. B. ein Polyacrylamidharz und untersucht die Fraktionen des Eluates dUnnschichtchromatographisch. Fraktionen, welche die Aminozuckerderivate rein enthalten, werden vereinigt, rechromatographiert und schließlich nach Einengen lyophilisiert oder mittels organischer Lösungsmittel, wie oben

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beschrieben, gefällt. Bei dieser Methode bleiben die höheren Homologen, in welchen R 7 bis 4o Hexosen enthält, im Ausschlußvolumen. Aus dieser Lösung können gewünschtenfalls einzelne Glieder der Homologen bzw. bestimmte Mischungen dieser homologen Verbindungen gegebenenfalls durch mehrfache Chromatographie erhalten werden.

Alle Aminozuckerderivate der Formel I haben die gemeinsame Eigenschaft, daß sie bei saurer Totalhydrolyse die Verbindungen der Formel IV Z"C₁^H^q0₇N_7, für welche die nachstehende Strukturformel vorgeschlagen wird, sowie das entsprechende Monosaccharid liefern.

OH

IV

HOH₂C

Wie bereits erwähnt, können Konzentration und Reinheit der Verbindungen der Formel I leicht mit Hilfe ihrer Eigenschaften, Amylase und Saccharase zu hemmen, bestimmt werden. Als zweckmäßigerweise zu verwendende Maßeinheiten seien die Amylase-Inhibitor-Einheit, im folgenden auch AIE und die Saccharase-Inhibitor-Einheit, im folgenden auch SIE genannt, angegeben. Die Definition und Bestimmung dieser Einheiten ist aus dem folgenden Amylasetest und Saccharasetest ersichtlich;

1. Amylasetest

Eine Amylase-Inhibitor-Einheit (1 AIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Amylaseeinheiten zu 5o % inhibiert. Eine Amylaseeinheit (AE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen

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1 /U Äquivalent glucosidischer Bindungen in der Stärke spaltet. Die /uVal gespaltenen Bindungen werden als /uVal gebildeter reduzierender Zucker mit Dinitrosalicylsäure kolorimetrisch bestimmt und mit Hilfe einer Maltoseeichkurve als/uVal Maltoseäquivalente angegeben. Zur Durchführung des Testes werden o,1 ml Amylaselösung (2o - 22 AE/ml) mit O - 1o /Ug Inhibitor oder 0 - 2o/ul der zu testenden Lösung in o,4 ml o,o2m Natriumglycerophosphatpuffer/o,oo1m CaCIp, pH 6,9, versetzt und etwa 1o - 2o Minuten in einem Wasserbad von 35 C äquilibriert. Dann wird 5 Minuten mit o,5 ml einer auf 35⁰C vorgewärmten 1 % Stärkelösung (Stärke, löslich, z. B. der Firma Merck, Darmstadt, Nr.1252) bei 35°C inkubiert und anschließend mit 1 ml Dinitrosalicylsäure-Reagens (nach P. Bernfeld in Colowick-Kaplan, Meth. Enzymol., Band 1, Seite 149) versetzt. Zur Farbentwicklung wird der Ansatz 5 Minuten auf dem siedenden Wasserbad erhitzt, dann abgekühlt und mit 1o ml destilliertem Wasser versetzt. Die Extinktion bei 54o nm wird gegen einen entsprechend angesetzten Leerwert ohne Amylase gemessen. Zur Auswertung wird aus einer vorher aufgenommenen Amylaseeichkurve die nach Inhibitorzusatz noch wirksame Amylaseaktivität abgelesen und daraus die prozentuale Hemmung der eingesetzten Amylase errechnet. Die prozentuale Hemmung wird als Funktion des Quotienten

Inhibitor +

AE ++

+ bezogen auf Trockensubstanz

++ AE im nicht inhibierten Ansatz der gleichen Serie

aufgetragen, der 5o % Hemmungspunkt aus der Kurve abgelesen und auf AIE/mg Inhibitor umgerechnet.

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2. Saccharasetest

•Eine Saccharase-Inhibitor-Einheit (SIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Saccharaseeinheiten zu 5o % inhibiert. Eine Saccharaseeinheit (SE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 /uMol Saccharose in Glucose und Fructose spaltet. Die/uMol gebildete Glucose werden mit Hilfe der Glucoseoxidase-Reaktion quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere Saccharosespaltung durch die Saccharase nicht mehr stattfindet. Zur Durchführung des Testes werden o,o5 ml einer auf o,12 SE eingestellten Saccharaselösung ' mit 0 - 2o /Ug Inhibitor oder O - 2o/ul der zu testenden Lösung versetzt und mit o,1 m Natriummaleina tpuf f er, pH 6,o, auf o,1 ml aufgefüllt. Es wird 1o Minuten bei 35⁰C äquilibriert und dann mit o,1 ml einer auf 35 C vorgewärmten o,o5 m Saccharoselösung in o,1 m Natriummaleinatpuffer, pH 6,o, versetzt. Man inkubiert 2o Minuten bei 35⁰C und stoppt die Saccharase-Reaktion

durch Zugabe von 1 ml Glucoseoxidase-Reagens ^J ab und inkubiert weitere 3o Minuten bei 35⁰C. Danach wird 1 ml 5o % ^SO. zugesetzt und bei 54-5 nm gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen. Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Saccharase berechnet und aus dem 5o % Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf SIE/g bzw. SIE/Liter umgerechnet.

'Solubilisierte Saccharase aus Schweinedünndarmmucosa nach B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. 12, (1958), Seite 1997. Mit o,1 m Natriummaleinatpuffer pH~T,o auf entsprechenden SE-Gehalt verdünnt.

2)
'Das Glucoseoxidase-Reagens wird durch Lösen von 2 mg Glucose-

oxidase (z. B. der Fa. Boehringer Nr. 15423) in loo ml 0,565m Tris-HCl-Puffer pH 7,ο und anschließenden Zusatz von 1 ml Detergenslösung (2 g eines nicht-ionogenen, oberflächenaktiven Stoffes, der durch die Reaktion von t.-Octylphenol mit Äthylenoxid entsteht + 8 g 95 % reinstem Äthanol), 1 ml Dianisidinlösung (26o mg o-Dianisidin . 2 HCl in 2o ml HpO) und o,5 ml o,1%iger wässriger Peroxidaselösung (z. B. der Fa. Boehringer Nr. 153o2) hergestellt.

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Die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen der Formel I weisen die Eigenschaften auf, in Tieren das Verhältnis des Anteiles an unerwünschtem Fett zum Anteil des erwünschten fettarmen Fleisches (mageres Fleisch) zugunsten des mageren Fleisches in hohem Maße zu beeinflussen. Dies ist von besonderer Bedeutung für die Aufzucht und Haltung von Masttieren, z. B. von Schweinen, aber auch von erheblicher Bedeutung für die Aufzucht und Haltung von sonstigen Nutztieren und Ziertieren. Die Verwendung der Verbindungen der Formel I kann weiterhin zu einer erheblichen Rationalisierung der Fütterung der Tiere führen. Da sie eine gewisse Verzögerung der Verdauung bewirken, wird die Verweildauer der Nährstoffe im Verdauungstrakt verlängert, wodurch in vielen Fällen eine mit wenig Aufwand verbundene ad libitum-Fütterung ermöglicht wird. Weiterhin ergibt sich bei der Verwendung der Verbindungen der Formel I in vielen Fällen eine erhebliche Einsparung von wertvollen Proteinen im Futter.

Die Wirkstoffe der Formel I können somit praktisch in allen 'Bereichen der Tierernährung als Mittel zur Reduzierung des Fettansatzes sowie der Einsparung von Futtereiweiß verwendet werden.

Die Wirksamkeit der Wirkstoffe der Formel I ist hierbei waitgehend unabhängig von der Art und dem Geschlecht der Tiere. Besonders wertvoll erweisen sich die Wirkstoffe der Formel I bei Tierarten, die überhaupt oder in bestimmten Lebensabschnitten zu stärkerer-'Fetteinlagerung neigen.

Als Tiere, bei denen die Wirkstoffe der Formel I zur Reduzierung des Fettansatzes und/oder zur Einsparung von Futtereiweiß eingesetzt werden können, seien beispielsweise folgende Nutz- und Ziertiere genannt: Warmblüter wie Rinder, Schweine, Pferde, Schafe, Ziegen, Katzen, Hunde, Kaninchen, Pelztiere, z.B. Nerze, Chinchilla, andere Ziertiere, z.B. Meerschweinchen und Hamster, Labor- und Zootiere, z.B. Ratten, Mäuse, Affen usw., Geflügel,

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z.B. Hühner, Gänse, Enten, Truthähne, Tauben, Papageien und Kanarienvögel und Kaltblüter, wie Fische, z.B. Karpfen und Reptilien, z.B. Schlangen.

Die Menge der Wirkstoffe, die den Tieren zur Erreichung des gewünschten Effektes verabreicht wird, kann wegen der günstigen Eigenschaften der Wirkstoffe weitgehend variiert werden. Sie liegt vorzugsweise bei etwa 0,5 mg bis 2,5 g, insbesondere bis 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Die Dauer der Verabreichung kann von wenigen Stunden oder Tagen bis zu mehreren Jahren betragen. Die passende Menge Wirkstoff sowie die passende Dauer der Verabreichung stehen in engem Zusammenhang mit dem Fütterungsziel. Sie hängen insbesondere von der Art, dem Alter, dem Geschlecht, dem Gesundheitszustand und der Art der Haltung der Tiere ab und sind durch jeden Fachmann leicht zu ermitteln.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe werden den Tieren nach den üblichen Methoden verabreicht. Die Art der Verabreichung hängt insbesondere von der Art, dem Verhalten und dem Allgemeinzustand der Tiere ab. So kann die Verabreichung einmal oder mehrmals täglich in regelmäßigen oder unregelmäßigen Abständen oral erfolgen. Aus Zweckmäßigkeitsgründen ist in den meisten Fällen eine orale Verabreichung, insbesondere im Rhythmus der Nahrungs- und/oder Getränkeaufnahme der Tiere, vorzuziehen.

Die Wirkstoffe der Formel I können als reine Stoffe oder in formulierter Form verabreicht werden, wobei die formulierte Form sowohl als Premix, also in Mischung mit nicht-toxischen inerten Trägerstoffen beliebiger Art, als auch als Teil einer Gesamtration in Form eines Beifutters bzw. als Mischungsbestandteil eines alleinigen Mischfutters zu verstehen ist. Mit eingeschlossen ist auch die Applikation geeigneter Zubereitungen über das Trinkwasser.

Die Wirkstoffe der Formel I können gegebenenfalls in formulierter Form auch zusammen mit anderen Wirkstoffen, z. B. Mineral-

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salzen, Spurenelementen, Vitaminen, Eiweißstoffen, Energieträgern (z. B. Stärke, Zucker, Fette), Farbstoffen und/oder Geschmacksstoffen in geeigneter Form verabreicht werden. Die Wirkstoffe der Formel I können vor, während oder nach der Nahrungsaufnahme den Tieren gegeben werden. Empfehlenswert ist die orale Verabreichung zusammen mit dem Futter und/oder Trinkwasser, wobei je nach Bedarf die Wirkstoffe der Gesamtmenge oder nur Teilen des Futters und/oder Trinkwassers zugegeben werden.

Die Wirkstoffe der Formel I können nach üblichen Methoden durch einfaches Mischen als reine Stoffe, vorzugsweise in fein verteilter Form oder in formulierter Form in Mischung mit eßbaren, nichttoxischen Trägerstoffen, gegebenenfalls auch in Form eines Premix oder eines Futterkonzentrates, dem Futter und/oder dem Trinkwasser beigefügt werden.

Das Futter und/oder Trinkwasser kann beispielsweise die erfindungsgemäßen Wirkstoffe in einer Konzentration von etwa o,oo1 bis 5,o %t insbesondere o,o2 bis 2,0 % (Gewicht) enthalten. Die optimale Höhe der Konzentration des Wirkstoffs im Futter und/oder Trinkwasser ist insbesondere abhängig von der Menge der Futter- und/oder Trinkwasseraufnähme der Tiere und kann durch jeden Fachmann leicht ermittelt werden.

Die Art des Futters und seine Zusammensetzung ist hierbei ohne Belang. Es können alle gebräuchlichen, handelsüblichen oder speziellen Futterzusammensetzungen verwendet werden, die vorzugsweise das übliche, für eine ausgewogene Ernährung notwendige Gleichgewicht aus Energie- und Eiweißstoffen, einschließlich Vitaminen und Mineralstoffen enthalten. Das Futter kann sich beispielsweise zusammensetzen aus pflanzlichen Stoffen, z. B. Ölkuchenschroten, Getreideschroten, Getreidenebenprodukten, aber auch aus Heu, Gärfutter, Rüben und anderen Futter-

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pflanzen, aus tierischen Stoffen, z.B. Fleisch- und Fischprodukte, Knochenmehl, Fette, Vitamine, z.B. A, D, E, K und B-Komplex sowie spezielle Proteinquellen, z.B. Hefen sowie bestimmten Aminosäuren und Mineralstoffen und Spurenelementen, wie z.B. Phosphor und Eisen, Zink, Mangan, Kupfer, Kobalt, Jod usw.

Premixe können vorzugsweise etwa 0,1 bis 50 %, insbesondere 0,5 bis 5,0 % (Gewicht) der Wirkstoffe der Formel I neben beliebigen eßbaren Trägerstoffen und/oder Mineralsalzen, z.B. kohlensaurem Futterkalk enthalten und werden nach den üblichen Mischmethoden hergestellt.

Mischfutter enthalten vorzugsweise 0,001 bis 5,0 %, insbesondere 0,02 bis 2,0 % (Gewicht) der Wirkstoffe der Formel I neben den üblichen Rohstoffkomponenten eines Mischfutters, z.B. Getreideschrote oder -nebenprodukte, Ölkuchenschrote, tierisches Eiweiß, Mineralien, Spurenelemente und Vitamine. Sie können nach den üblichen Mischmethoden hergestellt werden.

Vorzugsweise in Premixen und Mischfuttermitteln können die Wirkstoffe gegebenenfalls auch durch ihre Oberfläche bedeckenden geeigneten Mittel, z. B. mit nichttoxischen Wachsen oder Gelatine vor Luft, Licht und/oder Feuchtigkeit geschützt werden.

Beispiel für die Zusammensetzung eines fertigen Mischfutters, für Geflügel, das einen Wirkstoff der Formel I enthält:

2oo g Weizen, 34o g Mais, 36o,3 g Sojaschrot, 6o g Rindertalg, 15 g Dicalciumphosphat, log Calciumcarbonat, 4 g kodiertes Kochsalz, 7,5 g Vitamin-Mineral-Mischung und 3,2 g Wirkstoff-Premix ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg Futter.

Die Vitamin-Mineral-Mischung besteht aus:

6ooo I.E. Vitamin A, 1ooo I.E. Vitamin D₃, 1o mg Vitamin E, 1.mg Vitamin K₃, 3 mg Riboflavin, 2 mg Pyridoxin, 2o mcg Vitamin B₁₂, 5 mg Calciumpantothenat, 3o mg Nikotinsäure,

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2οο mg Cholinchlorid, 2οο mg Mn SO^ χ H₂O, I4o mg Zn SO^ χ

7H₂O, 1oo mg Fe SO^ χ 7H₂O und 2o mg Cu SO^ χ 5H₂O.

Der Wirkstoff-Premix enthält den Wirkstoff der Formel I

in der gewünschten Menge, z. B. I600 mg entsprechend

5 X 1o AJE und zusätzlich 1 g DL-Methionin sowie so viel

Sojabohnenmehl, daß 3,2 g Premix entstehen.

Beispiel für die Zusammensetzung eines Schweinemischfutters, das einen Wirkstoff der Formel I enthält:

63o g Futtergetreideschrot (zusammengesetzt aus 2oo g Mais-, 15o g Gerste-, 15o g Hafter- und 13o g Weizenschrot), 8o g Fischmehl, 6o g Sojaschrot, 58,8 g Tapiokamehl, 38 g Bierhefe, 5o g Vitamin-Mineral-Mischung für Schweine (Zusammensetzung, z. B. wie beim Kükenfutter) 3o g Leinkuchenmehl, 3o g Maiskleberfutter, log Sojaöl, log Zuckerrohrmelasse und 2 g Wirkstoff-Premix (Zusammensetzung z. B. beim Kükenfutter) ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg Futter.

•Die angegebenen Futtergemische sind vorzugsweise zur Aufzucht und Mast von Küken bzw. Schweinen abgestimmt, sie können jedoch in gleicher oder ähnlicher Zusammensetzung auch zur Aufzucht und Mast anderer Tiere verwendet werden.

Wie bereits erwähnt, können die Wirkstoffe der Formel I einzeln oder aber auch in beliebigen Mischungen untereinander verwendet werden, wobei sowohl die reinen Wirkstoffe als auch die bei der Herstellung erhaltenen rohen Wirkstoffe gegebenenfalls nach einer Grobreinigung eingesetzt werden. Als Mischungen können z. B. Gemische von Verbindungen der Formel I Verwendung finden, welche z. B. etwa 7 bis 4o, vorzugsweise 7 bis 25 und insbesondere 7 bis 2o Hexosen im Rest R enthalten. Es können jedoch auch Verbindungen einzeln oder in Mischungen untereinander verwendet werden, welche 1 bis 7, vorzugsweise 1 bis 3 Hexosen

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im Rest R enthalten. Ebensogut können auch Gemische der niederen und der höheren Homologen eingesetzt werden. Bei besonders dextr inhaltigen Futterzubereitungen (z. B. Zuckerrüben) kann es sich empfehlen, Verbindungen der Formel I zu verwen-.den, in welchen R aus einer geringen Zahl, z. B. 1 bis 7, vorzugsweise 1 bis 3 Hexoseresten besteht, bzw. Mischungen von Verbindungen der Formel I zu verwenden, in welchen ein höherer Anteil der niederen Homologen enthalten ist. Bei besonders stärkehaltigen Futterzubereitungen kann es zweckmäßig sein, Verbindungen der Formel I zu verwenden, in denen R aus einer höheren Zahl, z. B. 5 bis 35, vorzugsweise 7 bis Hexoseresten besteht, bzw. Mischungen zu verwenden, in welchen ein höherer Anteil an höheren Homologen enthalten ist. Die Zusammensetzung von Wirkstoffgemischen kann sehr stark variiert werden und ist als nicht kritisch zu betrachten.

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Die Wirksamkeit der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen der Formel I kann durch die folgenden Tierversuche demonstriert werden:

Versuch a)

Der Einfluß der Wirkstoffe auf die Depotfettentwicklung bei Ratten

Mahlzeitengefütterten Ratten wurde 27 Tage lang der Wirkstoff aus Beispiel 1 mit dem Futter zugeführt. Die nach dieser Zeit vorgenommene Wägung des epididymalen und retroperitonealen (perirenalen) Fettgewebes ergab, daß der Wirkstoff eine dosisabhängige Abnahme bzw. verminderte Ausbildung des epididymalen und retroperitonealen Fettgewebes um 15 - 4o Prozent bewirkt (vgl. Tabelle 1). Die faecale Stärkeausscheidung war in allen Gruppen gleich.

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Ir¹ CD

VJl

•P-

VJl

Tabelle

Fettgewebsgewichte in mg + Is ' Ratte und pro 1oo g Ratte; ' = Standardabweichung

Gewebe Versuchsgruppen (Einteilung s. unten) I II . III . IV

cn σ co co

CD ι

ο Co* cn cn '

Retroperit.Fett/Ratte

Retroperit. Fett/ 1oo g

Ratte

+ 86 484 + 2o6 449 + 219 4oo +188

(= I0056) 271 (= 75 %) 274 (- 76 %) 226 (= 63 %)

Epididym.	Fett/Ratte 1473	+ 344 1213	+ 218	1288	+ 294	972	+ 237
Epididym.	Fett/ 1oo g 8o5 Ratte	(= 1oo%) 585 ι	c- mi	7ö5"l	:= mi	549	(= 68%;
ρ	<o.o5 P	<o,o1
(= Prozent	gegen Gruppe zur Kontrollgruppe (Gr. I) )

Gruppeneinteilung: Gruppe I

Gruppe II Gruppe III Gruppe IV

Jede Gruppe enthielt 12 Tiere. = Kontrolle

= o,o1o Mega AIE Wirkstoff/1 = o,o5o " "

= o,5oo " "

tf

oo g Futter

It

Die Tabelle 1 zeigt deutlich, daß die Tiere, welche Wirkstoff erhielten, erheblich weniger Fett ansetzten als die Kontrolltiere, welche keinen Wirkstoff erhielten.

Material und Methoden zu Versuch a)

Tiermaterial: Futter:

Tierhaltung:

Fütterungszeiten:

Organwägungen :

männl. Wistar-Ratten/Winkelmann, SPF, 15o-2oo g

Vollfutter mit 5o % Stärke,

Leitungswasser ad libitum

6 Ratten / Käfig mit Drahtboden und Kotblech

8°° bis 8³° und 16⁰⁰ bis 16³°

Die Tiere wurden vor Versuchsbeginn 4 Wochen

lang an diesen Fütterungsmodus adaptiert.

Nach Entblutung der Ratten aus dem Orbitalvenenplexus, Kopfschlag und Halsschnitt wurden das epididymale und retroperitoneale Fettgewebe präpariert und gewogen (Genauigkeit: +0,2 mg).

Versuch b)

Reduzierung des Fettansatzes und Verbesserung des Eiweißansatzes durch Anwendung der erfindungsgemäß verwendbaren Wirkstoffe als Futterzusatz in der Schweinefütterung

An mahlzeitengefütterte Schweine wurden während der Mast von ca. 6o bis 15o kg Lebendgewicht (ca. 2o Wochen lang) 5,ο mega AIE des Wirkstoffs aus Beispiel 1/kg Futter (= Versuchsgruppe) bzw. kein Wirkstoff (= Kontrolle) verabreicht. Nach Erreichen eines einheitlichen Schlachtendgewichtes von ca. 15o kg wurden alle Tiere getötet und eine Reihe von Daten zur Bewertung der Schlachtkörperqualität ermittelt.

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- 2o -

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Nach kovarianzanalytischer Korrektur auf Anfangs- und Endgewicht sowie Dauer der Studie ergaben sich die folgenden Unterschiede' in den Schlachtkriterien beider Gruppen:

Tabelle 2

Meßstellen mit Wirk- ohne Wirkstoff stoff

Fettansatz

Speckdicke Widerrist in cm 5,43 + o,14 6,71+0,12

Speckdicke Rückenmitte in cm 3,52 + 0,08 4,15 + ο,οβ

Speckdicke Lende in cm 4,71+0,11 5,11 + o,o9

Schinken, Speckauflage in kg 5,o3 + o,1o 5,49 + o,o9

Fleischansatz

Kotelett: fettfreier Fleischkern in cm 5o,4 + 1,o1 45,4 + o,84

Die Ausschlachtungsergebnisse haben ergeben, daß durch Verwendung der erfindungsgemäß verwendbaren Wirkstoffe die Fetteinlagerung reduziert und der Fleischansatz (mageres Fleisch), z. B. durch Vergrößerung des Fleischartteils in der Kotelettfläche, verbessert wird.

Material und Methoden zu Versuch b) Tiermaterial:

Aus 5 gleichalten Würfen der weißen belgischen Rasse wurden je 4 gleichstarke Tiere (2 männliche kastrierte (= Borge) und 2 weibliche)ausgewählt und jeweils paarweise auf beide Versuchsgruppen verteilt.

Haltung:
Einzeltier t> Oxen

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Futter:

Handelsübliches Schweinemastfutter mit allen Nähr- und Wirkstoffen für optimales Wachstum (siehe hier weiter oben angeführte Mischfutter-Rezeptur für Schweine). Den Tieren, welche den Wirkstoff erhielten, wurde dieser im Putter vermischt gegeben.

Fütterung:

Die Fütterung erfolgte nach der Rationstabelle der Deutschen Landwirtschafts-Gesellschaft (DLG), d.h. die Steigerung der täglichen Futterzuteilung wurde der jeweiligen Gewichtsentwicklung des Gruppendurchschnitts angepaßt. Fütterungszeiten morgens 8.°° und abends 8. Uhr.

Versuchsdurchführung :

a) Fütterungsversuch;

Versuchsbeginn mit ca. 6o kg Lebendgewicht. Fütterung entsprechend dem wöchtenlichen Gewichtsfortschritt. Wiegung 1 χ wöchentlich am jeweils gleichen Wochentag morgens nüchtern. 3 Tiere (2 männlich, 1 weiblich) der Versuchsgruppe wurden in der 6., 7. und 13. Woche und 1 Tier (weiblich) der Kontrollegruppe wurde ebenfalls in der 7. Versuchswoche wegen Nahrungsverweigerung aus dem Versuch genommen. Die Sektionsbefunde waren chronische Pneumonie bzw. pneumonischer Infekt. Die Herausnahme der Tiere stand daher in keinerlei Zusammenhang mit der Wirkstoffverfütterung.

b) Schlachtversuch;

Mit Erreichen des vorher festgelegten Schlachtendgewichtes von ca. 15o kg wurden alle Tiere durch Stromstoß getötet. Die Tiere wurden ausgeschlachtet, beide Hälften warm gewogen und für 24 Stunden in ein Kühlhaus gebracht. Nach Erkalten wurde erneut gewogen und die im Ergebnis zusammengefaßten Messungen durchgeführt. Die Speckdickenmessungen an den genau

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festgelegten Meßstellen erfolgten mittels Schublehre, die " Fettauflage des Schinkens wurde sorgfältig abpräpariert und gewogen. Die Ermittlung der Kotelettfleischflächen wurde bei allen Tieren nach einer dafür entwickelten Standard-Methode zur Schlachtkörperbeurteilung durch Kotelettanschnitt zwischen der 13. und 14. Rippe vorgenommen. Die Kotelettfläche wurde maßstabgerecht fotografiert und die anteiligen Fett- und Fleischflächen mit einem Planimeter ausgemessen.

Auswertung;

Die kovarianzanalytische Korrektur aller Einzelergebnisse erfolgte auf Anfangs- und Endgewicht der Tiere sowie Dauer, der Studie.

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Die Herstellung der erfindungsgemäß verwendbaren Wirkstoffe der Formel I kann durch die folgenden Beispiele erläutert werden:

Beispiel 1

In einigen der folgenden Beispielen wird als Ausgangsmaterial eine Zubereitung verwendet, die wie folgt hergestellt wird:

Man beimpft einen Glasfermenter mit 8 Liter Nährlösung der Zusammensetzung 5,0 % Stärke, 1,o % Hefeextrakt, o,2 % KpHPO. mit einem 3 Tage alten Schüttelkolben des Stammes SE 5o/13 (CBS 614.71) und bebrütet unter intensiver Rührung und Belüftung 3 Tage bei 28⁰C und erhält eine Kulturbrühe mit 1o5.ooo AIE/ml.

6 Liter dieser Fermentationsbrühe werden nach dem Abkühlen auf 2o°C mit halbkonzentrierter HNO, auf pH 2,5 eingestellt, mit 3o g Aktivkohle versetzt und 1o Minuten gerührt. Anschließend wird 15 Minuten bei I0.000 Upm zentrifugiert und der klare, hellgelbe Überstand nach Neutralisation mit NH, auf 5oo ml eingeengt. Die 5oo ml Konzentrat wurden 45 Minuten mit 2oo g eines Anionenaustauschers (Cl~) gerührt, abgenutsctt, 3mal mit Äthanol und 2mal mit Äther gevaschen und im Vakuum bei 5o°C getrocknet. Ausbeute: 36 g eines weißen Pulvers mit 1o χ 1o AIE/g. Das auf diese Weise erhaltene Produkt entspricht der Formel I, wobei R 7 bis 4o Hexosereste enthält. Die Homologenverteilung kann je nach Versuchsführung schwanken. In vielen Fällen wird ein Produkt erhalten, welches etwa 3o % Anteile enthält, in welchen der Rest R aus 2o bis 4o Hexosen besteht und welches etwa 7o % Anteile enthält, in welchen der Rest R 7 bis 2o Hexosereste enthält. (Anteile % = Gewichtsanteile)

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Beispiel 2

Beimpft man 1 Liter Erlenmeyerkolben mit 12o ml einer Nährlösung, bestehend aus 4 % Stärke, 2,4 % Glucose, o,9 % Kaseinhydrolysat und o,9 % Hefeextrakt, pH mit NaOH auf 7,6 eingestellt, mit o,4 % CaCO, versetzt und 3o Minuten bei 121⁰C sterilisiert, mit 3 ml einer Vorkultur des Stammes SE 82, angewachsen in einer Nährlösung, bestehend aus 2 % Stärke, 1 % Glucose, o,5 % Kaseinhydrolysat und 1 % Hefeextrakt, pH mit NaOH auf 7,2 eingestellt, mit o,4 % CaCO, versetzt und 3o Minuten bei 121⁰C sterilisiert, und bebrütet 5 Tage bei 28 C auf einer Rundschüttelmaschine, so erhält man eine Kulturlösung mit 122.OOO AIE/ml. Zur Aufarbeitung trennt man das Mycel von den vereinigten Kulturlösungen durch Centrifugation bei 12.000 Upm ab, bringt 3oo ml des Kulturfiltrates mit halbkonzentrierter HNO, auf pH 2,5 und rührt für 1o Minuten mit

2.5 g Aktivkohle. Nach Abtrennung der Kohle bei 12.ooo Upm wird die mittels 1o N KOH auf pH 6 neutralisierte Lösung mit 3oo ml Methanol versetzt, kurz stehen gelassen und bei 12.000 Upm,vom Niederschlag befreit. Tropft man nun den Überstand in 3 Liter Äthanol, isoliert die Fällung nach kurzem Stehenlassen durch Centrifugation bei 12.ooo Upm, wäscht den Niederschlag zweimal mit absolutem Äthanol und einem mit Äther und trocknet im Vakuum, so erhält man 2,23 g eines Produktes mit 7,45 x 1o AIE/g, das zu über 95 % höhere Homologe der Aminozuckerderivate enthält, in welchen R der Formel I aus 4 bis 4o Hexoseresten besteht.

Beispiel 3

Beimpft man 1 Liter Erlenmeyerkolben, die 12o ml Nährlösung der Zusammensetzung 3 % Glucose, o,6 % Kaseinhydrolysat,

1.6 % Hefeextrakt, o,3 % CaCO^, o,3 % K₂HPO^, pH vor der Sterilisation mit KOH auf pH 7,8 eingestellt, Sterilisation 3o'/121°C, mit 6 ml einer Vorkultur des Stammes SE 5o/11o in

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einer Nährlösung bestehend aus 3 % Sojamehl, 3 % Glycerin und o,2 ?6 CaCO, und bebrütet 3 bis 4 Tage auf einer Rundschüttelmaschine bei 24⁰C, so erhält man eine Kulturbrühe mit 10.800 SIE/ltr, die überwiegend das Aminozuckerderivat der Formel I enthält, in welcher R für einen Hexoserest steht.

5 Liter KuIturfiltrat, bei 13.000 Upm vom Myeel abgetrennt, werden mit halbkonzentrierter HNO, auf pH 2,5 gestellt und für 15 Minuten mit 55 g Aktivkohle und 2oo g eines Filtrierhilfsmittels gerührt. Nach dem Entfernen der Feststoffe durch Absaugen neutralisiert man mit konzentriertem Ammoniak auf pH 7, engt die Lösung auf 1,5 Liter ein und fällt mit der 5fachen Menge Äthanol. Der resultierende flockige Niederschlag wird mittels eines Durchlaufrotors bei 12.000 Upm abgetrennt und der gelbliche Überstand auf 15o ml eingeengt und zur Abtrennung geringer Anteile ungelösten Materials niedertourig zentrifugiert. 5o ml dieser Lösung werden auf eine mit einem stark sauren Ionenaustauscher (H -Form) gefüllte Säule (3o χ 3oo mm; 3o ml H₂O pro Stunde) gegeben. Nachdem man insgesamt 300 ml Eluat aufgefangen hat, welches inerte Saccharide sowie einen Anteil nicht adsorbierter erfindungsgemäßer Wirkstoffe enthält, überführt man den Austauscher mit ca. 4oo ml HpO in ein Becherglas und fügt unter Rühren so lange konzentrierten Ammoniak zu, bis der pH einen Viert von 11,5 erreicht. Nach 3o Minuten weiterem Rühren trennt man vom Austauscher ab, engt auf 1/2o des Volumens ein, filtriert über eine Säule (2o χ 15o mm) mit einem Anionenaustauscher (HCO,^!-Form) und fängt bei einer Fließgeschwindigkeit von 3o ml/Stunde ca. 5oo ml Eluat auf, welches eingeengt wird und nach Lyophilisation 1,3 g Rohprodukt ergibt.

Eine weitere Reinigung des rohen Produktes kann wie folgt durchgeführt werden:

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Zur weiteren Reinigung wird das rohe Präparat an einem PoIyacrylamid-Gel, 1oo-2oo mesh, fraktioniert. Hierzu dient z. B. eine Säule von 5o mm 0 und 45o mm Länge, die mit ILjO bei einer Fließgeschwindigkeit von 4o ml/Stunde betrieben wird, wobei man Fraktionen von je 1o ml sammelt. Alle Fraktionen werden mittels des Anthrontestes auf Kohlenhydrate sowie mittels des Saccharase-Hemmtestes auf aktive Komponenten geprüft. Die erfindungsgemäße Wirkstoffe enthaltenden Fraktionen werden weiterhin dünnschichtchromatographxsch auf ihren Gehalt an individuellen Komponenten untersucht. Diejenigen Fraktionen, welche das Aminozuckerderivat der Formal I mit R = ein Hexoserest enthalten, werden vereinigt,'eingeengt und lyophilisiert. Man erhält 35 mg des Aminozuckerderivats mit R = 1 Hexoserest und mit o,3 x 1o AIS/g und 3o.ooo SIE/g.

Beispiel 4

Beimpft man einen Fermenter mit 1oo L Nährlösung der Zusammensetzung 3,5 /o Glucose, 2,5 % Malzextrakt, o,5 % Kaseinhydrolysat, 1,3 So Hefeextrakt, o,3 % CaCO,, 0,3 % K₂HPO^ und o,1 % Antischaummittel mit 5 L einer Vorkultur nach Beispiel 3 und bebrütet unter Rührung und Belüftung 5 Tage bei 24⁰C, so erhält man eine Kulturlösung mit 73.ooo SIE/L, die vorwiegend das Aminozuckerderivat der Formel I, in welcher R 2 Hexosereste bedeutet, enthält.

9o Liter Fermentationsansatz wurden mit Mycel am pH-Meter mit konzentrierter HNO, auf pH 2,5 eingestellt und unter Rühren mit 9oo g (= 1 %) Aktivkohle zur Adsorption der Hauptmenge der gebildeten Farbstoffe versetzt. Man rührt 15 Minuten, trennt über eine Zentrifuge bei 3ooo Upm vom Mycel und der Hauptmenge der Kohle ab und filtriert den Überstand schließlich unter Zusatz von 3 kg eines Filtrierhilfsmittels über eine Drucknutsche. Man erhält 65 Liter gelbbraunen, klaren Filtrats mit einem SIE-Gehalt von 60.000 SIE/Liter.

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S098A0/055Q

Das Filtrat wird mit konzentriertem NH, auf pH 7 eingestellt und zur Adsorption des Wirkstoffs mit 13oo g (2 %) Aktivkohle für 3o Minuten gerührt. Man filtriert über eine Drucknutsche und wäscht das Aktivkohlesediment dreimal mit 1o Liter destilliertem Wasser. Anschließend wird die Kohle gut trocken gedrückt und in 3 x 4 Litern 5o % (Volumen-Prozent) Aceton bei pH 2,5 für jeweils 15 Minuten gerührt, um den Wirkstoff von der Kohle zu desorbiereni Die acetonischen Desorbate werden - nach Abtrennen von der Kohle durch Filtration - vereinigt. Man engt das vereinigte Desorbat am Rotationsverdampfer auf 25o ml ein, versetzt mit einem gleichen Volumen (25o ml) Methanol und filtriert durch ein Faltenfilter. Das Filtrat (48o ml) wird in 5 Liter Aceton unter kräftigem Rühren eingetropft. Der ausfallende Niederschlag wird abgenutscht und dreimal mit Aceton und Äther gewaschen. Anschließend wird im Vakuum bei 35⁰C getrocknet. Ausbeute: 23o g mit 85oo SIE/g.

25 g des obigen rohen Produktes werden in 1 Liter HpO gelöst und mit 3oo g eines sbark sauren Kationenaustauschers 30 Minuten gerührt. Man filtriert das Harz ab und wäscht dreimal mit 2 Liter o,oo1 η HCl nach. D_as gewaschene Harz wird anschließend in 5oo ml HpO suspendiert und die Suspension am pH-Meter durch Zugabe von 25 % NH, auf pH 9,0 eingestellt. Anschließend wird noch zweimal mit je 5oo ml o,6 % NH, desorbiert, die Desorbate vereinigt und am Rotationsverdampfer auf 1oo ml eingeengt. Zur Entfärbung dieses Konzentrats wird es mit 2 g eines Anionenaustauschers auf Cellulosebasis (o,6 mVal/g) für 5 Minuten gerührt, dann zentrifugiert. Der hellgelbe Überstand wird mit einem gleichen Volumen (1oo ml Methanol) versetzt und dann in 2 Liter Aceton unter intensivem Rühren eingetropft. Der Niederschlag wird abgenutscht, mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum bei 35⁰C getrocknet. Ausbeute: 4,2 g mit 2β.οοο SIE/g.

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Zu einer weiteren Feinreinigung werden die 4,ο g Inhibitor in o,5 g Portionen über ein Polyacrylamid-Gel gelfiltriert. Dazu werden o,5 g des Präparats in 1o ml HpO gelöst und auf eine mit dem Gel gefüllte · Säule (2oo - 4oo mesh) vom Durchmesser 5 cm und der Länge 95 cm aufgetragen. Man entwickelt in Wasser bei einer Fließrate von 8o ml/Stunde. Es werden 12 ml Fraktionen gesammelt. Von allen Fraktionen wird der Gesamtkohlenhydratgehalt (in Form des Anthrontests als Extinktion bei Egp ) sowie der Gehalt an Saccharase-Inhibitor und Amylase-Inhibitor ermittelt. Außerdem werden die Fraktionen dünnschichtchromatographisch geprüft.

Die Fraktionen, in denen die Aminozuckerderivate der Formel I mit R = 4 bis β Hexoseresten nachgewiesen werden, werden vereinigt, im Vakuum auf to ml eingeengt und durch Eintropfen in 2oo ml Äthanol gefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet; Ausbeute aus 4,ο g,Rohinhibitor: o,2 g Aminozuckerderivat (R = 4 bis 6 Hexosereste) mit 17,5 x 1o AIE/g und 8.5oo SIE/g. Die das Aminozuckerderivat mit R = 3 Hexoseresten enthaltenden Fraktionen werden in gleicher Weise aufgearbeitet, wobei die Fällung mit 2oo ml Aceton erfolgt; Ausbeute aus 4,ο g Rohinhibitor: o,1 g Aminozuckerderivat mit R = 3 Hexoseresten mit 1,4 χ 1o AIE/g und 21.ooo SIE/g. Aus den das Aminozuckerderivat mit R = 2 Hexoseresten enthaltenden Fraktionen (Fällung mit Aceton) werden o,9 g Aminozuckerderivat mit R = zwei Hexoseresten mit o,3 x 1o AIE/g und 68.000 SIE/g isoliert.

Beispiel 5

Zur Gewinnung der Aminozuckerderivate der Formel I, in welchen R für 5 bis 7 Hexosereste steht, geht man z. B. von einer Zubereitung, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wird, aus.

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509840/055 0

Hierzu werden ?5o g der Zubereitung nach Beispiel 1 in 25o ml H₂O gelöst. Die Leitfähigkeit dieser Lösung beträgt 1o mS, das pH 5.5. Zur Entsalzung wird die Lösung mit 6o g eines schwach sauren Kationenaustauschers, der die Aminozuckerderivate aus wässriger Lösung nur spurenweise bindet, und 2o g eines stark basischen Ionenaustauschers versetzt und 2o Minuten gerührt. Das Filtrat (Leitfähigkeit o,5 mS,pH 3.5) wird mit 1 η HCl auf pH 3.0 eingestellt (Leitfähigkeit o,6 mS). Diese Lösung wird mit 42 ml/Stunde durch eine mit einem stark sauren Ionenaustauscher gefüllte Säule (Durchmesser 2,5 cm, Höhe 4o cm, äquilibriert in o.oc-1 η HCl) gepumpt und anschließend mit 2 Liter o.oo1 η HCl nachgewaschen. Nach dem Waschen der Säule eluiert man mit 1,2 % wässrigem Ammoniak und sammelt 1o ml Fraktionen. Die gemäß den Amylase- und Saccharasetests aktiven Fraktionen werden vereinigt, das Ammoniak im Vakuum abgezogen und die Lösung anschließend im Vakuum auf 3ο ml eingeengt. Man fällt durch Eintropfen in 600 ml Äthanol, nutscht den Niederschlag ab und trocknet im Vakuum nach Waschen mit Äthanol und Äther. Ausbeute: 4,4 g mit 26,5 x 1o AIE/g.

Jeweils o_#5 g werden zur Feinreinigung auf eine präparative, mit einem Polyacrylamid-Gel gefüllte Säule, wie in Beispiel 4 beschrieben, aufgetragen und entwickelt. Die gemäß Dünnschichtchromatogramm ermittelten,Aminozuckerderivate der Formel I mit R = 5 bis 7 Hexoseresten enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum eingeengt und wie oben beschrieben mit Äthanol gefällt. Ausbeute aus o,5 g Rohprodukt: o,2 g Aminozuckerderivate der Formel I,wobei R für 5 bis 7 Hexosereste steht, mit 3o χ 1o AIE/g und 2.5oo SIE/g. Durch mehrmalige Rechromatographie können die einzelnen homologen Aminozuckerderivate mit R = 5, 6 und 7 Hexoseresten erhalten werden.

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In den obigen Beispielen bedeutet, wo nichts anderes angegeben, % Gewichtsprozente.

Erläuterung einiger verwendeten Reagentien und Hilfsmittel:

Als Ionenaustauscher können z.B. die im Handel befindlichen Produkte Amberlite IRA 410 Cl"" (Anionenaustauscher); Amberlite IRC 120 (H⁺-Form) (stark saurer Kationenaustauscher); Amberlite (HCO,'-Form) (Anionenaustauscher); Amberlite IRA 410 OH" (stark basischer Anionenaustauscher); Amberlite IRC H⁺ (schwach saurer Kationenaustauscher) /""Warenzeichen der Firma Rohm and Haas Company J sowie Dowex 50 WX 4H⁺ (stark saurer Kationenaustauscher) ^"Warenzeichen der Firma Dow Chemical Co. Midland, Michigan, USA_-Z verwendet werden.

Als Anionenaustauscher auf Cellulosebasis kann z.B. DE AE-Zellulose der Firma Schleicher und Schüll verwendet werden.

Als Polyacrylamid-Gel kann z.B. Biogel-P-2 (Warenzeichen der Firma Bio Rad Laboratories, Richmond, California, USA) verwendet werden.

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Im folgenden seien "beispielhaft die niederen homologen Aminozuckerderivate der Formel I, in welcher R für 1 bis 7 Glucosereste steht, durch physiko-chemische Daten näher charakterisiert:

1. R = 1 Glucoserest (im folgenden "A" genannt)

Die Verbindung ist eine farblose, amorphe Festsubstanz mit guter Löslichkeit in H₂O, DMF, DMSO und MeOH. In der Hitze ist sie auch in Äthanol löslich.

a) Dünnschichtchromatographie:

Fließmittel: Essigsäureäthylester / Methanol / H^O 1o : 6 : 4 (Volumenteile)

I. Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (DC-Fertigfolien F 15oo Kieselgel der Firma Schleicher und Schüll)

Rf-Werte A: ο,46 Maltose: o,5o Glucose: o,65

II. Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (DC-Fertigplatten F 254 Kieselgel der Firma Merck)

Rf-Werte A: o,47 Maltose: o,54 Glucose: o,66

b) Drehwinkel:

Eine durch Einengen einer methanolischen Lösung von A gewonnene, nicht kristalline Probe von A wurde in Wasser gelöst und die spezifische Drehung zu C⁰^Or\ -bestimmt.

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c) IR-Spektrum:

Wenig aussagekräftiges, schlecht strukturiertes IR-Spektrum in KBr. Hauptabsorptionsbanden im Bereich der O-H und C-O Valenzschwingungen.

d) NMR-Spektrum in CD,OD bei 22o MHz:

</ im ppm	Multiplizität	J=6_:	7	Hz	relative	H	gegen
		r«jU.«	2	8-1 ο Hz	Intensität	H	Deute
1,3	Dublett:	r^u.<		7-9 Hz	3	H	rium
2,3	"Triplett"; ν			einzeln	1	H	ausge-
3,15	"Triplett"; ,	,5			1		tausch
3,3 - 3,9	Signale sind	O		Hz	12	H	te Pro
	zuzuordnen!	O		Hz )		H	tonen
4,13	AB-System; J	nicht		,5 Hz ]	2
4,48 )	Dublett;				1
u. 5,1 ]	Dublett;	= i;				H
		J =
4,9	Singlett	J ^=:		11

5,o 5,8

Dublett; J = 2-3 Hz (schlecht aufgelöst)

Dublett; J = 3-4 Hz (schlecht aufgelöst)

33 H

Zum Sichtba'rmachen des Aninozuckerderivates auf Kieselgelplatten benutzt man am besten das AgNO,/NaOH-Sprühreagens, Eine braun-schwarze Anfärbung erfolgt schon bei Raumtemperatur oder nach geringfügigem Erwärmen.

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- 33 -

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2. R = 2 Glucose reste (im folgenden "B" genannt)

B ist ein gut wasserlösliches amorphes Festprodukt.

a) Dünnschichtchromatographie:

Fließmittel: Essigsäureäthylester/Methanol/ELO 1o : 6 : 4 (Volumenteile)

I. Dünnschichtchromatographie am Kieselgel (DC-Fertigfolien F 15oo Kieselgel (Schleicher + Schüll):

Rf-Werte B: ο,35 Maltose: o,5o

II. Dünnschichtchromatographie am Kieselgel (DC-Fertigplatten F 254 Kieselgel (Merck):

Rf-Werte B: o,33 Maltose: ο,54

B gibt mit dem AgNO₇./NaÖH-Sprühreagens schon bei Raumtemperatur oder leichtem Erwärmen der Platten eine braun-schwarze Anfärbung.

b) IR-Spektrum:

Wenig aussagekräftiges, schlecht aufgelöstes IR-Spektrum in KBr. Hauptabsorptionsbanden im Bereich der 0-H und C-O Valenzschwingungen
(37oo - 31oo cm" bzw. 118o-95o cm" ).

c) Drehwinkel:

Γ<*ί-7_Ώ ^{in H}2^0: +1^7,2°

3. R = 3 Glucosereste (_im folgenden "C" genannt)

Die Verbindung C läßt sich bei saurer Partialhydrolyse in die Verbindung A und Glucose im Molverhältnis 1: 2 spalten.

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is-

Dünnschichtchromatographie:

Fließmittel: n-Butanol/Äthanol/Wasser = 5o : 3o : 2o (Volumenteile)

Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (DC-Fertigplatten F 15oo Kieselgel (Schleicher + Schüll):

^RGlucose-^{¥erte C:} °'⁴¹ ~ °'⁴⁶

R = 4, 5, 6 und 7 Glucoseresten (im folgenden "D", "E", "F" und "G" genannt)

Dünnschichtchromatographie:

Fließmittel: n-Butanol/Äthanol/Wasser = 5o : 3o : 2o

(Volumenteile)

^RGlucose-^¥erte -^D: ο»3o - o,34

E: o,21-o,23

F: o,14 - 0,16

G: o,o9 - o,11

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Claims

Patentansprüche

R für eine Oligosaccharidkette mit 1 bis 4o Hexose-

in Tieren zur Vermeidung eines unerwünschten Fettansatzes und zur Erreichung eines erhöhten Fleischansatzes sowie zur besseren Futterausnutzung.
2.) Verwendung gemäß Anspruch 1 in landwirtschaftlichen Nutztieren.
3.) Verwendung gemäß Ansprüchen 1 und 2 in Schweinen.
4.) Tieren zu verabreichende Mittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einer Verbindung gemäß der Formel in Anspruch 1.
5.) Premix, gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einer Verbindung gemäß der Formel in Anspruch 1.
6.) Tierfutter, gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einer Verbindung gemäß der Formel in Anspruch 1.
7.) Verfahren zur Herstellung von Mitteln gemäß den Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine Verbindung gemäß der Formel in Anspruch 1 mit nichttoxischen essbaren Trägerstoffen vermischt.

Le A 15 475 - 36 -

5 0 9 8 A 0 / 0 5 5 0
8.) Verfahren zur Herstellung von Tierfutter gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine Verbindung gemäß der Formel in Anspruch 1 gegebenenfalls in Form eines Premixes mit dem Tierfutter vermischt.

Le A 15 475 - 37 -

5098 It 0/0550