DE2726899C1 - - Google Patents

Description

Die Erfindung ist durch die Patentansprüche definiert.

Es ist bekannt, daß eine Reihe von Actinomyceten, vor allem Actinoplanaceen, Inhibitoren für Glydosidhydrolasen, vorzugsweise kohlenhydratspaltende Enzyme des Verdauungstraktes, bilden (DE-OS 20 64 092).

Weiterhin weiß man, daß Nojirimycin, ein bakteriostatisch wirkendes Antibioticum aus Stämmen der Gattung Streptomyces, gewisse mikrobielle α-Glucosidasen hemmt (T. NIWA et al. Agr. Biol. Chem. 34, 966 [1970]).

Die vorliegende Erfindung betrifft Inhibitoren für Glykosidhydrolasen, und zwar insbesondere Glucosidase-Inhibitoren, die im Verdauungstrakt wirksam werden.

Diese Inhibitoren werden von bestimmten Stämmen der Gattung Bacillus gebildet (vgl. die Ansprüche 1 bis 5).

Zur Auffindung der erfindungsgemäß einzusetzenden Stämme bediente man sich der nachstehend beschriebenen Methoden.

Aus Erdproben isoliert man in bekannter Weise Stämme der Familie Bacillaceae, insbesondere solche der Gattung Bacillus. Mit Abimpfungen dieser Stämme beimpft man Kulturkolben mit Nährlösungen, die das Wachstum dieser Stämme ermöglichen. Man kann z. B. eine Nährlösung verwenden, die 5 g Pepton und 3 g Fleischextrakt pro Liter enthält, jedoch sind grundsätzlich viele andere Typen von Nährlösungen, die geeignete Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Nährsalze enthalten, einsetzbar. Der pH-Wert der Nährlösungen kann in weiten Grenzen variieren; bevorzugt wird ein Anfangs-pH der Nährlösung zwischen 6,0 und 8,0 gewählt.

Als Kohlenstofflieferant für die Nährlösung kommen die verschiedenartigsten organischen Substanzen in Frage. Kohlenhydrate, organische Säuren und Alkohole seien beispielsweise genannt.

Als Stickstoffquelle können Hefeextrakt, Sojamehl, Peptone, Fleischextrakt und viele andere organische Substanzen Verwendung finden.

Die Konzentrationen der Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie der Nährsalze, von denen FeSO₄, CaCO₃ und MgSO₄ beispielhaft erwähnt seien, können in weiten Grenzen schwanken. Auf den gesonderten Zusatz von Nährsalzen kann in manchen Fällen ganz verzichtet werden, da sie oftmals in den komplexen Stickstoffquellen als Beimengungen enthalten sind.

Da die Bildung von Inhibitoren oft stark von der Zusammensetzung der Nährböden abhängig ist, empfiehlt es sich, die Stämme zur Optimierung der Produktionsleistung in verschiedenen Nährlösungen zu kultivieren. Entsprechende Vorschläge können den Beispielen entnommen werden.

Von der Nährlösung füllt man z. B. 100-200 ml in einen 1-Liter-Erlenmeyer-Kolben, sterilisiert in bekannter Weise, beimpft mit dem zu untersuchenden Stamm und bebrütet den Kolben bei 15-80°C, vorzugsweise bei 24-40°C bzw. 50-70°C bei thermophilen Bacillen, auf Schüttelmaschinen. Zeigt die Kultur Wachstum, was im allgemeinen nach 1-10 Tagen, meist nach 1-5 Tagen, sichtbar wird, so entnimmt man eine Probe von z. B. 5 ml und trennt in dieser Probe die Zellen durch Filtration oder Zentrifugation ab. Von den Kulturbrühen werden 1-100 µl in die nachfolgend beschriebenen Tests eingesetzt und die Hemmkapazität pro ml berechnet.

Die Zellen werden zweimal mit je 5 Volumina (bezogen auf das Zellvolumen) Aceton und anschließend einmal mit 5 Volumina Diethylether extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden zur Trockene eingeengt, in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Die Lyophilisate werden in Konzentrationen von 10-1000 µg/ml in die nachfolgend beschriebenen Tests eingesetzt.

Amylasetest

Eine Amylase-Inhibitor-Einheit (1 AIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Amylaseeinheiten zu 50% inhibiert. Eine Amylaseeinheit (AE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 µ Äquivalent glucosidischer Bindungen in der Stärke spaltet. Die µVal gespaltenen Bindungen werden als µVal gebildeter reduzierender Zucker mit Dinitrosalicylsäure kolorimetrisch bestimmt und mit Hilfe einer Maltoseeichkurve als µVal Maltoseäquivalente angegeben. Zur Durchführung des Testes werden 0,1 ml Amylaselösung (20-22 AE/ml) mit 10-1000 µg Inhibitor oder 1-100 µl der zu testenden Kulturlösung in 0,4 ml 0,02 M Natriumglycerophosphatpuffer/0,001 M CaCl₂ pH 6,9 versetzt und etwa 10-20 Minuten in einem Wasserbad von 35°C äquilibriert. Dann wird 5 Minuten mit 0,5 ml einer auf 35°C vorgewärmten 1%-Stärkelösung bei 35°C inkubiert und anschließend mit 1 ml Dinitrosalicylsäure-Reagens (nach P. Bernfeld in Colowick-Kaplan, Meth. Enzymol., Band 1, Seite 149) versetzt. Zur Farbentwicklung wird der Ansatz 5 Minuten auf dem siedenden Wasserbad erhitzt, dann abgekühlt und mit 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Die Extinktion bei 540 nm wird gegen einen entsprechend angesetzten Leerwert ohne Amylase gemessen. Zur Auswertung wird aus einer vorher aufgenommenen Amylaseeichkurve die nach Inhibitorzusatz noch wirksame Amylaseaktivität abgelesen und daraus die prozentuale Hemmung der eingesetzten Amylase errechnet. Die prozentuale Hemmung wird als Funktion des Quotienten

 *) bezogen auf Trockensubstanz
**) AE in nicht inhibiertem Ansatz der gleichen Serie

aufgetragen, der 50% Hemmungspunkt aus der Kurve abgelesen und auf AIE/mg Inhibitor umgerechnet.

Saccharasetest

Eine Saccharase-Inhibitor-Einheit (SIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Saccharaseeinheiten zu 50% inhibiert. Eine Saccharaseeinheit (SE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 µMol Saccharose in Glucose und Fructose spaltet. Die µMol gebildete Glucose werden mit Hilfe Glucoseoxidasereaktion quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere Saccharosespaltung durch die Saccharase nicht mehr stattfindet. Zur Durchführung des Tests werden 0,05 ml einer auf 0,12 SE eingestellten Saccharaselösung¹) mit 1-20 µg Inhibitor oder 1-20 µl der zu testenden Lösung versetzt und mit 0,1 M Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf 0,1 ml aufgefüllt.

¹) Solubilisierte Saccharase aus Schweinedünndarmmucosa nach B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. 12, (1958), Seite 1997. Mit 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf entsprechenden SE-Gehalt verdünnt.

Es wird 10 Minuten bei 35°C äquilibriert und dann mit 0,1 ml einer auf 35°C vorgewärmten 0,05 m Saccharoselösung in 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 35°C und stoppt die Saccharasereaktion durch Zugabe von 1 ml Glucoseoxidasereagens¹) ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35°C. Danach wird 1 ml 50% H₂SO₄ zugesetzt und bei 545 nm gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen. Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Saccharose berechnet und aus dem 50% Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf SIE/g bzw. SIE/Liter umgerechnet.

Maltasetest

Eine Maltase-Inhibitor-Einheit (MIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Maltaseeinheiten zu 50% inhibiert. Eine Maltaseeinheit (ME) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 µMol Maltose in 2 µMol Glucose spaltet. Die µMol gebildete Glucose werden mit Hilfe der Glucoseoxidasereaktion quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere Maltosespaltung durch die Maltase nicht mehr stattfindet. Zur Durchführung des Testes werden 0,05 ml einer auf 0,060-0,070 ME eingestellten Maltaselösung²) mit 1-20 µg Inhibitor oder 1-20 µl der zu testenden Lösung versetzt und mit 0,1 Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf 0,1 ml einer auf 35°C vorgewärmten 0,05 M Maltoselösung in 0,1 M Natriummaleinatpuffer pH 6,0 versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 35°C und stoppt die Maltasereaktion durch Zugabe von 1 ml Glucoseoxidasereagens¹) ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35°C.

Danach wird 1 ml 50% H₂SO₄ zugesetzt und bei 545 gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen.

¹) Das Glucoseoxidasereagens wird durch Lösung von 2 mg Glucoseoxidase (Reinheitsgrad I) in 100 ml 0,565 m Tris- HCl-Puffer pH 7,0 und anschließendem Zusatz von 1 ml Detergenslösung (2 g Triton X 100 + 8 g 95% Ethanol p. a.), 1 ml Dianisidinlösung (260 mg o-Dianisidin · 2 HCl in 20 ml H₂O) und 0,5 ml 0,1%iger wäßriger Peroxidaselösung (Fa. Boehringer, Lyophilisat, Reinheitsgrad II) hergestellt.
²) Solubilisierte Maltase aus Schweinedünndarmmucosa nach B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. 12, (1958), Seite 1997. Mit 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf entsprechenden ME-Gehalt verdünnt.

Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Maltase berechnet und aus dem 50% Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf MIE/g bzw. MIE/Liter umgerechnet.

Nach der oben beschriebenen Methode wurde eine ganze Reihe von Stämmen der Familie Bacillaceae geprüft. Dabei wurden insbesondere bei Stämmen der Art Bacellus subtilis deutliche Glykosidhydrolasen inhibierende Aktivitäten gefunden.

Die Häufigkeit, mit der nach der angegebenen Methode Stämme gefunden wurden, die sich in den Tests als aktive Inhibitoren erwiesen, lag über 5%. Besonders wirksame Stämme werden in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1

Bacillus-Stämme mit Saccharase-Inhibitor-Wirkung

Die aufgeführten Stämme sind unter den angegebenen DSM- Nummern bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Göttingen hinterlegt und von dort zu beziehen.

Zur Gewinnung der Glycosid-Hydrolasen-Inhibitoren werden die oben aufgeführten Stämme in den oben beschriebenen Nährlösungen kultiviert. Dabei ist zu beachten, daß praktisch jeder Stamm zur optimalen Produktion eine andere, qualitativ und quantitativ anders zusammengesetzte Nährlösung benötigt.

Nach 1-10tägiger Bebrütung bei 15-80°C, vorzugsweise 24-40°C bzw. bei Thermophilen 50-70°C, in Schüttelkolben oder in Fermentern verschiedener Größe werden die Zellen von der Kulturlösung abgetrennt und je nach dem Auftreten der Inhibitoren das wirksame Prinzip aus der Kulturlösung und/oder aus den Zellen angereichert.

Aus den Kulturbrühen gewinnt man die Inhibitoren durch Lyophilisation oder Fällung mit Salzen oder wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln (wie z. B. niedere Alkohole und Ketone) oder durch Adsorption der Wirkstoffe an Ionenaustauschern.

Aus den Zellen gewinnt man die Inhibitoren durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Alkoholen, Ketonen, Ethern, Estern und Sulfoxiden.

Dazu wird der Fermentationsansatz bei 3000-20 000 Upm, vorzugsweise 6-10 000 Upm, 10-60 Minuten, vorzugsweise 30 Minuten, zentrifugiert oder filtriert, vorzugsweise mit Druck und unter Zuhilfenahme von Filterhilfsmitteln, und derart in Kulturbrühe und Zellrückstand getrennt.

Die Isolierung des Inhibitors aus der jeweiligen Kulturbrühe kann auf verschiedene Weise erfolgen:

• a) Einengen der Kulturbrühen bei vermindertem Druck (10-50 Torr) bei Bad-Temperaturen von 20-100°C, vorzugsweise 40-80°C, auf ca. 1/5-1/50 des Ausgangsvolumens. Der eingeengte Extrakt wird filtriert oder zentrifugiert und das klare Filtrat (der klare Überstand) evtl. nach vorheriger Entsalzung lyophilisiert.
• b) Ausfällung der Inhibitoren aus der Kulturbrühe (oder den nach a) eingeengten Kulturbrühen) durch Zusatz von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Alkoholen oder Ketonen, vorzugsweise Methanol, Äthanol, Aceton, bis zu einem Gehalt von 60-90%. Da bei niederer Konzentration an Lösungsmittel inaktive Begleitsubstanzen gefällt werden, eignet sich dieses Fällungsverfahren besonders gut zur fraktionierenden Fällung zur Abtrennung von unerwünschten Begleitstoffen.
• c) Aussalzen der Inhibitoren aus den Extrakten (oder den nach a) eingeengten Extrakten), z. B. mit Ammonsulfat, Kochsalz usw. Der ausfallende Niederschlag wird durch Zentrifugation oder Filtration gesammelt und entweder direkt mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet oder nach Rücklösen in Wasser dialysiert und lyophilisiert.
• d) Adsorption der Inhibitoren an Ionenaustauscher. Dieses Verfahren eignet sich zur Isolierung von solchen Inhibitoren, die auf Grund ihrer chemischen Natur Ladungen tragen. Die Desorption des Inhibitors geschieht durch Änderung der Ionenstärke oder des pH- Wertes des Elutionsmediums.

Beispiel

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 100 ml der Nährlösung A enthält, mit einer Impföse mit Zellmaterial aus einem bewachsenen Schrägröhrchen des Stammes DSM 1060 und schüttelt diesen Kolben 5 Tage bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so erhält man eine Kulturbrühe mit 35 000 Saccharaseinhibitor-Einheiten pro Liter.

Nährlösung A (NL A)

3%Sojamehl entfettet, 3% Glycerin, reinst, 0,3% CaCO₃ p. A., Leitungswasser, pH 6,85 Sterilisation: 30 Minuten bei 121°C. pH nach der Sterilisation: 7,2.

Nährlösung B (NL B)

2% Maisstärke, 1% Glucose pro Inf., 0,5% N-Z- Amine A, 21,0% Hefe-Extr., Leitungswasser, pH 5,95 mit Na₂CO₃-Lösung (ca. 10%ig) auf pH 7,2 einst., dann 0,4% CaCO₃ p. A. zugeben. Sterilisation: 30 Minuten bei 121°C, pH nach der Sterilisation: 7,6.

Neben dem Inhibitor finden sich in den Kulturbrühen häufig unerwünschte Begleitsubstanzen. Die Abtrennung dieser Begleitstoffe kann auf verschiedene Weise erfolgen, z. B. durch Hitzedenaturierung der Begleitstoffe bei Inhibitoren, die hitzestabil sind, oder durch Dialyse durch entsprechende Membranen bei niedermolekularen Inhibitoren, wobei die ungewünschten Begleitstoffe von der Membran zurückgehalten werden oder durch fraktionierende Fällung oder durch Adsorption der Begleitstoffe an Ionenaustauscher (siehe oben).

Die Gewinnung von Inhibitoren aus den Zellen geschieht durch mehrmalige Extraktion der Zellen mit organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise zweimaliger 10-20minütiger Extraktion mit 3-5 Vol. Aceton (bezogen auf das Zellfeuchtvolumen) und anschließend einmaliger 5-10minütiger Extraktion mit Ether. Die Aceton- und Äther-Extrakte werden im Vakuum zur Trockne eingeengt, in Wasser aufgenommen lyophilisiert.

Die neuen Substanzen lösen sich gut in Wasser. Eine Gruppe der Inhibitoren ist bei neutralen pH-Werten hitzestabil, säurestabil (pH 2), alkalistabil (pH 12) und dialysierbar. Diese Inhibitoren werden durch Trypsin und Pepsin nicht inaktiviert, sie hemmen ihrerseits die genannten Enzyme nicht. Sie sind mit den typischen Proteinfärbestoffen nicht anfärbbar. Nach Abschätzungen aus der Gelfiltration liegt das Molekulargewicht dieser Inhibitoren über 100, aber unter 2000.

Die besten Inhibitoren dieser Gruppen zeichnen sich durch eine extrem hohe, auch alle bisher bekannten Saccharase- Inhibitoren übertreffende Hemmaktivität gegenüber Saccharase aus.

Es ist außerordentlich überraschend und war nicht vorherzusehen, daß diese Inhibitoren von Organismen der Art Bacillus subtilis produziert werden, da sich diese Mikroorganismen im allgemeinen als Sekundärstoff-Produzenten weniger eignen und allenfalls im wesentlichen peptidartige Sekundärstoffe bilden.

Es ist bekannt, daß bei Tieren und Menschen nach Aufnahme von kohlenhydrathaltigen Nahrungsmitteln und Getränken (z. B. Getreide-, Kartoffelstärke, Obst, Fruchtsaft, Bier, Schokolade) Hyperglykämien auftreten, die infolge eines raschen Abbaus der Kohlenhydrate durch Glycosidhydrolasen (z. B. Speichel- und Pakreasamylasen, Maltasen, Saccharasen) nach folgendem Schema

bewirkt werden. Diese Hyperglykämien sind bei Diabetikern besonders stark und anhaltend ausgeprägt. Bei Adipösen bewirkt die alimentäre Hyperglykämie oftmals eine besonders starke Sekretion von Insulin, das seinerseits zu vermehrtem Fettaufbau und vermindertem Fettabbau führt. Im Anschluß an derartige Hyperglykämien tritt bei stoffwechselgesunden und adipösen Personen infolge der Insulinsekretion häufig eine Hypoglykämie auf. Bekannt ist, daß sowohl Hypoglykämien als auch im Magen verweilender Speisebrei die Produktion von Magensaft fördern, der seinerseits die Entstehung einer Gastritis, eines Ulcus ventriculi oder duondeni auslöst oder begünstigt.

Ferner ist bekannt, daß in der Mundhöhle Kohlenhydrate, besonders Saccharose, durch Mikroorganismen gespalten werden und dadurch die Kariesbildung gefördert wird.

Malabsorption von Kohlenhydraten, z. B. infolge intestinalen Saccharasemangels, bewirkt eine Diarrhoe.

Geeignete Dosen eines Glucosidase-Inhibitors bewirken eine künstliche Malabsorption und sind deshalb geeignet, einer Obstipation entgegenzuwirken.

Die erfindungsgemäßen Inhibitoren eignen sich deshalb als Therapeutica für folgende Indikationen:
Adipositas, Hyperlipoproteinämie, Atherosklerose, Diabetes, Prädiabetes, Gastritis, Obstipation, Karies.

Zur Verbreiterung des Wirkungsspektrums kann es sich empfehlen, Inhibitoren für Glycosidhydrolasen, die sich gegenseitig in ihrer Wirkung ergänzen, zu kombinieren, sei es, daß es sich um Kombinationen der erfindungsgemäßen Inhibitoren untereinander oder um Kombinationen der erfindungsgemäßen Inhibitoren mit bereits bekannten handelt. So kann es beispielsweise zweckmäßig sein, erfindungsgemäße Saccharase-Inhibitoren mit bereits bekannten Amylase-Inhibitoren zu kombinieren.

Vorteilhaft sind in manchen Fällen auch Kombinationen der erfindungsgemäßen Inhibitoren mit bekannten oralen Antidiabetica (β-cytotrope Sulfonylharnstoffderivate und/oder blutzuckerwirksame Biguanide) sowie mit blutlipid-senkenden Wirkstoffen wie z. B. Clofibrat, Nicotinsäure, Cholestyramin und andere.

Die Verbindungen können ohne Verdünnung, z. B. als Pulver, oder in einer Gelatinehülle oder in Kombination mit einem Trägerstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung appliziert werden.

Pharmazeutische Zubereitungen können eine größere oder kleinere Menge des Inhibitors enthalten, z. B. 0,1% bis 99,5%, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen nicht-toxischen, inerten Trägerstoff, wobei der Trägerstoff eine oder mehrere feste, halbfeste oder flüssige Verdünnungsmittel, Füllstoffe und/oder nicht- toxisches, inertes und pharmazeutisch-verträgliches Formulierungshilfsmittel enthalten kann. Solche pharmazeutischen Zubereitungen liegen vorzugsweise in Form von Dosierungseinheiten vor, d. h. physikalisch-diskrete, eine bestimmte Menge des Inhibitors enthaltenden Einheiten, die einem Bruchteil oder einem Vielfachen der Dosis entsprechen, die zur Herbeiführung der gewünschten Hemmwirkung entsprechen. Die Dosierungseinheiten können 1,2, 3, 4 oder mehr Einzeldosen oder 1/2, 1/3 oder 1/4 einer Einzeldosis enthalten. Eine Einzeldosis enthält vorzugsweise eine genügende Menge Wirkstoff, um bei einer Applikation gemäß eines vorher bestimmten Dosierungsschemas einer oder mehrerer Dosierungseinheiten die gewünschte Hemmwirkung zu erzielen, wobei eine ganze, eine halbe oder ein Drittel oder ein Viertel der Tagesdosis gewöhlich einmal, zweimal, dreimal oder viermal am Tage verabreicht wird. Andere therapeutische Mittel können auch eingenommen werden. Obgleich die Dosierung und das Dosierungsschema in jedem Fall sorgsam abgewogen werden sollte, unter Anwendung gründlichen fachmännischen Urteils und unter Beachtung des Alters, des Gewichts und des Zustands des Patienten, der Art und der Schwere der Erkrankung, wird die Dosierung gewöhnlich in einem Bereich zwischen etwa 30 bis etwa 3× 10⁵ AIE/kg und zwischen etwa 1 bis 1×10⁴ SIE/kg des Körpergewichtes pro Tag liegen. In manchen Fällen wird man dabei eine ausreichende therapeutische Wirkung mit einer geringeren Dosis erreichen, während in anderen Fällen eine größere Dosis erforderlich sein wird.

Orale Applikation kann unter Verwendung fester und flüssiger Dosierungseinheiten durchgeführt werden, wie z. B. Pulver, Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulate, Suspensionen, Lösungen und dergleichen.

Pulver wird durch Zerkleinerung der Substanz in einer geeigneten Größe und Vermischen mit einem ebenfalls zerkleinerten pharmazeutischen Trägerstoff hergestellt. Obgleich ein eßbares Kohlenhydrat, wie z. B. Stärke, Lactose, Saccharose oder Glucose normalerweise zu diesem Zwecke Verwendung findet und auch hier benutzt werden kann, ist es wünschenswert, ein nicht metabolisierbares Kohlenhydrat, wie z. B. ein Cellulosederivat, zu benutzen.

Süßmittel, Geschmackszusätze, Konservierungsstoffe, Dispergiermittel und Färbemittel können auch mitverwendet werden.

Die Kapseln können durch Zubereitung der oben beschriebenen Pulvermischung und durch Füllung bereits gebildeter Gelatinehüllen hergestellt werden. Die Pulvermischung kann man vor dem Füllvorgang mit Gleitmitteln, wie z. B. Kieselgel, Talkum, Magnesiumstearat, Calciumstearat oder festem Polyäthylenglykol, versetzen. Die Mischung kann man ebenfalls mit einem Desintegrator oder Lösungsvermittler, wie z. B. Agar-Agar, Calciumcarbonat oder Natriumcarbonat, versetzen, um bei Einnahme der Kapsel die Zugänglichkeit des Inhibitors zu verbessern.

Die Anfertigung der Tabletten erfolgt zum Beispiel durch Herstellung einer Pulvermischung, groß oder feinkörnig, und Hinzufügung eines Gleitmittels und Desintegrators. Aus dieser Mischung formt man Tabletten. Eine Pulvermischung bereitet man vor durch Mischung der Substanz, welche in geeigneter Weise zerkleinert wurde und ergänzt ein Verdünnungsmittel oder eine andere Trägersubstanz wie oben beschrieben. Gegebenenfalls fügt man ein Bindemittel hinzu: z. B. Carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine oder Polyvinylpyrrolidone, einen Lösungsverzögerer, wie z. B. Paraffin, einen Resorptionsbeschleuniger, wie z. B. quarternäres Salz und/oder ein Adsorptionsmittel, wie z. B. Brentonit, Kaolin oder Dicalciumphosphat. Die Pulvermischung kann granuliert werden zusammen mit einem Bindemittel, wie z. B. Syrup, Stärkepaste, Akazienschleim, oder Lösungen aus Zellulose- oder Polymerenmaterialien. Danach preßt man das Produkt durch ein grobes Sieb. Als Alternative hierzu kann man die Pulvermischung durch eine Tablettenmaschine laufen lassen und die sich ergebenden ungleichmäßig geformten Stücke bis auf Korngröße zerkleinern. Damit die entstandenen Körner nicht in den tablettenbildenden Düsen stecken bleiben, kann man sie mit einem Gleitmittel versetzen, wie z. B. Stearinsäure, Stearatsalz, Talkum oder Mineralöl. Diese gleitfähig gemachte Mischung wird dann in Tablettenform gepreßt. Die Wirkstoffe können auch mit freifließenden inerten Trägerstoffen vereinigt werden und direkt in Tablettenform gebracht werden unter Auslassung der Granulat- oder Zerstückelungsschritte. Man kann das Produkt mit einer klaren oder opaken Schutzhülle versehen, z. B. einem Überzug aus Schellack, einem Überzug aus Zucker oder Polymersubstanzen und einer polierten Hülle aus Wachs. Farbstoffe können diesen Überzügen beigefügt werden, damit zwischen den verschiedenen Dosierungseinheiten unterschieden werden kann.

Die oral zu verabreichenden Zubereitungsformen, wie z. B. Lösungen, Syrup und Elixire, lassen sich in Dosierungseinheiten herstellen, so daß eine bestimmte Menge Präparat eine bestimmte Menge Wirkstoff enthält. Syrup kann so hergestellt werden, daß der Wirkstoff in einer wäßrigen Lösung, welche geeignete Geschmacksstoffe enthält, gelöst wird; Elixire werden unter Verwendung nicht-toxischer, alkoholischer Trägerstoffe erhalten. Suspensionen kann man durch Dispergieren der Verbindung in einem nicht-toxischen Trägerstoff darstellen. Lösungsvermittler und Emulgiermittel, wie z. B. äthoxylierte Isostearylalkohole und Polyoxyäthylensorbitester, Konservierungsmittel, geschmacksverbessernde Zusätze, wie z. B. Pfefferminzöl oder Saccharin u. dgl., können auch zugegeben werden.

Dosierungsvorschriften können auf der Kapsel angegeben werden. Überdies kann die Dosierung so abgesichert sein, daß der Wirkstoff verzögert abgegeben wird, z. B. durch Einhalten des Wirkstoffes in Polymerensubstanzen, Wachse od. dgl.

Zusätzlich zu den obenerwähnten pharmazeutischen Zusammensetzungen lassen sich auch diese Wirkstoffe enthaltende Lebensmittel herstellen; beispielsweise Zucker, Brot, Kartoffelprodukte, Fruchtsaft, Bier, Schokolade und andere Konfektartikel, und Konserven, wie z. B. Marmelade, wobei zu diesen Produkten eine therapeutisch-wirksame Menge mindestens eines der erfindungsgemäßen Inhibitoren gegeben wurde.

Die erfindungsgemäßen Inhibitoren weisen weiterhin die Eigenschaft auf, in Tieren das Verhältnis des Anteiles an unerwünschtem Fett zum Anteil des erwünschten fettarmen Fleisches (mageres Fleisch) zugunsten des mageren Fleisches in hohen Maße zu beeinflussen. Dies ist von besonderer Bedeutung für die Aufzucht und Haltung von landwirtschaftlichen Nutztieren, z. B. in der Schweinemast, aber auch von erheblicher Bedeutung für die Aufzucht und Haltung von sonstigen Nutztieren und Ziertieren. Die Verwendung der Inhibitoren kann weiterhin zu einer erheblichen Rationalisierung der Fütterung der Tiere führen, sowohl zeitlich, mengenmäßig wie auch qualitätsmäßig. Da sie eine gewisse Verzögerung der Verdauung bewirken, wird die Verweildauer der Nährstoffe im Verdauungstrakt verlängert, wodurch eine mit weniger Aufwand verbundene ad libitum- Fütterung ermöglicht wird. Weiterhin ergibt sich bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Inhibitoren in vielen Fällen eine erhebliche Einsparung von wertvollem Proteinfutter.

Die Wirkstoffe können somit praktisch in allen Bereichen der Tierernährung als Mittel zur Reduzierung des Fettansatzes sowie zur Einsparung von Futtereiweiß verwendet werden.

Die Wirksamkeit der Wirkstoffe ist hierbei weitgehend unabhängig von der Art und dem Geschlecht der Tiere. Besonders wertvoll erweisen sich die Wirkstoffe bei Tierarten, die überhaupt oder in bestimmten Lebensabschnitten zu stärkerer Fetteinlagerung neigen.

Als Tiere, bei denen die Inhibitoren zur Reduzierung des Fettansatzes und/oder zur Einsparung von Futtereiweiß eingesetzt werden können, seien beispielsweise folgende Nutz- und Ziertiere genannt: Warmblüter, wie Rinder, Schweine, Pferde, Schafe, Ziegen, Katzen, Hunde, Kaninchen, Pelztiere, z. B. Nerze, Chinchilla, andere Ziertiere, z. B. Meerschweinchen und Hamster, Labor- und Zootiere, z. B. Ratten, Mäuse, Affen usw., Geflügel, z. B. Broiler, Hühner, Gänse, Enten, Truthähne, Tauben, Papageien und Kanarienvögel, und Kaltblüter, wie Fische, z. B. Karpfen, und Reptilien, z. B. Schlangen.

Die Menge der Wirkstoffe, die den Tieren zur Erreichung des gewünschten Effektes verabreicht wird, kann wegen der günstigen Eigenschaften der Wirkstoffe weitgehend variiert werden. Sie liegt vorzugsweise bei etwa 0,5 mg bis 2,5 g, insbesondere 10 bis 100 mg/kg Futter. Die Dauer der Verabreichung kann von wenigen Stunden oder Tagen bis zu mehreren Jahren betragen. Die passende Menge Wirkstoff sowie die passende Dauer der Verabreichung stehen in engem Zusammenhang mit dem Fütterungsziel. Sie hängen insbesondere von der Art, dem Alter, dem Geschlecht, dem Gesundheitszustand und der Art der Haltung der Tiere ab und sind durch jeden Fachmann leicht zu ermitteln.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe werden den Tieren nach den üblichen Methoden verabreicht. Die Art der Verabreichung hängt insbesondere von der Art, dem Verhalten und dem Allgemeinzustand der Tiere ab. So kann die Verabreichung einmal oder mehrmals täglich, in regelmäßigen oder unregelmäßigen Abständen, oral erfolgen. Aus Zweckmäßigkeitsgründen ist in den meisten Fällen eine orale Verabreichung, insbesondere im Rhythmus der Nahrungs- und/oder Getränkeaufnahme der Tiere, vorzuziehen.

Die Wirkstoffe können als reine Stoffe oder in formulierter Form verabreicht werden, wobei die formulierte Form sowohl als Premix, also in Mischung mit nicht-toxischen inerten Trägerstoffen beliebiger Art, als auch als Teil einer Gesamtration in Form eines Beifutters bzw. als Mischungsbestandteil eines alleinigen Mischfutters zu verstehen ist. Mit eingeschlossen ist auch die Applikation geeigneter Zubereitungen über das Trinkwasser.

Die Wirkstoffe können gegebenenfalls in formulierter Form auch zusammen mit anderen Nähr- und Wirkstoffen, z. B. Mineralsalzen, Spurenelementen, Vitaminen, Eiweißstoffen, Energieträgern (z. B. Stärke, Zucker, Fette), Farbstoffen und/oder Geschmacksstoffen oder anderen Futterzusatzstoffen, z. B. Wachstumsförderern, in geeigneter Form verabreicht werden. Die Wirkstoffe können den Tieren vor, während oder nach der Nahrungsaufnahme gegeben werden.

Empfehlenswert ist die orale Verabreichung zusammen mit dem Futter und/oder Trinkwasser, wobei je nach Bedarf die Wirkstoffe der Gesamtmenge oder nur Teilen des Futters und/oder Trinkwassers zugegeben werden.

Die Wirkstoffe können nach üblichen Methoden durch einfaches Mischen als reine Stoffe, vorzugsweise in fein verteilter Form oder in formulierter Form in Mischung mit eßbaren, nicht-toxischen Trägerstoffen, gegebenenfalls auch in Form eines Premix oder eines Futterkonzentrates, dem Futter und/oder dem Trinkwasser beigefügt werden.

Das Futter und/oder Trinkwasser kann beispielsweise die erfindungsgemäßen Wirkstoffe in einer Konzentration von etwa 0,001 bis 5,0%, insbesondere 0,02 bis 2,0% (Gewicht) enthalten. Die optimale Höhe der Konzentration des Wirkstoffs im Futter und/oder Trinkwasser ist insbesondere abhängig von der Menge der Futter- und/oder Trinkwasseraufnahme der Tiere und kann durch jeden Fachmann leicht ermittelt werden.

Die Art des Futters und seine Zusammensetzung ist hierbei ohne Belang. Es können alle gebräuchlichen, handelsüblichen oder speziellen Futterzusammensetzungen verwendet werden, die vorzugsweise das übliche, für eine ausgewogene Ernährung notwendige Gleichgewicht aus Energie- und Eiweißstoffen, einschließlich Vitaminen und Mineralstoffen, enthalten. Das Futter kann sich beispielsweise zusammensetzen aus pflanzlichen Stoffen, z. B. Ölkuchenschroten, Getreideschroten, Getreidenebenprodukten, aber auch aus Heu, Gärfutter, Rüben und anderen Futterpflanzen, aus tierischen Stoffen, z. B. Fleisch- und Fischprodukten, Knochenmehl, Fetten, Vitaminen, z. B. A-, D-, E-, K- und B- Komplex, sowie speziellen Proteinquellen, z. B. Hefen, sowie bestimmten Aminosäuren und Mineralstoffen und Spurenelementen, wie z. B. Phosphor und Eisen, Zink, Mangan, Kupfer, Kobalt, Jod usw.

Premixe können vorzugsweise etwa 0,1 bis 50%, insbesondere 0,5 bis 5,0% (Gewicht) der Wirkstoffe der Formel I neben beliebigen eßbaren Trägerstoffen und/oder Mineralsalzen, z. B. kohlensaurem Futterkalk, enthalten und werden nach den üblichen Mischmethoden hergestellt.

Mischfutter enthalten vorzugsweise 0,001 bis 5,0%, insbesondere 0,02 bis 2,0% (Gewicht) der Wirkstoffe der Formel I neben den üblichen Rohstoffkomponenten eines Mischfutters, z. B. Getreideschrote oder -nebenprodukte, Ölkuchenschrote, tierisches Eiweiß, Mineralien, Spurenelemente und Vitamine. Sie können nach den üblichen Mischmethoden hergestellt werden.

Vorzugsweise in Premixen und Mischfuttermitteln können die Wirkstoffe gegebenenfalls auch durch ihre Oberfläche bedeckende geeignete Mittel, z. B. mit nicht-toxischen Wachsen oder Gelatine, vor Luft, Licht und/oder Feuchtigkeit geschützt werden.

Beispiel für die Zusammensetzung eines fertigen Mischfutters, für Geflügel, das einen erfindungsgemäßen Wirkstoff enthält:
200 g Weizen, 340 g Mais, 360,3 g Sojaschrot, 60 g Rindertalg, 15 g Dicalciumphosphat, 10 g Calciumcarbonat, 4 g jodiertes Kochsalz, 7,5 g Vitamin-Mineral-Mischung und 3,2 g Wirkstoff-Premix ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg Futter.

Die Vitamin-Mineral-Mischung besteht aus:
6000 I.E. Vitamin A, 1000 I.E. Vitamin D₃, 10 mg Vitamin E, 1 mg Vitamin K₃, 3 mg Riboflavin, 2 mg Pyridoxin, 20 mcg Vitamin B₁₂, 5 mg Calciumpantothenat, 30 mg Nikotinsäure, 200 mg Cholinchlorid, 200 mg MnSO₄ × H₂O, 140 mg ZnSO₄ × 7 H₂O, 100 mg FeSO₄ × 7 H₂O und 20 mg CuSO₄ × 5 H₂O. Der Wirkstoff-Premix enthält den erfindungsgemäßen Inhibitor in der gewünschten Menge, z. B. 1600 mg, und zusätzlich 1 g DL-Methionin sowie soviel Sojabohnenmehl, daß 3,2 g Premix entstehen.

Beispiel für die Zusammensetzung eines Schweinemischfutters, das einen Wirkstoff der Formel I enthält:
630 g Futtergetreideschrot (zusammengesetzt aus 200 g Mais-, 150 g Gerste-, 150 g Hafer- und 130 g Weizenschrot), 80 g Fischmehl, 60 g Sojaschrot, 58,8 g Tapiokamehl, 38 g Bierhefe, 50 g Vitamin-Mineral-Mischung für Schweine (Zusammensetzung, z. B. wie beim Kükenfutter), 30 g Leinkuchenmehl, 30 g Maiskleberfutter, 10 g Sojaöl, 10 g Zuckerrohrmelasse und 2 g Wirkstoff-Premix (Zusammensetzung z. B. beim Kükenfutter) ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg Futter.

Die angegebenen Futtergemische sind vorzugsweise zur Aufzucht und Mast von Küken bzw. Schweinen abgestimmt, sie können jedoch in gleicher oder ähnlicher Zusammensetzung auch zur Aufzucht und Mast anderer Tiere verwendet werden.

Wie bereits erwähnt, können die Inhibitoren einzeln oder aber auch in beliebigen Mischungen untereinander verwendet werden, wobei sowohl die reinen Wirkstoffe als auch die bei der Herstellung erhaltenen rohen Wirkstoffe gegebenenfalls nach einer Grobreinigung eingesetzt werden.

Claims (8)

1. Inhibitoren für Glykosidhydrolasen aus den Stämmen DSM 1060, DSM 1061, DSM 1062, DSM 1063, DSM 1064, DSM 1065, DSM 1066 und DSM 1067, ausgenommen l-Desoxynojirimycin.

2. Inhibitoren für Glucosidasen, die im Verdauungstrakt wirksam werden, aus den Stämmen DSM 1060, DSM 1061, DSM 1062, DSM 1063, DSM 1064, DSM 1065, DSM 1066, DSM 1067, ausgenommen l-Desoxynojirimycin.

3. Inhibitoren für a-Glucosedasen des Verdauungstraktes aus den Stämmen DSM 1060, DSM 1061, DSM 1062, DSM 1063, DSM 1064, DSM 1065, DSM 1066 und DSM 1067, ausgenommen l-Desoxynojirimycin.

4. Saccharase-Inhibitoren aus den Stämmen DSM 1060, DSM 1061, DSM 1062, DSM 1063, DSM 1064, DSM 1065, DSM 1066 und DSM 1067, ausgenommen l-Desoxynojirimycin.

5. Verfahren zur Herstellung der Inhibitoren gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stämme DSM 1060, DSM 1061, DSM 1062, DSM 1063, DSM 1064, DSM 1065, DSM 1066 und DSM 1067 in üblichen Nährlösungen bei Temperaturen von etwa 15 bis etwa 80°C etwa 1 bis etwa 8 Tage unter Belüftung in üblichen Fermentationsgefäßen kultiviert, die Zellen abschleudert und die Inhibitoren aus der Kulturbrühe oder den Zellextrakten durch übliche Reinigungsoperationen isoliert.

6. Verwendung der Inhibitoren gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 zur Beeinflussung des Kohlenhydratstoffwechsels von Menschen und Tieren.

7. Verwendung der Inhibitoren gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 als Therapeutika zur Behandlung von Adipositas und/oder Atherosklerose und/oder Diabetes und/oder Prädiabetes und/oder Gastritis und/oder Obstipation und/oder Karies.

8. Verwendung der Inhibitoren gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 bei Tieren zur Vermeidung eines unerwünschten Fettansatzes und zur Erreichung eines erhöhten Fleischansatzes sowie zur besseren Futterausnutzung.