DE2661012C2 - - Google Patents
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Description
Es ist bekannt, daß eine Reihe von Actinomyceten, vor
allem Actinoplanaceen Inhibitoren für Glykosidhydrolasen,
vorzugsweise kohlenhydratspaltender Enzyme des Verdauungstraktes
bilden (DT-OS 20 64 092).
Weiterhin weiß man, daß Nojirimycin, ein bakteriostatisch
wirkendes Antibioticum aus Stämmen der Gattung
Streptomyces, gewisse mikrobielle α-Glucosidaten hemmt
(T. Niwa et al., Agr. Biol. Chem., 34, 966v [1970]).
Die Erfindung betrifft Arzneimittel, gekennzeichnet
durch einen Gehalt an Inhibitoren für Glucosidhydrolasen, erhalten dadurch,
daß man Organismen der Arten Bacillus subtilis,
Bacillus subtilis var. niger, Bacillus amyloliquefaciens,
Bacillus coagulans, Bacillus longisporus oder Bacillus
polymyxy in üblichen Nährlösungen bei Temperaturen von
etwa 15 bis etwa 80°C etwa 1 bis 8 Tage unter Belüftung
in üblichen Fermentationsgefäßen kultiviert, die Zellen
abschleudert und die Inhibitoren aus der Kulturbrühe
oder den Zellextrakten durch übliche Reinigungsoperationen
isoliert.
Zur Auffindung geeigneter Stämme bedient man sich der
nachstehend beschriebenen Methoden.
Aus Erdproben isoliert man in bekannter Weise Stämme der
Familie Bacillaceae, insbesondere solche der Gattung
Bacillus. Mit Abimpfungen dieser Stämme beimpft man
Kulturkolben mit Nährlösungen, die das Wachstum dieser
Stämme ermöglichen. Man kann z. B. eine Nährlösung verwenden,
die 5 g Pepton und 3 g Fleischextrakt pro Liter
enthält, jedoch sind grundsätzlich viele andere Typen
von Nährlösungen, die geeignete Kohlenstoff- und Stickstoffquellen
und Nährsalze enthalten, einsetzbar. Der
pH-Wert der Nährlösung kann in weiten Grenzen variieren;
bevorzugt wird ein Anfangs-pH der Nährlösung zwischen
6,0 und 8,0 gewählt.
Als Kohlenstofflieferant für die Nährlösung kommen die
verschiedenartigsten organischen Substanzen in Frage.
Kohlenhydrate, organische Säuren und Alkohole seien
beispielhaft genannt.
Als Stickstoffquelle können Hefeextrakt, Sojamehl, Peptone,
Fleischextrakt und viele andere organische Substanzen
Verwendung finden.
Die Konzentrationen der Kohlenstoff- und Stickstoffquellen
sowie der Nährsalze, von denen FeSO₄, CaCO₃ und
MgSO₄ beispielhaft erwähnt seien, können in weiten
Grenzen schwanken. Auf den gesonderten Zusatz von Nährsalzen
kann in manchen Fällen ganz verzichtet werden,
da sie oftmals in den komplexen Stickstoffquellen als
Beimengungen enthalten sind.
Da die Bildung von Inhibitoren oft stark von der
Zusammensetzung der Nährböden abhängig ist, empfiehlt
es sich, die Stämme zur Optimierung der Produktionsleistung
in verschiedenen Nährlösungen zu kultivieren.
Entsprechende Vorschläge können den Beispielen entnommen
werden.
Von der Nährlösung füllt man z. B. 100-200 ml in einen
1-Liter-Erlenmeyer-Kolben, sterilisiert in bekannter
Weise, beimpft mit dem zu untersuchenden Stamm und bebrütet
den Kolben bei 15-80°C, vorzugsweise bei 24-
40°C bzw. 50-70°C bei thermophilen Bacillen, auf
Schüttelmaschinen. Zeigt die Kultur Wachstum, was im
allgemeinen nach 1-10 Tagen, meist nach 1-5 Tagen,
sichtbar wird, so entnimmt man eine Probe von z. B. 5 ml
und trennt in dieser Probe die Zellen durch Filtration
oder Zentrifugation ab. Von den Kulturbrühen werden
1-100 µl in die nachfolgend beschriebenen Tests eingesetzt
und die Hemmkapazität pro ml berechnet.
Die Zellen werden zweimal mit je 5 Volumina (bezogen auf
das Zellvolumen) Aceton und anschließend einmal mit 5
Volumina Diethylether extrahiert. Die vereinigten Extrakte
werden zur Trockene eingeengt, in Wasser aufgenommen
und lyophilisiert. Die Lyophilisate werden in
Konzentrationen von 10-1000 µg/ml in die nachfolgend
beschriebenen Tests eingesetzt.
Eine Amylase-Inhibitor-Einheit (1 AIE) ist definiert als
die Menge Inhibitor, die zwei Amylaseeinheiten zu 50%
inhibiert. Eine Amylaseeinheit (AE) ist die Menge an
Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen
Testbedingungen 1 µ Äquivalent glucosidischer Bindungen
in der Stärke spaltet. Die µVal gespaltenen Bindungen
werden als µVal gebildeter reduzierender Zucker mit Dinitrosalicylsäure
kolorimetrisch bestimmt und mit Hilfe
einer Maltoseeichkurve als µVal Maltoseäquivalente angegeben.
Zur Durchführung des Testes werden 0,1 ml Amylaselösung
(20-22 AE/ml) mit 10-1000 µg Inhibitor oder
1-100 µl der zu testenden Kulturlösung in 0,4 ml 0,02
M Natriumglycerophosphatpuffer/0,001 M CaCl₂ pH 6,9
versetzt und etwa 10-20 Minuten in einem Wasserbad von
35°C äquilibriert. Dann wird 5 Minuten mit 0,5 ml einer
auf 35°C vorgewärmten 1%-Stärkelösung bei 35°C inkubiert
und anschließend mit 1 ml Dinitrosalicylsäure-Reagens
(nach P. Bernfeld in Colowick-Kaplan, Meth.
Enzymol., Band 1, Seite 149) versetzt. Zur Farbentwicklung
wird der Ansatz 5 Minuten auf dem siedenden Wasserbad
erhitzt, dann abgekühlt und mit 10 ml destilliertem
Wasser versetzt. Die Extinktion bei 540 nm wird gegen
einen entsprechend angesetzten Leerwert ohne Amylase
gemessen. Zur Auswertung wird aus einer vorher aufgenommenen
Amylaseeichkurve die nach Inhibitorzusatz noch
wirksame Amylaseaktivität abgelesen und daraus die prozentuale
Hemmung der eingesetzten Amylase errechnet. Die
prozentuale Hemmung wird als Funktion des Quotienten
aufgetragen, der 50%- Hemmungspunkt aus der Kurve
abgelesen und auf AIE/mg Inhibitor umgerechnet.
Eine Saccarase-Inhibitor-Einheit (SIE) ist definiert als
die Menge Inhibitor, die zwei Saccharaseeinheiten zu 50
% inhibiert. Eine Saccharaseeinheit (SE) ist die Menge
an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen
Testbedingungen 1 µMol Saccarose in Glucose und
Fructose spaltet. Die µMol gebildete Glucose werden mit
Hilfe der Glucoseoxidasereaktion quantitativ bestimmt
unter Bedingungen, bei denen eine weitere Saccharosespaltung
durch die Saccharase nicht mehr stattfindet.
Zur Durchführung des Testes werden 0,05 ml einer auf
0,12 SE eingestellten Saccharaselösung
(Solubisierte Saccharase aus Schweinedünndarmmucosa
nach B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem., 12
[1958], S. 1997. Mit 0,1 m Natriummaleinatpuffer
pH 6,0 auf entsprechenden SE-Gehalt verdünnt.)
mit 1-20 µg
Inhibitor oder 1-20 µl der zu testenden Lösung versetzt
und mit 0,1 M Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf 0,1 ml
aufgefüllt. Es wird 10 Minuten bei 35°C äquilibriert und
dann mit 0,1 ml einer auf 35°C vorgewärmten 0,05-m-
Saccharoselösung in 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0
versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 35°C und stoppt
die Saccharosereaktion durch Zugabe von 1 ml Glucoseoxidasereagens
(Das Glucoseoxidasereagens wird durch Lösen von 2
mg
Glucoseoxidase [Fa. Boehringer, Reinheitsgrad
I] in 100 ml 0,565 m Tris-HCl-Puffer pH 7,0 und
anschließenden Zusatz von 1 ml Detergenslösung [2 g
Triton-X-100+8 g 95% Ethanol p.a.], 1 ml
Dianisidinlösung [260 mg o-Dianisidin · 2 HCl in
20 ml H₂O] und 0,5 ml 0,1%iger wäßriger
Peroxidaselösung [Fa. Boehringer, Lyophilisat,
Reinheitsgrad II] hergestellt.)
ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei
35°C. Danach wird 1 ml 50% H₂SO₄ zugesetzt und bei 545
nm gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen. Zur
Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten
Saccharase berechnet und aus dem 50%-Hemmpunkt mit
Hilfe einer Glucoseeichkurve auf SIE/g bzw. SIE/Liter
umgerechnet.
Eine Maltase-Inhibitor-Einheit (MIE) ist definiert als
die Menge Inhibitor, die zwei Maltaseeinheiten zu 50%
inhibiert. Eine Maltaseeinheit (ME) ist die Menge an
Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen
Testbedingungen 1 µMol Maltose in 2 µMol Glucose spaltet.
Die µMol gebildete Glucose werden mit Hilfe der
Glucoseoxidasereaktion quantitativ bestimmt unter Bedingungen,
bei denen eine weitere Maltosespaltung
durch die Maltase nicht mehr stattfindet. Zur Durchführung
des Testes werden 0,05 ml einer auf 0,060-
0,070 ME eingestellten Maltaselösung
(Solubisierte Maltase aus Schweinedünndarmmucosa
nach B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand.,
12 [1958], Seite 1997. Mit 0,1 m Natriummaleinatpuffer
pH 6,0 a.)
mit 1-20 µg
Inhibitor oder 1-20 µl der zu testenden Lösung versetzt
und mit 0,1 M Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf 0,1 ml
einer auf 35°C vorgewärmten 0,05 M Maltoselösung in 0,1
M Natriummaleinatpuffer pH 6,0 versetzt. Man inkubiert
20 Minuten bei 35°C und stoppt die Maltasereaktion durch
Zugabe von 1 ml Glucoseoxidasereagens
(Das Glucoseoxidasereagens wird durch Lösen von 2
mg
Glucoseoxidase [Fa. Boehringer, Reinheitsgrad
I] in 100 ml 0,565 m Tris-HCl-Puffer pH 7,0 und
anschließenden Zusatz von 1 ml Detergenslösung [2 g
Triton-X-100+8 g 95% Ethanol p.a.], 1 ml
Dianisidinlösung [260 mg o-Dianisidin · 2 HCl in
20 ml H₂O] und 0,5 ml 0,1%iger wäßriger
Peroxidaselösung [Fa. Boehringer, Lyophilisat,
Reinheitsgrad II] hergestellt.)
ab und inkubiert
weitere 30 Minuten bei 35°C.
Danach wird 1 ml 50% H₂SO₄ zugesetzt und bei 545 nm
gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen.
Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten
Maltase berechnet und aus dem 50%-Hemmpunkt mit
Hilfe einer Glucoseeichkurve auf MIE/g bzw. MIE/Liter
umgerechnet.
Die Häufigkeit, mit der nach der angegebenen Methode
Stämme gefunden wurden, die sich in den Tests als aktive
Inhibitoren erwiesen, lag über 5%. Beispiele besonders
wirksamer Stämme werden in Tabelle 1 aufgeführt:
Bacillus-Stämme mit Saccharase-Inhibitor-Wirkung | |
Art | |
Stamm-Nr. | |
B. subtilis | |
DSM 704 | |
B. subtilis var. niger | DSM 675 (ATCC 9372) |
B. amyloliquefaciens | DSM 7 (ATCC 23 350) |
B. coagulans | DSM 1 (ATCC 7050) |
B. longisporus | DSM 479 (hemmt auch Amylase) |
B. polymyxa | DSM 365 |
B. polymyxa | DSM 372 |
B. polymyxa | DSM 742 |
B. polymyxa | DSM 292 |
B. polymyxa | DSM 356 (ATCC 8523) |
B. polymyxa | DSM 36 (ATCC 842) |
B. polymyxa | DSM 740 |
B. polymyxa | DSM 741 |
Die aufgeführten Stämme sind unter den angegebenen DSM-
Nummern bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen
(DSM), Göttigen, hinterlegt und von dort zu beziehen.
Die Stämme DSM 704, 740, 741 und 742 werden in Tabelle
2 beschrieben; die restlichen Stämme sind aus der Literatur
bekannt und werden im "Catalogue of Strains 1974"
der DSM aufgeführt.
Zur Gewinnung der Glycosid-Hydrolasen-Inhibitoren werden
die oben aufgeführten Stämme in den oben aufgeführten
Stämme in den oben beschriebenen Nährlösungen kultiviert.
Dabei ist zu beachten, daß praktisch jeder Stamm
zur optimalen Produktion eine andere qualitativ und
quantitativ anders zusammengesetzte Nährlösung benötigt.
Nach 1-10tägiger Bebrütung bei 15-80°C, vorzugsweise
24-40°C bzw. bei Thermophilen 50-70°C, in Schüttelkolben
oder in Fermentern verschiedener Größe werden die Zellen
von der Kulturlösung abgetrennt und je nach dem Auftreten
der Inhibitoren das wirksame Prinzip aus der
Kulturlösung und/oder aus den Zellen angereichert.
Aus den Kulturbrühen gewinnt man die Inhibitoren durch
Lyophilisation oder Fällung mit Salzen oder wasserlöslichen
organischen Lösungsmitteln (wie z. B. niedere
Alkohole und Ketone) oder durch Adsorption der Wirkstoffe
an Ionenaustauschern.
Aus den Zellen gewinnt man die Inhibitoren durch Extraktion
mit organischen Lösungsmitteln, wie z. B.
Alkoholen, Ketonen, Ethern, Estern und Sulfoxiden.
Dazu wird der Fermentationsansatz bei 3000-20 000 UpM,
vorzugsweise 6-10 000 UpM, 10-60 Minuten, vorzugsweise
30 Minuten, zentrifugiert oder filtriert, vorzugsweise
mit Druck und unter Zuhilfenahme von Filterhilfsmitteln,
in Kulturbrühe und Zellrückstand getrennt.
Die Stämme DSM 740, DSM 741, DSM 742 und DSM 704 sind
aufgrund von Sporenbildung und aerobem Wachstum der
Gattung Bacillus zuzuordnen. Die ermittelten morphologischen
und physiologischen Merkmale der Stämme DSM
740, DSM 741 und DSM 742 entsprechen denjenigen von
Bacillus polymyxa, während der Stamm DSM 704 der Art
Bacillus subtilis zuzuordnen ist.
Die Identifizierung erfolgte nach den Angaben von R. E.
Gordon, W. C. Haynes, C. Hor-Nay Pong: The Genus Bacillus,
Washington, 1973.
Die Isolierung des Inhibitors aus der jeweiligen Kulturbrühe
kann auf verschiedene Weise erfolgen:
- a) Einengen der Kulturbrühen bei vermindertem Druck (10-50 Torr) bei Bad-Temperaturen von 20-100°C, vorzugsweise 40-80°C, auf ca. 1/5-1/50 des Ausgangsvolumens. Der eingeengte Extrakt wird filtriert oder zentrifugiert und das klare Filtrat (der klare Überstand) evtl. nach vorheriger Entsalzung lyophilisiert.
- b) Ausfällung der Inhibitoren aus der Kulturbrühe (oder den nach a) eingeengten Kulturbrühen) durch Zusatz von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Alkoholen oder Ketonen, vorzugsweise Methanol, Ethanol, Aceton, bis zu einem Gehalt von 69-90%. Da bei niederer Konzentration an Lösungsmittel inaktive Begleitsubstanzen gefällt werden, eignet sich dieses Fällungsverfahren besonders gut zur fraktionierenden Fällung zur Abtrennung von unerwünschten Begleitstoffen.
- c) Aussalzen der Inhibitoren aus den Extrakten (oder den nach a) eingeengten Extrakten), z. B. mit Ammonsulfat, Kochsalz usw. Der ausfallende Niederschlag wird durch Zentrifugation oder Filtration gesammelt und entweder direkt mit Aceton und Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet oder nach Rücklösen in Wasser dialysiert und lyophilisiert.
- d) Adsorption der Inhibitoren an Ionenaustauscher. Dieses Verfahren eignet sich zur Isolierung von solchen Inhibitoren, die auf Grund ihrer chemischen Natur Ladungen tragen. Die Desorption des Inhibitors geschieht durch Änderung der Ionenstärke oder des pH-Wertes des Elutionsmediums.
Neben dem Inhibitor finden sich in den Kulturbrühen
häufig unerwünschte Begleitsubstanzen. Die Abtrennung
dieser Begleitstoffe kann auf verschiedene Weise erfolgen,
z. B. durch Hitzedenaturierung der Begleitstoffe bei
Inhibitoren, die hitzestabil sind oder durch Dialyse
durch entsprechende Membranen bei niedermolekularen Inhibitoren,
wobei die ungewünschten Begleitstoffe von der
Membran zurückgehalten werden oder durch fraktionierende
Fällung (vgl. b) oder durch Adsorption der Begleitstoffe
an Ionenaustauscher.
Die Gewinnung von Inhibitoren aus den Zellen geschieht
durch mehrmalige Extraktion der Zellen mit organischen
Lösungsmitteln, vorzugsweise zweimaliger 10-20minütiger
Extraktion mit 3-5 Vol. Aceton (bezogen auf das Zellfeuchtvolumen)
und anschließend einmaliger 5-10minütiger
Extraktion mit Ether. Die Aceton- und Ether-Extrakte
werden im Vakuum zur Trockne eingeengt, in Wasser aufgenommen
und lyophilisiert.
Die neuen Substanzen lösen sich gut in Wasser. Eine
Gruppe der Inhibitoren ist bei neutralen pH-Werten
hitzestabil, säurestabil (pH 2), alkalistabil (pH 12) und
dialysierbar. Diese Inhibitoren werden durch Trypsin und
Pepsin nicht inaktiviert, sie hemmen ihrerseits die genannten
Enzyme nicht. Sie sind mit den typischen Proteinfärbestoffen
nicht anfärbbar. Nach Abschätzungen aus
der Gelfiltration liegt das Molekulargewicht dieser
Inhibitoren über 100, aber unter 2000.
Die besten Inhibitoren dieser Gruppe zeichnen sich
durch eine extrem hohe, auch alle bisher bekannten
Saccharase-Inhibitoren übertreffende Hemmaktivität
gegenüber Saccharase aus.
Bei Fermentation des Stammes DSM 7 in einer Nährlösung
der Zusammensetzung A werden nach viertägiger Fermentation
über 400 000 SIE/l, bei einer Kultivierung dieses
Stammes in Nährlösung S₃ werden nach sechstägiger Fermentation
über 300 000 SIE/l gewonnen.
Durch Adsorption an stark sauren Kationenaustauschern
in der H⊕-Form und anschließende Desorption mit wäßriger
NH₃-Lösung sowie Einengen und Lyophilisation des Desorbats
wird ein Rohinhibitor mit etwa 40 000 SIE/g erhalten.
Extraktion des Rohinhibitors mit Methanol, Einengen
des Extraktes zur Trockne, Rücklösen in Wasser und Chromatographie
der wäßrigen Lösung an schwach sauren Austauschern
auf Dextran- oder Cellulose-Basis, insbesondere
Carboxymethylcellulose, Desorption mit verdünnten
Mineralsäuren, vorzugsweise 10-3-10-1 N Salzsäure,
Einengen der saccharoseinhibitorisch aktiven Fraktionen
und Lyophilisation dieser Fraktionen führt zu einem
angereicherten Rohprodukt mit etwa 250 000 SIE/g.
Chromatographie des angereicherten Rohproduktes an
modifiziertem Dextran (Sephadex® LH 20) in Methanol,
Einengen der saccharose-inhibitorisch aktiven Fraktionen
und Zusatz von konzentrierten Mineralsäuren, vorzugsweise
konzentrierte Salzsäure, bis zu einem pH-Wert von
1-3 liefert ein kristallines Produkt mit 540 000 SIE/g.
Diese Substanz ist chromatographisch rein. Als Summenformel
wurde C₆H₁₃O₄N bzw. C₆H₁₄O₄NCl für das Hydrochlorid
ermittelt. Auf Grund ihrer physikalischen Parameter
(IR-, NMR-, UV-Spektren; Schmelzpunkt; spezifischer
Drehwert) und den chemischen Eigenschaften (Perjodat-
Oxidation, Elementaranalyse) ist sie identisch mit
einer von S. Inoye et al. (Tetrahedron. 23, 2125 [1968])
beschriebenen Verbindung der Summenformel C₆H₁₃O₄N bzw.
C₆H₁₄O₄NCl für das Hydrochlorid, welcher von den Autoren
die Strukturformel
zugeordnet und für die der Name "1-Desoxynojirimycin"
vorgeschlagen wurde.
Diese Verbindung wurde von den Autoren auf chemischem
Wege durch Hydrierung des Antibioticums Nojirimycin
erhalten. Das Ausgangsprodukt Nojirimycin wird nach T.
Niida et al. (J. Antibiotics, Ser. A., 20, 62 [1967])
durch Fermentation von Organismen der Gattung
Streptomyces erhalten.
Durch die vorliegende Erfindung wird es erstmalig
möglich, Desoxynojirimycin in einem Arbeitsgang durch
direkte mikrobiologische Synthese mit guten Ausbeuten,
ohne Umwege über das relativ instabile und dadurch
schwierig zu handhabende Nojirimycin herzustellen.
Es ist außerordentlich überraschend und war nicht vorherzusehen,
daß diese Verbindungen von Organismen der
Gattung Bacillus produziert werden, da sich diese
Mikroorganismen im allgemeinen als Sekundärstoff-Produzenten
weniger eignen und allenfalls im wesentlichen
peptidartige Sekundärstoffe bilden.
Darüber hinaus werden von einzelnen Stämmen, z. B. DSM
372, Saccharase-Inhibitoren gebildet, die im Gemisch
neben Desoxynojirimycin und/oder Nojirimycin noch andere
im Dünnschicht-Chromatogramm deutlich unterscheidbare
saccharaeinhibitorisch aktive Komponenten produzieren.
Andere Stämme, z. B. DSM 741, bilden Inhibitoren, die im
Dünnschicht-Chromatogramm kein Desoxynojirimycin oder
Nojirimycin erkennen lassen und die somit chemisch von
anderer Struktur sind.
Es ist bekannt, daß bei Tieren und Menschen nach Aufnahme
von kohlenhydrathaltigen Nahrungsmitteln und
Getränken (z. B. Getreide-, Kartoffelstärke, Obst,
Fruchtsaft, Bier, Schokolade) Hyperglykämien auftreten,
die infolge eines raschen Abbaus der Kohlenhydrate durch
Glycosidhydrolysen (z. B. Speichel- und Pankreaseamylasen,
Maltasen, Saccharasen) nach folgendem Schema
bewirkt werden. Diese Hyperglykämien sind bei Diabetikern
besonders stark und anhaltend ausgeprägt. Bei
Adipösen bewirkt die alimentäre Hyperglykämie oftmals
eine besonders starke Sekretion von Insulin, das seinerseits
zu vermehrtem Fettaufbau und vermindertem Fettabbau
führt. Im Anschluß an derartige Hyperglykämien
tritt bei stoffwechselgesunden und adipösen Personen
infolge der Insulinsekretion häufig eine Hypoglykämie
auf. Bekannt ist, daß sowohl Hypoglykämien als auch im
Magen verweilender Speisebrei die Produktion von Magensaft
fördern, der seinerseits die Entstehung einer
Gastritis, eines Ulcus ventriculi oder duodeni auslöst
oder begünstigt.
Ferner ist bekannt, daß in der Mundhöhle Kohlenhydrate,
besonders Saccharose, durch Mikroorganismen gespalten
werden und dadurch die Kariesbildung gefördert wird.
Malabsorption von Kohlenhydraten, z. B. infolge intestinalen
Saccharasemangels, bewirkt eine Diarrhoe. Geeignete
Dosen eines Glucosidase-Inhibitors bewirken eine
künstliche Malabsorption und sind deshalb geeignet,
einer Obstipation entgegenzuwirken.
Die erfindungsgemäßen Inhibitoren eignen sich deshalb
als Therapeutica für folgende Indikationen:
Adipositas, Hyperlipoproteinämie, Atherosklerose,
Diabetes, Prädiabetes, Gastritis, Obstipation, Karies.
Zur Verbreiterung des Wirkungsspektrums kann es sich
empfehlen, Inhibitoren für Glycosidhydrolasen, die sich
gegenseitig in ihrer Wirkung ergänzen, zu kombinieren,
sei es, daß es sich um Kombinationen der erfindungsgemäßen
Inhibitoren untereinander oder um Kombinationen
der erfindungsgemäßen Inhibitoren mit bereits bekannten
handelt. So kann es beispielsweise zweckmäßig sein, erfindungsgemäße
Saccharase-Inhibitoren mit bereits bekannten
Amylase-Inhibitoren zu kombinieren.
Vorteilhaft sind in manchen Fällen auch Kombinationen
der erfindungsgemäßen Inhibitoren mit bekannten oralen
Antidiabetica (β-cytotrope Sulfonylharnstoffderivate
und/oder blutzuckerwirksame Biguanide) sowie mit blutlipid-
senkenden Wirkstoffen wie z. B. Clofibrat, Nicotinsäure,
Cholestyramin und andere.
Die Verbindungen können ohne Verdünnung, z. B. als Pulver
oder in einer Gelatinehülle oder in Kombination mit
einem Trägerstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung
appliziert werden.
Pharmazeutische Zubereitungen können eine größere oder
kleinere Menge des Inhibitors enthalten, z. B. 0,1% bis
99,5%, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen
nichttoxischen, inerten Trägerstoff, wobei der
Trägerstoff eine oder mehrere feste, halbfeste oder
flüssige Verdünnungsmittel, Füllstoffe und/oder nicht-
toxisches, inertes und pharmazeutisch-verträgliches
Formulierungshilfsmittel enthalten kann. Solche pharmazeutischen
Zubereitungen liegen vorzugsweise in Form
von Dosierungseinheiten vor, d. h. physikalisch-diskrete,
eine bestimmte Menge des Inhibitors enthaltenden
Einheiten, die einem Bruchteil oder einem Vielfachen der
Dosis entsprechen, die zur Herbeiführung der gewünschten
Hemmwirkung führen. Die Dosierungseinheiten können
1, 2, 3, 4 oder mehr Einzeldosen oder 1/2, 1/3 oder 1/4
einer Einzeldosis enthalten. Eine Einzeldosis enthält
vorzugsweise eine genügende Menge Wirkstoff, um bei
einer Applikation gemäß eines vorher bestimmten Dosierungsschemas
einer oder mehrerer Dosierungseinheiten
die gewünschte Hemmwirkung zu erzielen, wobei eine
ganze, eine halbe oder ein Drittel oder ein Viertel der
Tagesdosis gewöhnlich einmal, zweimal, dreimal oder
viermal am Tage verabreicht wird. Andere therapeutische
Mittel können auch eingenommen werden. Obgleich die
Dosierung und das Dosierungsschema in jedem Fall sorgsam
abgewogen werden sollte, unter Anwendung gründlichen
fachmännischen Urteils und unter Beachtung des Alters,
des Gewichts und des Zustands des Patienten, der Art und
der Schwere der Erkrankung, wird die Dosierung gewöhnlich
in einem Bereich zwischen etwa 30 bis etwa 3×10⁵
AIE/kg und zwischen etwa 1 bis etwa 1×10⁴ SIE/kg des
Körpergewichts pro Tag liegen. In manchen Fällen wird
man dabei eine ausreichende therapeutische Wirkung mit
einer geringeren Dosis erreichen, während in anderen
Fällen eine größere Dosis erforderlich sein wird.
Orale Applikation kann unter Verwendung fester und
flüssiger Dosierungseinheiten durchgeführt werden, wie
z. B. Pulver, Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulate,
Suspensionen, Lösungen und dergleichen.
Pulver wird durch Zerkleinerung der Substanz in einer
geeigneten Größe und Vermischen mit einem ebenfalls
zerkleinerten pharmazeutischen Trägerstoff hergestellt.
Obgleich ein eßbares Kohlenhydrat, wie z. B. Stärke,
Lactose, Saccharose oder Glucose, normalerweise zu diesem
Zwecke Verwendung findet und auch hier benutzt werden
kann, ist es wünschenswert, ein nicht metabolisierbares
Kohlenhydrat, wie z. B. ein Cellulosederivat, zu benutzen.
Süßmittel, Geschmackszusätze, Konservierungsstoffe,
Dispergiermittel und Färbemittel können auch mitverwendet
werden.
Die Kapseln können durch Zubereitung der oben beschriebenen
Pulvermischung und durch Füllung bereits
gebildeter Gelatinehüllen hergestellt werden. Die
Pulvermischung kann man vor dem Füllvorgang mit Gleitmitteln,
wie z. B. Kieselgel, Talkum, Magnesiumstearat,
Calciumstearat oder festem Polyethylenglykol versetzen.
Die Mischung kann man ebenfalls mit einem Desintegrator
oder Lösungsvermittler, wie z. B. Agar-Agar, Calciumcarbonat
oder Natriumcarbonat versetzen, um bei der
Einnahme der Kapsel die Zugänglichkeit des Inhibitors
zu verbessern.
Die Anfertigung der Tabletten erfolgt z. B. durch Herstellung
einer Pulvermischung, grob oder feinkörnig, und
Hinzufügung eines Gleitmittels und Desintegrators. Aus
dieser Mischung formt man Tabletten. Eine Pulvermischung
bereitet man vor durch Mischung der Substanz, welche in
geeigneter Weise zerkleinert wurde und ergänzt durch ein Verdünnungsmittel
oder eine andere Trägersubstanz wie oben
beschrieben. Gegebenenfalls fügt man ein Bindemittel
hinzu: z. B. Carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine
oder Polyvinylpyrrolidone, einen Lösungsverzögerer, wie
z. B. Paraffin, einen Resorptionsbeschleuniger, wie z. B.
ein quarternäres Salz und/oder ein Adsorptionsmittel,
wie z. B. Bentonit, Kaolin oder Dicalciumphosphat. Die
Pulvermischung kann granuliert werden zusammen mit einem
Bindemittel, wie z. B. Syrup, Stärkepaste, Akazienschleim,
oder Lösungen aus Zellulose- oder Polymerenmaterialien.
Danach preßt man das Produkt durch ein grobes
Sieb. Als Alternative hierzu kann man die Pulvermischung
durch eine Tablettenmaschine laufen lassen und
die sich ergebenden ungleichmäßig geformten Stücke bis auf
Korngröße zerkleinern. Damit die entstandenen Körner
nicht in den tablettenbildenden Düsen stecken bleiben,
kann man sie mit einem Gleitmittel versetzen, wie z. B.
Stearinsäure, Stearatsalz, Talkum oder Mineralöl. Diese
gleitfähig gemachte Mischung wird dann in Tablettenform
gepreßt. Die Wirkstoffe können auch mit freifließenden
inerten Trägerstoffen vereinigt werden und direkt in
Tablettenform gebracht werden unter Auslassung der Granulat-
oder Zerstückelungsschritte. Man kann das Produkt
mit einer klaren oder opaken Schutzhülle versehen, z. B.
einem Überzug aus Schellack, einem Überzug aus Zucker
oder Polymersubstanzen und einer polierten Hülle aus
Wachs. Farbstoffe können diesen Überzügen beigefügt
werden, damit zwischen den verschiedenen Dosierungseinheiten
unterschieden werden kann.
Die oral zu verabreichenden Zubereitungsformen, wie z. B.
Lösungen, Syrup und Elixire, lassen sich in Dosierungseinheiten
herstellen, so daß eine bestimmte Menge Präparat
eine bestimmte Menge Wirkstoff enthält. Syrup kann
so hergestellt werden, daß der Wirkstoff in einer wäßrigen
Lösung, welche geeignete Geschmacksstoffe enthält,
gelöst wird; Elixiere werden unter Verwendung nicht
toxischer, alkoholischer Trägerstoffe erhalten. Suspensionen
kann man durch Dispergieren der Verbindung in
einem nichttoxischen Trägerstoff darstellen. Lösungsvermittler
und Emulgiermittel, wie z. B. ethoxilierte
Isostearylalkohole und Polyoxyethalensorbitester, Konservierungsmittel,
geschmacksverbessernde Zusätze, wie
z. B. Pfefferminzöl oder Saccharin und dergleichen,
können auch zugegeben werden.
Dosierungsvorschriften können auf der Kapsel angegeben
werden. Überdies kann die Dosierung so abgesichert sein,
daß der Wirkstoff verzögert abgegeben wird, z. B. durch
Einhalten des Wirkstoffes in Polymerensubstanzen, Wachse
oder dergleichen.
Zusätzlich zu den obenerwähnten pharmazeutischen Zusammensetzungen
lassen sich auch diese Wirkstoffe enthaltende
Lebensmittel herstellen; beispielsweise Zucker,
Brot, Kartoffelprodukte, Fruchtsaft, Bier, Schokolade
und andere Konfektartikel, und Konserven, wie z. B.
Marmelade, wobei zu diesen Produkten eine therapeutisch-
wirksame Menge mindestens eines der erfindungsgemäßen
Inhibitoren gegeben wurde.
Die erfindungsgemäßen Inhibitoren weisen weiterhin die
Eigenschaft auf, in Tieren das Verhältnis des Anteiles
an unerwünschtem Fett zum Anteil des erwünschten fettarmen
Fleisches (mageres Fleisch) zugunsten des mageren
Fleisches in hohem Maße zu beeinflussen. Dies ist von
besonderer Bedeutung für die Aufzucht und Haltung von
landwirtschaftlichen Nutztieren, z. B. in der Schweinemast,
aber auch von erheblicher Bedeutung für die Aufzucht
und Haltung von sonstigen Nutztieren und Ziertieren.
Die Verwendung der Inhibitoren kann weiterhin
zu einer erheblichen Rationalisierung der Fütterung der
Tiere führen, sowohl zeitlich, mengenmäßig wie auch
qualitätsmäßig. Da sie eine gewisse Verzögerung der
Verdauung bewirken, wird die Verweildauer der Nährstoffe
im Verdauungstrakt verlängert, wodurch eine mit weniger
Aufwand verbundene ad libitum-Fütterung ermöglicht wird.
Weiterhin ergibt sich bei der Verwendung der erfindungsgemäßen
Inhibitoren in vielen Fällen eine erhebliche
Einsparung von wertvollem Proteinfutter.
Die Wirkstoffe können somit praktisch in allen Bereichen
der Tierernährung als Mittel zur Reduzierung des Fettansatzes
sowie der Einsparung von Futtereiweiß verwendet
werden.
Die Wirksamkeit der Wirkstoffe ist hierbei weitgehend
unabhängig von der Art und dem Geschlecht der Tiere.
Besonders wertvoll erweisen sich die Wirkstoffe bei
Tierarten, die überhaupt oder in bestimmten Lebensabschnitten
zu stärkerer Fetteinlagerung neigen.
Als Tiere, bei denen die Inhibitoren zur Reduzierung des
Fettansatzes und/oder zur Einsparung von Futtereiweiß
eingesetzt werden können, seien beispielsweise folgende
Nutz- und Ziertiere genannt: Warmblüter wie Rinder,
Schweine, Pferde, Schafe, Ziegen, Katzen, Hunde, Kaninchen,
Pelztiere, z. B. Nerze, Chinchilla, andere Ziertiere,
z. B. Meerschweinchen und Hamster, Labor- und
Zootiere, z. B. Ratten, Mäuse, Affen usw., Geflügel, z. B.
Broiler, Hühner, Gänse, Enten, Truthähne, Tauben, Papageien
und Kanarienvögel, und Kaltblüter, wie Fische, z. B.
Karpfen, und Reptilien, z. B. Schlangen.
Die Menge der Wirkstoffe, die den Tieren zur Erreichung
des gewünschten Effektes verabreicht wird, kann wegen
der günstigen Eigenschaften der Wirkstoffe weitgehend
variiert werden. Sie liegt vorzugsweise bei etwa 0,5 mg
bis 2,5 g, insbesondere 10 bis 100 mg/kg Futter. Die
Dauer der Verabreichung kann von wenigen Stunden oder
Tagen bis zu mehreren Jahren betragen. Die passende
Menge Wirkstoff sowie die passende Dauer der Verabreichung
stehen in engem Zusammenhang mit dem Fütterungsziel.
Sie hängen insbesondere von der Art, dem
Alter, dem Geschlecht, dem Gesundheitszustand und der
Art der Haltung der Tiere ab und sind durch jeden Fachmann
leicht zu ermitteln.
Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe werden den Tieren nach
den üblichen Methoden verabreicht. Die Art der Verabreichung
hängt insbesondere von der Art, dem Verhalten
und dem Allgemeinzustand der Tiere ab. So kann die Verabreichung
einmal oder mehrmals täglich, in regelmäßigen
oder unregelmäßigen Abständen, oral erfolgen. Aus Zweckmäßigkeitsgründen
ist in den meisten Fällen eine orale
Verabreichung, insbesondere im Rhythmus der Nahrungs-
und/oder Getränkeaufnahme der Tiere, vorzuziehen.
Die Wirkstoffe können als reine Stoffe oder in formulierter
Form verabreicht werden, wobei die formulierte
Form sowohl als Premix, also in Mischung mit nichttoxischen
inerten Trägerstoffen beliebiger Art, als auch
als Teil einer Gesamtration in Form eines Beifutters
bzw. als Mischungsbestandteil eines alleinigen Mischfutters
zu verstehen ist. Mit eingeschlossen ist auch
die Applikation geeigneter Zubereitungen über das
Trinkwasser.
Die Wirkstoffe können gegebenenfalls in formulierter
Form auch zusammen mit anderen Nähr- und Wirkstoffen,
z. B. Mineralsalzen, Spurenelementen, Vitaminen, Eiweißstoffen,
Energieträgern (z. B. Stärke, Zucker, Fette)
Farbstoffen und/oder Geschmacksstoffen, oder anderen Futterzusatzstoffen,
z. B. Wachstumsförderern, in geeigneter
Form verabreicht werden. Die Wirkstoffe können den Tieren
vor, während oder nach der Nahrungsaufnahme gegeben
werden.
Empfehlenswert ist die orale Verabreichung zusammen mit
dem Futter und/oder Trinkwasser, wobei je nach Bedarf
die Wirkstoffe der Gesamtmenge oder nur Teilen des Futters
und/oder Trinkwassers zugegeben werden.
Die Wirkstoffe können nach übliche Methoden durch einfaches
Mischen als reine Stoffe, vorzugsweise in fein
verteilter Form oder in formulierter Form in Mischung
mit eßbaren, nichttoxischen Trägerstoffen, gegebenenfalls
auch in Form eines Premix oder eines Futterkonzentrates,
dem Futter und/oder dem Trinkwasser beigefügt
werden.
Das Futter und/oder Trinkwasser kann beispielsweise die
erfindungsgemäßen Wirkstoffe in einer Konzentration von
etwa 0,001 bis 5,0%, insbesondere 0,02 bis 2,0% (Gewicht)
enthalten. Die optimale Höhe der Konzentration
des Wirkstoffs im Futter und/oder Trinkwasser ist insbesondere
abhängig von der Menge der Futter- und/oder
Trinkwasseraufnahme der Tiere und kann durch jeden Fachmann
leicht ermittelt werden.
Die Art des Futters und seine Zusammensetzung ist hierbei
ohne Belang. Es können alle gebräuchlichen, handelsüblichen
oder speziellen Futterzusammensetzungen verwendet
werden, die vorzugsweise das übliche, für eine ausgewogene
Ernährung notwendige Gleichgewicht aus Energie-
und Eiweißstoffen, einschließlich Vitaminen und Mineralstoffen
enthalten. Das Futter kann sich beispielsweise
zusammensetzen aus pflanzlichen Stoffen, z. B. Ölkuchenschroten,
Getreideschroten, Getreidenebenprodukten, aber
auch aus Heu, Gärfutter, Rüben und anderen Futterpflanzen,
aus tierischen Stoffen, z. B. Fleisch- und Fischprodukten,
Knochenmehl, Fetten, Vitaminen, z. B. A, D,
E, K und B-Komplex, sowie speziellen Proteinquellen,
z. B. Hefen, sowie bestimmten Aminosäuren und Mineralstoffen
und Spurenelementen, wie z. B. Phosphor und
Eisen, Zink, Mangan, Kupfer, Kobalt, Jod usw.
Premixe können vorzugsweise etwa 0,1 bis 50%, insbesondere
0,5 bis 5,0% (Gewicht), der Wirkstoffe der Formel
I neben beliebigen eßbaren Trägerstoffen und/oder Mineralsalzen,
z. B. kohlensaurem Futterkalk, enthalten und
werden nach den üblichen Mischmethoden hergestellt.
Mischfutter enthalten vorzugsweise 0,001 bis 5,0%,
insbesondere 0,02 bis 2,0% (Gewicht), der Wirkstoffe der
Formel I neben den üblichen Rohstoffkomponenten eines
Mischfutters, z. B. Getreideschrote oder -nebenprodukte,
Ölkuchenschrote, tierisches Eiweiß, Mineralien, Spurenelemente
und Vitamine. Sie können nach den üblichen
Mischmethoden hergestellt werden.
Vorzugsweise in Premixen und Mischfuttermitteln können
die Wirkstoffe gegebenenfalls auch durch ihre Oberfläche
bedeckende geeignete Mittel, z. B. mit nichttoxischen
Wachsen oder Gelatine, vor Luft, Licht und/oder Feuchtigkeit
geschützt werden.
Beispiel für die Zusammensetzung eines fertigen Mischfutters
für Geflügel, das einen erfindungsgemäßen Wirkstoff
enthält:
200 g Weizen, 340 g Mais, 360,3 g Sojaschrot, 60 g Rindertalg, 15 g Dicalciumphosphat, 10 g Calciumcarbonat, 4 g jodiertes Kochsalz, 7,5 g Vitamin-Mineral-Mischung und 3,2 g Wirkstoff-Premix ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg Futter.
200 g Weizen, 340 g Mais, 360,3 g Sojaschrot, 60 g Rindertalg, 15 g Dicalciumphosphat, 10 g Calciumcarbonat, 4 g jodiertes Kochsalz, 7,5 g Vitamin-Mineral-Mischung und 3,2 g Wirkstoff-Premix ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg Futter.
Die Vitamin-Mineralmischung besteht aus:
6000 I.E. Vitamin A, 1000 I.E. Vitamin D₃, 10 mg Vitamine E, 1 mg Vitamin K₃, 3 mg Riboflavin, 2 mg Pyridoxin, 20 mcg Vitamin B₁₂, 5 mg Calciumpantothenat, 30 mg Nikotinsäure, 200 mg Cholinchlorid, 200 mg MnSO₄ ×H₂O, 140 mg ZnSO₄×7 H₂O, 100 mg FeSO₄×7 H₂O und 20 mg CuSO₄×5 H₂O. Der Wirkstoff-Premix enthält z. B. 1-Desoxynojirimycin in der gewünschten Menge, z. B. 1600 mg und zusätzliche 1 g DL-Methionin sowie so viel Sojabohnenmehl, daß 3,2 g Premix entstehen.
6000 I.E. Vitamin A, 1000 I.E. Vitamin D₃, 10 mg Vitamine E, 1 mg Vitamin K₃, 3 mg Riboflavin, 2 mg Pyridoxin, 20 mcg Vitamin B₁₂, 5 mg Calciumpantothenat, 30 mg Nikotinsäure, 200 mg Cholinchlorid, 200 mg MnSO₄ ×H₂O, 140 mg ZnSO₄×7 H₂O, 100 mg FeSO₄×7 H₂O und 20 mg CuSO₄×5 H₂O. Der Wirkstoff-Premix enthält z. B. 1-Desoxynojirimycin in der gewünschten Menge, z. B. 1600 mg und zusätzliche 1 g DL-Methionin sowie so viel Sojabohnenmehl, daß 3,2 g Premix entstehen.
Beispiel für die Zusammensetzung eines Schweinemischfutters,
das einen Wirkstoff der Formel I enthält:
630 g Futtergetreideschrot (zusammengesetzt aus 200 g Mais-, 150 g Gerste-, 150 g Hafer- und 130 g Weizenschrot), 80 g Fischmehl, 60 g Sojaschrot, 58,8 g Tapiokamehl, 38 g Bierhefe, 50 g Vitamin-Mineral-Mischung für Schweine (Zusammensetzung z. B. wie beim Kükenfutter), 30 g Leinkuchenmehl, 30 g Maiskleberfutter, 10 g Sojaöl, 10 g Zuckerrohrmelasse und 2 g Wirkstoff-Premix (Zusammensetzung z. B. wie beim Kükenfutter) ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg Futter.
630 g Futtergetreideschrot (zusammengesetzt aus 200 g Mais-, 150 g Gerste-, 150 g Hafer- und 130 g Weizenschrot), 80 g Fischmehl, 60 g Sojaschrot, 58,8 g Tapiokamehl, 38 g Bierhefe, 50 g Vitamin-Mineral-Mischung für Schweine (Zusammensetzung z. B. wie beim Kükenfutter), 30 g Leinkuchenmehl, 30 g Maiskleberfutter, 10 g Sojaöl, 10 g Zuckerrohrmelasse und 2 g Wirkstoff-Premix (Zusammensetzung z. B. wie beim Kükenfutter) ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg Futter.
Die angegebenen Futtergemische sind vorzugsweise zur
Aufzucht und Mast von Küken bzw. Schweinen abgestimmt,
sie können jedoch in gleicher oder ähnlicher Zusammensetzung
auch zur Aufzucht und Mast anderer Tiere verwendet
werden.
Wie bereits erwähnt, können die Inhibitoren einzeln oder
aber auch in beliebigen Mischungen untereinander verwendet
werden, wobei sowohl die reinen Wirkstoffe als auch
die bei der Herstellung erhaltenen rohen Wirkstoffe gegebenenfalls
nach einer Grobreinigung eingesetzt werden.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung der Zusammensetzung
2,0% Maisstärke
1,0% Glucose
0,5% Kaseinhydrolysat
1,0% Hefeextrakt
pH mit NaCO₃ auf 7,2 eingestellt + 0,4% CaCO₃, Sterilisation 30′ bei 121°C
1,0% Glucose
0,5% Kaseinhydrolysat
1,0% Hefeextrakt
pH mit NaCO₃ auf 7,2 eingestellt + 0,4% CaCO₃, Sterilisation 30′ bei 121°C
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 704
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine
Aktivität von 70 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung der Zusammensetzung
7,5% Malzextrakt
0,3% Kaseinhydrolysat
0,7% Hefeextrakt
0,3% CaCO₃
0,3% K₂HPO₄
Leitungswasser, Sterilisation 30′ bei 121°C pH nach der Sterilisation auf 6,6-6,8 mit K₂CO₃ eingestellt
0,3% Kaseinhydrolysat
0,7% Hefeextrakt
0,3% CaCO₃
0,3% K₂HPO₄
Leitungswasser, Sterilisation 30′ bei 121°C pH nach der Sterilisation auf 6,6-6,8 mit K₂CO₃ eingestellt
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 704
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine
Aktivität von 197 SIE/ml.
Beimpft man einen 140-l-Fermenter, der 100 l
Nährlösung der Zusammensetzung
7,5% Malzextrakt
0,3% Kaseinhydrolysat
0,7% Hefeextrakt
0,3% CaCO₃
0,3% K₂HPO₄
Leitungswasser, Sterilisation 30′ bei 121°C, pH nach der Sterilisation auf 6,6-6,8 mit K₂CO₃ eingestellt
0,3% Kaseinhydrolysat
0,7% Hefeextrakt
0,3% CaCO₃
0,3% K₂HPO₄
Leitungswasser, Sterilisation 30′ bei 121°C, pH nach der Sterilisation auf 6,6-6,8 mit K₂CO₃ eingestellt
enthält, mit 1,2 l Vorkultur, gewonnen durch Bebrütung
von 10 1-l-Erlenmeyerschüttelkolben mit je 120
ml Nährlösung derselben Zusammensetzung, beimpft mit dem
Stamm DSM 704 und bebrütet unter Rührung und Belüftung
5 Tage bei 28°C, so erhält man eine Kulturbrühe, die 260
SIE/ml enthält.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung der Zusammensetzung
3,0% Sojamehl
3,0% Glycerin
0,2% CaCO₃
Leitungswasser, Sterilisation 30′ bei 121°C
3,0% Glycerin
0,2% CaCO₃
Leitungswasser, Sterilisation 30′ bei 121°C
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 7
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine
Aktivität von 437 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung der Zusammensetzung
nach Beispiel 1
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 7
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine
Aktivität von 162 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung der Zusammensetzung
1,0% Glucose
1,0% Stärke lösl.
0,5% Kaseinhydrolysat
0,75% Fleischextrakt
0,75% Peptone
0,5% Hefe-Extrakt
0,1% K₂HPO₄
0,3% NaCl
0,1% MgSO₄ · 7 H₂O
Leitungswasser, pH mit Na₂CO₃ auf 7,2 eingestellt, Sterilisation 30′ bei 121°C
1,0% Stärke lösl.
0,5% Kaseinhydrolysat
0,75% Fleischextrakt
0,75% Peptone
0,5% Hefe-Extrakt
0,1% K₂HPO₄
0,3% NaCl
0,1% MgSO₄ · 7 H₂O
Leitungswasser, pH mit Na₂CO₃ auf 7,2 eingestellt, Sterilisation 30′ bei 121°C
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 7
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine
Aktivität von 36,4 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 200 ml
einer Nährlösung
nach Beispiel 3
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 7
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer
Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 6
Tagen eine Aktivität von 224 SIE/ml.
Beimpft man einen 140-l-Fermenter, der 100-
l-Nährlösung
nach Beispiel 4
enthält, mit 1,2 l Vorkultur, gewonnen durch
Bebrütung von 10 1-l-Erlenmeyerschüttelkolben mit je
120 ml Nährlösung derselben Zusammensetzung, beimpft mit
dem Stamm DSM 7 und bebrütet unter Rührung und Belüftung
5 Tage bei 28°C, so erhält man eine Kulturbrühe, die 286
SIE/ml enthält.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung
nach Beispiel 2
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 1
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer
Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 6
Tagen eine Aktivität von 28,4 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung
nach Beispiel 1
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 365
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine
Aktivität von 15,6 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung
nach Beispiel 2
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 365
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine
Aktivität von 25,8 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung
nach Beispiel 4
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 741
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer
Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5
Tagen eine Aktivität von 3,2 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung
nach Beispiel 1
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 741
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine
Aktivität von 26,4 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung
nach Beispiel 2
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 741
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine
Aktivität von 24,0 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung der Zusammensetzung
2,0% Maisstärke
0,5% Glucose
0,3% Kaseinhydrolysat
pH mit Na₂CO₃ auf 7,2 eingestellt + 0,4% CaCO₃, Sterilisation 30′ bei 121°C
0,5% Glucose
0,3% Kaseinhydrolysat
pH mit Na₂CO₃ auf 7,2 eingestellt + 0,4% CaCO₃, Sterilisation 30′ bei 121°C
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 741
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 2 Tagen eine
Aktivität von 81,7 SIE/ml und nach 3 Tagen eine Aktivität
von 121 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung
nach Beispiel 4
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 675
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine
Aktivität von 8,6 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung
nach Beispiel 1
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 675
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine
Aktivität von 53,0 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung
nach Beispiel 2
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 675
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine
Aktivität von 17,8 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung
nach Beispiel 4
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 372
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine
Aktivität von 6,0 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung
nach Beispiel 1
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 372
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine
Aktivität von 21,6 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 200 ml
einer Nährlösung
nach Beispiel 2
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 372
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine
Aktivität von 26,8 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung der Zusammensetzung
2,0% Maisstärke
1,0% Glucose
0,5% Kaseinhydrolysat
0,5% Hefe-Extrakt
pH mit Na₂CO₃ auf 7,2 eingestellt + 0,4% CaCO₃, Sterilisation 30′ bei 121°C
1,0% Glucose
0,5% Kaseinhydrolysat
0,5% Hefe-Extrakt
pH mit Na₂CO₃ auf 7,2 eingestellt + 0,4% CaCO₃, Sterilisation 30′ bei 121°C
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 372
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine
Aktivität von 26,5 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung
nach Beispiel 22
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 479
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine
Aktivität von 7,9 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung
nach Beispiel 6
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 479
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine
Aktivität von 5,4 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung
nach Beispiel 2
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 36
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine
Aktivität von 5,4 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung
nach Beispiel 2
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 356
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer
Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3
Tagen eine Aktivität von 8,8 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung
nach Beispiel 1
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 292
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine
Aktivität von 9,0 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung
nach Beispiel 2
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 292
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine
Aktivität von 9,2 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung
nach Beispiel 2
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 742
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine
Aktivität von 9,8 SIE/ml.
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung
nach Beispiel 1
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 740
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine
Aktivität von 5,7 SIE/ml.
Die Fermentationsbrühe aus einem 100-l-Fermenter
nach Beispiel 3
wurde mit halbkonzentrierter HCl auf pH 3,0-3,5 eingestellt
und die Bakterienmassen nach dem Ausflocken
abzentrifugiert. Man erhielt 70 l tiefbraune Kulturlösung
mit einem SIE-Gehalt von 220 000 SIE/l.
Diese Lösung wurde mit einer Fließrate von 20 l/h über
eine mit 12 kg Lewatit® SC 104 in der H⁺-Form gepackte
Säule von ⌀ 30 cm gegeben. Der Durchlauf hatte praktisch
keine saccharaseinhibitorische Aktivität und wurde verworfen.
Die Säule wurde mit 50 l dest. H₂O (Waschwasser
I) 20 l 0,01 n HCl und anschließend nochmals 20 l dest.
H₂O (Waschwasser II) gewaschen. Zur Desorption der Aktivität
wurde nun 2,5% Ammoniak angeschlossen. Parallel
mit dem Anstieg der Leitfähigkeit des Eluats und der
Zunahme der Braunfärbung wird die saccharaseinhibitorische
Aktivität eluiert. Der Vorlauf (20 l) bis zum Anstieg
der Leitfähigkeit wird verworfen, die die Aktivität
enthaltende Fraktion (35 l) im Rotationsverdampfer
eingeengt und in wenig Wasser rückgelöst (Konzentrat
3 l). Das Konzentrat wurde lyophilisiert. Man erhielt
288 g tiefbraunes Rohprodukt I mit 38 000 SIE/g.
Die Fermentationsbrühe aus einem 100-l-Fermenter
nach Beispiel 3
wurde mit halbkonzentrierter HCl auf pH 3,0-3,5 eingestellt
und die Bakterienmassen nach dem Ausflocken
abzentrifugiert. Man erhielt 60 l tiefbraune Kulturlösung
mit einem SIE-Gehalt von 240 000 SIE/l.
Diese Lösung wurde mit einer Fließrate von 20 l/h über
eine mit 12 kg Dowex 50 W×4 in der H⁺-Form gepackte
Säule von ⌀ 30 cm gegeben. Der Durchlauf hatte praktisch
keine saccharaseinhibitorische Aktivität und wurde verworfen.
Die Säule wurde mit 50 l dest. H₂O (Waschwasser
I) 20 l 0,01 n HCl und anschließend nochmals 20 l dest.
H₂O (Waschwasser II) gewaschen. Zur Desorption der Aktivität
wurde nun 2,5% Ammoniak angeschlossen. Parallel
mit dem Anstieg der Leitfähigkeit des Eluats und der Zunahme
der Braunfärbung wird die saccharaseinhibitorische
Aktivität eluiert. Der Vorlauf (20 l) bis zum Anstieg
der Leitfähigkeit wird verworfen, die die Aktivität
enthaltende Fraktion (35 l) im Rotationsverdampfer
eingeengt und in wenig Wasser rückgelöst (Konzentrat
3 l). Das Konzentrat wurde lyophilisiert. Man erhielt
360 g tiefbraunes Rohprodukt I mit 24 000 SIE/g.
50 g Rohprodukt I aus Beispiel 31 wurden fein zermörsert
und anschließend 3× mit je 300 ml techn. Methanol extrahiert.
Dazu wurde der Ansatz zunächst 2 Min. im Ultraturraxhomogenisator
homogenisiert, dann in ein
40-50°C warmes Wasserbad eingebracht und 20′ gerührt.
Nach jeder Extraktion wurde durch ein Faltenfilter abfiltriert.
Der nach der 3. Extraktion im Faltenfilter
verbleibende Rückstand wurde im Vakuum getrocknet (28,4
g). Da die Testung nur eine geringe spezifische Aktivität
dieses Rückstandes ergab, wurde er anschließend verworfen.
Die methanolischen Extrakte wurden vereinigt und
im Vakuum zur Trockne eingeengt. Der im Kolben verbleibende
aktive Rückstand wurde in 750 ml H₂O gelöst (l=
2,8 mS, pH=7,2) und mit einer Fließrate von 500 ml/h
über eine 5×50-cm-Säule, gefüllt mit CM-Cellulose in
der H⁺-Form (CH-Cellulose der Fa. Whatman, Typ C 52),
gegeben. Man wusch mit 5 l Wasser nach und schloß dann
zur Elution 20 l 0,002 n HCl an. Durchlauf, Waschwasser
und Eluat wurden in ca. 0,5-l-Portionen fraktioniert
aufgefangen. Die saccharaseinhibitorische Aktivität
wurde bestimmt und alle Fraktionen, die mehr als 30 000
SIE/l enthielten, vereinigt: Im Durchlauf die tiefbraun
gefärbten Fraktionen 2-4 und im hellgelben Eluat die
Fraktionen 16-35. Die vereinigten Fraktionen wurden
eingeengt und lyophilisiert. Man erhielt 18,2 g der
Durchlauffraktion 2-4 mit einer spezifischen Aktivität
von 4000 SIE/g (verworfen) sowie 3,1 g des sogenannten
Rohprodukts II mit 250 000 SIE/g (ca. 50-60% rein). Das
Rohprodukt II ist stark hygroskopisch und zerfließt an
der Luft in kurzer Zeit zu einer klebrigen Masse.
2,5 g des Rohprodukts II aus Beispiel 33 werden zur Abtrennung
der Hauptmenge der begleitenden Peptide in 15
ml Methanol gelöst und über eine 5×90 cm mit Sephadex
LH 20 in Methanol gefüllte Säule chromatographiert. Bei
einer Fließrate von 100 ml/h und einer Temperatur von
4-5°C sammelt man 10 ml-Fraktionen. 10 µl dieser Fraktionen
werden auf einer Kieselgelplatte (Fa. Merck)
aufgetragen und dünnschichtchromatographisch im System
Ethanol/25% NH₃/H₂O = 80/10/10 untersucht. Die nach DC
Inhibitor enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, auf
5-10 ml eingeengt und über die gleiche Säule rechromatographiert.
Man analysierte die Fraktionen in der DC
und vereinigte die inhibitorhaltigen Fraktionen, wobei
nur ein sehr enger Bereich geschnitten wurde. Man engt
zur Trockene ein. Derart LH 20-gereinigter Inhibitor ist
ca. 90% rein. Zur Abtrennung der letzten verbliebenen
Peptidverunreinigungen nimmt man die nach dem Einrotieren
als Rückstand verbleibende Substanz in 2-3 ml
Methanol auf und versetzt die gelbe methanolische Lösung
mit 50 µl konzentrierter HCl. Nach kurzer Zeit, evtl.
auch erst nach mehrstündigem Stehen, kristallisiert der
Inhibitor in Form leicht gelblicher Würfel oder Quader
aus. Die Peptide bleiben in der Mutterlauge. Man zentrifugiert
die Kristalle ab, wäscht 1× mit eiskaltem
Methanol und löst den gewaschenen Niederschlag anschließend
unter Erhitzen in 2 ml Methanol wieder aus.
Man setzt 4 ml Butanol hinzu und stellt über Nacht bei
4°C ab. Die am nächsten Morgen ausgefallenen farblosen
Kristalle werden abzentrifugiert, 1× mit eiskaltem
Methanol, 1× mit Aceton und 1× mit Ether gewaschen
und anschließend im Vakuum getrocknet. Ausbeute 460 mg
des Inhibitors als Hydrochlorid mit 540 000 SIE/g.
Zum Nachweis saccharaseinhibitorischer Komponenten in
Kulturlösung oder Rohprodukt wurde auch folgendes dünnschichtchromatographisches
Verfahren mit anschließender
Enzymreaktion auf der Platte benutzt, welches den Nachweis
inhibitorischer Komponenten direkt auf der Platte
gestattet. In dieser Dünnschichtchromatographie trägt
man 1-5 µl der Fermentationsbrühen oder 1-5 µg der Präparate
auf Kieselgelfertigplatten (Fa. Merck, Typ KG 60
F 254) auf und entwickelt in Ethanol/NH₃/H₂O = 8/1/1.
Zur direkten Sichtbarmachung der saccharaseinhibitorischen
Komponenten besprayt man die entwickelte und gut
getrocknete Platte mit Enzymgel (20 ml/20×20-cm-
Platte) und läßt das Gel erstarren. Dann wird für 5′ in
einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur vorinkubiert
und anschließend satt mit Substratgel besprayt. Nach dem
Erstarren dieser 2. Gelschicht bringt man die Platte in
eine feuchte Kammer ein und inkubiert bei 40°C. Die Inhibitionsfärbung
(helle Flecken, rotbrauner Hintergrund)
entwickelt sich in 60-90′. Zum Zeitpunkt der optimalen
Farbentwicklung wird abgebrochen und die Platte mit den
darauf befindlichen Agarschichten am Föhn mit Warmluft
getrocknet.
Enzymgel: 1,5 g Agarose (L'Industrie Biologique Francaise)
wird in 100 ml 0,2 m Na-Maleinatpuffer pH 6,0
suspendiert und anschließend durch Aufkochen gelöst. Die
klare Agaroselösung wird auf 50°C abgekühlt und mit 250
µl Triton-X-100-Lösung (2 g Triton X-100 + 8 g Ethanol
p.a.)und 0,5 ml Dianisidinlösung (20 mg Dianisidin/1
ml Aceton) unter Umschwenken versetzt. Direkt vor Gebrauch
des Gels werden 1 ml GOD/POD-Reagens (12,5 mg
Glucoseoxidase, Reinheitsgrad I, Fa. Boehringer,
Best.-Nr. 15 423, und 2,5 mg Peroxidase, Reinheitsgrad II,
Fa. Boehringer, Best.-Nr. 15 302, gelöst in 5 ml Maleinatpuffer)
und 4-5 Einheiten Saccharase aus Schweinedünndarm
(Solubisierte Saccharase aus Schweinedünndarmmucosa
nach B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem., 12,
[1958], S. 1997. Mit 0,1 m Natriummaleinatpuffer
pH 6,0 auf entsprechenden SE-Gehalt verdünnt.)
zugesetzt. Das Gel muß bis zum Versprayen auf
50°C gehalten werden, da es sonst beim Sprayvorgang in
den Düsen erstarrt.
Substratgel: 0,5 g Agarose wird in 100 ml Na-Maleinatpuffer
pH 6,0 suspendiert und unter Kochen gelöst. Man
kühlt anschließend auf 50°C ab, versetzt mit 100 µl
Triton (2 g Triton-X-100 + 8 g Ethanol p.a.) und gibt
1 g Saccharose (Serva Nr. 35 579) zu. Nach dem Lösen der
Saccharose ist das Gel gebrauchsfertig.
Die Untersuchung der Kulturlösungen der Stämme mit
dieser Methode ergaben saccharaseinhibitorische Komponenten
mit folgenden Rf-Werten:
Stämme | |
Rf-Werte | |
DSM 7 | |
0,25 | |
DSM 741 | 0,25, 0,41, 0,50, 0,59, 0,71 |
DSM 704 | 0,25 |
DSM 372 | 0,25, 0,51, 0,60, 0,71 |
Claims (1)
- Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Inhibitoren für Glycosidhydrolasen, erhalten dadurch, daß man Organismen der Arten Bacillus subtilis, Bacillus subtilis var. niger, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus longisporus oder Bacillus polymyxa in üblichen Nährlösungen bei Temperaturen von etwa 15 bis etwa 80°C etwa 1 bis 8 Tage unter Belüftung in üblichen Fermentationsgefäßen kultiviert, die Zellen abschleudert und die Inhibitoren aus der Kulturbrühe oder den Zellextrakten durch übliche Reinigungsoperationen isoliert.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE2661012A DE2661012C2 (de) | 1976-12-23 | 1976-12-23 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19762658563 DE2658563A1 (de) | 1976-12-23 | 1976-12-23 | Inhibitoren fuer glykosid-hydrolasen aus bacillen |
DE2661012A DE2661012C2 (de) | 1976-12-23 | 1976-12-23 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2661012C2 true DE2661012C2 (de) | 1989-06-15 |
Family
ID=25771298
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2661012A Expired DE2661012C2 (de) | 1976-12-23 | 1976-12-23 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE2661012C2 (de) |
-
1976
- 1976-12-23 DE DE2661012A patent/DE2661012C2/de not_active Expired
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Agr. Biol. Chemistry, 34, S. 966-968 (1970) * |
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Legal Events
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Q172 | Divided out of (supplement): |
Ref country code: DE Ref document number: 2658563 |
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8181 | Inventor (new situation) |
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|
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8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |