DE2514215A1 - Antibiotika und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

Antibiotika und verfahren zu deren herstellung

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DE2514215A1
DE2514215A1 DE19752514215 DE2514215A DE2514215A1 DE 2514215 A1 DE2514215 A1 DE 2514215A1 DE 19752514215 DE19752514215 DE 19752514215 DE 2514215 A DE2514215 A DE 2514215A DE 2514215 A1 DE2514215 A1 DE 2514215A1
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Germany
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methyl
hydroxy
ethyl
lasalocid
tetrahydro
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Withdrawn
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DE19752514215
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English (en)
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John Westley
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F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • C12P17/162—Heterorings having oxygen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. Lasalocid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D309/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings
    • C07D309/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D309/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D309/06—Radicals substituted by oxygen atoms

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  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Description

Dr.E.v.Ped- α- .. ;.^.lJehreng
Dp;. Ing. U. toctz
8 Mandien 90, Sdiweigeretr. 2
1A-46 328
Beschreibung; zu der Patentanmeldung
F. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz:
betreffend:
Antibiotika
und Verfahren zu deren Herstellung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Antibiotika der allgemeinen Formel
CO2H
Mn/7.3.1975
in der R , R2, R3 und R4 Methyl oder Aethyl darstellen, wobei nur eine der Substituenten R und R4 Aethyl darstellt,
in isolierter Form sowie pharmazeutisch verträgliche Salze
dieser Verbindungen.
Es wurde gefunden, dass die Antibiotika der Formel I und ihre pharmazeutisch verträglichen Salze coccidiotatische und antibakterielle Wirkung ausüben. Sie sind somit als
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coccidiostatische und antibakterielle Mittel verwendbar.
Die neuen Antibiotika der Formel I und ihre pharmazeutisch verträglichen Salze werden erfindungsgemäss durch ein Verfahren hergestellt, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen unter die Species Streptomyces X-537 fallenden Mikroorganismus in einem assimilierbare Kohlenhydrat- und Stickstoffquellen enthaltenden Nährboden submers und aerob kultiviert, bis das Medium erhebliche antibiotische Aktivität aufweist, wonach man die so erzeugten Verbindungen der Formel I aus dem wässerigen Nährboden isoliert und erwünschtenfalls ein erhaltenes Produkt in ein pharmazeutisch verträgliches Salz hiervon überführt.
Der die erfindungsgemässen Antibiotika erzeugende Mikroorganismus gehört der Gattung Streptomyces an und wurde aus einer in Hyde Park, Massachusetts, gefundenen Bodenprobe isoliert. Gefriergetrocknete Proben der mit der Laborbezeichnung X-537 kenntlich gemachten Kultur, wurden in der Mikroorganismensammlung des United States Department für Landwirtschaft, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, USA unter Nr. NRRL 3382 hinterlegt. Diese Kultur ist durch NRRL der Allgemeinheit zugänglich gemacht worden. Die Kultur ist ebenfalls aus International Center of Information in Zusammenarbeit mit W.H.O. in Belgien allgemein zugänglich.
Nachstehend folgt eine allgemeine; Beschreibung eines typischen Stammes von Streptomyces X-537.
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Wenn die Kultur nach den Vorschriften in Shirling, E.B. and D. Gottlieb, "Methods for Characterization of Streptomyces Species", Intern. J. Systematic Bacteriol. 16, 313-340, 1966" (nachstehend kurz "Shirling & Gottlieb, 1966" genannt) getestet wird, zeigt sie ein gut entwickeltes und verzweigtes Mycelium. Die Sporenketten weisen auseinandergezogene Windungen auf (Retinaculum-Apertum gemäss der Terminologie von Ralf Hütter: Systematic der Streptomyceten, Seite 10, Publ. S. Karger, 1967). Jede Sporenkette trägt im Durchschnitt etwa 25 Sporen; die Sporenoberfläche ist rauh.
Die Morphologie der Kolonien an verschiedenen Agarmedien ist wie folgt:
Agarmedium Farbe der
Kolonien- _.
oberfläche ; 		Farbe der
Rückseite _.
der Kolonie		 Lösliches ..
Pigment
Hefe-Malz
(ISP No. 2)		 2dc
(hell bräun
lich-grau)		 0c5r
(gelb-braun)		 Gelb-braun
Hafermehl
(ISP No. 3)		 e
(hell metal
lisch grau)		 Co5a
(weisslich
gelb)		 Schwach gelb
braun)
Anorganische
Salze und
Stärke
(ISP No. 4)		 e Coo4s
(rötlich
gelb-braun)		 Gelblich-braun
Glucose-
asparagin
(ISP No. 5)		 2dc Coo2m
(golden gelb
braun)		 Hell gelblich
braun
i
Medien gemäss Shirling & Gottlieb, 1966 Tresner-Backus Farbskala Prauser's (1964) Farbskala Keine Veränderung in 0,05 N HCl oder NaOH
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Wenn die Kultur gemäss Shirling & Gottlieb, 1966 getestet wird, verwertet sie Kohlenhydrate wie folgt: Arabinose 3+, Cellulose + , Fructose 3+, Glucose 3+, Inositol 4+, Mannitol 4+, Raffinose +, Rhamnose 2+, Sucrose +, Xylose 3+.
Wenn die Kultur gemäss R.E. Gordon "The Taxonomy of Soil Bacteria" in Ecology of Soil Bacteria, Verleger T.R.G. Gray & D. Parkinson, Liverpool University Press, Liverpool, 1967, getestet wird, werden folgende physiologische Reaktionen beobachtet:
Hydrolyse von: Adenin +, Casein +, Hypoxanthin +, Tyrosin +, Kartoffelstärke +.
Erzeugung von: Urease -, Nitratreduktase -.
Verwertung von: Citrat +, Lactat -, Malat +, Mucat -, Oxalat -, Succinat +.
Säure aus: Adonitol -, Arabinose -, Dulcitol -, Erythritol -, Galactose +, Glucose +, Inositol +, Lactose +, Maltose +, Mannitol +, Mannose +, Melibiose +, a-Methyl-D-glucosid +, Raffinose -, Rhamnose +, Sorbitol -, Trehalose +, Xylose +.
Wachstum bei: 10°C +, 42°C +, 53°C -.
Wachstum in: Lysozymbrühe -, Salxcylatbrühe -, Glycerolbrühe +.
Bei Verwendung der Methoden gemäss dem International Streptomyces Project (ISP) (Shirling & Gottlieb, 1966) und dem Schlüssel von Nonomura (J. Nonomura: Key for
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Classification and Identification of 458 Species of Streptomycetes included in ISP; J. Ferment. Technol. 52: 78-92,
1974) wird ersichtlich, dass die Kultur keinem der in diesen Studien untersuchten Streptomyceten entspricht. Die Kultur
enthält das L-Isomere von Diaminopimelinsäure.
Das bisher als Antibitikum X-537A (Lasalocid A) gekennzeichnete Antibiotikum wurde bei der Laboratorienanalyse als 6-{7(R) -[5(S)-Aethyl-5-(5(R)-äthyltetrahydro-S-hydroxy-6(S) methyl-2H-pyran-2(R)-yl)-tetrahydro-3(S)-methyl-2(S)-furyl]-4(S)-hydroxy-3(R),5(S)-dimethyl-6-oxononylj-2,3-kresotinsäure charakterisiert, d.h. eine Verbindung der Formel
CO2H
Die vorliegende Erfindung betrifft Homologe des Antibiotikums Lasalocid A und deren pharmazeutisch verträgliche
Salze. Die erfindungsgemässen Lasalocidhomologe sind Verbindungen der folgenden Formeln und Nomenklatur:
Lasalocid B: CO2H
CH
6-[7(R) -[5(S)-Aethyl-5-(5(R)-äthyltetrahydro-5-hydroxy-
6(S)-methyl-2H-pyran-2(R)-yl)-tetrahydro-3(S)-methyl-2(S)-furyl]-4(S)-hydroxy-3(R),5(S)-dimethyl-6-oxononyl}-2-
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25U2-15
hydroxy-3-äthy!benzoesäure.
Lasalocid C:
CO,H C,H
CH-
6-{j (R) -[5(S)-Aethyl-5-(5(R)-äthyltetrahydro-5-hydroxy-6 (S)-methyl-2H-pyran-2(R)-yl)-tetrahydro-3(S)-methyl-2(S) furyl]-3(R)-äthy1-4(S)-hydroxy-5(S)-methyl-6-oxononyl}-2,3-kresotinsäure.
Lasalocid D:
CO2H CH
6-{7(R) -[5(S)-Aethyl-5-(5(R)-äthyltetrahydro-5-hydroxy-6(S)-methyl-2H-pyran-2(R)-yl)-tetrahydro-3(S)-methy1-2(S)-furyl]-5(S)-äthy1-4(S)-hydroxy-3(R)-methyl-6-oxononyl}-2,3-kresotinsäure·
Lasalocid E:
CO2H CH3
CH
CH1
C2H5
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6-£7 (R)-[5(S)-Aethyl-5-(5(R)-äthyltetrahydro-5-hydroxy-6(S)-methyl-2H-pyran-2(R)-yl)-tetrahydro-3(S)-äthyl-2(S) furyl]-4(S)-hydroxy-3(R),5(S)-dimelhyl-6-oxononylf -2,3-kresotinsäure.
Die erfindungsgemässen Lasalocidhomologen werden durch Fermentation von Streptomyces X-537 unter aeroben submersen Bedingungen hergestellt, wobei der pH-Wert der Gärlösung auf etwa neutral, d.h. etwa 6,5 bis 7,5, eingestellt wird. Der verwendete Nährboden enthält eine Stickstoffquelle, wie z.B. Hefe, ein Hefeprodukt, Maismehl, Bohnenmehl und dergleichen, wobei Sojabohnenmehl bevorzugt ist; Salze wie z.B. Kaliumphosphat, Calciumcarbonat, und Spurenelemente; eine Kohlenhydratquelle, wie Zucker, Melasse und dergleichen, vorzugsweise braunen Zucker; und ein pflanzliches oder tierisches Fett oder OeI, wie z.B. Sojabohnenoel oder Schmalzöl, als Kohlenstoffquelle und Agens zur Schaumbekämpfung und zur Verbesserung der Ausbeute am gewünschten Endprodukt. Die Fermentation wird bei leicht erhöhter Temperatur, d.h. zwischen etwa 25 und 35 C, insbesondere bei etwa 28 C, durchgeführt. Nach einer Inkubationszeit von etwa 4 bis 6 Tagen wird die Gärlösung filtriert und die Antibiotika durch Extraktion gewonnen.
Nach erfolgter Fermentation können eine Vielzahl Methoden zur Isolierung und Reinigung der erfindungsgemässen Lasalocidhomologen angewendet werden. Beispiele hierfür sind Lösungsmittel-Extraktionsverfahren, wie z.B. intermittierende Extraktion oder flüssig-flüssig-Extraktion in Gegenstromverteilungsverfahren oder auch Gelpermeationchromatographie in einem nicht-wässerigen System.
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Die pharmazeutisch verträglichen Salze der erfindungsgemässen Lasalocidhomologen können nach herkömmlichen Methoden hergestellt werden. Diese Salze werden aus der freien Säureform des Antibiotikums oder seiner Derivate nach an sich bekannten Methoden hergestellt, beispielsweise durch Waschen der freien Säure in Lösung mit einer geeigneten Base bzw. einem geeigneten Salz. Beispiele solcher pharmazeutisch verträglichen basischen, zur Salzbildung befähigten Substanzen sind Alkalimetallbasen, wie z.B. Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Lithiumhydroxid und dergleichen; Erdalkalimetallbasen wie z.B. Calciumhydroxid, Kaliumhydroxid und dergleichen; und Ammoniumhydroxid. Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze, welche für die Herstellung der erfindungsgemässen, pharmazeutisch verträglichen Salze angewendet werden können, sind beispielsweise Carbonate, Bicarbonate und Sulfate.
Die relative antibiotische Wirksamkeit der Lasalocidhomologen B, C, D und E im in vitro Test gegen den Mikroorganismus Bacillus TA wurde durch Vergleich eines reinen Natriumsalzes von Lasalocid A mit den vier Homologen unter Verwendung der Agardiffusionsmethode auf Lochplatten ermittelt. Die berechneten Zahlenwerte für die fünf Komponenten basieren auf eine willkürlich gesetzte Aktivität von 100 für Lasalocid Α-Base und gehen aus der nachstehenden Tabelle hiervor:
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25U215
Verbindung Berechnete in vitro Aktivität
gegen Bacillus TA
Lasalocid A 100
Lasalocid B 90
Lasalocid C 180
Lasalocid D 160
Lasalocid E 170
Die erfindungsgemässen coccidiostatischen Präparate enthalten als wirksamen Bestandteil Homologe des Antibiotikums Lasalocid A oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz hiervon und werden hergestellt durch Vermischen des wirksamen Bestandteiles mit einem inerten Träger. Der inerte Träger kann aus Futter, Ersatzmaterialien und dergleichen bestehen. Mit dem Ausdruck "inerter Träger" wird ein Material gemeint, dass als antiparasitäres Mittel, z.B. als Coccidiostatikum, nicht wirkt, und für die zu behandelnden Tiere unschädlich ist.
Der wirksame Bestandteil unterdrückt Coccidiose bei Nutzgeflügel, insbesondere Puten und Küken, entweder durch Verhinderung oder, bei bereits vorhandener Krankheit, Heilung derselben nach oraler Verabreichung als eine Komponente des Futters. Desweiteren behalten die behandelnden Tiere ihr Gewicht oder sie(sogar)vermehren ihr Gewicht im Vergleich zu Kontrolltieren. Die erfindungsgemässen Mittel kontrollieren somit nicht nur die Coccidiose, sondern sie wirken darüber hinaus als wachstumsfördernde Mittel.
Die Konzentration des Wirkstoffes in Futtermitteln kann den individuellen Bedürfnissen entsprechend variiert werden. Beispielsweise kann ein Futterprämix oder ein vollständiges Futter mit genügend Wirkstoff angereichert werden, um etwa 0,006 bis etwa 0,03 Gew.% des täglichen Futterkonsums zu enthalten. Bevorzugt verwendet man etwa 0,015
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bis 0,03 Gew.%. Im allgemeinen genügen etwa 0,015 Gew.% des Wirkstoffes, um die Coccidiose erfolgreich zu unterdrücken bzw. zu bekämpfen. Grössere Mengen als 0,015 % sind zwar wirksam, sie zeigen jedoch im allgemeinen keine Vorteile gegenüber 0,015% und können in einigen Fällen das Wachstum, die Futterumwandlung und die Mortalität nachteilig beeinflussen.
Obwohl Mengen oberhalb 0,03 Gew.% zur Bekämpfung von Coccidiose wirksam sind, stellt diese Menge aus ökonomischen Gründen die bevorzugte obere Grenze dar, d.h. die Kosten pro Wirkungseinheit sind innerhalb dieses Bereiches am niedrigsten. Unterhalb 0,006 Gew.% sind die Wirkstoffe zur Bekämpfung von Coccidiose nicht wirksam. Bevorzugt ist eine niedere Grenze von 0,015%, weil diese Konzentration optimale Wirksamkeit gewährleistet. Die besonders bevorzugte Konzentration, d.h. etwa 0,015 Gew.% des täglichen Futterkonsums., ist deshalb besonders bevorzugt wirksam, weil sie bei minimaler Dosierung die maximale Wirkung hervorruft.
Für die Behandlung oder Verhinderung von Coccidiose können die Wirkstoffe zunächst in Form eines Konzentrates, eines Futterzusatzprämixes oder eines Futterzusatzes gebracht werden. Aus diesen können durch Verdünnen Vollfutter oder Zusatzfutter hergestellt werden. Beispiele von Trägern sind: kommerzielle Geflügelfutter, gemahlene Cerealien, Nebenprodukte der Mühlereiindustrie, Pflanzenprotein-Konzentrate (Soja, Erdnuss, etc.), Nebenprodukte von Fermentationen, Salz, Kalkstein, anorganische Verbindungen, usw. oder Mischungen hiervon. Flüssige Dispersionen können unter Verwendung von Wasser oder pflanzlichen Oelen, bevorzugt unter Einbeziehung eines oberflächenaktiven Mittels oder eines Emulgators, usw., wie Aethylendiamintetraessigsäure etc., und Lösungsvermittler hergestellt werden. Auch andere Träger oder Ersatzmaterialien können als inerte
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Träger verwendet werden, sofern sie sich gegenüber dem Wirkstoff inert verhalten und gegenüber dem zu verabreichenden Tier untoxisch sind.
Typische Geflügelfutter, die mit dem Wirkstoff vermengt werden können, enthalten z.B. Getreideprodukte, wie Mais, Weizen, Hafer, Gerste, MiIo, Hafermehl, Nachmehl (z.B. Weizennachmehl) usw.; stabilisierte Fette; Pflanzenproteine, wie Soyamehl, Maisglutenmehl, Erdnussmehl, usw.; Tierproteine wie Fischmehl, wasserlösliche Anteile von Fischen ("fish solubles"), Fleischabfälle usw.; Quellen für UGF ("unidentified growth factor") und andere B-Vitaminträger wie Trockenmilchprodukte, getrocknete Brauereihefe, getrocknete lösliche Rückstände der Destillationsindustrie, lösliche Rückstände von Fermentationen etc., Luzernegrünmehl; und verschiedene Spezialzusatzmittel wie Riboflavin, Vitamin B12, Calciumpantothenat, Niacin, Cholin, Vitamin K, Vitamin E, stabilisiertes Vitamin A, Vitamin D,. (aktivierte tierische Sterole), Calcium und Phosphorsupplemente wie z.B. Dicalciumphosphat, dampfbehandeltes Knochenmehl, defluoriertes Phosphat, Kalkstein etc., jodiertes Salz, Mangansulfat, Zinkcarbonat, Methionin oder dessen Hydroxyanalogon, Antioxidantien sowie auch weitere, antibiotisch wirksame Futterzusätze.
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Beispiel 1 Herstellung der Lasalocidhomologe B, C, D und E
Der Streptomyces-Organismus wird in belüfteter submerser Nährlösung in Schüttelflaschen bebrütet. Der pH-Wert der Gärlösung wird durch Zugabe von wässeriger Kaliumhydroxidlösung auf 6,5 bis 7,5 eingestellt; anschliessend wird die Nährlösung sterilisiert. Es wird eine Tankgärung durchgeführt, wobei ein 5-lO%iges Inoculum bestehend aus einer 3 Tage alten submersen Kultur aus den belüfteten Flaschen verwendet wird. Das Nährmedium enthält 2% Sojabohnenmehl, 2% braunen Zucker, 0,1% Dikaliumphosphat und 0,5% Maisquellwasser· Die Fermentation wird bei 28 C unter positivem Luftdruck durchgeführt, wobei Luftmengen von 150-300 Liter pro Minute pro 150-300 Liter Lösung eingeblasen werden. Die Gärung wird nach 4 bis 6 Tagen unterbrochen, die Gärlösung filtriert und das Antibiotikum durch Extraktion gewonnen. Die Extraktion wird wie folgt durchgeführt:
204 Liter Gärlösung werden filtriert. Der nasse Filterkuchen wird in 100 Liter n-Butylacetat aufgeschlämmt und das Gemisch über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Das Gemisch wird anschliessend filtriert und die Wasserschicht abgetrennt und verworfen. Die n-Butylacetatlösung, die eine Antibiotikumkonzentration entsprechend 30 Millionen Bacillus Ε-Einheiten enthält, wird unter vermindertem Druck auf 3 Liter konzentriert, mit 10% wässeriger Natriumcarbonatlösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet.
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Nach weiterem Konzentrieren auf 3OO ml und Verdünnen mit 350 ml Petroläther (Siedepunkt 5O-6O°C) erhält man 41 g Festsubstanz, die bei der Probe 25 Millionen Bacillus E-Einheiten entsprechen, abgetrennt. Diese Festsubstanz wird anschliessend in einer Soxhlet-Apparatur mit 4 Liter Petroläther (Siedepunkt 5O-6O°C) 40 Stunden extrahiert. Der Extrakt wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft und der kristalline Rückstand in Petroläther dispergiert und filtriert. Nach wiederholten Kristallisationen erhält man eine an den Lasalocidhomologen B, C, D und E angereicherte Mutterlauge.
Beispiel 2 Isolierung der Lasalocidhomologen B, C, D und E
Eine Portion (entsprechend 22 g Festsubstanz) der gemäss Beispiel 1 gewonnenen Mutterlauge wird in einer mit 200 Röhrchen (jedes mit einem Fassungsvermögen von 80 ml) bestückten Gegenstromverteilungsapparatur chromatographiert. Die Probe wird in 160 ml der gemischten Phasen (Heptan-Aethylacetat-Methanol-Wasser, 27:18:18:2) gelöst und die Lösung in die ersten beiden Röhrchen vorgelegt. Nach Verteilungen erhält man folgende Fraktionen, wobei die gewonnenen Festsubstanzen nach Eindampfen wie folgt identifiziert sind:
A. Gemisch der Lasalocidhomologen B, C, D und E
B. Lasalocid A
C. Isolasalocid A. Dieses Produkt ist ein Isomeres von Lasalocid A mit einer von den Lasalociden A-E abweichenden Struktur.
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Fraktion A wird in 20 ml der gemischten Phasen des Lösungsmittelsystems Heptan-Aethylacetat-Aethanol-Wasser-Eisessig (10:5:9:3:1) gelöst und an einer mit 500 Röhrchen bestückten Gegenstromverteilungsapparatur chromatographiert. Nach 2800 Verteilungen werden je etwa 200 mg Lasalocid B, C, D und E der folgenden Schmelzpunkte separiert:
Lasalocid B - 85-87 C Beispiel 3
Lasalocid D - 97-lOO°C
Lasalocid D - 1O2-1O4°C
Lasalocid E - 90°C
Natriumsalz von Lasalocid E
Etwa 100 mg Lasalocid E werden in Methylenchlorid gelöst und mit gesättigter wässeriger Natriumcarbonatlösung behandelt. Die Methylenchloridphase wird mit Hexan konzentriert. Man erhält 104 mg kristallines Natriumsalz von Lasalocid E (Schmelzpunkt 182-182,5°C).
Beispiel 4
Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung der Wirkstoffe in einem Tierfutter. Ein als Anfangsfutter für Broiler vorgesehenes, medikiertes Geflügelfutter wird in der Weise hergestellt, dass man 0.015 Gew.% und 0,006 Gew.% eines Gemisches von Lasalocid B und c (5O/5O) und Lasalocid D und E (50/50) einem Geflügelfutter beimischt, das aus folgenden Bestandteilen besteht:
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co co co
Bestandteile
Gemahlenes Maismehl Stabilisiertes Fett oder Pflanzenöl Sojabohnenmehl (niederer Fibergehalt; 50% Protein) Maisglutenmehl Fischmehl, behandelt mit Antioxidans, 60% Protein Wasserlösliche Anteile von Fischen ("fish solubles"), auf Trockengewichtsbasis
Fleisch- und Knochenabflalle, 50% Protein Getrocknete, lösliche Rückstände aus der Maisbrennerei Luzernegrünmehl, 17% Protein, 200,000 A/kg Mangansulfat, Futterqualität Zinkcarbonat oder -oxid Riboflavin Vitamin B12 Calciumpantothenat Niacin Stabilisiertes Vitamin A, US Pharmacopoe-Einheiten Vitamin D_ , int. Küken-Einheiten Vitamin E Acetat, int. Einheiten Vitamin K, (Menadion-natriumbisulfit) DL-Methionin oder das Hydroxyanalogon hiervon Antioxidans'(Aethoxyquin oder butyliertes Hydroxytoluol) Gewichtseinheiten
510 kg/ton
27 kg/ton
200 kg/ton
23 kg/ton
14 kg/ton
5 kg/ton
64 kg/ton
23 kg/ton
14 kg/ton
0,35 kg/ton
0,11 kg/ton
3 g
6 mg
5 g
30 g
,000,000
650,000
5,000
2 g
0,45 kg/ton
0,11 kg/ton
NJ)
cn
ro
cn
25H215
Folgender Versuch illustriert die Wirkung der Wirkstoffe:
Laboratorien-Küken infiziert durch Eimeria tenella Versuchsmethodik:
Es werden 10 Küken pro Dosis eingesetzt. 10 Küken werden als Gewichtskontrolle und 10 Küken als infizierte Kontrolle verwendet. Das Antibiotikum wird 48 Stunden vor der Infektion gegeben. 1 g des Antibiotikums wird in einem mechanischen Mixer mit der benötigten Menge Kükenfutter vermischt, um die gewünschte Dosierung zu erreichen. Die Infektion besteht aus etwa 200,000 Oocysten, peroral mit Hilfe einer Pipette verabreicht. Der Versuch dauert 11 Tage, wonach die überlebenden Tiere autopsiert und auf grobe caecale Verletzungen untersucht werden. Die Zahl der überlebenden Tiere und die Zahl der caecalen Verletzungen werden ermittelt. Die Ergebnisse werden als "durchschnittlicher Infektionsgrad" ausgedrückt. Bei einem durchschnittlichen Infektionsgrad von weniger als 1,5 wird die zugehörige Dosis als signifikant wirksam angesehen.
Wie aus dem nachstehenden hervorgeht, ist das Antibiotikagemisch wirksam bei der Behandlung von Coccidiose.
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Dosierung im Durchschnittlicher Prozent Futter, Gew.% Infektionsgrad Mortalität
O (O OO
Uninfizierte, unbehandelte Kontrolle keine
Infizierte, unbehandelte Kontrolle keine
1:1 Gemisch
1:1 Gemisch
0,015 0,006 0,015 0,006
0,0
2,6-2,8 1,0 1,2 0,0 1,2
10-20
25H215
Beispiel 5
Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung eines Einzelwirkstoffes als Coccidostatxkum in einem Tierfutter. Ein als Anfangsfutter für Broiler vorgesehenes medikiertes Geflügelfutter wird gemäss Beispiel 4 hergestellt. Etwa 0,01 Gew.% Lasalocid D wird dem in Beispiel 4 beschriebenen GeflugeIfutter beigemischt. Die in Beispiel 4 beschriebene Testmethodik für die Untersuchung auf Wirksamkeit gegen Eimeria tenella wird angewendet. Wie aus dem nachstehenden hervorgeht, besitzt das Antibiotikum Wirksamkeit gegen Coccidiose.
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PO
Dosierung im Durchschnittlicher Prozent Futter, Gew.% Infektionsgrad Mortalität
Uninfizierte, unbehandelte
Kontrolle keine 0,0 0
Infizierte, unbehandelte
Kontrolle keine 3,0 20
cn
O Lasalocid D 0,01 0,5 0
CO
00
CD CO
U)
1TJ
rf-
(D
3 d·
Oi P cn d
ä ο tr
CD
cn cn

Claims (4)

Patentansprüche
1. Antibiotika der allgemeinen Formel
CO2H
in der R,, R3, R und R. Methyl und Aethyl darstellen, wobei nur einer der Substituenten R.-R4 Aethyl darstellt,
in isolierter Form sowie pharmazeutisch verträgliche Salze
dieser Verbindungen. :
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung.nach Anspruch
• - dadurch gekennzeichnet, dass man
einen unter die Species Streptomyces X-537 fallenden Mikroorganismus in einem assimilierbare Kohlenhydrat- und Stickstoffquellen enthaltenden Nährboden submers und aerob kultiviert, bis das Medium erhebliche antibiotische Aktivität aufweist, wonach man die so erzeugten Verbindungen der Formel I aus dem wässerigen Nährboden isoliert und erwünschtenfalls ein erhaltenes Produkt in ein pharmazeutisch verträgliches Salz hiervon überführt.
3-;· Verfahren nach Anspruch 2. dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Streptomyces X-537, NRRL 3382 verwendet.
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U 25H215
'4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kultivierung von Streptomyces X-537 bei einem pH-Wert von etwa 6,5 bis etwa 7,5 und bei einer Temperatur von etwa 25°C bis etwa 35°C durchführt.
■5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2-4/, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kultivierung in Gegenwart eines pflanzlichen oder tierischen Fettes oder OeIs durchführt.
6· Verfahren nach einem der Ansprüche 2-5 . dadurch gekennzeichnet,' dass man die Endprodukte in der Weise gewinnt, dass man den wässerigen Nährboden filtriert, das Filtrat mit einem wasserunlöslichen Lösungsmittel extrahiert und die Endprodukte aus dem Lösungsmittelextrakt separiert.
■1 Verfahren nach Anspruch .-6, dadurch gekennzeichnet, dass man das Filtrat mit n-Butylacetat extrahiert und den Extrakt mit Petroleumäther·zwecks Erhalts einer an den gewünschten Endprodukten angereicherten Mutterlauge behandelt.
8 . Verfahren nach Anspruch 6 oder S], dadurch gekennzeichnet, dass man die Trennung der Endprodukte aus dem Lösungsmittelextrakt in der Weise durchführt, dass man letzteren einer Gegenstromverteilung unterwirft.
9.. Verfahren nach Anspruch 8y dadurch gekennzeichnet, dass.man die Gegenstromverteilung in der Weise bewerkstelligt, dass man zuerst ein Lösungsmittelsystem bestehend aus Heptan-Aethylacetat-Methanol-Wasser verwendet und anschliessend die die erwünschten Produkte enthaltende Fraktion einer zweiten Gegenstromverteilung mit Heptan-Aethylacetat-Aethanol-Wasser-Eisessig als Lösungsmittelsystem unterwirft.
10. Verfahren nach Anspruch % dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittelsystem für die erste Gegenstromverteilung aus Heptan-Aethylacetat-Methanol-Wasser in einem
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25H215
Volumenverhältnis von etwa 27:18:18:2 besteht und dass das Lösungsmittel für die zweite Gegenstromverteilung aus Heptan-Aethylacetat-Aethanol-Wasser-Eisessig in einem Volumenverhältnis von etwa 10:5:9:3:1 besteht.
11. Präparat mit coccidostatischer und antibakterieller Wirkung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Verbindung oder einem Gemisch von Verbindungen nach Anspruch
iS.. Präparat nach Anspruch 1-I7 dadurch gekennzeichnet, dass es etwa 0.006 bis etwa 0.03 Gew.% wirksamen Bestandteil enthält.
15- Präparat nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Gemisch von 6-£7(R)-[5(S)-Aethy1-5-(5(R)-äthyltetrahydro-S-hydroxy-ö(S)-methyl-2K-pyran-2(R) yl)-tetrahydro-3(S)-methyl-2(S)-furyl]-4(S)-hydroxy-3 (R) , 5 (S)-dimethyl-6-oxononyl}-2-hydroxy-3-äthy!benzoesäure und 6- [7(R) -[5(S)-Aethyl-5-(5(R)-äthyltetrahydro-5-hydroxy-e(S) methyl-2H-pyran-2(R)-yl)-tetrahydro-3(S)-methyl-2(S)-furyl]-
3 (R)-äthyl-4(S)-hydroxy-5(S)-methyl-6-oxononyl}-2,3-kresotinsäure in einem 1:1 Gewichtsverhältnis als wirksamen Bestandteil enthält.
14. Präparat nach anspruch IV oder 12,- dadurch gekennzeichnet, dass es ein Gemisch von 6-j_7 (R) - [5 (S) -Aethyl-5-(5 (R) -äthyltetrahydro-5-hydroxy-ö (S) -methyl-2H-pyran-2 (R) yl)-tetrahydro-3(S)-methyl-2(S)-furyl]-5(S)-äthyl-
4 (S)-hydroxy-3 (R) -methyl-6-oxononylJ'-2 ,3-kresotinsäure und 6--[7 (R) - [5 (S) -Aethyl-5- (5 (R) -äthyltetrahydro-5-hydroxy-6(S)-methyl-2H-pyran-2(R)-yl)-tetrahydro-3 (S)-äthyl-2(S)-furyl]-4(S)-hydroxy-3(R),5(S)-dimethyl-6-oxononylJ-2,3-kresotinsäure in einem 1:1 Gewichtsverhältnis als wirksamen Bestandteil enthält.
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