DE2534342A1 - Als verbindung 38 295 bezeichnetes antibiotikum, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung - Google Patents

Description

RECHTSANWÄLTE

DR. JUR. DIPL-CHEM. WALTER BER, λ q q / ο / O

ALFRED KOEPFEHER 'Tl. Juli 1375

DR. JUR. D:r-L.-CHEM. H.-J. WOLFF
DR. JUR. HAhS CIiS. BEIL

FRAUKFURr AM MAlN-HOCHSt

Unsere Nr. 20 049 Ec/tk

Pfizer Inc.
New York, N.Y., V.St.A.

Als Verbindung 38 295 bezeichnetes Antibiotikum, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung.

Die Erfindung betrifft ein neues Glied der aus sauren polycyclischen Äthern bestehenden Gruppe von Antibiotika, d.h. einer Klasse von Verbindungen, die biologisch durch ihre Wirkung auf den Kationentransport in Mitochondrien gekennzeichnet ist. Zu dieser Familie von Antibiotika gehören Monensin (J. Amer. Chem. Soc, Bd. 89, S. 5737, 1967); Nigericin (Biochem. Biophys. Res. Comm., Bd. 33, S. 29» 1968); Grisorixin (J. Chem. Soc. Chem. Commun., S. 1421, I97O); Dianemycin (J. Antibiotics, Bd. 22, S. I6l, 1969); Salinomycin (J. Antibiotics, Bd..27, S. 8l4, 1974); X-537A (J. Chem. So.c. Chem. Commun., S. 967, 1972); X-206 (J. Chem. Soc. Chem. Commun., S. 927, 1971); und A2O4A (J. Amer. Chem. Soc, Bd. 95, S. 3399, 1973).

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Die vorstehend aufgeführten, aus polycyclischen Äthern
bestehenden Antibiotika sind wirksam gegenüber grampositiven Bakterien, Pilzen und Protozoen. Sie weisen eine
starke Wirksamkeit gegenüber Coccidiose auf.

Die US-PS 3 839 557 beschreibt ein Verfahren zur Verbesserung der Putterverwertung durch Wiederkäuer und monogastrische Tiere (Tiere mit einem Magen), die mit pflanzlichen Faser-r materialien gefüttert werden und denen Monensin, Dianemycin, Nigericin oder andere polycyclische Äther als Antibiotika verabreicht werden.

Die Erfindung betrifft ein als Verbindung 38 295 bezeichnetes Antibiotikum mit der Formel:

CH₃

OCH.

HCUCi/IHlC

CH₃ OCH₃

ΌΗ-

H₃CO CH₃

Das Antibiotikum wird durch submerse aerobe Züchtung von
Streptomyces hygroscopicus ATCC 31050 in wäßrigen Nährmedien hergestellt. Das Antibiotikum und seine kationischen. Salze sind starke antimikrobielle Mittel und sind wirksam als Coccidiostatika und als Wachstumsförderungsmittel für Tiere.

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Der zur Herstellung des erfindungsgemäßen Antibiotikums brauchbare Mikroorganismus wurde aus einer Bodenprobe aus Japan isoliert. Er wurde auf verschiedenen Medien gezüchtet, die zur Idenfizierung dieser Gattung verwendet werden, und es wurde geschlossen, daß er der Beschreibung von Streptomyees hygroscopicus sehr ähnlich ist.

Die Kultur dieses Mikroorganismus (Pfizer F.D. 23604) wurde auf verschiedenen Medien hinsichtlich verschiedener Merkmale mit einer Kultur von Streptomyees hygroscopicus 482.48 verglichen, die von der Holländischen öffentlichen Kulturensammlung, dem Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), erhalten worden war. Die Vergleiche und Entscheidungen wurden auf der Grundlage des in Applied Microbiology; Bd. 4, S. 243 bis 250, 1956, beschriebenen Artenverzeichnisses vorgenommen. Ein Vergleich der beiden Kulturen folgt:

Morphologie der Sporenketten - Ketten des Organismus Pfizer P.D. 23604 in Spiralen mit 6 bis 10 Windungen oder weniger auf verschiedenen Medien ähnelten den beschriebenen Ketten von Streptomyees hygroscopicus CBS, die in Pig. I der vorstehenden Veröffentlichung erläutert sind. Sporen des Organismus Pfizer F.D. 23604, die unter dem Elektronenmikroskop (scanning electron microscope) untersucht wurden, sahen genau wie die des CBS-Stammes von S. hygroscopicus aus, die in Applied Microbiology, Bd. 18, S. 695-696, I969, erläutert sind, wo beschrieben ist, daß die Sporen eine runzelige Oberfläche haben, die aus zahlreichen Gruben besteht, die durch Grate von Sporenwandmaterial begrenzt sind. Gefärbte Sporenscheiben der beiden Kulturen hatten ein identisches Aussehen.

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Farbe der Kolonien - Das Luftmycel erschien grau auf den meisten Medien, wobei jedoch die genaue Schattierung für die beiden Kulturen etwas unterschiedlich war. Der Organismus Pfizer F.D. 23604 auf Czapek-Saccharose-Agar hatte ein dickes, unregelmäßig gefaltetes, gräulich/weißes Wachstum, während das Wachstum des CBS-Stammes von S. hygroscopicus flach, dünn und grau war. Der Organismus Pfizer F.D. 23604 auf Hafermehl-Agar entwickelte nach einer Inkubationszeit von vier Wochen einen gelben Farbton in dem vorher grauen Luftmycel. Auf Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar hatte der Organismus Pfizer F.D. 23604 gelbe Wachstumsflecke in dem grauen Mycel.

Melanin-Bildung - Auf einem Pepton-Eisen-Agar wurde von keiner der Kulturen Melanin gebildet.

Kohlenstoff-Verwertung - (Methode von Pridham und Gottlieb, J. Bact., Bd. 56, S. 107-114, 1948) Der Organismus Pfizer F.D. 23604 verwertete Glukose, L-Arabinose, Dextrin, D-Fructose, D(+)-Galactose, Glycerin, Inosit, Inulin, Lactose, Maltose, D-Mannit, salische Raffinose, Rhamnose, Natriumacetat, D-Sorbit, Sorbose, Stärke, Saccharose, Trehalose und D-Xylose; Dulcit wurde nicht verwertet. Diese Ergebnisse stimmen überein mit denen, die für Stämme von S. hygroseopicus in Applied Microbiology, Bd. I5, S. 637 bis 639» I967, und für den CBS-Stamm von S. hygroseopicus in Industrial Microbiology, Bd. 10, S. I83 bis 221, I969, aufgeführt sind mit der Ausnahme, daß der CBS-Stamm keinen Inosit verwertete.

HgS-Bildung - Auf Pepton-Eisen-Agar-Schrägkulturen wurden mit Bleiacetatstreifen für beide Kulturen positive Ergebnisse erzielt.

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Milch - Für beide Kulturen wurden gleiche Ergebnisse erzielt; keine Koagulation, vollständige oder fast vollständige Hydrolyse in 12 Tagen; braunes, lösliches Pigment.

Gelatine - Die Kulturen verhielten- sich gleich in Wachstum, Farbe und mäßiger Geschwindigkeit der Verflüssigung.

Spezielle Eigenschaften - Der CBS-Stamm von S. hygroscopicus entwickelte in drei Wochen auf Glukose-Asparagin-Agar, Hafermehl-Agar und Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar schwarze hygroscopische Bereiche, während der Organismus Pfizer F.D. 23604 schwarze Flecke nur auf Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar zeigte. Eine weitere einwöchige Inkubation und Lagerung von einigen Kulturen in Petrischalen bei 4 bis 10⁰C verstärkte das Schwarzwerden des Organismus Pfizer F.D. 23604 in der vierten Woche. Auf Hafermehl-Agar, Czapek-Saccharose und Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar bildete der Organismus Pfizer F.D. 23604 einen Geruch nach wilder Zwiebel oder Knoblauch zusammen mit etwas erdigem Geruch, während S. hygroscopious CBS nur den erdigen Geruch bildete, und von dieser Art auch sonst nirgends beschrieben ist, daß sie einen Geruch nach wilder Zwiebel hat oder bildet. Der Stamm Pfizer F.D. 23604 von S. hygroscopicus bildet die Verbindung 38 295, die ein aus einem polycyclischen Äther bestehendes Antibiotikum darstellt, während S. hygroscopicus CBS diese Verbindung nicht bildet und die Bildung dieses Antibiotikums auch nicht für andere Stämme von S. hygroscopicus beschrieben wurde.

Diese Kultur (F.D. 23604) wurde bei der The American Type Culture Collection, Rockville, Md., unter der Nr. ATCC 31050 hinterlegt.

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Die Züchtung von Streptomyces hygroscopicus ATCC 3IO5O erfolgt vorzugsweise in einem wäßrigen Nährmedium bei einer Temperatur von 28 bis 36⁰C und unter submersen aeroben Bedingungen unter Rühren. Zu den Nährmedien, die für diesen Zweck brauchbar sind, gehören eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, wie z.B. Zucker, Stärken und Glycerin; eine Quelle für organischen Stickstoff, wie z.B. Casein, enzymatische Abbauprodukte von Casein, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Erdnußmehl, Weizenglutin, Sojamehl, Fleischmehl und Fischmehl, Eine Quelle für wachstumsfördernde Substanzen, wie z.B. Korntrester und Hefeextrakt, sowie Salze, wie z.B. Natriumchlorid und Calciumcarbonat, und auch Spurenelemente, wie z.B. Eisen, Magnesium, Zink, Kobalt und Mangan, können ebenfalls mit vorteilhaften Ergebnissen eingesetzt werden. Wenn während der Fermentation übermäßiges Schäumen auftritt, so können Schaumbremsmittel, wie z.B. pflanzliche öle oder Silikone, dem Fermentationsmedium zugesetzt werden. Die Belüftung des Mediums in den Tanks für ein submerses Wachstum wird vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,5 bis 2 Volumen freie Luft pro Volumen Fermentationsbrühe pro Minute durchgeführt. Die Rührung kann mit Hilfe von Rührwerken durchgeführt werden, die in der Fermentationsindustrie allgemein üblich sind. Natürlich müssen aseptische Bedingungen während der Übertragung des Organismus und während des gesamten Wachstums aufrechterhalten werden.

Das Impfmedium für die Herstellung des Antibiotikums kann erhalten werden, indem man Wachstum von einer Schrägkultur des Organismus verwendet. Das Wachstum kann verwendet werden, um entweder Schüttelbehälter oder Impftanks zu beimpfen, oder es können auch die Impftanks aus den Schüttelbehältern beimpft werden. Das Wachstum in den Schüttelbehältern hat seine maximalen Ausmaße im allgemeinen in drei bis fünf Tagen erreicht, während ein Impfmedium in submersen

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Impftanks gewöhnlich in 2 bis 3 Tagen seine günstigste Periode erreicht hat. In der letzten Fermentationsstufe wird in etwa 3 bis 5 Tagen eine wesentliche antibiotische Wirksamkeit erreicht. Der Gehalt an Antibiotikum beträgt 50 bis 500 mg pro Liter.

Die Herstellung des Antibiotikums wird üblicherweise während der Fermentation durch eine biologische Untersuchung der Fermentationsbrühe unter Anwendung eines auf das Antibiotikum ansprechenden Stammes von Staphylococcus aureus oder Bacillus subtilis -«erfolgt. Dabei wird eine übliche Plattentechnik verwendet, wobei die Hemmzone, die ein mit der Fermentationsbrühe gesättigtes Rundfilter umgibt, als Maß für die antibiotische Stärke angewendet wird.

Die Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silikagel ist eine brauchbare Methode zur Analyse des in Fermentationsmedien hergestellten Antibiotikums und der Zusammensetzung von rohen und gereinigten Materialien, die aus den Fermentationsbrühen extrahiert wurden. Die Dünnschichtchromatogramme werden nach Entwicklung mit Äthylacetat mit 3 % Vanillin in äthanolischer Schwefelsäure (98,5 % : 1,5 %» Vol./Vol.) besprüht und anschließend einige Minuten auf 60 bis 8O⁰C erhitzt. Das Antibiotikum wird als glänzender, rötlich bis roter Fleck auf einem weißen Untergrund beobachtet.

Das als Verbindung 38 295 bezeichnete Antibiotikum kann aus der geklärten Fermentationsbrühe durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, wie z.B. Chloroform, Äthylacetat oder Methylisobutylketon, abgetrennt und gewonnen werden. Der Hauptteil des Antibiotikums ist in dem abgetrennten Mycel enthalten und wird daraus gewöhnlich extrahiert, indem man das Mycel mit einem wasserlöslichen

Lösungsmittel, wie z.B. Methanol, aufschlämmt.

Die bevorzugte Methode zur Abtrennung und Gewinnung des als Verbindung 38 295 bezeichneten Antibiotikums ist die folgende:

Die gesamte (unfiltrierte) Fermentationsbrühe wird zweimal mit etwa 1/5 bis 1/2 Volumen Methylisobutylketon extrahiert. Der Lösungsmittelextrakt wird unter Vakuum konzentriert, der dabei erhaltene ölige Rückstand wird dann in einem Gemisch von Chloroform und Hexan im Verhältnis 1:1 aufgeschlämmt und auf eine Silikagel-Säule gegeben (vorzugsweise eine Schicht von Silikagel 60 bedeckt mit einer Schicht von Silikagel PF₂₁-J., beide erhältlich von E. Merck, Darmstadt). Die Silikagel-Säule wird nacheinander mit Hexan, einem Gemisch aus Chloroform und Hexan im Verhältnis 1:1 sowie mit Chloroform entwickelt. Die Hauptfraktion mit Antibiotikum wird mit Äthylacetat eluiert. Das Eluat wird im Vakuum konzentriert, in Aceton aufgenommen und etwa 30 bis 60 Minuten mit aktivierter Holzkohle (Darco G 60) gerührt. Die Holzkohle wird durch Filtration entfernt, die Lösung wird im Vakuum auf ein geringes Volumen konzentriert, eine geringe Menge Wasser wird zugesetzt, und der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid auf 8,0 bis 8,5 eingestellt. Das sich abtrennende kristalline Material wird durch Filtration entfernt, mit Wasser gewaschen und getrocknet.

Das in dieser Stufe isolierte Antibiotikum ist ein gemischtes Natrium- und Kaliumsalz von Verbindung 38 295, das sich mit den Natrium- und Kaliumionen gebildet hat, die in der Fermentationsbrühe und dem zugesetzten Natriumhydroxid vorkommen und daraus herausgespült werden. DÜnnschichtchromatogramme dieser Materialien können Spurenmengen von mindestens zwei weiteren^stärker polaren Antibiotika

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zeigen, die beim Besprühen mit Vanillin in äthanolischer Schwefelsäure wie Verbindung 38 295 einen charakterxstischen rötlich bis roten Fleck ergeben.

Verbindung 38 295 kann durch Säulenchromatographie über Silikagel PPpcll aufgefüllt in Hexan als einziges Produkt erhalten werden. Die gemischten Natrium- und Kaliumsalze werden als eine Lösung in Äthylacetat oder Chloroform aufgegeben, und die Säule wird mit Hexan, das steigende Mengen an Äthylacetat enthält, unter 5,62 kg/cm entwickelt. Der Fortschritt der Trennung wird durch DünnschichtChromatographie verfolgt. Die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum eingedampft, und das Antibiotikum wird au£ Aceton-Wasser kristallisiert.

Die freie Säure von Verbindung 38 295 kann aus dem gemischten Natrium- und Kaliumsalz erhalten werden, indem man den pH-Wert einer Äthylacetat- oder Chloroformlösung mit verdünnter Phosphorsäure auf ¹1,5 einstellt. Die organische Schicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft, und der Rückstand wird aus Chlorοform-Hexan kristallisiert.

Das Natriumsalz von Verbindung 38 295 kann erbalten werden, indem man den pH-Wert einer Lösung der freien Säure in Äthylacetat oder Chloroform mit Natriumhydroxid (1 n) auf 8,5 einstellt. Das Material wird aus Acton-Wasser kristallisiert. Das kristalline Kaliumsalz wird auf gleiche Weise unter Vervrendung von Kaliumhydroxid anstelle von Natriumhydroxid erhalten.

Ein kristallines Silbersalz kann durch Zusatz von wäßrigem Silbernitrat zu einer äthanolischen Lösung des gemischten

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Natrium- und Kaliumsalzes von Verbindung 38 295 hergestellt werden. Andere leicht erhältliche Verbindungen sind die Kupfer-, Zink-, Ammonium-, Calcium-, Magnesium- und Lithiumsalze von Verbindung 38 295.

Wenn die Verbindung 38 295 zur Verhinderung und Behandlung von Coccidiose in Geflügel verwendet werden soll, kann die gesamte Permentationsbrühe, die die Verbindung 38 enthält, zur Trockene eingedampft werden (vorzugsweise durch Sprühtrocknung) und sodann in der für die gewünschte Stärke des Antibiotikums entsprechenden Menge einem Geflügelfutter zugesetzt werden.

Verbindung 38 295 hemmt das Wachstum verschiedener Mikroorganismen (vgl. Tabelle I). Eine Reihe von Versuchsröhrchen, die ein Nährmedium und verschiedene Konzentrationen der Verbindung 38 295 enthalten, wird mit dem jeweiligen Testorganismus beimpft, um die Mindestkonzentration an Antibiotikum in mcg/ml zu bestimmen, die das Wachstum des Organismus im Verlauf von 2k Stunden hemmt.

Tabelle I

Organismus Verbindung 38295 Verbindung 38295

(gemischtes Na/K- (freie Säure) Salz) ·

Staph. aureus 01A005 0,78 0,39

OIAO52 0,78 3,12

OIAIO9 0,78 0,78

01A110 0,39 1,56

01A400 0,39 1,56

Strep, faecalis 0,20 1,56

Strep, pyogenes < 0,10 < 0,10

Neisseria sicca < 0,10 < 0,10

Bacillus subtilis < 0,10 < 0,10

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Portsetzung Tabelle I

Organismus Verbindung 3829'5 Verbindung 38295

(gemischtes Na/K- (freie Säure)

Salz)

Lactobacillus casei var casei 1,56

Lactobacillus catenaforme 0,78

Clostridium innocuum 0,20 —

Clostridium bifermentans 0,78

Treponema hyodysenteriae 0,39

Verbindung 38 295 und ihre Salze weisen eine ausgezeichnete Wirksamkeit gegenüber Coccidiose-Infektionen in Geflügel auf. Wenn sie in Mengen von 15 bis 250 ppm dem Kükenfutter zugesetzt werden, sind diese Verbindungen wirksam zur Bekämpfung von Einzelinfektionen durch Eimeria tenella, E. acervulina, E. maxima usw. sowie gemischten Infektionen durch diese Organismen.

Wirksamkeitsdaten für Verbindung 38 295 und ihre Salze gegen Coccidiose-Infektionen in Küken werden auf folgende Weise erhalten: Gruppen von 3 bis 5 zehn Tage alten männlichen Küken von SPF weiße Leghorn wurden mit einem Breifutter gefüttert, das die Verbindung 38 295 oder eines ihrer Salze gleichmäßig darin verteilt enthielt. Nachdem sie etwa 24 Stunden lang diesem Futter ausgesetzt waren, wird jedes Küken per os mit Oocysten der besondern Art von Eimeria, die getestet wird, geimpft. Andere Gruppen von Küken, die mit einem Breifutter gefüttert werden, das kein Antibiotikum enthält, werden auf gleiche Weise infiziert, und dienen als infizierte Kontrollen. Nicht infizierte, nicht mit Medikament behandelte Küken dienen als normale

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Kontrollen. Die Ergebnisse der Behandlung werden im Fall von E. acervulina nach 5 Tagen und für alle anderen Arten von Eimeria nach 6 Tagen ausgewertet.

Die folgende Tabelle II erläutert die mit dem gemischten Natrium- und Kaliumsalz von Verbindung 38 295 erhaltenen Ergebnisse.

Tabelle II

Zur Infektion ver- Dosis

wendeter Organismus (ppm)

durchschn. Infektions grad

Verhältnis*

Eimeria tenella

Eimeria acervulina

Eimeria necatrix

Eimeria maxima

Eimeria brunetti

gemischte 'Infektion
(Cöccivac T), Sterwine
laboratories, Opelika,
Alabama)

250

125

60

30

15

250 125 60 45 30 15

250

125

60

250 125 60 45 30 15

250 125 60 45 30 15

250

125

60

50

40 0.0 0.0 0'.7

2[7

0,0 0,2 0,0 0,4 12 2,0

0.0 2 0,2

0,0 0.0 014 0^6 0,8 1,8

0,4 0.4 018

1,6 1,6

0,0, 0,0**

ο;2, ^Λ ' 0,2,

0,4 0^0

.6η 9aοrr ι ο /♦ ο 110, 0,6 1,2, 2,6, 2;0

0,0

0.0

0,21

0,54

0,86

0,0 0,1 0,0 0,2 0,6

¹⁰

0.0

0{l3

0,13

0,0

0.0

0,25

0.33

0,44

0,66

0.22 0.22 0,44 0,66 0,88 0

0,0, 0,08, 0.18 0^08, 0^0 0.38, θΐ21 Ol46, θ',35 0^85, 0.71

Die zur Bewertung der anticoccidialen V/irksamkeit angewendeten Kriterien bestehen aus Schädigungszahlen von 0 bis h für E. tenella (J.E. Lynch, Am. J. Vet. Res., Bd. 22, S. 324-326, 196I) und Schädigungszahlen von 0 bis 3 für die anderen Arten (J. Johnson und W.H. Reid, Exp. Parasit., Bd. 28, S. 30-36, 1970). Ein konstantes Verhältnis wird durch Division der Schädigungszahl jeder behandelten Gruppe durch die Schädigungszahl der infizierten Kontrolle erhalten.

Die erste Zahl betrifft Darmschädigungen und die zweite Zahl betrifft Zökumschädigungen.

Ähnliche Ergebnisse können mit der freien Säure, dem Natriumsalz, dem Kaliumsalz oder einem getrockneten Fermentationsmedium, das die Verbindung 38 295 in dem der gewünschten Stärke des Antibiotikums entsprechenden Verhältnis enthält, erhalten werden.

Die wachsturnsfördernden Eigenschaften von Verbindung 38 295 werden durch die folgenden Versuche mit Rindern erläutert.

Angus Färsenkälber werden wahllos auf Ställe verteilt, wobei jeweils 5 Kälber in einen Stall gebracht werden, und man verabreicht ihnen die Verbindung 38 295 oral auf beliebige Art (by volus), im Trinkwasser usw. Die Verbindung wird jedoch, bezogen auf die Wirksamkeit, vorteilhaft und schnell verabreicht, indem man sie in Mengen von 11 bis 33 ppm in Futtergemische einmischt, die einen hohe Gehalt an unverdaulichen Stoffen enthalten. Die Verbindung 38 295 kann in unterschiedlichen Formen, z.B. als freie Säure, Natriumsalz, Kaliumsalz, gemischtes Natrium- und Kaliumsalz oder als getrocknete Fermentationsbrühe, hergestellt aus Streptomyces hygroscopicus ATCC 3IO5O, eingesetzt werden.

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Futtergemische, die kein Medikament enthalten, und Futtergemische, die die Verbindung 38 295 enthalten, werden unbegrenzt an die Versuchstiere verfüttert. Das Futtergemisch ist ein Vollfutter für Rinder mit einem Proteingehalt von 12,5 % und einem Verhältnis von Konzentrat zu unverdaulichen Stoffen von 75:25, das Mais, Sojabohnenmehl, Luzernemehl (Medicago sativa), Calciumphosphat, Melassen, Vitamine und Spurenminerale enthält. Verbindung 38 295 ist zusammen mit gemahlenem Mais, den Mineralen und Vitaminen in einem Vorgemisch enthalten.

Grundfutter

(Rinder-Vollfutter mit einem Proteingehalt von 12,5 % und einem Verhältnis von Konzentrat zu unverdaulichen Stoffen von 75:25)

Bestandteil Prozent

gemahlener gelber Mais 55 >6

Sojabohnenmehl, 48 % Protein 6,3

Luzernemehl, 17 % Protein 25,0

getrocknete Melassen^x 10,0

Soj abohnenöl 2,0

Dicalciumphosphat (24 % Ca, l8,5 P) 0,40

XX

Spurenmineralsalze 0,50

VV V

Vitamin-Mineral-Vorgemisch 0,20

Zuckerrohrmelassen auf einer Maiskolbenfraktion als Träger: nicht weniger als 3 % rohes Protein, nicht mehr als 15 % Fasern, nicht weniger als 42 % Inertzucker, maximal 6 % Wasser.

Steuerte die folgenden Mengen an Spurenmineralien bei: Mangan 10 ppm; Eisen 6,25 ppm; Kupfer 1,25 ppm; Jod 0,025 ppm; Kobalt 0,86 ppm; Zink 45 ppm.

^xxxSteuerte die folgenden Mengen an Vitaminen pro kg Futter bei: Vitamin A 3297 I.E.; Vitamin D 441 I.E.; Vitamin E 55 I.E.

609808/ 1 0Λ0

Vorgemisch Bestandteil Menge (l,8l kg)

Vitamin A-Zusatz (30 000 IE/g) 99,8 g

Vitamin D -Zusatz (200 000 IE/g) 2,00 g

Vitamin-Zusatz (275 000 IE/kg) 181 g

Zinkoxid (79,4 % Zink) 38,0 g

Kobaltcarbonat (45 % Kobalt) 1,70 g

gemahlene Sojabohnen oder feingemahlener 1480 g Mais

Verbindung 38 295 40,0 g

0,454 kg Vorgemisch pro 907,2 kg des fertigen Putters ergeben einen endgültigen Gehalt an Verbindung 38 295 von 11 ppm.

Die folgende Tabelle III erläutert die Ergebnisse eines 28tägigen Versuches, die mit drei wiederholt eingesetzten Ställen von 5 Kälbern pro Stall erhalten wurden, wobei jedes Kalb anfänglich etwa I80 kg wog.

Tabelle III

(Gemischte Natrium- und Kaliumsalze von Verbindung 38 295)

DTG^X DTP^XX DTP/DTG^XXX

Behandlung (ppm) kg Index kg Index figjfais Index

Kontrolle 0,939 100,0 6,44 100,0 6,95 100,0

Verbindung 38 295 (11) 1,036 110,6 6,12 95,1 5,94 117,0

Verbindung 38 295 (33) 1,098 116,9 5,62 87,3 5,11 136,0

durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme durchschnittliche tägliche Futteraufnahme

kg Futteraufnahme pro kg Gewichtszunahme

Praktisch die gleichen Ergebnisse können mit der freien Säure, dem Natriumsalz, dem Kaliumsalz oder einer getrockneten Fermentationsbrühe, die die Verbindung 38 295 enthält, erhalten werden.

Vergleichbare Ergebnisse können mit anderen Wiederkäuern, wie z.B. Schafen, oder monogastrischen Tieren, wie z.B. Pferden, Schweinen und Kaninchen, erhalten werden.

Die wirksame Verbindung 38 295 kann in einem Tierfutter oder in einer Tränke oder in einem Vorgemisch, das zum Einmischen in ein Tierfutter oder in eine Tränke verwendet wird, verabreicht werden. Ein flüssiges konzentriertes Vorgemisch, das das Antibiotikum enthält, und als Zusatz zum Trinkwasser geeignet ist, um die Wirksamkeit des Tierfutters zu erhöhen, kann hergestellt werden, indem man die Verbindung 38 295 in einer gewünschten Konzentration in einem geeigneten Lösungsmittel, wie z.B. Äthanol oder Propylenglykol, löst.

Flüssiges konzentriertes Vorgemisch

Ein flüssiges konzentriertes Antibiotikum-Vorgemisch, das als Zusatz zum Trinkwasser für Tiere geeignet ist, kann hergestellt werden, indem man das die Verbindung 38 295 enthaltende Antibiotikum in einer gewünschten Konzentration in einem geeigneten Lösungsmittel, wie z.B. Äthanol oder Propylenglykol, löst.

Beispiel 1

Es wurde ein steriles wäßriges Medium mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

60-9808/10AO

λ*

Glucose 10,0

lösliche Stärke 20,0

Hefeextrakt 5,0 enzymatisches Abbauprodukt von Casein 5,0

Fleischmehl 5,0

CaCO, · 1,0

pH - 7,0

Zellen aus einer Schrägkultur von Streptomyces hygrocopicus ATCC 31050 wurden auf eine Reihe von 300 ml-Kolben übertragen, die jeweils 50 ml des vorstehenden sterilen Mediums enthielten, und diese Kolben wurden sodann 3 bis 4 Tage bei 28 bis 30⁰C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung geschüttelt. Anteile von jeweils 5 ml des so gezüchteten Impfmediums wurden aseptisch auf 300 ml-Kolben übertragen, die jeweils 100 ml des vorstehend beschriebenen sterilen Mediums enthielten. Nach 3 bis Hägigem Schütteln bei bis 30°C wurde das gezüchtete Impfmedium auf Fermentationsgefäße mit einem Fassungsvermögen von H 1 übertragen, die jeweils 2 1 des folgenden sterilen Mediums enthielten:

g/l

Glucose 10,0

Maisstärke 10,0

Sojamehl 10,0

Korntrester 5,0

NaCl 5,0

CaCO 1,0

pH - 6,6

Die Fermentation wurde unter Rühren bei 1700 UpM, einer Belüftungsgeschwindigkeit von etwa 1 Vol. Luft pro Volumen Fermentationsbrühe pro Minute und bei 28 bis 36⁰C 90 bis

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120 Stunden lang durchgeführt. Große Fermentationsgefäße, die etwa 300 bis ²JO 000 1 Fermentationsmedium enthalten, können mit etwa 2 % dieses Wachstums beimpft werden. Die Fermentation wird durchgeführt, bis ein Gehalt an Antibiotikum von mindestens 50 mg/1 erreicht ist, was etwa 90 bis 120 Stunden erfordern kann.

Einhundert Liter der vollständigen, nicht filtrierten Fermentationsbrühe wurden 2 mal mit einem Fünftel Volumen an Methylisobutylketon extrahiert. Der abgetrennte Lösungsmittelextrakt wurde im Vakuum zu einem öligen Rückstand konzentriert, der 769 g wog. Dieser Rückstand wurde auf Silikagel dispegiert, indem man ihn in 2 1 Chloroform löste und diese Lösung auf 1 kg Silikagel PFpj-h gab. Anschliessend wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der erhaltene Rückstand wurde in 2 1 eines Gemisches aus Chloroform und Hexan im Verhältnis 1:1 aufgeschlämmt und zu einer Schicht aus 300 g Silikagel 60 gegeben, die mit einer Schicht aus 300 g Silikagel PF₂₅^ bedeckt war. Das Silikagel wurde dann nacheinander mit 7,6 1 Hexan, 7.6 1 eines Gemisches aus Chloroform und Hexan im Verhältnis 1:1 und 7,6 1 Chloroform.gewaschen. Das Antibiotikum wurde mit 3,8 Äthylacetat eluiert. Das Äthylacetat wurde im Vakuum entfernt, und die erhaltenen 38 g Rückstand wurden in 400 ml Aceton gelöst. Die Acetonlösung wurde etwa 45 Minuten lang bei Raumtemperatur mit etwa 40 g aktivierter Holzkohle (Darco G 60) gerührt. Anschließend wurde filtriert und auf ein Volumen von etwa 200 ml konzentriert und sodann mit 100 ml Wasser verdünnt. Bei Einstellung des pH-Wertes mit 1,0 η NaOH auf 8,5 trennte sich die Verbindung 38 295 als gemischtes Natrium- und Kaliumsalz ab. Es wurden 13,8 g kristallines Material erhalten, die in Äthylacetat gelöst und über einer Säule von Silikagel P?254 ^^{n Hexan} chromato-

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graphiert wurden. Die Säule wurde unter 5,6 kg/cm mit Hexan entwickelt, das steigende Mengen an Äthylacetat enthielt. Der Fortschritt der Abtrennung wurde durch Dünnschichtchromatographie verfolgt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und im Vakuum eingedampft, und die reine Verbindung wurde aus einem Gemisch aus Aceton und Wasser kristallisiert.

Das reine, kristalline gemischte Natrium- und Kaliumsalz der Verbindung 38 295 hatte einen Schmelzpunkt von 200⁰C und eine optische Drehung l&J -> - + 36 bei einer Konzentration von 1 % in Methanol. Nach Trocknen im Vakuum über Nacht bei 70⁰C über Phosphorpentoxid wurden bei der Analyse durchschnittliche Werte für Kohlenstoff von 60,58 % und für Wasserstoff von 8,56 % erhalten.

Die Verbindung war löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Chloroform, Methylenchlorid, Diäthylather, Äthylacetat und Methylisobutylketon; teilweise löslich in Hexan und unlöslich in Wasser.

Das gemischte Natrium- und Kaliumsalz der Verbindung 38 295 besaß kein charakteristisches UV-Spektrum.

Das IR-Spektrum des gemischten Natrium-/Kaliumsalzes ist in Fig. 1 der Zeichnungen dargestellt. Ein KBr-Kügelchen zeigt charakteristische Absorptionen im Infrarotbereich bei den folgenden Wellenlängen in um: 2,92, 3,40, 6,27, 6,85, 7,22, 8,40, 9,00, 9,15, 9,25, 9,^8, 9,98, 10,45, 10,68 und 11,45.

Beispiel 2

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde unter Verwendung einer

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geklärten Fermentationsbrühe anstelle der gesamten, nicht filtrierten Fermentationsbrühe wiederholt.

Beispiel 3

Das von der geklärten Fermentationsbrühe gemäß Beispiel 2 abgetrennte Mycel wurde mehrmals mit Methanol aufgeschlämmt, der Methanolextrakt wurde im Vakuum konzentriert und der Rückstand wurde nach der Arbeitsweise von Beispiel 1 behandelt.

Beispiel 4

Das Fermentationsverfahren von Beispiel 1 wurde unter Verwendung eines Fermentationsmediums mit der folgenden Zusammensetzung wiederholt:

g/l

Glucose 20,0

Maisstärke 10,0

Sojamehl 10,0

Korntrester 5»0

Fe₂(SO₁P₃ 0,2

MnCl₂ 0,2

CaCO, 1,0

NaCl . 5,0

Methyloleat 2,0

Sojabohnenöl 2,0

pH 6,6 - 6,7

Nach Beendigung des Fermentationszyklus wurde die gesamte nichtfiltrierte Fermentationsbrühe mittels Sprühtrocknung zur Trockne eingedampft.

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Beispiel 5

Das gemischte Natrium-/Kalium-Salz von Verbindung 38 295 wurde in Äthylacetat gelöst, und der pH-Wert wurde mit verdünnter Phosphorsäure auf 4,5 eingestellt. Die Lösungsmittelschicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft, und der erhaltene Rückstand wurde aus einem Gemisch aus Chloroform und Hexan kristallisiert, wobei die kristalline Säure mit einem Schmelzpunkt von 135 bis 138°C und einer optischen Drehung Γ<Χ>7$⁵ = +38° bei einer Konzentration von 1 % in Methanol erhalten wurde. Nach Trocknen über Nacht im Vakuum bei 70⁰C über Phosphorpentoxid ergab die Analyse eine durchschnittliche Zusammensetzung von 61,65 Gew.-% Kohlenstoff, 8,94 Gew.-% Wasserstoff und 29,41 Gew.-% Sauerstoff (als Differenz). Die freie Säure der Verbindung 38 295 besaß kein charakteristisches UV-Spektrum.

Das IR-Spektrum der freien Säure von Verbindung 38 295 ist in Fig. 2 der Zeichnungen dargestellt. Ein KBr-Kügelchen zeigte charakteristische Absorptionen im Infrarotbereich bei den folgenden Wellenlängen in um: 2,92, 3,43, 5,74, 6,85, 7,25, 7,53, 8,28, 8,60, 8,80, 9,00, 9,15, 9,80, 10,10, 10,45, 10,68, 10,92 und 11,13.

Eine Röntgenkristallanalyse des Silbersalzes von Verbindung 38 295 ergab für diese Verbindung die folgende Strukturformel :

CH₃

HO₂C-" 1 ,c

CH₃ OCH₃

CH

-CH-

H^CO CH-

_ op —

2b34342

Beispiel, 6

Das Natriumsalz der Verbindung 38 295 wurde erhalten, indem man eine Äthylacetat-Lösung der freien Säure von Beispiel 5 bis zu einem pH-Wert von 8,5 mit 1,0 η NaOH versetzte. Das aus einem Gemisch aus Aceton und Wasser auskristallisierte Produkt hatte einen Schmelzpunkt von 197 bis 198°C und eine optische Drehung [QtJ-? - +38° bei einer Konzentration von 1,03 % in Methanol. Nach Trocknen im Vakuum Ober Nacht bei 70⁰C über Phosphorpentoxid ergab die Analyse des Natriumsalzes einen Kohlenstoffgehalt von 60,28 % und einen Wasserstoff gehalt von 8,76 %.

Das IR-Spektrum des Natriumsalzes von Verbindung 38 295 ist in Fig. 3 der Zeichnungen dargestellt. Ein KBr-Kügelchen zeigte charakteristische Absorptionen im Infrarotbereich bei den folgenden Wellenlängen in Mm: 2,9¹I, 3,¹IO, 6,25, 6,85, 7,20, 7,^5, 8,38, 9,00, 9,27, 9,48, 10,00, 10,45, 10,65, 10,90, 11,13.und 11,47.

Beispiel 7

Das Kaliumsalz der Verbindung 38 295 wurde nach der Arbeitsweise von Beispiel 6, jedoch unter Verwendung von Kaliumhydroxid anstelle von Natriumhydroxid, hergestellt. Das aus einem Gemisch aus Aceton und Wasser auskristallisierte Produkt hatte einen Schmelzpunkt von I96 bis 198⁰C und eine optische Drehung fcCjJ^ = +38° bei einer Konzentration von 1,02 % in Methanol. Nach Trocknen im Vakuum über Nacht bei 70⁰C über Phosphorpentoxid ergab die Analyse der Verbindung einen Kohlenstoffgehalt von 60,58 % und einen Wasserstoffgehalt von 8,70 %.

Das IR-Spektrum des Kaliumsalzes von Verbindung 38 295 ist in Fig. 4 der Zeichnungen dargestellt. Ein KBr-Kügelchen

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zeigte charakteristische Absorptionen im Infrarotbereich bei den folgenden Wellenlängen in um: 2,9¹I, 3,42, 6,27, 6,84, 7,20, 8,75, 9,00, 9,14, 9,30, 9,45, 10,45, 10,92, 11,15 und 11,47.

Beispiel 8

Das Silbersalz von Verbindung 38 295 wurde hergestellt, indem man eine äthanolische Lösung des gemischten Natrium-/ Kaliumsalzes von Beispiel 1 mit einer wäßrigen Silbernitratlösung versetzte. Der sich abtrennende Peststoff wurde aus Methanol umkristallisiert. Er hatte einen Schmelzpunkt von 198 bis 200⁰C und eine optische Drehung focJ^⁵ - +27° bei einer Konzentration von 0,982 % in Methanol. Die durchschnittliche Zusammensetzung einer Probe, die über Nacht im Vakuum bei 70 C über Phosphorpentoxid getrocknet worden war, betrug 55,95 % Kohlenstoff und 7,89 % Wasserstoff. Das Molekulargewicht des kristallinen Silbersalzes von Verbindung 38 295, bestimmt aus Daten der Röntgenanalyse, betrug 1060 - 4 Atommassen-Einheiten.

0 9 8 0 8 / 1 Π k Π

Claims (1)

1. Patentansprüche

   Als Verbindung 38 295 bezeichnetes Antibiotikum mit der Formel:

   CH-

   OCH.

   HOoC

   und dessen kationische Salze.

   2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um das Natriumsalz, das Kaliumsalz oder um das gemischte Natrium- und Kaliumsalz handelt.

   3. Verfahren zur Herstellung des als Verbindung 38 295 bezeichneten Antibiotikums nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus ATCC 31050 bei einer Temperatur von 28 bis 36⁰C unter submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kulturmedium züchtet, das eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält.

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   ί». Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das als Verbindung 38 295 bezeichnete Antibiotikum aus der Fermentationsbrühe durch Extraktion der Brühe mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel ohne Einstellung des pH-Wertes extrahiert und anschließend durch Säulenchromatographie des konzentrierten Lösungsmittelextraktes mittels Silikagel isoliert.

   5. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß man die das Antibiotikum enthaltende gesamte Fermentationsbrühe ohne Einstellung des pH-Wertes zur Trockene eindampft ιό. Mittel zur Wachstumsförderung und therapeutischen Behandlung von Tieren, insbesondere zur Bekämpfung der Geflügelcoccidiose, dadurch gekennzeichnet, daß es als wirksamen Bestandteil die Verbindung 38 295 gemäß Anspruch 1 sowie einen verträglichen Träger, einschließlich eines Tierfutters, einer Tränke oder eines Vorgemisches, enthält.

   7. Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es als Verbindung 38 295 deren Natriumsalz, Kaliumsalz oder deren gemischtes Natrium- und Kaliumsalz enthält.

   8. Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es

   die Verbindung 38 295 in Form der getrockneten Fermentationsbrühe gemäß Anspruch 5 enthält.

   9. Verfahren zur Verbesserung der Futterverwertung von Wiederkäuern und monogastrischen Tieren, insbesondere von Rindern, Schafen, Schweinen, Kaninchen oder Pferden, dadurch gekennzeichnet, daß man den Tieren die Verbindung nach Anspruch 1 in einer Menge von 11 bis 33 ppm verabreicht.

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   10. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß man den Tieren die Verbindung 38 295 in Form des Natriumsalzes, des Kaliumsalzes oder des gemischten Natrium- und Kaliumsalzes verabreicht.

   11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man den Tieren die Verbindung 38 295 in Form der getrockneten Fermentationsbrühe gemäß Anspruch 5 verabreicht.

   Für: Pfizer Inc.

   Mew York, Ij₇If/., V.St.A

   Dr.H.J.Wolff Rechtsanwalt

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