AT341081B - Verfahren zur herstellung von neuen antibiotika oder eines synergistischen antibiotischen gemisches derselben - Google Patents

Description

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   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Antibiotika oder eines synergistischen Gemisches von Antibiotika derselben. 



   Das Synergismus-Phänomen wurde in der Antibiotika betreffenden Literatur ausführlich erörtert :
The Journal of Antibiotics 25, Nr. 6,371   (1972) ;  
J. Chem. Soc, 19C, 1653   (1966) ;  
Bull. Soc. Chim. Belg. 68,716   (1959) ;     J. Amer. Chem. Soc.   82,4414 (1960) ;
Tetrahedron Letters 2687   (1971) ;  
J. Antibiotics, Ser. A 14,14   (1961) ;  
Nature 187,598 (1960) :
J. Chem. Soc. 2286   (1960) ;  
Antimicrobial Agent & Chemotherapy 360 bis 365 (1964) ;
Tetrahedron Letters 4231 bis 4238   (1966) ;  
Organic Mass Spectrometry 6,151 bis 166   (1972) ;  
Tetrahedron Letters 369 bis 372 (1966) und
J. Chem. Soc. 19C, 1669 bis 1676 (1966). 



   Die neuen   synergistischen Gemische der erfindungsgemäss herstellbarenAntibiotika   schliessen sich an die Familie von andern erörterten synergistischen Gemischen   an : Mikamycin,   Pristinamycin, Ostreogrycin, Streptogramin, P. A. 114, Vernamycin und Virginiamycin. 



   Die Erfindung betrifft demnach ein Verfahren zur Herstellung von neuen Antibiotika oder eines synergistischen antibiotischen Gemisches derselben, enthaltend die Verbindungen 35. 763, 36.926, 37. 277 und 37. 932 und verschiedene antibiotischen Nebenkomponenten, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man   Actinoplanes   anranticolor ATCC 31011 in einem wässerigen Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoff-und Stickstoffquelle enthält, unter submersen aeroben Bedingungen züchtet, bis eine wesentliche antibiotische Wirksamkeit erhalten wird, und eine oder mehrere der Verbindungen 35. 763, 36. 926, 37. 277 und 37. 932 oder ein Gemisch aller dieser Verbindungen aus demselben abtrennt. 



   Dieses Gemisch, das makrozyklische Lactone und Depsipeptide enthält, kann aus der Fermentations- 
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 durch Lösungsmittelextraktion,biotische Wirksamkeit auf, Das rohe antibiotische Gemisch oder Kombinationen eines reinen makrozyklischen Lactons und eines reinen Depsipeptides, die aus dem rohen Gemisch erhalten wurden, zeigen markante synergistische antibiotische Wirksamkeit. Das rohe antibiotische Gemisch, die reinen einzelnen antibiotischen Komponentenund die Gemische von reinen makrozyklischen Lactonen und Depsipeptiden sind wirksame Förderer des Wachstums von Küken und Schweinen und therapeutische Wirkstoffe bei der Bekämpfung von Schweine-Dysenterie. 



   Der Mikroorganismus, der für die Herstellung der neuen Antibiotika nützlich ist, wurde aus einer Erdprobe in Ägypten isoliert. Der Mikroorganismus wurde an   Kartoffel-Mohrrüben-Agar   gezüchtet und es wurde gefunden, dass er zur Ordnung der Actinomycetales gehört, die Sporangien produzieren, die ähnlich denen der GattungActinoplanes sind. Der Mikroorganismus wurde daher an einer Anzahl von Medien, die für das Studium dieser Gattung verwendet werden, gezüchtet. Suspensionen der Kultur wurden hergestellt, indem man   Stücke der Kultur, die ausAgar-Schrägkulturen abgeleitet wurden, in kleinenKolben, die jeweils etwa 0, 2   ml steriles destilliertes Wasser enthielten, zerkleinerte, die Inhalte nachspülte und mit weiterem sterilen Wasser zur Herstellung eines Volumen von etwa 5 ml für die Kultur vereinigte.

   Diese Suspensionen wurden zum Anlegen der Kultur in Rohren, Schrägkulturen oder Petrischalen der verschiedenen Medien verwendet. Die Inkubationstemperatur betrug 28 C, ausgenommen dort, wo andere Temperaturen angegeben wurden. Die Resultate wurden in Intervallen bis zu22 Tagen für einige Tests bestimmt, aber die meisten Resultate wurden   nach 14 Tagen bestimmt. Die Farben der Kultur waren jene von Maerz und Paul Dictionary of Colors,   2. Auflage, 1950, ebenso wie die individuellen beschreibenden Ausdrücke. Diese neue Kultur (Pfizer F. D. 24090) wurden am 11. März 1974 der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, übergeben und erhielt die Bezeichnung Actinoplanes auranticolor ATCC 31011. 



   Die Identifikationsmedien, die zur Charakterisierung der Kultur verwendet wurden, sind folgende :
1. 2% Leitungswasser-Agar 
 EMI1.2 
 



  4. Glucose-Asparagin-Agar. Waksman, wie vorstehend, Medium Nr. 2, Seite 328. 



  5. Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar. Antibiotics Ann. 1956/1957, Seiten 947 bis 953. 



  6. Hickey und Tresner Agar. J.   Bact,   64,891 bis 892 (1952). 



    7.   Kartoffeln-Glucose-Agar, Schälen, Zerschneiden und Dämpfen von 100 g Kartoffeln in 500 ml Was- 

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 ser, Filtrieren durch weitmaschige Gaze, Zusatz von 10 g Glucose, 20 g Agar und ausreichend Was- ser zur Auffüllung auf 1 1. 



   8. Stärke-Agar. J. Bact. 73,15 bis 27 (1957). 



   9. Gelatine, J. Bact. 73,15 bis 27   (1957).   



  10. Tyrosin-Agar, J. Baet. 69,147 bis 150 (1955). 
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   Medium Nr. 1 mit   3,     0 g Glucose   anstelle von Saccharose und ohne Agar. 



   14. Oganische Nitrat-Brühe, J.   Bact.,   73,15 bis 27 (1957). 



   15. ATCC Medium 172, American Type Culture Catalogue, 10. Ausgabe. Seite 235 (1972). 



   16. Kohlenstoff-Verwertung, J.   Bact.,   56,107 bis 114 (1948). 



   Die neue Kultur kann folgendermassen beschrieben werden :
Leitungswasser-Agar : Wachstum schlecht, dünn, flach, nahe 9D2 (sehr blass pinkfarben), kein Luftmycel, Substrat-Mycel farblos bis 9D2 ; kein lösliches Pigment. 



     C zapek-Saccarose-Agar : Wachstum mässigbis   gut, flach (flat), nahe 9G6 (blass orange) ; kein   Luftmycel, Sub-   strat-Mycel nahe 9G6 ; kein lösliches Pigment. 



   Glucose-Asparagin-Agar : Wachstum mässig, steigend (raised), gerauht, nahe 9L9 (hell-orange) ; kein Luftmycel, kein lösliches Pigment. 



   Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar : kein Wachstum. 
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 :Kartoffel-Glucose-Agar : Wachstum mässig, steigend, gerauht, nahe 9L9 (hell orange), kein Luftmycel, Substrat-Mycel nahe 9L9, lösliches Pigment. 



   Tyrosin-Agar : Wachstum schwach bis mässig, flach, nahe 13A10 (matt rötlich-orange), kein Luftmycel, Substrat-Mycel nahe 10D11, braun lösliches Pigment. 



   Gelatine : Wachstum mässig, flach, nahe 9K12 (rötlich orange), Spuren von weisslicher Blume, SubstratMycel nahe 9K12, kein lösliches Pigment. 



   Stärke-Agar : Wachstum mässig bis gut, steigend, nahe 9K10 (orange), geringfügig weissliche Blume, Sub-   strat-Mycel   nahe 9K10, blassgelb lösliches Pigment. 



   Stärke wurde schwach hydrolysiert, Gelatineverflüssigung war stark, Nitrate wurden selbst in 22 Tagen in keinem Nitratmedium zu Nitriten reduziert (das Wachstum war sehr schwach in Dextrosenitrat-Brühe, aber gut in organischer   Nitrat-Brühe), H   S wurde schwach produziert, in Pepton-Eisen-Agar lag kein lösliches Pigment vor, selbst in 22 Tagen trat keine Coagulation oder Hydrolyse von Milch auf, Tyrosin wurde nicht verdaut, das Wachstum an ATCC-Medium 172 fand bei 21 bis   370C     statt, wobeidasbeste Wachstumbei   28   und 370C erhalten wurde, es trat bei 450C kein Wachstum auf.   Arabinose, Fruktose, Glucose, Mannit, Raffinose, Rhamnose, Saccharose und xylose wurden verwendet; Inosit wurde nicht verwendet.

   An keinem Medium trat Geruch auf. 
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 zahlreich, irregulär in der Form und setzten durch graduelles Erweichen Sporen frei. Sporangien aus Kartoffel- Mohrrüben-Agar setzten nach 3 wöchiger Inkubation in wenigen Stunden bei etwa 210C Sporen frei, wenn Stücke der Kultur in eine kleine Menge einer Lösung von 1 g Glucose und 1 ml Tween 80 in 1   l   Wasser (eine 
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 wurden. Die Sporen waren in den Sporangien in Ketten von irregulärer Form, wenn sie jedoch freigesetzt wurden, waren sie fast kugelförmig (subglobose) und   l, 6 Mikron   gross bis klar elliptisch, 1, 6 bis 2, 2 x 1, 1 bis 1, 6 Mikron. Fast alle waren   bewegungsfähig,  
Eine Probeidentifikation führte zu einem Vergleich dieser Kultur mit A. auranticolor ATCC 15330.

   Der neue Stamm A. auranticolor ATCC 31011 und A. auranticolor ATCC 15330 zeigtenimwesentlichen an   Benett IS-     Agar, Nähragar,   Hefeextrakt-Agar, Glucoseasparagin-Agar, Glycerin-Asparagin-Agar, Caleiummalat-Agar und Tyrosin-Agar gleiche morphologische Merkmale, Farbe und lösliches Pigment. 



   Keine Kultur reduzierte Nitrat zu Nitrit, beide produzierten schwach   Ei   S und versagten bei der Produktion   von Melanin anPepton-Eisen-Agar.   Beide   hydrolysierten Stärke.   A. auranticolor ATCC 15330 bewirkte keine Änderung in Magermilch-Rohren, während die neue Kultur in 3 der 6 Rohre eine Klärung der Milch bewirkte und nach 21 Tagen ein gelb bis cremefarbenes lösliches Pigment produzierte. 



   A. auranticolor ATCC 31011 verwendete Glucose, Arabinose, Fruktose, Mannit, Raffinose, Rhamnose, Saccharose und Xylose. A. auranticolor ATCC 15330 verwendete alle diese Zucker mit Ausnahme von Raffinose. Sporangien und Sporen der beiden Kulturen waren ähnlich, wobei die Sporen von A. auranticolor ATCC 15330 stabförmiger waren. 

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   Am wichtigsten ist, dass A. auranticolor ATCC 15330 keine antibiotische Wirksamkeit unter den Fer-   mentationsbedingungenproduzierte. nwelchenA. auranticolor ATCC 31011 das Gemisch der Antibiotika   produzierte. 



   Die Züchtung von A. auranticolor ATCC 31011 findet vorzugsweise in wässerigen Nährmedien bei einer Temperatur von 28 bis   360C   und unter submersen aeroben Bedingungen unter Rühren statt. Nährmedien, welche für solche Zwecke nützlich sind, umfassen eine Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff, wie Zucker, Stärke und Melasse, eine Quelle von organischen Stickstoff, wie Casein, enzymatischer Extrakt von Casein (enzymatic digest of   casein),   Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Erdnussmehl und Weizengluten. Eine Quelle von Wachstumssubstanzen wie Brandweintrester, Fischmehl und Hefeextrakt ebenso wie Salze, wie   Natriumchlorid und Calciumcarbonat und Spurenmineralien, wie Eisen, Magnesium,   Zink, Kobalt und Mangan können ebenfalls mit vorteilhaften Ergebnissen verwendet werden.

   Wenn während der Fermentation übermässiges Schäumen auftritt, können Antischaummittel, wie pflanzliche Öle oder Silikone dem Fermentationsmedium zugesetzt werden. Die Belüftung des Mediums in Tanks für submerses Wachstum wird vorzugsweise in einem Ausmass von etwa 0, 5 bis 2 Volumina freie Luft pro Volumen Brühe pro Minute aufrecht erhalten. 



  Das Rühren wird mittels   Rührer, die im allgemeinen in der   Fermentationsindustrie   gebräuohlichsind. durohge-   führt. Während des Transfers des Organismus und während dessen Züchtung   müssen natürlich   aseptische Bedingungen aufrecht erhalten werden. 



   Das Inokulum für die Herstellung des antibiotischen Gemisches kann durch Verwendung der Züchtung aus einer   Schrägkultur   auf einem Medium wie ATCC-Medium 172, welches vorstehend erläutert wurde, hergestellt werden. Die Kultur kann zur Inokulierung entweder von Schüttelflaschen oder Inokulum-Tanks verwendet werden oder alternativ können die   Inokulum-Tanks   aus den   Schüttel-Flaschen geimpft,   werden. In Schüttel-Flaschenwird das Wachstum sein Maximum im allgemeinen in   etwa 4   Tagen erreichthaben, während des Inokulum in   submersenInokulum-Tanks gewohnlich am gunstigsten in 2   bis 3 Tagen sein wird. Wesentliche antibiotische Wirksamkeit wird in der   End-Fermentor-Stufe   in etwa 20 bis 30 h erzielt. 



   Das Verfahren zur Herstellung der Antibiotika wird während der Fermentation geeigneterweise durch biologische Prüfung der Brühe unter Anwendung eines empfindlichen Stammes von Staphylococcus aureus verfolgt. Es wird   eine Standard-Platten-Untersuchungstechnik   angewandt, in welcher die Zone der Inhibierung, die eine Filterpapierscheibe, die mit der Brühe gesättigt ist, umgibt, als Mass für die antibiotische Wirksamkeit verwendet wird. Nachdem die Fermentationsbrühe einen gewünschten Grad an antibiotischer Wirksamkeit erreicht hat, werden die Produkte aus entweder der gesamten Brühe oder der filtrierten Brühe isoliert. Im letzteren Fall wird das Mycel durch Filtration oder Zentrifugation entfernt. Verschiedene Arten von Vorrichtungen, wie Filterpressen, Zentrifugen usw. können angewandt werden. 



   Dünnschichtchromatographie, die Silikagel anwendet, ist ein nützliches Mittel zur Analysierung des antibiotischen Gemisches, das im Fermentationsmedium produziert wurde und des Gemisches aus rohen und gereinigten Materialien, die aus Fermentationsbrühen extrahiert wurden. Die Zerlegung der Komponenten des antibiotischen Gemisches ist wesentlich abhängig von der antibiotischen Belastung des Systems. Bei zu   ge-   ringer antibiotischer Wirksamkeit werden kleinere antibiotische Komponenten nicht sichtbar, zu starke antibiotische Wirksamkeit führt zu einem Schlepp-Effekt mit resultierender schlechter Auflösung. 



   Das Entwicklungssystem für die Dünnschichtchromatographie ist Chloroform-Äthanol (9 : 1). Die Dünnschichtchromatogramme können nach Entwicklung unter   UV-Licht   bei 254 und 366 mg beobachtet werden. 



    Bioautographischer Nachweis   der antibiotischen Komponenten kann mittels einer Auflage einer dünnen Schicht Nähragar, der mit einem empfindlichen Stamm von Staphylococcus aureus oder anderen empfindlichen Organismen geimpft ist, erreicht werden,
Die   primären Komponenten   in dem antibiotischen Gemisch, das durch A. auranticolor ATCC 31011 pro- 
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 usw. Unter den in den nachstehenden Beispielen zusammengestellten Bedingungen sind die hauptsächlichen antibiotischen Komponenten in dem antibiotischen Gemisch Verbindungen 37. 277 (Depsipeptid) und 36. 926 makrozyklisches Lacton), während die kleineren antibiotischen Komponenten Verbindungen 37. 932 (Depsipeptid) und 35. 763 (makrozyklisches Lacton) sind. 



   Die Komponenten des antibiotischen Gemisches können durch eine Anzahl von verschiedenen Verfahren, einschliesslich   Losungsmittelextraktion, Graig-Gegenstromverteilung, Säulenohromatographie oder   Kombinationen derselben aus der Fermentationsbrühe abgetrennt und gewonnen werden. Verschiedene organische Lösungsmittel, wie Chloroform, Äthylacetat und Methylisobutylketon sind bei der Extraktion der Antibiotika aus der Brühe nützlich. Lösungsmittelextraktion wird vorzugsweise durch zweimaliges Extrahieren der Brühe bei etwa PH 7 mit einem Volumen an Lösungsmittel, das etwa gleich bis etwa 1/3 bis 1/2 des Volumens der Brühe, aus welcher das antibiotische Gemisch gewonnen werden soll, ist, durchgeführt.

   Abhängig von den Volumina der Brühe sind verschiedene Arten von Vorrichtungen, wie Scheidetrichter,   RUhr tanks   und mechanische Extraktionsvorrichtungen, wie Zentrifugen zu Extraktionszwecken nützlich. 

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   Das bevorzugte Verfahren zur Abtrennung und Gewinnung der Komponenten des antibiotischen Gemisches wird wie folgt durchgeführt : entweder die ganze oder die geklärte Brühe wird auf etwa PH 7 eingestellt und zweimal mit etwa 1/3 bis 1/2 Volumen an Methylisobutylketon extrahiert. Der Lösungsmittelextrakt wird unter Vakuum konzentriert und das Konzentrat wird durch Extraktion mit Heptan oder Petroläther entfettet, Das entfettete Lösungsmittelkonzentrat wird anschliessend unter Vakuum zur Trockne eingeengt, Die Feststoffe werden der Craig-Gegenstromverteilung (6 Stufen oder Platten) unter Verwendung von 5 Teilen Toluol,   2 Teilen Äthanol, 3 Teilen wässerigem Phosphatpuffer, PH 4, 5, unterworfen.

   Die abgetrennten Schichten   liefern die oberen und unteren Phasen des   Gegenstrom-Verteilungs-Systems.   Nach Verteilung wurden die Schichten durch Dünnschichtchromatographie beobachtet. Die abgetrennten Fraktionen wurden unter Vakuum getrocknet. 



   Die Feststoffe, die die Depsipeptide enthielten, wurden in Chloroform gelöst, mit Aktivkohle behandelt, filtriert und im Vakuum eingedampft. Der nach Abdampfen des Chloroforms erhaltene Rückstand wurde in Aceton gelöst. Die durch Zusatz von Heptan ausgefallenen Feststoffe wurden in einer kleinen Menge Chloroform gelöst und auf eine Säule von auf   PH 6 gepuffertem   Silikagel, hergestellt in Chloroform : n-Propanol (99 : 1%, V/V), aufgebracht. Die Säule wurde mit dem gleichen Lösungsmittelsystem unter einem Druck von
5,62   kg/cm2   entwickelt. Die aus der Säule entnommenen Fraktionen wurden durch   Dünnschichtchromatographie   beobachtet. Die Fraktionen, die abgetrennte Depsipeptide enthielten, wurden vereingt, im Vakuum eingedampft und aus Aceton-Heptan kristallisiert. 



     DieGegenstrom-Fraktionen,   die die makrozyklischen Lactone enthielten, wurden vereinigt, im Vakuum eingedampft und die Feststoffe wurden in Äthylacetat aufgenommen. Die Lösung wurde mit Silikagel gerührt, filtriert und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in Äthylacetat aufgenommen und mit Hexan ausgefällt. Die Feststoffe wurden in einer kleinen Menge Chloroform gelöst und unter einem Druck von 5,62   kg/cm2   an einer auf PH 6,0 gepufferten Silikagel-Säule, hergestellt in   Äthylacetat, chroma-     tographiert.   Das Entwicklungssystem war Äthylacetat-Tetrahydrofuran-Hexan   (80 : 20 :   20), das mit wässerigem Phosphatpuffer vom PH 6,0 gesättigt war.

   Die Fraktion der Säule wurden durch   Dünnschichtchro-   matographie   beobachtet. DieFraktionen, die   abgetrennte makrozyklische Lactone enthielten, wurden vereinigt und im Vakuum eingedampft. Die einzelnen Fraktionen wurden   getrennt durch Graig-Gegenstromverteilung   und/oder   Säulenchromatographie   unter Verwendung unterschiedlicher Entwicklungssysteme aufgearbeitet. 



    Sorgfältiges Beobachten bei jeder Reinigungsstufe lokalisiert die einzelnenmakrozyklischen Laotone, die aus-    reichend isoliert sind, so dass die Lösungsmittelfraktionen zur Erzielung reiner Verbindungen getrocknet werden können. 



   A. auranticolor ATCC 31011 produziert mindestens 4 Depsipeptide und mindestens 4   makrozyklisehe   Lactone. Die hauptsächlichen Komponenten sind jedoch die Depsipeptide Verbindungen 37. 277 (grösser) und 37.932 (geringer) und makrozyklische Lactone Verbindungen 36.926 (grösser) und 35.763 (geringer). 



   Rohe antibiotische Gemische, die direkt aus der Brühe erhalten wurden, und gereinigte einzelne Komponenten besitzen breite antibakterielle Spektren. Zu den Organismen, die sich in Gegenwart der Antibiotika nicht vermehren,   gehören Salmonella typhosa,   Shigella dysenterie, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, 
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 subtilis, Corynebacteriumdiphtheriae, Clostridium septicum, Brucella abortus, Neisseria sicca, Iactobacillus acidophilus und Pasteurella multocida. 



   Die neuen Antibiotika können entweder als rohes Gemisch oder in Form der gereinigten Einzelkomponenten oder Gemische derselben bei der Behandlung verschiedener Infektionen bei Mensch und Tier eingesetzt werden. 



   Die   neuen Antibiotika sind besonders als Wachstumsförderer bei Geflügel und Lebewesen   auf Grund ihrer breiten antibakteriellen Spektren und für die Behandlung von Schweinedysenterie auf Grund ihrer markanten Wirksamkeit gegenüber Treponema hyodysenteriae, einer anaeroben Spirochäte, der an dieser Krankheit beteiligt ist, interessant,   Beispiel l :

   Es   wurde ein steriles wässeriges Medium mit der folgenden Zusammensetzung bergestellt : 
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<tb> 
<tb> g/Liter
<tb> Glucose <SEP> 10,0
<tb> lösliche <SEP> Stärke <SEP> 20,0
<tb> Hefeextrakt <SEP> 5,0
<tb> Enzymatisches <SEP> Abbauprodukt <SEP> von <SEP> Casein <SEP> 5,0
<tb> CaCOs <SEP> 1, <SEP> 0
<tb> PH <SEP> 7, <SEP> 0
<tb> 
 

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Zellen einer Schrägkultur von A.

   auranticolor ATCC 31011 gezüchtet auf ATCC-Medium 172 wurden in eineReihe von 300 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben, die jeweils 50 ml dieses Mediums enthielten, gebracht und auf   einer Rotations-Schüttelvorrichtung   3 bis 4 Tage bei 28 bis   300C geschüttelt, Aliquote   Teile von 5 ml des gezüchteten Inokulums wurden in 300 ml fassende Erlenmeyer-Kolben, die jeweils 100 ml des vorstehend beschriebenen sterilen Mediums enthielten, transferiert.

   Nach 3 bis 4tägigem Schütteln bei 28 bis   300C   wurden 5 bis 10% (V/V) des   gezüchteten Inokulums in einen 4 Liter-Fermentor,   der 2   l   des folgenden sterilen Mediums enthielten, transferiert : 
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<tb> 
<tb> g/Liter
<tb> Hefeextrakt <SEP> 2,0
<tb> Glucose <SEP> 10,0
<tb> Maiswasser <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> enzymatisches <SEP> Abbauprodukt <SEP> von <SEP> Casein <SEP> 5,0
<tb> Kobaltchlorid <SEP> 0,002
<tb> PH <SEP> 7, <SEP> 0
<tb> 
 
 EMI5.2 
 
 EMI5.3 
 
<tb> 
<tb> PHKohlenstoff <SEP> 60,91
<tb> Wasserstoff <SEP> 5,98
<tb> Stickstoff <SEP> 10,45
<tb> Sauerstoff <SEP> (durch <SEP> Differenz) <SEP> 22,66
<tb> 
 Verbindung 37.277 ist optisch aktiv und weist eine Rotation von 
 EMI5.4 
 

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 EMI6.1 
 von   309, 3,   36,67, 45,01, 70 bzw. 20. 



   Das IR-Spektrum der Verbindung 37 277 ist aus Fig. 1 ersichtlich. Eine Chloroformlösung zeigt cha- 
 EMI6.2 
    im IR-Bereich5, 93, 6, 07, 6, 62, 6, 82   und   7, 67.   



   Die Gegenstrom-Fraktionen die die Verbindungen 35. 763 und 36. 926 enthielten wurden im Vakuum abgedampft, der Rückstand wurde in Äthylacetat aufgenommen und die Lösung wurde mit Silikagel gerührt. Die filtrierte Lösung wurde im Vakuum eingedampft, der Rückstand wurde in Äthylacetat aufgenommen und die Feststoffe wurden durch Zusatz von Hexan ausgefällt. Die ausgefällten Feststoffe wurden in einer kleinen Menge Chloroform gelöst und an einer Säule   von auf p-6, 0   gepuffertem Silikagel, hergestellt in Äthylacetat, chromatographiert.

   Die Säule wurde mit Äthylacetat : Tetrahydrofuran : Hexan (80 : 20 : 20), gesättigt mitwässerigem Phosphatpuffer, PH 6, 0, unter   einem Druck von 5, 62 kg/cm2 entwickelt.   Die   ersten 17- Säulen - Frak-   tionen, jeweils 20 ml, enthielten ein gelbes Öl, welches verworfen wurde. Fraktionen 26 bis 40 sind reich an Verbindung 3 6. 926. Fraktionen 41 bis 50 sind grösstenteils ein Gemisch von Verbindungen 36.926 und 35, 763. 



  Fraktionen 26 bis 40 wurden vereingt, im Vakuum konzentriert und erneut an Silikagel chromatographiert, wobei 20 ml Fraktionen aufgefangen wurden. Die ersten 15 Fraktionen enthielten ein gelbes Öl, welches verworfen wurde. Fraktionen 16 bis 30 waren hauptsächlisch Verbindung 36. 926. Fraktionen 31 bis 40 enthielten ein Gemisch von Verbindungen 36. 926 und 35. 763. Fraktionen 16 bis 30 wurden im Vakuum eingedampft, der Rückstand wurde in einer kleinen Menge Chloroform gelöst und auf eine Säule von auf PH 6, 0 gepuffertem Silikagel, hergestellt in Chloroform, gebracht, Die Säule wurde mit   Chloroform : Äthanol (95, 5 :   4,5%, V/V) unter einem Druck von   9, 14 kg/cm2 entwickelt   und 160 Fraktionen von 6 ml wurden aufgefangen. Die Fraktionen 60 bis 90 enthielten nur Verbindung 36. 926. Sie wurden vereinigt und im Vakuum eingedampft.

   Der Rückstand wurde in dem minimalen Volumen Äthanol gelöst und mit Äther ausgefällt, wobei die reine amorphe Verbindung 36. 926 erhalten wurde. 



   Verbindung 36. 926 ist löslich in Methanol, Äthanol, Chloroform und Methylenchlorid. Sie ist unlöslich in Diäthyläther, Hexan und Heptan. 



   Verbindung 36. 926 weist keinen bestimmten Schmelzpunkt auf. Die Zersetzung beginnt bei etwa 100 C. 



  Die Analyse ergibt die folgenden durchschnittlichen Anteile : 
 EMI6.3 
 
<tb> 
<tb> Kohlenstoff <SEP> 57,89
<tb> Wasserstoff <SEP> 6,78
<tb> Stickstoff <SEP> 8,04
<tb> Sauerstoff <SEP> (durch <SEP> Differenz) <SEP> 27,29
<tb> 
 
Das Molekulargewicht, bestimmt durch hochauflösendes Massenspektrum, beträgt 501 und die Summenformel ist   C2 6 H35N307,  
Verbindung   36,     926   ist optisch aktiv mit einer Rotation von 
 EMI6.4 
 
0..Das IR-Spektrum der Verbindung 36. 926 ist aus Fig. 2 ersichtlich. EinKBr- Pressling zeigt charakteristische Absorption im IR-Bereich bei den folgenden Wellenlängen (in Mikron): 2,95, 3, 40, 5,75, 5,98,   6, 23,   6,58, 6,87, 7,45, 8, 25, 8,38, 8,80, 9,08, 10,15, 10, 35, 11,10 und 13, 30. 



   Diese Verbindung ist ähnlich oder ununterscheidbar von demAntibiotikum A 2315 B, von dem auf der 14. 



  Interscience Conference on Antimicrobial Agent and Chemotherapy,11.bis 13.September 1974 berichtet wurde. 



   Verbindung 35. 763 wurde in fast der gleichen Weise wie Verbindung   36. 926   isoliert und gereingt. Die reine Verbindung ist löslich in Methanol, Äthanol, Chloroform und Methylenchlorid. Sie ist unlöslich in Di- äthyläther, Hexan und Heptan. Es liegt kein bestimmter Schmelzpunkt vor. Die Zersetzung beginnt bei etwa   1000C.   Die Analyse ergibt die folgenden durchschnittlichen Anteile : 
 EMI6.5 
 
<tb> 
<tb> Kohlenstoff <SEP> 61,29
<tb> Wasserstoff <SEP> 6,73
<tb> Stickstoff <SEP> 8,83
<tb> Sauerstoff <SEP> (durch <SEP> Differenz) <SEP> 23, <SEP> 15 <SEP> 
<tb> 
 

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Das Molekulargewicht, das durch hochauflösendes Massenspektrum bestimmt wurde, ist 503 und die Summenformel ist   CHgNgO.   



   Die Verbindung 35. 763 ist optisch aktiv mit einer Rotation von 
 EMI7.1 
 
Das IR-Spektrum der Verbindung 35. 763 ist aus Fig. 3 ersichtlich. Ein KBr-Pressling zeigt charakteristischeAbsorption imIR-Bereich bei den folgenden Wellenlängen (in Mikron): 2,95, 3,38, 5,73, 6,00, 6,23,   6, 60, 6, 88, 7, 23, 8, 25, 8, 38, 8, 83   und 10, 20. 
 EMI7.2 
 geengt, der Rückstand wurde mit Petroläther trituriert und an einer Silikagelsäule wie vorstehend beschrieben chromatographiert. Die zugehörigen Fraktionen wurden vereinigt und aus Aceton : Heptan kristallisiert, wobei die Verbindung 37. 932 erhalten wurde. 



   Die Verbindung 37. 932 ist löslich in Methanol, Äthanol, Chloroform und Methylenchlorid. Sie ist unlöslich in Diäthyläther, Hexan, Heptan und Wasser. Die Verbindung weist keinen bestimmten Schmelzpunkt auf. Die Zersetzung beginnt bei etwa   185 C.   Die Elementaranalyse ergibt die folgenden durchschnittlichen Anteile : 
 EMI7.3 
 
<tb> 
<tb> Kohlenstoff <SEP> 59,41
<tb> Wasserstoff <SEP> 6,01
<tb> Stickstoff <SEP> 10,66
<tb> Sauerstoff <SEP> (durch <SEP> Differenz) <SEP> 23,92
<tb> 
 Verbindung   37. 932   ist optisch aktiv mit einer Rotation von 
 EMI7.4 
 ristische Absorption im IR-Bereich bei folgenden Wellenlängen (in Mikron)   : 2, 96, 3, 05, 3, 38, 5, 68, 5, 73,   5,93, 5,98,6,13,6,50,6,58,6,88,7,40,7,65,8,08,8,45,8,60,9,03,9,45,9,70,9,98,10,55,11,00,   11, 25, 11, 60, 12, 35   und 13, 25. 



   Beispiel 2 : Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit vergleichbaren Ergebnissen unter Anwendung eines Fermentationsmediums mit der folgenden Zusammensetzung wiederholt : 
 EMI7.5 
 
<tb> 
<tb> g/Liter
<tb> Glucose <SEP> 8,0
<tb> Tryptose <SEP> 3, <SEP> 0
<tb> Enzymatisches <SEP> Abbauprodukt <SEP> von <SEP> Casein <SEP> 1, <SEP> 0
<tb> Glutaminsäure <SEP> 1, <SEP> 0
<tb> Sojamehl <SEP> 0, <SEP> 5
<tb> NaCl <SEP> 8,3
<tb> K2HPO4 <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> 
<tb> KH2P04 <SEP> 2,0
<tb> MnCl2 <SEP> 0,02
<tb> 
 
Beispiel 3 :

   Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit vergleichbaren Ergebnissen unter Anwendung eines Fermentationsmediums mit der folgenden Zusammensetzung wiederholt : 
 EMI7.6 
 
<tb> 
<tb> g/Liter
<tb> Glucose <SEP> 10,0
<tb> Soj <SEP> amehl <SEP> 10,0
<tb> Maiswasser <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 8> 

   Beispiel 4 :   Das Verfahren von Beispiel 1 wurde unter Erzielung vergleichbarer Ergebnisse bei Anwendung eines Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung wiederholt : 
 EMI8.1 
 
<tb> 
<tb> g/Liter
<tb> Melasse <SEP> 10,0
<tb> Enzymatisches <SEP> Abbauprodukt <SEP> von <SEP> Casein <SEP> 1, <SEP> 0
<tb> Hefeextrakt <SEP> 2,0
<tb> Maiswasser <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> Casein <SEP> 3,0
<tb> 
 
Beispiel 5 : Das Verfahren gemäss Beispiel 1 wurde wiederholt.

   Der Methylisobutylketon-Extrakt der fertigen Fermentationsbrühe wurde unter Vakuum getrocknet und der Rückstand wurde mit Petroläther tri-   tuiert. dans   bröckelnde Material wurde gemahlen und die antibiotischen Komponenten wurden durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie quantitativ bestimmt.

   Repräsentative Anteile des rohen antibiotischen Gemisches wurden aus getrennten Fermentationsversuchen untersucht, wobei folgende Ergebnisse erhalten wurden   (il) :   
 EMI8.2 
 
<tb> 
<tb> Anteil <SEP> Nr. <SEP> 35.763 <SEP> 36.926 <SEP> 37.932 <SEP> 37.277 <SEP> geringere <SEP> Komponenten
<tb> 1 <SEP> 8,5 <SEP> 32.0 <SEP> 8,7 <SEP> 19,3 <SEP> 1,3
<tb> 2 <SEP> 3,1 <SEP> 39,5 <SEP> 7,8 <SEP> 15,9 <SEP> 1,2
<tb> 3 <SEP> 6, <SEP> 0 <SEP> 38, <SEP> 6 <SEP> 10, <SEP> 7 <SEP> 25, <SEP> 5 <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> 
<tb> 4 <SEP> 9, <SEP> 4 <SEP> 47, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 26, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> 5 <SEP> 8, <SEP> 4 <SEP> 31, <SEP> 9 <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP> 20, <SEP> 3 <SEP> 1, <SEP> 4 <SEP> 
<tb> 

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH : Verfahren zur Herstellung von neuen Antibiotika oder eines synergistischen antibiotischen Gemisches derselben, enthaltend die Verbindungen 35. 763, 36. 926, 37. 277 und 37. 932 und verschiedene antibiotische Nebenkomponenten, dadurch gekennzeichnet, dass man Actinoplanes auranticolor ATCC 31011 in einem wässerigen Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthält, unter submersen aeroben Bedingungen züchtet, bis eine wesentliche antibiotische Wirksamkeit erhalten wird, und eine oder mehrere der Verbindungen 35.763, 36,926, 37.277 und 37. 932 oder ein Gemisch aller dieser Verbindungen aus demselben abtrennt.