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Herstellung und Gewinnung eines Antibioticums Die Erfindung bezieht
sich auf ein Verfahren zur Herstellung neuer Verbindungen mit antibiotischer Wirksamkeit.
Das neue Produkt, das hier mit D-52 bezeichnet wird, erhält man durch Fermentation,
Gewinnung und Konzentration aus Rohlösungen einschließlich der Fermentationsmassen
und- Reinigung. Das neue Antibioticum ist gegen Bakterien, insbesondere gegen grampositive
Bakterien wirksam, desgleichen seine Salze mit Säuren.
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Es wurde gefunden, daß man durch Kultivierung einer bisher nicht beschriebenen
Art von Mikroorganismen, die aus einer in Utah entnommenen Bodenprobe stammt, Streptomyces
caelestis, unter kontrollierten Bedingungen und auf geeigneten Kulturmedien ein
neues Produkt, das Antibioticum D-52, erhalten kann. Der vorgeschlagene Name des
neuen Mikroorganismus Streptomyces caelestis charakterisiert die himmelblaue Farbe
(nach Ridgway, »Color Standards and Nomenclature«) seiner Conidien, wenn man denselben
aus den verschiedensten unter erwähnten Medien kultiviert. Eine Kultur des lebenden
Mikroorganismus wurde bei der Fermentation Division of the Northern Regional Research
Laboratory in Peoria, Illinois, deponiert und wurde der permanenten Sammlung unter
der Bezeichnung NRRL 2418 einverleibt.
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Eine sorgfältige Unternehmung der Morphologie und Physiologie von
S. caelestis zeigt, daß er deutlich verschieden ist von irgendwelchen früher in
Bergey,
»Manual of Determinative Bacteiiology« 6. Auflage, S: 929
bis 977, und. Waksman und Lechevalier, nActinomycetes and their Antibiotics«, beschriebenen
Streptomycesarten. Die Beschreibung erfolgt nachstehend in Form einer Tabelle. Alle
Beimpfungen erfolgten mit einer Sporensuspension. Die Reagenzgläser enthielten die
verschiedenen Kulturmedien, und die Bebrütung erfolgte bei 24 bis 28° C. Die Bestimmungen
erfolgten am vierten, siebenten und vierzehnten Tag.
| ' Tabelle I |
| Kultureigenschaften von S. caelestis |
| Farbe des der Luft aus- Lösliches |
| Medium Wachstum gesetzten Mediums und der Pigment Bemerkungen |
| Sporen |
| Reine Gelatine ........... gut Blaugrau Braun Verflüssigung
bis |
| zur Tiefe des Pig- |
| ments- |
| o,5 °/o Trypton - 0,3 °/o . |
| Hefeextraktbrühe ...... schwach Blauweiß Braun |
| Tryptonbrühe ........... schwach Grauweiß Braun |
| Czapeks sucrose Agar .... gut Blaugrauweiß Gelb |
| Waksmans Stärkeagar . .. keines leine keine |
| d-Glucoseagar ........... gut Blaugrauweiß Gelbbraun |
| Nähragar ............... ziemlich gut Schwachrosa-weiß
Braungelb- |
| braun |
| d-Glucosenährbrühe...... gut keine Gelbbraun |
| Lakmusmilch ........... ziemlich gut schwach keine keine
Peptonisa- |
| tion oder Reduk- |
| tion |
| Kartoffelboden .......... schräggut Gräulich bis Braun
Scheibe wird |
| Blauweiß dunkel |
| Rübenschrägboden ....... gut T schwach, Weiß mit keine |
| Blaustich |
| Nitratnährbrühe |
| o,z °/o KN03 : ......... gut schwach, Blauweiß tiefes
Gelb- keine Reduktion |
| braun des Mediums |
| Waksmans Tyrosinagar . . gut keine keine |
| wäßrige x-Tyrosin (i0/0) gut keine keine |
| Nährbouillon ............ gut schwach, Weiß tiefes Gelb- |
| braun |
| Pepton-Eisenagar........ gut keine Schwarzbraun H,S-dunkel- |
| werden |
| Dorsetts Eierschrägboden. gut schwach, Braun |
| Lavendelweiß |
| Loefflers |
| Serumschrägboden ..... gut schwach, |
| - Rösalavendelweiß Braun |
| Bennetts Agar .......... gut Blauweiß Gelbbraun |
| bis Braun |
Die Nutzbarmachung von Kohlenstoffverbindungen durch S. caelestis in einem. synthetischen
Medium wird in Tabelle II- gezeigt. Man arbeitete nach der Arbeitsweise von Pridham
und Gottlieb, J. Bact., 56, 107 bis 114 (i948), mit folgenden Abänderungen: z. Schüttelkolben
wurden mit Sporen von S. caelestis beimpft und bei 28° auf einem hin- und hergehenden
Schüttelapparat bebrütet.
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2. Nach 48 Stunden wurde das Überstehende abgegossen, die Kultur mit
zoo cm3 .sterilem destilliertem
Wasser gewaschen und das Überstehende
wiederum abdekantiert. Dann setzt man z_ oo cm3 steriles destilliertes Wasser zu
und bebrütet bei 28° auf einem hin- und hergehenden Schüttelapparat.
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3. Nach 48 Stunden wurde das Überstehende abdekantiert, wie oben gewaschen
und in einem Waring-Mischer i Minute mit Zoo cm3 sterilem destilliertem Wasser vermischt.
| Tabelle Il - |
| Assimilation von Kohlenstoffverbindungen durch |
| S. caelestis im synthetischen Medium von Pridham |
| und Gottlieb |
| Medium |
| ge nis Medium g bnis |
| Blindversuch .... - lösliche Stärke (+) |
| d-Xylose........ -[- Glycerin -[- |
| i-Arabinose ..... + Dulcit (-) |
| Rhamnose ...... + d-Mannit - |
| d-Fructose ...... + d-Sorbit (-) |
| d-Galactose ..... + dl-Inosit + |
| d-Glucose ....... + Na-Formiat - |
| d-Mannose ...... + Na-Oxalat - |
| Maltose ......... + Na-Tartrat - |
| Sucrose ......... + Na-Salicylat - |
| Lactose ......... + Na-Acetat + |
| Cellobiose ....... + Na-Nitrat (+) |
| Raffinose ....... + Na-Succinat (+) |
| Dextrin......... + |
| Inulin .......... (-) |
| + = positive Assimilierung |
| - = negative Assimilierung |
| (+) = positive Assimilierung, nur schwaches |
| Wachstum |
| (-) = schwaches Wachstum, keine Assimilierung. |
In allen Fällen, wo Assimilierang stattfindet, war das Mycelium des S. caelestis
durch eine pulverige blaugraue Farbe mit Spuren von Weiß gekennzeichnet. Die Kultur
des S. caelestis bildet lange fadenförmige Mycele, die sich üppig verzweigen. Die
Conidien haben eine kugelige bis ovale Form und werden von locker gespiralten Sporophoren
getragen, die sich aus dem Mycelium erheben. Kultiviert man S. caelestis auf Bennetts
Agar, so hat das Mycelium eine blasse meergrüne Farbe. Ferner wird im Medium ein
gelbbraunes Pigment entwickelt. Die Kolonien auf Bennetts Agar sind in der Mitte
leicht erhoben mit glatten Rändern, die eine weiße Färbung aufweisen. Die günstigste
Temperatur zur Sporenbildung von S. caelestis ist zwischen 28 und 30°.
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Obschon S. caelestis in gewissen Beziehungen dem S. glaucus (Waksman
und Lechevalier, »Actinomycetes and Their Antibiotics«, S. 9i) und S. chartreusis
(J. A. C. S. 75, 4011 [19531) ähnlich ist, lassen sich diese Mikroorganismen leicht
durch ausgesprochene Unterschiede in ihren Kultureigenschaften unterscheiden, die
in der untenstehenden Tabelle zusammengestellt sind.
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Wie oben erwähnt, kann S. caelestis, NRRL 2418, auf einem Kulturmedium
unter Bildung eines wirksamen antibiotischen Materials gezüchtet werden. Das Kulturmedium
kann irgendeines von einer Anzahl verschiedener Medien sein, wie aus den obenerwähnten
Versuchen hervorgeht. Der Organismus ist befähigt, viele Energiequellen zu assimilieren.
Aus Gründen der Wirtschaftlichkeit der Produktion, maximalen Ausbeute an Antibioticum
und der leichten Isolierung des Antibioticums D-52 werden aber gewisse Kulturmedien
bevorzugt. So sind z. B. die zur Zeit bevorzugten Quellen für Kohlehydrat im Kulturmedium
brauner Zucker, Lactose und Dextrin. Andere Quellen sind Stärke, Sucrose, Melassen
u. dgl. Die bevorzugten Stickstoffquellen sind Mais-Einweichflüssigkeit, Brauereihefe,
löslicher Anteil von Schlempe, doch kommen auch andere Quellen, wie Sojabohnenmehl,
Casein, Aminosäurengemische, Peptone (Fleisch und Soja) u. dgl. in Frage.
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Die anorganischen Nährsalze, die dem Kulturmedium zugesetzt werden
können, sind solche, die
| Tabelle III |
| Unterscheidende Eigenschaften von S. caelestis, S. chartreusis
K-18o und S. glaucus |
| Reaktion |
| Medium S. caelestis S. chartreusis K-x8o S. glaucus |
| Kartoffel ............... Wachstum gut, gräulich Wachstum
ordentlich, Wachstum sehr stark, |
| bis blauweiß mit Mitte der Kolonien bedeckt mit samt- |
| Dunkelwerden der blaugrau mit weißen artigen grünen |
| Scheibe Kanten Luftmycelien |
| Milch .................. keine Peptonisierung langsame
Peptonisierung Peptonisierung langsam, |
| mit vorheriger |
| Koagulation durch |
| einige Stämme |
| Stärke.................. keine Hydrolyse gute Hydrolyse rasche
Hydrolyse |
| Nitrat .................. keine Reduktion auf Reduktion
Reduktion |
| dem verwendeten |
| Medium |
Ionen liefern, z. B. Kalium, Natrium, Calzium, Phosphat, Chlorid,
Sulfat u. dgl. Anorganische Stickstoffquellen sind Nitrate oder Ammoniumsalze.
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Im Kulturmedium für S. caelestis sollten auch wesentliche Spurenelemente
enthalten sein. Solche Spurenelemente sind gewöhnlich in den anderen Zusätzen als
Verunreinigungen enthalten.
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Für das optimale Wachstum und die Entwicklung von S. caelestis, NRRL
2418, sollte das Kulturmedium vor der Beimpfung mit dem Organismus auf ein p$ zwischen
etwa 6,5 und 7,5 eingestellt werden, wobei das pg 7 bevorzugt wird. Es wurde beobachtet,
daß während der Wachstumsperiode des Organismus und der Produktion des Antibioticums
das Medium allmählich alkalisch wird und eine Alkalinität vom p$ etwa 8 bis 8,5
oder höher erreicht. Das End-pH hängt mindestens zum Teil vom Anfangs-pg des Mediums,
den vorhandenen Puffern und der Zeitdauer, während welcher der Organismus wachsen
gelassen wurde, ab.
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Zur Herstellung großer Mengen des Antibioticums D-52 bevorzugt man
die submerse aerobe Kultur. Will man nur beschränkte Mengen des Antibioticums erhalten,
kann man Schüttelkolben und Oberflächenkulturen in Kolben anwenden. Bei der Züchtung
in großen Tanks empfiehlt es sich, die vegetative Form des Organismus zur Beimpfung
zu verwenden, um eine Verzögerung in der Herstellung des Antibioticums und die damit
verbundene ungenügende Ausnutzung der Anlage zu vermeiden. Dementsprechend ist es
erwünscht, zuerst ein vegetatives Inokulum des -Organismus herzustellen,
indem man eine verhältnismäßig kleine Menge des Kulturmediums mit Sporen des Organismus
beimpft, und nach Ausbildung des jungen aktiven, vegetativen Iriokulums dieses aseptisch
in die großen Tanks zu geben. Das Medium, in welchem das vegetative Inokulum hergestellt
wird, kann das gleiche sein wie das, in welchem das Antibioticum erzeugt wird, oder
von diesem verschieden.
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S. caelestis, NRRL 24z8, läßt sich bei Temperaturen zwischen etwa
20 und etwa 32° gut kultivieren. Die besten Ausbeuten werden erhalten, wenn das
Kulturmedium zwischen etwa 24 und 28° gehalten wird.
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Die Bildungsgeschwindigkeit des Antibioticums D-52 und die Konzentration
der antibiotischen Aktivität im Kulturmedium kann während der Wachstumsperiode des
Mikroorganismus leicht verfolgt werden, indem man Proben des Kulturmediums auf ihre
Wirksamkeit gegen Organismus prüft, von denen man weiß, daß sie gegen das Antibioticum
empfindlich sind, wie z. B. B. subtüis. Für diese Bestimmungen empfiehlt sich die
Anwendung eines Tests, bei welchem serienweise Verdünnungen der Kulturproben hergestellt,
dem geschmolzenen Nähragar zugesetzt werden, wonach man den Agar in einer Petrischale
erstarren läßt, mit einer jungen Kultur von B. subtilis beimpft und die größte Verdünnung
ermittelt, die das Wachstum des Organismus auf dem Nähragar noch vollständig verhindert.
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Die Bildung des Antibioticums D-52 kann auch durch Trübungsmessungen,
wie sie bei der Herstellung anderer Antibiotica üblich sind, verfolgt werden. Im
allgemeinen findet die größte Produktion des Antibioticums zwischen etwa 2 und 6
Tagen nach der Beimpfung statt, wenn die Kultur submers aerobisch erfolgt, und zwischen
etwa 4 und 8 .Tagen, wenn man Oberflächen- oder Schüttelfiaschenkulturen anwendet.
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Die antibiotischen Stoffe können aus dem Kulturmedium durch extraktive
oder adsorptive Arbeitsmethoden gewonnen werden. Für die technische Produktion werden
erstere bevorzugt, da sie weniger zeitraubend und kostspielig sind. Zur Extraktion
eignen sich vorzugsweise wasserunlösliche polare organische Lösungsmittel, wie chlorierte
Kohlenwasserstoffe, z. B. Methylenchlorid, Äthylendichlorid, Chloroform u. dgl.
; Alkohole mit geringer Wasserlöslichkeit, wie Butanol, Amylalkohol u. dgl. ; Alkylester
von Fettsäuren wie Äthylacetat, Propylacetat, Butylacetat, Ämylacetat u. dgl. ;
wenig wasserlösliche Ketone wie Methyl-isobutylketon, Methylamylketon u. dgl. Andere
Lösungsmittel mit ähnlichem Charakter können ebenfalls verwendet werden. Der Extrakt
aus der Kulturflüssigkeit kann vorzugsweise im Vakuum zur Trockne eingedampft werden.,
wobei man das Antibioticum in roher Form erhält.
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Andererseits kann man das Antibioticum D-52 aus dem Kulturmedium gewinnen,
indem man die filtrierte Lösung mit einem adsorbierenden Mittel zusammenbringt.
Hierzu eignen sich aktivierte Tonerde, Silikagel, Magnesiumaluminiumsüikat u. dgl.
Diese eignen sich auch zur Reinigung des Produktes auf chromatographischem Wege.
Desgleichen kann man Aktivkohle verwenden, da diese das Antibioticum kräftig adsorbiert.
Es empfiehlt sich jedoch, die Kohle mit einem Mittel wie Essigsäure vorzubehandeln,
um die starke Bindungsaffinität des Kohlenstoffs für das Antibioticum herabzusetzen
und dessen nachherige Elution zu erleichtern. Die Elution erfolgt leicht mit einem
polaren organischen Lösungsmittel, in welchem das Antibioticum löslich- ist.
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Verwendet man zur Gewinnung des Antibioticums D-32 ein Extraktionsverfahren,
so kann man das Lösungsmittel auf ein relativ kleines Volumen einengen und das Antibioticum
daraus durch Zusatz eines mischbaren Lösungsmittels, in welchem es nur wenig löslich
ist, ausfällen. Das antibiotische Material fällt in Form der freien Base in roher,
aber fester Form aus.
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Eine z.-Z. bevorzugte Art zur Isolierung des Antibioticums D-52 in
Form seiner Base besteht darin, das pg des filtrierten Mediums auf etwa 7 bis zo
einzustellen, vorzugsweise auf etwa 7,5 bis 8, und dann mit einem in Wasser unlöslichen
organischen Lösungsmittel, wie Amylacetat, Butanol, Äthylacetat, Methylenchlorid
od. dgl., zu extrahieren. Der Extrakt wird dann zur Trockne verdampft und der Rückstand
@u einem flüssigen, gesättigten Kohlenwasserstoff mit 5 bis 8 Kohlenstoffatomen,
vorzugsweise 6 Kohlenstoffatomen, wie Hexan, gegeben, um einen amorphen Niederschlag
zu erzeugen: Der Niederschlag wird filtriert und getrocknet, wobei man das Antibioticum
als freie Base erhält.
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Die Salze des Antibioticums D-52 mit Säuren kann man erhalten, indem
man eine Lösung desselben in einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol,
Äthylacetat,
Methylenchlorid od. dgl., mit einer äquivalenten Menge Säure, wie z. B. gasförmigem
Chlorwasserstoff, Oxalsäure, Salicylsäure, Citronensäure od. dgl., versetzt und
die Lösung zur Trockne verdampft. Ferner kann man eine Lösung des Antibioticums
D-52 in einem organischen Lösungsmittel mit einer ausgewählten Säure oder eine Lösung
derselben behandeln und das Salz des Antibioticums D-52 direkt aus der Lösung ausfällen.
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Beispiele für Salze, die hergestellt wurden, sind das Hydrochlorid,
Oxalat und Salicylat. Andere Salze, wie das Citrat, Benzoat, Sulfat u. dgl., können
nach der oben erwähnten Arbeitsweise leicht erhalten werden. Für therapeutische
Zwecke sollte das gewählte Salz natürlich nich-iL toxisch sein.
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Die Erfindung beschränkt sich nicht auf die Herstellung des Antibioticums
D-52 mittels S. caelestis oder eines Organismus der voll und ganz der oben gegebAnen
Beschreibung entspricht, die lediglich zu Zwecken der Erläuterung angeführt wurde.
Es versteht sich, da.B das Fermentierungsverfahren der vorliegenden Erfindung auch
andere das Antibioticum D-52 erzeugende Abarten von S. caelestis umfaßt, die leicht
durch routinemäßige Isolierungs- und Modifikationsverfahren, wie Auswahl des kultivierten
Organismus und Behandlung desselben. mit modifizierenden Mitteln, wie Röntgenstrahlen,
ultraviolettem Licht, und chemischen Mitteln wie z. B. Stickstoff-Senfölen, erhältlich
sind.
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Das Antibioticum D-52 und seine Salze mit Säuren haben eine große
antibakterielle Wirkungsbreite, insbesondere gegen graue positive Bakterien. Die
Wirksamkeit des Antibioticums D-52 im Vergleich zu Streptomycin gegen verschiedene
Organismen ist in der folgenden Tabelle zusammengestellt
| Tabelle IV |
| Antibakterielles Spektrum |
| Kleinste wachstumshindernde Konzentration |
| (mcg/cm3) |
| Organismus Antibioticuml StrePto- |
| D-@z III mycm |
| D. pneumoniae ......... 0,39 25,0 |
| S. viridans 25-1r ...... 3,1 50,0 |
| S. viridans L-17 ....... 6,2 zoo,o |
| S. hemolyticus C 203 ... o,19 o,19 |
| S. hemolyticus L-2 ..... 0,78 3,1 |
| S. agalactiae 7077 ...... 1,5 zoo,o |
| M. pyogenes var. > |
| aureus L 40 ...... 0,39 zoo,o |
| M. pyogenes var. |
| aüreus M-1 ....... 1,5 3,1 |
| M. pyogenes var. |
| aureus 284 ........ 0,78 1,5 |
| S. albus ............... 2,5 0,05 |
| S. fecalis .............. 2,5 z,0 |
| B. anthracis ........... 2,5 0,05 |
Die antibiotische Wirksamkeit wurde durch Abstrichverdünnungs- oder Nährbouillonverdünnungsproben
ermittelt. Im ersten Fall wurden die zu prüfenden Organismen auf eine Reihe von
Agarplatten, die verschiedene Konzentrationen des Antibioticums enthielten, abgestrichen,
um die kleinste Menge Antibioticum D-52 in msg/cm3 Substrat zu bestimmen, welche
das Wachstum q0 Stunden verhinderte. Bei der zweiten Prüfung werden die zu prüfenden
Organismen in einer Nährbouillon, die verschiedene Mengen des Antibioticums D-52
enthält, gezüchtet.
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Das Antibioticum D-52 ist wirksam gegen Nocardia asteroides, den Organismus
der bei Tieren und Menschen Actinomycose hervorruft und ist ebenfalls wirksam gegen
Xanthomonas pruni, Phytomonas fasciculata und Phytomonas stewartii, welche Bakterien
in Pflanzen von wirtschaftlicher Bedeutung Krankheiten verursachen. Da Giftigkeitsprüfungen
ergaben, daß bei Konzentrationen- von zooo Teilen pro Million des Antibioticums
D-52 Apfel- und Birnenlaub nicht schädigen, ist das Antibioticum auch wertvoll zur
Bekämpfung des Meltaus von Apfel-und Birnbäumen.
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Das Antibioticum D-52 kann entweder für sich allein oder zusammen
mit anderen Antibiotica wie Oxytetracyclin, Chlortetracyclin, Penicillin, Streptomycin,
Actidion u. dgl. zur Behandlung von Pflanzenkrankheiten wie bakterielle Flecken
auf Tomaten und Pfefferpflanzen, Nußbaummeltau, Bohnenmeltau, verschiedene Rasenkrankheiten,
Pfefferminzbrand, Kirschblattflecken u. dgl. verwendet werden.
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Außerdem kann man wegen der geringen Giftigkeit des Antibioticums
D-52 und dessen Aktivitäten in vivo dieses sowohl gegen Streptokokken als auch gegen
Staphylokokken, dasselbe zur Behandlung von Scharlachfieber, Streptokokken-Brustinfektionen,
Oberflächeninfektionen u. dgl. einsetzen. Demzufolge ist das Antibioticum D-52 von
therapeutischer Bedeutung in Kombination mit einem oder mehreren der folgenden Antibiotica
wie Streptomycin, Dihydrostreptomycin, Oxytetracychn, Tetracyclin, Chlortetracyclin,
Bacitracin, Circulin, Penicillin, wie Penicillin 0, Procain-penicillin, Chlorprocainpenicillin
u. dgl. Chloramphenicol Tyrothricin, Polymixin B, Endomycin, Amicetin, Fumagillin,
Erythromycin u. dgl. Sulfaverbindungen, wie Sulfadiazin, Sulfamerazin, Sulfamethazin
u. dgl., Steroidhormone, wie Cortison Hydrocortison und Estern desselben, Halogen-Cortisone,
wie 9-a-Chlorcortison, 9-a-Fluorcortison u. dgl. und deren Ester, Halogenhydrocortison,
wie 9-a-Chlorhydrocortison, 9-a-Fluorhydrocortison und deren Ester, oestrogene Stoffe
u. dgl. Analgetica wie Salicylate u. dgl. Antihystamine wie Pyrrolazote (Pyrrollidinäthyl-phenothiazin-Chlorhydrat)-,
Pyribenzamin-(N' - pyridyl - N'- benzyl - N - dimethyläthylendiaminmonochlorhydrat)-
u. dgl. Das Antibioticum D-52 kann auch als Nahrungsmittelergänzung zur. Förderung
des Wachstums von Tieren und Geflügel allein oder in Verbindung mit einem oder mehreren
der vorgenannten antibiotischen Stoffe verwendet werden. Es kann auch mit fungiziden
Stoffen wie Caprylsäure, Undecylensäure, p-Oxybenzoesäure u.-dgl. Anwendungen finden.
Die
folgenden Beispiele beschreiben die Bildung, Gewinnung, Konzentration, Reinigung
und Indentifizierung des Antibioticums D-52 und dessen Salzen. Beispiel i Bildung
des Antibioticums D-52.
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In eine Anzahl von 500 cm3 Erlenmeyerkolben gibt man je ioo
cm3 des folgenden Mediums: Bactopepton (Difaco) ......... 7,5 g Hefeextrakt (Difaco)
.............. 2,5 g Glucose .......................... 5,0 g Destilliertes
Wasser auf ........... iooo ccm Die Kolben werden 2o Minuten im Autoklav bei 12i°
sterilisiert. Nach dem Abkühlen werden die Kolben mit einer wäßrigen Sporensuspension,
die erhalten wurde, auf den üblichen Casein-Stärke-Agar-Schrägstücken beimpft, worauf
man etwa 48 Stunden bei einer Temperatur zwischen 24 und 28° auf einer hin und her
gehenden Schüttelmaschine bebrütet. 5 cm3 dieses vegetativen Impfmediums wurden
verwendet, um eine Reihe von 5oo cm3 Erlenmeyerkolben, die je ioo cm3 des folgenden
Mediums enthielten, zu beimpfen.
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Rohzucker .... .................. , io g Glycerin ................
........ 5 g Lacton ........................... 5 g Dextrin ....................
-... 5 g Brauereihefe ..................... 2 g SVP1) ...........................
5 g NH,N03 ........................ 2 g Maiseinweichflüssigkeit ............ 2 g
CaCO3 .......................... 4 g NaCl ............................ 5
9 -
Wasser bis ....................... iooo cm3 x) SVP = Lösliches pflanzliches
Proteingemisch der Glenmore Distelleries, Inc.
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Vor der Beimpfung wurden die Kolben im Autoklav 2o Minuten bei 121°
sterilisiert und abgekühlt. Die Kolben bei 24 bis 28° auf einem Schütteltisch bebrütet.
Nach 12o Stunden enthielt eine Probe des fermentierten Kulturmediums 87 M.-avium-Einheiten
pro cm3 und 18o B.-subtilis-Einheiten pro cm3.
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Die Gehaltsbestimmung erfolgte nach dem Verfahren von Loo und Mitarb.
(J. Bact., 50, S. 701 bis 7o9 [1g45]) und wird als M.-avium-Einheiten bezogen auf
den Streptomycinsulfatstandard ausgedrückt und in B.-subtilis-Einheiten bezogen
auf den Neomycinsulfat Standard. Jede M.-avium-Einheit entspricht einem Mikrogramm
Streptomycinbase auf Grundlage der Plattenaktivität und jede B.-subtilis-Einheit
einem Mikrogramm Neomycinbase auf Grundlage der Plattenaktivität.
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Beispiel 2 Bildung des Antibioticums D-52. ioo cm3 Portionen des folgenden
Mediums Dextrose ........................ 20,0 g Sojamehl .......................:
io,o g Brauereihefe ......:............... 2,5 g (NH4)1S04 ......................
5,0 9
| KCl............................. 3,0 g |
| CaCO3 .......................... 4,0 g |
| Wasser bis zu .................... iooo cm3 |
| werden in 5oo-cm3-Kolben gefüllt, die dann 2o Minu- |
| ten bei 121° im Autoklav sterilisiert wurden. Die ab- |
| gekühlten Kolben wurden mit 5 cm3 der 48stündigen |
| Kultur, wie sie im Beispiel i beschrieben wurde, |
| beimpft und dann bei 24 bis 28° auf dem Schüttel- |
| tisch bebrütet. -Nach no Stunden enthielt eine Probe |
| des fermentierten Kulturmediums einundzwanzig |
| M.-avium-Einheiten pro cm3 und mehr als achtzig |
| B.-subtilis-Einheiten pro cm3. |
| Beispiel 3 |
| Bildung und Gewinnung des Antibioticums D-52 |
| Ein Tank aus rostfreiem Stahl von 378,51 Inhalt |
| wurde mit 2401 des folgenden Nährmediums be- |
| schickt. |
| Rohzucker .......................... io g/1 |
| Glycerin .........:.................. 59/1 |
| Lactose.............................. 5 9/l |
| Dextrin ............................ 59/1 |
| Brauereihefe ........................ 2 g/1 |
| SVP ............. .................. 59/1 |
| NH,N03 ........................... 2 gA |
| Maiseinweichwas"ser .................. 2 g/1 |
| CaCO3 ............................. 49/1 |
| NaCl............:.................. 59/1 |
| Dann wurde 30 Minuten bei 121° sterilisiert und |
| abgekühlt. Hierauf wurde mit i21 einer wie folgt |
| hergestellten Kultur beimpft: Man verwendete Sporen |
| von S.-caelestis, die von einer Casein-Stärke-Agar- |
| Schrägkultur erhalten wurden, zur Beimpfung eines |
| 5oo-cm3-Kolbens, der ioo cm3 des folgenden Saat- |
| mediums enthielt |
| Dextrose .......................... 2o;o g/1 |
| Sojamehl .......................... 10,0 g@l |
| Brauereihefe ......................... 2,5 9/l |
| (NH4)1S04 ......................... 5;o 9/l |
| KC1............ ................... 3,o g/l |
| CaCO3 ............................ 4,o 9/l |
| Dieser Kolben wurde auf einem hin und her ge- |
| henden Schütteltisch 48 Stunden bei 28° bebrütet. |
| 25 cm3 dieser Kultur wurden zur Beimpfung eines |
| etwa i91 fassenden Fermentiertanks aus rostfreiem |
| Stahl, der 121 des obengenannten Saatmediums ent- |
| hielt, benutzt. Er wurde vorgängig 1l/2 Stunden bei |
| 12i° sterilisiert und dann abgekühlt. Dann wurde bei |
| 28° 2 Tage fermentiert. Während dieser Zeit wurde |
| mit einem Rührer gerührt und. mit 61 pro .Minute |
| belüftet. Das ergab das Saatmedium. |
| Der 378,5-1-Tank wurde mittels eines verkleideten |
| Flügelrads mit Saugrohrschikane in Bewegung ge- |
| halten, die Drehzahl des Propellers betrug 280 U/min. |
| Luft wurde in einer Menge von o,o849 M3/min. zu- |
| geführt. Der Kultur setzte man ioo cm3 eines Anti- |
| schaummittels, bestehend aus Specköl und 10/0 |
| Octadecanol zu. |
| Nach 67 Stunden wurden 1500 cm3 der Kultur |
| filtriert und zweimal mit je 500 cm3 Methylenchlorid |
extrahiert. Das p$ der Probe war 7,8. Der Extrakt wurde im Vakuum
auf 2 cm3 eingeengt und dann zu
10 cm3 Skellysolve B gegeben, einem Lösungsmittel,
das größtenteils ein Gemisch von Hexankohlenwasserstoffen enthält. Man erhielt einen
flockigen Niederschlag. Nach dem Waschen mit Skellysolve B und Trocknen erhielt
man 38 mg (43 6/o Ausbeute) an Antibioticum D-52 mit 270o B.-substilis-Einheiten
pro cm3 und
720 M.-awium-Einheiten pro cm3.
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Das Antibioticum D-52 besitzt im p$-Bereich zwischen ?,..und 7 eine
gute Stabilität (3 Stunden bei 8o°), und die Stabilität scheint geringer beim pH
io, wenn man 3 Stunden bei 25° hält.
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Das Antibioticum D-52 ist in Wasser löslich im p$-Bereich von i bis
7, unlöslich zwischen 7,5 und g und löslich im Bereich zwischen io und 13. Dieses
Löslichkeitsverhalten zeigt, daß das Antibioticum amphoter ist. Es ist unlöslich
in 6 N NaOH. Seine Salze mit Säuren sind wasserlöslich.- Es ist löslich in Methanol,
Chloroform, Äthylacetat und Methylenchlorid aber unlöslich in Äther und Ligroin.
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Die Analyse des Antibioticums D-52 führt zur versuchsweisen
Formel C23H36 bis 460sN.S.
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Bestimmt man das Ultraviolettabsorptionsspektrum des Antibioticums
D-52 in wäßriger Lösung unter Verwendung eines Beckman-Quarz-Spectrophotometers,
Modell DU, oder eines Cary-Registrier-Spectrophotometers, werden Maxima von E 1@'m
= 182 bei 239 Millimikron und E'1','.- = 74 bei 307 Millimikron beobachtet.
Das Antibioticum D-52 besitzt eine optische Drehung [a] D = +121,5° (0,5
% in Chloroform).
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Eine Suspension des Antibioticums D-52 in flüssigem Petrolatum zeigt
folgende charakteristische Absorptionsbanden im Infrarot, ausgedrückt in cm-': 3340
3210, igoo, 1672, 1655, 1615, 1570 1545 1488, logo und 758. Dies ist in Fig. 1 dargestellt.
Die Banden bei 3340 und 3210 sind charakteristisch für 0-H-und/oder N-H-Gruppen.
Die Bande bei igoo ist charakteristisch für ein Salz und zeigt an, daß das Antibioticum
wahrscheinlich als Zwitterion vorliegt. Die Banden bei 1672, 1655, i570 und 1545
sind charakteristisch für die Carbonylgruppe. Die Banden bei 1615, 1488 und 758
sind charakteristisch für die Phenylgruppe. Die Bande bei logo ist charakteristisch
für die C-H-Gruppe oder die C-0-Gruppe. Beispiel 4 Herstellung des Chlorhydrats
von Antibioticum D-52 Eine Lösung von 750 mg Antibioticum D-52 (Beispiel
3) wurde mit trockenem Chlorwasserstoff behandelt. Beim Eindampfen erhielt
man einen harzigen Rückstand. Nach Verreiben desselben mit wasserfreiem Äther erhielt
man 435 mg eines weißen, halbkristallinen Pulvers, das als Hydrochlorid des Antibioticums
D-52 identifiziert wurde. Dieses Produkt enthielt 1650 M.-avium-Einheiten pro mg
und 220o B.-subtilis-Einheiten pro mg.
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Das Ultraviolettabsorptionsspektrum einer Probe des Chlorhydrats des
Antibioticums D-52 zeigt Maxima von E K'm = 188 bei 24o Millimikron und E i*#'m
= 67 bei 305 Millimikron. Eine Suspension des Chlorhydrats in flüssigem Petrolatum
zeigt folgende charakteristische Absorptionsbänder im Infrarot, ausgedrückt in cm-':
3290,
3o65, 1671, 1613, 1583 1566 1485, 1o88 und 755. Das Einzelband bei
3290 ist charakteristisch für die OH- und/oder NH-Gruppe. Die Bänder bei
1671, 1583 und 1566 sind charakteristisch für die C=O-Gruppe. Die Bänder bei 1613,
1485 und 755 sind charakteristisch für die Phenylgruppe. Das Band bei 1o88 ist charakteristisch
für die C-0-Gruppe`. Das Band bei 3o65 ist charakteristisch für die =C-H-Gruppe.
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Das Hydrochlorid des Antibioticums D-52 besaß eine optische Drehung
von [a] D = + g6,7° (0,5 6/6 in Wasser).
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Beispiel 5 Oxalat des Antibioticums D-52 Zu 12o cms wasserfreiem Äther
gibt man eine Lösung von 40m9 Oxalsäuredihydrat in 2o cm3 Methanol sowie Zoo mg
Antibioticum D-52 (Beispie13). Nach Umkristallisieren des erhaltenen Niederschlags
aus Methanol erhielt man 7o mg Oxalat des Antibioticüms D-52 als weiße, zwischen
149 und 154° schmelzende Nadeln. Das Produkt enthielt goo M.-avium-Einheiten pro
mg und 4ooo B: subtüis-Einheiten pro mg.
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Die Analyse ergibt eine versuchsweise empyrische Formel von
C., H36 61s 40()13N,S.
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Das Ultraviolettabsorptionsspektrum des Oxalats in wäßriger Lösung
ist durch folgende Maxima charakterisiert: E i%m = 155,9 bei 24o Millimikron und
E '1'.l.- = 61,8 bei 305 Millimikron.
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Eine Suspension des Oxalats in flüssigem Petrolatum zeigt folgende
charakteristische Absorptionsbänder im Infrarot, ausgedrückt in cm-': 360o, 346o
3265, 2540, 22o6, 1935, 1720, 1689, 1674, 1625, 1589 1545, 1486, 1085
und 756. Dies ist in Fig. 2 dargestellt.
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Die Einzelbänder bei 3600, 3460, 3265, 254o und 22o6 sind charakteristisch
für die 0-H- und/oder N-H-Gruppe. Das Band bei 1935 ist charakteristisch für das
Salza Die Bänder bei 1720, 1689, 1674, 1625, und 1545 sind charakteristisch für
die C-0-Gruppe. Die Bänder bei 1589, 1486 und 756sindcharakteristisch für die Phenylgruppe.
Das Band bei 1085 ist charakteristisch für die C-0-Gruppe.
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Das Oxalat des Antibioticums D-52 besitzt eine optische Drehung von
[a] D =+ 1o6,4° (0,5 °o in Wasser). Die Untersuchung zur Aufklärung der Struktur
des Oxalats des Antibioticums D-52 zeitigte folgende
| Ergebnisse: ' |
| Nitroprussid .... negativ |
| Ferrichlorid .... negativ (braun) |
| Millons Reagens weißer Niederschlag |
| Bariumchlorid .. weißer Niederschlag, säurelöslich |
| (kein Sulfat) |
| Jodoform ...... negativ |
| Benzolsulfonyl- |
| chlorid ....... unbestimmt |
| Brz in C Cl 4 ..... negativ |
| Br2-H20 ..... weißer Niederschlag (Arylamin |
| oder Phenolgruppe) |
| NaN3-I2 . . . . . . Entwicklung von N2 Gas |
| (C=SH oder C=S) |
| H2-Pt02 Kata- |
| lysator ....... keine Reduktion. Behält das UV- |
| Spektrum. |
1,15 g des Oxalats des Antibioticums D-52 wurden zu Jo cm3 6 N Na OH gegeben.
Nach Stehen über Nacht bei Zimmertemperatur ging das Antibioticum in Lösung und
man erhielt einen Niederschlag, der als Natriumoxalat identifiziert werden konnte.
Die überstehende Schicht wurde mit Methylenchlorid gewaschen und angesäuert, wobei
man einen neuen Niederschlag erhielt. Das feste Produkt wurde dann aus heißem Wasser
umkristallisiert. Man erhielt 8o mg eines weißen kristallinen Produktes, das bei
ioo° sublimierte und zwischen 154 und 158° schmolz. Bei der Infrarotanalyse erwies
sich dieses Produkt als Salicylsäure.
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Die intraperitonealen Toxizitäten des Antibioticums D-52, dessen Oxalats,
des Chlortetracyclins und Tetracychns sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
| Tabelle V |
| Akute Toxizität (mg/kg bei Mäusen) |
| Antibioticum LD6o (mg/kg) |
| D-52 freie Base ................. 167 |
| D-52 Oxalat .................... 233 |
| Chlortetracyclin ................. 192 (im Mittel) |
| Tetracyclin ...............:..... igo (im Mittel) |
Beispiel 6 Gewinnung des Antibioticums D-52 als freie Base aus dessen Salzen 2 g
Oxalat des Antibioticums D-52 (Beispiel 5) wurden in 2o cm3 Wasser gelöst. Das p$
der Lösung wurde durch Zusatz von 6 N Na OH auf 8,5 eingestellt, wobei sich ein
öliger Niederschlag bildete, der mit 2o cm3 Methylenchlorid extrahiert wurde. Der
Extrakt wurde über Natriumsulfat getrocknet und dann unter vermindertem Druck zur
Trockne eingedampft. Man erhielt 75o mg eines amorphen, praktisch farblosen Produktes,
das als Antibioticum D-52 in Form der freien Base identifiziert wurde. Sie enthielt
goo M.-avium-Einheiten pro Milligramm und 27oo B.-subtilis-Einheiten pro Milligramm.
Beispiel 7 Salicylat des Antibioticums D-52 Nach Zusatz von 6o cm3 wasserfreiem
Äther zu einer Lösung von i g Antibioticum D-52 (Beispiel 3) und o,27 g Salicylsäure
in io cm3 Methanol schied sich ein harzartiger Niederschlag aus. Nach Umkristallisieren
aus heißem Äthylacetat erhielt man das Salicylat des Antibioticums D-52 vom Schmelzpunkt
136 bis 138°, das
720 M.-avium-Einheiten pro mg und
3800 S.-subtilis-Einheiten
pro mg enthielt.
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Das UV-Spektrum des Salicylats ist gekennzeichnet durch Maxima von
.E y@@m = 227 bei 236,5 Millimikron und E l@@m = io6,7 bei 3013 Millimikron. Seine
optische Drehung -[a] -E- ö = 9o,2° (0,5 % in Wasser).
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Elektrometrische Titrationsstudien am Salicylat bei Verwendung einer
Mischung von Wasser und 95)/, Äthanol als Lösungsmittel zeigen eine basische-Funktion
mit einem pKa 7,8o und eine saure Gruppe mit dem pKa g,go. Das Äquivalentgewicht
dieses Salzes ist 68o @ 2o g: Eine Suspension des Salicylats in flüssigem Petrolatum
zeigt folgende charakteristische Absorptionsbänder im Infrarotgebiet, in cm-r ausgedrückt:
3540 3260, 3070, 1950 1677, 1625, 1614, 1584, 1546 1488, iog6, io8g, 766
und 764, was in Fig. 3 dargestellt ist.
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Die Einzelbänder bei 3540, 326o und 3070 sind charakteristisch
für die O-O- und/oder N-H-Gruppe. Das Bandbei 1950 ist charakteristisch für das
Salz. Die Bänder bei 1677, 1625, 1614, 1548 und 1546 sind charakteristisch für die
C=D-Gruppe und die Bänder bei 1488, 776 und 764 sind charakteristisch für die Phenylgruppe.
Die Bänder bei iog6 und io8g sind charakteristisch für die C-0-Gruppe.