DE1033854B - Herstellung und Gewinnung von Novobiocin - Google Patents

Description

• Herstellung und Gewinnung von Novobiocin Die Erfindung betrifft die Herstellung von Novobiocin, einem neuen Antibioticum auf biologischem Wege.
• Die Auffindung der erstaunlichen antibiotischen Eigenschaften des Penicillins erregte großes Interesse und hatte die Entdeckung vieler anderer wertvoller Antibiotica zur Folge, z. B. Streptothricin, Streptomycin, Gramicidin, Subtilin, Bacitracin, Chlortetracyclin, Oxytetracyclin, Terramycin u. dgl. Im allgemeinen wirken einige dieser Antibiotica auf bestimmte gramnegativ e Erreger, andere sind gegen grampositive Erreger wirksam und andere wiederum sowohl gegen gramnegative als auch grampositive Erreger. Gewöhnlich ist jedoch die Aktivität der bekannten Antibiotica auf einige pathogene Erreger beschränkt; man hat fortgesetzt versucht, Antibiotica aufzufinden, die gegen andere Erreger wirksam sind.
• Obgleich sich manche Antibiotica bei der Behandlung verschiedener Krankheiten als unschätzbar erwiesen haben, werden bestimmte Stämme einiger pathogener Organismen gegenüber einem bestimmten Antibioticum resistent; das betreffende Antibioticum besitzt daher keine Aktivität mehr gegen diese Stämme.
• Diese Unzulänglichkeit der bekannten Antibiotica hat nun weitere Forschungsarbeiten mit dem Ziel ausgelöst, Antibiotica aufzufinden, welche sowohl in einem breiteren Bereich pathogener Erreger als auch gegen die resistenten Stämme bestimmter Organismen aktiv sind.
• Das neue Antibioticum entsteht bei der Kultur einer bisher unbekannten Mikrobenart unter gesteuerten Bedingungen, die als Streptomyces spheroides bezeichnet wird. Diese wurde aus der Erde einer alter: Weidensode in Vermont isoliert. Die neue Mikrobe erhielt die Bezeichnung Streptomyces spheroides MA-319 in der Kultursammlung der Fa. Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey. Eine Kultur wurde bei der Fermentation Section of the Northern Utilization Research Branch, United States Department of Agriculture in Peoria, Illinois, niedergelegt und in diese Dauerkultursammlung unter N RRL 2449 aufgenommen.
• Die morphologischen und Kultureigenschaften von Streptomyces spheroides sind in folgender Aufstellung zusammengestellt Streptomyces spheroides Morphologie: (Untersucht auf YED, Czapeks Saccharose und Glucose-Asparagin-Agar) Sporen oval, 0,7 bis 1,1 &, Breite mal 1,5 bis 2,0 &, Länge. Einige Spiralen sind offen, die Mehrzahl aber liegt geschlossen und kompakt. In einigen Zonen erscheinen die Spiralen kugelähnlich.
• Czapeks Saccharose: Schnelles klares Wachstum. Reichliches weißes Luftmycel in gelblichweißem bis olivgrauem Farbton. Kein Wachstum in dem Medium. Kein lösliches Pigment. Unterseite weiß, wird strohfarben. Oberflächenwachstum glänzend. Gelatine: Verflüssigung beginnt in 2 bis 3 Tagen. Vollständige Verflüssigung nach 10 bis 11 Tagen. Kein lösliches Pigment. Gelblichweiß gefärbt, flockiges Sediment.
• Glucose-Asparagin-Agar: Reichliche weiße Luftmycelbildung, wird grau. Kein lösliches Pigment. Glucose-Pepton-Agar : Mäßiges gelbes Wachstum. Grauweißes Luftmycel. Unterseite strohfarben. Kein lösliches Pigment.
• Glucosebrühe : Häutchen. Sinkt beim Rühren auf den Boden des Reagenzrohres. Kein lösliches Pigment. Oberflächenhäutchen in alter Kultur.
• Milch: 28'C: 7 Tage, keine Änderung; nach 14 Tagen, Ring bei pH 7,0; nach 15 bis 23 Tagen beginnende Koagulation und Peptonisierung; 23 Tage pH = 6,5, Koagulation nach 45 Tagen vollständig. 37°C: kein Wachstum.
• Kartoffelpfropf: Langsam. Spärliches, weißes Wachstum in 7 Tagen. Nach 14 Tagen schweres, graues Wachstum. Graues Luftmycel. Kartoffel wird dunkelbraun.
• Stärke-Agar : Lösliche Stärke: 4 Tage: Stärke hydrolysiert. Schweres `'Wachstum; weißes Luftmycel. Unterseite gelblichweiß bis strohfarben.
• Kartoffelstärke: 4 Tage: Stärke hydrolysiert. Schweres `'Wachstum; durchscheinendes, farbloses Wachstum wird grau bis grauweiß. Weißes Luftmycel.
• Nitrat-Agar: 2 Tage: schwache Reduktion zu Nitrit. 4 Tage: schwache Reduktion zu Nitrit. Glucose-Nähragar: Mäßiges farbloses Wachstum, reichliche Bildung von weißem Luftmycel. Unterseite schwach strohfarben. Kein Wachstum in dem Medium.
• Milch-Agar: Hydrolyse von Kasein nur unter Kolonien. Möhre: Sehr schweres weißes Wachstum.
• Citrate: Sehr spärliches Wachstum.
• Optimale Temperatur: 20 bis 26°C: Gutes Wachstum. 28°C: Sehr gutes Wachstum. 37°C: Kein Wachstum. 50'C: Kein Wachstum.
• Indol: Negativ.
• Tyrosin-Agar: Reichliche Bildung von weißem Luftmycel. Kein Pigment. 18 Tage: Strohfarbenes Pigment. 60 Tage: Dunkelbraunes lösliches Pigment.
• Glycerin-Nähr-Agar: Reichliche Bildung von weißem Luftmycel. Stroh- bis bernsteinfarbenes lösliches Pigment. Kein Wachstum in dem. Medium. Unterseite gelblichweiß.
• Czapeks Saccharose: Reichliches weißes Wachstum als Häutchen. Weißes Sediment am Boden des Rohres, haftet an der Rohrwandung, oben und unten Flüssigkeitsspiegel. Unterseite strohfarben.
• Cellulose: Kein Wachstum.
• Calciummalat: Mäßige Bildung von weißem Luftmycel. Mäßiges Wachstum in dem Medium. Kein lösliches Pigment. Unterseite nicht gefärbt.
• Kohlehydrate: Alkalische Reaktion, keine Gasbildung aus Adönit, Arabinose, Cellobiose, Dextrin, Dextrose, Galactose, Lactose, Laevulose, Maltose, Mannit, Mannose, Raffinose, Salicin-Rhamnose, Saccharose, Xylose.
• Obige Beschreibung der Novobiocin bildenden Mikroorganismen dient lediglich der Erläuterung für geeignete Stämme von Streptomyces spheroides, die bei der Herstellung von Novobiocin benutzt werden können. Die Erfindung ist nicht auf Mikroben beschränkt, welche dieser Beschreibung entsprechen, sondern erfaßt auch andere Arten von Streptomyces spheroides, welche Mutanten der beschriebenen Mikroben sind, die z. B. durch natürliche Auswahl erhalten oder durch mutierende Mittel, z. B. Bestrahlung mit Röntgenstrahlung, mit UV, 2,2-Dichlor-N-methyldiäthylaminhydrochloridu. dgl., erzeugt werden.
• Auf Grund der Tatsache, daß Streptomyces spheroides ein Saprophyt und psychrophil bis mesophil ist und auf organischen Medien kein lösliches Pigment produziert, außer auf einem Spezialmedium, welches stark tyrosinhaltig ist, ferner auf Grund der Tatsache, daß reichlich weißes oder farbloses Luftmycel entsteht, ist die am nächsten stehende Art, welche in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology (6. Ausgabe) beschrieben ist, Streptomyces albus.
• Neuere Beschreibungen verwandter Kulturen, die seit Veröffentlichung von Bergeys Manual erschienen sind, benennen Streptomyces globisporus, Streptomyces farinosus, Streptomyces longisporus und Streptomyces annulatus, die in dem Buch »Actinomycetes and their Antibiotics« von Waksman und Lechevalier beschrieben sind.
• Streptomyces spheroides unterscheidet sich von Streptomyces globisporus und Streptomyces farinosus darin, daß er dichte Spiralketten von Konidien erzeugt, während diese beiden Arten keine Spiralen erzeugen. - Spiralbildung oder fehlende Spiralbildung ist ein Kriterium für Streptomycesarten.
• Streptomyces spheroides unterscheidet sich von Streptomyces longisporus darin, daß er keine zylindrischen Sporen mit scharf geschnittenen Enden aufweist, welche für Streptomyces longisporus charakteristisch sind.
• Streptomyces spheroides unterscheidet sich von Streptomyces annulatus darin, daß er keine konzentrischen Wachstumsringe erzeugt, ein Merkmal von Streptomyces annulatus. Streptomyces spheroides unterscheidet sich von Streptomyces albus in zwei physiologischen Merkmalen. Streptomyces albus reduziert Nitrat zu Nitrit; Nitrite sind dagegen nach dem Wachstum von S. spheroides kaum nachweisbar. Auch die Eigenschaften des Wachstums der beiden Kulturen auf einem Kartoffelkeil weichen stark voneinander ab. S. spheroides erzeugt dichte Spiral-Konidien, häufig mit so dichten Windungen, daß sie dichte Kugeln oder Sporenballungen zu bilden scheinen. Dieses Merkmal ist bei nachfolgenden Kulturen von S. spheroides ständig reproduzierbar und so schlagend, daß es die Kultur von allen untersuchten S. albus-Kulturen deutlich unterscheidet.
• Novobiocin reagiert wie eine saure organische Verbindung und ist in alkalischen Lösungen, z. B. wäßrigen Lösungen der Alkalihydroxyde, -carbonate und -bicarbonate sowie in Methanol, Äthanol, n-Butanol, sec.-Butanol, Äthylacetat, Essigsäure, Dioxan, Aceton, Methyläthylketon, leicht löslich, unlöslich oder kaum löslich dagegen in Äther, Benzol, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylendichlorid, Wasser, Salzsäure. Es wird aus alkalischer Lösung durch Ansäuern ausgefällt.
• Novobiocin wird durch die beschriebenen Verfahren in zwei Kristallarten erhalten. Die eine Kristallart in Form von Rosetten hat einen Schmelzpunkt von etwa 152 bis 154°C; die andere Kristallart in Form flacher Nadeln schmilzt bei etwa 170 bis 172°C. Diese zuweilen gemeinsam anfallenden Kristallarten lassen sich mechanisch voneinander trennen.
• Novobiocin ist optisch aktiv und zeigt eine Drehung von [a]D = -27° (0,1 in n-Natriumhydroxydlösung); [a]ö = -44° (0,1 in Pyridin).
• Eine Lösung von Novobiocin in 0,1 n-Natriumhydroxyd zeigt eine charakteristische Ultraviolettabsorption mit einer Spitze bei etwa 307 mp, (El t 600). Eine Lösung von Novobiocin in 0,1 n-Salzsäure in wäßrigem Methanol zeigt auch eine charakteristische Ultraviolettabsorption mit einer Spitze bei etwa 324 m#t (Ei%m 390). Eine Lösung von Novobiocin in einer auf p$ 7 gepufferten Phosphatlösung hatte Hauptmaxima in den Ultraviolettabsorptionsspektren bei 304 mp@ (E;%_ 350).
• Das Inirarotabsorptionsspektrum von praktisch reinem amorphem oder submikrokristallinem Novobiocin, welches in einem Mineralöl (Nuj o1) suspendiert ist, wurde in einem Infrarotspektrophotometer, Modell 12 B Baird Associates, mit einem Chlornatriumprisma ermittelt; es zeigte mehrere charakteristische Spitzen, die ausgeprägteren haben folgende Frequenzen, ausgedrückt in Mikron: 5,8 bis 6,0 (breit), 6,10, 6,21, 6,30, 6,49, 6,63, 7,4 bis 7,6 (breite,Schulter), 7,78, 7,96, 8,27 (schwach), 8,60 (Schulter), 8,7 (Schulter), 9,13, 9,40, 10,0 bis 10,1 (breit),10,28,10,60 (breit), 12,0 bis 12,30 (breit), 12,60 bis 12,75 (breit), 13,07 und 13,39. Das Inirarotspektrum zeigt Fig. 1. Das für die Bestimmung des Spektrums benutzte amorphe oder submikrokristalline Novobiocin wurde aus kristallinem Novobiocin durch »Nornlalisierunga hergestellt. Hierzu wird eine Lösung von 1 g kristallinem Novobiocin in 100 ccm Aceton rasch mit 1 1 Petroläther versetzt, worauf sich amorphes Novobiocin aus der Lösung abscheidet. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit. Petroläther gewaschen und unter vermindertem Druck bei 100°C getrocknet.
• Praktisch reines, nach dieser Arbeitsweise normalisiertes Novobiocin zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum von Fig. 1. Fig.2 und 3 bringen das Infrarotabsorptionsspektrum der in Nadeln und in Rosetten kristallisierenden Formen zur Anschauung. Während die verschiedenen, nach obigen Angaben »normalisierten« Kristallformen verschiedene Absorptionsspektren aufweisen, wie aus Fig. 2 und 3 hervorgeht, haben die amorphen oder sub:-mikrokristallinen Produkte das Absorptionsspektrum von Fig. 1.
• Novobiocin besteht aus den Elementen Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff. Die Elementaranalyse von kristallinem Novobiocin ergibt folgende Zusammensetzung

  Kohlenstoff ................. 60,24; 60,26°/o

  Wasserstoff ................. 6,56; 6,49°/o

  Stickstoff . . . . . . . . . . . . . . . . 1.. 4,860/0

  Sauerstoff .................. 29,3 °/,

  Nach der Mikroanalyse ergibt sich für Novobiocin die Zusammensetzung C3o_32H34_42N2Olo-12* Novobiocin ist eine saure Substanz, die sich mit Basen zu Salzen umsetzt. Bei der Umsetzung mit 1 Äquivalent Natriumhydroxyd entsteht das Mononatriumsalz, bei Umsetzung mit 2 Äquivalent das Dinatriumsalz. Andere anorganische Basen bilden die entsprechenden Metallsalze. Umsetzung mit einer organischen Base, z. B. einem Amin, ergibt die entsprechenden Aminsalze. Novobiocin bildet so mit Methylamin das entsprechende Methylaminsalz.
• Die Acidität von Novobiocin ist ein Kriterium für dieses neue Antibioticum. Beim Titrieren von Novobiocin mit Natriumhydroxyd werden zwei basenbindende Gruppen festgestellt. Die erste zum Mononatriumsalz führende Bindung erfolgt bei einem pu von etwa 7,0 und hat ein pK von etwa 3,8. Die zweite Bindung findet bei einem pu von etwa 11,0 statt und zeigt ein p11 von etwa 9,4. Die potentiometrische Titration in einem Gemisch aus Wasser und Aceton (3:4) zeigte zwei saure funktionelle Gruppen, p,11 1/2 etwa 4,7, Äquivalentgewicht 653, und p112 1/2 etwa 10, Äquivalentgewicht 660 bis 680. Die Bestimmung der sauren Gruppen durch Ultraviolettabsorption ergab die Werte pul 1/2, 3,8 und p112 1/2, 9,4. Das Molekulargewicht von Novobiocin in einem azeotropen Gemisch aus Isopropanol und Wasser ist nach der ebullioskopischen Methode 592 ± 25.
• Kristallines Novobiocin hat eine mikrobiologische Aktivität von etwa 5000 Einheiten/mg nach den üblichen Schalenplattendiffusionsmethoden mit Bacillus megatherium ATCC 9885 bei Verwendung von praktisch reinem Novobiocin als Prüfobjekt.
• Novobiocin hemmt in erster Linie grampositive Erreger, ist aber auch gegen gramnegative Erreger wirksam. Erreger, deren Wachstum schon durch sehr niedrige Novobiocinmengen oder deren Salze gehemmt wird, sind unter anderem folgende: M. pyogenes var. albus, M. pyogenes var. aureus, Streptococcus pyogenes, Proteus vulgaris, Pasteurella multocide, Hemophilus pertusis, Pasteurella avicida, Diplococcus pneumoniae, Corynebact. diphtheriae intermedius, Corynebact. diphtheriae mitis, Corynebact. xerose, Corynebact. renale, Neisseria meningitidis, Sarcina lutea (VD), M. pyogenes aureus resistent gegen Aureomycin, M. pyogene aureus resistent gegen Streptomycin-Streptothricin, und M. pyogenes aureus resistent gegen Penicillin.
• Das Natriumsalz von Novobiocin hemmt bei der Prüfung mit einer agarhaltigen Verdünnung das Wachstum verschiedener Species von M. pyogenes var. aureus, M. pyogenes var. albus, Neisseria meningitidis (No. 274) und Sarcina lutea (VD) bei Konzentrationen unter 0,5 mg/ccm. Andere Mikroben werden durch Novobiocin oder dessen Salze in wechselndem Maße angegriffen.
• Novobiocin wird von Mäusen, Ratten und Hunden nach einer oder wiederholten oralen Verabfolgungen gut vertragen. In Mäusen beträgt 11D5, etwa 2,0 g/kg. Bei Ratten oder Hunden trat nach Tagesdosierungen von 0,2 g/kg während 90 bis 140 Tagen keine Toxizität ein. Novobiocin wird durch aerobe Gärung geeigneter wäßriger Medien unter den weiter unten beschriebenen Bedingungen mittels Stämmen von Streptomyces spheroides erzeugt. Wäßrige Medien, wie sie für die Erzeugung anderer Biotica im Gebrauch sind, eignen sich hierfür. Die Medien enthalten Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff und Stickstoff sowie anorganische Salze. Außerdem enthalten die Gärmedien Spurenmetalle, die für das Wachstum des Organismus notwendig und in zusammengesetzten Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff vorhanden sind.
• Im allgemeinen sind Kohlehydrate wie Zucker, z. B. Dextrose, Saccharose, Maltose, Lactose, Dextrin u. dgl., sowie Stärke geeignete Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff. Die genaue Menge der Kohlenstoffquelle, welche in dem Medium zu verwenden ist, hängt teilweise von den anderen Bestandteilen des Mediums ab; gewöhnlich sind etwa 1 bis 6 Gewichtsprozent Kohlehydrate, bezogen auf das Gewicht des Mediums, ausreichend. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln oder kombiniert verwendet werden.
• Eine Reihe von Stickstoffquellen, wie Caseinhydrolysate, papainangedautes Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Erdnußölmehl, lösliche Schlempebestandteile, Maisquellwasser, Natriumnitrat, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat u. dgl., werden leicht durch Streptomyces spheroides assimiliert und können in den Gärmedien zur Bildung des neuen Antibioticums verwendet werden. Im allgemeinen sind organische Stickstoffquellen, insbesondere Sojabohnenmehl und lösliche Schlempebestandteile, für die Erzeugung von Novobiocin sehr gut geeignet. Die verschiedenen organischen oder anorganischen Stickstoffquellen können entweder allein oder in Kombination miteinander, und zwar in Mengen von etwa 0,2 bis 6 Gewichtsprozent des wäßrigen Mediums, Verwendung finden.
• Der Zusatz von Natriumchlorid zu einem Medium, welches geeignete Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff enthält, ist in Mengen von etwa 0,1 bis 10/, für die Herstellung des neuen Antibioticums zweckmäßig. Im allgemeinen ist eine Natriumchloridmenge, die etwa 0,25 Gewichtsprozent des Nährmediums entspricht, sehr gut brauchbar.
• Beispiele für geeignete Medien für das Wachstum von Streptomyces spheriodes und Herstellung von Novobiocin sind folgende:

  Medium Nr. 1 Sojabohnenmehl . . . . . . . . . . . . . 20/,

  Chlornatrium . . . . . . . . . . . . . . . 0,250/0

  Dextrose . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 bis 3 °/o

  lösl. Schlempebestandteile .... 0,750 !,

  Medium Nr. 2 Maisquellwasser . . . . . . . . . . . . . 2 bis 6 °/,

  Dextrose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 bis 4 °/,

  Medium Nr. 3 lösliche Schlempebestandteile. 3 bis 6 °/,

  Dextrose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 bis 6 0/,

  Medium Nr. 4 lösliche Schlempebestandteile 3 bis 6 °/,

  Die Gärung mittels der Novobiocin erzeugenden Mikroben kann bei etwa 20 bis 37°C erfolgen; die Optimaltemperatur beträgt 24 bis 28°C. Der pg-Wert der Nährmedien für das Wachstum von Streptomyces spheroides und die Erzeugung des Antibioticums liegt in der Größenordnung von etwa 5,5 bis 9,0.
• Novobiocin wird durch Oberflächengärung und submerse Gärung erzeugt; bevorzugt wird die submerse Gärung. Kleinversuche werden zweckmäßig in der Weise ausgeführt, daß das Nährmedium in einen Kolben eingebracht und dieser nebst Inhalt durch Erhitzen auf 120-C sterilisiert, der Kolben mit einigen Sporen oder einem vegetativen Cellularwachstum eines Novobiocin erzeugenden Stammes von Streptomyces spheroides geimpft, der Kolbenhals mit Baumwolle lose verschlossen und die Gärung bei konstanter Temperatur von etwa 25°C auf einer Schüttelmaschine während etwa 2 bis 7 Tagen durchgeführt wird. Gärungen mit größeren Mengen werden vorzugsweise in Behältern vollzogen, die mit einem Rührwerk und einer Belüftungseinrichtung für das Gärmedium ausgestattet sind. Hierbei wird das Nährmittel in dem Behälter bereitet und durch genügend langes Erhitzen auf 120°C sterilisiert. Das sterilisierte Medium wird nach dem Abkühlen mit einer geeigneten Quelle eines vegetativen Cellularwachstums eines Novobiocin erzeugenden Stammes von Streptomyces spheroides beimpft. Die Gärung wird in 2 bis 7 Tagen unter Rühren und bzw. oder Belüften des Nährmediums unter Aufrechterhaltung der Temperatur auf etwa 24 bis 27'C vollzogen. Diese Arbeitsweise eignet sich besonders zur Herstellung des Antibioticums in großen Mengen.
• Wenn die Gärung submers erfolgt, kann ein geeignetes Antischaummittel in geringer Menge, z. B. Sojabohnenmehl, Ricinusöl, Schmalzöl, 10/, Octadecanol in Mineralöl oder ein substituiertes Oxazolin, welches unter dem Handelsnamen »Alkaterge Ca auf dem Markt ist, u. dgl., zugesetzt werden.
• Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Gärung zur Herstellung von Novobiocin. Beispiel 1 Ein Medium mit 2°/o Sojabohnenmehl, 1l)/, Dextrose, 0,25 °/o Chlornatrium und 0,750/, lösliche Schlempebestandteüe wurde mit Leitungswasser bereitet. Etwa 25 ccm Medium wurden in einen 75-ccm-Kolben eingebracht und durch Erhitzen auf 120°C während 20 Minuten sterilisiert. Das Medium wurde danach mit einer vegetativen Kultur von Streptomyces spheroides MA-319 (NRRL 2449) beimpft und der Kolben mit Baumwolle lose verschlossen. Diese wurde dann auf eine Schüttelmaschine mit einem Ausschlag von 3,8 cm bei 28°C für 6 Tage gebracht. Die vergorene Flüssigkeit wurde nach der Zylinderplattenmethode mit Bacillus megatherium ATCC 9885 als Prüfmikrobe geprüft. Die Aktivität wurde zu 600 Einheiten/ccm oder 30 meg/ccm Novobiocin ermittelt.
• Bei Vergären eines Mediums aus 2°/o Sojabohnenmehl, 30/, Dextrose, 0,250/, Chlornatrium und 0,750/, lösliche Schlempebestandteile wurde in der vergorenen Flüssigkeit eine Aktivität von 256 mcg/ccm festgestellt.
• Nach Beispiel 1 wurden weitere Versuche mit einer Gärdauer von 7 Tagen angestellt, wobei 3 Medien vergoren wurden: Erstens 4 °/o lösliche Schlempebestandteile, 5 °/o Dextrose; zweitens 2 °/o Maisquellwasser, 5 °/o lösliche Schlempebestandteile, 5 °/o Dextrose; drittens 2 °/o gemahlener Roggen, 5 °/o lösliche Schlempebestandteile, 5 % Dextrose. Folgende Aktivitätswerte wurden ermittelt: 511 mcg/ccm; 720 mcg/ccm; 740 mcg/ccm Novobiocin. Beispiel 2 Größere Mengen Novobiocin können durch submerse Gärung in Behältern folgendermaßen erzeugt werden: Eine Blake-Flasche mit 25 ccm eines sterilen wäßrigen Agarmediums aus 10/, Hefeextrakt, 10/, Dextrose, 0,120/, Na, H P 04, 0,0750/0 K HZ P 04, 01050/0 Mg S 04 . 7 HZ O, 2 °/o Agar in wäßriger Lösung wurde mit einer geringen Menge Kulturerde von Streptomyces spheroides MA-319 (NRRL 2449) beimpft und 4 bis 5 Tage bis zur ausreichenden Sporenbildung bei 26°C bebrütet.
• 20 ccm steriles Wasser wurden in die Blake-Flasche eingegossen und die Sporen zu einer Suspension verrieben. Etwa 5 ccm der Sporensuspension wurden in einen 2-1-Erlenmeyerkolben eingetragen, in dem sich 750 ccm eines sterilen wäßrigen Mediums aus 0,3 °/o Rindfleischextrakt, 1,00/, Casienhydrolysat, 100/, Dextrose, 0,50/, Chlornatrium, mit einem pH-Wert von etwa 7,2 befanden. Der Kolben wurde mit Baumwolle verschlossen und bei 26°C auf einer Rotationsschüttelmaschine 48 Stunden lang bebrütet.
• Die vegetative Kultur wurde dann in ein 189-1-Gärgefäß aus rostfreiem Stahl eingetragen, in dem sich etwa 95 bis 1131 sterilen Rindfleischextraktmediums der oben angegebenen Zusammensetzung befanden. Nach Zusatz einer 1 °/oigen Lösung von Octadecanol in Mineralöl als Antischaummittel in geringer Menge wurde das Medium bei 26°C während 48 Stunden bebrütet. Das Medium wurde hierbei geschüttelt und sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von etwa 84,961/min hindurchgeleitet.
• Ein Gärgefäß aus rostfreiem Stahl von etwa 7561 wurde dann mit etwa 3781 eines wäßrigen Mediums beschickt, das folgende Zusammensetzung hatte: 3°/o Sojabohnenmehl, 2 °/o Dextrose, 0,75 °/o lösliche Schlempebestandteile, 0,25()/, Chlornatrium.
• Das Medium hatte einen pH-Wert von etwa 7,1. Nachdem das Medium mit Dampf bei etwa 120°C während 30 Minuten sterilisiert und gekühlt war, wurde das Gärgefäß mit etwa 8,40/0 der vegetativen Impfkultur, die in dem 189-1-Gärgefäß nach obigen Angaben bereitet war, beimpft. Das Gut wurde dann bei 26°C unter Schütteln und 339,841/min Luftdurchtritt bebrütet. Nach 96 Stunden hatte die vergorene, Novobiocin enthaltende Flüssigkeit eine Aktivität von etwa 82 mcg/ccm.
• Die Konzentration der neuen antibiotischen Substanzen in den oben beschriebenen Gärmedien beträgt gewöhnlich etwa 30 bis 400 mcg/ecm; die Feststoffe der Gärflüssigkeiten zeigen im allgemeinen eine Aktivität von etwa 1 bis 2 mcg/mg Feststoff. Die aktiven Substanzen können gereinigt und durch mehrere Verfahren in reinerer Form gewonnen werden. Beispielsweise werden die antibiotischen Substanzen mittels n- oder sec.-Butanol aus dem alkalischen Gärmedium extrahiert. Andere Reinigungsverfahren, dienen der Gewinnung von Novobiocin in Kristallform. Danach wird das rohe Antibioticum durch Ausfällung aus alkalischer Lösung mittels Säuren, Chromatographie an Aluminiumoxyd und Adsorption an geeigneten Ionenaustauschharzen oder durch Kombination mehrerer dieser Verfahren gereinigt. Kristallnovobiocin läßt sich beispielsweise folgendermaßen gewinnen: Nach Filtrieren der ganzen Gärflüssigkeit bei einem pH-Wert von 9,0 wurden 2,27 kg Diatomeenerde-Filtrierhilfsmittel je 3781 der filtrierten Flüssigkeit zugesetzt. Sodann wurde mit Salzsäure bis auf einen pH-Wert von 2,0 langsam angesäuert. Nach 10 Minuten langem Schütteln wurde die Masse filtriert und der Filterkuchen mit Wasser gewaschen. In dem sauren Filtrat war kein Antibioticum nachweisbar. Die ausgefällten Feststoffe, ausschließlich des Filtrierhilfsmittels, hatten einen Reinheitsgrad von 0,2 bis 0,3 %.
• Der Filterkuchen der sauren Ausfällung wurde zweimal mit 85 °/oigem wäßrigem Methanol bei einem pH-Wert von 9,0 extrahiert, wobei annähernd ein Zehntel des ursprünglichen Volumens der Gärflüssigkeit für jede Extraktion benutzt wurde. Diese Extraktion lieferte insgesamt etwa 80 °/o der gesamten Bioaktivität der Gärflüssigkeit. Die Feststoffe hatten in Lösung einen Reinheitsgrad von 1 bis 1,5 °/a.
• Die wäßrige Methanollösung wurde auf etwa ein Zehntel des Volumens der ursprünglichen Methanollösung konzentriert. Das pu wurde auf 9,0 mit Ätznatron eingestellt und die Lösung zweimal mit gleichen Raumteilen n-Butanol extrahiert. Das scheinbare Verteilungsverhältnis bei einem pH-Wert von 9,0 beträgt etwa 40: 1. Die Feststoffe des Butanolextraktes hatten einen Reinheitsgrad von 4 bis 60/0.
• Der Butanolextrakt wurde auf ein Zehntel des ursprünglichen Volumens eingeengt und in 15 Raumteile Wasser, pH-Wert = 9,0, eingetragen. Danach wurde ein Filtrierhilfsmittel in einer Menge von 0,5 g je 3,781, bezogen auf das ursprüngliche Volumen der Gärflüssigkeit, eingetragen und der pH-Wert langsam durch Zuführung von Salzsäure auf 2,0 eingestellt. Die gesamte Bioaktivität wird hierbei auf dem Filtrierhilfsmittel niedergeschlagen und abfiltriert. Der Reinheitsgrad der Feststoffe, ausschließlich des Filtrierhilfsmittels, betrug etwa 10 bis 120/10.
• Der Kuchen wurde im Vakuum bei 40°C getrocknet, vermahlen und mit Petroläther verrieben (etwa 180 bis 400 ccm für die aus je 3,781 Gärflüssigkeit stammenden Feststoff), bis das Filtrat farblos war. Hierbei wurden 20 bis 250/, der Feststoffe ausgeschieden und die inaktiven öligen Gärungsprodukte, welche in der Masse verblieben waren, entfernt. Durch das Verreiben ging keine Bioaktivität verloren. Die verbleibenden Feststoffe hatten einen Reinheitsgrad von 12 bis 150/,.
• Der Kuchen wurde mit wasserfreiem Äthanol extrahiert, bis die Extrakte schwachhellgelb gefärbt waren. Die Extrakte wurden vereinigt und auf 15 bis 20 °/p Feststoffe mit etwa 40 000 mcg/ccm Bioassay konzentriert. Der Feststoff hatte einen Reinheitsgrad von 20 bis 300/, und 200 bis 300 mcg/mg Bioassay.
• Die konzentrierte Äthanollösung wurde an säuregewaschenem Aluminiumoxyd chromatographiert. Ein Aluminiumoxydverhältnis von 50:1, bezogen auf die Gesamtmenge an Feststoffen in der Beschickungslösung, muß zur Erzielung einer ausreichenden Reinigung angewandt werden. Die aktive Substanz passiert die Säule, während ein großer Teil der festen Fremdstoffe an der Säule zurückbleibt. Die A1203 Säule wurde zur Gewinnung von Novobiocin mit Äthanol eluiert. Etwa 95 °/o der Bioaktivität waren in dem 2,5- bis 3fachen Säulenleerraum.
• Das mit Bioassay bezeichnete Testverfahren ist weiter unten erläutert.

  Tabelle

  Volumen Bioassay

  Gesamteinheiten

  ccm

  Einh./CCM I mg/ccm mcg/mg

  Säulenbeschickung ...... 1000 44000 265 166 220 x 106

  Segment 1*) ............ 1000 92 2,5 37 0,46 x 106

  " 2 ............ 1000 8400 19,6 428 42 x 106

  " 3 ............. 1000 15200 31,3 484 76 x 106

  " 4 ............. 1000 12400 22,3 556 62 x 106

  " 5 .....ä....... 1000 7400 13,4 552 37 x 106

  " 6 ............. 1000 2600 4,5 604 13 x 106

  " 7 ............. 1000 900 1,3 690 4,5 x 106

  Mittel ................. I 7000 I 6700 I 13,2 I 504

  *) erste Farbe.

  A120,-Vol. = 8000 ccm; Säulenleerraum = 2600 ccm;

  Das Äthanoleluat der A1203 Säule wurde auf etwa 5 °/o Feststoffe konzentriert. Wasser wurde bis zur Trübung zugesetzt; hierfür wurde etwas mehr als die gleiche Raummenge benötigt; das Produkt wurde zur Auskristallisation des Antibioticums sich selbst überlassen. Die Kristallbildung verlief sehr langsam. Nach 5 Tagen waren noch bis zu 150/, der ursprünglichen Bioaktivität in der überstehenden Flüssigkeit. Rühren bzw. oder Temperaturänderung hat augenscheinlich auf die Geschwindigkeit der Kristallbildung wenig Einfluß. Die Novobiocinkristalle hatten etwa 500 bis 600 mcg/mg Bioassay.
• Der Kristallbrei wurde in wasserfreiem Aceton zu einer 30°/oigen Lösung aufgelöst, die mit Aktivkohle in der doppelten Gewichtsmenge des gelösten Kristallbreis behandelt wurde. Darauf wurde abfiltriert und mit Aceton wiederholt gewaschen, um die Lösung auf etwa 50/, Feststoffe zu verdünnen. Petroläther wurde bis zur Trübung zugesetzt und die Kristallbildung von Novobiocin abgewartet. 90 bis 9501'. der Bioaktivität wurden gewonnen; die Kristalle des Antibioticums zeigten 900 bis 1000 mcg/mg bei der Probe.
• Die Salze von Novobiocin lassen sich leicht durch Umsetzung desselben mit Basen herstellen. Die folgenden Beispiele erläutern die Salzbildung.
• Beispiel 3 Mononatriumsalz von Novobiocin Etwa 40 g Novobiocin wurden in 800 ccm Äthylacetat bei etwa 80°C gelöst. Nach Abkühlen auf etwa 25'C wurde eine Lösung von 3,43 g Natriummethoxyd in 34 ccm Methanol während 20 bis 30 Minuten zugesetzt. Der Niederschlag aus Novobiocin-Mononatriumsalzwurde abfiltriert, mit etwa 200 ccm Äthylacetat gewaschen und bei 70°C in 6 Stunden unter vermindertem Druck, schließlich bei 55°C in 24 Stunden unter vermindertem Druck getrocknet.
• Das Mononatriumsalz wurde dadurch zur Kristallisation gebracht, daß 1,1 g in 3 ccm Methanol gelöst, die klare Lösung mit 55 ccm Aceton bis zur Trübung verdünnt, die trübe Lösung mit einigen Kristallen Natriumnovobiocin beimpft und die Lösung bei Raumtemperatur etwa 4 Stunden bzw. bis zur Beendigung der Kristallbildung gerührt wurde. Die ausgefällten Kristalle des Monönatriumsalzes wurden mit Aceton gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Beispiel 4 Novobiocin-Spiramycinsalz Eine Lösung von 5 g Mononatriumnovobiocin in 50 ccm Wasser wurde unter Rühren mit einer Lösung von 4,5 g Spiramycinsulfat in 40 ccm Wasser, eingestellt auf pH 7, versetzt. Das Novobiocin-Spiramycinsalz fiel aus und wurde abfiltriert und unter vermindertem Druck getrocknet. Das feste Produkt war in Methanol, Amylacetat, Aceton löslich, in Äthylendichlorid teilweise löslich. Beispiel s Novobiocin-Negmycinsalz In eine Lösung von 5 g Neömycinsulfat in 50 ccm Wasser wurden unter Rühren 250 ccm einer 10o/oigen Lösung von Novobiocin in Wasser, p, 7, eingetragen. Das ausgefällte Novobiocin-Neomycinsalz wurde filtriert und unter vermindertem Druck getrocknet. Beispiel 6 Novobiocin-Dihydrostreptomycinsalz In eine Lösung von 5 g Dihydrostreptomycinsulfat in 50 ccm Wasser, pH 7, wurden unter Rühren 145 ccm einer l0o/jgen wäßrigen Lösung von Mononatriumnovobiocin eingebracht. Das ausgefällte feste Novobiocin-Dihydrostreptomycinsalz wurde abfiltriert und unter vermindertem Druck getrocknet. Beispiel ? Novobiocin-Streptomycinsalz Eine Lösung von 100g Mononatriumsalz von Novobiocin in 1 1 Wasser wurde filtriert. Das Filtrat wurde unter Rühren mit einer Lösung von 40 g Streptomycinsulfat in 40 ccm Wasser, eingestellt auf p$ 7 mit Natriumhydroxyd, versetzt. Der Niederschlag aus festem Novobiocin-Streptomycinsalz wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Beispiel 8 Calciumsalz von Novobiocin In eine Lösung von 10g Mononatriumnovobiocin in 200 ccm Wasser wurden unter Rühren 20 ccm 100/jge Chlorcalciumlösung, eingestellt auf p$ 10, unter Rühren eingetragen. Die erhaltene Aufschlämmung wurde weitere 30 Minuten gerührt, der Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet.
• 4 g von dem so erhaltenen festen Novobiocinsalz wurden in 40 ccm Methanol aufgelöst und mit 25 ccm Wasser versetzt. Die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das ausgefällte kristalline Calciumsalz wurde abfiltriert und getrocknet. Das Produkt enthielt 2,6 °/o Calcium und hatte nach Titration (pH 1/2 10,8 in Aceton-Wasser) ein Äquivalentgewicht von 669 und E1%", von 528 bei 307 m#t in Das Magnesiumsalz von Novobiocin wird nach den im letzten Beispiel für das Calciumsalz gebrachten Angaben durch Umsetzung von Magnesiumchlorid mit Natriumnovobiocin gewonnen.
• Nach der Verfahrensführung der Beispiele 4 bis 7 erhält man aus den sauren Salzen von Benzyltrimethylammonium, Chinin, Procain, Guanidin, Noformacin, N-Benzylß-phenyläthylamin und N,N-Dibenzyläthylendiamin die entsprechenden Novobiocinsalze.
• Die Salze des Novobiocins können auch nach anderen Verfahren gewonnen werden. Aminsalze erhält man durch Umsetzung von Novobiocin einer annähernd äquivalenten Menge des Amins in Äthylacetatlösung. Das hierbei ausfallende Aminsalz wird abfiltriert, mit Äthylacetat gewaschen und getrocknet. Nach dieser Arbeitsweise können die Novobiocinsalze von Cyclohexylamin, Chinin, N-Äthylpiperidin, Triäthylamin, Dicyclohexylamin, Äthylendiamin und Isobutylamin hergestellt werden.
• Ein anderes Herstellungsverfahren für die Salze bildet die Umsetzung von Novobiocin mit einer äquimolekularen Menge eines Amins in wäßriger Methanollösung und Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck. In dieser Weise sind die Novobiocinsalze von Arginin, Histidin und Lysin herstellbar.
• Novobiocin und dessen Salze sind wertvolle Antimikrobenmittel. Sie können beispielsweise zur Entfernung empfänglicher Mikroben aus pharmazeutischer Ausrüstung usw. oder zum Abtrennen bestimmter Mikroben aus Mikrobengemische enthaltenden Lösungen dienen. Novobiocin nebst Salzen eignet sich auch für die Behandlung von Tieren, die mit Mikroben infiziert sind, welche auf das neue Antibioticum ansprechen. So erwies sich Novobiocin als sehr nützlich bei der Behandlung der Mastitis von Kühen. Mastitissalbe mit 20 bis 100 mg Natriumnovobiocin auf 7,5 g sind hierfür brauchbar.
• Novobiocin sowie dessen Salze sind gegen penicillinresistente Staphylococcen, ferner gegen Streptococcen und Pneumococcen aktiv. Da die meisten bakteriellen Infektionen der Atmungsorgane auf diese Erreger zurückzuführen sind, kann Novobiocin zur Behandlung dieser Infektionen in der Humanmedizin angewandt werden. Hierfür wird das Natriumsalz oral in Form von Kapseln appliziert, die beispielsweise etwa 100 bis 500 mg Antibioticum bei einer Tagesdosierung von 1 bis 2 g enthalten. Eine geeignete Dosierung wird durch Einkapseln von 250 mg Mononatriumsalz in eine weiche Gelatinekapsel Nr.1 bereitet. Novobiocin und dessen Salze können auch in Form von Tabletten verabfolgt werden. Die Tabletten werden in der Weise hergestellt, daß man pulverförmiges Natriumnovobiocin mit einer geringen Menge einer 5o/oigen Lösung von Essigsäurephthalsäureester der Cellulose in Methanol-Aceton (50:50) herstellt, das Gut durch ein Sieb Nr. 8 granuliert, die körnige Masse trocknet, die getrockneten Körner durch ein Sieb Nr. 12 treibt und die Körner unter Zusatz von etwas Magnesiumstearat zu Tabletten komprimiert, die 250 mg Natriumnovobiocin enthalten.
• Novobiocin ist auch für die Behandlung und Kontrolle von Pflanzenkrankheiten anwendbar, z. B. von Meltau, der durch Xanthomonas phaseoli verursacht ist. Die Pflanzen werden mit einer wäßrigen Lösung besprüht, die etwa 100 Teile Natriumnovobiocin je Million enthält. Die Spritzmittel können verschiedene Netz- oder Verteilungsmittel und bzw. oder andere aktive Zusätze enthalten und in bekannter Weise hergestellt werden.
• Das Antibioticum Novobiocin ist auch unter der Bezeichnung »Cathomycin, Handelsname der Patentinhaberin, bekannt.
• Novobiocineinheiten werden auf die mikrobiologische Aktivität von praktisch reinem kristallinem Novobiocin bezogen; die mikrobiologische Aktivität von praktisch reinem kristallinem Nov obiocin wurde willkürlich mit 5000 Einheiten/mg angesetzt, bestimmt nach den Standardmethoden der Schalenplattendiffusion, unter Verwendung von Bacillus megatherium ATTC 9885 oder vorzugsweise Bacillus subtilis ATTC 12.432 als Testorganismus. Wenn dieser Stamm von B. subtilis als Testorganismus benutzt wird, läßt sich die Assay-Probe wie folgt durchführen: Eine Kultur von B. subtilis ATTC 12.432 wird in Gehirnfusion-Agar auf einem Neigungsboden (Difco Manual, 9. Ausgabe, S. 90/91) 24 Stunden bei 37°C kultiviert und dann bei 5°C für Perioden von nicht länger als einem Monat gelagert. Zur Sporenbildung wird Impfmaterial durch Zusatz von 5 ccm sterilem destilliertem Wasser zu einer frischen Kultur von B. subtilis bereitet. Die Zellen werden aseptisch von dem Neigungsboden abgeschabt, gut gemischt und in 50 ccm sterilem destilliertem Wasser in einem Erlenmeyerkolben üb°rtragen. 2 ccm Bakteriensuspension werden als Impfmaterial in eine Roux-Flasche eingetragen, in der sich ein Medium aus 3% Sojabohnenmehl, 0,2°;o NaCI, 0,4°/o lösliche Schlempebestandteile, 0,80/0 Dextrose und 2,00/0 Agar befinden. Nach 7tägigem Bebrüten bei 37°C wird das Bakterienwachstum in sterilem destilliertem Wasser (50 ccm) suspendiert und in 30 Minuten bei 65°C pasteurisiert. 4 ccm einer 1 : SO-Verdünnung dieser Sporensuspension wird je Liter Medium angesetzt, die 0,5 °/o Pepton, 0,3 °/o Rindfleischextrakt, 0,3 °/o Hefeextrakt und 1,5°/a Agar bei pH 5,9 bis 6,1 enthält. Das Saatmedium wird in Portionen von 15 ccm auf Petrischalen mit ebenem Boden verteilt.
• Sechs Zylinder aus rostfreiem Stahl werden auf den Saatagar gebracht. Drei Zylinder werden mit Standardlösung von 4 mcg (Microgramm Novobiocin/cm (äquivalent 20 Einheiten Novobiocin/ccm) und drei mit der unbekannten Lösung gefüllt, die auf annähernd die gleiche Potenz mit M/20-gepufferten Phosphatlösung, p$ 6,0, verdünnt ist. Man stellt eine Standardtageskurve mit reinem Novobiocin her, das auf verschiedene Konzentrationen von 2 bis 16 mg/ccm verdünnt ist. Nach 18stündigem Bebrüten bei 28°C werden die Durchmesser der erhaltenen Hemmungshöfe der unbekannten und der Standardlösungen auf jeder Platte exakt ausgemessen. Die Potenz der unbekannten Lösung wird nach einem Nomograph bestimmt, das von dem Empfänglichkeitsgrad bei verschiedenen Konzentrationen nach Maßgabe der Standardtageskurve ausgeht.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH: Verwendung von Streptomyces spheroides, z. B. des Stammes NRRL 2449, oder deren natürlichen oder künstlichen Mutanten zur Herstellung des Antibiotikums Novobiocin auf biologischem Wege unter den üblichen aeroben Bedingungen, Gewinnung des Antibioticums aus der Nährlösung in für Antibiotica bekannter Weise, Reindarstellung und gegebenenfalls Überführung mittels Basen in seine Salze.