<Desc/Clms Page number 1>
Verfahren zur Gewinnung von neuen antibiotischen Stoffen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung neuer therapeutischer Substanzen, die als Desmethyltetracyclinantibiotica bezeichnet werden und Desmethyltetracyclin, Chlordesmethyltetracyclin und Bromdesmethyltetracyclin sowie Epimere dieser Verbindungen umfassen.
Die erfindungsgemäss erhältlichen neuen Antibiotica werden bei einem Fermentationsverfahren unter Verwendung von Mutantenstämmen des Streptomyces aureofaciens erzeugt. Die neuen Antibiotica scheinen zwar bereits bekannten Gliedern der Tetracyclin-Reihe sehr nahe zu stehen, unterscheiden sich von diesen jedoch deutlich. Sie zeichnen sich durch ausgeprägte Stabilität sowohl unter alkalischen als auch unter sauren Bedingungen aus und sind den Tetracyclinen in dieser Hinsicht überlegen. Sie haben ähnliche antibiotische Wirksamkeit und können für die gleichen Zwecke und in der gleichen Weise verwendet werden wie die bereits bekannten Tetracycline.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Gewinnung der neuen Antibiotica Desmethyltetracyclin, Chlordesmethyltetracyclin, Bromdesmethyltetraeyclin und ihrer Epimere, welches darin besteht, dass man einen Desmethyltetracycline bildenden Stamm von Str. aureofaciens aerob in einem wässerigen Nährmedium züchtet, dessen Halogenionengehalt derart bemessen ist, dass es zur Bildung von vorherrschenden Mengen an Desmethyltetracyclin im wesentlichen chloridfrei ist,
während es zur Bildung von vorherrschenden Mengen an Chlordesmethyltetracyclin auf einen Gehalt von wenigstens 50 Teile/Million Chlorionen und zur Bildung von vorherrschenden Mengen an Bromdesmethyltetracyclin auf einen Gehalt von wenigstens 50 Teile/Million Bromionen und weniger als 50 Teile/Million Chlorionen eingestellt wird und dass man die gebildeten Desmethyltetracycline aus der Gärmaische gegebenenfalls abtrennt sowie, wenn gewünscht, durch Einstellung des pH-Wertes der konzentrierten Antibioticalösung auf 3 - 5 epimerisiert.
Jedes der bisher bekannten. durch Fermentation mittels Str. aureofaciens unter besonderen Bedingungen erzeugten Tetracycline, nämlich Tetracyclin, Chlortetracyclin und Bromtetracyclin, hat somit ein Gegenstück in der neuen Reihe der erfindungsgemäss erhältlichen Antibiotica. Unter Verwendung bestimmter Mutantenstämme von Str. aureofaciens, die weiter unten im einzelnen beschrieben werden sollen, kann eine antibiotische Substanz erzeugt werden, die dem Tetracyclin entspricht, eine andere, die dem Chlortetracyclin entspricht, und schliesslich eine weitere, die dem Bromtetracyclin analog ist, in Abhängigkeit von der Beschaffenheit des Nährmediums und andern Verfahrensbedingungen.
Gewöhnlich wird während des Fermentationsverfahrens auch etwas Tetracyclin, Chlortetracyclin und bzw. oder Bromtetracyclin gebildet, wobei die Mengenverhältnisse diesem Substanzen von dem Chlor- und bzw. oder Bromionengehalt des Mediums und dem verwendeten Stamm des Mikroorganismus abhängen. Durch sorgfältige Selektionen des Stammes von Str. aureofaciens ist es möglich, die Bildung dieser bekannten Tetracycline nahezu vollständig auszuschalten.
Die neuen erfindungsgemäss herstellbaren Antibiotica können, wie weiter unten beschrieben werden soll, in ähnlicher Weise in ihre Epimeren übergeführt werden wie die Tetracycline in die Quatrimycine.
Chemische Analysen sowie die chemischen und physikalischen Eigenschaften der neuen Verbindungen lassen erkennen, dass sie sich von den entsprechenden Tetracyclinen insofern wesentlich unterscheiden, als sie eine Methylgruppe weniger aufweisen und somit Desmethyltetracycline darstellen. Die hiebei in Betracht kommende Methylgruppe ist höchstwahrscheinlich diejenige, die in 6-Stellung an dem Naphthacenring der Tetracycline steht. Demgemäss kann das Tetracyclinanaloge der vorliegenden Erfin-
<Desc/Clms Page number 2>
dung als 4-Dimethyl-amino-l, 4, 4a, 5, 5a, 6, 11, 12a-octahydro-3, 6, 10, 12, 12a-pentaoxy-l, 11-dioxo- - naphthacen- (2)-carboxamid bezeichnet werden. Im Fall der Chlor- und Bromanalogen dürfte der Halogensubstituent in 7-Stellung stehen.
Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass die abgeleitete Struktur nicht durch eindeutige Synthese erwiesen ist und sich deshalb in Zukunft als irrtümlich erweisen kann.
Die neuen erfindungsgemässen Antibiotica werden von bestimmten Mutantenstämmen von Str. aureo- faeiens gebildet. Diese Stämme gehören unzweifelhaft der Species streptomyces aureofaciens an, da sie aus dem ursprUnglichen Stamm A-377 erhalten wurden, der von Dr. Duggar isoliert und bei den Northern Regional Research Laboratories in Peoria, Illinois, hinterlegt wurde, wo er die Registrierungs-Nummer NRRL 2209 erhielt. Mutationen hervorrufende Behandlung von A-377 mit mutagenen Mitteln, wie wiederholte Ultraviolettbestrahlung, Anwendung von Nicotin und Stickstofflost, wurde zur Entwicklung eines der Stämme angewandt ; verschiedene andere Stämme wurden durch spontane Mutation und durch Behandlung mit mutagenen Mitteln erhalten.
Alle diese Stämme, die die neuen Antibiotica in verschiedenen Mengenverhältnissen und unterschiedlicher Wirksamkeit erzeugen, weisen die allgemeine Charakteristik der Species Str. aureofaciens auf. Sowohl untereinander als auch von bereits beschriebenen Stämmen von Str. aureofaciens sind sie in erster Linie bezüglich der Pigmentation und ihrer Fähigkeit, die neuen Antibiotica zu erzeugen, verschieden. In den meisten Fällen wird ein rötlich-braunes Pigment festgestellt, wenn die Mikroorganismen auf üblichen Kulturmedien gezüchtet werden. Die Pigmentschattierungen reichen von pfirsich-lederfarben oder kupferbraun bis tiefbraun-mahagonifarben oder burgunderfarben, je nach dem besonderen Stamm und dem verwendeten Nährmedium.
Die Fähigkeit zur Erzeugung der neuen Antibiotica findet sich zwar ganz allgemein bei Stämmen mit dieser Art der Pigmentation, doch stellt die Erzeugung des Pigments und diejenige der neuen Antibiotica nicht notwendigerweise eine gemeinsame Eigenschaft dar. Alle untersuchten Stämme erzeugen etwas Chlortetracyclin und gewöhnlich etwas Tetracyclin, doch können die Mengenverhältnisse dieser Antibiotica je nach der Beschaffenheit des Fermentationsmediums, der Fermentationsbedingungen und des jeweils gewählten Stammes beträchtlich variieren. In einigen Fällen ist die Chlortetracyclin- und Tetracyclinbildung sehr gering, u. zw. in der Grössenordnung von einigen Prozent des gesamten bei der Fermentation gebildeten Antibioticums.
Die die neuen erfindungsgemässen Antibiotica bildenden Mutantenstämme besitzen die gleichen allgemeinen Charakteristika wie die die Tetracycline bildenden Stämme und unterscheiden sich untereinander in der gleichen allgemeinen Weise, wie dies für die Tetracyclinstämme bereits bekannt ist. Wenn auch viele Stämme von Str. aureofaciens der Öffentlichkeit durch die Culture Collections zugänglich sind und viele in Patentschriften und der wissenschaftlichen Literatur beschrieben wurden, sollen doch die folgenden Daten wiedergegeben werden, die zur Erläuterung der Art der Abweichung der neuen Stämme von dem ursprünglichen A-377-Stamm, der als NRRL 2209 zugänglich ist, dienen mögen.
Vergleich der Str. aureofaciens-Stämme S-604 und A-377 auf verschiedenen Medien.
Der Streptomyces aureofaciens Stamm S-604, der Chlordesmethyltetracyclin und Desmethyltetracyclin bildet, wurde mit Streptomyces aureofaciens Stamm A-377 (NRRL 2209) auf Grund der Beobachtung der Wachstumseigenschaften auf verschiedenen Medien, die bei 26 - 270C bebrütet wurden, verglichen.
Die in den nachfolgenden Tabellen verwendeten Farbbezeichnungen stammen aus "Color Harmony Manual, 3. Auflage, Container Corporation of America". Wo eine eindeutige direkte Übersetzung nicht möglich war, wurden die eng lichen Bezeichnungen in Klammern beigefügt.
EMI2.1
<tb>
<tb>
1. <SEP> Glycerin-Asparagin-Fleischextrakt-Agar
<tb> Glycerin <SEP> 1, <SEP> 00/0 <SEP>
<tb> L-Asparagin <SEP> 0, <SEP> 05% <SEP>
<tb> Fleischextrakt <SEP> 0, <SEP> 20/0 <SEP>
<tb> KHPC <SEP> 0, <SEP> 05% <SEP>
<tb> Bacto-Agar <SEP> I, <SEP> 50/0 <SEP>
<tb> Destilliertes <SEP> Wasser <SEP> q. <SEP> s.
<SEP> 100, <SEP> 0% <SEP>
<tb> pH <SEP> Einstellung <SEP> mit <SEP> 50% <SEP> figer <SEP> KOH <SEP> 7,0
<tb> pH <SEP> nach <SEP> der <SEP> Sterilisation <SEP> 7, <SEP> 1
<tb>
<Desc/Clms Page number 3>
EMI3.1
<tb>
<tb> Streptomyces <SEP> aureofaciens
<tb> Stamm <SEP> S-604 <SEP> Stamm <SEP> A-377
<tb> Wachstum <SEP> reichlich, <SEP> venezianischrot <SEP> mässig
<tb> Luftmycel <SEP> reichlich, <SEP> blassrosa <SEP> weiss, <SEP> einheitlich
<tb> (White <SEP> to <SEP> Rose <SEP> Grey)
<tb> Sporulation <SEP> schwach, <SEP> wird <SEP> reichlich <SEP> keine
<tb> Lösliches <SEP> Pigment <SEP> rötlichbraun <SEP> gelb
<tb> Unterseite <SEP> mahagonibraun <SEP> gelb <SEP> bis <SEP> lichtgelb
<tb> orangegelb
<tb> 2. <SEP> Dextrin-Czapek-Dox-Agar
<tb> Dextrin <SEP> 1, <SEP> 0% <SEP>
<tb> NaN03 <SEP> 0,2%
<tb> KHPC <SEP> 0, <SEP> 1% <SEP>
<tb> MgSO4.
<SEP> 7H2O <SEP> 0,05%
<tb> KCl <SEP> 0, <SEP> 05% <SEP>
<tb> FeSO4-7H2O <SEP> 0,001%
<tb> Bacto-Agar <SEP> 1,5%
<tb> Destilliertes <SEP> Wasser <SEP> q. <SEP> s. <SEP> 100, <SEP> 0% <SEP>
<tb> PH <SEP> nach <SEP> der <SEP> Sterilisation <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Streptomyces <SEP> aureofaciens
<tb> Stamm <SEP> S-604 <SEP> Stamm <SEP> A-377
<tb> Streptomyces <SEP> aureofaciens
<tb> Stamm <SEP> S-604 <SEP> Stamm <SEP> A-377
<tb> Wachstum <SEP> spärlich, <SEP> durchsichtig <SEP> sehr <SEP> reichlich
<tb> Luftmycel <SEP> keines <SEP> reichlich, <SEP> bleigrau
<tb> wasserklare <SEP> Oberfläche
<tb> Kügelchen
<tb> Sporulation <SEP> keine <SEP> reichlich
<tb> Lösliches <SEP> Pigment <SEP> keines <SEP> schwach, <SEP> blassgelb
<tb> Unterseite <SEP> pigmentlos <SEP> pigmentlos
<tb>
<Desc/Clms Page number 4>
EMI4.1
<tb>
<tb> 3.
<SEP> Maisquellwasser-Agar
<tb> Malsquellwasser <SEP> 0,4%
<tb> Saccharose <SEP> l, <SEP> 0% <SEP>
<tb> MgSO.7H2O <SEP> 0, <SEP> 025%
<tb> KILO. <SEP> 0, <SEP> 2% <SEP>
<tb> (NH4)2HPO4 <SEP> 0,2%
<tb> Bacto-Agar <SEP> 2, <SEP> 00 <SEP> ;, <SEP>
<tb> Leitungswasser <SEP> q. <SEP> s. <SEP> 100, <SEP> 0% <SEP>
<tb> PH <SEP> nach <SEP> der <SEP> Sterilisation <SEP> 6, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Streptomyces <SEP> aureofaciens
<tb> Stamm <SEP> S-604 <SEP> Stamm <SEP> a-377
<tb> Wachstum <SEP> sehr <SEP> reichlich <SEP> sehr <SEP> reichlich
<tb> Luftmycel <SEP> reichlich, <SEP> rötliches <SEP> Maul- <SEP> reichlich;
<SEP> biberbraun
<tb> wurfbraun <SEP> (Dk. <SEP> Rose <SEP> Taupe) <SEP> (Beaver <SEP> biber)
<tb> Spomlation <SEP> sehr <SEP> reichlich, <SEP> einheitlich <SEP> sehr <SEP> reichlich, <SEP>
<tb> einheitlich
<tb> Lösliches <SEP> Pigment <SEP> sehr <SEP> stark <SEP> tiefbraun <SEP> bis <SEP> hell <SEP> grünlich-gelb
<tb> tiefmahagonibraun
<tb> Unterseite <SEP> dunkles <SEP> Mahagonibraun <SEP> dunkelbraun
<tb> (Covert <SEP> Brown)
<tb>
<Desc/Clms Page number 5>
EMI5.1
<tb>
<tb> 4. <SEP> Andere <SEP> Nähnnedien
<tb> Streptomyces <SEP> aureofaciens
<tb> Stamm <SEP> S-604 <SEP> Stamm <SEP> A-377
<tb> Nähr-Agar <SEP> schwaches <SEP> Wachstum, <SEP> maulwurfbraun <SEP> mässiges <SEP> Wachstum <SEP> ; <SEP> kein
<tb> bis <SEP> dunkelbraun. <SEP> Kein <SEP> Luftmycel. <SEP> Luftmycel. <SEP> Unterseite <SEP> : <SEP> blaB- <SEP>
<tb> Unterseite <SEP> :
<SEP> maulwurfbraun. <SEP> Rôtlicb. <SEP> - <SEP> gelb. <SEP> Gelbes <SEP> bis <SEP> hell-braunbraunes, <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> lich-gelbes <SEP> lösliches <SEP> Pigment.
<tb>
Glukose-Asparagin-reichliches <SEP> Wachstum. <SEP> Kräftiges <SEP> Luft- <SEP> mässiges <SEP> Wachstum; <SEP> weisses
<tb> Fleischextrakt-Agar <SEP> mycel, <SEP> gefleckt <SEP> : <SEP> rötlichbraune <SEP> bis <SEP> Luftmycel, <SEP> das <SEP> mit <SEP> zunehgelbbraune <SEP> Farbtöne <SEP> (Rose <SEP> taupe <SEP> to <SEP> mender <SEP> Sporenbildung <SEP> allmähFawn <SEP> to <SEP> Camel). <SEP> Sporulation <SEP> : <SEP> reich-lieh <SEP> grau <SEP> wird. <SEP> Unterseite <SEP> : <SEP>
<tb> lich. <SEP> Unterseite; <SEP> maulwurfbraun. <SEP> hellgelb, <SEP> Hellgelbes, <SEP> lösliRötlichbraunes <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> ches <SEP> Pigment.
<tb>
Kartoffelschnitzel <SEP> sehr <SEP> reichliche <SEP> feuchte, <SEP> weiche, <SEP> sehr <SEP> reichliche <SEP> feuchte,
<tb> knötchenförmige <SEP> Kolonien, <SEP> dunkel-weiche, <SEP> knötchenförmige <SEP>
<tb> mahagonibraun <SEP> mit <SEP> einer <SEP> Spur <SEP> Pfir-Kolonien, <SEP> hell-melonengelb <SEP>
<tb> sichfarbe <SEP> (peach <SEP> tan). <SEP> Luftmycel <SEP> : <SEP> (light <SEP> melon <SEP> yellow) <SEP> bis
<tb> keines <SEP> bis <SEP> reichlich, <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> he11- <SEP> altrosa. <SEP> Spuren <SEP> von <SEP> Luftbraun <SEP> (camel) <SEP> werdend. <SEP> Reichliche <SEP> mycel, <SEP> kein <SEP> lösliches
<tb> Sporulation <SEP> in <SEP> Bereichen <SEP> kräftiger <SEP> Pigment.
<tb>
Luftmycelbildung. <SEP> Schokoladefarbenes
<tb> bis <SEP> schokoladebraunes <SEP> lösliches
<tb> Pigment.
<tb>
"Purple <SEP> milk" <SEP> (mit <SEP> einem <SEP> rötlich-mahagonifarbene <SEP> (slight <SEP> deep <SEP> schwache, <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> blassIndikator <SEP> zum <SEP> Anzeigen <SEP> red <SEP> mahagony) <SEP> ringförmige <SEP> Kolonie, <SEP> gelbe <SEP> ringförmige <SEP> Kolonie.
<tb> eines <SEP> sauren <SEP> oder <SEP> alkali- <SEP> Nur <SEP> geringfugige <SEP> PH-Änderung, <SEP> keine <SEP> Geringfügige <SEP> PH-Änderung,
<tb> sehen <SEP> PH <SEP> versetzte <SEP> ent-merkbare <SEP> Peptonisierung, <SEP> Zufolge <SEP> keine <SEP> merkbare <SEP> Peptonisierahmte <SEP> Milch) <SEP> Diffusion <SEP> von <SEP> löslichem <SEP> Pigment <SEP> rung <SEP> innerhalb <SEP> von
<tb> wird <SEP> eine <SEP> schwach <SEP> alkalische <SEP> Farb- <SEP> 15 <SEP> Tagen,
<tb> reaktion <SEP> vorgetäuscht.
<tb>
Auf allenagarnährböden mit Ausnahme von Dextrin-Czapek-Dox-Agar sowie bei Schrägkulturen auf Kartoffelnährböden bildet Str. aureofaciens Stamm S-604 in charakteristischer Weise tief gefärbte Kolonien und ein charakteristisches lösliches rötlichbraunes Pigment.
<Desc/Clms Page number 6>
EMI6.1
<tb>
<tb>
5. <SEP> Mikroskopische <SEP> Beobachtungen
<tb> Streptomyces <SEP> aureofaciens
<tb> Nährmedium <SEP> Stamm <SEP> S-604 <SEP> Stamm <SEP> A-377
<tb> Mycel <SEP> Sporen <SEP> Mycel <SEP> Sporen
<tb> Glycerin-Asparagin-gekrümmt, <SEP> kontlnuierlich, <SEP> kugel-bis <SEP> eiförmig, <SEP> gekrümmt, <SEP> kontinuierlich, <SEP> kugel-bis <SEP> eiförmig, <SEP>
<tb> Fleischextrakt-Agar <SEP> verzweigt, <SEP> Durchmesser <SEP> Durchmesser <SEP> l, <SEP> 5p <SEP> verzweigt, <SEP> Durchmesser <SEP> Durchmesser <SEP> 1, <SEP> 5J1.
<tb>
0, <SEP> 8 <SEP> bis <SEP> > 1,0 <SEP> bis <SEP> 2,0 <SEP> <SEP> 0,7 <SEP> bis <SEP> > 1,0 <SEP> bis <SEP> 2,0
<tb> Maisquellwasser-Agar <SEP> gekrümmt, <SEP> kontinuierlich, <SEP> kugel- <SEP> bis <SEP> elförmig, <SEP> gekrümmt, <SEP> kontinulerlich, <SEP> kugel-bis <SEP> eiförmig,
<tb> verzweigt, <SEP> Durchmesser <SEP> Durchmesser <SEP> l, <SEP> 5p <SEP> verzweigt, <SEP> Durchmesser <SEP> Durchmesser <SEP> l, <SEP> 5p <SEP>
<tb> 0, <SEP> 8ü <SEP> bis <SEP> > 1,0 <SEP> bis <SEP> 2,0 <SEP> 0,8 <SEP> bis > 1,0 <SEP> bis <SEP> 2,0
<tb>
EMI6.2
<Desc/Clms Page number 7>
Zur Erläuterung der Abweichungen bezüglich der Färbung bei den verschiedenen Stämmen von Str. aureofaciens, die die erfindungsgemässen neuen Desmethyltetracycline bilden, wurden vier ausgewählte Stämme auf Maisquellwasser-Agar gezüchtet und folgende Beobachtungen gemacht :
EMI7.1
<tb>
<tb> Maisquellwasser-Agar <SEP> (AP) <SEP> : <SEP>
<tb> 4tägige <SEP> Züchtung <SEP> bei <SEP> 270C.
<tb>
Stamm <SEP> Einzelkolonien <SEP> Massenwachstum
<tb> S-604 <SEP> ML <SEP> tiefrot-mahagonibraun <SEP> tiefrot-mahagonibraun <SEP>
<tb> S1071 <SEP> kupferbraun <SEP> dunkel- <SEP> bis <SEP> rötlich
<tb> mahagonibraun
<tb> V-62 <SEP> breiter <SEP> Randbereich <SEP> hellkupferbraun
<tb> pfirsichfarben <SEP> (peach
<tb> tan), <SEP> wird <SEP> gegen <SEP> den
<tb> Mittelpunkt <SEP> der <SEP> Kolonie
<tb> zu <SEP> hellkupferbraun
<tb> B-740 <SEP> dunkelweinfarben <SEP> burgunderfar <SEP> ben <SEP>
<tb> (Dark <SEP> Wine)
<tb>
Eine verhältnismässig einfache Arbeitsweise der Selektion eines Stammes von Str. aureofaciens, der die neuen, erfindungsgemäss herstellbaren Antibiotica bildet, besteht in der Auswahl eines solchen Stam- mes von Str. aureofaciens, der dunkel-kastanienbraune Kolonien ausbildet, wenn er auf Maisquellwasser-
Agar-Medium gezüchtet wird.
Von diesen Kolonien werden Impfkulturen bereitet, die dann bei der Fermentation nach den weiter unten angegebenen Beispielen 1 und 2 Verwendung finden. Am Ende der Gärperiode wird eine Probemenge der Gärbrlihe auf einen pH-Wert von etwa 1, 5 angesäuert, um das Antibioticum löslich zu machen und zur Erzielung einer klaren wässerigen Lösung filtriert. Ein oder zwei
Tropfen des Filtrats werden auf einen Papierstreifen aufgebracht und nach üblichen chromatographischen Entwicklungsmethoden chromatographiert. Mit 0, 3 molarem wässerigem Phosphatpuffer von PH 3 gesättigtes Butanol wird als Lösungsmittel verwendet. Die Papierstreifen werden in absteigender Chromatographie mit der Lösungsmittelphase dieses'Gemisches entwickelt.
Die Lage der Flecken, die den erfindungsgemäss erhältlichen Antibioticis entsprechen, lässt sich leicht durch die Fluoreszenz unter ultraviolettem Licht ermitteln. Eine andere und noch empfindlichere Methode besteht darin, die Streifen auf eine Agarplatte aufzubringen, die mit gegenüber dem Antibioticum empfindlichen Mikroorganismen, z. B. Bacillus cereus oder Bacillus subtilis, beimpft ist, und diese Platten zu bebrüten. In den Bereichen, die den Antibioticaflecken entsprechen, zeichnen sich Hemmzonen ab. Der Vergleich der Flecken mit Vergleichsproben der reinen Antibiotica und die Rf-Werte, die weiter unten angegeben werden, liefern eine Grundlage für den Nachweis der neuen Antibiotica in der Gärmaische und eine halbquantitative Basis zur Bestimmung der vorhandenen Menge.
Eine Erläuterung dieser Arbeitsweise soll an Hand der Fig. 1 gegeben werden, aus welcher die Auftrennung und Identifizierung von verschiedenen Tetracyclinen einschliesslich der erfindungsgemäss erhältlichen Produkte aus einer Mischung mit Hilfe der Papierstreifenchromatographie ersichtlich ist. Die Zeichnung stellt einen Papierstreifen 1 dar, auf den eine kleine Menge einer Antibioticumlösung, die Tetracyclin, Chlortetracyclin, Desmethyltetracyclin und Chlordesmethyltetracyclin enthält, bei Punkt 2 aufgebracht wurde. Der Gesamtgehalt an antibiotisch wirksamen Substanzen der bei Punkt 2 aufgebrachten Lösung betrug 30 y, ausgedrückt als Tetracyclin. Die Papierstreifen wurden sodann, wie oben beschrieben, entwickelt. Nach einer gewissen Zeitspanne wurden die Streifen im ultravioletten Licht betrachtet, wobei die in der Zeichnung wiedergegebenen Ergebnisse beobachtet wurden.
Die Lösungsmittelfront hatte die durch die ausgezogene Linie 3 dargestellte Lage erreicht. Die Tetracyclin-Komponente des Antibioticum-Gemisches hatte Punkt 5 erreicht und das Chlortetracyclin war bis Punkt 7 gewandert. Das neue Antibioticum Desmethyltetracyclin war bis Punkt 4 gewandert und das Antibioticum Chlordesmethyltetracyclin wurde bei Punkt 6 gefunden. Die Rf-Werte dieser Antibiotica sind ebenfalls in der Zeichnung wiedergegeben. Der Rf-Wert ist definiert als der Quotient aus dem Abstand des Fleckens von
<Desc/Clms Page number 8>
dem Ausgangspunkt 2 und dem Abstand der Lösungsmittelfront 3 von dem Ausgangspunkt 2 und ist selbstverständlich immer kleiner als 1.
Verschiedene Lösungsmittelsysteme können zur Erzielung einer Reihe von Rf-Werten für ein bestimmtes Antibioticum verwendet werden ; diese Daten sind für die Identifizierung der Antibiotica und ihre Unterscheidung von andern Antibiotica von grossem Wert.
Die Rf-Werte einer Reihe von Tetracyclinen, Quatrimycinen und der neuen erfindungsgemäss erhält-
EMI8.1
EMI8.2
<tb>
<tb> Antibioticum <SEP> Äthylacetat <SEP> PH <SEP> 4, <SEP> 7 <SEP> 90 <SEP> : <SEP> 10 <SEP> -Chloroform <SEP> - <SEP> Buta <SEP> nol/ <SEP>
<tb> Citiat-phosphat-wässerige <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> m <SEP> H <SEP> PC <SEP> +
<tb> Puffer <SEP> (McElvain) <SEP> 0, <SEP> l% <SEP> Trichloressigsäure <SEP> PH <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP>
<tb> Chlortetracyclin <SEP> 0, <SEP> 76-0, <SEP> 80 <SEP> 0,61
<tb> Bromtetracyclin <SEP> 0, <SEP> 76-0, <SEP> 80 <SEP> 0, <SEP> 61 <SEP>
<tb> Tetracyclin <SEP> 0, <SEP> 46-0, <SEP> 47 <SEP> 0, <SEP> 20 <SEP>
<tb> Quatrimycin <SEP> 0, <SEP> 14-0, <SEP> 16 <SEP> 0, <SEP> 12 <SEP>
<tb> Chlorquatrimycin <SEP> 0, <SEP> 27-0, <SEP> 28 <SEP> 0, <SEP> 33 <SEP>
<tb> Bromquatrimycin <SEP> 0, <SEP> 27-0,
<SEP> 28 <SEP> 0, <SEP> 33 <SEP>
<tb> Oxyqua <SEP> trimycin <SEP> 0, <SEP> 00-0, <SEP> 06 <SEP> 0, <SEP> 11 <SEP>
<tb> Chlordesmethyltetracyclin <SEP> 0, <SEP> 68-0, <SEP> 72 <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP>
<tb> Desmethyltetracyclin <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP>
<tb> Epichlordesmethyltetracyclin <SEP> 0, <SEP> 25-0, <SEP> 27 <SEP> 0, <SEP> 20 <SEP>
<tb> Epidesmethyltetracyclin <SEP> 0, <SEP> 09 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP>
<tb>
Mehrere Stämme von Str. aureofaciens, die die neuen Antibiotica bilden, wurden bei der American Type Culture Collection, Washington, D. C., und unter der Bezeichnung ATCC 12 551, 12552, 12553 und 12 554 registriert.
Selbstverständlich können auch Mutanten, die ebenfalls die neuen Antibiotica bilden und die nach üblichen Methoden aus diesen Stämmen erhalten werden, sowie Varianten dieser Stämme verwendet werden. Möglicherweise können manche dieser. Mutanten unter günstigen Bedingungen höhere Ausbeuten an dem einen oder andern der neuen Antibiotica bilden. Solche Mutanten können gewisse Abweichungen der allgemeinen morphologischen Charakteristika zeigen, wie dies auch bei den verschiedenen Stämmen der Species Str. aureofaciens der Fall ist.
Einer der hauptsächlichsten Vorteile der Desmethyltetracycline gegenüber den bisher bekannten Tetracyclinen besteht in ihrer erhöhten Stabilität gegen Säuren und Alkalien. Die Unbeständigkeit des Tetracyclins gegenüber Säuren und die Unbeständigkeit des Chlortetracyclins gegenüber Alkali sind allgemein bekannt. Chlortetracyclin besitzt in einer mit einem Natriumcarbonatpuffer gepufferten wässerigen Lösung bei PH 9, 85 bei 230C eine Halbwertszeit von 29, 2 Minuten. Im Gegensatz dazu verliert Chlordesmethyltetracyclin innerhalb von 24 Stunden unter den gleichen Bedingungen nicht mehr als 6% seiner Wirksamkeit. Tetracyclin wird in weniger als 5 Minuten in ln-Schwefelsäure bei 1000C vollständig zerstört.
Demgegenüber verliert Chlordesmethyltetracyclin bei 100 C nach 15 Minuten in In-Schwe-
EMI8.3
digkeit des Tetracyclins gegenüber Säuren und die Unbeständigkeit des Chlortetracyclins gegenüber Alkali die Anwendung dieser wertvollen Substanzen in vielen Fällen begrenzt oder vollkommen ausschliesst.
Auf Grund der wesentlich grösseren Stabilität der neuen Antibiotica ist die Herstellung vieler pharmazeutischer Produkte möglich, die mit den Tetracyclinen nicht in zufriedenstellender Weise zubereitet werden können. Die erhöhte Stabilität ermöglicht auch die Verbesserung der Gewinnungs- und Reinigungsverfahren, da stärker saure bzw. alkalische pH-Bereiche und höhere Temperaturen angewandt werden können und die Wirksamkeit verschiedener Stufen bei den Verfahren infolgedessen gesteigert werden kann.
Chemische Analysen hochgereinigter Proben von Chlordesmethyltetracyclin stimmten mit der berechneten empirischen Formel C H Cl0 innerhalb der experimentellen Fehlergrenze überein. Die
<Desc/Clms Page number 9>
Kuhn-Roth-Methode zur Bestimmung von Methylgruppen ergab einen ausserordentlich niedrigen Wert, der erkennen liess, dass in 7-Stellung des Naphthacenringes keine Methylgruppe vorhanden ist. Die Bezeichnung Chlordesmethyltetracyclin erscheint daher gerechtfertigt.
Der Vergleich der Ultraviolett- und Infrarotabsorptionsspektren der Produkte und der verschiedenen Tetracycline liefert eine weitere Bestätigung für diesen Sachverhalt.
Der Schmelzpunkt von Chlordesmethyltetracyclin in Form der freien Base beträgt bei der Messung auf der Heizbank 170 - 1750C unter Zersetzung. Der Schmelzpunkt von Chlortetracyclin liegt bei 168-169 C. Desmethyltetracyclin als freie Base schmilzt bei 170 - 1770C unter Zersetzung, wohingegen Tetracyclin auf der Heizbank nach Kofler bei 160 - 1680C schmilzt.
Weitere Vergleiche zwischen Chlortetracyclin und Chlordesmethyltetracyclin führten zu folgenden Ergebnissen : Chlordesmethyltetracyclin hat einen pKa-Wert von 4, 45 in Dimethylformamid/Wasser (50/50). Chlortetracyclin hat in demselben System einen Wert von 4, 50. Die optische Drehung von Chlordesmethyltetracyclin in 0, 03 normaler Salzsäure bei einer Konzentration von 0, 5% betrug [a]= = -2610, von Chlortetracyclin dagegen-2430. Die Desmethyltetracycline sind offenbar stärker wasserlöslich als die entsprechenden Tetracycline. So lösen sich beispielsweise etwa 45 mg Chlordesmethyltetracyclin-hydrochlorid in 1 ml Wasser gegenüber etwa 14 mg Chlortetracyclin/ml Wasser.
Die antibakteriellen Aktivitäten der Tetracycline und Desmethyltetracycline sind weitgehend ähnlich, weisen jedoch bestimmte Unterschiede auf, wie aus der folgenden Tabelle ersehen werden kann.
In dieser Tabelle werden die Konzentrationen von Chlortetracyclin und Chlordesmethyltetracyclin verglichen, die erforderlich sind, um die Hälfte der maximalen Wachstumshemmung innerhalb von 4 bis 48 Stunden bei verschiedenen Mikroorganismen zu bewirken, ausgedrückt in y Antibioticum/ml Lösung.
Niedrigere Werte entsprechen wirksamerer Wachstumshemmung.
Tabelle I
EMI9.1
<tb>
<tb> Antibioticum
<tb> Chlortetracyclin <SEP> Chlordesmethyltetracyclin <SEP>
<tb> Mikroorganismus <SEP>
<tb> Zeit <SEP> 4 <SEP> 8 <SEP> 24 <SEP> 48 <SEP> 4 <SEP> 8 <SEP> 24 <SEP> 48
<tb> Staphylococcus
<tb> aureus <SEP> A <SEP> TCC <SEP> 6538P <SEP> 0, <SEP> 041 <SEP> 0, <SEP> 072 <SEP> 0, <SEP> 57 <SEP> 4, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 065 <SEP> 0, <SEP> 094 <SEP> 0, <SEP> 41 <SEP> 0,68
<tb> Staphylococcus
<tb> albus <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> 20, <SEP> 5 <SEP> > 50, <SEP> 0 <SEP> > 50, <SEP> 0 <SEP> 16, <SEP> 5 <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP> > 50, <SEP> 0 <SEP> > 50, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Escherichia <SEP> col1 <SEP> 0,12 <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 10, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 16 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 0,66 <SEP> < 1, <SEP> 56
<tb> > 0, <SEP> 8 <SEP>
<tb> Salmonella
<tb> gallinarum <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 74 <SEP> 4,65 <SEP> 37, <SEP> 0 <SEP> 0,
<SEP> 4 <SEP> 0,56 <SEP> 1. <SEP> 06 <SEP> 1,1
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> < 0, <SEP> 025 <SEP> 0, <SEP> 035 <SEP> 0,15 <SEP> 1,1 <SEP> < 0, <SEP> 015 <SEP> 0, <SEP> 039 <SEP> 0, <SEP> 077 <SEP> 0,19
<tb> Pseudomonas
<tb> aeruginosa <SEP> 0, <SEP> 31 <SEP> 0, <SEP> 56 <SEP> 6, <SEP> 3 <SEP> 35, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 94 <SEP> 1,3 <SEP> 4, <SEP> 3 <SEP> 6, <SEP> 7 <SEP>
<tb> Streptococcus
<tb> pyogenes <SEP> ss
<tb> haemolyticus <SEP> 11, <SEP> 5 <SEP> 43, <SEP> 0 <SEP> > 50, <SEP> 0 <SEP> > 50,0 <SEP> 14, <SEP> 4 <SEP> 41, <SEP> 0 <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Proteus <SEP> vulgar1s <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP> 0, <SEP> 56 <SEP> 9, <SEP> 2 <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP> 0,62 <SEP> 1,12 <SEP> 1, <SEP> 38 <SEP> 4,4
<tb> Escherichia <SEP> coli
<tb> ATCC9637 <SEP> 0, <SEP> 54 <SEP> 1, <SEP> 18 <SEP> 6,6 <SEP> 34, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 43 <SEP> 0,67 <SEP> 0,
<SEP> 97 <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 10>
Aus den in der obigen Tabelle wiedergebebenen Werten geht hervor, dass die Aktivität des Chlortetracyclins nach vier Stunden im allgemeinen etwas grösser ist. Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass nach längerem Stehenlassen der Lösungen das bakterielle Wachstum im Fall des Chlortetracyclins wieder auftritt, wogegen es in denjenigen Lösungen,. die Chlordesmethyltetracyclin enthalten, noch allgemein gehemmt wird. Dieser Umstand ist auf die grössere Stabilität des letztgenannten Antibioticums zurückzuführen. Entsprechende Ergebnisse werden beim Vergleich von Tetracyclin mit Desmethyltetracyclin und Bromtetracyclin mit Bromdesmethyltetracyclin beobachtet. Ferner wurde gefunden, dass die Desmethyltetracycline dem Oxytetracyclin unter den gleichen Versuchsbedingungen beträchtlich überlegen sind.
Die Desmethyltetracycline wurden ausserdem bei Versuchen in vivo mit den Tetracyclinen verglichen und es wurde gefunden, dass keine merklichen Unterschiede in der antibakteriellen Aktivität der Desmethyltetracycline und der entsprechenden Tetracyclin-Analoga bestehen. Diese neuen Antibiotica können daher zur Behandlung der gleichen Krankheiten und in der gleichen Weise wie die Tetracycline dienen.
Die Ultraviolett-Absorptionsspektren der Tetracycline und Desmethyltetracycline sind einander sehr ähnlich. Die Fig. 2 der beigefugten Zeichnung zeigt einen Vergleich zwischen dem Ultraviolettabsorptionsspektrum des Chlortetracyclins und des Chlordesmethyltetracyclins bei gleicher Konzentration. Daraus wird ersichtlich, dass die Form der Kurven praktisch die gleiche ist, wobei jedoch eine geringe Abweichung des Chlordesmethyltetracyclin-Absorptionsspektrums in der Gegend von 260 mli zu beobachten ist.
EMI10.1
der Konzentration, bei welcher die Proben gemessen wurden, auf 1% berechnet. Alle Proben wurden in 0, In-Schwefelsäurelösung gemessen.
EMI10.2
EMI10.3
<tb>
<tb> Max. <SEP> Min. <SEP> Max. <SEP> Min. <SEP> Max.
<tb>
Antibioticum <SEP> m <SEP> m <SEP> m <SEP> m <SEP> m
<tb> E1 <SEP> cm1% <SEP> E1 <SEP> cm1% <SEP> E1 <SEP> cm1% <SEP> E1 <SEP> cm1% <SEP> E1 <SEP> cm1% <SEP>
<tb> 1cm <SEP> -1cm <SEP> -1cm <SEP> -1cm <SEP> -1cm
<tb> Chlortetracyclinhydrochlorid <SEP> 209 <SEP> 368 <SEP> 135 <SEP> 302 <SEP> 356 <SEP> 265 <SEP> 288 <SEP> 242 <SEP> 343 <SEP> 228
<tb> Epichlortetracyclin-NH, <SEP> 170 <SEP> 368 <SEP> 100 <SEP> 302 <SEP> 332 <SEP> 254 <SEP> 290 <SEP> 242 <SEP> 342 <SEP> 228
<tb> Tetracyclinhydrochlorid <SEP> 305 <SEP> 355 <SEP> 182 <SEP> 299 <SEP> 393 <SEP> 268 <SEP> 191 <SEP> 232 <SEP> 289 <SEP> 217
<tb> Epitetracyclin <SEP> NH4 <SEP> 290 <SEP> 355 <SEP> 140 <SEP> 299 <SEP> 326 <SEP> 254 <SEP> 200 <SEP> 232 <SEP> 275 <SEP> 216
<tb> Desmethyltetracyclin,
<SEP> neutral <SEP> 292 <SEP> 353 <SEP> 169 <SEP> 298 <SEP> 395 <SEP> 268 <SEP> 202 <SEP> 232 <SEP> 299 <SEP> 217
<tb> Epidesmethyltetracyclinhydrochlorid <SEP> 310 <SEP> 355 <SEP> 162 <SEP> 299 <SEP> 367 <SEP> 255 <SEP> 228 <SEP> 232 <SEP> 306 <SEP> 217
<tb> Chlordesmethyltetracyclinhydrochlorid <SEP> 249 <SEP> 368 <SEP> 160 <SEP> 299 <SEP> 362 <SEP> 268 <SEP> 270 <SEP> 238 <SEP> 357 <SEP> 227
<tb> Epichlordesmethylterracyclinhydrochlorid <SEP> 242 <SEP> 368 <SEP> 130 <SEP> 300 <SEP> 348 <SEP> 254 <SEP> 289 <SEP> 238 <SEP> 346 <SEP> 227
<tb>
<Desc/Clms Page number 11>
In den übrigen Figuren der beigefügten Zeichnungen werden die Infrarotabsorptionsspektren verschie- dener der neuen erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen wiedergegeben.
Fig. 3 stellt das Infrarotab- sorptionsspektrum von Chlordesmethyltetracyclin-hydrochlorid und Fig. 4 eine Gegenüberstellung der
Infrarotabsorptionsspektren von Tetracyclin als freier Base und Desmethyltetracyclin als freier Base dar.
Daraus lässt sich neben den Übereinstimmungen eine Reihe von deutlichen Unterschieden ersehen. Fig. 5 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum von Epichlordesmethyltetracyclin-hydrochlorid und Fig. 6 das Ab- sorptionsspektrum von Epidesmethyltetracyclin-hydrochlorid. Diese Kurven wurden mit einem selbstauf- zeichnenden Infrarotspektrophotometer Perkin-Elmer Modell 21, an den Antibiotica in fester Phase, die mit Kaliumbromid zu einer Tablette gepresst waren, erhalten.
Für die GehaltsprUfung der Tetracycline wurden bereits verschiedene Arbeitsweisen entwickelt. Einige derselben können nach geeigneter Modifikation zur Bestimmung der Desmethyltetracycline angewandt werden. Die fluorometrische Bestimmung für Chlortetracyclin beruht auf einer Zunahme der Fluoreszenz, die auf die Bildung eines Isochlortetracyclins unter alkalischen Bedingungen zurückzuführen ist. Die zu bestimmende Probe wird in einem alkalischen Phosphatpuffer gelöst und die Fluoreszenz der Lösung wird zum Zeitpunkt 0 (unmittelbar nach der Herstellung der Lösung) und erneut nach Stehenlassen zur Isomerisation in einem Fluorophotometer bestimmt. Die Zunahme der Fluoreszenz entspricht der vorhandenen Chlortetracyclinmenge.
Die Anwesenheit von Chlordesmethyltetracyclin in der Lösung kann jedoch den Chlortetracyclinnachweis stören und demgemäss zu einem überraschend niedrigen Chlortetracyclinwert führen. Eine zuverlässigere Methode zur Bestimmung von Chlortetracyclin in Gemischen mit Chlordesmethyltetracyclin beruht darauf, dass das alkalische Abbauprodukt des Chlortetracyclins bei 380 mji keine Absorption zeigt. Die zu untersuchende Mischung wird in einer mit Carbonat gepufferten wässerigen Lösung von PH 10 gelöst und es wird die Veränderung der Absorption bei 380 mil nach 30minütigem Stehenlassen (etwa das Dreifache der Halbwertzeit des Chlortetracyclins) gemessen. Vor dem alkalischen Abbau weisen sowohl Chlortetracyclin als auch Chlordesmethyltetracyclin eine Absorption auf, die nach der Abbaubehandlung jedoch nur noch von Chlordesmethyltetracyclin gezeigt wird.
Die verminderte Absorption ist ein Mass für das in der Probe ursprünglich vorhandene Chlortetracyclin.
Eine spezifische Gehaltsprüfung fur Chlordesmethyltetracyclin in Gegenwart anderer Tetracyclinantibiotika beruht auf der sogenannten Hiscox-Methode : Durch Behandlung mit ln-Salzsäure während 15 Minuten bei 100 C werden alle Tetracycline ausser Chlordesmethyltetracyclin zerstört. Ein Anteil der so behandelten Probe wird dann während 15 Minuten bei 1000C mit 6n-Salzsäure zur Zerstörung des Chlordesmethyltetracyclins behandelt. Der Chlordesmethyltetracyclin-Gehalt wird durch Messung der Abnahme der spektrophotometrischen Absorption bei 368 mu oder der Zunahme bei 430 mu, die durch die Behandlung mit der stärkeren Säure hervorgerufen wird, und Vergleich mit einem Standard berechnet.
Ein nur zwei Komponenten, beispielsweise die zwei Glieder eines epimeren Paares, enthaltendes Gemisch kann spektrophotometrisch bestimmt werden. Die spektrophotometrischen Absorptionen werden bei zwei Wellenlängen bestimmt und das Verhältnis dieser Absorptionen wird zwischen den bekannten Werten für die reinen Verbindungen linear interpoliert. Auf diese Weise kann die prozentuale Zusammensetzung des Gemisches ermittelt werden.
Bromdesmethyltetracyclin kann ganz einfach durch Ermittlung des Bromgehaltes nach üblichen Mikroanalysenmethoden bestimmt werden.
Wie oben erwähnt, kann Bromdesmethyltetracyclin als hauptsächliches Antibioticum bei der Gärung durch Einstellung des Halogengehaltes des Gärmediums erhalten werden. Das wässerige Nährmedium soll gewöhnlich wenigstens 50 Teile/Million Bromionen enthalten und der Chlorionengehalt soll so niedrig wie möglich gehalten werden, u. zw. bei weniger als etwa 50 Teilen/Million. Vorzugsweise soll das Medium etwa 100 - 1500 Teile/Million Bromionen und weniger als etwa 10 Teile/Million Chlorionen enthalten. Der Bromionengehalt kann mittels jedes beliebigen wasserlöslichen Bromsalzes, z. B. Kaliumbromid, das die Bromionen für den Verbrauch bei der biologischen Synthese des Antibioticums liefert, eingestellt werden.
Bromdesmethyltetracyclin hat praktisch die gleiche antibakterielle Aktivität wie Chlordesmethyltetracyclin und kann für die gleichen Zwecke und in der gleichen Weise wie letzteres angewandt werden.
Es ist nicht erforderlich, Bromdesmethyltetracyclin von den andern, gleichzeitig gebildeten Antibiotica zu trennen, da ein Gemisch aus verschiedenen Desmethyltetracyclinen für viele Zwecke brauchbar ist. So kann beispielsweise das fermentierte Nährmedium eingeengt und direkt auf Grund seines antibiotischen Gehaltes verwendet werden. Eine andere Verwendungsweise besteht darin, die Gärbrühe anzusäuern, das Mycel und die unlöslichen Bestandteile abzufiltrieren, danach zu neutralisieren und einzu-
<Desc/Clms Page number 12>
engen, wodurch ein trockenes Pulver erhalten wird, das man Tierfuttermitteln beimischen kann. Die gemischten Antibiotica eignen sich zur Anregung des Wachstums vieler Tiere.
Die Abtrennung des Bromdesmethyltetracyclins von den andern, in der GärbrUhe enthaltenen Anti- biotica kann auf mehreren, an sich bekannten Wegen erreicht werden. So zerstört beispielsweise die Behandlung mit Säure das Tetracyclin und die Behandlung mit einem Alkali Chlor- und Bromtetracyclin in der Gärmaische. Aus den so erhaltenen Lösungen kann das Bromdesmethyltetracyclin durch Verteilungs- chromatographie unter Verwendung einer mit Diatomeenerde beschickten Säule gewonnen werden. Mit- tels eines Gemisches aus Chloroform und Butanol bei einem pH-Wert von etwa 2 kann man die Antibiotica aus der Diatomeenerde eluleren. Bromdesmethyltetracyclin tritt vor Desmethyltetracyclin aus der
Säule aus und kann aus dem Eluat gewonnen werden.
Auch durch Anwendung der Craig-Gegenstromverteilungstechnik kann man Bromdesmethyltetracyclin als antibiotische Einzelkomponente abtrennen.
Die erfindungsgemässen Epidesmethyltetracycline können als Isomere der Desethyltetracyc1ine angesehen werden. Die strukturellen Unterschiede beruhen offenbar auf einer Umlagerung der Desmethylminogruppe am C,-Kohlenstoffatom.
Die Desmethyltetracycline können durch einfaches Einstellen der Wasserstoffionenkonzentration einer konzentrierten Lösung des Antibioticums auf einen pH-Bereich von vorzugsweise 3,0 bis 5, 0 und Stehenlassen der Lösung, bis die Isomerisation ein Gleichgewicht erreicht hat, in ihre isomeren Formen übergeführt werden. Die Hauptbedingungen, die bei der Umwandlung der Desmethyltetracycline in ihre Isomeren eingehalten werden müssen, sind Konzentration, Wasserstoffionenkonzentration, Zeit und Temperatur.
Am zweckmässigsten wird die Isomerisation bei Zimmertemperatur durchgeführt, obwohl bei höheren Temperaturen eine höhere Umwandlungsgeschwindigkeit erreicht wird. Der pH-Wert soll vorzugsweise im Bereich von etwa 3, 0 bis 5, 0 liegen. Auch ausserhalb dieser Bereiche und selbst in destilliertem Wasser erfolgt Epimerisation bis zu einem gewissen Grad, doch ist die Geschwindigkeit dann sehr niedrig.
Die Konzentration des Antibioticums in der wässerigen Lösung soll so hoch wie möglich sein, um grössere Epimerisationsgeschwindigkeiten zu erzielen. Eine vollständige Gleichgewichtseinstellung erfordert bei 250C etwa 24 Stunden, doch können unter speziellen Bedingungen auch in wesentlich ktirzerer Zeit brauchbare Ergebnisse erhalten werden. Die besten Ergebnisse werden aber gewöhnlich durch Stehenlassen der Lösungen während einer Woche oder mehr erzielt. Das Gleichgewicht stellt sich in den meisten Fällen offenbar bei etwa 50% ein, d. h. etwa die Hälfte des Desmethyltetracyclins ist beim Gleichgewicht in sein Epimer übergeführt.
Da die Konzentration ein wesentlicher Faktor zur Erzielung hoher Ausbeuten in kurzen Zeitspannen darstellt, soll ein Lösungsmittelsystem gewählt werden, in dem Desmethyltetracyclin in höchstmöglichen Konzentrationen löslich ist. Derartige Lösungsmittelsysteme sollen zur Einstellung eines pH-Wertes innerhalb des bevorzugten Bereiches gepuffert werden.
Die erfindungsgemässen Epimere können aus der wässerigen Lösung in der gleichen Weise gewonnen werden wie die Tetracycline. Wenn sich auch in vitro und in vivo eine etwas geringere antibakterielle Aktivität als die Desmethyltetracycline aufweisen, so sind sie doch bei der Behandlung von durch Bakterien hervorgerufenen Krankheiten immer noch in hohem Masse brauchbar.
Es wurde weiterhin gefunden, dass die Desmethyltetracycline Salze und Komplexe der gleichen Art und in der gleichen Weise bilden wie die Tetracycline. Bei der Behandlung mit Säuren mit einem PHWert von weniger als etwa 4 werden die Säuresalze gebildet. Die freie Base kann bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 4 bis 6 erhalten werden und bei pH-Werten von über 6 werden Salze mit Basen, z. B.
Calciumsalz, gebildet. Die Salze des Epimeren bilden sich in entsprechender Weise.
Die folgenden Beispiele erläutern das im Rahmen der vorliegenden Erfindung angewandte Gärverfahren.
Beispiel l : Ein geeignetes Nährmedium für die Herstellung von Impfkulturen kann mit folgenden Substanzen zubereitet werden.
EMI12.1
<tb>
<tb>
Saccharose <SEP> 30 <SEP> g/1
<tb> (NH4) <SEP> 2S04 <SEP> 2 <SEP> g/1
<tb> CaCOg <SEP> 7 <SEP> g/1
<tb> Corn <SEP> Steep <SEP> Liquor <SEP> 16, <SEP> 5 <SEP> ml/l <SEP>
<tb>
Der PH-Wert des so zubereiteten Mediums beträgt etwa 6, 8. Ein Anteil von 8 ml wird in ein Gärrohr von etwa 20 cm gegeben und 20 Minuten bei 1200C sterilisiert. Das sterilisierte Medium wird dann mit 0, 5 ml einer wässerigen Sporensuspension eines Stammes von Str. aureofaciens beimpft, der zur Chlordesmetnyitetracyclinbildung fähig ist, beispielsweise mit S-604, wobei die Suspension etwa 40 bis
<Desc/Clms Page number 13>
60 Millionen Sporen/ml enthält. Das beimpfte Medium wird bei 28 C 24 Stunden auf einer Schüttelvor- richtung mit Hin- und Herbewegung bei 110 Schwingungen/Minute bebrütet.
Ein typisches, für die Erzeugung von Chlordesmethyltetracyclin geeignetes Nährmedium ist folgendermassen zusammengesetzt :
EMI13.1
<tb>
<tb> Maisstärke <SEP> 55 <SEP> g/l
<tb> CaCO3 <SEP> 7 <SEP> g/l
<tb> (NH4) <SEP> 2S04 <SEP> 5 <SEP> g/l
<tb> NH4 <SEP> CI <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> FeSO4. <SEP> 7H2O <SEP> 40mg/1
<tb> MnS04. <SEP> 4H20 <SEP> 50 <SEP> mg/l
<tb> ZnS04. <SEP> 7H20 <SEP> 100 <SEP> mg/l
<tb> CoCl. <SEP> 6H <SEP> O <SEP> 5 <SEP> mg/l
<tb> Corn <SEP> Steep <SEP> Liquor <SEP> 30 <SEP> g/l
<tb> Baumwollsamenmehl <SEP> 2 <SEP> g/l
<tb> Schmalzöl <SEP> 2,0% <SEP> V/V
<tb>
Eine Beschränkung des Chlorionengehaltes dieses Mediums führt zu einer Zunahme der Desmethyltetracyclinmenge auf Kosten der Chlordesmethyltetracyclinerzeugung.
Beispiel 2 : Eine Fermentation, bei der sowohl Desmethyltetracyclin als auch Chlordesmethyltetracyclin erzeugt wurden, wurde mit einem folgendermassen zubereiteten Medium in Schüttelkolben durchgeführt.
EMI13.2
<tb>
<tb>
Corn <SEP> Steep <SEP> Liquor <SEP> 30 <SEP> g/1
<tb> Schmalzöl <SEP> 2% <SEP> V/V
<tb> Maisstärke <SEP> 55 <SEP> g/l
<tb> Baumwollsamenmehl <SEP> 2 <SEP> g/l
<tb> CaCO3 <SEP> 7 <SEP> g/l
<tb> (NHSO <SEP> 5 <SEP> g/l
<tb> NH4Cl <SEP> 1,5g/l
<tb> FeSO4. <SEP> 7H2O <SEP> 40mg/l
<tb> ZnSO4.7H2O <SEP> 100 <SEP> mg/l
<tb> MnS0. <SEP> 4H <SEP> 0 <SEP> 50 <SEP> mg/l
<tb> CoCI. <SEP> 6HO <SEP> 5 <SEP> mg/l
<tb>
EMI13.3
120VCrilisiert und mit, l ml der gemäss Beispiel 1 hergestellten Impfkultur beimpft. Nach 120stündigem Bebruten bei 26 C auf einer Rundschüttelvorrichtung (186 Umdr/min) wurde die Maische auf ihren Gehalt geprüft. Sie enthielt nicht mehr als etwa 70 y/ml Chlortetracyclin und etwa 450 γ/ml Desmethyltetra- cyclin und 900 y/ml Chlordesmethyltetracyclin.
Beispiel 3 : Tankfermentation.
In einem Versuchstank von 40 1 Inhalt wurde eine Fermentation im wesentlichen nach der in Beispiel 2 beschriebenen Arbeitsweise durchgeführt. Das Medium wurde nach der Zubereitung 25 Minuten bei 125 C sterilisiert und mit einer Impfkultur des Stammes S-604 beimpft, der, wie in der USA-Patentschrift Nr. 2, 482, 055 beschrieben, hergestellt worden war. Die Gärung wurde unter kontinuierlichem Rühren bei einer Temperatur von 280C während der ersten 24 Stunden und von 250C bis zur Beendigung nach 135 Stunden geführt. Sterile Luft wurde während der ersten 16 Stunden mit einer Geschwindigkeit von 0,3 1/1 und Minute und 0, 5 1/1 und Minute bis zur Ernte eingeleitet.
Die folgenden Beispiele erläutern die Gewinnung, Reinigung und Trennung der Antibiotica :
Beispiel 4 : a) Reinigung von Chlordesmethyltetracyclin und Desmethyltetracyclin.
25, 8 I der wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellten Gärbrühe wurden mit 200 ml konzentrierter Salzsäure zur Einstellung des PH- Wertes auf 1, 5 versetzt. Die so behandelte Brühe wurde nach Vermi- schen mit 2, 8 kg Filterhilfe filtriert und ergab 16, 3 1 Filtrat. Der Filterkuchen wurde mit 25 l Wasser von etwa 500C erneut aufgeschlämmt und auf ein PH von 1, 5 eingestellt. Nach 30minütigem Rühren wurde der wiederaufgeschlämmte Kuchen abfiltriert und das Filtrat mit dem ursprünglich erhaltenen Filtrat vereinigt, wobei insgesamt 42, 3 l erhalten wurden. Das vereinigte Filtrat wurde mit 6, 76 kg Natriumchlorid versetzt und viermal mit 15% seines Volumens an Butanol extrahiert.
Die vereinigten Extrakte wurden durch Filtrieren geklärt und im Vakuum bei 25-30 C auf ein Endvolumen von 6 l eingeengt.
<Desc/Clms Page number 14>
b) Chromatographische Trennung von Chlordesmethyltetracyclin und Desmethyltetracyclin.
Das gemäss a) erhaltene Butanolkonzentrat wurde zur Weiterverarbeitung in zwei gleiche Teile geteilt. Einer derselben wurde auf 900 ml, der andere auf 610 ml im Vakuum eingeengt. Die Konzentrate wurden abfiltriert und mit 50%iger Natronlauge auf einen pH-Wert von 2 eingestellt.
Das fUr die chromatographische Trennung verwendete Lösungsmittelsystem wurde durch Sättigen eines Gemisches aus 80% Butanol und 20% Chloroform mit Wasser, das mit Salzsäure auf PH = 2 eingestellt war, hergestellt. Es wurden Glasrohre von etwa 15 cm Durchmesser verwendet, die mit 2,8 kg einer mit Säure gewaschenen Diatomeenerde (Celite ?. 545) gefüllt waren. Die Säulen wurden vor der Verwendung mit der wässerigen Phase des Lösungsmittelsystems behandelt.
Die zwei Butanolkonzentrate wurden langsam auf getrennte Säulen aufgegossen. Die Säulen wurden dann mit der Lösungsmittelphase mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von etwa 10 l/Stunde eluiert. In beiden Fällen wurden jeweils 500 ml-Fraktionen aufgefangen, deren Antibioticumgehalt durch Papierstreifenchromatographie bestimmt wurde.
Bei dem 900 mI-Ansatz enthielten die Fraktionen 6-17 das Chlordesmethyltetracyclin und Chlortetracyclin und die Fraktionen 24 - 40 Desmethyltetracyclin und Tetracyclin. Bei dem 610 ml-Ansatz enthielten die Fraktionen - 18 das Chlordesmethyltetracyclin und Chlortetracyclin und die Fraktionen 19 - 31 das Desmethyltetracyclin und Tetracyclin. c) Gewinnung von Chlordesmethyltetracyclin aus den eluierten Fraktionen.
Die gemäss b) erhaltenen Chlordesmethyltetracyclin enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, wobei ein Volumen von etwa 12 1 erhalten wurde. Nach Zugabe eines gleichen Volumens Wasser wurde das Gemisch im Vakuum auf 1810 ml wässeriger Lösung eingeengt. Der pH-Wert des Konzentrats wurde durch Zugabe von Salzsäure auf 2, 3 - 1, 9 eingestellt. Das angesäuerte Konzentrat wurde zweimal mit 180 ml Chloroform gewaschen, filtriert und im Vakuum auf ein Volumen von 360 ml eingeengt. Der pH-Wert
EMI14.1
trocknet und ergab 18, 56 g amorphes Chlordesmethyltetracyclin-hydrochlorid mit einem Wirkstoffgehalt von 550 y/mg. d) Gewinnung von Desmethyltetracyclin aus den eluierten Fraktionen.
Die gemäss b) erhaltenen Desmethyltetracyclin enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und ergaben ein Volumen von 14 l. Nach Zugabe eines gleichen Volumens Wasser wurde das Gemisch im Vakuum bei 240C auf ein Volumen von 565 ml wässeriger Lösung eingeengt. Der pH-Wert des Konzentrats wurde durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure auf l, 65 eingestellt und die Lösung zweimal mit 55 ml Chloroform gewaschen. Die gewaschene Lösung wurde filtriert und der pH-Wert mit 50% figer Natronlauge auf 5, 8 gebracht. Nach 3stündigem Stehenlassen bei Zimmertemperatur und 15stündigem Stehenlassen bei 40C wurden die erhaltenen Kristalle abfiltriert und das Produkt mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei 400C getrocknet.
Man erhielt eine Ausbeute von 4,7 g rohen neutralen Desmethyltetracyclins mit einem Wirkstoffgehalt von 880 y/mg, berechnet als Tetracyclin-hydrochlorid, was einer Gesamtausbeute von 73% aus dem wässerigen Konzentrat entspricht. e) Kristallisation von Chlordesmethyltetracyclin-hydrochlorid aus Aceton-Äther.
18,56 g des gemäss c) erhaltenen gefriergetrockneten Chlordesmethyltetracyclins wurden in ein Gemisch aus 55 ml Aceton, 7, 4 ml Wasser und 3, 7 ml konzentrierter Salzsäure eingerührt. Die Lösung wurde filtriert und die Festsubstanzen wurden zweimal mit insgesamt 55 ml Aceton, das l, 85 ml Wasser enthielt, gewaschen. Die vereinigten Filtrate, deren pH-Wert 0,8 betrug, wurden mit 55 ml Äther behandelt. Das Gemisch wurde angeimpft und 18 Stunden bei Zimmertemperatur ständig gerührt, wonach die sich bildenden Kristalle abfiltriert wurden. Das Produkt wurde mit einem Gemisch aus Aceton, Wasser und Äther, dann mit Aceton und schliesslich mit Äther gewaschen und bei 400C im Vakuum getrocknet.
Man erhielt eine Ausbeute von 4,74 g kristallinem Chlordesmethy1tetracyclin-hydrochlorid mit einem Wirkstoffgehalt von 1090 y/mg, was einer Ausbeute von 50, 6% in dieser Stufe entsprach. Das Produkt enthielt 11% Chlortetracyclin. f) Kristallisation von Chlordesmethyltetracyclin-hydrochlorid aus Butanol/Äthoxyäthanol.
50,4 g des gemäss c) hergestellten gefriergetrockneten Chlordesmethyltetracyclins mit einem Wirkstoffgehalt von 700 y/mg wurden in 22,5 ml Äthoxyäthanol aufgeschlämmt und die so erhaltene Mischung wurde mit insgesamt 205 ml Butanol versetzt. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 11 ml konzentrierter Salzsäure auf 0,8 eingestellt und das Gemisch 51 Stunden unter Rühren stehengelassen. Die gebildeten Kristalle wurden abfiltriert, mit einem Gemisch aus 90% Butanol und 10% Äthoxyäthanol und dann mit Chloroform gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt eine Ausbeute von 30,6 g Chlordesmethyltetracyclin-hydrochlorid mit einem Wirkstoffgehalt von 1053 y/mg, entsprechend einer Ausbeute von 84%.
<Desc/Clms Page number 15>
g) Umkristallisieren von Chlordesmethyltetracyclin unter Zerstörung des Chlortetracyclins.
1 g des wie in e) beschrieben hergestellten Chlordesmethyltetracyclins mit einem Wirkstoffgehalt von 1000 y/mg wurde in 3 ml eines Gemisches aus 90% Butanol und 10% Äthoxyäthanol aufgeschlämmt und zur Einstellung des PH-Wertes auf 10, 4 mit 3 ml Triäthylamin versetzt. Das nicht vollständig gelöste Gemisch wurde 24 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen, um das etwa vorhandene Chlortetracyclin zu zerstören, wonach konzentrierte Salzsäure zur PH- Wert-Erniedrigung auf 0, 8 zugesetzt und das Gemisch 24 Stunden gerührt wurde. Das kristalline Produkt wurde abfiltriert, mit einem Gemisch aus 90% Butanol und 10% Äthoxyäthanol, dann mit Chloroform gewaschen und bei 400C im Vakuum getrocknet.
Man erhielt eine Ausbeute von 0,36 g Chlordesmethyltetracyclin-hydrochlorid mit einem
Wirkstoffgehalt von 1228 y/mg, das etwa 2, 5% Chlortetracyclin enthielt, was einer Ausbeute von 40% entsprach.
Die folgenden Beispiele erläutern die Umwandlung der Antibiotica in verschiedene Verbindungsformen. h) Chlordesmethyltetracyclin-hydrobromid.
1 g Ammoniumchlordesmethyltetracyclin wurde in 20 ml Wasser gelöst und die Lösung mit 0,6 ml 48% tiger Bromwasserstoffsäure zur Einstellung des PH-Wertes auf 1, 6 versetzt. Das Gemisch wurde unter Rühren bei Zimmertemperatur 18 Stunden stehengelassen, wonach lange, nadelförmige Kristalle von Chlordesmethyltetracyclin-hydrobromid auftraten. Das Produkt wurde abfiltriert, mit 6 ml Wasser, das mit Bromwasserstoffsäure auf PH 2,2 eingestellt worden war, gewaschen und 5 Stunden bei 440C im Va- kaum getrocknet.
Man erhielt eine Ausbeute von 750 mg Chlordesmethyltetracyclin-hydrobromid.
EMI15.1
i) Herstellung des Ammoniumsalzes von Chlordesmethyltetracyclin.
100 mg des gemäss e) hergestellten Chlordesmethyltetracyclins wurden in 0,5 ml eines Gemisches aus 90% Butanol und 10% Äthoxyäthanol gelöst und gasförmiges Ammoniak wurde bis zum Auftreten eines voluminösen Niederschlages in die Lösung eingeleitet. Die Aufschlämmung wurde mit einer geringen Menge konzentrierten wässerigen Ammoniaks verdünnt, 5 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen und abfiltriert. Das Produkt wurde mit einem Gemisch aus 90% Butanol und 10% Äthoxyäthanol und dann mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt eine Ausbeute von 41, 4 mg Chlordes-
EMI15.2
y/mg, ausgedrückttetracyclin-hydrochlorid (44%). j) Herstellung von neutralem Chlordesmethyltetracyclin.
50 mg des gemäss e) erhaltenen Chlordesmethyltetracyclins mit einem Wirkstoffgehalt von 10901/mg wurden in 1, 3 ml Wasser gelöst und die Lösung mit trockenem Natriumcarbonat bis zu einem PH- Wert von 7 bis 8 versetzt. Der erhaltene amorphe Niederschlag wurde abzentrifugiert und die klare, überstehende Lösung nach Abdekantieren auf PH 5, 4 eingestellt und dann 16 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Das Produkt wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und bei 350C im Vakuum getrocknet. Man erhielt 21,9 mg kristallines, neutrales Chlordesmethyltetracyclin mit einem Wirkstoffgehalt von 1250'Y/mg (500/cige Ausbeute).
Wie oben erwähnt, können durch Behandlung mit Säuren und Basen Salze der Desmethyltetracycline erhalten werden. Insbesondere die Salze der Desmethyltetracycline mit Salzsäure stellen wertvolle Produkte dar. Durch Verwendung anderer Säuren, z. B. Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Borsäure und weiterer organischer und anorganischer Säuren, können bestimmte pharmakologische wichtige Eigenschaften erzielt werden. Salze mit Basen können mittels Alkalihydroxyden, z. B. Natriumhydroxyd, und den Erdalkalien in der oben beschriebenen Weise hergestellt werden. Das Calciumsalz ist für die Praxis besonders brauchbar und kann durch einfaches Einstellen einer wässerigen Lösung eines beliebigen der Desmethyltetracycline auf einen pH-Wert zwischen 6 und 10 in Gegenwart von wenigstens einem Mol Äquivalent Calcium in der Lösung hergestellt werden.
Auch die Barium-, Magnesium-, Strontium- und andern Salze können in entsprechender Weise erhalten werden. Wie im Fall der Tetracycline bilden auch die Desmethyltetracycline Komplexe mit Bor-, Zirkon- und andern mehrwertigen Metallionen.