DE966635C - Herstellung und Gewinnung des Antibiotikums Carbomycin - Google Patents

Description

AUSGEGEBEN AM 29. AUGUST 1957

P gii2 IVa j 30h

Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung und Gewinnung eines neuen und wertvollen Antibiotikums, Carbomycin genannt (ursprünglich P. A. 97), auf biologischem Wege. Die Erfindung umfaßt die Herstellung des Antibiotikums und seiner Salze in verdünnten Lösungen sowohl in Form der rohen Konzentrate als auch in reiner kristalliner Form. Diese neuen Produkte sind besonders nützlich in vitro als Desinfektionsmittel und örtlich und innerlich als therapeutische Mittel zur Bekämpfung von pathogenen Mycobakterien und verschiedenen grampositiven Mikroorganismen.

Das neue Antibiotikum bildet sich bei der gelenkten Kultivierung eines bisher nicht beschriebenen Stammes einer als Streptomyces halstedii bekannten Mikroorganismenart. Diese neue Kultur wurde auf den gewöhnlich zur Identifizierung des Actinomycetes verwendeten Nährböden gezogen und getestet. Auf Grund der erzielten Ergebnisse wurde sie als ein neuer Stamm des Streptomyces halstedii identifiziert, wobei die in Bergeys Werk »Manual of Determinative Bacteriology«, 6. Auflage (1948), angegebene Beschreibung der Actinomyceten berücksichtigt wurde. Die Kennzeichen dieses Stammes weichen in manchen Pvnkten von der Bergeyschen Beschreibung des Streptomyces halstedii ab. Lebende Kulturen des neuen Stammes wurden der Gärungsabteilung des »Northern Regional Research Laboratory« in Peoria, Illinois, USA., übergeben und in dessen ständige Sammlung von Mikroorganismen als NRRL-2331 eingereiht.

Die gesamten Kulturmerkmale des neuen Stammes, der im folgenden mit NRRL-2331 bezeichnet wird (ursprünglich als Isolat Nr. 13040-30A bezeichnet),

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werden in der folgenden Tabelle angegeben. (Farbenangaben, die mit R bezeichnet sind, beziehen sich auf
das Werk von Ridgway, »Color Standards and

Nomenclature«.) Die Angaben beruhen, wenn nicht
anders angegeben, auf der Auswertung von sechs 65 Röhren.

Tabelle I
Streptomyces halstedii NRRL-2331

Nährboden	Glukoseagar	Λ η	Stärkeplatten	Wachstums grad	Farbe Luftmycel und Sporenbildung	lösliche Pigmente	Bemerkungen
Glukose-			mäßig	gute Sporenbildung. Maus	keine	Rand der Kolonie glatt,
15 Asparagin				grau (R) bis Dunkeloliv		Kolonie leicht erhoben;
	3° Nähragar	Synthetischer		grau (R); in einigen Ab		Rückseite weiß bis ganz
		45 Agar		schnitten weißes Luft		leicht braun; Sporen
				mycel		grampositiv. Maß der
						Stäbe 2,27 · ΐ,95μ. Einige
20		Cellulose				lose Spiralen; einzelne
	35 Kartoffel	Emersonscher				Ketten, an den Enden
	nährböden	50 Nährboden				gebogen. Verdünnungs
	Apfelsaures					platten : Kolonien ähn
	Calcium					lich, außer Farbunter
					schieden von Olivgrau (R)
	D extr ose-Nitrat-				bis Dunkelolivgrau (R)
Brühe	mäßig	weißes Luftmycel; keine	keine	Kolonie runzelig, Rückseite
Gelatine (210)		Sporen; Ränder nechten-		kremigweiß
		ärtig
Magermilch	schwach bis	weißes Luftmycelium; ge	keine	Rückseite kremigweiß
60 (15 Tage)	mäßig	ringe weiße Sporenbil
		dung am Rand der Ko
		lonie ; einige wächserne
		Kolonien
schwach bis	weißes Luftmycel, keine	leicht gräulich
mäßig	Sporenbildung	braun '
schwach bis	gute Sporenbildung, tief	keine	Rückseite kremigweiß
mäßig	mausgrau (R); ausgebrei
	tete Kolonien
mäßig	weißes Luftmycel, schwache	keine	Rückseite weiß; schwache
	Sporenbildung, gräulich		Hydrolyse
	weiß
gut	gute Sporenbildung, maus	keine	Rückseite dunkelgrau bis
	grau (R) bis tiefmaus		hellgrau; Spiralen an
	grau (R)		wesend, jedoch nicht
			zahlreich
schwach
gut	an einigen Stellen des Rohrs	keine	Rückseite kremigweiß
	keine Sporenbildung,
	weißes Luftmycel; an an
	deren Stellen mausgraue
	(R) Sporenbildung
mäßig			Nitrate reduziert
gut	weißes Luftmycel; keine	keine	schwache Verflüssigung;
	Sporenbildung		Rückseite weiß
mäßig		keine	Milch in zwei Röhren ko
			aguliert; Milch in zwei
			Röhren unverändert;
			Keine Peptonisierung;
			Proteolyse sehr schwach

Der neue Stamm Streptomyces halstedii, NRRL-2331, unterscheidet sich in verschiedenen Punkten von der Beschreibung in Bergeys Werk. Diese Unterschiede werden in der folgenden Tabelle gezeigt.

Tabelle II

Nährboden

Stamm NRRL-2331 Bergeys Beschreibung

Stärkeagar

Glukoseagar
Kartoffelnährboden
Synthetischer Agar

mäßiges Wachstum; weißes Luftmycel; schwache Sporenbildung, gräulichweiß Ränder flechtenartig, bleiben weiß

Wachstum schwach bis mäßig mit weißem

Luftmycel, keine Sporen Spiralen anwesend, jedoch nicht zahlreich reichliches Wachstum, bräunlich, glänzendes Wachstum

Ränder der Kolonie flechtenartig, werden braun

reichliches Wachstum. Wachstum feucht, runzelig, kremfarbig mit grüner Tönung

keine Spiralen

Es wird betont, daß die Erfindung zwecks Herstellung von Carbomycin nicht auf die Verwendung dieses speziellen Organismus oder von Organismen, die obiger Beschreibung genau entsprechen, beschränkt ist, da diese Beschreibung nur zur Erläuterung gegeben ist. Die Erfindung umfaßt vielmehr auch die Verwendung von Mutanten dieser Organismen, die aus ihnen mittels Röntgenstrahlen, Ultraviolettstrahlen, Stickstoffsenfölen u. dgl. erhalten werden. Carbomycin zeigt hohe Wirksamkeit gegenüber einer Anzahl von Mikroorganismen. Wie bereits erwähnt wurde, ist es besonders bemerkenswert wegen seiner Einwirkung auf Myobakterien und grampositive Mikroorganismen. Es zeigt ebenfalls einige Wirksamkeit gegenüber gramnegativen Organismen, jedoch ist diese etwas geringer. Die folgende Tabelle zeigt das antibiotische Spektrum des Carbomycins gegenüber einer Anzahl von gramnegativen und grampositiven Mikroorganismen. Diese Versuche wurden durch

Tabelle III

Strep, faecalis

Brucella bronchiseptica

A. aerogenes 2

E. coli 21

Proteus Sp. 1

Ps. aeruginosa 173

M. albicans 8

E. typhosa 344

K. pneumonia 132

S. paratyphi A 134

S. paratyphi B 139

Mikrokokkus pyogenes var.

areus 5

B. subtilis 219

Wachstum jiig/ccm

6,25

50 IOO

50 50

IOO

50 50 50 50

0,19

0,39

Kein

Wachstum μg/ccm

< 0,19 12,5

IOO

IOO IOO

IOO IOO IOO IOO

0,39

0,78

Impfung von Nährbrühen durchgeführt, die verschiedene Konzentrationen des reinen Antibiotikums mit den besonderen Organismen enthalten. Die in der mit »Wachstum« bezeichneten Spalte befindlichen Zahlen zeigen die höchste untersuchte Konzentration '(in μg/ccm), bei der noch ein Wachstum der Mikroorganismen stattfand. Die zweite Spalte » Kein Wachstum« zeigt die verwendete Minimalkonzentration an, bei der kein Wachstum mehr stattfand. Die Untersuchung wurde unter genormten Bedingungen durchgeführt, und die Röhren wurden während eines genormten Zeitabschnittes inkubiert.

Zusätzlich zu den oben angegebenen Mikroorganismen wurden gewisse resistente Stämme verwendet, um die Wirksamkeit des neuen Antibiotikums zu bestimmen. Bei der Verwendung des aureomycin- und chloramphenicolresistenten Stammes des A. aerogenes wurde z. B. gefunden, daß ein Wachstum bei einer Konzentration von 25 μg Carbomycin je ecm der Nährbrühe stattfindet, daß jedoch bei einer Konzentration von 50 μg/ccm kein Wachstum stattfindet. In einem zweiten Versuch dieser Art wurde gefunden, daß ein streptomycin- und streptothricinresistenter Stamm des A. aerogenes ebenfalls bei Anwesenheit von 25 μg Carbomycin je ecm wuchs, daß ein Wachstum jedoch bei einer Konzentration von 50 μg/ccm nicht stattfand. Außer der Wirksamkeit des neuen Antibiotikums gegenüber solchen resistenten Stämmen zeigte dieser Versuch auch, daß das Antibiotikum sich wesentlich von Aureomycin, Chloramphenicol, Streptothricin und Streptomycin unterscheidet. Es zeigt sich auch, daß Carbomycin, wie in der Tabelle III gezeigt ist, sogar wirksamer gegenüber antibioticaresistenten Stämmen des A. aerogenes ist als gegenüber dem normalen Stamm des A. aerogenes. Es wurde gefunden, daß ein Stamm des Staphylokokkus aureus gegenüber der Wirkung von Penicillin bei einer Konzentration von 100 Einheiten/ccm, von Dihydrostreptomycin bei 100 Einheiten/ccm und von Polymyxin bei 100 Einheiten/ccm in vitro resistent ist, jedoch gegenüber der Wirkung von Chloramphenicol bei 100 μg/ccm und Aureomycin bei 12,5 μg/ccm empfindlich ist. Dieser Organismus wurde bei einer Carbomycinkonzentration von 3,1 μg/ccm inhibiert.

Carbomycin hat sich als höchst wirksam gegenüber einer Anzahl von Myobakterienarten erwiesen. In der folgenden Tabelle werden die Ergebnisse solcher Untersuchungen angegeben. In diesem Fall wurden Röhren mit einem flüssigen Medium nach Dubos und einem Albumingehalt von 0,5 % als Testmedium verwendet. Carbomycin wurde, wie in der ersten Spalte der folgenden Tabelle gezeigt wird, zu verschiedenen Mengen des Mediums gegeben. Die Röhren mit dem Medium, das, wie gezeigt, verschiedene Konzentra-

tionen des Antibiotikums enthält, wurden dann mit Kulturen der verschiedenen Myobakterien geimpft. In der Tabelle ist an der Spitze einer jeden Spalte die Myobakterienart angegeben. Darunter sind die Ergebnisse der Untersuchungen angegeben. Die Röhren wurden unter sterilen Bedingungen i8 Stunden lang inkubiert. Das Ausbleiben des Wachstums in den Röhren am Ende des genormten Zeitabschnittes ist durch ein Minuszeichen (—), zweifelhaftes Wachstum durch ± und Wachstum durch + gekennzeichnet.

Tabelle IV

Wirksamkeit des Carbomycins gegenüber Myobakterien

/tg/ccm	ranae	phlei	smeg- matis	607	beroli- nense	traty- ricium
12,5						—
6,25	—	—	—	—	—	—
3,12	±	—	—	—	—	—
1,56	+	—	—	—	—	—
0,78	+	±	—	±	—	±
0,39	+	+	—	±	±	±
0,19	+	+	±	+	±	+

Aus dieser Tabelle gehthervor, daß Carbomycin gegenüber diesen Myobakterien ungewöhnlich wirksam ist. Es wurde gefunden, daß Carbomycin eine verhältnismäßig geringe Giftigkeit hat, wenn es bei Versuchstieren verwendet wird. Wenn das Antibiotikum als Lösung in angesäuertem Wasser Mäusen intravenös eingespritzt wird, beträgt z. B. der LD₀-Wert 7 mg pro 20 g Maus. Die Giftigkeit, gegenüber anderen Arten und bei anderer Anwendungsform ist ähnlich.

Die Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Züchtung des bisher nicht beschriebenen Stammes des S. halstedii. Die Kultivierung des Mikroorganismus findet vorzugsweise innerhalb eines wäßrigen Nährbodens unter submerser Rührung und Belüftung bei einer Temperatur von etwa 24 bis 30⁰ statt. Für dieses Verfahren besonders geeignete Nährstoffe sind Kohlehydrate, wie z. B. Zucker, Stärke, Glycerin, Maismehl und eine organische Stickstoffquelle, wie z. B. Kasein, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Weizenkleber, Baumwollsamenmehl, Laktalbumin, ein enzymatisches Abbauprodukt von Kasein, Trypton u. a. Ein Wachstumsstoff, wie z. B. ein unter dem Namen «Distillers' Solubles« bekanntes Handelsprodukt, Hefeextrakt, Melasse-Gärrückstände und Mineralsalze, wie z. B.

Natriumchlorid, Kaliumphosphat, Natriumnitrat, Magnesiumsulfat und Spurenelemente, wie z. B. Kupfer, Zink und Eisen, können ebenfalls mit den gewünschten Resultaten verwendet werden. Wenn während der Gärung übermäßiges Schäumen auftritt, können Antischaummittel, wie z. B. Pflanzenöle, dem Gärmittel zugegeben werden. Der p_H-Wert der Gärung neigt dazu, ziemlich konstant zu bleiben. Falls jedoch Schwankungen auftreten, kann eine Puffersubstanz, wie z. B. Calciumcarbonat, zu dem Medium gegeben werden.

Impfstoff zur Herstellung von Carbomycin durch Züchtung des neuen Stammes von S. halstedii kann man erhalten, wenn man ein Wachstum aus Schrägnährböden auf einem- Nährboden, wie z. B. Emersons Agar oder »Beef Lactose« (Agar-Nährboden aus Fleischextrakt, Agar, Pepton und Wasser mit Zusatz von ι % Lactose), verwendet. Dieses Wachstum kann man verwenden, um entweder geschüttelte Kolben oder Impfbehälter für submerses Wachstum zu impfen. Man kann auch diese Impfbehälter aus den geschüttelten Kolben impfen. Das Wachstum des Mikroorganismus erreicht gewöhnlich seinen Höchstwert in 2 bis 3 Tagen. Jedoch können Änderungen der verwendeten Apparatur, der Belüftungsmenge, Rührung usw. die Geschwindigkeit beeinträchtigen, mit der die maximale Wirksamkeit erreicht wird. Im allgemeinen ist ein Zeitraum von etwa 24 Stunden bis 4 Tagen zur Herstellung des Antibiotikums erwünscht. Die Belüftung des Nährbodens in Behältern für submerses Wachstum wird so vorgenommen, daß etwa ¹Z₂ bis 2 Volumen Luft pro Volumen Brühe pro Minute eingeblasen werden. Das Umwälzen der Flüssigkeit kann durch geeignete, bekannte Rührer vorgenommen werden. Aseptische Bedingungen müssen natürlich während der ganzen Zeit der Impfung und des Wachsturns beibehalten werden.

Nach dem Wachstum des Mikroorganismus kann das Mycel, das im allgemeinen fein und üppig wuchert, aus der Gärbrühe mit Hilfe von verschiedenen genormten Vorrichtungen, wie z. B. Filterpressen, Zentrifugen u. dgl., gewonnen werden. Es wurde gefunden, daß die Herabsetzung des p_H-Wertes der gesamten Gärbrühe auf etwa 3,0 das Filtern fördert. Da das Antibiotikum unter sauren Bedingungen nicht sehr beständig ist, soll die Gärbrühe, nachdem sie filtriert wurde, annähernd neutral eingestellt werden. Das Carbomycin kann aus der Gärbrühe nach verschiedenen unterschiedlichen Verfahren gewonnen werden. Man kann die gesamte Brühe auch in dem erhaltenen Zustand verwenden, oder sie kann getrocknet werden. Das Antibiotikum kann auf verschiedene Weise weitergereinigt werden. Die Verbindung kann z. B. aus wäßriger Lösung bei neutralen oder leicht alkalischen p_H-Werten, vorzugsweise zwischen etwa 6 und etwa 10, mittels einer Anzahl mit Wasser nicht mischbarer organischer Lösungsmittel, wie z. B. Äther, aromatische Kohlenwasserstoffe, Ester, Ketone, niederer Alkohole oder halogenierter Kohlenwasserstoffe, extrahiert werden. Beispiele dafür sind Diäthyläther, Benzol, Toluol, Äthylacetat, Butylacetat, Methylisobutylketon, Butanol und Chloroform. Selbst bei sauren p_H-Werten extrahieren einige dieser Lösungsmittel eine beachtliche Menge des Antibiotikums. Dies trifft besonders für die mit Wasser nicht mischbaren Alkohole zu, wie z. B. Butanol, Pentanole u. dgl. Das Antibiotikum kann aus den meisten Lösungen in Lösungsmitteln in angesäuertes Wasser zurückextrahiert werden, vorzugsweise bei einem p_H-Wert von unter etwa 2,5. Gewünschtenfalls kann der Lösungsmittelextrakt vor der Extraktion in das angesäuerte Wasser konzentriert werden. Durch Einstellung des p_H-Wertes auf Neutralität oder Alkalität kann das Antibiotikum in eines der oben angegebenen Lösungsmittel zurückextrahiert werden. Nach Trocknung des Lösungsmittels und Konzentrierung der Lösung kristallisiert das An-

tibiotikum. Es kristallisiert im allgemeinen in Form weißer grober kristalliner Nadeln. In manchen Fällen jedoch werden die Kristalle in Form von Platten erhalten. Das Produkt kann aus Benzol, Äther, niederen Ketonen oder niederen Alkoholen umkristallisiert werden. Gewünschtenfalls wird eine Lösung in einem der mit Wasser nicht mischbaren Alkohole oder Ketone konzentriert, und es wird Wasser zugegeben, um die Kristallisation zu fördern. Das Antibiotikum kann ίο auch durch Adsorption auf Aktivkohle aus der Gärbrühe oder Konzentraten gewonnen werden. Durch Auswaschen mit Säure oder mit Wasser und einem mit Wasser mischbaren säurehaltigen Lösungsmittel wird die Verbindung in gereinigter Form zurückerhalten.

Carbomycin ist eine schwach basische, weiße, organische Verbindung, die in verdünnten wäßrigen Lösungen löslich, jedoch in Wasser nur schwach löslich ist (etwa 0,5 mg/ccm). Es ist äußerst löslich in einer Anzahl organischer Lösungsmittel, wie z. B. Aceton, Äther, Benzol, Chloroform und Dioxan, und etwas weniger löslich in Methanol und Äthanol. In Hexan ist es unlöslich. Bei der Konzentrierung einer Lösung des Carbomycin in einem Lösungsmittel besteht die Neigung zur Bildung von übersättigten Lösungen und von Kristallen, die einen Teil des verwendeten Lösungsmittels zurückhalten. Die Verbindung zeigt in starken Säuren und in basischen Lösungen, selbst bei Raumtemperatur, eine verringerte Beständigleit. Beim Erhitzen in Säure- und Alkalilösungen ist sie völlig unbeständig. Sie zeigt ihre maximale Beständigkeit bei p_H-Werten von 3 bis 7. Ihre Beständigkeit als trockene oder in einem trockenen Lösungsmittel gelöste Verbindung ist gut. Eine stark gereinigte kristalline Carbomycinbase, wie sie z. B. durch viermaliges Umkristallisieren aus Lösungsmitteln, wie z. B. Äthanol, Benzol usw., erhalten wird, neigt dazu, lösungsmittelhaltige Kristalle zu bilden, aus denen das Lösungsmittel durch Trocknen im Vakuum bei ioo° mehr oder weniger vollständig entfernt werden kann. Wenn ein solcher Stoff unter diesen Bedingungen 3 Stunden lang getrocknet wird, zeigt er einen Schmelzpunkt von 217 bis 2i8° bei leichter Zersetzung. (Hierbei wird die Probe in das Schmelzpunktbestimmungsbad bei 196⁰ gegeben und die Badtemperatur um 3,6° pro Minute gesteigert.) Das kristalline, wasserfreie Material bildet ein Monohydrat, wenn es der atmosphärischen Feuchtigkeit ausgesetzt wird. Die Analyse dieses Monohydrats zeigt folgende Zusammensetzung:

Kohlenstoff 59.oi %

Wasserstoff 8,35 %

Stickstoff 1,66%

Sauerstoff (aus der Differenz) .... 30,98 %

Die stark gereinigte kristalline Base, die im Vakuum bei ioo° 3 Stunden lang getrocknet wurde, wurde analysiert und hatte die folgende Zusammensetzung:

Kohlenstoff 60,04%

Wasserstoff 8,24 %

Stickstoff 1,55%

Sauerstoff (aus der Differenz) ... 30,17%

Die optische Drehung des Stoffes beträgt etwa [a]o = — 55° (1% Lösung in Chloroform). Die Titrierung der Verbindung in einer Mischung von 2 Volumen Dimethylformamid und 1 Volumen Wasser ergab einen pKa-Wert von 6,4 und ein Molekulargewicht von etwa 866. Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der reinen, in Äthanol gelösten Base hat zwei Maxima, das eine liegt bei 240 πιμ (ε = i6,o8o) und das andere bei 327,5 πιμ (ε = 113). Wenn die wasserfreie kristalline Base in Chloroform gelöst wird, zeigt sie eine Anzahl von charakteristischen Höhepunkten im Infraroten. Unter diesen befinden sich die folgenden Frequenzen (in reziproken cm): 3510, 2920, 1732, 1690, 1630, 1460, 1375, 1300, 1230, 1160, 1122, 1077, 1052, 1025, 1015, 976, 916, 910, 873, 860 und 827. Das infrarote Spektrum ist in Fig. 1 der Zeichnungen dargestellt.

Die Salze des Carbomycin mit Säuren können durch die Behandlung der Base mit der jeweiligen Säure hergestellt werden. Wird z. B. die Base in Äther gelöst und ein Chlorwasserstoffstrom in die Lösung eingeblasen, so fällt sofort Carbomycinchlorhydrat aus. Andere Säuren können in der gleichen oder ähnlichen Weise zur Herstellung der Salze des Antibiotikums verwendet werden. Die Behandlung der Base mit der Säure kann in wäßrigem Medium, in dem das Salz löslich ist, vorgenommen werden. Das Salz kann dann durch Verdampfung des wäßrigen Mediums gewonnen werden. Carbomycin ist jedoch, wie oben gesagt, in wäßrigen Säurelösungen nicht sehr beständig, so daß Vorsicht geboten ist.

Das getrocknete, kristalline, in Chloroform gelöste Chlorhydrat zeigt unter anderem folgende charakteristische Höhepunkte im Infraroten (in reziproken cm): 3220, 2870, 1715, 1670, 1610, 1450, 1358, 1296, 1230, 1160,1140, 1120, 1100, 1074, 1060, 975, 914, 890 und 860. Das Infrarotspektrum dieses Salzes ist in Fig. 2 dargestellt.

Eine Anzahl verschiedener Mikroorganismen kann zur Bestimmung der Wirksamkeit der Carbomycinpräparate verwendet werden. Dazu gehören K. pneumoniae, B. Subtilis, Staph. aureus und andere genormte Testorganismen. Wenn K. pneumoniae verwendet wird, so kann dies in Form eines Trübungstestes oder einer Plattenprobe geschehen. Kristallines Chloramphenicol kann als Standard verwendet werden, wobei diesem Antibiotikum ein Wert von 1000 Einheiten/mg gegeben wird. Auf dieser Basis hat kristallines Carbomycin eine Wirksamkeit von 750 bis 850 Chloramphenicoleinheiten/mg. Bei der Herstellung von Carbomycin mittels Gärung werden Gärbrühen mit einer Wirksamkeit von etwa 15 bis 100 Einheiten/ccm erhalten.

Carbomycin wird von anderen Antibiotika durch seine Eigenschaften unterschieden. Zu den für diesen Vergleich verwendeten Eigenschaften gehören die oben angegebenen sowie Messungen mittels Papier-Chromatographie, die einen deutlichen Unterschied anzeigen. Es wurden ebenfalls Vergleiche mit Mikroorganismen gezogen, die sich verschiedenen anderen Antibiotika gegenüber resistent verhalten.

Die folgenden Beispiele dienen der Er^terung und sollen die Erfindung nicht beschränken.

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Beispiel ι

Sporen eines Emersonschen Schrägagars von S. halstedii NRRL-2331 wurden unter aseptischen Bedingungen zu einem Nährboden der folgenden Zusammensetzung gegeben:

Cerelose (festes Glukosehydrat) 10 g

Sojabohnenmehl 10 g

Natriumchlorid 5 g

Distillers Solubles 5 g

Calciumcarbonat ig

Diese Mischung wurde auf 11 verdünnt, und der p_H-Wert wurde von der Sterilisierung mit Kalium-

hydroxyd auf 7 eingestellt. Nach der Abkühlung wurden die Sporen zugegeben. Man ließ den Organismus in geschüttelten Flaschen 2 Tage lang bei etwa 28° wachsen. Die das Mycel enthaltende Gärbrühe wurde dann in die zwanzigfache Menge ihres Volumens eines sterilen Mediums der folgenden Zusammensetzung gegeben:

Stärke 20 g

Kasein 10 g

^a5 Sojabohnenmehl 15 g

Calciumcarbonat ig

Dieses Gemisch wurde auf 11 verdünnt und auf einen p_H-Wert von 7 eingestellt, bevor es in einen Autoklav gegeben und geimpft wurde. Nach 2tägiger Rührung und Belüftung unter sterilen Bedingungen betrug die Wirksamkeit der Gärbrühe 100 Einheiten j e ecm. Das Gemisch wurde auf einen p_H-Wert von 3,0 gebracht und das Mycel durch Filtrieren entfernt. Der p_H-Wert des Filtrats wurde auf 6,5 eingestellt, und das Filtrat wurde dann zweimal mit einem Viertel seines Volumens Methylisobutylketon extrahiert. Die vereinigten Lebensmittelphasen wurden dann im Vakuum auf ein Zehntel ihres Volumens konzentriert. Das Antibiotikum wurde in Wasser bei einem p_H-Wert von 2,0 extrahiert, wobei Schwefelsäure zur Einstellung des p_H-Wertes verwendet wurde. Die wäßrige Phase wurde abgetrennt, mit einem kleinen Volumen

Benzol gewaschen, um gelöstes Methylisobutylketon zu entfernen. Dann wurde die wäßrige Phase auf einen p_H-Wert von 6,5 eingestellt. Das Antibiotikum wurde mehrmals mit Äther extrahiert, und die einzelnen Ätherphasen wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation entfernt, worauf das Antibiotikum in Form weißer Nadeln auskristallisierte. Das Produkt wurde durch Lösen in Aceton, Filtrieren, Konzentrieren und Wasserzugeben umkristallisiert. Ein Fließschema, das zur Erläuterung des oben beschriebenen Extraktionsverfahrens dient, ist in Fig. 3 gezeigt. Es wurde gefunden, daß das erhaltene Produkt gegenüber einer Anzahl von Myobakterien und grampositiven Mikroorganismen äußerst wirksam ist.

Beispiel 2

Es wurde ein Medium der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

Stärke 20 g

Distillers Solubles '. 10 g

Sojabohnenmehl 15 g

11 Wasser wurde zu dem Stoffgemisch gegeben, und der p_H-Wert wurde auf 7 eingestellt, bevor 1 g Calciumcarbonat zugegeben wurde. Das Medium wurde dann in einem Autoklav gegeben und unter sterilen Bedingungen mit S. halstedii NRRL-2331 geimpft. Das Gemisch wurde unter sterilen Bedingungen bei etwa 28⁰ 2 Tage lang belüftet und gerührt. Die filtrierte Gärbrühe enthielt 25 Einheiten Carbomyein pro ecm Lösung.

Beispiel 3

Eine Kultur von Streptomyces halstedii NRRL-2331 wurde einer Röntgenstrahlung von 100 000 Röntgen ausgesetzt. Aus den überlebenden Organismen wurden Kulturen hergestellt. Eine dieser Kulturen (Nr. 1) wurde zur Beimpfung von mehreren 300 ecm fassenden Erlenmeyerkolben verwendet, in denen sich jeweils 50 ecm des folgenden sterilen Nährrnediums befanden:

Glucose Monohydrat 1,0 %

Maisstärke 1,0 °/₀

N-Z Amins B (Enzymatiscb.es Kaseinhydrolysat) 0,5 %

Curbay BG flüssig (Rückstand aus der
Destillation von Alkohol, der durch
Vergärung von Korn erhalten wurde) 1,0 %

NaCl 0,5%

Sojamehl i,5 °/o

Wasser zum Ausfüllen auf das gewünschte Volumen, p_H-Wert 7 (mit
Kaliumhydroxydlösung eingestellt)

CaCO₃ 0,1 °/₀

75 Minuten bei 0,14 atü autoklaviert

Der Kolben wurde nach der Beimpfung 48 Stunden bei 28⁰ geschüttelt. Die filtrierte Lösung hatte je ecm eine Wirksamkeit von 115 γ Carbomycin.

Beispiel 4

Die, wie im Beispiel 3 angegeben, durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen erhaltene Mutante Nr. 6 des Streptomyces halstedii NRRL-2331 wurde unter den gleichen Bedingungen und auf dem gleichen Nährmedium wie im Beispiel 3 kultiviert. Die filtrierte Gärlösung hatte je ecm eine Wirksamkeit von 155 γ Carbomycin.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH:

   Die Verwendung von Streptomyces halstedii, Stamm NRRL-2331, zur Herstellung des Antibiotikums Carbomycin auf üblichem biologischem Wege, Gewinnung des Antibiotikums aus der Gärlösung und gegebenenfalls Überführung in seine Salze. '

   Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

   © 709 652/77 8.