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Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums 106-7
| Die Erfir@ina bezieht sich auf die Herstellung |
| das als Antibioticum zo6-7 |
| I-'eZiich:li=I wird und ans einer neuen Streptomycesart |
| hie Auff-dun; der erstaunlichen antibiotischen |
| Ei;@-ncha_ten Lies Penicillins erregte großes Interesse |
| h:--ttt,- diu Entdeckung vieler anderer wertvoller |
| _lntil>iotica zur Fohc, die durch Fermentation ent- |
| .`@@z. 13. Strrptothricin, Streptomvcin, Gramici- |
| di:-), Sta-@tilin, Lacitracin, Aureomvcin, Terramvcin |
| ?i. @`a. Ir.1 <<il:;em@_incn wirken derartige Antibiotica |
| auf l.,estiininte Bakterien besonders stark |
| «-a@@l@@tt:rr.@hcmmei:d und sind gegen andere Orga- |
| ni=men v@,ll@t@india inaktiv. So sind einige dieser |
| Pruduktu bestimmte gramnegative, andere |
| -@-@i:ramp@_ait:ve und andere «-iederum sowohl |
gegen gramnegative als auch grampositive Organismen aktiv. Im allgemeinen jedoch
ist die Aktivität dieser bekannten Antibiotica gewöhnlich auf einige patlioaene
Erreger beschränkt, und man hat fortgesetzt versucht, Antibiotica aufzufinden, die
ein breiteres Wirkungsspektrum besitzen.
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Obgleich sich manche Antibiotica bei der Behandlung verschiedener
Krankheiten als unschätzbar erwiesen haben, werden bestimmte Stämme einiger pathoaener
Organismen gegenüber einem bestimmten Antibioticum resistent, und das betreifende
Antibioticum besitzt infolgedessen keine Aktivität mehr gegen diese Erreger. Diese
Unzulänglichkeit der bekannten Antibiotica hat nun weitere Forschungsarbeiten mit
dem Ziel ausgelöst, Antibiotica aufzufinden, «-elche sowohl in einem weiteren Bereich
pathogener
Organismen als auch gegen die resistenten Stämme bestimmter Organismen aktiv sind.
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Die vorliegende Erfindung zielt auf die Herstellung eines neuen Antibioticums
ab, welches gegenüber verschiedenen pathogenen Bakterien sowohl gramnegativer als
auch grampositiver Organismen stark wachstumshemmend wirkt. Ein weiteres Ziel der
Erfindung ist die Herstellung von Lösungen dieses neuen Antibioticums, welche wertvolle
bakterizide Eigenschaften besitzen.
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Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in der Herstellung dieses
neuen Antibioticums durch Fermentation wäßriger Nährmedien mit geeigneten Stämmen
eines bisher unbekannten Mikroorganismus. Weitere Zweckangaben der Erfindung gehen
aus der nachfolgenden Beschreibung hervor.
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Gemäß der Erfindung wurde gefunden, daß bei der Fermentation geeigneter
wäßriger Medien durch bisher unbekannte Mikroorganismen ein neues und wertvolles
Antibioticum gebildet wird, welches als Antibioticum 1o6-7 bezeichnet wird. Dieser
Mikroorganismus wurde als eine neue Species von Streptomyces identifiziert und als
S. garyphalus bezeichnet.
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S. garyphalus ist ein bisher unbekannter, aber weitverbreiteter Mikroorganismus,
dessen Stämme aus Bodenproben sowohl gemäßigter als auch tropischer Klimate nach
der üblichen Methode der Bodenverdünnung isoliert wurden. So wurden Bodenverdünnungen
aus Chicacao, Guatemala, und Nahualate Road, Guatemala, und dem Staate New York
auf Dextrose Asparagin-Agar gebracht und ergaben nach einer hinreichenden Bebrütungszeit
viele Actinomycet-Isolate, welche nach ihrer Fähigkeit zur Produktion von Antibiotica
ausgewählt und geprüft wurden. Mikroorganismus Nr. 1o6-7 aus Böden aus Chicacao,
Guatemala, die Mikroorganismen Nr. igo-8, igo-9 und 19o-33 aus Böden aus Nahualate
Road, Guatemala, und Mikroorganismen Nr.54o-33 und 54o-34 aus Böden aus dem Staate
New York wurden isoliert und zeigten eine merkliche antibiotische Wirksamkeit. Diese
Mikroorganismen haben im wesentlichen übereinstimmende morphologische und physiologische
Eigenschaften. Jeder dieser Mikroorganismen wurde in Schüttelflaschen gezüchtet,
und die Kulturfiltrate wurden auf ihre antibiotische Wirksamkeit nach der Zylinderplattenmethode
geprüft, die in Journal of Bacteriology, 5o (1945), 701, beschrieben ist. Dabei
wurden die in Tabelle I angegebenen mikrobiologischen Spektren erhalten.
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Die in Tabelle I angegebenen Werte zeigen, daß durch Fermentation
dieser Stämme die gleiche antibiotische Substanz, die als Antibioticum 1o6-7 bezeichnet
wird, gebildet wird.
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Eine Untersuchung der in Tabelle I angegebenen Stämme von Mikroorganismen
zeigte, daß es sich hierbei um eine bisher unbekannte Streptomycesart handelt, die
nicht in der sechsten Ausgabe von Bergeys Manual of Determinative Bacteriology beschrieben
ist. Dieser neuen Species von Mikroorganismen wurde die Bezeichnung Streptomyces
garyphalus gegeben. Dieser Mikroorganismus unterscheidet sich von anderen Streptomyces
durch Bildung gerader Sporenmycele, die rosa gefärbt sind, sowie durch die Fähigkeit,
Nitrate zu Nitriten zu reduzieren. Andere sekundäre Eigenschaften, welche beweisen,
daß S. garyphalus als eine neue Species von Streptomyces zu gelten hat, ist seine
Fähigkeit, Milch zu peptonisieren, Gelatine zu verflüssigen und Stärke zu hydrolysieren.
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Die Kultureigenschaften eines bestimmten Stammes von S. garyphalus,
welcher Antibioticum 1o6-7 erzeugt, ist in der Tabelle II angegeben.
| Tabelle I |
| Zonendurchmesser der Wachstumshemmung, welche den das Filtrat
der Testkultur enthaltenden |
| Zylinder umgibt |
| f |
| C CC2 |
| tn Stamm |
| .., tr sr C a w #. .-.. =f. |
| @r.° c |
| i06-7........ 21 25 24 22 28 13 28 28 24 23 |
| i90-8........ 20 24 22 21 25 11 35 25 17 22 |
| 190-g........ 16 24 25 21 26 13 28 27 |
| 19o-33....... 20 26 26 ig 27 30 27 21 24 |
| 540-33 ....... 15 22 23 20 24 - 25 23 17 25 |
| 54o-34....... 18 24 23 20 27 11 29 32 22 25 |
| Tabelle II |
| Morphologische und Kultureigenschaften des Stammes Streptomyces
garyphalus Nr. i06-7 |
| Isoliert aus Guatemala-Böden |
| Morphologie: Gerades Sporenmycel. Keine Spiralen beobachtet.
Conidien stabförmig. |
| o,8 bis i,i X 1,7 bis 1,9 Mikron. |
| Gelatine: Verflüssigung erfolgt nach sechstägiger Bebrütung
bei 28'. Grauweißer Ring |
| und grauweißes submerses Häutchen. Dunkelbraune Pigmentschicht,
welche sich |
| nach i bis 2 Tagen bildet. Wird beim Schütteln grünlichbraun. |
| Stärke-Agar: Hydrolysiert. Ausgezeichnetes Wachstum. Grau gerändert
mit weißem Luft- |
| mycel. Unterseite gelblichweiß. Schwachbraun gefärbtes lösliches
Pigment. |
| Glucose-Asparagin-Agar : Gutes farbloses Wachstum. Weißes Luftmycel.
Unterseite weiß. Kein lösliches |
| Pigment. |
| Modifiziertes Glucose-Asparagin-Agar: |
| Ausgezeichnetes pulvriges rosaweißes Wachstum. Seemuschelrosagefärbtes
Luft- |
| mycel. Unterseite braungelb. Kein lösliches Pigment. |
| Nährbrühe: Grauweißes Häutchen und Ring. Kein lösliches Pigment. |
| Nähr-Agar: Gutes farbloses Wachstum. Grauweißes Luftmycel.
Auch unter der Oberfläche |
| Wachstum. Unterseite gelblichweißgefärbt. Schwachbraunes lösliches
Pigment |
| Reagensmilch: Langsam peptonisiert. Milch wird zuerst dunkelpurpur
und später bräunlich- |
| purpur. p$ 6,4. Schwacher grauweißer Ring. Gelbes Sediment
am Boden des |
| Reagenzrohres. |
| Nitrat-Agar: Starke Bildung von Nitriten aus Nitraten. |
| Indol-Medium: Indol wird nicht gebildet. |
| Czapeks Saccharoselösung: Kein Wachstum. |
| Czapeks Saccharose-Agar: Gutes farbloses Wachstum. Grauweißes
Luftmycel. Unterseite farblos. Kein |
| Wachstum unter der Oberfläche. Kein lösliches Pigment. Die
Kultur erzeugte |
| Hämolyse auf Blutagar (Gehirnherzaufguß) (brain heart infusion
blood agar). |
| Kartoffelkeil: Schweres faltiges Wachstum. Luftmycel sehr dunkelgrauschwarz.
Kartoffel |
| wird dunkler. |
| Calciummalat-Agar: Farbloses Wachstum, kein Luftmycel. |
| Cellulose: Nicht zersetzt. |
| Glucosebrühe: Grauweißer Ring. Submerses grauweißes Häutchen.
Schwachgelbliches Pigment. |
| Nach 2 Wochen schwach sauer. |
| Hefeextrakt-Dextrose-Agar: Ausgezeichnetes Wachstum. Luftmycel
grauweiß, welches rosagrau und zum |
| Schluß seemuschelrosa wird. Schwachbraunes lösliches Pigment. |
| Stärke-Trypton-Agar: Gutes Wachstum. Graues Luftmycel. Dunkelbraunes
lösliches Pigment. |
| Pepton-Glucose-Agar: Gelblichweißes Wachstum. Luftmycel grauweiß,
welches rosa wird. Schwach- |
| braunes lösliches Pigment. |
| Optimale Temperatur: Wächst gut bei 24, 26, 28 und 37°. Kein
Wachstum bei 47°. |
| Optimaler pA : 7,o bis 7,2. |
| Aerob. |
Die obige Beschreibung des besonderen Stammes dient lediglich zur Erläuterung geeigneter
Stämme von S. garyphalus, welche zur Durchführung der Erfindung verwendet werden
können; aber die Erfindung beschränkt sich nicht auf die Verwendung eines bestimmten
Stammes der oben angegebenen Eigenschaften. Sie zielt vielmehr auch auf die Verwendung
anderer Stämme von S. garyphalus ab, die das Antibioticum io6-7 erzeugen, z. B.
diejenigen, welche durch natürliche Auswahl erhalten werden, wie es in Tabelle I
dargestellt ist, oder weiter diejenigen, die durch künstliche Mutation gebildet
werden, z. B. durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, mit UV u. dgl.
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Antibioticum io6-7 wird im Verlaufe der aeroben Fermentation geeigneter
wäßriger Medien unter den nachfolgenden Bedingungen durch Stämme von Streptomyces
garyphalus erzeugt. Wäßrige Medien, wie sie zur Herstellung anderer Antibiotica
verwendet werden, eignen sich auch für die Herstellung des Antibioticums io6-7.
Derartige Medien enthalten Quellen für durch Mikroorganismen assimilierbaren Kohlenstoff
und Stickstoff sowie anorganische Salze. Außerdem enthalten die Fermentationsmedien
Spurenmetalle, die für das Wachstum des Organismus notwendig sind. Diese Spurenelemente
werden gewöhnlich in Form von Verunreinigungen eingeführt, die in den Bestandteilen
des Mediums enthalten sind.
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Im allgemeinen sind Kohlehydrate, wie Zucker, z. B. Dextrose, Saccharose,
Maltose, Lactose, Dextrin u.dgl., sowie Stärke, geeignete Quellen für assimilierbaren
Kohlenstoff. Die genaue Menge der Kohlenstoffquelle, welche in dem Medium zu verwenden
ist, hängt teilweise von den anderen Bestandteilen des Mediums ab. Im allgemeinen
reichen 3 Gewichtsprozente Kohlehydrate, bezogen auf das Gewicht des Mediums, aus.
Diese Kohlenstoffquellen können sowohl einzeln verwendet werden, oder man kann mehrere
derartiger Ausgangsstoffe miteinander kombinieren.
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Eine Reihe von Stickstoffquellen, wie Caseinhydrolysate, papainangedautes
Sojabohnenmehl, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Erdnußölmehl, lösliche Schlempebestandteile,
Maisquellwasser, Natriumnitrat, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat u. dgl., werden
leicht durch Streptomyces garyphalus assimiliert und können in den Fermentationsmedien
zur Bildung des neuen Antibioticums verwendet werden. Im allgemeinen sind organische
Stickstoffquellen, insbesondere Sojabohnenmehl und lösliche Schlempebestandteile,
sehr
gut geeignet für die Erzeugung von Antibioticum i06-7. Die verschiedenen organischen
oder anorganischen Stickstoffquellen können entweder allein oder in Kombination
miteinander, und zwar in Mengen von etwa o,2 bis 5 Gewichtsprozent des wäßrigen
Mediums, Verwendung finden.
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Der Zusatz von Natriumchlorid zu einem Medium, welches geeignete Quellen
von assimilierbarem Kohlenstoff und Stickstoff enthält, ist in Mengen von etwa o,i
bis i,o °/o für die Herstellung des neuen Antibioticums zweckmäßig. Im allgemeinen
ist eine Natriumchloridmenge, die etwa 1/4 Gewichtsprozent des Nährmediums entspricht,
sehr gut brauchbar.
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Die Fermentation unter Verwendung von Antibioticum i06-7 erzeugenden
Stämmen kann bei Temperaturen von etwa 24 bis 37° durchgeführt werden. Für optimale
Ergebnisse ist es recht zweckmäßig, diese Fermentationen bei etwa 28° durchzuführen.
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Das p$ der Nährmedien, die für die Züchtung von Streptomyces garyphalus
und Bildung des Antibioticums geeignet sind, kann zwischen etwa 6 und 7 liegen.
Gewöhnlich haben, wie später gezeigt wird, die vdrteilhaft angewendeten Fermentationsmedien
ein PH innerhalb dieses Bereichs und können ohne jede weitere Einstellung des pg-Wertes
verwendet werden.
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Obgleich das Antibioticum i06-7 durch Oberflächenwachstum und durch
submerses Wachstum des Organismus entsteht, zieht man es gegenwärtig vor, eine Submerskultur
durchzuführen. Kleine Probefermentationen werden zweckmäßig ausgeführt, indem man
geeignete Mengen der Nährmedien in Erlenmeyer: kolben einbringt, die Kolben und
ihren Inhalt durch Erhitzen auf z20° sterilisiert, die Kolben entweder mit Sporen
oder einem vegetativen Zellenwachstum von Antibioticum z06-7 beimpft, welche S.
garyphalus produzieren, worauf man den Hals der Kolben lose mit Baumwolle verschließt
und die Bebrütung in temperaturkonstanten Räumen bei etwa 28° in einer geeigneten
Schüttelvorrichtung in etwa 2 bis 4 Tagen vornimmt.
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Bei der Durchführung des Verfahrens in größerem Maßstab empfiehlt
es sich, die Züchtung in geeigneten Tanks vorzunehmen, die mit einem Rührwerk und
-einer Vorrichtung zum Belüften des Fermentationsmediums ausgestattet sind. Bei
diesem Verfahren wird das Nährmedium im Tank selbst hergestellt und durch Erhitzen
auf i20° sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird das sterilisierte Medium mit einem
geeigneten vegetativen Zellenwachstum eines Antibioticums z06-7 beimpft, welches
S. garyphalus erzeugt. Man läßt die Fermentation 2 bis 4 Tage fortschreiten, während
man das Nährmedium bebrütet und/oder rührt und die Temperatur auf etwa 28° hält.
Dieses Verfahren zur Herstellung des Antibioticums i06-7 ist insbesondere für die
Herstellung großer Mengen geeignet.
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Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung eignet sich ein
wäßriges Nährmedium mit etwa 3°/o Sojabohnenöl, 2°/o Dextrose, 0,75°/0 lösliche
Schlempebestandteile und 0,25°/o Natriumchlorid besonders für die Herstellung von
Antibioticum r06-7 in Submerskultur mit einem geeigneten Stamm von S. garyphalus.
Die maximale Bildung dieses Antibioticums erfolgt in einem derartigen Medium gewöhnlich
bei etwa 28° 65 Stunden lang nach der Beimpfung.
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Das Antibioticum =o6-7 kann aus der Fermentationsbrühe nach einer
Reihe von Methoden abgetrennt werden. Eines dieser Verfahren besteht darin, daß
man die Brühe filtriert und das Filtrat trocknet. Der so gewonnene Feststoff enthält
das gesuchte Antibioticum. Ein ähnlicher Feststoff von größerer Reinheit und Aktivität
kann gewonnen werden, wenn man die filtrierte Brühe zuerst mit Aktivkohle behandelt,
das Gemisch filtriert, das Filtrat unter vermindertem Druck einengt und dann unter
vermindertem Druck der Zerstäubungstrocknung zuführt. Auf diese Weise wird ein Feststoff
gewonnen, der das Antibioticum i06-7 enthält und eine Aktivität von etwa 4 bis 12
Streptomycineinheiten je mg besitzt, bestimmt nach der Zylinderplattendiffusionsmethode
unter Verwendung von Micrococcus pyogenes var. aureus und einem Streptomycinstandard.
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Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Fermentationsverfahren,
die zur Herstellung des Antibioticums i06-7 angewendet werden können.
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Beispiel i 50 ccm eines Mediums, welches 3°/o Sojabohnenmehl, 2°/o
Dextrose, 0,75°/0 lösliche Schlempeanteile und 0,25°/o NaCl in destilliertem Wasser
enthält, wurden in 25o-ccm-Erlenmeyerkolben eingebracht. Die Kolben wurden mit 2
ccm eines vegetativen Wachstums von Streptomyces garyphalus beimpft und bei 28°
auf einer rotierenden Schüttelmaschine von einem Ausschlag von 6,35 cm bei 22o U/Min.
4 Tage lang bebrütet. Das Mycel wurde abfiltriert und die erhaltene Brühe auf ihre
antibakterielle Aktivität nach der Zylinderplattenmethode geprüft. Der Durchmesser
des Hemmungshofes um den Prüfzylinder bei den verschiedenen Testkulturen ist in
der nachfolgenden Tabelle angegeben:
| Qi des |
| Testkultur Hemmungs- |
| hofes |
| in mm |
| K. pneumonia . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 |
| S. dysenteriae shiga ................. 22 |
| Salmonella shottmulleri . . . . . . . . . . . . . . 22 |
| Sahnonella typhosa ................. 21 |
| Escherichia coli W . . . . . . . . . . . . . .'. . . . 24 |
| Pseudomonas aeruginosa . . . . . . . . . . . . . 14 |
| M. pyogenes var. aureus Smith ...... :L 26 |
| Diplococcus pneumoniae ............. 26 |
| Dillon strain, widerstandsfähig gegenüber |
| Streptomycin ..................... i9 |
| M. pyogenes var. aureus, widerstands- |
| fähig gegenüber Streptomycin ...... aktiv |
Beispiel 2 3,2 1 eines wäßrigen Mediums, welches 3°/o Sojabohnenmehl, 2°/o Dextrose,
0,75°/0 lösliche Schlempebestandteile und 0,25°/o NaCl enthält, wurden in einen
5-1-Fermenter eingebracht. Das Medium wurde bei i20° il/, Stunden sterilisiert und
nach dem Abkühlen mit Zoo ccm eines vegetativen Wachstums von
Streptomyces
garyphalus beimpft. Das Medium wurde 96 Stunden unter Belüftung und Rühren bei 28,5°
fermentiert. Die Aktivität der filtrierten Brühe (2,571) wurde nach der Zylinderplattenmethode
unter Verwendung von M. pyogenes var. aureus und einem Streptomycinstandard bestimmt.
Diese Brühe hatte eine Aktivität von ioo Streptomycineinheiten je ccm, wenn man
M. pyogenes var. aureus verwendete (etwa 5 Einheiten je mg). Beispiel 3 Es wurde
ein wäßriges Fermentationsmedium von folgender Zusammensetzung hergestellt:
| Saccharose ....................... 2,50/0 |
| Erdnußölmehl oder Erdnußmehl ... 1,5% |
| CaC 0g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. 0,4% |
| Maisquellwasser .................. o,20/0 |
| (N H4)2 S 04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . 0,20/0 |
| NaCl............................ o,20/0 |
5o-ccm-Anteile dieses Mediums wurden in 25o-ccm-Erlenmeyerkolben eingebracht, sterilisiert
und mit 2 ccm eines vegetativen Wachstums von Streptomyces garyphalus beimpft. Die
Kolben wurden bei 28° auf einer rotierenden Schüttelmaschine von einem Ausschlag
von 6,35 cm und 22o U/Min. 4 Tage bebrütet. Die Aktivität der filtrierten Brühe
wurde nach der Zylinderplattenmethode bestimmt, wobei man M. pyogenes var. aureus
und ein Antibioticum-io6-7-Präparat von 65 Einheiten/mg als Standard benutzte. Diese
Brühe hatte eine Aktivität von 12o Streptomycineinheiten j e ccm.
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Beispiel ¢ Es wurde ein wäßriges Fermentationsmedium von folgender
Zusammensetzung hergestellt Papainangedautes Sojabohnenmehl .. i0/0 Dextrose..........................
i0/0 Dieses Medium wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, beimpft und bebrütet.
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Die Brühe hatte eine Aktivität von ioo Streptomycineinheiten j e ccm.
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Antibioticum 1o6-7 und Konzentrate von größerer Aktivität können hergestellt
werden, indem man die filtrierte Antibioticum-io6-7-Fermentationsbrühe auf ein pH
von etwa 2 ansäuert und danach das Antibioticum an einem stark sauren Kationenaustauschharz
in alkalischer Form adsorbiert. Das Harzadsorbat wird dann mit Wasser gewaschen,
um die schwach adsorbierten oder nicht adsorbierten Verunreinigungen zu entfernen.
Das aktive Produkt wird durch Eluieren des Harzadsorbates mit einer wäßrigen Lösung
einer geeigneten organischen Base oder einer geeigneten anorganischen Base und Gefriertrocknung
des Eluates gewonnen. Auf diese Weise werden Antibioticum-io6-7-Konzentrate gewonnen,
deren Aktivität etwa 5o bis Zoo Einheiten/mg beträgt.
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Die stark sauren Kationenaustauschharze, welche kerngebundene Sulfonsäuregruppen
oder Methylensulfonsäuregruppen enthalten, sind bei diesem Verfahren als Adsorptionsmittel
besonders gut verwendbar. Handelsnamen von Harzen dieser Art sind beispielsweise
Amberlite IR-i2o (hergestellt von der Roehm & Haas Co.), Dowex 50 (hergestellt
von der Dow Chemical Co.) und Duolite C-io (hergestellt von der Chemical Process
Co.). Diese Harze lassen sich für die Adsorption von Antibioticum 1o6-7 leicht in
ihre alkalische Form bringen, indem man sie mit einem geeigneten Alkali- oder Erdalkalihydroxyd
in Reaktion bringt und dann die überschüssige Lauge auswäscht. Die stark sauren
Kationenaustauschharze in Natriumform wurden als besonders gut geeignet gefunden.
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Die Anwendung dieses Verfahrens zur Abtrennung und Reinigung von Antibioticum
1o6-7 aus einer Fermentationsbrühe kann wie folgt durchgeführt werden Das PH von
ioo ccm der gemäß Beispiel 2 hergestellten Fermentationsbrühe wurde durch Zusatz
von 4 ccm 2,5 n-Salzsäure auf 1,5 eingestellt. Die Brühe wurde dann mit einer Geschwindigkeit
von 25 ccm/Std. durch eine Säule geleitet, die etwa 6 g Amberlite IR-i2o (Sulfonsäureharz)
in Natriumform enthielt. Das Antibioticum blieb auf der Säule zurück und wurde mit
50 ccm Wasser ausgewaschen. Die aktive Substanz wurde mit o,i n-NH40H eluiert.
Wenn 45 ccm Flüssigkeit durch die Säule geströmt waren, stieg das p$ von 5 auf 6,
und Aktivität wurde im Eluat gefunden. Im wesentlichen war die gesamte Aktivität
zwischen p$ 6 und io in etwa 2o ccm der abströmenden Flüssigkeit eluiert. LyophylisierteFeststoffe
aus den einzelnen Schnitten in diesem pH-Bereich besaßen Aktivitäten von 5o bis
122 Einheiten/mg. (Die Aktivitäten wurden nach der Zylinderplattenmethode unter
Verwendung von M. pyogenes var. aureus und einem Streptomycinstandard bestimmt).
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Die Konzentrate von Antibioticum 1o6-7, die eine Aktivität von etwa
5o bis Zoo Einheiten/mg besitzen und nach dieser Methode hergestellt sind, können
weitergereinigt werden, um das Antibioticum in reiner Form zu erhalten.
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Ein derartiges Verfahren, welches indessen nicht Gegenstand der vorliegenden
Erfindung ist, besteht darin, daß man das Antibioticum aus den Eluaten der oben
beschriebenen Kationenaustauschharzadsorbate an einem stark basischen Anionenaustauschharz
in Hydroxylform adsorbiert, worauf man die Verunreinigungen des so gewonnenen Harzadsorbats
mit Wasser entfernt und das gewünschte Produkt mit einem Anionen enthaltenden Mittel
eluiert. Die Harze, welche für dieses Verfahren verwendet werden können, sind die
stark basischen quaternären Ammoniumaustauschharze, deren Austauschkapazität auf
quaternären Amingruppen beruht. Handelsnamen für bestimmte Harze, die hierbei verwendet
werden können, sind z. B. Amberlite IRA-40o, Amberlite IRA-4I0, Amberlite XE-98,
Amberlite XE-75, Amberlite XE-58 (hergestellt von der Roehm & Hass Co.), Ionac
A-293 (hergestellt von der American Cyanamid Corp.) und Dowex 2 (hergestellt von
der Dow Chemical Co.). Diese Harze lassen sich für ihre Verwendung in diesem Verfahren
leicht in Hydroxylform umwandeln, indem man sie mit einer alkalischen Lösung behandelt,
wie Natriumhydroxyd, und das so behandelte Harz mit Wasser auswäscht, um das überschüssige
Alkali
zu entfernen. Nach Adsorption des Antibioticums auf dem in Hydroxylform befindlichen
Anionenaustauschharz wird das erhaltene Adsorbat mit einem Anionen enthaltenden
Eluierungsmittel eluiert, z. B. einer wäßrigen Lösung einer starken Base, wie NaOH,
KOH u. dgl., einer wäßrigen Lösung einer Säure, wie Salz-, Schwefel-, Essigsäure
od. dgl., oder einer wäßrigen Lösung eines Salzes, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid,
Natriumsulfat u. dgl. Wenn man sauer eluiert, enthalten die Eluatfraktionen von
einem pg von etwa 7 bis 4,5 das gesuchte Antibioticum. Wenn man basisch eluiert,
enthalten die Eluatfraktionen von einem pa von etwa 7 bis 14 das Antibioticum 1o6-7.
Durch Gefriertrocknung der erhaltenen Eluate kann Antibioticum 1o6-7 von einer Aktivität
von etwa 25o bis 300 Einheiten/mg gewonnen werden. -Das nachfolgende Beispiel
erläutert dieses Verfahren zur Reinigung vonAntibioticum 1o6-7.
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Eine 3ooo-ccm-Fraktion eines Antibioticum 1o6-7 enthaltenden Eluates
von pH 8,5 und 1400 Einheiten/ccm, welches durch Eluieren des Kationenaustauschadsorbates
(Amberlite IR-i2o) mit Ammoniumhydroxyd , in der oben beschriebenen Weise erhalten
war, wurde mit einer Geschwindigkeit von etwa 25 ccm/Min. durch eine Säule geleitet,
die 250 ccm eines Anionenaustauschharzes (Amberlite IRA-400) in Hydroxylform
enthielt. Die Aktivität der abströmenden Flüssigkeit betrug o Einheiten/ccm. Die
Säule wurde dann mit 250 ccm Wasser gewaschen und das Antibioticum durch Waschen
des Harzadsorbates mit etwa 2500 ccm einer 2%igen wäßrigen Lösung von Essigsäure
eluiert. Die Eluatfraktion, deren pH-Bereich etwa 7 bis 4,5 betrug, belief sich
auf etwa 1o65 ccm und hatte eine Aktivität von 3211 Einheiten/ccm.
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Antibioticum 1o6-7 von einer Aktivität von etwa 25o bis
300 Einheiten/mg kann durch bloße Gefriertrocknung der so erhaltenen Eluate
gewonnen werden. Wenn gewünscht, können diese Eluate weiterbehandelt werden, um
Antibioticum 1o6-7 in kristalliner Form zu erhalten.
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Ein derartiges Verfahren, welches indessen nicht Gegenstand der- vorliegenden
Erfindung ist, besteht darin, daß man das p$ des bei der vorstehend beschriebenen
Behandlung mit Anionenaustauschharz gewonnenen Eluates auf etwa 8,5 einstellt, das
alkalische Eluat auf ein kleines Volumen einengt, dem Konzentrat ein Gemisch niederer
aliphatischer Alkohole zusetzt, die pH der alkoholischen Lösung auf etwa 6 einstellt
und die Lösung kühlt, wodurch die Base von Antibioticum 1o6-7 in kristalliner Form
ausfällt. Dieses Verfahren zur Gewinnung von kristallinem Antibioticum 1o6-7 wird
durch das nachfolgende spezielle Beispiel erläutert.
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Das Eluat, welches durch Eluieren des Anionenaustauschadsorbates (Amberlite
IR-i2o) mit der oben beschriebenen 2o/oigen wäßrigen Essigsäure gewonnen war und
sich auf 1o65 ccm von einer Aktivität von 2211 Einheiten/ccm belief, wurde durch
Zusatz von NaOH auf ein pg von etwa 8,5 eingestellt. Dieses alkalische Eluat wurde
auf etwa ioo ccm eingeengt und das Konzentrat mit 500 ccm Isopropanol und
500 ccm Äthanol verdünnt. Aus dieser alkoholischen Lösung wurden unlösliche
Bestandteile abfiltriert. Nach Einstellung des pu des Filtrats auf etwa 5,8 mittels
Essigsäure und Abkühlen fiel die kristalline Base des Antibioticum 1o6-7 aus. Das
durch Filtration gewonnene kristalline Produkt hatte eine Aktivität von 3o5 Einheiten/mg.
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Die kristalline Antibioticum-io6-7-Base ist im wesentlichen farblos.
Sie ist in Wasser sehr leicht löslich und in wasserfreien Alkoholen, Aceton, Chloroform,
Äthylacetat und Pyridin im wesentlichen unlöslich. Sie zersetzt sich in Eisessig.
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Das natürliche p$ der kristallinen Base des Antibioticums 1o6-7 in
Wasser beträgt etwa 6. Ihre spezifische Drehung in Wasser beträgt etwa [a] D=+z16°.
Antibioticum 1o6-7 hat ein amphoteres Verhalten. Wenn es mit Säure titriert wird,
ergibt es ein Kp von etwa 4,5 und ein Äquivalentgewicht von etwa ioi, wenn es mit
Alkali titriert wird, ergibt es ein. Kp von 7,4 und ein Äquivalentgewicht von etwa
103. Das Molekulargewicht von Antibioticum 1o6-7 beträgt etwa ioo, bestimmt
nach der Methode der Gefrierpunktserniedrigung.
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Die Zusammensetzung einer gereinigten Probe der kristallinen Base
des Antibioticums 1o6-7 wurde durch chemische Analyse zu etwa 35,85°/o C, 5,67%
H, 27,9% N, Rest o bestimmt. Danach hätte die Base des Antibioticums 1o6-7 die empirische
Zusammensetzung C,H602N2.
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Die Base des Antibioticums 1o6-7 hat keinen Schmelzpunkt im eigentlichen
Sinne des Wortes, sondern zersetzt sich zwischen etwa 150 und 155°.
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Für diese Base ist ferner die Absorptionskurve im UV sehr charakteristisch.
Sie zeigt in Wasser von pg 6 ein Maximum bei 226o Ä (Eo/o = 403).
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Wenn die Base des Antibioticums i06-7 aus wäßriger Lösung kristallisiert,
fällt sie in Form eines kristallinen Monohydrates an. Wasserfreies Antibioticum
1o6-7 wird leicht gewonnen, indem man entweder das Monohydrat der Base unter vermindertem
Druck erhitzt, bis das Wasser entfernt ist, oder indem man das Antibioticum aus
einem im wesentlichen wasserfreien Lösungsmittel kristallisiert.
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Die Röntgenogramme des kristallinen Monohydrates von Antibioticum
1o6-7 und des kristallinen wasserfreien Antibioticums 1o6-7 zeigen unterschiedliche
Kristallformen, wie es sich durch die ungleichartigen Reflexionsintensitäten erweist,
die in der nachfolgenden Tabelle III zusammengestellt sind.
| Tabelle III |
| Wasserfreie Base von Antibioticum 1o6-7 |
| Gitterabstand Relative |
| Linie |
| Intensität |
| 1 9,1i 15 |
| 2 4,73 (ioo) |
| 3 4,56 55 |
| 4 4,27 85 |
| 5 4,02 40 |
| 6 3.79 25 |
| 7 3,46 20 |
| 8 3,04 35 |
| 9 2,83 40 |
| 10 2,71 45 |
| Monohydrat der Base von Antibioticum io6-7 |
| Gitterabstand Relative |
| Linie Reflexions- |
| intensität °% |
| 1 5,21 30 |
| 2 4,00 15 |
| 3 3,91 20 |
| 4 3,77 (ioo) |
| 5 3,66 20 |
| 6 3,24 40 |
| 7 3,13 40 |
| 8 2,80 I 15 . |
Die Ultrarotabsorptionsspektren der wasserfreien Base des Antibioticums 1o6-7 und
des Monohydrates der Base wurden in flüssigem Mineralfett bestimmt. Die Absorptionsbanden
im Ultrarot wurden in einem Ultrarotspektrophotometer nach Baird bestimmt, der mit
Steinsalzoptik ausgerüstet ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.
| Tabelle IV |
| Absorptionsbanden im Ultrarot, (Mikron) |
| Wasserfreie Base Monohydrat |
| von Antibioticum 1o6-7 des Antibioticums 1o6-7 |
| 2,8bis4,4multipleBanden 3,0 |
| 4,65 3,2 bis 3,3 |
| 6,12 3,6bis4,6multipleBanden |
| 6,2o Schulter 5,0 Schulter |
| 6,30 5,93 |
| 6,42 6,1 Schulter |
| 6,52 6,17 Schulter |
| 7,io 6,23 Schulter |
| 7.3 |
| 6,37 |
| 7,5 6,50 Schulter |
| 7,85 7,04 |
| 8,15 7,30 |
| 8,55 Schulter 7,52 |
| 8,80 7,72 |
| 9,40 |
| io,68 8,i5 |
| io;9 8,6o |
| 11,2 bis ii,3 Schulter 8,69 |
| 11,38 9119 |
| 12,08 10,0 |
| 13,23 10,37 Schulter |
| 15,0 10,42 |
| 11,25 |
| 12,27 |
| 13,5 breite Bande |
Ferner ist der Rf-Wert für die Base von Antibioticum io6-7 charakteristisch. Hierunter
ist das Verhältnis des Abstands, den ein Flecken von Antibioticum io6-7 von seinem
Ausgangspunkt auf einem Papierchromatogramm zurücklegt, zu dem Weg zu verstehen,
der von einem Entwicklungslösungsmittel zurückgelegt wird. Bei Versuchen mit der
Base des Antibioticums io6-7 unter Entwicklung mit Mischlösungsmitteln aus 4 Teilen
Äthanol + i Teil Wasser und 4 Teilen Butanol + 2 Teilen Wasser -E- i Teil Essigsäure
erhielt man Rf-Werte von
0,33 bis
0,37. Die Stellen der io6-7-Base
wurden bei diesen Versuchen leicht durch eine Lösung von o,2°/, Ninhydrin in 95°/oigem
Äthanol bestimmt, welche in Berührung mit dem Antibioticum eine charakteristische
gelbblaue Färbung gibt.
-
Da das Antibioticum 1o6-7 eine amphotere Substanz ist, bildet sie
einerseits Metallsalze, wie Allkali-und Erdalkalisalze, andererseits Säureadditionssalze,
wie das Hydrochlorid, Sulfat u. dgl. Diese Salze können in der üblichen Weise gewonnen
werden.
-
Alkali- und Erdalkalisalze von Antibioticum =o6-7 werden einfach hergestellt,
indem man das Antibioticum mit einer geeigneten Alkali- oder Erdalkalibase in Wasser
behandelt. Für diesen Zweck sind die Alkali- und Erdalkalioxyde, -hydroxyde, -carbonate
und -bicarbonate geeignet. Die Isolierung der Erdalkalisalze, z. B. des Ca-, Ba-
und Mg-Salzes, in kristalliner Form erreicht man, indem man das Salz aus wäßrigen
Lösungen durch Zusatz von Äthanol oder Isopropanol ausfällt. Die Alkalisalze von
Antibioticum 1o6-7 können zweckmäßig abgetrennt werden, indem man ihre wäßrigen
Lösungen zur Trockne verdampft.
-
So kann man die Ca-, Mg- und Ba-Salze von Antibioticum 1o6-7 wie folgt
herstellen: 3 g Calciumoxyd wurden in 40 ccm Wasser aufgeschlämmt und auf o bis
5° gekühlt. Zu dieser Aufschlämmung wurden 5 g der Base von Antibioticum io6-7 von
einer Aktivität von 26o Einheiten/mg zugesetzt, worauf man das Gemisch filtrierte.
Der Filterkuchen wurde mit io ccm Wasser gewaschen und das Waschwasser mit dem Filtrat
vereinigt. Das Filtrat hatte ein pA von ii,o bis 11,5. Man setzte genügend weitere
kristalline Base von Antibioticum io6-7 hinzu, bis das pA 9,5 betrug. Nun wurde
Aktivkohle zugesetzt und die Lösung 15 Minuten gerührt und dann filtriert. Zum Filtrat
wurden 6 Raumteile Äthanol zugesetzt, um das Calciumsalz des Antibioticums io6-7
in kristalliner Form auszufällen. Die Kristalle wurden gesammelt, mit Äthanol gewaschen
und unter vermindertem Druck getrocknet. Das Calciumsalz hatte eine Aktivität von
igo bis 22o Einheiten/mg. Es zersetzte sich bei 215 bis 221° und hatte ein titrimetrisch
ermitteltes Äquivalentgewicht von 151 bis 154. Die Absorptionskurve im UV hatte
ein Maximum bei 224o !@ (EO/o = 262). Die spezifische Drehung betrug [a]
'D" = + 74°. Das Kristallwasser betrug etwa 21 °/o oder 3,5 Mol Wasser je Mol Calciumsalz.
-
Entsprechend wurde das Magnesiumsalz des Antibioticums io6-7 hergestellt,
indem man 3 g Magnesiumhydroxyd mit 5 g Antibioticum io6-7 von einer Aktivität von
26o Einheiten/mg entsprechend der oben beschriebenen Arbeitsweise behandelte. Das
Magnesiumsalz hatte eine Aktivität von Zoo bis 22o Einheiten/mg und zersetzte sich
bei 224 bis 228°. Die spezifische Drehung betrug [a] D = -1-- 78° und seine UV-Absorptionskurve
hatte ein Maximum bei 2240 Ä (E°/,) = 274). Das Kristallwasser betrug etwa 2o°/a
oder 3 Mol Wasser je Mol Magnesiumsalz.
-
Das Bariumsalz von Antibioticum io6-7 wird hergestellt, indem man
i g der Base von Antibioticum io6-7 von der Aktivität 26o Einheiten/mg langsam
unter
Rühren zu io ccm Wasser zusetzt, welches 1,5 g Ba(OH)2 - 8 H20 enthält. Die
Lösung wurde filtriert und der Rückstand mit i ccm Wasser gewaschen. Zu dem klaren
Filtrat fügte man q.0 ccm g5°/oiges Äthanol und 40 ccm Isopropanol hinzu und schleuderte
die Lösung, um geringe Mengen einer Ölphase abzutrennen. Die Lösungsmittelschicht
wurde auf o° abgekühlt und i Stunde gerührt. Das Bariumsalz des Antibioticums io6-7
fiel aus der Lösung in kristalliner Form aus, wurde gesammelt, mit Isopropanol und
schließlich mit Äther gewaschen. Es hatte eine Aktivität von 18o Einheiten/mg und
zersetzte sich bei 2ö5 bis 2i5°.
-
Säureadditionssalze des Antibioticums io6-7, wie das Hydrochlorid;
Sulfat u. dgl., können einfach durch Zusatz der entsprechenden Säure zu einer wäßrigen
Lösung der Base des Antibioticums hergestellt werden. Die Salze können aus ihrer
wäßrigen Lösung durch Zusatz eines mischbaren Lösungsmittels abgetrennt werden,
in welchem das Säuresalz unlöslich ist.
-
So wird das Sulfatadditionssalz des Antibioticums io6-7 nach- folgender
Methode hergestellt Eine io°/oige wäßrige Lösung der kristallinen Base des Antibioticums
io6-7, welche eine Aktivität von 26o Einheiten/mg hatte, wurde mit Schwefelsäure
bei Raumtemperatur auf pH 2,5 angesäuert. Zu dieser Lösung setzte man io Raumteile
Isopropanol zu: Die Kristalle des Sulfats des Antibioticums io6-7 fielen sofort
aus: Sie wurden abfiltriert, mit Isopropanol und Äther gewaschen und unter vermindertem
Druck bei Raumtemperatur getrocknet: Das Produkt hatte eine Aktivität von 185 Einheiten/mg.
-
Die Titration von Antibioticum-io6-7-Sulfat mit Alkali ergab ein Kp
von etwa 4,5 und ein Äquivalentgewicht von 175 und ein Kp von 7,4 und einÄquivalentgewicht
von 167. Der Karl-Fischer-Test ergab 8,3 %
Wasser. Das Produkt hat deshalb
wahrscheinlich die Zusammensetzung (Base des Antibioticums io6-7)$ H,SO9'2HZ0.
-
Antibioticum io6-7 ' hat ein breites Wirkungsspektrum mit einer ausgeprägtem
Aktivität gegenüber einer großen Anzahl sowohl grampositiver als auch gramnegativer
Basen. Beispiele für grampositive Bakterien, gegen welche es wirksam ist, sind Streptococcus
pyogenes, M. pyogenes var. äureus, Streptococcus faecalis, Diplococcus pneumoniae,
Erysipelothrix rhuspiopathiae, Corynebacterium diphtheriae, C. ovis, C. renalis,
C. diphtheriae und C. xerosis. Beispiele für einige gramnegative Bakterien, gegen
welche es ebenfalls aktiv ist, sind Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella
schottmulleri, Shigella dysenteriae, Salmonella typhosa und Pseudomonas aeruginosa.
-
Die in Tabelle V zusammengestellten Werte ermöglichen einen Vergleich
des Hemmungseffektes von Antibioticum io6-7, Streptomycin und Terramycin auf verschiedene
grampositive und gramnegative Organismen und zeigen das breite antibakterielle Wirkungsspektrum
des neuen Antibioticums. Sie beweisen ferner, daß dieses Antibioticum von Terramycin
und Streptomycin deutlich unterschieden ist.
| Tabelle V |
| Vergleichende antibakterielle Wirkungsspektren von Antibioticum
io6-7, Streptomycin und Terramycin |
| in vitro nach der Zylinderplattenmethode |
| Durchmesser des Hemmungshofes, mm |
| h .a b |
| O o p F1 |
| Organismen ö N |
| Antibioticum 1o6-71) |
| 5 0,5 1 0,05 0,1 0,1 |
| mg/ccm mg/ccm m:g/ccm mg/ccm mg/ccm |
| Klebsiella pneumoniae..................................
25 - 15 20 |
| Shigella dysenteriae (Shiga) ............................ 34
9.1 - 13 25 |
| Salmonella schottmulleri................................
35 20 - 15 23 |
| Salmonella typhosa ... ..............................: 29 17
- 17 23 |
| Escherichia coli ....................................... 36
24 il 16 21 |
| Pseudomonas aeruginosa .............................. 25 -
- io 14 |
| E. coli (Dillon-stamm) ................................
30 i6 - - 22 |
| 1VI. pyogenes var. aureus .............................. 38
24 -@- ig 27 |
| M. pyogenes var. aureus (streptothricin-resistent) ......-..
40 40 36 - 3i |
| Streptococcus faecalis ................. , .............. 32
1 6 - 27 |
| Streptococcus pyogenes............. .....................
32 i8 - 30 |
| Diplococcus pneumoniae .. ... .. . .... . .. . ...-... . ........
352) 143) 4) 38 |
| = Hemmungshof noch unter dem Zylinder (8 mm) |
| - = keine Hemmung |
| i) Es wurde ein Antibioticum von der Aktivität iSo Einheiten/mg
verwendet. |
| Konzentration des |
| Antibioticums io6-7 |
| 3) 2 mg/CCm " |
| 0,2 mg/ccm Es wurde ein Antibioticum io6-7 von der Aktivität
6o Einheiten/mg verwendet. |
| 4) 0,02 mg/CCm |
Aus Tabelle V ersieht man, daß sich Antibioticum io6-7 deutlich
von Streptomycin unterscheidet, welches hauptsächlich nur das Wachstum von gramnegativen
Bakterien hemmt. Das neue Antibioticum ähnelt insofern etwas dem Terramycin, als
es sowohl gegenüber gramnegativen als auch grampositiven Bakterien eine wachstumshemmende
Wirkung ausübt. Indessen ist Antibioticum io6-7 gegenüber einem streptothricin-resistenten
Stamm von M. pyogenes var. aureus verhältnismäßig viel stärker aktiv als Terramycin.
-
In den Tabellen VI und VII sind die Untersuchungen der gegenseitigen
Resistenz angegeben, die mit einem normal empfindlichen Stamm von M. pyogenes var.
aureus und Unterkulturen aus diesem Stamm durchgeführt wurden, welche gegenüber
Terramycin, Aureomycin, Chloromycetin, StreptothricinundStreptomycin resistent geworden
sind.
| Tabelle VI |
| Unterschiedliche Wirkung von Antibioticum io6-7, Terramycin
und Streptomycin auf empfindliche |
| und resistente Stämme von M. pyogenes var. aureus |
| Konzentration Durchmesser des Hemmungshofes, mm |
| des (typische Werte) |
| Antibiotieum Antibiotiiums streptomycin- terramycin- |
| io6 71) normaler resistenter resistenter |
| mglccm Stamm |
| Stamm |
| Stamm |
| io6-7 ......................... 3,1 33 31 36 |
| io6-7 ......................... 0,31 i9 15 22 |
| io6-7 ......................... 0,031 - - - |
| Terramycin ................... i,0 NT NT -r- |
| - ................... 0,1 27 NT - |
| Streptomycin ... . ..... . .... . ... 2,0 NT - NT |
| - .................. 0,i ig - NT |
| + = Hemmungshof noch unter dem Zylinder (8 mm) - = keine Hemmung
NT = nicht geprüft |
| 1) Das Antibioticum io6-7 hatte eine Aktivität von 92 Einheiten/mg. |
| Tabelle VII |
| Unterschiedliche Wirkung von Antibioticum io6-7, Streptomycin,
Aureomycin, Terramycin, Chloro- |
| mycetin und Streptothricin auf empfindliche und resistente
Stämme von M. pyogenes var. aureus |
| M. Pyo- M. Pyo- M. Pyo- M. Pyo- M. PyoM. Pyo- M. Pyo- |
| Antibioticum genes Dillon genes - genes genes |
| genes CMR genes STSMR genes TMR AMR |
| io6-7 Ansatz 2930 ............. 18,o > 35 |
| io6-7 Ansatz 3969 ............. 2o,o > 35 |
| io6-7 Ansatz 3971 .............. 21,0 35 |
| Chloromycetin, 0,25 mg/ccm ..... 17,0 0 |
| - 0,i0 mg/ccm ..... 20,0 0 |
| io6-7 Ansatz 4179 . . . . . . . . . . . . . i9 28 > 35 |
| io6-7 Ansatz 3969 ............. 15 25 > 35 |
| io6-7 Ansatz 3971 .......... - ... 20 28 31 |
| Streptomycin-Ca C12-Komplex, |
| ioo Einheiten/ccm . . . . . . . . . . . - 22 - |
| Streptothricin-hydrochlorid, |
| iooo Einheiten/ccm . . . . . . . . . . - |
| Aureomycin-hydrochlorid |
| 5 7/ccm ................... 14 < 10 < 10 |
| io Y/ccm ................... 15,5 < io < 1o |
| 25 y/ccm ................... 23 13 13 |
| 50 Y/ccm ... . . . . . . . . . . . . . . . .
21,5 14 15 |
| 75 7/ccm ................... 23,5 17 16 |
| 100 y/ccm .................... 2¢ 18 20 |
| Terramycin-hydrochlorid |
| 5 Y/ccm ................... 13 < io < io |
| io -y/ccm ................... 16 |
| < io < 10 |
| 25 Y/ccm ................... 20 io 12 |
| 50 Y/ccm ................... 22 12 |
| 75 Y/ccm ................... 23 14 |
| ioo y/ccm ................... 24 16 |
| io6-7 Ansatz 4179 . . . . . . . . . . . . . 20 18 18 |
| CMR = chloromycetin-resistent SMR = streptomycin-resistent
AIMMR = aureomycin-resistent |
| TMR = terramycin-resistent STR = streptothricin-resistent |
Die Werte der Tabellen VI und VII zeigen, daB auch das neu aufgefundene
Antibioticum deutlich von Streptothricin, Aureomycin, Chloromycetin, Streptomycin
und Terramycin unterschieden ist. Gegenüber Antibiotioum =o6-7 verhalten sich die
resistenten Stämme von M. pyogenes var. aureus wie ein normal empfindlicher Stamm.
Dieses Verhalten rechtfertigt den SchluB, daB das Antibioticum 11o6-7 von Terramycin
verschieden ist.
-
Andere Versuche in vitro haben gezeigt, daB Antibioticum 11o6-7 eine
starke Hemmungswirkung auf das Wachstum von M. tuberculosis (virulent, Humanstamm)
hat. Das Wachstum dieses Erregers wird durch die Base von Antibioticum =o6-7 in
Konzentrationen von 0,005 bis o,oi mg/ccm Dubosmedium vollständig gehemmt.
-
Versuche an Mäusen zeigen, daB Konzentrate von Antibioticum 11o6-7
eine Heilwirkung bei mehreren bakteriellen in-vivo-Infektionen besitzen. Die Resultate
eines solchen in-vivo-Experimentes mit zwei grampositiven Bakterien und zwei graninegativen
Bakterien sind in Tabelle VIII angegeben.
| Tabelle VIII |
| Wirkung von Konzentraten von Antibioticum 11o6-7 auf typische
Vertreter grampositiver |
| und gramnegativer Erreger in Mäusen |
| Aktivität |
| von |
| Konzentraten Wirksame Minimaldosis Therapeutischer |
| von |
| Erreger Antibioticum (mg/2o g) Index |
| ro6-7 |
| Streptomycin- ED roo ED 5o (LD 5o/ED 5o) |
| einheiten/mg |
| Subkutane Applikation |
| M.-pyogenes var. aureus .......... . ... 150 6,2 11,4
1100 |
| Diplococcus pneumoniae ................ 6o > 50,0 311,0 4,2 |
| Klebsiella pneumoniae ......... ......... 6o 50,0 15,6
8,3 |
| Salmonella schottmulleri . . . . . . . . . . . . . . . .
150 12,5 4,11 34,0 |
| Orale Applikation |
| M. pyogenes var. aureus ................ 60 25,0 8,8
> 34 |
| M. pyogenes var. aureus ................ 92 3,11 11,g > 1158 |
In einem anderen in-vivo-Experiment wurde die antibakterielle Aktivität der Base
von Antibioticum 11o6-7 (30o Einheiten/mg) und bestimmter Salze derselben verglichen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle IX
| Tabelle IX |
| Form des Erreger, Einzeldosis, ED 50 |
| Antibi. ticums in |
| 11o6-7 peroral |
| mg/ 2o g |
| Base......... Micrococcus aureus 0199 |
| Calcium ..... - - 0199 |
| Magnesium .. - - 1,05 |
| Sulfat ........ - - 11,8o |
| Natrium ..... - - i,71 |
| Base......... Klebsiella pneumoniae 2,49 |
| Calcium ..... - - 455 |
| Calcium ..... Salmonella schottmulleri 7,35 |
| Erreger, Einzeldosis, |
| subkutan |
| Base......... Micrococcus aureus o,69 |
| Sulfat ....... - - o,61 |
| Natrium ..... _ - 1,32 |
| Base......... Klebsiella pneumoniae 2,5i |
zusammengestellt. Es ist dort die wirksame Dosis angegeben, die notwendig ist, um
50°/o einer Gruppe von 2o g Mäusen von einem letalen Ausgang zu schützen.
-
Antibioticum 11o6-7 hat in vivo eine antirickettsielle Aktivität bei
Mäusen und Hühnerembryos, die mit Rickettsiaerregern vom Rattentyphus infiziert
sind. Wenn man Mäusen, die mit Rickettsia infiziert sind, eine einzige subkutane
Dosis von 5 mg oder zwei Dosen von 2,5 mg von Antibioticum 11o6-7 (Aktivität:
300 Streptomycineinheiten/mg) appliziert, sind sie vollständig von sonst
letalen Infektionen geschützt. Dieselbe Menge (5 mg) schützt mit Rickettsia infizierte
Hühnerembryos völlig.
-
Antibioticum 11o6-7 zerstört wirksam Borellia novyi, die Spirochäte
von Rückfallfieber in Mäusen. Einzelne subkutane Dosen, die 24 Stunden nach der
Infektion appliziert werden, sind ebenso wirksam, als wenn sie unmittelbar nach
der Infektion angewendet werden.
-
Die Ergebnisse akuter Toxizitätsteste in Mäusen, denen Einzeldosen
mehrerer Konzentrate von Antibioticum 11o6-7 eingegeben wurden, sind in Tabelle
X zusammengestellt.
| Tabelle X |
| Akutu Toxizität von Antibioticum 1o6-7 in Mäusen |
| Aktivität Akute LD.o (Mäuse) |
| von Konzentraten in mg/2o g Maus |
| Probe des Antibioticums Appli- Appli- Appli- |
| io6-7 kation kation kation |
| in Streptomycin- intra- sub- per- |
| einheiten/mg venös kutan oral |
| 1 6o > 8o 13o > 300 |
| 2 15o > 63 etwa 15o nicht |
| unter- |
| sucht |
| 3 92 nicht 162 > 300 |
| unter- |
| sucht |
Diese Werte zeigen, daß Antibioticum 1o6-7 verhältnismäßig gut verträglich ist.
Im Vergleich mit kristallinem Aureomycin und Terramycin [subkutan LDSO --. 6o -
8o mg/2o g bzw. z2 bis 13 mg/2o g (Schoenbach, Ann. N. Y. Acad. Sci. 53, 2, S. 247)7,
ist Antibioticum 1o6-7 etwa 1/2 bis '/")mal so toxisch.
-
Weitere Versuche an Ratten und Hunden mit Konzentraten der Base von
Antibioticum 1o6-7 (Aktivität: etwa 300 Einheiten/mg) ergaben, daß dieses
Produkt von den Versuchstieren gut vertragen wurde.
-
Nach Applikation von Konzentraten von Antibioticum 1o6-7 in Mäusen
in Dosierungen von 25 und
50 mg/2o g (subkutan) und
50 mg/2o g (peroral)
wurde der Blutspiegel unter Anwendung der Zylinderplattenmethode geprüft, wobei
man M. pyogenes var. aureus als Testerreger verwendete. Die Ergebnisse sind in Tabelle
XI angegeben.
| Tabelle XI |
| Aktivität |
| von Antibiotische Konzentration im Serum, mg/ccm |
| Dosierung Antibioticum Art der |
| 1o6 Stunden nach der Applikation |
| mg/2o g Ein- |
| heiten/mg Applikation |
| 1@4 l@a a@4 1 I rlh I 2 I 21s I 3 |
| 25 92 subkutan z,35 o,65 0,6 0,58 o,17 0,03 0,05 0 |
| 50 92 - o,52 0,33 0,28 0,17 0,07 0 0 0 |
| 50 92 oral 0,7 o,53 0,34 o,22 o,o6 0,04 0 0 |
Antibioticum 1o6-7 wurde auf seinen klinischen Wert zur Verhinderung und Zerstörung
natürlicher bakterieller Infektionen in Zahntaschen nach Extraktion menschlicher
Zähne geprüft. Bei örtlicher Anwendung ist Antibioticum 1o6-7 hierfür wirksam und
unterstützt die Rückbildung von gesundem Gewebe. Ferner ist Antibioticum 1o6-7 von
Wert bei der Behandlung von Pyorrhoetaschen.
-
Antibioticum 1o6-7 ist auf Grund seiner Aktivität gegen verschiedene
Bakterien auch bei Behandlung von Tierinfektionen wirksam. Hierfür kann man die
Base von Antibioticum 1o6-7 oder seine Salze entweder in Form reiner Produkte oder
deren Konzentrate örtlich anwenden. Zu diesem Zwecke kann das antibiotische Präparat
in Form einer Lösung oder einer Salbe u. dgl. angewendet werden, die in an sich
bekannter Weise hergestellt werden.
-
In der vorstehenden Beschreibung ist die Aktivität von Antibioticum
1o6-7 und seiner Salze in Streptomycineinheiten angegeben. Diese Aktivität wurde
nach der üblichen Zylinderplattenmethode bestimmt, wobei man M. pyogenes var. aureus
und einen Streptomycinstandard verwendete. Diese Prüfmethode ist die gleiche, wie
sie für die Bestimmung von Streptomycin angewendet wird, jedoch mit der Maßgabe,
daß hier ein anderer Erreger verwendet wird.