DE2916155A1 - Verbindung dc-11, verfahren zu ihrer herstellung, pharmazeutische zubereitung und mikroorganismenstamm zur durchfuehrung des herstellungsverfahrens - Google Patents
Verbindung dc-11, verfahren zu ihrer herstellung, pharmazeutische zubereitung und mikroorganismenstamm zur durchfuehrung des herstellungsverfahrensInfo
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Description
Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen gekennzeichneten
Gegenstand.
Es besteht ein ständiger Bedarf nach Verbindungen mit antibakterieller
oder antineoplastischer Wirksamkeit. Von Seiten der Erfinder wurde eine neue Art eines Mikroorganismus
aus einer Bodenprobe in Sendai-shi, Miyagi-ken, Japan, isoliert. Die aufgefundene neue Art bildet bei ihrer Züchtung
in einem Nährmedium eine Verbindung mit antibakterieller Wirksamkeit.
Eine Untersuchung der morphologischen Eigenschaften des Mikroorganismus1 führt zu der Erkenntnis, daß es sich bei
diesen um einen neuen Stamm der Gattung Mikromonospora handelt.
Eine Untersuchung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der isolierten aktiven Verbindung
führt zu dem Ergebnis, daß es sich dabei um eine neue Verbindung handelty die als DC-11 bezeichnet wird.
Erfindungsgemäß wird die neue Verbindung DC-11 hergestellt,
indem man einen Mikroorganismus der Gattung Micromonospora,
der zur Bildung der neuen Verbindung DC-11 in der Lage ist,
in einem Nährmedium züchtet. Nach beendeter Züchtung wird die erfindungsgemäße neue Verbindung DC-11 aus der Kulturflüssigkeit
in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz, isoliert.
Die Verbindung DC-11 gemäß der Erfindung weist eine antibakterielle
Wirksamkeit auf und ist deshalb unter anderem auch zur Reinigung und Sterilisation von Laboratoriums-
L _J
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Glasgeräten und chirurgischen Instrumenten geeignet. Ferner kann sie zusammen mit Seifen, Waschmitteln und Waschlösungen
für sanitäre Zwecke eingesetzt werden. Die Verbindung der Erfindung ist aufgrund ihrer antibakteriellen Eigenschaften
auch zur Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Tieren geeignet. Darüberhinaus eignet sich die erfindungsgemäße
Verbindung DC-11, wie aus der nachstehenden Beschreibung deutlich wird, auch als antxneoplastisches Mittel bei Tieren.
Die neue Verbindung DC-11 gemäß der Erfindung weist somit
antibakterielle und antineoplastische Eigenschaften auf vmd
ist durch die nachstehenden physxkochemxschen Eigenschaften gekennzeichnet:
(1) Schmelzpunkt: 225 bis 228°C (u.Zersetzung),
(1) Schmelzpunkt: 225 bis 228°C (u.Zersetzung),
(2) Elementaranalyse: H = 6,9 %, C = 59,0, N = 2,0 %;
(3) IR-Spektrum (KBr-Pressling gemäß nachstehender Figur 1),
(4) UV-AbsorptionsSpektrum in Methanol gemäß nachstehender
Figur 2,
(5) PMR-Spektrum in CDCl3 (internes TMS) :
9,62, 6,92, 5,87-2,26 (viele Peaks), 2,09, 1,82, 1,64, 1,60, 1,53, 1,36, 1,29, 1,27, 1,21, 1,18, 1,13 (ppm),
(6) CMR-Spektrum in CDCl3 (internes TMS):
14,0, 14,2, 15,1, 16,1, 16,9, 17,0-21,0 (ca. 4 Peaks) 22,1, 25,3, 26,8-28,0 (ca. 2 Peaks), 29,7, 31,2,
34,0-37,0 (ca. 3 Peaks), 38,5, 41,8, 43,2, 44,9, 51,2, 52,8, 53,8, 54,3, 60,0-68,0 (ca. 5 Peaks), 69,3,
70,0-78,0 (ca. 6 Peaks), 83,9, 91,4, 91,5-100,0 (ca. 5 Peaks), 100,8, 118,2, 123,0, 125,9, 126,3, 136,0/
136,3, 141,3, 149,6, 157,3, 166,5, 170,4, 17O,8, 192,6,
201,4; 206,4 (ppm) und
(7) Spezifischer Drehwert:
[a]^° = -0,52° (c=2,0, Aceton),
(8) Löslichkeit:
Die Verbindung DC-11 ist löslich in Methanol, Äthanol,
Butanol, Aceton, Äthylacetat und Chloroform; geringfü-
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gig löslich in Benzol und Wasser und unlöslich in Diäthyläther,
Petroläther und n-Hexan.
Das Massenspektrum, zeigt kein ausgeprägtes Molekülion.
5
Aus der Elementaranalyse und dem CMR-Spektrum wird der Verbindung DC-11 die empirische Formel Cg4-72 Hgo-102 N2 °26-3O
zugeordnet, sowie ein Molekulargewicht von 1204 bis 1476.
Wie aus der nachstehenden Experimentalanalyse hervorgeht,
wurde festgestellt, daß die Struktur der Verbindung DC-11
L-Digitoxose sowie L—Amicetose als Bestandteile enthält.
Gemäß der vorstehend genannten Experimentalanalyse wird 1,5 g der Verbindung DC-11 in einem Lösungsmitteigemisch
aus 75 ml 0,2 N HCl und 150 ml Aceton gelöst. Die Lösung wird 17 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Anschließend wird
Aceton unter vermindertem Druck abdestilliert. Das entstandene
Gemisch wird viermal mit jeweils 50 ml Chloroform extrahiert.
Die entstandene wäßrige Phase wird unter vermindertem Druck
auf ein Volumen von 10 ml eingeengt,und das entstandene Konzentrat
wird durch eine mit einem Kationenaustauscherharz, Dowex 1x4 (OH ), gefüllte Säule, geleitet. Anschließend wird
das Austauscherharz gründlich mit Wasser gewaschen.
Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt und der
entstandene Rückstand wird säulenchromatographisch, unter
Verwendung von Kieselgel, behandelt. Die Säule x^ird mit
einem Gemisch aus Chloroform und Methanol (9 ; 1 Volumteile) entwickelt. Man erhält Fraktionen, die L-Amicetose enthalten,
sowie Fraktionen, die L-Digitoxose enthalten.
Die ersteren Fraktionen werden eingeengt, bis ein Rückstand
von 218 mg einer ölartigen Substanz verbleibt. Die letzteren
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Fraktionen werden zur Trockene eingeengt, inn 196 mg eines
Feststoffs zu ergeben.
Die ölartige Verbindung wird bei einem Druck von 0,1 Torr
destilliert, wobei ein gereinigtes Öl entsteht. Die feste Substanz wird aus einem Gemisch von η-Hexan und Aceton umkristallisiert.
Man erhält farblose Prismen.
Nachstehend sind die physikochemischen Eigenschaften des
gereinigten Öls zusammengestellt j
(1) Erscheinungsform: farbloses öl;
(2) Siedepunkt: 75°C/O,1 Torr;
(3) spezifische Drehung:
[a]p2 = -50,9° (c=1,08, Aceton);
(4) die physikochemischen Eigenschaften des 2,4-Dinitro- phenylhydrazons, das durch Umsetzung der ölartigen
Substanz mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin erhalten wird,
sind nachstehend zusammengestellt:
Schmelzpunkt: 160 bis 161°C,
PMR-Spektrum des 2 „4-Dinitrophenylhydrazons in
d,--Pyridin und internem TMS (ö, ppm) :
1,56{d, 6,1, 3H), 2,2O(m, 2H), 2f85(m, 2H), 3,94
(m, 1H), 4,14(dq, 6,1, 6,1, 1H), 7,91(d, 9,5,1H),
7,96Ct, 5,3, 1H)f 8,29(dd, 9,5, 2,7, 1H), 9,O4(d, 2,7,
1H) .
Elementaranalyse des 2,4-Dinitrophenylhydrazons:
C12H16N4°6: C HN
ber.: 46,15 5,16 17,94
gef„: 46,13 5,14 17,94.
Aus dem Vorstehenden ergibt sich, daß die ölartige Substanz als L-Amicetose identifiziert wird.
Nachstehend sind die physikochemischen Eigenschaften der vorstehend erwähnten unkristallisierten farblosen Prismen
zusammengestellt:
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1 (1) Erscheinungsform: farblose Prismen,
(2) Schmelzpunkt! 110 - 1120C,
(3) Spezifische Drehung:
[a]p2· = -37,3° (c =1,11, Methanol),
5 (4) PMR-Spektrum in CD3OD und mit internem TMS (δ, ppm):
1,23(d, 6,1, 3H), 1,61(ddd, 13,7, 9,5, 2,8, 1H),
2,02 (ddd, 13,7, 3,7, 2,8, 1H), 3,14(dd, 9,5, 3,2, 1H),
3,77 (dg, 9,5, 6,1, 1H), 4,0Ö(ddd, 3,7, 3,2, 2,8, 1H), 5,06 (dd, 9,5, 2,4, 1H).
10 (5) Elementaranalyse:
10 (5) Elementaranalyse:
C6H12O4: C H
ber.: 48,64 8,16
gef.: 48,47 8,34.
15 Aus den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, daß die farblosen
Prismen als L-Digitoxose identifiziert werden können.
In der nachstehenden Tabelle I sind die Rf-Werte der Verbindung
DC-11 bei Kieselgel-Dünnschichtchromatographie (DC) 20 unter Verwendung verschiedener Entwickler zusammengestellt:
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1 | Träger | O | Tabelle I | Rf-Werte |
I 5 |
Entwickler (V/V) | 0,55 | ||
Benzol j Aceton (35 : 65) |
0,48 | |||
Toluol : Aceton (4 : 6) |
0,60 | |||
Chloroform | ||||
II | (9 | 0,70 | ||
Chloroform , | ||||
(92,5 : | O767 | |||
Chloroform . | ||||
(85 . | 0,50 | |||
Chloroform ; (9 . |
||||
: Methanol | ||||
: D | ||||
: Dioxan | ||||
7,5) | ||||
. Tetrahydrofuran | ||||
15) | ||||
• Aceton : D |
||||
III Aceton : Dioxan : 0,35
10 % Ammoniumacetat (5:5:1)
+1: Kieselgel für DC, Nr. 5715, hergestellt von der
„λ Firma Merck & Co.7 Inc.
II: Kieselgel für "reversed phase" DC, Nr. 5747, hergestellt von Merck & Co., Inc.
III: Aluminiumoxid für DC, Nr. 5727, hergestellt von
Merck & Co., Ine.
Die Verbindung DC-11 der Erfindung wird durch Züchtung eines
Mikroorganismus* der Gattung Micromonospora, der die Fähigkeit
zur Bildung der erfindungsgemaßen Verbindung aufweist, 30
hergestellt. Ein besonders bevorzugter Stamm ist Micromonospora sp. KY 11091. Der vorstehende Stamm wurde bei der
Kultursammlung der Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S.
Department of Agriculture (ehemals Northern Regional 35
Research Agriculture), Peoria, Illinois 61604 unter der Hinter legungs -Nr . NRRL 11289 hinterlegt und ist öffentlich zugänglich.
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■j Der genannte Stamm wurde auch beim Fermentation Research
Institute, Japan, unter der Hinterlegungs-Nr. FERM-P-Nr.4458
hinterlegt.
Der genannte Stamm KY 11091 ist durch die nachstehenden Eigenschaften
gekennzeichnet j
I. Morphologische Eigenschaften:
Gut entwickeltes, verzweigtes, nicht septiertes Substrat —
.Myzel mit einem Durchmesser von etwa 0,5 μ, jedoch wird kein echtes Luftmyzel gebildet. Sporen werden sehr gut ausgebildet
und einzelne Sporen werden an den Enden von einfachen Sporophoren (Länge etwa 0,3 bis 1,0 μ), die sich aus dem
Substrat-Myzel abzweigen, gebildet. Viele Sporen werden am
Ende des Substrat-Myzels gebildet,. Gereifte Sporen weisen einen Durchmesser von etwa 1,0 μ auf und sind kugelförmig.
Wenn der Stamm im flüssigem Medium gezüchtet wird, ist das Wachstum anfänglich hellorange und wechselt in den späteren
Stadien in ein Dunkelbraun. Es werden viele Sporen gebildet.
Sofern der Stamm in einem Agar-Medium gezüchtet wird, entsteht
auf dem Medium, in dem die Sporen leicht gebildet werden, eine ziegelrote, glänzende, wachsartige Sporenschicht -
II ο Wuchsformen:
Wachsturnsgrad, Farbe des Substrat-Myzels sowie das eventuelle
Auftreten löslicher Pigmente bei der Züchtung des Stammes· KY 11091 in verschiedenen Nährböden sind in nachstehender
Tabelle II zusammengefaßt ο Die englischen Farbangaben richten
sich nach der Klassifizierung in dem Color Harmony Manual (Container Corporation of America). Die Bestimmung
der Eigenschaften erfolgt nach einer Züchtung bei 30°C während 2 Wochen.
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Tabelle II | Farbe | Lösliche Pigmente |
|
Nährboden | Wachstum | Black-olive (1 po), schwarz-oliv |
keine |
Sucrose-Nitrat-Agar | gut, flach | White (a), weiß |
keine |
Glucose-Asparagin-Agar | spärlich, flach |
White (a), weiß |
keine |
Glycerin-Asparagin- Agar |
spärlich, flach |
Black-olive (1 po), Schwarz-oliv |
keine |
Stärke-anorganische Salze-Agar |
gut, flach | Black-olive (1 po) schwarzoliv |
keine |
Tyrosin-Agar | mäßig | Apricot (4 ca), aprikosenfarben |
keine |
Nähragar | mäßig, flach | Apricot (4 ca), aprikos enfarben |
keine |
Hafermehl-Agar | mäßig, flach | Black-olive (1 po) s chwarz-oIiν |
keine |
Hefe-Malz-Agar | gut, erhaben |
Orange (4 la), orange |
keine |
Pepton-Hefe-Agar | mäßig, flach | ||
III. Physiologische Eigenschaften: Die physiologischen Eigenschaften des Stammes KY 11091 gehen
aus der nachstehenden Tabelle III hervor, in der die optimale Wachstumstemperatur nach 5-tägiger Züchtung festgestellt
wird und die Eigenschaften gegenüber Milch sowie im Hinblick auf die Zersetzung von Cellulose nach Imonatiger
Züchtung festgestellt werden. Die sonstigen Eigenschaften werden nach Züchtung bei 27 C während 2 Wochen festgestellt.
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- 11 Tabelle III
(1) Verwertung von Kohlenstoffquellen
Kohlenstoffquelle D-Arabinose D-Xylose
D-Glucose ■ D-Fructose Sucrose Inosit L-Rhamnose
D-Raffinose D-Mannitol
(2) Sonstige Eigenschaften
Verflüssigung von Gelatine Verflüssigung von Milch
Peptonisierung von Milch Zersetzung von Cellulose Hydrolyse von Stärke optimaler pH-Wert des Wachsturas
optimale Temperatur des Wachstums Bildung von Tyrosinase Bildung von melanoiden Pigmenten
Verwertung
Negativ Positiv Negativ schwach positiv 6,6 - 7,5
28 - 38°C keine
keine
Wie aus den vorstehenden Ergebnissen hervorgeht, bildet der
Stamm KY 11O91 kein echtes Luftmyzel in einem Agar-Nährboden
und bildet Einzelsporen an dem Substrat—Myzel. Durch Analyse der Zellwand kann festgestellt werden, daß der
Stamm Mesodiaminopimelinsäure enthält.
Der Stamm KY 11091 wird somit der Gattung Micromonospora
zugeordnet und der Stamm der Erfindung (KY 11091) erzeugt in einer biologisch reinen Kultur bei der Züchtung die erfindungsgemäße
Verbindung DC-11 in verwertbarer Ausbeute.
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Wie im Fall von anderen Stämmen von Actinomyzeten kann
der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete Mikroorganismus einer an sich bekannten künstlichen
Mutationsbehandlung, beispielsweise durch UV-Bestrahlung, Co -Bestrahlung, Röntgenbestrahlung und Mutation durch verschiedene,
die Mutation induzierende chemische Wirkstoffe, wie N-mathyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin und dergleichen,
unterworfen werden. Deshalb ist für das erfindungsgemäße Verfahren jeder Stamm, selbst nach erfolgter Mutation, geeignet,
soweit er die Fähigkeit zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung DC-11 aufweist.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können herkömmliche Verfahren zur Züchtung von Actinomyzeten verwendet
werden. Im Züchtungsmedium können verschiedene Nährstoff quellen eingesetzt werden. Beispiele für geeignete
Kohlenstoffquellen sind Glucose, Stärke, Mannose, Dextrin,
Fructose, Sucrose (= Saccharose) und/oder Melassen. Kohlenwasserstoffe und Alkohole, organische Säuren und dergleichen
können, je nach ihrer Verwertbarkeit durch die verwendeten Mikroorganismen, ebenfalls verwendet werden. Beispiele
für anorganische oder organische Stickstoffquellen sind Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat
und Natriumnitrat. Diese können allein oder zusammen mit natürlichen Stickstoffquellen, wie Pepton, Fleischextrakt,
Hefeextrakt, Trockenhefe, Maisquellflüssigkeit, Soyabohnenpulver, Kasaminsäure und löslichen Pflanzenproteinen, verwendet
werden. Gegebenenfalls können anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat,
Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Eisensulfat, Calciumchlorid, Mangansulfat, Zinksulfat,
oder Kupfersulfat, dem Medium zugesetzt werden. Außerdem
können organische und anorganische Produkte, beispielsweise Vitamin B1, Biotin und dergleichen, die das Wachstum des
speziellen Stammes und die Bildung der Verbindung DC-11
fördern, dem Medium zugegeben werden.
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Vorzugsweise wird die Züchtung in einem flüssigen Medium, insbesondere unter Rühren im Submersverfahren, durchgeführt.
Die Züchtungstemperaturen betragen nach Möglichkeit 25 bis 400C, vorzugsweise 28 bis 38°C. Die Züchtung wird
bevorzugt bei einem pH-Wert von 4 bis 10, insbesondere 6 bis 8, durchgeführt, wobei der gewünschte pH-Wert mittels
einer wäßrigen Ammoniaklösung oder einer Ammoniumcarbonatlösung
eingestellt wird.
Im allgemeinen hat sich nach 1 bis 7-tägiger Züchtung im flüssigen Medium die Verbindung DC-11 in der Kulturflüssigkeit
gebildet und angereichert. Wenn die Ausbeute der Verbindung DC-11 in der Kulturflüssigkeit ein Maximum erreicht,
wird die Züchtung abgebrochen. Das gewünschte Produkt wird nach dem Entfernen der Mikroorganismenzellen aus der Kulturflüssigkeit,
beispielsweise durch Abfiltrieren, isoliert und gereinigt.
Die Isolierung und Reinigung der Verbindung DC-11 wird nach
an sich üblichen Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Mikroorganismen-Stoffwechselprodukten auf Kulturflüssigkeiten
durchgeführt. Beispielsweise wird das zellfreie Kulturfiltrat
(pH-Wert 6,0) über einen mit einem nicht-ionischen porösen Austauscherharz, wie HP-20 (Warenzeichen der
Firma Mitsubishi Chemical Industries) bepackte Säule gegeben, damit die aktiven Bestandteile adsorbiert werden.
Die Desorption der aktiven Bestandteile erfolgt unter Verwendung von Methanol, Aceton, fithylacetat oder dergleichen.
Das entstandene Eluat wird zur Trockene eingeengt und der Rückstand wird in Wasser gelöst. Anschließend wird die
Lösung durch eine mit Aktivkohle gefüllte Säule geleitet und die Elution erfolgt mit einem organischen Lösungsmittel,
wie Äthylacetat. Das Eluat wird zur Trockene eingeengt und der Rückstand wird in Chloroform gelöst. Die entstandene
Lösung wird sodann durch eine Säule geleitet, die mit in Chloroform suspendiertem Kieselgel gefüllt ist, wobei gelb-
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liehe Verunreinigungen entfernt werden. Die Elution erfolgt
mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Methanol (98 ; 2 Volumteile) und das Eluat wird zur Trockene eingeengt.
Man erhält die aktive Verbindung. Das gleiche, vor-
stehend beschriebene Chromatographierverfahren oder ein Chromatographierverfahren unter Verwendung eines vernetzten
Polysaccharid-Dextrans, wie Sephadex LH-2O (Warenzeichen
der Firma Pharmacia Fine Chemicals Inc., Schweden), kann zur weiteren Reinigung des erwünschten Produktes wiederholt
werden. Die auf diese Weise erhaltene erfindungsgemäße Verbindung DC-11 weist die vorstehend geschilderten
physikochemischen Eigenschaften auf.
Die biologischen Eigenschaften der Verbindung DC-11 werden
nachstehend geschildert.
In der nachstehenden Tabelle IV ist das in vitro gemessene antibakterielle WirkungsSpektrum der Verbindung DC-11,
nach der Blättchen-Methode (Hemmhoftest-Methode) gemessen
(pH 8,0) angegeben.
Mindesthemmkonzentration (pg/ml)
25
Staphylococcus aureus ATCC 6538 P 100
Bacillus subtilus Nr. 10707 1,6
Klebsiella pneumoniae ATCC 10031
>100
Escherichia coli ATCC 26 >100
Shigella sonnei ATCC 9290 >100
Salmonella typhosa ATCC 9992 >100
Die akute Toxizität (LD50 -Wert) für die Verbindung DC-11
beträgt bei intraperitonealer Verabfolgung für Mäuse 54 mg/kg.
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Die antineoplastische Wirksamkeit der erfindungsgemäßen
Verbindung DC-11 ergibt sich aus den nachstehenden Untersuchungen :
Wirkung bei Sarkom 180 Ascitestumoren
Sechs männliche ddY-Stamm-Mäuse mit einem jeweiligen Gewicht
von 2O g werden für jede Gruppe als Testtiere eingesetzt. Es werden jeweils 5 χ 10 Sarkon 180 Ascitestumorzellen
den Tieren implantiert. 24 Stunden nach erfolgter
Implantation wird den Tieren jeweils intraperitoneal 0,2 ml Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), die jeweils
unterschiedliche Konzentrationen der erfindungsgemäßen Verbindung DC-11 enthalten, verabfolgt. Die vorstehend genannte
PBS besteht aus 0,8 g/dl Kochsalz, 0,02 g/dl KCl, 1i-15 g/dl Na3HPO4 und 0,02 g/dl KH2PO4 (pH 7,2).
Zum Vergleich werden 0,2 ml PBS-Lösungen, die als Testverbindung
Mitomycin C enthalten, einer Gruppe von Tieren während der gleichen Zeit, bei der den anderen Versuchsgruppen
die erfindungsgemäße Verbindung verabfolgt wird, gegeben.
7 Tage nach erfolgter Implantation wird bei den Versuchstieren das durchschnittliche Tumorvolumen T (mm ); und der
Wert T/C (T = durchschnittliches Tumorvolumen nach Verabfolgung der erfindungsgemäßen Testverbindung; C = durchschnittliches
Tumorvolumen ohne Verabfolgung einer Testverbindung) bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden
Tabelle V zusammengefaßt.
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Testverbindung | Dosis (mg/kg) | T (mm ) | T/C |
Kontrolle | 0 | 1405 | — |
DC-11 | 25 | 1096 | 0,78 |
DC-11 | 50 | 730 | 0,52 |
DC-11 | 70 | 590 | 0,42 |
Mitomycin C | 4,2 | 450 | 0,32 |
Ti durchschnittliches Tumorvolumen
(2) Wirkung auf den Lymphozytenleukämie P-388 Tumor Als Testtiere werden für jede Versuchsgruppe fünf männliche
CDF1-MaUSe mit einem jeweiligen Gewicht von etwa 22 g
verwendet. Den Testtieren werden jeweils 1 χ 10 -Zellen Lymphozytenleukämie P-388 Tumor-Zellen intraperitoneal
implantiert. 24 Stunden nach erfolgter Implantation erfolgt die intraperitoneale Zugabe von 0,2 ml PBS-Lösung, die die
Verbindung DC-11 in jeweils verschiedenen Konzentrationen
enthält.
Zum Vergleich mit einer Gruppe der Testtiere wird gleichzeitig eine Lösung von 0,2 ml PBS, die als Testverbindung
Mitomycin C enthält, intraperitoneal verabreicht.
Die nach der Implantation erhaltenen Versuchsergebnisse
sind in der nachstehenden Tabelle VI zusammengefaßt. In der Tabelle bedeuteten die Ausdrücke ASP (average survival
period) die durchschnittliche Überlebensdauer nach der Verabfolgung, ausgedrückt in Tagen. Der Quotient ASP/C
stellt das Verhältnis der durchschnittlichen tiberlebensdauer (in Tagen) aus der Gruppe der Versuchstiere, denen
die erfindungsgemäße Testverbindung verabfolgt wurde und der durchschnittlichen Überlebensdauer (in Tagen) C von
Versuchstieren, denen keine Testverbindung verabfolgt wurde, dar,
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- 17 - | ASP (Tage) | 2916155 | "I | |
Tabelle VI | 9,4 | |||
Testverbindung | Dosis (mg/kg) | 11,2 | ÄSP/C | |
Kontrolle | 0 | 13,4 | — | |
DC-It | 6,25 | 13,0 | 1,20 | |
DC-11 | 12,5 | 14,2 | 1,43 | |
DC-11 | 25,0 | 1,38 | ||
Mitomycin C | 4,2 | 1,51 | ||
Wie die vorstehenden Ergebnisse zeigen, ist die erfindungsgemäße
Verbindung DC-11 sowohl als antxneoplastisches als auch als antibakterielles Mittel wirksam.
Die Verabfolgung der erfindungsgemäßen Verbindungen als
pharmazeutische Präparate kann enteral, parenteral oder
lokal erfolgen.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen
übliche Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel
und/oder Hilfsstoffe enthalten.
20
20
Die Verabfolgung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zu-.
bereitungen kann in an sich bekannter Weise in Form von Tabletten, Kapseln oder als Flüssigkeiten, z.B. in Form
von Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen, erfolgen.
Die Verabfolgung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen
zur Verwendung als antineoplastische Mittel erfolgt vorzugsweise in Form von Injektionspräparaten.
Die jeweils geeignete Dosierung hängt von der erwünschten therapeutischen Wirkung der Verabfolgungsweise und der geplanten
Behandlungsdauer ab. Im allgemeinen sind tägliche Dosierungen von etwa 0,1 bis 0,5 mg/kg Körpergewicht zum
Erzielen einer antineoplastischen Wirksamkeit ausreichend.
9Q9844/O912
Das Beispiel erläutert die Erfindung. Hierbei wird die Anwesenheit
der Verbindung DC-11 durch ein bio-assay-Verfahren unter Verwendung von Bacillus subtilus Nr. 10707 als
Test-Mikroorganismus nachgewiesen.
Beispiel 1
Der Stamm Micromonospora sp. KY 11091, NRRL 11289 wird in
einen 2 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben überimpft, der 30O ml eines Kulturmediums enthält, das wie folgt zusammen-"
gesetzt ist: 4 g/Liter KCl, 0,5 g/Liter MgSO..7H„O,
1,5 g/Liter KH2PO4, 5,0 g/Liter (NH4J2SO4, 20 g/Liter
Sucrose, 10 g/Liter Fructose, 10 g/Liter Glucose, 5,0 g/Liter Maisquellwasser und 20 g/Liter CaCO3 (pH 7,0).
Die Züchtung wird 48 Stunden unter Rühren (220 Upm) bei 300C
durchgeführt. Sodann werden 0,75 Liter der auf diese Weise
erhaltenen Vorkultur in einen 30 Liter fassenden Fermenter überimpft. Die Zusammensetzung des dort enthaltenen Kulturmediums
ist wie folgt:
40 g/Liter lösliche Stärke, 8 g/Liter Hefeextrakt, 0,09 g/Liter MgSO4^H3O, 0,15 g/Liter KH2PO4, 0,21 g/Liter K3HPO , 10 mg/Liter Vitamin B..HCl, 30 ug/Liter Biotin, 10 mg/Liter FeSO4^H3O, 30 mg/Liter CaCl3, 4 mg/Liter MnSO4, 30 mg/Liter ZnSO..7H2O und 2 mg/Liter CuSO4-SH2O.
40 g/Liter lösliche Stärke, 8 g/Liter Hefeextrakt, 0,09 g/Liter MgSO4^H3O, 0,15 g/Liter KH2PO4, 0,21 g/Liter K3HPO , 10 mg/Liter Vitamin B..HCl, 30 ug/Liter Biotin, 10 mg/Liter FeSO4^H3O, 30 mg/Liter CaCl3, 4 mg/Liter MnSO4, 30 mg/Liter ZnSO..7H2O und 2 mg/Liter CuSO4-SH2O.
Vor der Sterilisation wird das Nährmedium mit NaOH auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Die Züchtung in dem Fermenter
wird 72 Stunden unter Belüftung und Rühren (15 Liter/min, Belüftung; 150 Upm) bei 30°C durchgeführt. Der pH-Wert des
Nährmediums wird während der Züchtung nicht kontrolliert.
Die entstandene Kulturflüssigkeit wird danach filtriert.
Man erhält 13 Liter Filtrat. Das Filtrat wird auf eine mit 1 Liter eines nicht-ionischen porösen Austauscherharzes
HP-10 (Warenzeichen der Firma Mitsubishi Chemical Industries) gegeben, um die aktiven Bestandteile zu adsorbieren. Anschließend
wird das Austauscherharz zur Entfernung der Ver-
909844/0912
unreinigungen mit einem Gemisch aus Wasser und 30 % (V/V)
Aceton gewaschen. Die Elution erfolgt mit Aceton. Die vereinigten Acetonfraktionen werden zur Trockene eingeengt.
Man erhält einen Rückstand/ der in einer 30prozentigen Acetonlösung gelöst wird.
Die entstandene Lösung wird auf eine mit 50 ml Aktivkohle
gefüllte Säule gegeben. Anschließend wird die Säule mit
einer 30prozentigen Acetonlösung gewaschen. Die Elution erfolgt
mit Aceton, wobei der größte Teil der in der Lösung als Verunreinigungen anwesenden Pigmente entfernt wird.
Die aktiven Fraktionen werden vereint und zur Trockene eingeengt.
Der Rückstand wird in etwa 10 ml Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung wird auf eine mit 500 ml Kieselgel
(Silic AR CC-4, Warenzeichen der Firma Mallinckrodt Co., U.S.A.), das in Chloroform suspendiert ist, gefüllte Säule
gegeben und mit etwa 2 Liter Chloroform gewaschen.
Die Elution erfolgt mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform
und Methanol (98 : 2 Volumteile'. Man erhält DC-11
enthaltende Fraktionen. Die Fraktionen werden vereint und zur Trockene eingeengt. Man erhält 55 mg eines Rohproduktes.
Das Rohprodukt wird wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung von Kieselgel, chromatographiert. Man erhält
32 mg eines gereinigten Pulvers, dessen physikochemische Eigenschaften und dessen antibakterielle und antineoplastische
Wirksamkeit mit den vorstehend geschilderten Eigenschaften übereinstimmen.
909844/0912
Claims (6)
- u.Z.ι Ρ 140 (PT/kä)
Case: 232-4KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.
Tokyo, Japan
10" Verbindung DC-11, Verfahren zu ihrer Herstellung, pharmazeutische Zubereitung und Mikroorganismenstamni zur Durchführung des Herstellungsverfahrens "Priorität: 2O. April 1978, Japan, Nr. 45 916/1978Patentansprüche1= Verbindung DC-11, gekennzeichnet durch folgende Kenndaten:(1) Schmelzpunkt: 225 bis 228°C (übersetzung),
(2) Elementaranalyse: H = 6,9 %,.C = 59,0, N = 2,0 %,(3) IR-Spektrum (KBr-Pressling gemäß nachstehender Figur 1)(4) UV-Absorptionsspektrum in Methanol gemäß nachstehender Figur 2, *(5) PMR-Spektrum in CDCl3 (internes TMS) ι9,62, 6,92, 5,87-2,26 (viele Peaks), 2,09, 1,82, 1,64, 1,60, 1,53, 1,36, 1,29, 1,27, 1,21, 1,18, 1,13 (ppm),(6) CMR-Spektrum in CDCl3 (internes TMS):14,0, 14,2, 15,1, 16,1, 16,9,'17,0-21,0 (ca. 4 Peaks)
22,1 s 25,3, 26,8-28,0 (ca. 2 Peaks), 29,7, 31,2,
34,0-37,0 (ca. 3 Peaks), 38,5, 41,8, 43,2, 44>9, 51,2, 52,8, 53,8, 54,3, 60,0-68,0 (ca. 5 Peaks), 69,3,909844/0912Γ -2 -70,0-78,0 (ca. 6 Peaks), 83,9, 91,4, 91,5-100,0 (ca. 5 Peaks), 100,8, 118,2, 123,0, 125,9, 126,3, 136,O,136.3, 141,3, 149,6, 157,3, 166,5, 170,4, 170,8, 192,6,201.4, 206,4 (ppm) und
(7) Spezifischer Drehwert:[a]p° = -0,52° (c=2,0, Aceton). - 2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung DC-11 gemäß Anspruch \, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Gattung Micromonospora, der die Fähigkeit zur Bildung der Verbindung DC-11 besitzt, in einem Nährmedium züchtet , bis sich in der Kulturflüssigkeit eine wesentliche antibakterielle Aktivität nachweisen läßt und daran anschließend die Verbindung DC-11 aus der Kulturflüssigkeit isoliert.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Micromonospora sp.· KY 11091, NRRL 11289 verwendet.
- 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei einer Temperatur von 25 bis 40 C während 1 bis 7 Tagen bei einem pH-Wert von etwa 4 bis 10 vornimmt.
- 5. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend die Verbindung gemäß Anspruch 1 und übliche Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoffe.
- 6. Biologisch reiner Mikroorganismenstamm Micromonospora sp. KY 11091 zur Durchführung des Verfahrens gemäß den Ansprüchen 2 bis 4, der die Kenndaten des hinterlegten Stammes NRRL 11289 aufweist, gekennzeichnet durch dessen Fähigkeit, die Verbindung DC-11 gemäß Anspruch 1 in ausreichenden Mengen durch Züchtung in einem Nährmedium zu bilden. 35L J909844/0912
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-
1979
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- 1979-04-20 GB GB7913750A patent/GB2019388B/en not_active Expired
Non-Patent Citations (1)
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Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 1957, S. 822-823 * |
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---|---|
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GB2019388A (en) | 1979-10-31 |
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