DE3012014C2

DE3012014C2 - Istamycine, Verfahren zu deren Herstellung sowie Verwendung derselben als antibakterielle Mittel

Info

Publication number: DE3012014C2
Application number: DE3012014A
Authority: DE
Inventors: Shinichi Yokohama Kanagawa Kondo; Yoshiro Tokio/Tokyo Okami; Hamao Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1979-05-01
Filing date: 1980-03-28
Publication date: 1986-11-13
Also published as: CH646712A5; DE3012014A1; IT8009394A0; CA1158999A; NL8001842A; FR2455596A1; FR2455596B1; ES8105034A1; ES491077A0; IT1153794B; US4296106A; GB2048855B; GB2048855A

Description

Die Erfindung betrifft vier Antibiotika, die als Istamycin A, Istamycin B, Istamycin A₀ und Istamycin B₀ bezeichnet werden. Die Erfindung betrifft weiterhin die fermentative Herstellung dieser neuen Antibiotika unter Verwendung eines neuen Mikroorganismus sovie die Verwendung der neuen Antibiotika als antibakterielle Mittel (vg!. hierzu die Patentansprüche 1-3).

Eine große Anzahl verschiedener pathogener Mikroorganismen wie Bakterien und Fungi ist die Ursache fur das Auftreten von Krankheiten bei Menschen, bei Tieren und Pflanzen. Obwohl eine Anzahl von Antibiotika entwickelt worden ist, von denen einige eine hohe antimikrobielle Wirkung gegen die verschiedenen pathogenen Mikroorganismen aufweisen, besteht nach wie vor ein Bedarf an starker wirksamen therapeutischen Mitteln, mit denen von pathogenen Mikroorganismen beim Menschen, bei Tieren und Pflanzen hervorgerufene Krankheiten bekämpft werden können.

Die ErPndung macht es sich zur Aufgabe, neue Antibiotika bereitzustellen, die als antibaJcterielle Mittel bei der therapeutischen Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Menschen und Tieren und/oder zur Sterilisation chirurgischen Materiales und chirurgischer Instrumente verwendet werden können. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur fermentativen Herstellung der neuen Antibiotika vorzuschlagen.

Im Zusammenhang mit der Gewinnung der neuen Antibiotika hat die Anmelderin umfangreiche Forschungen durchgeführt. Das Ergebnis dieser Forschungen besteht unter anderem in der Auffindung eines neuen Stamme"« der Gattung Streptomyc ;s, welcher aus einer Bodenprobe isoliert werden konnte, die im Seeboden der Küste der Halbinsel Miura in Kanagawa Prefecture, Japan gefunden wurde. Der neue Stamm erhielt die Bezeichnung Streptomyces tenjimariensis SS-939 und wurde in einem Kulturmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet. Bei der Züchtung wurden vier verschiedene Substanzen erzeugt, die eine antibakterielle Wirkung gegen eine groß-.; Zahl verschiedener Bakterien aufweisen. Diese antibakteriellen Sustanzen konnten aus der Kulturbrühe isoliert und gereinigt werden. Aus den chemischen, physiÄalischen und mikrobiologischen Untersuchungen der isolierten Substanzen ergab sich, daß es sich bei jeder der isolierten Substanzen um ein neues Aminoglycosid-Antibiotikum handelt, welches sich durch eine geringe Toxizität auszeichnet und welches klar von den bekannten Antibiotika unterschieden ist. Die Wer neuen Antibiotika sind als Istamycin A, Istamycin B, Istamycin A₀ und Istamycin B₀ bezeichnet worden.

(a) Istamycin A entspricht der Summenformel Ci₇Hj₅N₅O₅. Die Verbindung enthält zwei N-Methylgruppen und eine O-Methylgruppe im Molekül. Sie zeigt nur eine Endabsorption im Ultraviolett-Absorptionsspektrum in Wasser. Die Verbindung ist löslich in Wasser und Methanol, kaum löslich oder unlöslich in Äthanol und anderen gewöhnlichen organischen Lösungsmitteln. Sie gibt eine positive Re; ktion mit Ninhydrin- und Rydon-Sm ith-Reagenz und ihr Rf-Wert bei der Zellulose-Dünnschichtchromatographie beträgt 0,22, wenn zum Entwikkein n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (Volumenverhältnis 6:4:2:4) verwendet wird. Das Istamycin-A-Hemicarbonat liegt in Form eines farblosen Pulvers vor, welches keinen definierten Schmelzpunkt besitzt und sich bei 102 bis 108⁰C zersetzt. Die spezifische optische Drehung beträgt (a)² _D ^s = +155° (cO,4, Wasser).

(b) Istamycin B entspricht der Summenformel C₁₇Hj₅N₅O₅. Die Verbindung enthält zwei N-Methylgruppen und eine O-Methylgruppe im Molekül. Sie zeigt nur eine Endabsorption im Ui/raviolstt-Absorptionsspektnim in Wasser. Die Verbindung ist löslich in Wasser und Methanol, kaum oder unlöslich in Äthanol und anderen gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln. Sie gibt eine positive Reaktion mit Ninhydrin-und Rydon-Smith-Reagenz. Der Rf-Wert bei der Zellulose-Dünnschichtchromatographie liegt bei 0,25, wenn zum Entwickeln ein

Gemisch aus n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (Volumenverhältnis 6:4:2:4) verwendet wird. Das Istamycin-B-Hemicarbonat stellt ein farbloses Pulver dar, welches keinen definierten Schmelzpunkt besitzt, sondern sich bei 112 bis 114 °C zersetzt und eine spezifische optische Drehung von (α) ff = +165°(c0,4, Wasser) aufweist.

(c) Istamycin A₀ entspricht der Summenformel Ci₅H₃₂N₄O₄. Die Verbindung enthält zwei N-Methylgruppen und eine O-Methylgruppe im Molekül. Im Ultraviolett-Spektrum zeigt die Verbindung in Wasser nur eine

Endabsorption. Istamycin A₀ ist in Wasser und Methanol kaum löslich, in Äthanol und anderen gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln unlöslich. Die Verbindung gibt eine positive Reaktion mitNinhydrin und Rydon-Smith-Reagenz; ihr Rf-Wert bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel liegt bei 0,36, wenn zum Entwikkeln die untere Phase einer Mischung aus Chloroform-Methanol-17%igem wäßrigen Ammoniak (Volumenver-ίο hältnis2:1:1) verwendet wird. Das Istamycin Ao-Hemicarbonat bildet ein farbloses kristallines Pulver, welches keinen definierten Schmelzpunkt besitzt, sondern sich bei 111 bis 114⁰C zersetzt und eine spezifische optische Drehung von (a)^: _n ^: = +76° (c0,56, Wasser) aufweist.

(d) Istamycin B₀ entspricht der Summenformel C₁₅H₃₂N₄O₄. Die Verbindung enthält zwei N-Methylgruppen und eine O-Methylgruppe im Molekül. Im Ultraviolett-Absorptions-Spektrum zeigt Istamycin B₀ in Wasser nur eine Endabsorption. Die Verbindung ist in Wasser und Methanol kaum löslich, in anderen gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln und Äthanol unlöslich. Die Reaktion gegenüber Ninhydrin und Rydon-Smith-Reagenz ist positiv; bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel liegt der Rf-Wert der Verbindung bei 0,14, wenn zum Entwickeln die untere Phase einer Mischung aus ChIoroform-Methanol-17%igem wäßrigem Ammoniak (Vclun^enverhältnis 2:1:1} verwendet wird. Dss IsisrR^cin ^--Hsrnicürbonst lis°t in Form ^inc^ ferb'ospn kristallinen Pulvers vor, welches keinen definierten Schmelzpunkt besitzt. Die spezifische optische Drehung liegt bei(e)£* = + 160° (c 1,0 Wasser).

Wenn im Folgenden von Istamycin die Rede ist, so ist damit entweder Istamycin A, Istamycin B, Istamycin A₁, oder Istamycin B₀ oder aber eine Mischung dieser Substanzen gemeint, soweit im Einzelfall nicht etwas anderes angegeben ist. Unter dem Ausdruck Istamycin-Komplex wird eine Mischung aus zwei, drei oder allen Istamycinen A, B, A_n und B₀ verstanden, soweit nichts anderes angegeben ist. Die vorliegende Erfindung umfaßt also Istamycin A, Istamycin B, Istamycin A₀ und Istamycin B₀, entweder allein oder in Mischung von wenigstens zwei der genannten Substanzen, die in verdünnter Lösung, als Rohkonzentrat oder als feste Rohsubstanz, jedoch auch als gereinigte feste Substanz in Form der freien Base oder in F itn von Säureanlagerungssaizen mit anorganischen oder organischen Säuren vorliegen können.

Die physiko-chemischen Eigenschaften von Istamycin, einschließlich der bereits erwähnten Eigenschaften werden im Folgenden im einzelnen beschrieben.

Istamycin A ist eine basische Verbindung; es läßt sich als Carbonat in Form eines farblosen Pulvers isolieren, welches keinen definierten Schmelzpunkt besitzt, sich vielmehr bei 102 bis 108⁰C zersetzt und eine spezifische optische Drehung von (a) ff = + 155°(cO,4, Wasser) besitzt. Die Gewichtsanalyse stimmt mit den theoretischen Werten für die Summenformel C₁₇H₃₅N₅O₅ · ¹A H₂CO, (C 49,99%; H 8,63%; N 16,65%; O 24,73%) überein.

Die Summenformel konnte durch die Massenspektrometrie (gefunden: m/e 389,2588; berechnet für

CpHj₅N₅O₅: m/e389.2635) bestätigt werden. Das Infrarot-Absorptionsspektnim von Istamycin-A-Hemicarbonat in Kaliumbromid-Tablette ist in Fig. 1 der beigefügten Zeichnungen dargestellt. Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Istamycin-A-Hemicarbonat in Wasser zeigt nur eine Endabsorption. Beim kernmagneti-.sehen Resonanzabsorptionsspektrum - Proton (' H) - äußerer Standard: TMS, pD 5,4 - von Istamycin-A-Hemicarbonat in Deuterowasser finden sich charakteristische Signale bei 53,20 (s, N - CH₃), 3,57 (s, N - CH₃), 3,89 (s, O - CH,), 4,50 (s, CH₂) und 5,SO (d, J = 3,5 Hz, CH). Istamycin A ist löslich in Wasser und Methanol, schwach löslich oder unlöslich in Äthanol und anderen gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln und seine Reaktion gegenüber Ninhydrin- und Rydon-Smith-Reagenz ist positiv. Istamycin A gibt einen Einzelfleck bei Rf 0,22 bei der Dünnschichtchromatographie an Zellulose (Avicel^e), wenn zum Entwickeln ein Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (Volumenverhältnis 6:4:2:4) verwendet wird. Istamycin A unterscheidet sich so von Istamycin B, welches einen Einzelfleck bei derselben Dünnschichtchromatographie an Zellulose bei Rf 0,25 gibt. Bei der Hochspannungspapierelektrophorese (3300 Volt, 15 Minuten) unter Verwendung von Ameisensäure-Essigsäure-Wasser (Volumenverhältnis 25 :75:900) ist die Mobilität von Istamycin A und Istamycin B gleich groß und liegt bei 2,15, wenn die Mobilität von Alanin als Standardsubstanz mit 1,0 angenommen wird. Durch Hochspannungspapierelektrophorese läßt sich Istamycin A folglich nicht von Istamyci.. B unterscheiden.

Istamycin B ist in seinen Eigenschaften dem Istamycin A sehr ähnlich. Das Istamycin B ist ebenfalls eine basische Verbindung. Das als Carbonat in Form eines farblosen Pulvers isolierte Istamycin B besitzt keinen definierten Schmelzpunkt, zersetzt sich vielmehr bei 112 bis 124°C und zeigt eine spezifische optische Drehung von (a) ²o = +165 ° (c 0,4, Wasser). Die Werte der Gewichtsanalyse stimmen mit den theoretischen Werten der Summenforme! C₁₇H₃₅N₅O₅ · V₂ H₂CO₃ (C 49,99%; H 8,63%; N 16,65%; O 24,73%) überein. Diese Summenformel konnte durch die Werte der Massenspektrometrie mit hohem Auflösungsvermögen (gefunden: m/e 389,2625; berechnet für C₁₇H₃₅N₅O₅: m/e389,2635) bestätigt werden. Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Istamycin B

in Kaliumbromid-Tablette ist in Fig. 2 der beigefügten Zeichnungen dargestellt Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Istamycin-B-Hemicarbonat in Wasser zeigt nur eine Endabsorption. Im kernmagnetischen Resonanz-Absorptionsspektrum - Proton (' H) - externer Standard: TMS, pD 5,4 - von Istamycin-B-Hemicarbonal in Deuterowasser finden sich charakteristische Signale bei δ 3,26 (s, H-CH₃), 3,59 (s, N-CH₃), 3,95 (s, O - CH₃), 4,57 (s, CH₂) und 5,96 (d, J = 3,5 Hz, CH). Ähnlich wie Istamycin A ist Istamycin B in Wasser und Methanol löslich, schwach löslich bis unlöslich in Äthanol und anderen gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln. Eine Reaktion gegenüber Ninhydrin- und Rydon-Smith-Reagenz ist positiv. Wie bereits angegeben, ist Istamycin B vom Istamycin A durch die Dünnschichtchromatographie an Zellulose zu unterscheiden und zu trennen.

lstamycin A₀ ist ebenfalls eine basische Verbindung. Istamycin A₀ läßt sich als Hemicarbonat in Form eines farblosen kristallinen Pulvers isolieren; dieses Pulver besitzt keinen definierten Schmelzpunkt, zersetzt sich bei 111 bis 114°C und zeigt eine spezifische optische Drehung von (a)js = +76° (cO.56, Wasser). Die Werte der Gewichtsanalyse stimmen mit den theoretischen Werten der Summenformel C]₅H₃₂N₄O₄ · V₂ H₂CO₃ (C 51,22%; H 9,15%; N 15,42%) übcrcin. Die Summcnformcl konnte durch Massenspektrornetrie mit hoher Auflösung (gefunden: m/e332,2414; berechnet für Ci₅H₃₂N₄O₄: m/e332,2420) bestätigt werden. Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Istamycin-Ao-Hemicarbonat in Kaliumbromid-Tablette ist in Fig. 3 der beigefügten Zej^anungen dargestellt. Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Istamycin-Ao-Hemicarbonat in Wasser zeigt nur eine Endabsorption. Im kernmagnetischen Resonanzabsorptionsspektrum - Proton (¹H) - externer Standard: TMS, pD 5,0 - von Istamycin-Ao-Hemicarbonat in Deuterowasser finden sich charakteristische Signale bei δ 3,23 (s, N - CH₃), 3,28 (s, N - CH₃), 3,94 (s, O - CH₃), 5,86 (d, J = 4 Hz, CH). Istamycin A₀ ist löslich in Wasser und Methanol, kaum löslich oder unlöslich in Äthanol und anderen gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln. Seine Reaktion gegenüber Ninhydrin- und Rydon-Smith-Reagenz ist positiv. Istamycin A₀ gibt einen Einzelfieck bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel bei Rf 0,36, wenn zum Entwickeln die untere Phase einer Mischung aus Chloroform»Methanol-17%igem wäßrigem Ammoniak (Volumenverhältnis 2:1:1) verwendet wird. Bei der Hochspannungspapierelektrophorese (3300 Volt, 15 Minuten) beträgt die relative Mobilität von Istamycin A₀ 2,35, wenn die Mobilität von Alanin mit 1,0 angenommen wird und als Laufmittel ein Gemisch aus Ameisensäure, Essigsäure und Wasser (Volumenverhältnis 1:3 :36) verwendet wird.

!stufivci·* ^* ist »benfsüs eine basische Verb'*»«¹¹]*" ^i ^°f^m ^e^c Hw^m'carbonates kann die Verbinden*¹ als farbloses kristallines Pulver isoliert werden, welches keinen definierten Schmelzpunkt zeigt. Die spezifische _ optische Drehung liegt bei {a) ff = +160° (c 1, Wasser). Die Werte der Gewichtsanalyse stimmen mit den theore-

tischen Werten für die Summenformel Ci₅H₃₂N₄O₄ · '/₂ H₂CO₃ · V₂ H₂O (C 49,98%; H 9,20%; N 15,04%) überein. Diese Summenformel konnte durch Massenspektrometrie mit hoher Auflösung (gefunden: m/e 332,2384; berechnet für Ci₅H₃₂N₄O₄ :m/e332,2421) bestätigt werden. Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Istamycin B₀ in Kaliumbromid-Tablette ist in F i g. 4 der beigefügten Zeichnungen dargestellt. Das Ultraviolett-Absorptions-Spektrum von Istamycin-Bo-Hemicarbonat in Wasser zeigt nur eine Endabsorption. Im kernmagnetischen Resonanz-Absorptionsspektrum - Proton (' H) - externer Standard: TMS, pD 5,2 - von Istamycin-Bo-Hemicarbonat in Deuterowasser zeigen sich charakteristische Signale bei δ 3,21 (s, N-CH₃); 3,28 (s, N-CH.,); 3,91 (s, O - CH₃); 5,92 (d, J = 3,5 Hz, CH). Istamycin B₀ ist löslich in Wasser und Methanol, jedoch kaum löslich oder unlöslich in Äthanol und anderen gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln. Die Reaktion gegen Ninhydrinup-Rydon-Smith-Reagenz ist positiv. Istamycin B₀ ergibt einen Einzelfieck bei der bereits beschriebenen Dünnschichtchromatographie an Silikagel bei Rf 0,14, wenn zum Entwickeln die untere Phase einer Mischung aus Chloroform-Methanol-15%igem wäßrigen Ammoniak (Volumenverhältnis 2:1:1) verwendet wird. Bei der Hochspannungspapierelektrophorese - durchgeführt wie für Istamycin A₀ beschrieben - ist Istamycin B₀ nicht vom Istamycin A₀ zu unterscheiden, weil die Mobilitäten beider Verbindungen in gleicherweise bei 2,35 liegen.

Aufgrund der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung durchgeführten Untersuchungen können die folgenden Strukturformeln für die erfindungsgemäßen Istamycine als gesichert gelten:

JH \ O

Istamycin A

NH₂
H₃CNH * .

NH₂O-

(D OCH₃

H₂NCH₂CON
I

CH

Istamycin B

NH₂

OCH₃

H₂NCH₂CON

CH₃

Istamycin A₀

HO-

OCH₃

oder

OCH₃

(ΠΙ) (IV)

Bei den Untersuchungen zur chemischen Struktur des Istamycins A₀ hat sich gezeigt, daß diese Verbindung in wäßriger Lösung bei höheren pH-Werten als dem Neutralwert eine Konfiguration annimmt, die der Formel III 50 entspricht, während sie in wäßriger Lösung bei pH-Werten niedriger als derNeutralwert (protonenhaltige Form) der Formel IV entspricht.

Istamycin B₀

„ CH₂NHCH₃

NH₂

(V)

OCH₃

Istamycin A, Istamycin B, Istamycin A₀ und Istamycin B₀ lassen sich jeweils in Form der freien Base oder als Hydrat oder Carbonat derselben erhalten; die Verbindungen können in pharmazeutisch akzeptable Säureanlagcrungssalze umgewandelt werden, indem man sie in bekannter Weise mit einer pharmazeutisch akzeptablen Siiure umsetzt. Die pharmazeutisch akzeptablen Säureanlagerungssalze des Istamycins lassen sich so beispielsweise durch Umsetzen mit einer anorganischen Säure wie ChlorwasserstofFsäure, BromwasserstofTsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Sulfonsäure oder mit einer organischen Säure wie Essigsäure, Apfelsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Methansulfor.säure gewinnen.

In den beigefügten Zeichnungen entsprechen die dargestellten Kurven den Infrarot-Absorptionsspektren von Proben der Hemicarbonate - in Kaliumbromid-Tablette von

Fig. 1 Istamycin A,
Fig. 2 Istamycin B,
Fig. 3 Istamycin A₀ und
Fig. 4 Istamycin B₀.

Istamycin A und Istamycin B gemäß vorliegender Erfindung zeigen eine starke antibakterielle Wirkung gegen eine große Zahl gram-negativer und gram-positiver Bakterien, was deutlich aus den Wirkungsspektren der Substanzen in der folgenden Tabelle 1 hervorgeht. Istamycin A und Istamycin B inhibieren sowohl das Wachstum von gram-negativen als auch gram-positiven Bakterien. Die Mindesthemmkonzentrationen (mcg/ml) von Istamycin A urtd Istamycin B gegen verschiedene Bakterien wurden nach der seriellen Standard-Verdünnungsmethode an Mähragarplatten bestimmt, die bei einer Temperatur von 37°C 17 Stunden bebrütet wurden.

Test-Mikroorganismus

Mindesthemmkonzentration
(mcg/ml)

Istamycin A Istamycin B

Staphylococcus aureus 209 P Staphylococcus ture.us Smith Staphylococcus aureus Ap 01 Staphylococcus epidermidis Micrococcus flavus FDA 16 Sarcina lutea PCI 1001 Bacillus anthracis
Bacillu subtilis PCI 219 Bacillu subtilis NRRLB-558 Bacillus cereus ATCC 10 702 Corynebacterium bovis 1810 Mycobacterium smegmatis ATCC Escherichia coli NIHJ Escherichia coli K-12 Escherichia coli K-12 R 5 Escherichia coli K-12 R 388 Escherichia coli K-12 J 5 R 11-2 Escherichia coli K-12 ML 1629 Escherichia coli K-12 ML 1630 Escherichia coli K-12 ML 1410 Escherichia coli K-12 ML 1410 S. Escherichia coli K-12 LA 290 R Escherichia coli K-12 LA 290 R Escherichia coli K-12 LA 290 R Escherichia coli W 677 Escherichia coli JR 66AV 677 Escherichia coli K-12 C 600 R

1,56	0,78
0,39	< 0,10
1,56	1,56
1,56	1,56
25	6,25
1,56	3,13
0,78	< 0,10
0,39	< 0,10
1,56	< 0,10
6,25	3,13
3,13	1,56
1,56	0,78
3,13	1,56
3,13	1,56
6,25	6,25
3,13	1,56
3,13	1,56
3,13	3,13
6,25	3,13
12,5	3,13
6,25	3,13
6,25	3,13
3,13	1,56
3,13	1,56
3,13	1,56
6,25	6,25
>5O	25

Fortsetzung

Test-Mikroorganismus Mindesthemmkonzentnition

(mcg/ml)

Istamycin A Istamydn B

Escherichia coH JR 225 3,13 1,56

Klebsiella pneumoniae PCI 602 6,25 3,13

Klebsiella pneumoniae 22 # 303S 12,5 12,5

Shigella dysenteriae JS 11910 12,5 6,25

Shigellaflexneri4B JS 11811 12,5 12,5

Shigella sonnei JS 11756 12,5 12,5

Salmonella typhi T-63 1,56 12,5

Salmonella enteritidis 1891 3,13 3,13

Proteus vulgaris OX 19 1,56 0,78

Proteus retigeri GN 311 25 12,5

Proteus rettgeri GN 466 6,25 6,25

Serratia marcescens 25 12,5

Serratia SOU >50 >25

Serratia 4 >50 >25

Providencia Pv 16 50 12,5

Providencia 2991 50 25

Pseudomonas aeruginosa A 3 >50 12,5

Pseudomonas aeruginosa No. 12 >50 >25

Die antibaktenelle Wirkung von Istamycin A₀ und Istamycin B₀ wurde in derselben Weise nach derselben Standard-Verdünnungsmethode an Nähragarplatten wie für Istamycin A und Istamycin B angegeben bestimmt. Istamycin A₀ und Istamycin B₀ zeigen nur eine geringe Wirkung. Es hat sich gezeigt, daß die antibakterielle Wirkung von Istamycin A₀ nur etwa '/_2OOstel von Istamycin A und die antibakterielle Wirkung vom Istamycin B₀ nur etwa '/₂₀₀stel der Wirkung von Istamycin B betragen, wenn man als Test-Mikroorganismus Bacillus subtilis verwendet.

Mäuse vertrugen die intravenöse Verabreichung von 100 mg/ag Istamycin A, Istamycin B, listamycin A₀ oder Istamycin B₀.

Im Hinblick auf die vorstehend genannten Eigenschaften von Istamycin A und Istamycin B: kann gesagt werden, daß Istamycin A und Istamycin B in einigen Punkten dem Fortimicin A (R. Okachi et al, Journal of Antibiotics Bd. 30, Seite 541 (1977) und Sporaricin (T. Deushi et al, Journal of Antibiotics, Bd. 32, Seilte 173 (1979) ähnlich sind. Unzweifelhaft unterscheiden sich Istamycin A und Istamycin B aber von den bekannten Antibiotika durch die Tatsache, daß sie keine C-Methylgruppe, sondern vielmehr zwei N-Methylgruppen im Molekül enthalten; die Istamycine A und B und ebenso die Istamycine A₀ und B₀ müssen daher als neue Antibiotika angesehen werden.

Die Herstellung des Istamycin-Komplexes und die Isolierung der einzelnen Istamycine A, B, A₀ und B₀ erfolgt mit Hilfe des Verfahrens, welches im Anspruch 2 beschrieben ist.

Der den Istamycin-Komplex erzeugende Stamm von Actinomycetes, nämlich Streptomyces tenjimariensis SS-939 weist folgende mikrobiologische Eigenschaften auf.

(a) Mikroskopische Morphologie

Bei gutem Wachstum in Agarmedium erzeugt das Mycel von SS-939 monopodiale Verzweigungen. Gerade oder wenig gebogene Lufthyphen entwickeln sich vom Bodenmycel. Die reifen Lufthyphen tragen an den Spitzen eine Kette mit 10 bis 50 Sporen. Die Gestalt der Sporen ist zylindrisch (1 Mikron breit und 4 bis 5 Mikron lang). Spiralige oder quirlförmige Verzweigungen wurden nicht beobachtet. Unter dem Elektronenmikroskop erkennt man, daß die Oberfläche der Sporen glatt ist und keine flusigc oder haarige Struktur aufweist. Geißeln und Sporangien wurden nicht beobachtet. Der Stamm SS-939 ist folglich ein typischer Stamm von Streptomyces.

(b) Züchtungseigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien 65

(1) Auf Saccharose-Nitrat-Agar-Medium (bebrütet bei 27°C): schwach farbloses Wachstum mit Lufthyphen, welches zunächst weiß ist und sich allmählich in grau mit Blaustich verändert (17 ec, wasserblau,, gemäß den Farbangaben in dem »Color Harmony Manual«, veröffentlicht von der Container Corporation of America; soweit

nichts anderes angegeben ist, beziehensich die im folgenden benutzten Farbbezeichnungen ebenfalls auf dieses Standardwerk). Diffundierendes Pigment wird in dem Inkubations-Medium nicht in merklicher Menge gebildet.

(2) Auf Glycerin-Asparagin-Agar-Medium (bebrütet bei 27°C): die Ergebnisse sind im wesentlichen die gleichen wie bei Saccharose-Nitrat-Agar-Medium unter (1) angegeben, jedoch werden kaum Lufthyphen erzeugt

(3) Auf Stärke-Agar-Medium (bebrütet bei 27⁰C): im wesentlichen die gleichen Ergebnisse wie bei S3ccharose-Nitrat-Agar-Medium unter (1); Lufthyphen werden erzeugt. Die Stärke am Rand des Wachstums wird durchsichtig.

(4) Auf Tyrosin-Agar-Medium (bebrütet bei 37°C): die Kultureigenschaften sind im wesentlichen dieselben wie auf den Medien gemäß (1) und (2), jedoch wird ein Melanoidpigment erzeugt.

(5) Auf Nähr-Agar-Medium (bebrütet bei 27°C): farbloses Wachstum, auf dem sich weißfarbende Lufthyphen bilden. Das Inkubationsmedium hat einen dunkelbraunen Fa^rbton.

(6) Auf Hefeextraki-Malzextrakt-Medium (bebrütet bei 27°C): farbloses Wachstum mit Lufthyphen. Die Lufthyphen sind weiß und bekommen allmählich eine graue Farbe mit blaugrünem Stich (19 de, wassergrün). Das Medium wird dunkelbraun.

(7) Auf Hafermehl-Agar-Medium (bebrütet bei 27°C): farbloses Wachstum mit Lufthyphen, die eine weiße bis blaugraue Farbe aufweisen (17 ec, wasserblau).

(c) Physiologische Eigenschaften

(1) Temperatur für das Wachstum: Wachstum bei 20 bis 41°C.

(2) Hydrolyse von Stärke: Stärke wird in Stärke-Agar-Medium hydrolysiert.

(3) Koagulierung und Peptonisierung von Magermilch: im wesentlichen negativ.

(4) Bildung von Melanoid-Pigment: positiv auf Tyrosin-Agar-Medium und auf Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar-Medium.

(d) Ausnutzung von Kohlenstoffquellen für das Wachstum (bestimmt in Pridham-Goitlieb-Medium) s

Glucose und Inosit werden verwendet. *

Arabinose, Saccharose, Rhamnose, Raffinose und D-Mannitol werden nicht ausgenutzt. Die Verwendung von 30 j

D-Fructose ist zweifelhaft.

Faßt man die vorstehend angegebenen Charakteristika des neuen Stammes zusammen, so erkennt man, daß dtes*.* zur Gattung Streptomyces gehört und durch das Fehlen von Spiralen an den Lufthyphen und durch seine Chromogenizität charakterisiert ist. Auf der Basis der vorstehend genannten Eigenschaften kann der neue Stamm daher mit bekannten Streptomycesarten vergleichen werden, wobei Bezug genommen wird auf die Beschreibungen in »International Sirepiuinyces Project (ISF) und Sergey's Determinative Bacierioiogy«, 1974. Die charakteristischen Eigenschaften des neuen Stammes erinnern stark an Streptomyces viridochromogenes. Der neue Stamm unterscheidet sich jedoch von S. viridochromogenes insoweit, daß er weder Spiralen produziert, noch Xylose, Arabinose, Rhamnose, Fructose, Raflinose noch Mannitol ausnutzt. Weitere Unterschiede bestehen in der Richtung, daß die Oberfläche der von dem neuen Stamm produzierten Sporen nicht flusig ist. Streptomyces viridifaciens zeigt keine Chromogenizitäi und erzeugt Lufthyphen in einer Farbe, die der des neuen Stammes ähnlich ist. Die beiden Stämme sind jedoch dadurch voneinander unterscheidbar, daß der neue Stamm Streptomyces tenjimariensis weder Spiralen an den Lufthyphen produziert, noch Fructose und Saccharose als Kohlenstoffquellen für das Wachstum ausnutzt. Im übrigen gibt es keine bekannten Streptomycesarten, die die Eigenschaften der Ausnutzung von Kohlenstoffquellen aufweisen, wie sie dem neuen Stamm Streptomyces tenjimariensis eigen ist. Streptomyces tenjimariensis unterscheidet sich folglich von den bekannten Stäm- |f

men soweit, daß er als eine neue Art zu bezeichnen ist.

Der neue Stamm Streptomyces tenjimariensis wurde bei der öffentlichen japanischen Hinterlegungsstelle »Fermentation Research Institute«, Agency of Industrial Science and Technology, Tsukuba-gun, Ibsragi Prefecture, Japan unter der Hinterlegungs-Nummer FERM-P 4932 am 21. April 1979 und von dieser direkt bei der American Type Culture Collection, Washington, D. C, U.S.A. anter der AICC-Nummer 31859 hinterlegt.

Die Istamycine gemäß der Erfindung werden durch aerobe Züchtung von Sporen oder Mycel von Streptomy- |

ces ten^mariensis (ATCC 31859) erzeugt. Eei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Erzeu- |

gung der Istamycine wird folglich eine bestimmte Menge an Sporen oder Mycel von Streptomyces tenjimarien- |

sis in ein geeignetes Kulturmedium eingeimpft. Dieses Kulturmedium muß entsprechende Nährstoffquellen 55 |

enthalten, die für den Stamm assimilierbar sind. Das beimpfte Nährmedium wird dann unter aeroben Bedingun- |

gen bebrütet, bis sich in der Kulturbrühe Istamycin, d. h. wenigstens eine der Substanzen Istamycin A, B, A oder |

B₀ angesammelt hat. Nährstoffe in dem Kulturmedium können alle üblicherweise für die Züchtung von Actino- |

myceten verwendeten Substanzen sein. Geeignet sind beispielsweise im Handel erhältliches Sojabohnenmehl, Erdnuüpulver, Baumwollsamenmehl, getrocknete Hefe, Pepton, Fleischextrakt, Casein, Maisquellwasser, Natriumnitrat, Ammoniumsulfat u. ä. als Stickstoffquellen. Die im Handel erhältlichen Kohlehydrate wie Saccharose, Stärke, Glycerin, Maltose, Dextrin, Glukose, Lactose u. ä. sowie Sojabohnenöl und Fett sind als Kohlenstoffquellen geeignet. Gegebenenfalls können der Kulturbrühe anorganische Salze wie Natriumchlorid, CaI-ciumcarbonat, Magnesiumsulfat, Manganchlorid und Phosphate sowie verschiedene Aminosäuren zugesetzt werden. Alle Nährstoffe, die für die Züchtung von Actinomeceten bekannt sind, können für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, solange sie von Streptomyces tenjimariensis ATCC 31859 assimiliert werden können. I

Für die Produktion der Istamycine in großem Maßstab eignet sich insbesondere die Züchtung in flüssigem

Medium. Die Züchtung kann bei beliebigen Temperaturen, bei welchen Streptomyces tenjimariensis ATCC 31859 zu wachsen und Istamycine zu produzieren vermag, durchgeführt werden; vorzugsweise arbeitet man bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 30⁰C. Die Züchtung wird im allgemeinen solange fortgesetzt, bis sich eine ausreichende Menge der Istamycine in dem Kulturmedium angesammelt hat; dies erfordert im allgemei-S nen 2 bis 7 Tage.

Die Prüfung von Istamycin A und istamycin B kann unter Verwendung von Bazillus subtilis PCI 219 als Testorganismus durchgeführt werden. Man arbeitet nach der Standard-Deckelplattenmethode, die auch üblicherweise zur Prüfung bekannter Antibiotika angewendet wird. Eine reine Probe von Istamycin A, welches gemäß dem im Folgenden beschriebenen Beispiel 3 erhalten worden ist, kann als authentisches Produkt verwendet werden, lB!i welches eine Potenz von 1000 meg (Einheiten) pro mg aufweist. Erne reine Probe von Istamycin B, die ebenfalls gemäß folgendem Beispiel 3 erhalten worden ist, zeigt eine Potenz von 3170 meg (Einheiten)/mg.

Die Prüfung von Istamycin A₀ und Istamycin B₀ kann ebenfalls mit Bacillus subtilis PCI 219 als Test-Organismus unter Verwendung der Standard-Deckelplattenmethode durchgeführt werden. Eine reine Probe von Istamycin A₀, welche gemäß der Erfindung erhalten worden ist, weist eine Potenz von 5 meg (Einheiten)/mg und B eine reine Probe von Istamycin B₀ eine Potenz von 10 meg (Einheiten)/mg auf, wobei als Vergleich angesetzt ist, daß die reine authentische Probe von Istamycin A eine Potenz von 1000 mcg (Einheiten)/mg aufweist.

Istamycin A, Istamycin B, Istamycin A₀ und Istamycin B₀ sowie ihre Säureanlagerungssalze sind leicht löslich in Wasser. Der Istamycin-Komplex ist in der Kulturbrühe im wesentlichen in der flüssigen Phase der Lösung enthalten. Istamycine A und B sowie die Istamycine A₀ und B₀ lassen sich aus wäßriger Lösung mit organischen Lösungsmitteln wie Butanol, Butylacetat, Chloroform oder anderen mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel) praktisch nicht extrahieren, so daß diese organischen Lösungsmittel gut dazu verwendet werden können, um erforderlichenfalls Verunreinigungen aus der Kuiiurbrühe zu extrahieren. Für die Abtrennung des Istamycin-Komplexes aus der Kulturbrühe oder aus einer wäßrigen Lösung kann die Kulturbrühe oder die wäßrige Lösung mit verschiedenen Adsorbentien behandelt werden, an denen sich das Istamycin anlagert. Verwendet man Aktivkohle als Adsorbens, so kann das von dieser adsorbierte Istamycin durch Behandlung mit schwach ausgesäuertem Wasser, schwach angesäuertem wäßrigen Methanol, schwach angesäuertem wäßrigen Propanol, schwach angesäuerten wäßrigen Aceton u. ä. wieder extrahiert werden.

Istamycin wird infolge seiner Basizität in wirksamer Weise von Kationenaustauscherharzen adsorbiert, von ι welchen es mittels geeigneter Lösungsmittel wieder eluiert werden kann. Die Adsorption an einem Kationen-

austauscherharz ist der gangbarste und geeignetste Weg zur Abtrennung von Istamycin aus einer großen Menge Kulturbrühe. Die Kationenaustauscher, die für diesen Zweck geeignet und erhältlich sind, können beispielsweise die folg-.iden sein: Kationenaustauscherharze mit Carboxylfunktionen wie Amberlite IRC-50® und Amberlite CG-50®, Lewptit CN?^a, CM-Sephadex®, und zwar sowohl in ihren Η-Formen, Na-Formen und/oder NH<-Formen. Das Istamycin, welches an dem Kationenaustauscherharz adsorbiert ist, kann wieder eluiert werden, indem man mit angesäuertem Wasser, verdünntem wäßrigem Ammoniak oder einer wäßrigen Lösung eines anorganischen Salzes behandelt. Pur die genannte Eluierung eignen sich am besten 0,2 η bis 1 η Chlorwasserstoffsäure und 0,2 η bis 1 η wäßriges Ammoniak. Da Istamycin A und Istarnycin B ebenso wie Istamycin A₀ und Istamycin B₀ an Anionenaustauscherharzen praktisch nicht adsorbiert werden, können Anionenaustauscherharze zum Neutralisieren der wäßrigen sauren Lösung von Istamycin oder zur Entfernung von sauren Verunrei-4Ci nigungen aus der Istamycinlösung verwendet werden.

Um Istamycin A, Istamycin B, Istamycin A₀ oder Istamycin B₀ getrennt aus dem so gewonnenen Istamycin-Komplex zu erhalten, wird der Istamycin-Komplex einer Säulenchromatographie an Silikagel unterworfen, wobei zum Entwickeln die untere Phase eines Lösuigsmittelgemisches aus Chloroform-MethanoI-17%igem wäßrigen Ammoniak (Volumenverhältnis 2:1:1) oder andere analoge Lösungsmittelgemische verwendet werden. Die Trennung ist möglich aufgrund der Tatsache, daß die vier Istamycine bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel bei der Entwicklung mit der unteren Phase des Lösungsmittelgemisches aus Chloroform-Methanol-17%igem wäßrigen Ammoniak (2 :1:1) Einzelflecken ergeben, und zwar das Istamycin A einen Eins zelfleckbei RfO, 17, das Istamycin Beinen Einzelfleck bei Rf 0,11, das Istamycin A₀ einen Einzelfleck bei RfO,36

s und das Istamycin B₀ einen Einzelfleck bei Rf 0,14. Auf diese Weise sind die vie: Istamycine voneinander trenn-

50 bar. Um Istamycin A von Istamycin B zu trennen kann eine Mischung dieser beiden Istamycine der chromato- \ graphischen Trennung an einer Cellulosekolonne unterworfen werden, die mit einem Lösungsmittelgemisch

aus n-ButanoI-Pyridin-Essigsäure-Wasser (Volumenverhältnis 6:4:2:4) oder einem analogen Lösungsmittelgemisch entwickelt wird. Dies ist möglich aufgrund der Tatsache, daß bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose bei Entwicklung mit dem genannten Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (6:4:2:4) Istamycin A einen Einzelfleck bei Rf 0,22, Istamycin dagegen einen Einzelfleck bei Rf 0,25 ergibt. Die Prozeduren der chromatographischen Trennung lassen sich infolgedessen für die Gewinnung der Istamycine ebenso wie für die Reinigung von isoliertem Istamycin verwenden. Istamycin A, B, A₀ oder B₀ läßt sich in || gereinigtem Zustand isolieren, wenn man sowohl die beschriebenen Extraktionsmethoden als auch die chroma-

|j tographische Isolierung in kombinierter Form gegebenenfalls mehrfach wiederholt anwendet.

60 Für die Abtrennung des Istamycin-Komplexes und für die Isolierung und Reinigung der einzelnen Istamycine wird die folgende Prozedur bevorzugt;

. :Die Kulturbrühe des Jstamycin ,erzeugenden Stammes wird durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt und anschließend filtriert. Mari erhält so ein Brühenfiltrat, welches anschließend über eine Kolonne mit einem Kationenaustauscherharz, z. B. Amberlite IRC-50® (NlVZyklus) geleitet, so daß das Istamycin von dem Harz adsorbiert wird. Das Harz wird dann mit Wasser gewaschen und mit 1 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen des Eluates werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt, so daß man eine konzentrierte Lösung erhält, die dann über eine Kolonne mit einem Kationenaustauscherharz, z. B. Amberlile CG-50® geleitet wird. Das Istamycin wird an dem genannten Harz adsorbiert. Das

Harz wird mit Wasser gewaschen und mit 0,2 η wäßrigem Ammoniak und danach mit 0,4 η wäßrigem Ammoniak eluiert.

Mehrere aktive Fraktionen, die eine nennenswerte Menge an Istamycin B enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Man erhält so ein pulverformiges Rohprodukt, welches Istamycin B darstellt. Dieses Rohprodukt wird mehrfach der Säulenchromatographie an Silikagel unterworfen, wodurch man Istamy- s ein B in gereinigter Form als farbloses Pulver gewinnt.

Mehrere aktive Fraktionen, die eine nennenswerte Menge an Istamycin A sowie Mengen an Istamycin A₀ und B₀ enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Man erhält so ein pulverförmiges P.ohprodukt, welches aus den Istamycinen A, A₀ und B₀ besteht. Dieses pulverformige Rohprodukt wird der Säulenchromatographie an Silikagel unterworfen; die Kolonne wird mit der unteren Phase eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform-Methanol-8,5%igem wäßrigen Ammoniak (Volumenverhältnis 2:1:1) entwickelt.

Die aktiven Fraktionen des Eluates, die allein Istamycin A₀ enthalten, werden vereinigt und im Vakuum eingeengt. Die so gewonnene konzentrierte Lösung wird über eine Kolonne mit einem Kationenaustauscherharz, z. B. Amberlite CG-50^e (NH₄-ZyIdUs) geleitet; die Kolonne wird mit 0,5 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Die so eluierten aktiven Fraktionen, die nur Istamycin A₀ enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne ein- !|, geengt. Man erhält auf diese Weise reines Istamycin A₀ als farbloses kristallines Pulver.

Die aktiven Fraktionen des Eluates der durchgeführten Säulenchromatographie, die Istamycin A enthalten, werden ebenfalls vereinigt und im Vakuum eingeengt. Die so gewonnene konzentrierte Lösung wird wiederum der Säulenchromatographie an Silikagel unterworfen, wobei die aktiven Fraktionen, die ausschließlich Istamycin A enthalten, vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt werden. Man erhält so reines Istamycin A als 2C farbloses Pulver. Die aktiven Fraktionen der beschriebenen Säulenchromatographie an Silikagf' ■ chließlich, die nur Istamycin B₀ enthalten, werden vereinigt und im Vakuum eingeengt. Die entstandene kunzeiitr» »rie Lösung wird wiederum der Säulenchromatographiu an einem Kationenaustauscherharz wie Amberlite CG-50® (NH₄-Zyklus) unterworfen, wobei zum Entwickeln 0,5 η wäßriges Ammoniak verwendet wird. Die Fraktionen des Eluates, die allein Istamycin B₀ enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Man erhält auf diese Weise gereinigtes Istamycin B₀ in Form eines farbloser kristallinen Pulvers.

Das Istamycin A und Istamycin B gemäß vorliegender Erfindung zeichnen sich durch hohe bakterielle Wirkung und eine niedrige Toxizität für Tiere aus. Istamycin A und B sind infolgedessen ebenso wie die bekannten Antibiotika wertvolle antibakteriell Mittel und können in entsprechenden pharmazeutischen Verabreichungsformen als solche Verwendung finden.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Eine Schrägbodenkultur von Streptomyces tenjimariensis ATCC 31859 wurde in ein flüssiges Kulturmedium (je 110 ml in Erlenmeyer-Kolben mit einem Fassungsvermögen von 500 ml) eingeimpft; das Kulturmedium enthielt !,0% Stärke, 0,2% Glukose, 1,0% Sojabohnenmehl, 0,3% Natriumchlorid, 0,1% DikaHumhydragenphosphat und 0,1 % Magnesiumsulfat · 7 H₂O. Die Züchtung und Bebrütung erfolgte unter Drehung und Schütteln bei 27°C im Verlauf von 48 Stunden. Die nach dieser Zeit vorliegende Saatkultur (220 ml) wurde in einen 5,0-1-Gärbebehälter eingeimpft, der 15 Liter eines flüssigen Produktionskulturmediums enthielt, welches 2,0% Stärke, 0,2 ή Glukose, 2,0% Sojabohnenmehl,0,3% Natriumchlorid, 0,1 % Dikaliumhydrogenphosphat und 0,1 % Magnesiumsulfat ■ 7 H₂O aufwies. Die Gärung lief bei 27°C in ti Stunden unter Belüftung (151 Luft pro Minute) und Rühren (300 Umdrehungen pro Minute) ab.

Die Kulturbrühen aus sechs Gärbehältern wurden vereinigt, durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt und anchließend filtriert. Man erhielt auf diese Weise 90 ! Brühenfiltrat (Potenz 2,5 mcg/ml). Das Brühenfiltrat wurde durch eine Kolonne geleitet, welche 12 1 des Kationenaustauscherharzes Amberlite IRC-50¹⁸ (ΝΙΙ,-Form) enthielt. Das Istamycin wurde an dem Harz adsorbiert. Das Harz wurde anschließend mit 24 1 Wasser gewaschen und danach mit 1 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen des Eluates wurden vereinigt (3 1) und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 3,51 g eines pulverformigen Rohproduktes (Potenz 61 mcg/mg).

Dieses pulverformige Rohprodukt wurde in 100 ml Wasser gelöst. Die entstandene Lösung wurde durch eine Kolonne mit einem Durchmesser von 40 mm geleitet, welche eine einem Volumen von 300 ml entsprechende Menge des Anionenaustauscherharzes Dowex 1-X4® (OH-Form) enthielt; anschließend wurde die Kolonne mit Wasser entwickelt. Die zunächst ablaufenden Mengen (200 ml) 'ie t Eluates wurden verworfen; die dann ablaufende Menge (880 ml) wurde aufgefangen und über eine andere Kolonne mit einem Durchmesser von 25 mm geleitet, die eine einem Volumen von 150 ml entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes Art^berlite CG-50® (NHi-Form) enthielt, an welchem das Istamycin adsorbiert wurde. Die Kolonne mit dem Kationenaustauscherharz wurde mit 300 ml Wasser gewaschen und anschließend zunächst mit 900 ml 0,2 η wäßrigem Ammoniak und dann mit 900 ml 0,4 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Das E'uat wurde in 18 ml-Fraktionen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen Nr. 66 bis 80 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man erhielt auf diese Weise 210 mg eines weißen Pulveis (Potenz 460 mcg/mg), welches aus den /Istamycinen A und B bestand. ,Die Fraktionen Nr. 28 bis 65 wurden in entsprechender Weise aufgearbeitet, wobei man ein pulverformig'esrRohprodükt erhielt, welches aus einigen nicht identifizierten Antibiotika, bei denen es sich um andere als die Istamycine A, B, A₀ und B₀ handelt, bestand.

Beispiel 2

Das Brühenfiltrat (150 Liter, gesammelt aus 10 Gärbehältern), welches bei der Fermentierung von Streptomyces tenjimariensis in derselben Weise wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnen worden war, wurde durch eine Kolonne geleitet, die 20 Liter des Kationenaustauscherharzes Amberlite IRC-50 ^β (NH₄-Form) enthielt, an dem das Istamycin adsorbiert werden konnte. Nach dem Waschen mit Wasser (40 Liter) wurde die Kolonne mit 1 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen des Eluates wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 4,1 g eines pulverformigen Rohproduktes (Potenz 240 mcg/mg).

»u ίο Dieses pulverformige Rohprodukt wurde in 20 ml Wassergelöst. Die so gewonnene wäßrige Lösung wurde auf ' j eine Kolonne mit einem Durchmesser von 30 mm gegeben, die eine einem Volumen von 200 ml entsprechende

Menge des Anionenaustauscherharzes Dowex 1-X4® (OH-Form) enthielt. Die Kolonne wurde mit Wasser entwickelt. Die zunächst ablaufende Flüssigkeit (270 ml) wurde verworfen. Die danach ablaufende Flüssigkeit (270 ml) wurde aufgefangen und über eine weitere Kolonne mit einem Durchmesser von 25 mm geleitet, die eine einem Volumen von 150 ml entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes Amberlite CG-50^e (ΝΗ,-Form) zur Adsorption des Istamycins enthielt. Die Kolonne wurde mit 150 ml Wasser gewaschen und dann zunächst mit 900 ml 0,2 η wäßrigem Ammoniak und dann mit 900 ml 0,4 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in 18 ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen Nr. 55 bis 90 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 980 mg eines weißen Pulvers (Potenz 940 mcg/mg), welches aus den Istamycinen A und B bestand.

Beispiel 3

Das gemäß Beispiel 2 erhaltene weiße Pulver (980 mg, Potenz 940 mcg/mg), welches aus den Istamycinen A und B bestand, wurde in 15 ml einer Mischung aus n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (Volumenverhältnis 6:4:2:2) aufgenommen. Die erhaltene Lösung wurde auf eine Kolonne mit einem Durchmesser von 25 mm gegeben, welche 60 g Cellulosepulver (Avicel®) zur Adsorption des Istamycins enthielt. Die Cellulosekolonne wurde zunächst mit 1200 ml des vorstehend angegebenen L^sungsmittelgemisches (Volumenverhältnis 6:4:2:2) und anschließend noch mit 600 ml des Lösungsgemisches aus n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (jedoch im Volumenverhältnis von 6:4:2:4) entwickelt. Das Eluat wurde in 10 ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen Nr. 45 bis 74 enthielten nur Istamycin B, die Fraktionen Nr. 114 bis 154 enthielten nur Istamycin A und d:^:e Fraktionen Nr. 75 bis 113 enthielten ein Gemisch aus den Istamycinen A und B.

Die Fraktionen Nr. 45 bis 74 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt ein Pulver, welches in 5 ml Wasser gelöst wurde. Die so gewonnene wäßrige Lösung von Istamycin B wurde über eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 25 ml entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes Amberlite CG-50® (NHrForm) zur Adsorption des Istamycin B enthielt. Nach dem Waschen mit 25 ml Wasser wurde die Harzkolonne mit 0,4 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen (insgesamt 40 ml) des Eluates wurden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt; man erhieit so 15,3 mg reines pulverförmiges Istamycin B (Potenz 3170 mcg/mg).

Die Fraktionen Nr. 114 bis 154 wurden ebenfalls vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man erhielt auf diese Weise ein Pulver, welches in 5 ml Wasser gelöst wurde. Die Lösung von Istamycin A in Wasser, die so erhalten worden war, wurde durch eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 25 ml entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes Amberlite CG-50® (NHt-Form) zur Adsorption von Istamycin A enthielt. Nach dem Waschen mit 25 ml Wasser wurde die Kolonne mit 0,4 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen (insgesamt 45 ml) des Eluates wurden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 50 mg reines pulverförmiges Istamycin A (Potenz 1000 mcg/mg).

Beispiel 4

Eine Agar-Schrägbodenkultur von Streptomyces tenjimariensis ATCC31859 wurde in je 110 ml eines flrrsigen Kulturmediums eingeimpft, welches sich in Erlenmeyer-Kolben mit einen Fassungsvermögen von 500 ml befand und welches 1,0% Starke, 0,2% Glukose, 1,0% Sojabohnenmehl, 0,3 % Natriumchlorid, 0,1 % Dikaliumhydrogenphosphat und 0,1% Magnesiumsulfat · 7H₂O enthielt Die Züchtung erfolgte während 48 Stunden bei 27°C unter Schütteln und Drehung. Die so gewonnene Saatkultur (220 ml) wurde in 30-1-Gärbehälter eingeimpft, die jeweils 15 1 eines flüssigen Produktionskulturmediums enthielten. Das Produktionskulturmedium hatte einen Gehalt von 2,0% Stärke, 0,2% Glukose, 2,0% Sojabohnenmehl, 0,2% Nairiumpalmitat, 0,3% Natriumchlorid, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat und 0,1% Magnesiumsulfat · 7H₂O. Die Fermentierung wurde 72 Stunden lang bei 27°C unter Belüftung (151 Luft pro Minute) und Bewegung (300 Umdrehungen pro Minute) durchgeführt.

Die entstandene Kulturbrühe wurde aus den Gärbehältern entnommen, durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf pH 2,0 eingestellt und filtriert. Man erhielt 1501 eines Brühenfiltrates mit einer Potenz von 6 mcg/mg. Dieses Brühenfiltrat wurde durch eine Kolonne geleitet, weiche eine einem Volumen von 12 1 entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes IRC-50^s (NH^-Form) zur Adsorption von Istamycin enthielt Nach dem Waschen mit 24 I Wasser wurde die Harckolonne mit 1 η wäßrigem Ammoniak eluiert Die aktiven Fraktionen (insgesamt 5,6 1) des Eluates wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt Die so gewonnene konzentrierte Lösung wurde auf eine Kolonne gegeben, die eine einem Volumen von 200 ml entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes Amberlite CG-50® (NH₄-FOnIi) enthielt. Nach dem Waschen mit 200 ml

Wasser wurde die Harzkolonne noch mit 1200 ml 0,2 η wäßrigem Ammoniak gewaschen und dann mit 1200 ml 0,4 η wäßrigem Ammoniak eluiert.

Das Eluat wurde in i8-ml-Fraktionen aufgefangen.

Die Fraktionen Nummer 80 bis 106 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 240 mg rohes pulverförmiges istamycinB (Potenz 380 mcg/mg). Dieses pulverformige Rohprodukt wurde mehrfach der Säulenchromatographie an Silikagel unterworfen, wobei zur Entwicklung die untere Phase einer Mischung aus Chloroform-Methanol-8,5%igem wäßrigen Ammoniak (2:1:1) verwendet wurde, bis reines weißes pulverförmiges Istamycin B mit einer Potenz von 1350 mcg/mg vorlag. Ausbeute 25 mg.

Die Fraktionen Nummer 107 bis 124 wurden ebenfalls vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise 380 mg eines pulverförmigen Rohproduktes (Potenz 180 mcg/mg), welches aus den Istamycinen A, A₀ und B₀ bestand. Dieses pulverförmige Rohprodukt wurde der Säulenchromatographie unterworfen, wobei man eine Kolonne mit 38 g Silikagel 60® verwendete. Die Kolonne wurde mit der unteren Phase eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform-Methanol-8,5%igem wäßrigen Ammoniak (VoIumcnverhültnis 2:1:1) entwickelt. Das Eluat von der Silikagelkolonne wurde in 5 ml-Fraktionen aufgefangen.

Die Fraktionen Nr. 54 bis 61 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Die konzentrierte Lösung wurde auf eine Kolonne gegeben, die eine einem Volumen von 3 ml entsprechende Menge des Kationenaustauschcrharzes Amberlite CG-50® (ΝΗ,,-Form) zur Adsorption des Istamycins A₀ enthielt. Die Kolonne mit dem Kationenaustauscherharz wurde mit 0,5 η wäßrigem Ammoniak eluiert und die aktiven Fraktionen der ablaufenden Flüssigkeiten wurden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise reines Istamycin Au (Potenz 5 mcg/mg) als farbloses kristallines Pulver. Ausbeute 25 mg.

Die Fraktionen Nr. 65 bis 76 wurden ebenfalls vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Die konzentrierte Lösung wurde der Säulenchromatographie unterworfen, wobei man eine Kolonne mit 10 g Silikagel verwendete. Zum Entwickeln wurde die untere Phase des Lösungsmittelgemisches aus Chloroform-Methanol-8,5%igem wäßrigen Ammoniak (2:1:1) verwendet. Der Vorgang diente der Reinigung von Istamycin A. Auf diese Weise konnte reines Istamycin A mit einer Potenz von 1000 mcg/mg als farbloses pulverförmiges Produkt in einer Menge von 23 mg erhalten werden.

Die Fraktionen Nr. 77 bis 90 wurden auch vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Die konzentrierte Lösung wurde über eine Kolonne gegeben, die eine einem Volumen von 3 ml entsprechende Menge des Kationenaustauscherharzes Amberlite CG-50¹⁸ (ΝΗ,,-Form) zur Adsorption von Istamycin B₀ enthielt. Diese Kolonne wurde mit 0,5 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen des Eluates wurden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise reines Istamycin B, mit einer Potenz von 10 mcg/mg als farbloses kristallines Pulver. Ausbeute 18 mg.

Beispiel 5 (nachgereicht)

2,0 g pulverförmiges Roh-Istamycin A₀ wurden mit Hilfe der Säulenchromatographie gereinigt. Es wurde eine Säule ftiii ίου g Siiikagei verwendet, die mit der unteren Phase eines LösungSfniiteigemisehes aus Chloroform-Methanol-8,5%igem wäßrigem Ammoniak (Volumenverhältnis 2:1:1) entwickelt wurde. Das Eluat wurde in I

25 ml-Fraktionen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen Nr. 65 bis 104 wurden vereinigt und unter vermindertem 40 | Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise reines Istamycin A₀ als farbloses kristallines Pulver. Ausbeute 586 mg.

2,0 g pulverförmiges Roh-Istamycin B₀ wurden ebenfalls durch Säulenchromatographie an Silikagel in der vor- |

stehend angegebenen Weise gereinigt; die einzige Ausnahme dabei war, daß das Eluat in 23 ml-Fraktionen auf- |

gefangen wurde. Die aktiven Fraktionen Nr. 73 bis 170 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt auf diese Weise reines Istamycin B₀ als farbloses kristallines Pulver in einer Menge von 1369 mg.

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen
50

Claims

15 20

³⁰ 35 40 45 50 55 60 65

Patentansprüche:

Die Verbindungen des aus Istamycin A der Formel

NH₂

VoH/\

OCH₃

H₂NCH₂CON

CH₃

Istamycin B der Formel H₃CNH N.

NH₂

Vrn

NH₂O

H₂NCI₂CON

CH₃

Istamycin A₀ der Formel CH₂NHCH₃

HO-

OCH₃

oder der Formel CH₂NHCH₃

NH₂

OCH₃ (Π)

(ΠΙ)

und Istamycin B₀ der Formel
CH₂NHCH₃

O /

(V) OCH₃

bestehenden Komplexes einschließlich der Säureanlagerungssalze derselben, allein oder in Mischung untereinander.

2. Verfahren zur Herstellung der Istamycine gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces tenjimariensis ATCC 3! 859 unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, welches Stickstoff- und Kohlenstoffquellen enthält, rüchtet, den Komplex der gebildeten Istamycine durch Adsorbieren an und anschließendes Eluieren von einem geeigneten Adsorptionsmaterial isoliert und erforderlichenfalls danach durch Chromatographieren die Istamycine A, B, A₀ und B₀ voneinander trennt, isoliert und reinigt.

3. Die Verwendung der Istamycine gemäß Anspruch 1 als antibakterielle Mittel.