DE1617768A1 - Neuartige antibiotische Polyoxine D,E,F,G und H und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

Rikagaku Kenkyusho, Tokyo, Japan

neuartige antibiotische Polyoxine D, E, 1, G- und H und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung betrifft heue antibiotisohe Polyoxine B, E, F, Gr und H sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Erfindungsgemäß werden neuartige antibiötis ehe Polyoxine D, E, ]?, G und H mit spezifischen antifungelleh Wirksamkeiten gegen pflanzenpathogene Pilze vorgeschlagen, welche erhalten werden durch Züchtung von Streptomyces cacaoi var. asoensis, Stämme Nr. 20-52, 20-60 und 20-66, neue ixteji der Gattung Streptomyces in einem Medium-durch Gewinnung eines Polyoxinkomplexes aus der gezuchteten Substanz, Behandlung des Polyoxinkomplexes mit einem basischen Harz zwecks Auftrennung des Komplexes in ein adsorbiertes Gemisch der Polyoxine D, E und F und ein nichtadsorbiertesGemischder Polyoxine G und H, und durch ehr omatograf is ehe !Trennung beider Gemische unter. Verwendung eines geeigneten Lösungsmittels, wodurch die -Auftrennung und Elution des Gemisches in einzelne Komponenten

Unterlagen

erfolgt, und anschließende Reinigung und Umkristallisation.

Abb. 1, 2, 3, 4 und 5 zeigen der Reihe nach UV-Absorptionsspektren der Polyoxine D, E, P, G und H und Abb. 6, 7, 8, 9 und 10 zeigen der Reihe nach die IR-Absorptionsspektren der Polyoxine D, E, P, G und H.

Die erfindungsgemäß verwendeten Polyoxin-produzierenden Stämme 20-52, 20-60 und 20-66 sind neue Arten der Gattung Streptomyces, welche von den Erfindern aus dem Boden von Bochu, Aso-gun, Kumamoto Prefecture, Japan, isoliert v/urden. Obgleich diese Stämme vollständig identisch sind in ihren morphologischen Eigenschaften und der Nutzung der Kohlenstoffquelle, unterscheidet sich der Stamm Nr. 20-66 von den Stämmen Nr. 20-52 und 20-60 in der Farbe der Plattenunterseite, wenn er auf einem Medium von Czapek¹s Agar gezüchtet wird, und unterscheidet sich etwas von ihnen in seinem Verhalten auf anderen Agar-Medien. Daher werden die Stämme 20-52 und 20-60 vorab als "Typ I" (ATCC 1.9095)und der Stamm Nr.20-66 als »Typ II» (ATCC 19094) bezeichnet.

Die Stämme Streptomyces Asoensis Nr. 20-52 und 20-60 (Typl) sowie Nr. 20-66 (Typ II), die gemäß der*Erfindung verwendet werden, sind bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter den ATCC-Nummern 19093 bzw. 19094 hinterlegt.

Die erfindungsgemäß verwendeten Stämme sind von den Erfindern als "Streptomyces cacaoi var. asoensis" benannt worden (im

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Folgenden mit Streptomyees asoensis abgekürzt).

Die mycologisehen Verhaltensweisen der Typen I und II der Polyoxin-prdduzierenden Stämme sind folgende:

(1) Mikroskopische Beobachtung;

Gutes Wachstum bei 20-32⁰C» Morphologisch im allgemeinen identisch mit den Stämmen der Gattung Streptomyces. Gestrecktes Luftmycel auf synthetischem Agarmedium und proteinhaltigem Agarmedium. Die Sporenträger bilden offene Spiralen, aber keine Drehspiralen (whirls). Die Sporen sind einheitlich in Form und Größe, stäbchenförmig (1,5 - 1,8yu χ 0,5 - 0_r7/u ) oder ellipsoid (1,2 -. 1,0/u--χ 1,0 - 0,7/U ). Die Oberflächenstruktur ist weiöh.

(2) Verhaltensweisen auf verschiedenen Agar-Medien:

1) Czapek's Agarmedium (27⁰C);

Typ I ϊ Gutes, farbloses bis ganz schwach hellgelbes Wachstum« Reichliches staubartiges Luftmycel, weiß bis grau werdend, mit einer oliv—gelb gefärbten Plattenunterseite. Kein lösliches Pigment.

Typ Hi Staubendes Luftmycel, von weiß nach gelblichgrau wechselnd, Plattenunterseite rösa-gelb.

2) Glycerin-Czapek's Agarmedium (27⁰C):

Typ I : Gutes, οIiv-gelb gefärbtes Wachstum. Kein bis kärgliches dünnes weißes Luftmycel. Unterseite leicht oliv-gelb oder cremefarben. Kein lösliches Pigment.
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Typ II: Überhaupt kein Luftmycel. Die anderen Verhaltensweisen wie Typ I.

3) Gewöhnliches Agarmedium (27⁰C) :

Typ I s Gutes, gefaltetes, grau-braunes Wachstum.

Spärliches Luftmyeel, von weiß nach hellgrau wechselnd. Unterseite ein helles Braungelb. Braunes, lösliches Pigment produziert.

Typ II; Wachstum wie bei Typ I. LuftmyceJ. weiß bis hell-gelblich, spärlich. Lösliches Pigment schwächer als bei Typ I.

4) Glukose-Pepton-Agarmedium (27⁰C):

Typ I : Cremefarbenes bis leicht grau-gelb gefärbtes Wachstum. Kein bis spärliches weißlich-graues Luftmycel. Unterseite hellbraun. Hellbraunes lösliches Pigment.

Typ II: Schwaches Wachstum« Spärliches Luftmycel, weiß oder hellgrau, zu späterem Zeitpunkt der Züchtung produziert. Unterseite oliv-grau.

5) Glukose-Asparagin-Agarmedium (27°C)s

lyp I ί Gefaltetes Wachstum, gewöhnlich wechselnd von farblos bis messingfarben. Weißes bis hellgraues oder graues Luftmycel wird produziert. Platten-Unterseite messingfarben} kein lösliches Pigment.

Typ II: Wenig Luftmycel, jedoch in einigen Fällen Produktion eines weißlich-grauen Luftmycels.

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6) Stärke-Agarmedium (27⁰O): ;

Typ I : Reichliches, färblos Ms oliv-ge !^gefärbt es Wachstum. Staubförmiges, reichliches, hellgraues Luft-■■-"" mycel. Plattenunterseite oliv-gelb. Kein lösliches . Pigment* Stärke wird in geringem Maße hydrolysiert, Typ II: Absolut gleiches VerhaltenwieTyp i.

7) Calciummalat-Agarmedium (27⁰G): ·, :

Typ I : Farbloses bis hellbräunlicheö-gelb-gefärbtes Wachstum , mit reichlichem grauen Luftmycel« Unterseite cremefarben,In einigen Fällen wird gelblich-braunes lösliches Pigment produziert.

Typ II: wie Typ I. ■ ■ ^;

8) Tyrosin-Agarmedium (27°C): \ ; / ^,

Typ I : Spärliches, braunes Wachstum* Kein luftmycel. .

Unterseite cremefärben* Kein lösliches Pigment* . Typ'll: wie Typ I*. ' : _: ^

9) Eieralbumin-Agarmedium (27⁰C): . ;. ; .Typ I : Gutes, farbloses bis weißes Wachstum* Kein bis sehr

spärliches weißes IiUftmycel, zu späterem ^eitpuhitt der Züchtung produziert, Plät^tenunterseite weiß * ^v Kein lösliches Pigment. ;

Typ II: wie Typ I. :

10) Hafermehl-Agarmedium (Octmeal-agar medium) (27⁰G):

Typ I : Normales, olivfarbenes Wachstum, mit keinem bis spärlichem hellgrauem Luftmycel. Unterseite farblos j kein lösliches Pigment.

Typ II? wie Typ I. _:_'.,.... \, ■■;. ■■; ..^v,--.

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11) Kartoffeln (27⁰C):

Typ I ι Gutes, dunkelbraunes iTachstum, mit hellgrauem

Luftmycel. Mitte leicht schwärzlich. Typ II: wie Typ I.

12) Gelatine-Stichkultur (18⁰C):

Typ I : Gutes Wachstum. Langsame Verflüssigung.

Geringfügiges dunkelbraunes lösliches Pigment

produziert. Typ II: Wenig Verflüssigung.

13) Glukose-Nährmedium (27⁰C):

Typ I : Gutes Wachstum an der Oberfläche und in der

Flüssigkeit. Braunes lösliches Pigment. Typ II: wie Typ I.

H) Czapek's Flüssigkeit (27⁰C):

Typ I : Gutes Oberflächen- und Bodenwachstum. Dünner

Film auf der Flüssigkeitsoberfläche. Spärliches weißes Luftmycel. Kein lösliches Pigment. Typ II: Kein Film auf der Flüssigkeitsoberfläche.

15) Melamin-Bildung:

Beide Typen I und II sind negativ.

16) Nitratreduktion:

Beide Typen I und II sind leicht positiv.

17) Cellulosemedium:

Kein Wachstum auf synthetischem Medium mit Cellulose als einziger Kohlenstoffquelle.

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18) Nährstoff (Fleisch, Pepton, Glukose)-Agarmedium (27⁰C): Typ I : Gutes,, blass oliv-glänzend-gefärbtes, gefaltetes Wachstum. Kein oder spärliches weißes Luftmycel. Plattenunterseite weiß. Spuren eines lösliehen schwärzlichen Pigmentes.

Typ II: Gutes, cremig-gelbes'Wachstum mit weicher Oberfläche. Kein Luftmyeel. Andere Verhaltensweisen wie Typ I.

19) Loeffler's Blutserummedium (27⁰C):

Typ I : Gutes, oliv-gelbes, tiefgefaltetes Wachstum.

Kein Luftmycel. Spuren löslichen schwärzlichen

Pigmentes. _t

Typ II: wie Typ I. .
20) Litmusmilch (27°C):

Typ I ί Brauner Oberflächenring j weder koaguliert noch

peptonisiert. pH 4,0 Ms 5,0 am 20,Tage der

Züchtung.
Typ II: Ringförmiges Oberflächenwachstum, allmähliche

Koagulation, leichte Peptonisierung.

pH 7*8 bis 8,0 am 20.Tag der Züchtung.

(5) Physiologische Eigenschaften:

1) Optimale Wachstumsbedingungen:
pH 6-8 (Typen I und II)
Temperatur 25-30⁰C (Typen I und II) Stark aerob (Typen I und II)

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2) Mögliche Wachstumsbedingungen:

pH 9 und 4 (Typ I)

10 und 4 (Typ II) Temperatur 18 und 37⁰C (Typen I und II)

3) Tyro sinas e-Reaktions

Sehwach positiv (Typen I und II)

4) Milch-Peptonisierung: Typ I : negativ Typ II: positiv

5) Cellulose-Abbau : Typen I und II negativ

6) Chromogene Wirkung:

Schwach positiv, gelegentlich negativ

(4) Verwendbarkeit von Kohlenstoffquellen:

Die Verwendbarkeit der Kohlenstoffquellen, festgestellt nach der Methode von T.G. Pridham et al., wird in der folgenden Tabelle gezeigt_t

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Typ I

Typ II

+4*4·

Glucose Sucrose : Stärke lactose Fructose Maltose ; .: Inulin Inosit Eaffinose Arabinose Galactose Xylose Mannose Bhamnose Mannit

Salicin + +

Bemerkung:; +++ sehr häufig genutzt ++ normal ausgenutzt + kaum genutzt

In Anbetracht der genannten Verhaltensweisen von Streptomyces asoensis scheint die Annahme gerechtfertigt, daß die erfindungsgemäß verwendeten Stämme zu der Art Streptomyces griseus gehören. Es scheint,daß die erfindungsgemäß verwendeten Stämme unter den bekannten Stämmen der Aufstellung in Bergey's "Manual of Determinative Bacteriology", T.Ausgabe, und in "Waksman: "The Ac tinomyc et es ", Bd * 2, <ien dreien Str ept omyceS

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griseolus, Streptomyces griseus und Streptomyces Cacaoi ähneln*.

Ein Vergleich zwischen Typ I, der typische Verhaltensweisen von Streptomyces asoensis aufweist, und Streptomyces griseolus zeigt, daß die beiden in den folgenden Punkten offensichtlich unterschiedlich sind:

Auf einem Czapek's Agarmedium produziert Streptomyces griseolus ein graues Luftmycel und ein "braunes lösliches Pigment, während Streptomyces asoensis ein graues Luftmycel und kein lösliches Pigment produziert. Ferner produziert Streptomyces griseolus auf einem Calciummalat-Agarmedium ein grünlichgraues Luftmycel und ein braunes lösliches Pigment, wohingegen Streptomyces asoensis ein graues luftmycel und kein lösliches Pigment produziert.

Auch Streptomyces griseus unterscheidet sich von Streptomyces asoensis in den folgenden Punkten:

Auf einem Czapek·s Agarmedium produziert Streptomyces griseus ein hell-gelblich-grünes Luftmycel, wohingegen Streptomyces asoensis ein graues Luftmycel produziert; auf einem gewöhnlichen Agarmedium produziert Ersterer ein hell-gelblich-graues Luftmycel, während der Letztere ein graues" Luftmycel bildet; und auf einer Kartoffelscheibe ist das Luftmycel des Ersteren weiß, des letzteren dagegen hellgrau. Ferner können Streptomyces griseolus oder Streptomyces griseus deutlich durch die Tatsache von Streptomyces asoensis unterschieden werden, daß

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Ersterer keine Spiralen bildet, der Letztere jedoch solche ' bildet.

Streptomyces cacaoi ist Streptomyces asoensis am ähnlichsten, unterscheidet sich jedoch auch von ihm in den folgenden Punkten:

Auf einem gewöhnlichen Agarmedium produziert Streptomyces cacaoi ein gelblich-grünes Luftmycel, wohingegen Streptomyces asoensis ein weißes Luftmycel bildetf auf einem Stärke-Agar·- medium produziert Ersterer ein gelbes lösliches Pigment, der Letztere hingegen kein Pigment $ und auf einer Kartoffelscheibe oder in Gelatine-Stichkultur produziert Ersterer kein lösliches · Pigment, Letzterer hingegen eine geringe Menge dunkelbraunen : \ löslichen Pigmentes« Da die beiden jedoch in anderenVerhal- |

■■"-" *- I tensweisen auf Agarmedien gut übereinstimmen, reichen die ge- f nannten Unterscheidungsmerkmale nicht aus, um eine neue Art I festzustellen, mit der SehlußfOlgerung, daß Streptomyces

asoensis ein neue*r Stamm der Gattung Streptomyces sei, und so wird angenommen, daß Streptomyces asoensis zu Streptomyces oaoaoi gehört. Jedoch in Anbetracht der Unterschiede zwischen \ dea beiden im engen Bereich und in der Polyoxin*-Produktivi1iät ist die Annahme angebracht, daß Streptomyces asoensis eine Variante von Streptomyces cacaoi ist. Diese Variante umfaßt natürlich auch Typ II.

Gemäß der vorliegenden Erfindung können Polyoxine unter Ver-. § Sendung nicht nur von Streptomyces cacaoi var. asoensis " selbst, sondern auch seiner natürlichen und künstlichen

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Varianten hergestellt werden. Wie bekannt ist, sind Actinomyceten in ihren Eigenschaften nicht unveränderlich, und solche mycologischen Verhaltensweisen wie die genannten sind nicht immer von ausschlaggebender Bedeutung. Natürliche oder künst-« liehe Varianten von Stämmen, die Streptomyces cacaoi var. asoensis verwandt sind, und die aus Böden isoliert worden sind, können ebenfalls bei dem erfindungsgemäßen Verfahren angewendet werden, soweit ihre Verwendung den Zielen der Erfindung entspricht.

Bei dem vorliegenden Verfahren kann die Züchtung entsprechend den Züchtungsverfahren für Actinomyceten im allgemeinen durchgeführt werden. Jedoch wird der genannte Stamm im allgemeinen bei aeroben Bedingungen und unter Rühren bei 25 - 35 C gezüchtet, unter Verwendung eines im wesentlichen neutralen, flüssigen Nährmediums, welches als Kohlenstoffquelle Stärke, Dextrin, Glukose, Glycerin, Maltose oder Pruktose enthält j als Stickstoffquelle Fleischextrakt, Pepton, Maisquellflüssigkeit, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Baumwollsamenmehl, Hefe oder Weizenkeimej und anorganische Stoffe wie z.B. Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumkarbonat oder Kaliumphosphat. Normalerweise erreicht die Konzentration des produzierten Antibiotikums ein Maximum nach 40 bis 100 Stunden. Die genannte Zeit variiert in Abhängigkeit, von den Bedingungen des Rührens und der Belüftung, auch wenn die Temperaturbedingungen und das verwendete Nährmedium gleichbleiben, und kann daher in jedem Falle durch biologische Versuchsmessung der Wirksamkeit bestimmt werden.

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Zur Gewinnung des gewünschten Antibiotikums aus der_Kulturflüssigkeit kann ein üblicherweise geeignetes physikochemisches Verfahren angewendet werden.. Beispielsweise wird die Kulturflüssigkeit bei einem sauren oder neutralen pH mit Hilfe eines Filtrier-Hilfsmittels, wie z.B. Diatömeenerde oder eines ähnlichen Mittels filtriert und.dadurch das Mycel entfernt) dann wird das Filtrat bei saurem oder neutralem pH mit Aktivkohle behandelt, und schließlich, das gewünschte Antibiotikum aus der Aktivkohle mittels eines geeigneten Lösungsmittels, wie z.B. Methanol oder wässrigem Aceton, eluiertv Ferner können die Polyoxine, da sie amphotere Eigenschaften besitzen, an ein Kationen- oder Anionen-Austauseherharz gebunden werden und mittels einer geeigneten Säure oder lauge oder einer geeigneten Salzlösung eluiert werden. Z.B. wird das Filtrat der Kulturflüssigkeit angesäuert und zur Adsorption der Polyoxine über eine Austauschersäule, die Dowex 50 W- Z 8 (Η-Form) (das Wort "Dowex¹¹ ist ein eingetragenes Warenzeichen) enthält, -geschickt, von der sie mittels einer 5^igen iFatriumchloridlösung oder einer Phosphorsäurelösung' eluiert werden können.

Das so erhaltene ungereinigte Folyoxinkömplex-Pulver kann säulenchrömatographisch gereinigt werden unter Verwendung eines Ionenaustauschers, wie z.B. eines Ionenaustauscherharzes, Suifoäthylsephadex (das Wort "Sephadex*· ist ein eingetragenes Warenzeichen) , SuIfoäthylcellulose, oder SuIfomethylpelluiose, oder die Reinigung wird mittels Zonenelektrophorese durchgeführt. Bei Verwendung eines basis chain -Harzes kann der

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erhaltene Polyoxinkomplex aufgeteilt werden in die an das Harz adsorbierten Polyoxine D, E und P, und die nichtadsorbierten Polyoxine A, B, &, und H. Die Polyoxine A und B sind außerdem in der deutschen Patentanmeldung P 14 92 111.0, eingereicht am 24. September 1965, im einzelnen beschrieben. Die adsorbierten Polyoxine D, E und P werden mit einer anorganischen Salzlösung, Säure oder Lauge eluiert. Im anderen Falle, bei Anwendung des Elektrophorese-Verfahrens unter Verwendung einer Pufferlösung mit einem pH über 3,0 wird der Polyoxinkomplex aufgeteilt in D, E und P, welche eine größere Wanderungsdistanz zur Anode aufweisen, und A, B, G- und H, deren Wanderungsdistanz kleiner ist.

Die so aufgetrennten Polyoxingemische A-B-G-H und D-E-P können normalerweise vollständig auf chromatographischem Wege unter Verwendung von Cellulosepulver oder Silikagel in ihre Einzelkomponenten aufgetrennt werden. Werden die Gemische mit einem geeigneten Lösungsmittel, z.B. einem Gemisch aus Butanol, Essigsäure und Wasser, entwickelt, so werden die Einzelbestandteile getrennt und eluiert. Im anderen Pail ist wiederholtes Umkristallisieren aus wässrigen Lösungsmitteln entsprechend fraktionierter ümkristallisation ebenso wirksam zur Auftrennung in die einzelnen Bestandteile,,

Bei der Umkristallisation aus einem wässrigen Alkohol v/erden die getrennten und gereinigten Polyoxine D, E, P, G und H der Reihe nach als kristalline Pulver erhalten.

BAD

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Die physikochemischen Eigenschaften der Polyoxine D, E, F, G und H werden im folgenden beschrieben.

(1) Zersetzungspunkte:

Die Polyoxine D, E, F, G und H (weiterhin nur noch mit D, E, F, G und H bezeichnet) zeigen keine klaren Zersetzungspunkte, sondern werden allmählich angefärbt und zersetzt bei oberhalb 19O⁰C, oberhalb 1.80⁰C, oberhalb 190⁰G, oberhalb 19O⁰C und oberhalb 200⁰C, in der genannten Reihenfolge.

(2) Elementgehalte und Werte der Elementaranalyse:

D, E, F, G und H enthalten sämtlich die 4 Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff.

Werte der Elementaranalyset

C (Ji) H. (#) N

D : 39,44 4,45 13,62

E : 40,52 4,88 14,02

F : 45,87 4,96 12,76'

G : 41,61 5,17 14,16

H : 46,13 5,49 13,64

(3) Molekulargewichte:

D, E, F, G und H sind sämtlich amphotere Stoffe, und ihre Molekulargewichte, gemessen anhand der Neutralisationsäquivalente entsprechend elektrometrischer Titration, betragen wie folgt:

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D :	530
E :	521
F :	616
G :	497
H :	645

(4) Summenformeln:

D : C₁₇H₂₃^₅O₁₄ ^{P J C}23^H30^N6°15.

vT · L/ «ι rfXlοC" C V Λ f\

H , O₂₃H₅₂K₆O₁₃

(5) Theoretische Werte der Eiernentgehalte und Molekulargewichte, berechnet anhand der Summenformeln ι D : für C₁₇H₂₃N₅O₁₄ Molekulargewicht: 521,39 Elementgehalte: 39,16 ?έ C, 4,45 $> H, 13,43 & N

E : für C₁₇H₂₃N₅O₁₃ Molekulargewicht: 505,39 Elementgehalte: 40,40 fo C, 4,59 # H, 13,86 $> N

P : für C₂₃H₃₀N₆O₁₅ Molekulargewicht: 630,52 Elementgehalte: 43,81 # C, 4,80 i> H, 13,33 $> N

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& : für

Molekulargewicht; 491,41 "

Elementgehalte; 41,55 $ 0, 5,13

für O₂₃H₃₂N₆O₁₅ Molekulargewicht; 600,53 Elementgehalte j 46,00 $> C, 5,34

14,25 $ N

j 14,00

(6) Chemische Struktur; Ϊ), B, F, G- und Ή begitZen die folgenden chemischen Strukturen: -■-■.. '.- \ ■> i

HOOC

C 0 Hl 0 H

0OH

HCOH .

HOCH H

CH₂OCONH₂

<ί

OH OH

HOOC

C 0 H W C H

H₂NCH

GEr,

i ²

HOCH

}l

Ο^ϊ'

COOH

CH₂OCONH₂

OH OH

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- 18 -

Rikagaku Kenkyusho

COOH

.CH *

OC

O^

COOH

COHNCH

H₂NCH HCOH HOCH i

H OH

Il

-CH₂OH

HOOC C OHNCH

H₂NCH CH₂ HOCH

H H

OH OH

CH₂OCONH₂

-CH.

COHNCH

² . NCOH

HOCH I CH₂OGONH₂

O-

OH OH

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Wie in den obigen Strukturen gezeigt ist, besitzen D₁ E₁ P, G und H eine starke Ähnlichkeit hinsichtlich ihrer chemischen Strukturen.

(7) Spezifische Drehungen:

D : [a]^⁰= +3O⁰ (C- 1, Wasser)

P ι [α]*⁰= -18° ( " « )

(8) UV-Absorptionsspektrenj

Die UV-Absorptionsspektren von D, E, F, G und H sind der: Reihe nach in den Abb. 1, 2, 3, 4 und 5 gegeben. Die maximalen Absorptionswerte sind folgende:

276 lyu CEf₀₁₁ 217 ).

*>■

^nH01-^

276 m/U (E^₀₁₁₁ 200 ).

128).

00 9812/17 58

257 ).

276 m/U (E™°_cm 181 ).

118-)·

«HOI _=261m/u(^_{m 1TO)}.

127

0,05

Als Ergebnis von Abbau-Untersuchungen der genannten PoIyoxine vmrde klargestellt, daß die Absorption von G von der in dem Molekül enthaltenen chromophoren 5-Hydroxymethyluracil-Gruppe herrührt und daß die Polyoxine A und B ebenfalls dieselbe chromophore Gruppe besitzen.

Auf der anderen Seite vurde festgestellt, daß die UV-Absorption von B, E und P von der chromophoren Gruppe Uracil-5-carbonsäure herrührt, die UV-Absorption von H von der chromophoren Thymin-Gruppe.

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(9) IR-Absorptionsspektren: Die IR-Absorptionsspektren von D-, E, F, G und H, gemessen als Kaliumbromidtabletten, sind in dieser Reihenfolge in den Abb. 6, 7, B, 9 und 10 dargestellt. Die Stellen der hauptsächlichen Absorption, angegeben in Frequenzen, sind folgende: D : 3200 - 3500, 1716, 1620, 1565, 1463> 1410,

1350, 1257, 1130, 1070, 970, 885, 606, 770 cm"¹.

E: 3200 - 3500, 1690, 1617, 1470, 1410, 1385,

1345, 1275, 1120, 1065, 880, 823, 769 cm"¹.

F: 3200 - 3500, 1710, 1635, 1465, 1380, 1275, 1125, 1665, 810 cm"¹.

a : 3200-3500, 1685, 1605, 1476, 1415, 1346, . 1282, 1125, 1065, 790, 770 cm"¹.

H: 3400, 1693, -164O> 1470, 1380, 1320, 1280, 1130, 1060, 900, 595 cm"¹.

(10) Rf-Wertes _{: :} ^ ■" ■-. Die durch Entwicklung mit Butanol-Essigsäure-Tiasser ( 4 ί 1 J 2, bezogen auf das Volumen) unter Verwendung von Toyo Filterpapier Nr. 51 erhaltenen. Rf-Werte sind wie folgt: ".:. : V ;

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D : 0,10

E : 0,13

F : 0,21

G : 0,12

H : 0,27

Die bei Entwicklung mit 75%igem Phenol erhaltenen Rf-Werte sind folgende:

Die Rf-Werte der Polyoxine A und B unter den gleichen Bedingungen betragen:

A : 0,21, B : 0,10

D :	0,08
E :	0,12
F :	' 0,38
& :	0,30
H :	0,66

( Die Rf-Werte der Polyoxine A und B (bei diesen Bedingungen sind: ( A : 0,53, B : 0,18

(11) Löslichkeiten:

D, E, F, G und H sind sämtlich in Wasser leicht löslich, jedoch schwer löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Chloroform, Benzol und Ither.

(12) Farbreaktionen: . ■ D, E, F, G und H reagieren sämtlich positiv auf die Ifinhydrin-, Meta-Perjodsäure-Benzidin- und Di azo-Reaktion, jedoch negativ auf die Fehling-, 2,4-Dinitrophenylhydrazin-, MOlisch-, Eisenchlorid-, ÜTitroprussidnatrium- und Sakaguchi-Reaktion.

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(13) pK'a-Werte: ; '■"'-'"■

D, E, F, Gr und H sind sSmtlieh amphotere Stoffe j U, E und F besitzen je 4 titrierbare Gruppen, G und H 5 titrierbare Gruppen. Die pK'a-Werte sind folgende»

D t	2,6	3,7	7,3	9	,4
E ι/	2,8	3,9	7,4	9	,3
F :	2,7	3,9	7,2	9	,3
G :	3,2	7,3	9,3
H ι	3,2	7,2	9,4

(14) Stabilitäten: ; ·" \ ;

D, E, F, G und Hsind alle instabil gegenüberAlkali, jedoch inerklieh stabil bei saurem oder neutralem pH. Bei pH 2 bis 7 werden sie kaum zersetzt, selbst wenn sie 15 Minuten lang auf 1QO⁰G erhitzt werden. Sie sind ebenfalls stabil gegenüber UV-Bestrahlung, und werden selbst ciaiin nicht desaktiviert, wenn ihre-wässrigen lösungen 24 Stunden lang mit einer chemischen 20Vi'-Lampe aus einer Entfernung von 30 cm bestrahlt werden.

Die physiologischen Wirksamkeiten der Polyoxine D, E, F, G und H sind folgende: . ν

(1)Antimikrobielles WirkungsSpektrum:

Die minimalen HemmkonzentratJLonen der Polyoxine D,

E, F, G und H gegen verschiedene pflanzenpathogene Pilze werden in der folgenden labeile aufgezeigt.

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Testorganismus

Minimale Hemmkonzentration (mcg/ml)

Piricularia oryzae

3,12 12,5 2,5 6,25

Cochliobolus miyabeanus 6,25 12,5 6,25 3,12

Pellicularia sasakii <1,56 3,12 100 3,12

Alternaria kikuchiana 50 50 >100 6,25

Glomerella cingulata *>100 >100 >100 >100

Guignardia laricina 100 50 >100 6,25

Cladosporium fulvum 100 25 25 3,12

Fuq£arium oxysporiam > 100 >100 >100 >100

Phytophthora parasitica nicht untersucht

Gibberella fujikuroi Helminthosporium sigmoideum Leptosphaeria salvinii Scherotinia sclerotiorum

nicht untersucht

nicht untersucht

nicht untersucht

nicht untersucht

3,1

25-50

25-50 ^100

3,1-6,2

12,5-25 >100

100 >100

25-50

25

6,2

(Die Konzentrationen wurden nach 48 Stunden unter Verwendung eines Kartoffel-Sukrose-Agarmediums bewertet)

Wie'in der Tabelle gezeigt wird, sind D, E, P, S und H sämtlich in hohem Maße dadurch gekennzeichnet, daß sie eine spezifische hohe Wirksamkeit gegen verschiedene Pflanzenpilze besitzen, Jedoch wenig Aktivität gegen andere Pilze und Bakterien zeigen.

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In Gefäßversuchen und in Feldversuchen gegen verschiedene pathogene Pilze zeigten, sie erhebliche präventive lind curative Wirksamkeiten. Es erwies sißh. also in der Praxis, daß sie in der Landwirtschaft als Fungizide zum Schütze von Pflanzen außerordentlich brauchbar sind. _

(2) Toxizitäten: ■_' .

Weder D, noch E, P, G- oder H zeigt Toxizität, selbst dann nicht, wenn 500 mg/kg von ihnen einer Maus intravenös injiziert werden.

Werden die genannten physikochemischen und physiologischen Eigenschaften der Pölyöxine D, E, F, S und H mit denen bekannter Antibiotika verglichen, ist klar zu ersehen, daß sie neuartige Antibiotika darstellen, die nicht mit irgendwelchen bekannten Antibiotika, übereinstimmen. Ferner hat, wie gezeigt, das Polyoxin G 5-Hydroxymethyluracil als chromophore Gruppe, wie im Falle der Polyoxine A und B, während die Polyoxine D, E und F und PolyoxinH dadurch gekennzeichnet sind, daß sie als chromophore Gruppen Uraeil-5-earbonsäure bzw. iDhymin besitzen. . . " '

Die Polyoxine A, F undvE, die Polyoxine B und D und* die Polyoxine G und E sind /jeweils struktur eil verwandt. Daß dieser Unterschied dem "Unterschied in den chromophoren Gruppen zugeschrieben werden kann, ist aJihand der Summenformeln und der physikochemischen Eigenschaften leicht anzunehmen. Diese 'Annahme wird: durch^ die Äbbau-Studien erhärtet.

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ι Die folgenden Beispiele erläutern das vorliegende Verfahren zur Herstellung der neuartigen antibiotischen Polyoxine D, E, i¹, G und H.

Beispiel 1	-
Lösliche Stärke	12,0 kg
Weizenkeimlinge	8,0 kg
Trockenhefe	4,0 kg
Sojabohnenmehl	2,0 kg
Glukose	2,0 kg
Calciumkarbonat	0,4 kg
Wasser	400 Liter

Ein Nährmedium dieser Zusammensetzung wurde 20 Minuten lang bei 12O⁰C sterilisiert. In dieses Medium wurde der Stamm Streptomyces asoensis, Typ I (ATCC 19 093), eingeimpft, nachdem er 48 Stunden vorgezüchtet worden war, und der Stamm wurde unter aeroben Bedingungen und unter Rühren bei 27°C gezüchtet. Die Züchtung wurde weitergeführt, während die Wirksamkeit mittels Pellicularia sasakii als Testorganismus untersucht wurde, bis die maximale Wirksamkeit erreicht worden war. Die Wirksamkeit erreichte ihr Maximum nach etwa 96 Stunden, wobei die Submerskultur bei 220 U/min und unter Einleitung von 400 Liter sterilisierter Luft pro Minute ausgeführt worden war. Die Wirksamkeit betrug 1800 mcg/ml, berechnet auf der Basis von Polyoxin D, bei Verwendung von Pellicularia sasakii als Testorganismus,

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Beispiel 2 : :

Lösliche Stärke 10,0kg "

Weizenkeiine 4,0 kg

Hefe - \ 6,0 kg -

Sojaböhnenmehl 4,0 kg

Caloiumkarbonat "■·."■" 0,8 kg

Wasser V 4-00 Liter

Ein Medium dieser Zusammensetzung wurde bei den gleichen Bedingungen der■.Sterilisation undZüchtung wie in- Beispiel 1 angewendet, wiederum Pellicularia sasakii als TeatOrganismus verwendet, und dabei eine Wirksamkeit von 1800 mcg/ml, berechnet auf der Basis von Polyoxin D, erhalten, und zwar 72 bis 96 Stunden nach Binimpfen von Streptomyces asoensis, Typ I (ATOC 19095)- V V

Beiapi el 3	,-■;'■■- 6,0 kg
Glukose	■-■-ν--./--4,0.ICg..
Glycerin	y 6,0 kg
Sojabohnenmehl	2,0 kg!
- - - ■ - ■ Ammoniumsulfat	■ .. 2,0 kg
Hefe y ,.,-■-.-■	2,0 kg
H" a t riumchlo rid	1,6 kg
Caleiumkarbohat	400 Liter
Wasser ;

Ein Medium dieser Zusammensetzung würde bei .den gleiche'n Beaingungen der Sterilisation und Züchtung wie in Beispiel 1 verwendet,,mit Pellicularia sasakii als TestOrganismus, wobei V ■: ■ 009812/1758 :

eine Wirksamkeit von 800 mcg/ml, berechnet auf der Basis von Polyoxin D, erhalten wurde, und zwar 72 bis 96 Stunden nach Einimpfen von Streptomyces"asoensis, Typ I (ATCC 19093).

Beispiel 4	6,0 kg
Glukose	4,0 kg
Glycerin	' 6,0 kg
Sojabohnenmehl	2,0 kg
Ammoniumsulfat	2,0 kg
Trockenhefe	2,0 kg
Natriumchlorid	1,6 kg
Calci,umkarbonat	400 Liter
Wass er

Ein Medium dieser Zusammensetzung wurde auf pH » 7,6 eingestellt und dieselben Bedingungen der Sterilisation und Züchtung wie in Beispiel 1 angewendet, mit der Abwandlung, daß Streptomyces asoensis, Typ II (ATCC 19094) eingeimpft wurde. Die Züchtung wurde weitergeführt unter Verwendung von Alternaria kikuchiana und Cochlibolus miyabeanus als TestOrganismen, bis die maximale Wirksamkeit erreicht worden war.

Die Wirksamkeit erreichte ihr Maximum nach 72-96 Stunden der Fermentation nach dem Einimpfen von Streptomyces asoensis, Typ II (ATCC 19094) in das Medium, wonach 70 ml des Mediums in einem 300 ml-Erlenmeyerkolben abgefüllt wurden, und der Stamm einer Schüttelkultur unterworfen wurde.

Gleichermaßen erreichte die Produktion des Antibiotikums das

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Maximum nach 72 Stunden, als der Stamm, der 48 Stunden lang in Schüttelkultur gezüchtet worden war, in einen 400 Liter-Tank eingebracht wurde und einer Submersfermentation bei 220 U/Min. unter Einleitung von 400 Liter/Min, sterilisierter Luft unterworfen wurde.

Die Wirksamkeit betrug 2000 mcg/ml, berechnet auf der Basis von Polyoxin D, bei Verwendung von Pelliculariasasakii als TestOrganismus.

Beispiel 5 ""-■'. '..'.''■-

400 Liter Kulturflüssigkeit, die durch Einimpfen in das in Beispiel 1 beschriebene Züchtungsmedium erhalten worden war, wurden durch Zugabe von 1obiger Salzsäure .auf pH 5 eingestellt, anschließend auf 70⁰G erhitzt, mit.8 kg Diatomeenerde versetzt und dann unter Verwendung einer Miterpresse filtriert.

Das Filtratwurdeüber eine Säule geschickt, die mit 40 Liter Amberlite XE - 100 (H-Porm) ("Amberlite¹· ist ein eingetragenes .Warenzeichen) von 50 -- 100 mesh gepackt war, um die Antibiotika an das Harz zu adsOrbieren.-Die Säule wurde mit Wasser ge-^v waschen und die Antibiotikamit\0,3n Ammohiumhydroxyd eluiert. Die erhaltenen aktiven Eluate wurden bei Temperaturen unter-50⁰O auf etwa 1/4 ihres ursprünglichen Vblumens eingeengt und dann sprühgetrocknet, wobei etwa 900 g eines braunen ungereinigten Pulvers erhalten wurden. 150 g dieses Pulvers wurden in 0,1m Salzsäure -Phosphat-Püfferlösüng von pH =2,0 gelöst, zur Absorption über eine mit 20 Liter Dowex 5OW χ 8 (100-200 mesh) gepackte Säule geschickt, die zuvor mit der gleichen Puf-

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ferlösung gepuffert worden war, und dann entwickelt und eluiert mit einer 0,1m Phosphorsäure-Pufferlösung von pH = 5»3. Nach einem Entsalzungsprozess mit Aktivkohle wurden 30 g eines hellgelben Pulvers erhalten. Dieses Pulver wurde chromatographisch mit Sulfoäthylsephadex weiter gereinigt. D.h., das Pulver wurde in einer 0,1m Salzsäure-Phosphat-Pufferlösung gelöst, über eine mit 50 g Sephadex (SE-C-25) gepackte Säule geschickt, die mit der gleichen Pufferlösung gepuffert worden war, und schließlich mit derselben Pufferlösung entwickelt, wobei 15 g eines weißen gereinigten Pulvers des Polyoxinkomplexes erhalten wurden.

Der so erhaltene Polyoxinkomplex wurde in Wasser gelöst und über eine mit 500 Liter Amberlite IR-4B, Cl-Form, (100-200 mesh) beschickte Säule geschickt. Die Ablauflösung und die Waschflüssigkeiten wurden vereinigt und bei vermindertem Druck eingeengt, wobei 6 g eines weißen Pulvers erhalten wurden. Dieses Pulver enthielt-die Polyoxine A, B-, G und H. Die Harzsäule wurde mit einer 6$igen Natriumchloridlösung entwickelt, um die Antibiotika zu eluieren, und die aktiven Eluate wurden zur Adsorption der Antibiotika mit Aktivkohle behandelt. Nachdem die Aktivkohle mit Wasser gewaschen worden war, wurden die Antibiotika mit Methanol-Pyridin-Wasser (5 : 1 : 4, bezogen

f auf das Volumen) eluiert, das Eluat zur Trockne eingedampt, wobei 4 g eines weißen Pulvers erhalten wurden. Dieses Pulver enthielt die Polyoxine D, E und P. Da sie fest an Metallionen gebunden sind (vorwiegend Calcium), wurden die folgenden Arbeitsweisen zur Entfernung dieser Ionen ausgeführt:

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Das Pulver wurde in O,2ß Salzsäure gelöst, die Lösung dann über eine mit 400 ml Dowex 5OWX-16 (Η-Form) gepackte Säule geschickt, wodurch die aktiven Stoffe hindurchpassierten, während die Metalle durch das Harz gebunden wurden. Die Ablauflösung und die Waschlösungen wurden zur Adsorption der wesentlichen Bestandteile mit Aktivkohle behandelt. Nachdem die Aktivkohl· mit Wasser gewaschen worden war, Würden die Antibiotika mit Methanol-Essigsäure-Wasser (5 : 1 : 4, bezogen auf das Volumen) eluiert, vniä das Eluat zur Trockne eingedampft, wobei 3,4- g eines weißen.Pulvers erhalten wurden. Dieses Pulver ist Asche-frei.

Um die Polyoxine G und H aus der Fraktion, die die Polyoxine A, B, G und H enthält, rein zu isolieren, Wurde Cellulose-Säulenchroinatographie verwendet. D.h., 5 g dieser Mischung wurden über eine""Gellulo'sesäulevon 55 mm Durchmesser und . 1000 mm Länge freschickt, wobei als Lösungsmittel eine Lösung verwendet wurde,", die Bu-canol, Essigsäure' und Wasser in einem Volumenverhältnis von 4 j I : 2 enthielt, wodurch H,A, G und B in dieser Reihenfolge nacheinander elüiert wurden mit Ausbeuten von 0,1 g bzw; 1,3 g, ; 0,15 g und 1,1 g.

Die Isolierung der Polyoxine D^ S und F aus der Mischung, die diese Polyoxine enthält, wird in genau derselben beschriebenen Weise mittels Cellulose-Säulenchromatographie durchgeführt. In diesem Falle wurden, als 4 g des Gemisches,: das D, E und F enthielt, unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems von Butanol - Essigsäure - Wasser (VoIi-Verhältnis 4:1 : 2) chromatögraphiert.würden,, die Polyoxine F, E und. D in dieser ;'■:■ :,'.;■ 009812/1758

Reihenfolge mit'Ausbeuten von 0,98 g D, 0,12 g B und 1,04 g F eluiert.

Bei der Umkristallisation aus wäßrigem Alkohol wurden die Polyoxine E, F und G einzeln als farblose Pulver erhalten. Ferner wurden die Polyoxine D und H einzeln als farblose kristalline Pulver erhalten.

Beispiel 6

430 Liter einer Kulturflüssigkeit, die durch Einimpfen in das in Beispiel 4 beschriebene Züchtungsmedium erhalten worden war, wurden durch Zugabe von 1Obiger Salzsäure auf pH = 2,0 eingestellt, auf 7O⁰C erhitzt, und mit Hilfe von 9 kg Diatomeenerde durch eine Filterpresse filtriert.

Das Filtrat wurde mit 8 kg'Aktivkohle und 8 kg Diatomeenerde versetzt, gerührt und dann filtriert % die Aktivkohle wurde mit 350 Liter Wasser gewaschen. Die Aktivkohle wurde zweimal mit 100 Liter 60$igem Aceton extrahiert, anschließend das Eluat unter vermindertem Druck eingeengt, wobei 4 Liter konzentrierter Lösung erhalten wurden. Hierzu wurden 50 Liter Aceton hinzugefügt, anschließend der ausgefällte Niederschlag unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 644 g eines braunen ungereinigten Pulvers erhalten wurden.

370 g dieses ungereinigten Pulvers wurden in Wasser gelöst, auf pH = 2,0 eingestellt, und dann über eine mit 4,5 Liter Dowex 50 WX8, H-Form (50-100 mesh) gepackte Säule geschickt, wobei die Antibiotika adsorbiert wurden. Nachdem die Harzsäule jnit Wasser

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gewaschen worden war, wurden die Antibiotika mit 5$iger Hatriumchloridlösung eluiert. Das erhaltene aktive Eluat wurde einem Entsalzungsprozess mit Aktivkohle unter Adsorption und Desorption unterworfen, wobei 60 g eines leicht braunen Pulvers erhalten-wurden. .

Dieses Pulver wurde chromatOgraphisch mit Dowex 50 WX8 weiter gereinigt. D.h., das' Pulver wurde in 0,1m Phosphat-Pufferlösung gelöst, an eine mit 2 Liter Dowex; 50 WX8 (100-200 mesh) gefüllte Harzsäule adsOrbiert, die mit Saizsäure*-Phosphat~Pufferlösung von pH =2,0 gepuffert worden war, und anschließend mit einer 0,1m Phosphat-Pufferlösung bei pH « 4,3 zur Eluierung der Antibiotika entwickelt. Das erhaltene aktive Eluat wurde einem Entsalzungsprozess unterworfen, wobei 29 g eines gelbliehen Pulvers erhalten wurden. c

Dieses Pulver wurde chromatographisch mit Sulfoäthylsephadex weiter gereihigt, d.h., das Pulver wurde über eine mit 50 g Sephadex (SE-O-25) beschickte Säule geschickt, welche mit einer 0,01m Phosphatpufferlösung von pH »2,0 gepuffert worden war, und wurde entwickelt, indem die Konzentration der Pufferlösung kontinuierlich auf 0,1m erhöht wurde, wobei schließlich 14" g eines weißen gereinigten Pulvers des Polyoxihkomplexes erhalten wurden.' ._. ■": ■ . --. .

Der so erhaltene Polyoxinkomplex wurde in Wasser gelöst, und über eine mit 500 Liter Amberlite IE-4B, Cl-iOrm (100-200 mesh) gepackte Säule geschickt. Die Ablauflösung und die Waschflüssigkeit wurden vereinigt und unter vermindertem Druck einge-

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engt, wobei ,10 g eines weißen Pulvers erhalten wurden. (In diesem Falle waren die Polyoxine D, E und F an dem Harz adsorbiert.) Das Pulver enthielt die Polyoxine A, B, G und H. Um G und H in reiner Form aus dem Pulver abzutrennen, wurde Cellulose-Säulenchromatographie als Mittel verwendet. D.h., das Pulver wurde einer chromatographischen Auftrennung mittels einer Cellulosesäule von 35 mm Durchmesser und 1000 mm Länge unterworfen, wobei ein Lösungsmittelsystem Butanol-Essigsäure-Wasser im VoIumenverhältnis 4:1x2 verwendet wurde, wodurch die Polyoxine H, A, G und Bin dieser Reihenfolge nacheinander abgetrennt und eluiert wurden, und wobei 0,25 g G und 0,2 g H aus 5 g des Polyoxinkomplexes erhalten wurden.

Die Polyoxine G und H wurden gereinigt mittels Zonen-Elektrophorese. D.h., die Polyoxine G und H wurden einzeln 16 Stunden lang einer Elektrophorese bei 150 V unterworfen, unter Verwendung von Zeonharz als Träger in Gegenwart eines 0,1m Phosphatpuffers. Der erhaltene aktive Anteil wurde in Wasser extrahierS, und einem Entsalzungsprozess mit Aktivkohle unterworfen, wobei G und H als gereinigte Pulver erhalten wurden. Die Ausbeuten betrugen je etwa 50 i°·

Die so gereinigten Polyoxine G und H wurden einzeln aus wässrigem Alkohol umkristallisiert, wobei Polyoxin G als weißes Pulver und Polyoxin H als weißes kristallines Pulver erhalten wurden.

Patentansprüche :

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Claims (15)

1. P a t e η t a η s ρ r ii ch. e :

   1» Neuartiges, antibiotisciies Polyoxin I) mit der Struktur:

   HOOC 1

   C 0 HN G H ι

   H₂NCH

   - HCOH

   HOCH

   t "'-■;. CH₂OCONH
2. 2. Neuartiges, antibiotisches Polyoxin E mit" der Struktur:

   ' ::. "■ ■ ." - ".' ο "■■■■. " ■ ■■'■■:■."■ .

   f>

   COOH

   HOOC

   C O HNC H ι

   HOCH
   ι

   OH OH

   CH₂OCONH₂

   - -uti J*itl ,^ir

   Q09 8 12/1758

   ^:"'-. " .· c -ΐζ 3dei
3. 3. Neuartiges, antibiotisches Polyoxin F mit der Struktur:

   COOH

   COOH

   CH,.CH< NOC

   3 "\ s

   OH OH

   CH₂OCONH₂
4. 4. Neuartiges, antibiotisch.es Polyoxiü G mit der Struktur $

   HN

   HOOC

   CH₂OH

   COHN CH

   H₂NCH GH,

   HOCH

   O H H

   H OH

   CH₂OQONH₂

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5. 5. neuartiges, antibiötisches Polyoxin H mit der Struktur;

   COOH

   . GH=< NOC

   C 0H5 0 H

   H₂NGH

   HOOH

   ι
   HOGH

   OH OH

   CH₂OCOIiH₂
6. 6. Verfahren zur Herstellung neuartiger antibiotischer PoIyoxlrre D, E, F, G und H mit den Summenformeln

   "bzw.

   ₇H₂₃B₅O₁^ C₂3^H30^W6⁰15* ^C17^H25%°12 , dadurch gekennzeichnet, daß man einen

   Mikroorganismenstamm vonStreptomyces cacäoi var. asoensis mit einer derAiCC-Hummern 19093 oder 19094 in ein Züchtungsmedium, das sich aus einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle und einem anorganischen Material zusammensetzt, einimpft, daß man das Medium bei einer Temperatur von 25 bis 35⁰C solange züchtet, bis dem Züchtungsmedium eine wesentliche ahtibiotisohe Aktivität verliehen worden ist und ein Polyoxinkomplex, der die Polyoxine D, E, Ί?, G

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   und H enthält, in dem Medium produziert worden ist, daß man den Komplex aus dem Züchtungsmedium gewinnt und den Komplex dann in die einzelnen Polyoxine D, E, Έ, G und H auftrennt.
7. 7. Verfahren zur Herstellung eines neuartigen antibiotischen Polyoxinkomplexes, der die antibiotischen Polyoxine D, E, F, G- und H mit den Summenformeln C „„Η«-,Ν,-Ο... C₁,7H₀JuT₁-CL,,,

   ^C23^H3O^N6°15' ^Gn^E25^5^Q12 ^²""* ^C23^II32^li6^O13 enthält,, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismenstamm von Streptomyces cacaoi var. asoensis mit einer der ATCC-Nummern 19093 oder 19094 in ein Züchtungsmedium, das sich aus einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle und einem anorganischen Material zusammensetzt, einimpft, daß man das Züchtungsmedium bei einer Temperatur von 25 bis 35 C solange züchtet, bis dem Züchtungsmedium eine wesentliche antibiotisehe Aktivität verliehen worden ist und der Komplex, der die Polyoxine D, E, F, G- und H enthält, in dem Medium produziert worden ist, und daß man dann den Komplex aus dem Medium gewinnt.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung als aerobe Submersfermentation und unter Rühren durchführt, . ;
9. 9. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung etwa 40 bis 100 Stunden lang durchführt.

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10. 10. Verfahren nach. Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, •daß man als Kohlenstoff quelle Stärke, Dextrin, Glucose, Glycerin, Maltose oder Fructose verwendet.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7» dadurch gekennzeichnet, daß man als Stickstoffquelle Fleischextrakt, Pepton, Maisquellflussigkeiir,Sojabohnenpulver, Erdnußpulver, Baumwollsamenpulver oder Hefe verwendet.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 6 oder .7, dadurch gekennzeichnet, daß man als anorganisches Material Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat oder Kaliumphosphat verwendet.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die !Trennung der Polyoxine D, E, F, G und H voneinander durch CeIl^-UlOse-Säulenchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelsyetems aus Butanol, Essigsäure und Wasser zur Eluierung der Pölyoxine Ό, E, F, G und H durchführt. . ■ \ '..
14. 14. Verfahren nach Anspruch 6 oder 13» dadurch gekennzeichnet, daß man ein VoIumenverhältnis von Butanol j Essigsäure s Wasser von 4 :' T ; 2 anwendet.
15. 15. Verfahren nach einem der Ansprüche 6, 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß man die Trennung der Eolyoxine D, E, Ty G und H voneinander durch Elektrophorese unter Verwendung eines Harzes und eines Phosphätpuffers zur'Umkristallisierungder Polyoxine aus einem wässiigen Alkohol durchführt. ■■:_"■■■...■.-'■ :■':-- ■/ '

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