DE1937494C3 - Verfahren zur Herstellung einer Antivirussubstanz - Google Patents

Description

2. Czapek-Agar, (kultiviert bei 28°C)

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hei stellung Erhaben, olivfarben (1 Ig) mit Falten an der Obereiner neuen, als. »84-B-3« bezeichneten Antivirussub- 25 fläche. Luftmyzel gelblichweiß (1 ba) bis hellgrau stanz. (2 de). Lösliches Pigment blaßgelblichbraun (2 ie) bis

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur dunkelbraun (3 pn).

Herstellung einer Antnirussubstanz, die _{} G}|_ucose._Czapek-Agar (kultiviert bei 28°C)

.) eine Zersetzungstemperatur von 161 bis 164 C, ^^ _{dunkelblBUn (2pn) mit Falte}n an der

b) ein Molekulargewicht von etwa 300 bis 400, Oberfläche. Wassertropfen werden erzeugt. Luftmyzel

c) einen Rf-Wert von 0,36 bis 0,48 (Silikagel-Dünn- samtig und grau (f). Lösliches Pigment blaßbraun Schichtchromatographie, Entwicklung mit Buta- (3 ig _>. 3 _nj).

nol-Pyridin-Essigsäure-Wasser 6:4:1:3) „ . . , .

hat, das dadurch gekennzeichnet ist. daß man Strepto- 35 ⁴" Glucose-Asparagm <Kra.nsky)-Agar

myces rameus ATCC 21273 oder Streptomyces S. P. (kultiviert oei μ ν.ι

ATCC 21274 in einem Medium, das eine Quelle für Reichlicherhaben, blaßbraun (I¹Z₂H) mit Luftmyzel

assimilierbaren Kohlenstoff, eine Stickstoffquelle und grau (2 fe) bis beige (3 qe). Lösliches Pigment blaß

ein anorganisches Material enthält, kultiviert und aus gelblichbraun (2 ie) bis blaßbraun (3 Ig).

dem Medium die gebildete Antivirussubstanz auf 40 , „ , . . . .11*· ;»-♦ w„; tü~r\

übliche Weise gewinnt. ⁵· ^Iciummalat-Agar (kultiviert be. 28 C)

Die Kultivierung erfolgt vorzugsweise bei einem Transparent, flechtenartig, Luftmyzel pulverförmig,

pH-Wert von 6 bis 8 und bei einer Temperatur von hirschhaarfarben (4 ge). Kein lösliches Pigment.
22 bis 40⁰C.

Zur Abtrennung der erzeugten Virussubstanz wird 45 f,. Glucose-Pepton-Brühe (kultiviert bei 28'C)
die Fermentationsbrühe vorzugsweise mit einem

Kationenaustauscherharz, auf dem die Substanz Transparent, erhaben mit Falten an der Oberfläche,

adsorbiert wird, in Kontakt gebracht, und das Harz Luftmyzel samtig und weiß (a). Lösliches Pigment

wird dann mit einer wäßrig-alkalischen Lösung eluiert, blaßgelblichbraun (2 ie) bis dunkelorange (4 pg).

um die Substanz zu gewinnen. Alternativ kann die 50 .,,..,» ,1 1 · · . u · io»ri

Fermentationsbrühe mit Aktivkohle in Kontakt ge- ⁷· Nahr-Agar (kultiviert bei 28 C)

bracht und die Kohle dann mit einem alkalischen Transparent. Luftmyzel samtigweiß (a) bis grauweiß

organischen Lösungsmittel, das Wasser enthält, eluiert (b). Lösliches Pigment bambusfarben (2 gc).

werden, um die Antivirussubstanz zu gewinnen. „ , „, „, ,, . . . . , . -.-,ο/-..

Nach dem Verfahren der Erfindung kann die neue 55 ⁸' ^{Loefflers Blutsmim (kultiviert be}' ^{J? C)}

Antivirussubstanz in der Form einer verdünnten Transparent, Luftmyzel weiß (a). Lösliches Pigment

Lösung, eines rohen Konzentrats, eines gereinigten dunkelbraun (4 pn). Serum hämolysiert.

Feststoffes oder reiner Kristalle aus der Substanz _Λ „, , ι · ■ ■_ ■ „.r,

selbst oder einem ihrer Salze erhalten werden. ⁹· ^Bluta?^ar (kultiviert be· 37 C)

Die neue Antivirussubstanz inhibiert das Wachstum. 60 Flechtenartig. Luftmyzel zerstreut, hellgrau (c).

von beispielsweise Tabakmosaikvirus, Gurkenmosaik- Lösliches Pigment, starkrötlichbraun (6¹Z₂ pl), keine

virus, Rettichmosaikvirus und Luzernemosaikvirus Hämolyse.

und hat außerdem prophylaktische Wirkung gegen ,„ „ _ , _A , , ■ ■ , ■ _λοο^>

diese, wenn es auf Saatgut oder Blätter der Test- ¹⁰· Karloffel-Agar (kultiviert bei 28 C)

pflanzen aufgebracht oder aufgesprüht wird. Es wird 63 Ergaben, olivfarben (l'/₂pl) mit Falten an der

gewöhnlich in Konzentrationen von 1 bis 'on mg/ml, Oberfläche. Luftmyzel samtiggrau (2 bis 3 ih). Lös-

verzugsweise 10 bis 50 mg/ml (rohe Kristalle, wie im liches Pigment dunkelbraun (3 nl) bis schokoladen-

Be, .piel 2 erhalten), verwendet. farben (4 nl).

Ein Vergleich der obigen Eigenschaften mit denen bekannter Streptomyces-Stämme, wie sie in »The Actinomycetes« S. A. W a k s m a η, Bd. Il (The \* ι Hams and Wilkins Co., 1961) angegeben sind, ergibt,

daß der vorliegende Stamm dem Stamm Streptomyces rameus außerordentlich ähnlich ist. Es ergeben sich jedoch die folgenden Unterschiede:

Das Luftmyzel von Streptomyces rameus ist bei Züchtung in Glucose-Asparagin-Agar und in Kar-

toffelmedium weiß, während dasjenige des Stammes, der die Antivirussubstanz gemäß der Erfindung erzeugt, im ersteren Medium grau bis beige und im letzleren grau ist. Außerdem verwertet Streptomyces rameus gar keine oder nur wenig Rhamnose und

wächst nicht, während der vorliegende Stamm Rhamnose gut verwertet und gut wächst. Jedoch unterliegen Streptomycesarten im allgemeinen leicht natürlichen oder künstlich herbeigeführten Veränderungen auf einem Medium, so daß nicht gesagt werden kann,

•o daß die Eigenschaften des vorliegenden Stammes unveränderlich sind. Die Unterschiede zwischen dem vorliegenden Stamm und Streptomvces rameus sind nicht "so beachtlich, daß der vorliegende Stamm von einer anderen Spezies unterschieden werden konnte. Die Erzeugung der neuen Antivirussubstanz kann unter Anwendung bekannter Kult.werungsmethoden. beispielsweise Kultivierung auf festem Nährboden unter aerobischen Bedingungen. Stichkultiv.erung cultivation method), Kultivierung im fluss,-

11. Eieralbumin-Agar (kultiviert bei 37°C) Transparent, flechtenartig, Luftmyzel pulverartig, gelblichbraun (2 ge) bis grau (f). Lösliches Pigment blaßgelblichbraun (2 ie) bis zimtfarbcn (3 Ie). 12. Stärke-Agar (kultiviert bei 28°C)

Transparent, erhaben. Luftmyzel samtigweiß (a) bis grau (1 ih). Lösliches Pigment blaßbrajn (3 Ig). Stärke verflüssigt.

13. Glucose-Tyrosin-Agar (kultiviert bei 28°C) Flechtenartig, bambusfarben (2 gc). Luftmyzel zerstreut, dunkelgelb (2 gc) bis gelblichbraun (2 ge). Kein lösliches Pigment.

14. Melaminbildendes Medium (kultiviert bei 28° C) Transparent. Luftmyzel samtig, grau (e) bis silbergrau (3fe). Lösliches Pigment blaSbraun (31g) bis dunkeischokoladenfarben (5 po). Tyrosinaseaktiv.

15. Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (von Difco Co. USA) (kultiviert bei 28°C) Erhaben, dunkelgrau (m bis n). Luftmyzel schwach, grau (g). Lösliches Pigment schwärzlichbraun (3 po) bis dunkelschokoladenfarben (5 po). H₂S erzeugt.

16. Hefeextrakt-Malz-Agar (von Difco Co. USA) (kultiviert bei 28°C)

Erhaben, dunkelolivfarben (T'₂pn). I uftmyzel l™""¹¹¹» "'"'-"^¹J₀Y"--"Vorzugsweise'erfolgt die reichlich, grau (2 fe) bis dunkel (3 ig). Lösliches 30 gen Medium usw. erfolgen. ^V0«^lJ

Pigment dunkelbraun (3 bis 4 pn). ^SnA*r A? M^uTkönnen Sac

17. Bactonitratbrühe (hergestellt von charide, wie Stärke. Glucose. Dextrin, Rohrzucker,

Difco Co. USA) (kultiviert bei 28°C) Melasse usw. oder verschiedene andere Materialien

Film auf der Oberfläche Mes flüssigen Mediums, 35 verwendet werden. Ah ^^Uc Scnes PflaT-weiß. Kein Luftmyzel. Lösliches Pigment bernstein- ^^^J^^^ Autoly-

sat Fleischextrakt, Pepton usw. und verschiedene anorganische odei organische Stickstoffverbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat Ammoniumchiorid. Harnstoff usw. verwendet werden. Auch anorganische Salze, Spurennährstoffe. D.geriermittel und andere Zusätze können verwendet werden.

Das Medium ist vorzugsweise schwach sauer bis schwach alkalisch, d. h., der pH-Wert beträgt 6 b,s 8 und die Kultivierungstemperatur hegt vorzugsweise zwischen 22 und 40^C. Bei geeigneter Belüftung und Rühren hat sich nach 12 Stunden eine beträchtliche Menge an der neuen Antiv.russubstanz angesammelt,

_D„„_kelbr.„» ₍3„„. Lur,_m»z_{el g}r„, ,« bis 3dC. S. ujd* gE~_li£_c!rk£uSräS£

tationsbrühe kann durch Auszählen der erkrankten Stellen von Nicotiana glutinosa unter Verwendung

farben (3 pe).

18. Lackmus-Milch (kultiviert bei 37⁰C) Lösliches Pigment dunkelbraun (5 pl) bis dunkelschokoladenfarben (5 po). Milch nicht koaguliert. Peptonisierung.

19. Gelatine (kultiviert bei 20"C)

Gelblichbraun (3 pi), Luftmyzel samtig, weiß (a). Lösliches Pigment dunkelorangefarben (4pg). Fast keine Verflüssigung.

20. Kartoffeln (potato plug) (kultiviert bei 28^CC)

Lösliches Pigment schwarz (p).

21. Karotten (carrot plug) kultiviert bei 28C) Kein Wachstum.

22. Cellulosemedium (kultiviert bei 28 C) Kein Wachstum.

23. Verwertung von Kohlenstoffquellen (Pridham-Gottlieb-Salz als Basa'medium)

d-Glucose, 1-Arabinose, d-Mannose, 1-l.ävulose, Rhamnose, d-Mannit, Inositol, Lactose, Saccharose, Maltose, Cellobiose, d(+)-Raffinose, d-Trehalose werden verwertet. Sorbit und Cellulose werden fast nicht verwertet.

Anmerkung: Die Zeichen in den Klammern sind l'arbbezeichnungen gemäß »Color Harmony Manual« 4. Auflage, 1958, Container Corporation of America.

des Tabakmosaikvirus erfolgen.

Die in der Fermentationsbrühe erzeugte Antivirussubstanz kann durch physikalisch-chemische Methoden isoliert und gereinigt werden:

Das Filtrat der in dem obigen Verfahren erhaltenen Fermentationsbrühe wird direkt durch eine Kationen-

austauscherharzsäule geführt, umdieAntivirussubstanz auf dem Harz zu adsorbieren. Das Harz wird mit einer großen Menge an entionisiertem Wasser gewaschen und dann mit einer alkalischen Lösung, vorzugsweise verdünntem wäßrigem Ammoniak, eluiert. Das Eluat

65 wird unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet, wobei das rohe Produkt als braunes Pulver erhalten wird. Dieses braune Pulver kann gevvünschtenfalls weiter gereinigt werden, indem man

es in Wasser löst und erneul auf einem Kationenaustauscherharz adsorbiert. Das Harz wird dann wieder mit einer großen Menge entionisiertem Wasser gewaschen und mit einer alkalischen Lösung, vorzugsweise wäßrigem Ammoniak, eluiert. Das Eluat wird im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet, wobei ein braunes Pulver erhallen wird. Das pulvrige Produkt hat beträchtliche Antivirus-Wirkung und kann ohne weitere Nachbehandlung verwendet weiden, Es kann gewünschtenfalls aber auch weiter gereinigt und isoliert werden, indem man es durch eine chromatographische Säule mit Aluminiumoxyd führt und Wasser als Entwicklungsmittel verwendet. Wenn dann noch Spuren restlicher Verunreinigungen und färbender Substanzen abgetrennt werden sollen, kann das Produkt durch Chromatographie auf pulvriger Cellulose unter Verwendung der sich beim Vermischen von n-Butanol, Essigsäure und Wasser ausbildenden oberen Schicht als Entwicklungsmittel weiter gereinigt werden. Die aktive Fraktion wird im Vakuum eingeengt und lyophylisiert. Alternativ kann das Produkt mit einem Filtermittel in Gelform und Wasser als Entwicklungsmittel weiter gereinigt werden und die aktive Fraktion dieser Reinigung im Vakuum eingeengt und lyophylisiert werden, wobei ein weißes bis blaßgelbes Pulver erhalten wird.

Auch Aktivkohle kann als Adsorbens verwendet werden: Der pH-Wert der Fermentationsbrühe wird auf 6 bis 7 eingestellt, und der Brühe wird Aktivkohle und gewünschtenfalls eine geringe Menge Filterhilfe zugesetzt. Das Gemisch wird gerührt, damit die Antivirussubstanz von der Aktivkohle adsorbiert wird. Sie kann dann leicht mit einem alkalischen wäßrig-organischen Lösungsmittel, vorzugsweise wäßrig-ammoniakalischem Methanol, eluiert werden. Das Eluat wird im Vakuum eingedampft und lyophylisiert, wobei ein braunes Pulver erhalten wird.

Das so erhaltene Pulver hat eine beträchtliche inhibierende und prophylaktische Wirkung gegen die obengenannten Viren. Es kann aber gewünschtenfalls weiter gereinigt werden, indem man es in Wasser löst und dann durch eine Kationenaustauschersäule führt und das Harz dann mit einer großen Menge an entionisiertem Wasser wäscht und mit 3,5°;„igem wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wird im Vakuum eingeengt und lyophylisiert, wobei ein braunes hygroskopisches Pulver erhalten wird. Dieses Produkt kann gewünschtenfalls durch Aluminiumoxydchromatographie weiter gereinigt werden. Durch Entwickeln und Eluieren mit Wasser können Entfärbung und Isolierung gleichzeitig erfolgen. Wenn dann noch Restmengen von Verunreinigungen und färbenden Substanzen abgetrennt werden sollen, wird zur weiteren Reinigung vorzugsweise ein Filtermittel in Gelform verwendet. Auch andere Filtermittel, wie Sägemehl, Asbest, Talkum, Aktivkohle usw.. können verwendet werden.

Die bei dem obigen Verfahren in der Form eines weißen bis blaßgetben Pulvers anfallende gereinigte neue Antivirussubstanz zersetzt sich bei IM bis 164 C und hat ein Molekulargewicht von etwa 300 bis 400.

Sie kann leicht durch eine regenerierte Cellulosemembran dialysiert werden. Das IR-Spektrum (KBr-Prisma) ist in '- i g. 2 gezeigt, während das UV-Spektrum der wäßrigen Lösung keine spezifische Absorption zeigt, wie F i g. 1 erkennen läßt.

Die neue Antiv'.rusMibstanz ist gut löslich in Wasser, jedoch schlecht löslich in verschiedenen organischen Lösungsmitteln. Sie ist bei neutralem und alkalischem pH-Wert wärmefest, bei saurem pH-Wert jedoch etwas instabil. Wenn sie beispielsweise bei einem pH-Wert von 12 eine Stunde auf 100 bzw. 80⁰C erhitzt wird, verliert sie 30 bzw. 25°/₀ ihrer Anfangsaktivität, während bei Erhitzen auf 60⁰C keine merkliche Inaktivierung erfolgt. Beim pH-Wert 2,0 verliert sie dagegen fast ihre gesamte Aktivität, wenn sie auf 100 oder 80⁰C erhitzt wird und 50°/₀ ihrer Anfangsaktivität, wenn sie auf 6O⁰C erhitzt wird.

Die Farbreaktionen waren: Molish-Reaktion, Anthron-Reaktion, Elson-Morgan-Reaktion und Ninhydrin-Reaktion positiv, Sakaguchi- Reaktion, Buret-Reaktion, Millon-Reaktion, Wheeler-Tollens-Reaklion, Ferrichlorid-Reaktion, Ehrlich-Reaktion (und Aktiv-Methylen-Reaktion) negativ.

Wenn die Antivirussubstanz der Silicagel-Dünnschichtchromatographic unter Verwendung eines Gemisches von Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser im Volumverhälfnis 6:4:1:3 als Entwicklungsmiltel unterworfen wird, so erscheint sie als einzelner Fleckbei Rf 0,36 bis 0,48, der durch die Ninhydrin-Reaktion oder Anthron-Reaktion Farbe entwickelt.

Die anlimikrobielle Aktivität der neuen Antivirussubstanz wurde durch die Methode der stufenweisen Verdünnung bestimmt. Die antibiotischen Eigenschaften ergeben sich aus der folgenden Tabelle:

Tabelle I

Mikroorganismus

Mindestinhibierungskonzentration

Staphylococcus aureus 209 P >200

Staphylococcus aureau Y*) >200

Sarcina lutea 1001 >200

Bacillus subtilis ATCC 6633 >200

Eschcrichia coli K-2 >200

Penicillium chromogenes >200

Candida albicans Y U-1200 >200

Torula utilis Y-5-1 >200

♦) Dieser Stamm ist resistent gegenüber Streptomycin, Tetracyclin und Penicillin.

Diese Tabelle zeigt, daß die neue Antivirussubstanz praktisch keine baktizide und fungizide Wirkung auf die obengenannten Mikroorganismen hat.

Dagegen beträgt die Antivirusaktivität gegen Tabakmosaikvirus (preventing value) 92°/₀ bei einer Kon-

zentration von 1 μg/ml.

Nach S u m i k i, »Antibiotics« (Tokyo University Press, 1961). und einigen neueren Veröffentlichungen gibt es unter den bekannten Antibiotica einige, die gegen Pflanzenerkrankungen verwendet werden können. beisnielsweise 2,6-Dinitrophenol, 2-Thiouracil, 2 - Thicytosin, 2 - Thithymin, Naphthalinessigsäure, 2,6-Diaminopurin, 8-Azaguanin, 8-Azadenin-f-Carbobenzoyl-1 -lysin-polypeptid und 0-[5-Imino-2-propylidencarboxydl-propamidendihydrochlorid.

Molish-Reaktion und Anthron-Reaktion sind jedoch bei diesen bekannten Mitteln negativ, während sie bei der Antivirussubstanz gemäß der Erfindung positiv sind. Außerdem sind 2.6-Dinitrophenol, 2-Thiouracil, 2-Ti.:ocytosin, 2-Thiothymin, Naphthalinessig-

säure. 2,6-Diar.iinopurin, 8-Azaguanin und 8-Azadenin nicht oder schwer löslich in Wasser, während die neue Antiviiussubstanz sehr gut wasserlöslich ist. f-Carbobenzoyl-i-lysin-polypeptid ist eine hochmolekulare

Substanz, während die neue Antivirussubstanz ein geringes Molekulargewicht hat und leicht durch eine Cellulosemembran dialysiert werden kann. /?-(5-Iminopropylidencarboxyj-propamiden-dihydrochlorid hat keine Antiviruswirkung bei einer Konzentration unter 1 mg/ml, während die neue Antivirussubstanz schon in einer Konzentration unter 1 μg/mI gute Antiviruswirkung hat. "

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erlindung. .

Der in den Beispielen angegebene »prophylaktische Wert« wurde in üblicher Weise wie folgt ermittelt: Eine wäßrige Lösung der nach dem Verfahren der Erfindung erhaltenen Substanz wurde auf die Oberfläche der linken Hälfte eines Blattes der Testpflanzc gesprüht. Danach wurde Wasser, das einen Testmikroorganismus enthielt, auf die gesamte Oberfläche des Blattes gesprüht. Nach 4 Tagen wurde die Anzahl der von dem wachsenden Mikroorganismus gebildeten Flecken auf der linken Hälfte A und der rechten Hälfte B ausgezählt. Der prophylaktische Wert P wurde wie folgt berechnet:

100"/

Die Menge an aufgeimpftem Mikroorganismus wurde so gewählt, daß auf der VergleicKsfläche B nach 4 Tagen noch etwa 100 bis 150 1 lecken gebildet waren.

Der pH-Wert eines Mediums, das 1,5^ο/_η Glycerin, 3,0% Maisquellwasser, 0,5°/_o Peplon und 0,5"/₀ Natriumchlorid enthielt, wurde auf 7,1 eingestellt, 50 ml des Mediums wurden in einen 500-inl-Sakaguchi-Koibcn eingebracht und sterilisiert. Das Medium wurde mit Streptomyces rameus ATCC 21 273 geimpft und unter Schütteln (170UpM) bei 27 C kultiviert. Nach 96 bis 144 Stunden hatte die überstehende Brühe einen prophylaktischen Wert von 90 bis 92°_O.

ο - ■ I 2

Der pH-Wert eines Mediums, das 2,0% Stärke, 1,0°/„ Pepton, 1,0°/„ I lcischexlrakt, 0,3 °/„ Natriumchlorid und 0,1 °/„ SojabohncnJSl enthielt, wurde auf 7,0 eingestellt. 151 des Mediums wurden in einem 30-1-Fermentationsglas sterilisiert. Das Medium wurde mit Streptomyces rameus ATCC 21273 beimpft, und die Kultivierung erfolgte bei 25^aC unter Rühren (250UpM) unter Belüften (101 min). Nach 40 bis 60Sf.inden wurde die überstehende Fermentationsbrühe lyop'iylisiert, wobei eine Substanz mit den folgenden Aktivitäten erhalten wurde:

Aktivität ^Virus (10 mg/ml)

Tabakmo;aikvirus, über 80⁰O

Gurkenmosaikvirus, über 80°/₀

Breitebohnennekrosemosaik-

virus 60 bis 79°/₀

Sojabohnenmosaikvirus 40 bis 59%

Luzernemosaikvirus 40 bis 59%

Rettichmosaikvirus 40 bis 59%

Blumenkohlmosatkvirus 60 bis 79%

kartoffeivirus X 40 bis 59%

Kartoffelvirus Y 40 bis 59%

B e i s ρ i e I 3

Der pH-Wert eines Mediums, das 2,0"/„ Glucose, UO⁰/,, Pcpton, 0.5% Fleischextrakt, 0,25°/₀ Nalriumchlorid und 0,1 °/₀ Sojahohnenöl enthielt, wurde auf 7,1 eingestellt. 1000 1 des Mediums wurden in einem 2000-!-Tunk sterilisiert und mit Slreptomyccs ramcus ATCC 21273 beimpft. Die Kultivierung erfolgte unter Rühren (H)OUpM) und Belüftung (400 l/min) bei

ίο 27" C. Nach 24 bis 48 Stunden wurde die überstehende Fermentationsbrühe lyophylisierl, wobei eine Substanz mit einem prophylaktischen Wert von 95 bis 96% bei einer Konzentration \on 10 mg, ml erhalten wurde.

' '

Der pH-Wert eines Mediums, das 2,5%, Melasse, 2,0% Hefeextrakt, 0,2° ;,, Calciumcarbonat, 0,27",, Dikaiiumhydrogcnphosphat, 0,1 °/„ Kaliumchlorid, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,001"/,, Ferrosulfat enthielt, wurde auf 7,2 eingestellt. 3 1 des Mediums wurden in einem 5-1-Fermentationsgcfä.ß sterilisiert und mit Slrcptomyces S. P. ATCC 21274 beimpft. Die Kultivierung erfolgte unter Rühren (450 UpM) und Belüftung (3 L/min) bei 30 C. Nach 60 bis 72 Stunden hatte die überstehende Fcrmentationsbrühe einen prophylaktischen Wert von 5d bis 60° „.

. c 1 > ρ ■ c .>

DerpH-Wcrt von 1000 I einer die Anti\irussiir>slanz.

gemäß der F.rlindung enthaltenden, nach dem Vcrfahren von Beispiel 3 erhaltenen Fermentationsbrühe wurde auf S eingestellt, und der Hrii'nc winden 50 Kl. einer herkömmlichen Filterhilfe zugesetzt. Man erhielt 9M)I Filtrai. Dieses Fillrul wurde durch eine mit 101 Kaiionenaustauscherharz gefüllte Säule geführt, um die Anlivirussubstanz zu adsorbieren. Das Harz wurde mit 20 I entionisiertem Wasser gewaschen un-l mit 20 I 3°/_oigem wäßrigem Ammoniak eluierl, wobei die Anlivirussubstanz vollständig cluicrt wurde. Das Eluat wurde im Vakuum auf 4 1 eingedampft und dann lyophylisiert. wobei 900 g eines braunen hygroskopischcn Puhors mit einer Wasserlöslichkeit über 1 gml erhalten wurden. Fine wäßrige Lösung dieses Pulvers mit einer Konzentration von I mg'ml lvitlc einen prophylaktischen Wert von 68%.

^{u pin}

100 g eines gemäß Beispiel 5 erhaltenen Pulvers wurden in Methanol mit einem Wassergehalt von 20" „ gelöst, um unlösliches Material abzutrennen, und durch eine mit 4 kg Aluminiumoxyd, dessen pH Wert mit SchwcfeKäurc auf 4,5 eingestellt war, gefällte Säule geführt. Die Säule \vurdemit4 1 Methan»: mit 20% Wassergehalt gewaschen und dann mit Wasser entwickelt und eluiert. Es wurden Fraktionen von je MOmI gesammelt, und die Fraktionen Nr. 41 bis 50 wurden zu einem Liter Eluat vereinigt. Dieses Eluat wurde im Vakuum auf 200 ml eingedampft und dann lyophylisiert. wobei 7,3 g eines gelblichen

hygroskopischen Pulvers erhalten wurden. Der prophylaktische Wert dieses Pulvers gegen Tabakmosaikvirus betrug 99% bei einer Konzentration von 1000 jig ml.

7 g eines gemäß Beispiel 6 erhaltenen Pulvers wurden in 5 ml der überstehenden Flüssigkeit eines Gemisches von n-ßutanol. Essigsäure und Wasser

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im verhältnis 4:1:5 gelöst, und die Lösung wurde durch eine mit 200 g pulverförmiger Cellulose bis zu einer Höhe von 1,5 in gefüllten Säule geführt. Die Säule wurde mit der oben erwähnten Flüssigkeit entwickelt und cluiert, wobei 10 ml Fraktionen gesammelt wurden. Die Fraktionen 48 bis 61, insgesamt 130 ml. wurden vereinigt, mit 130 ml Pelroläthcr und 10 ml Wasser versetzt und 5 Minuten geschüttelt. Die wäßrige Schicht wurde lyophylisieri und ergab 4,4 «eines bhßgelben hygroskopischen Pulvers, dessen prophylaktischer Wert gegen Tabakmosaikvirus ^ι)8"'₍, bei einer Konzentration von 100 [ig ml betrug.

Beispiel 8

1000 1 einer nach Beispiel 3 erhaltenen, die AntiviriiNsubstan/ enthaltenden Fermentationsbrühe wurden auf pH-Wert 6 eingestellt. Dann wurden 50 kg einer herkömmlichen Filterhilfe zugesetzt. Man erhielt 950 1 Filtrat, die durch eine mit 10 1 eines stark sauren Kationenaustauscherharzes gefüllte Säule geführt wurden. Die Säule wurde dann mit 20 I entionisiertem Wasser gewaschen, und die adsorbierte Anlivirussubstanz wurde mit 20 I 3° „igem wäßrigem Ammoniak vollständig eluiert. Das Eluat wurde im Vakuum auf

4 1 eingeengt und tropfenweise unter Rühren in 50 1 Methanol gegossen, wobei sich ein brauner Niederschlag bildete. Der Niederschlag wurde abgesaugt, mit 1 1 Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei 820 g eines braunen hygroskopischen Pulvers erhalten wurden. Der prophylaktische Wert dieses Pulvers gegen Tabakmosaikvirus betrug 72°'„ bei einer Konzentration von 1 mg ml. 820 g des Pulvers wurden in Wasser gelöst und durch eine mit

5 I eines *tark sauren Kationenaustauscherharzes gefüllte Säule geführt.

Die Säule wurde mit 201 entionisiertem Wasser gewaschen und mit 101 3° „igcm Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde im Vakuum auf 1,51 eingedampft, filtriert und lyophylisiert. Man erhielt 600 g eines bräunlichen hygroskopischen Pulvers mit einem prophylaktischen Wert gegen Tabakmosaikvirus von 98° Ό bei einer Konzentration von 1 mg'm!.

Beispiel 9

100 g des nach Beispiel 8 erhaltenen PuKers wurden in Methanol mit 20° „Wassergehalt gelöst. Die Lösung wurde filtriert, um unlösliches Material abzutrennen, und dann durch eine mit 3 kg Aluminiumoxyd, dessen pH-Wert auf 4.5 eingestellt war. gefüllte Säule geführt. Die Säule wurde mit 31 Methanol mit 20° ₀ Wassergehalt gewaschen und mit Wasser entwickelt und eluiert. Fraktionen von je 100 ml wurden gesammelt, und die Fraktionen 36 bis 52. insgesamt 1.61. wurden vereinigt, im Vakuum auf 150 ml eingeengt und lyophylisiert. Man erhielt 5.1 g eines gelblichen hygroskopischen Pulvers Eine wäßrige Lösung dieses Pulvers mit einer Konzentration von 100 μg ml hatte einen prophylaktischen Wen von 98⁰Z₀ gegenüber Tabakmosaikvirus.

Beispiel 10

5 g des nach Beispiel 9 erhaltenen Pulvers wurden in 20 ml Wasser gelöst und durch eine mit einem Filtermittel in Gelform bis zu einer Höhe von 1,5 m gefüllten Säule geführt. Die Eluierung erfolgte mit Wasser, und es wurden Fraktionen von je 10 ml gesammelt. Die Fraktionen 78 bis 83, insgesamt 50 ml, wurden vereinigt und lyophylisiert. wobei 1,5 g weißes pulvriges 84-B-3 erhalten wurden. Eine Lösung von 10mcg/ml dieser Substanz hatten einen prophylaktischen Wert von 96% und eine Lösung mit einer Konzentration von 1 |i.g/ml einen prophylaktischen Wert von 92% gegenüber Tabakmosaikvirus.

B e i s ρ i e I 11

Der pH-Wert von 1100 1 gemäß Beispiel 3 erhaltener Fermentationsbrühe wurde auf 6,5 eingestellt. 50 kg

ίο herkömmliche Filterhilfe wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde filtriert. Dem Fillrat wurden 30 kg Aktivkohle und Id kg der Filterhilfe zugesetzt, und das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt. Die Aktivkohle wurde dreimal mit je 100 1 eines Gemisches von Methanol und konzentriertem wäßrigem Ammoniak (9:1) eluiert, so daß 300 I Eluat erhalten wurden. Das Eluat wurde im Vakuum auf 41 eingedampft, filtrieit und lyophylisiert. Man erhielt 1,0 kg bräunliches hygroskopisches Pulver. Eine wäßrige Lösung dieses Pulvers mit einer Konzentration von 1 mg/ml hatte einen prophylaktischen Wert von 60% gegenüber Tabakmosaikvirus.

Beispiel 12

100 g eines gemäß Beispiel 11 erhaltenen Pulvers wurden in Methanol mit 20% Wassergehalt gelöst und filtriert, um unlösliches Material abzutrennen. Die Lösung wurde durch eine mit 4 kg Aluminiumoxyd, dessen pH-Wert auf 4,5 eingestellt war. gefüllte Säule geführt. Die Säule wurde mit 101 Methanol mit 20% Wassergehalt gewaschen und mit Wasser entwickelt und eluiert. Fraktionen von je 100 ml wurden gesammelt, und die Fraktionen Nr. 39 bis 51, (insgesamt 1,2 1) wurden vereinigt und im Vakuum auf 200 ml eingeengt und lyophylisiert. Man erhielt 8,1 g eines gelblichen hygroskopischen Pulvers. Eine wäßrige Lösung dieses Pulvers mit einer Konzentration von 100μg/ml hatte einen prophylaktischen Wert von 95" „ gegenüber Tabakmosaikvirus.

B e ι s ρ i e 1 13

8,0 g des im Beispiel 11 erhaltenen Pulvers wurden in 5 ml Wasser gelöst und durch eine mit 500 g Silicagel gefüllte Säule geführt. Die Säule wurde mit

einem Gemisch von Äthanol und 0.5n-wäßrigem Ammoniak (2:1) entwickelt und eluiert. Fraktionen von je 10 ml wurden gesammelt, und die Fraktionen Nr. 39 bis 47 wurden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Man erhielt 4,5 g blaßgelbes hygroskopisches Pulver. Eine wäßrige Lösung diese Pulvers mit einer Konzentration von 10μg'ml hattt einen prophylaktischen Wert von 94° „.

Beispiel 14

4 g Pulver von Beispiel 13 wurden in 15 ml Wasse gelöst und durch eine mit 500 g Filtermittel in GeIfom bis zu einer Höhe von 1,5 m gefüllten Säule geführt Entwicklung und Eluierung erfolgten mit Wasser und es wurden Fraktionen von je 10 ml gesammeil Die Fraktionen Nr. 86 bis 104, insgesamt 180 ml wurden vereinigt und lyophylisiert, wobei 0,92 eines weißen Pulvers erhalten wurden. Eine wäßrig Lösung dieses Pulvers mit einer Konzentration vo

6s 10 μg/ml hatte einen prophylaktischen Wert von 97 ·, und eine wäßrige Lösung mit einer Konzentratio von 1 μξ!τη\ hatte einen prophylaktischen Wert vo 93% gegenüber Tabakmosaikvirus.

Beispiel 15

11001 einer gemäß Beispiel 3 erhaltenen Fermentationsbrühe wurden auf einen pH-Wert vun 6,5 eingestellt. 50 kg herkömmliche Filterhilfe wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde filtriert. Man erhielt 10001 Filtrat, die mit 10 kg der gleichen Filterhilfe und 30 kg Aktivkohle versetzt und 30 Minuten gerührt wurden. Die Aktivkohle wurde dreimal mit je 1001 eines Gemisches von Methanol und konzentriertem wäßrigem Ammoniak (9:1) eluiert, so daß 3001 Eluat erhalten wurden. Das Eluat wurde im Vakuum auf 41 eingeengt, filtriert und lyophylisiert. Man erhielt 1,0 kg bräunliches hygroskopisches Pulver. Eine wäßrige Lösung dieses Pulvers mit einer Konzentration von 1 mg/ml hatte einen prophylaktischen Wert von 60°'_o gegen Tabakrnosaikviruv

Beispiel 16

50Og des im Beispiel 15 erhaltenen Pulvers wurden in 1 1 Wasser gelöst, und die Lösung wurde durch eine mit 51 eines stark sauren lonenaustauscherharzes gefüllten Säule geführt. Die Kolonne wurde mit 201 entionisiertem Wasser gewaschen und mit 15 1 0,l°/₀igem wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde im Vakuum auf 500 ml eingeengt und lyophylisiert. Man erhielt 190 g bräunliches hygroskopisches Pulver. Eine wäßrige Lösung dieses Pulvers mit einer Konzentration von 1 mg/ml hatte einen prophylaktischen Wert von 82°/₀ gegen Tabakmosaikvirus.

Beispiel 17

100 g des im Beispiel 16 erhaltenen Pulvers wurden in Methanol mit 20°/₀ Wassergehalt gelöst und filtriert, um unlösliches Material abzutrennen. Die Lösung wurde durch eine mit 3,5 kg Aluminiumoxyd, das auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt war, gefüllte Säule geführt. Die Säule wurde mit 4 1 Methanol mit 20°/₀ Wassergehalt gewaschen und mit Wasser eluiert, wobei Fraktionen von je 100 ml gesammelt wurden. Die Fraktionen Nr. 40 bis 50, insgesamt 1 1, wurden vereinigt, im Vakuum auf 200 ml eingeengt und lyophylisiert, wobei 4,3 g eines blaßgelben hygroskopischen Pulvers ei halten wurden. Eine wäßrige Lösung dieses Pulvers mit einer Konzentration von IOjj.gml hatte einen prophylaktischen Wert von 9O⁰Z₀.

Beispiel 18

4,0 g des im Beispiel 17 erhaltenen Pulvers wurden in 5 ml gelöst, und die Lösung wurde durch eine mit 500 g Filtermittel in Gelform bis zu einer Höhe von

ίο 1,5 m gefüllten Säule geführt. Die Säule wurde mit Wasser entwickelt und eluiert, und es wurden Fraktionen von je 10 ml gesammelt. Die Fraktionen Nr. 75 bis 90, insgesamt 190 ml, wurden vereinigt und lyophylisiert, wobei 1,3 g eines weißen Pulvers er-

halten wurden. Eine wäßrige Lösung dieses Pulvers mit einer Konzentration von lOjig/ml hatte einen prophylaktischen Wert von 96°'_O gegen Tabakmosaikvirus und eine Lösung mit einer Konzentration von 1 μ§/πιΙ einen prophylaktischen Wert von 91ⁿ ₀

gegenüber Tabakmosaikvirus.

In der folgenden Tabelle sind die prophylaktischen Werte der gemäß den Beispielen 10, 14 und 18 erhaltenen Antivirussubstanz gegenüber Tabakmosaikvirus demjenigen von Cytovirin gegenübergestellt:

Antivirussubstanz

Prophylaktischer Wert bei Tabak mosaikvims

1 1 2

92 93 91 26

Beispiel 10 Beispiel 14 Beispiel 18

Cytovirin*)

*) Vgl. Index of Antibiotics from Actinomycctcs University of Tokyo Press and University Park Press, State College Pennsylvania, 1967, S. 240.

Während also mit der Antivirussubstanz gemäß dei

40 Erfindung bei einer Konzentration von 1 μg/ml eir

prophylaktischer Wert von 91 bis 93°/₀ erzielt wurde

wurde mit Cytovirin in der doppelten Konzentratioi

ein prophylaktischer Wert von nur 26°/₀ erzielt.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. Insbesondere durch die beschriebene prophylak-

   Patentanspruch: tische Wirkung gegen für Pflanzenerkrankungen verantwortliche Viren zeichnet sich die neue Antivirus-Verfahren zur Herstellung einer Antivirussub- substanz gegenüber bekannten aus. ,-^,-..,,.,
   stanz, die 5 Der Stamm Streptomyces rameus AJCC 21273,

   der für die Erzeugung der neuen Antivirussubstanz

   a) eineZer_Setzungstemperaturvonl61bisl64 C, _{venvendet werd}en kann, hat die folgenden Eigen-

   b) ein Molekulargewicht von etwa 300 bis 400, schäften*

   c) einen Rf-Wert von 0,36 bis 0,48 (Silikagel- ' , , . , _c. „,,,_*„_
   Dünnschichtchromatographie. Entwicklung _xo »· Morphologische Eigenschaften
   mitButanol-Pyridin-Essigsäure-Wasstr Auf Hefeextrakt'Malzagar bei 28°C erfolgt das 6:4:1:3) Wachstum in der Form eines Myzels mit langen

   hat, dadurch gekennzeichnet, daß gebogenen oder wellig verzweigten Hyphen mit einer

   man Streptomyces rameus ATCC 21273 oder Breite von etwa 0,9 bis 1,5 μ. Das Myzel erzeugt ein

   Streptomyces S. P. ATCC 21274 in einem Medium, 15 in Büscheln angeordnetes Luftmyzel. Der Extrempunkt

   das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, -des Luftmyzels ist spiralig oder hakenförmig. Die

   eine Srickstoffquelle und ein anorganisches Material Sporen sind am Exirempunkt des Luftmyzels in Ketten

   enthält, kultiviert und die gebildete Antivirus- angeordnet. Unter dem Elektronenmikroskop zeigen

   substanz aus dem Medium auf übliche Weise die Sporen glatte Oberfläche und haben die Form

   gewinnt. ao von Ellipsoiden mit Durchmessern von 1,3 bis 1,6 2,6

   bis 2,7 μ.