CH639978A5

CH639978A5 - Neue antibiotika und verfahren zu ihrer herstellung.

Info

Publication number: CH639978A5
Application number: CH421378A
Authority: CH
Inventors: Masaru Otani; Shuzo Satoi; Masaki Takada
Original assignee: Toyo Jozo Kk
Priority date: 1977-04-19
Filing date: 1978-04-19
Publication date: 1983-12-15
Also published as: DK147710B; IT7822455A0; SE7804389L; FR2387993B1; BE866095A; GB1585997A; DK147710C; DE2817669C2; ATA274778A; DE2817669A1; IT1094101B; DK167778A; HU179353B; NL7804188A; AT357262B; US4212858A; CA1110561A; FR2387993A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Antibiotika, Aculeacin-Aa, -Ay, -Da und -Dy und auf ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Es wurde gefunden, dass ein Pilz, welcher zur Gattung Aspergillus gehört, nämlich der Stamm No. M 4845, neue Antibiotika erzeugt, welche wirksam sind gegen Hefen, wie z.B. Candida albican, und Pilze, wie Dermatophytes und pflanzenpathogene Pilze in niederer Konzentration, und diese Antibiotika wurden als Aculeacin-Aa, -Ay, -Da und -Dy bezeichnet.

Der genannte Aspergillus-Stamm M 4845 weist folgende taxo-nomische Eigenschaften auf:

A) Macroskopische Beobachtung:

1) Czapeck-Agar-Medium:

Wachstum: rasch,Durchmesser 55 bis 65 mm bei 26° Cin 10 Tagen.

Oberfläche der Kolonie: eben und dünn; weiss zu Beginn der Kultur; Rehfarben (hue 4ig) abhängig vom Grad der Bildung von Conidien. Bildung von Conidien ist reichlich.

Umgebung der Kolonie: schwach arachnoid.

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Rückseite der Kolonie: farblos bis. schwach gelb (hue Ica). Keine Bildung von diffundierbarem Pigment und Exudat. Wachstum bei 37° C: langsam; 14 bis 17 mm in 10 Tagen.

2) Malzextrakt-Agar-Medium:

Wachstum: rasch, Durchmesser 60 bis 70 mm bei 26° C in 10 Tagen.

Oberfläche der Kolonie: eben und dünn, weiss zu Beginn der Kultur; biberfarbig (hue 4 li) abhängig vom Grad der Bildung von Conidien.

Conidien: Bildung in grosser Menge.

Umgebung der Kolonie: glatt oder fast glatt.

Rückseite der Kolonie: schwach gelb (hue 1 Vi ca.) keine Bildung von diffundierbarem Pigment und Exudat.

Wachstum bei 37° C: langsam; 10 bis 12 mm in 10 Tagen.

3) Kartoffel-Glucose-Agar-Medium:

Wachstumgeschwindigkeit und -bedingung: ähnlich jenen auf Malzextrakt-Agrar-Medium, mit Ausnahme einer klar-arachoi-den Umgebung der Kolonie.

Die Farbangaben basieren auf den Angaben in «Color Harmo-ny Manual», Ausgabe 1958, herausgegeben bei Container Corporation of America.

B) Mikroskopische Beobachtung:

Der Conidien-Kopf ist im Frühstadium kugelförmig, später radial segmentiert in verschiedenen Säulen. Die Länge der Conidiophoren beträgt 400 bis 1500 p.. Die Breite beträgt 8 bis 13 |x, farblos hellgelb-braun, und die Wand ist glatt und etwas dick, die Dicke beträgt etwa 1,5 bis 2,0 [x. Die Blase ist hellbraun und kugelförmig oder nahezu kugelförmig; Durchmesser 30 bis 75 fi,, hauptsächlich 40 bis 60 (x. Das Sterigma erscheint in einer Reihe mit einer Grösse von 6 bis 8 x3 bis 4 |x nahe aneinander. Das Conidium ist im allgemeinen kugelförmig oder elliptisch mit verschiedenen Formen und die Grösse beträgt 3,5 bis 5,0 x 3,0 bis 3,5 (x, hellgelblich-braun gefärbt und die Wand ist rauh.

C) Wachstumsbedingungen:

Wachstumstemperatur: 13 bis 40° C.

Wachstums- pH: 2 bis 9.

Optimale Wachstumstemperatur und pH: 29 bis 31° C, pH 3 bis 5.

Gemäss der obenstehenden taxonomischen Untersuchungen gehört dieser Stamm zur Gruppe Aspergillus niger (siehe Japan. J. Agrical. Chem., 27,806 bis 809 (1953) und «The Genus Aspergillus» 328bis331 (1965)), welche schwachbraune Conidien aufweisen. Diese Gruppe wird ferner in zwei Gruppen unterteilt gemäss den einreihigen oder zweireihigen Sterigma. Dieser Stamm gehört zur einreihigen Gruppe. Gegenwärtig sind als Pilze mit einreihigem Sterigma Aspergillus japonicus und Aspergillus aculeatus bekannt, und da bei Aspergillus japonicus das Conidium globos oder subglobos mit 3 bis 3,5 jx ist und die Blase 15 bis 45 (x, insbesondere20 bis 35 u aufweist, und bei Aspergillus aculeatus das Conidium subglobos oder elliptisch mit 4,5 bis 5 x3 bis 3,5 jx ist und die Blase 35 bis 100 [x, insbesondere 60 bis 80 [x aufweist, gleicht dieser Stamm daher Aspergillus aculeatus in seinerTaxonomie. Der Stamm Aspergillus aculeatus ATCC 1034, welcher von der American Type Culture Collection erhalten wurde, und der vorliegende Stamm gleichen sich beim Vergleich, so dass der vorliegende Stamm als Aspergillus ascu-leatus M 4845 bezeichnet wurde. Dieser Stamm wurde am 13. April 1978 im Institute for Industriai Fermentation and Technology, Agency of Industriai Science and Technology, Japan, hinterlegt und erhielt die No. FERM-P No. 4023. Der Stamm wurde ferner in United States Department of Agriculture, Agri-cultural Research Service, Northern Utilization Research and Development Division, hinterlegt und unter der No. NRRL 11270 dessen ständiger Sammlung angegliedert.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Beschaffung der neuen Antibiotika Aculeacin-Aa, -Ay, -Da und -Dy.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Beschaffung einer Gruppe von Aculeacinen, welche wirksam sind zur Bekämpfung pathogener Pilze und Hefen.

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Die vorliegende Erfindung wird im folgenden näher beschrieben unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen, in welchen

Fig. 1 das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Aculeacin-Aa in Methanol,

Fig. 2 das Infrarot-Absorptionsspektrum von Aculeacin-Aa, Fig. 3 die Aminosäureanalyse von Aculeacin-Aa,

Fig. 4 das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Aculeacin-Ay in Methanol,

Fig. 5 das Infrarot-Absorptionsspektrum von Aculeacin-Ay, Fig. 6 die Aminosäureanalyse von Aculeacin-Ay,

Fig. 7 das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Aculeacin-Dy in Methanol,

Fig. 8 das Infrarot-Absorptionsspektrum von Aculeacin-Dy, Fig. 9 die Aminosäureanalyse von Aculeacin-Dy,

Fig. 10 das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Aculeacin-Dy in Methanol,

Fig. 11 das Infrarot-Absorptionsspektrum von Aculeacin-Da, und

Fig. 12 die Aminosäureanalyse von Aculeacin-Da darstellt. Die Antibiotika der Aculeacin-Gruppe bestehen aus Aculeacin-Aa, -Ay, -Da und Dy, welche erzeugt werden durch Züchtung von Aspergillus aculeatus M 4845, NRRL 11270, weisen eine starke fungizide Wirksamkeit auf, besitzen eine Spitze im Ultraviolett-Absorptionsspektrum bei 278 nm und enthalten Threonin als Aminosäurekomponente. Da die Aculeacin-Gruppe Peptid-Antibiotika sind, werden diese Gruppen von Antibiotika im folgenden als Aculeacine bezeichnet.

Gemäss der vorliegenden Erfindung werden Aculeacine hergestellt durch Züchten eines Stammes von Aspergillus, welcher Aculeacine erzeugt, insbesondere Aspergillus aculeatus M 4945, NRRL 11270, in einem C- und N-haltigen Nährmedium. Die Züchtung des Mikroorganismus kann auf verschiedene Weise erfolgen, z. B. als flüssige Kultur oder feste Kultur. Für eine industrielle Erzeugung wird eine submerse belüftete Kultur, beimpft mit einer 1 bis 2Tage alten Kulturbrühe oder Sporensuspension von Aspergillus aculeatus M 4845, NRRL 11270, bevorzugt.

Nährmedien, welche für die Erzeugung von Aculeacinen nützlich sind, können eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, wie Glukose, Saccharose, Lactose, Maltose, Stärke, Dextran, Molassen und Glycerin; eine assimilierbare Quelle für organischen und anorganischen Stickstoff, wie Maiseinweichflüssigkeit, Sojabohnenpulver, Baumwollsamenöl, Weizengluten, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Hefe, Caseinhydrolysat, Pepton und Ammoniumsalzoder Nitrat enthalten, und die Medien enthalten ferner mit Vorteil Salze, wie Phosphat, Magnesium-, Calcium-, Kalium-, Natrium-, Zink-, Ferri- oder Mangansalze.

Die Kulturtemperatur zur Erzeugung von Aculeacinen kann im Bereich der Temperatur gewählt werden, bei welcher der Mikroorganismus wachsen und Aculeacine erzeugen kann und liegt vorzugsweise bei 25 bis 28° C.

Die Kulturzeit beträgt im allgemeinen 70 bis 90 Stunden, und wenn die Kulturbrühe die maximale Stärke bezüglich der Anti-biotika-Erzeugung aufweist, sollte die Züchtung beendet werden.

In der derart erhaltenen Kulturbrühe sind die Aculeacine im Mycélium und teilweise ausserhalb des Mycéliums angereichert.

Die Aculeacine können durch Schalenversuche oder Papierscheibenversuche unter Verwendung von Candida albicans oder Trichophyton asteriodes als Testorganismen geprüft werden.

Die Aculeacine können vorzugsweise und wirksam aus dem Mycélium isoliert werden.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform wird die ganze Brühe filtriert, um das Mycélium zu gewinnen, welches die Aculeacine enthält, wobei ein Trommelfilter, eine Filterpresse oder eine Zentrifuge verwendet werden kann. Das derart erhaltene nasse Mycélium wird mit einem mit Wasser mischbaren

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organischen Lösungsmittel, wie Alkohol oder Aceton, extrahiert, das Lösungsmittel sodann aus dem Extrakt abdestilliert, der Rückstand mit Wasser verdünnt, diese Lösung mit n-Butanol oder Aethylacetat extrahiert und der Extrakt mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck konzentriert, wobei ein 5 öliges Material erhalten wird. Das ölige Material kann durch Absorption oder Chromatographie über aktives Aluminiumoxid, Silicagel oder dergleichen gereinigt werden, um die derart erhaltene aktive Fraktion wird konzentriert, um ein Pulver zu ergeben, welches einen einzigen Fleck bei der Dünnschichtchro- 10 matographie mit verschiedenen Entwickler-Lösungsmittelsy Sternen ergibt

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Aculeacine sind die folgenden:

15

(1) Elementaranalyse:

c%

H%

N%

Aculeacin-Aa Aculeacin-Ay Aculeacin-Da Aculeacin-Dy

56,48 54,70 55,96 57,55

8,60 8,23 8,44 8,32

9,23 10,51 9,96 8,94

Schwefel und Halogen wurden nicht nachgewiesen.

(2) Molekulargewicht

Rast-Methode

Aminosäureanalyse *

Gelfiltrationsmethode ****

Aculeacin-Aa Aculeacin-Ay Aculeacin-Da Aculeacin-Dy

1015 1021 1243 1265

(860)n** (860)n** (555)n*** (555)n***

800±110 800±110 850±100 850±100

berechnet aus der festgestellten Menge an Threonin. 35 3,0 n Mol Threonin wurden aus dem Hydrolysat von 2,6 mg Aculeacin-Aa oder -Ay bestimmt.

4,8 |x Mol Threonin wurden im Hydrolysat von 2,6 mg Aculeacin-Da oder -Dy bestimmt.

Geschätzt anhand der Eluierungszeit im Vergleich mit Antibiotika von bekanntem Molekulargewicht unter Verwendung von «Sephadex LH-20» (Pharmacia Fine Chemi- 40 cals Co., Schweden)

Farbreaktion

Aculeacine

+ : positiv — : negativ

Aa

Ay

Da

Biuret Reaktion

+

Xanthoprotein-Reaktion

+

T ollens-Reaktion

±

+

±

Ninhydrin-Reaktion

-

Bennedict-Reaktion

-

Sakaguchi-Reaktion

-

Ehlrich-(Ehrlich)-Reaktion

-

Ferrichlorid-Reaktion

-

Dragendorff-Reaktion

-

2,4-Dinitrophenylhydrazin-

Reaktion

—

-

—

(6) Löslichkeit:

Löslich in niederen Alkoholen.

Schwach-löslich in Aethylacetat.

Praktisch unlöslich in Aceton, Chloroform, n-Hexan, Petrolät-her und Wasser.

(7) Aculeacine können nicht titriert werden infolge der Zersetzung bei alkalischem pH, und infolge ihrer schlechten Löslichkeit sind Aculeacine unbeweglich bei der Elektrophorese. Die Aculeacine konnten aus einer Butanollösung nicht in Wasser bei pH 2 bis 9 übertragen werden. Dies kann als Hinweis der neutralen Natur der Aculeacine betrachtet werden.

(8) Farbe: weisses kristallines Pulver.

(9) Stabilität: stabil bei 37° C während 20 Stunden unter sauren und neutralen Bedingungen.

(10) Ultraviolett-Absorptionsspektrum

Fig. 1: Aculeacin-Aa in Methanol (32,4 y/ml). Fig. 4: Aculeacin-Ay in Methanol (32,4 y/ml). Fig. 7: Aculeacin-Dy in Methanol (40 y/ml). Fig. 10: Aculeacin-Da in Methanol (40 y/ml).

Wie in den Figuren ersichtlich ist, weisen Aculeacin-Aa und -Ay maximale Spitzen bei 278 nm und Schultern bei 226 und 283 nm auf und Aculeacin-Da und -Dy weisen die maximale Spitze bei 278 nm und Schultern bei 226 und 284nm auf.

Eum von jeder Verbindung ist der folgenden Tabelle zu entnehmen:

(3) Schmelzpunkt:

Aculeacin-Aa

174 bis 177° C

Aculeacin-Ay

172 bis 175° C

Aculeacin-Da

159 bis 162° C

Aculeacin-Dy

159 bis 162° C

(4.) Spezifische Drehung [a]o (c=0,25 Methanol)

Aculeacin-Aa

-46,8°

Aculeacin-Ay

-47,4°

Aculeacin-Da

-45,7°

Aculeacin-Dy

-46,7°

(5) Farbreaktion:

Zusammengestellt in der folgenden Tabelle:

Farbreaktion

Aculeacine

+: positiv negativ

Aa Ay Da Dy

Pauli-Reaktion + + + +

Folin-Reaktion + + + +

HI04-Benzidin-Reaktion + + + +

KMn04-EntfärbungsReakton + + + +

Molisch-Reaktion ± ± ± ±

in Methanol

226 nm

278 nm

283 nm

284 nm

(Schulter)

(Spitze)

(Schulter)

(Spitze)

Aa

146

16,0

13,5

—

Ay

145

15,5

13

—

Da

138

17,5

-

14,7

Dy

137

17,0

-

14,2

(11) Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr-Tabelle):

Aculeacine Absorptiosbanden (cm ')

Fig. 2: Aculeacin-Aa 3350, 2910, 2840, 1510 1435

Fig. 5: Aculeacin-Ay Fig. 8: Aculeacin-Dy Fig. 11: Aculeacin-Da

(12) Rf-Wert:

Träger: Silicagelblatt (Produkt von Eastman Kodak Co., Eastman Chromagram sheet No. 6060).

Lösungsmittel:

A: Chloroform-Methanol (10 : 3)

B: Aethylacetat-Methanol-Wasser (20 : 4 : 1).

C: Aethylacetat-n-Butanol (3 : 1) gesättigt mit Wasser.

Entwickler: Jod

Biologische Prüfung unter Verwendung von Candida albicans.

Lösungsmittelsystem

A

B

C

Aculeacin-Aa:

0,47

0,28

0,37

Aculeacin-Ay:

0,47

0,28

0,37

Aculeacin-Da:

0,67

0,35

0,42

Aculeacin-Dy:

0,67

0,35

0,42

(13) Retentionszeit bei flüssiger Chromatographie:

Retentionszeit (Minuten)

Aculeacin-Aa 7,9

Aculeacin-Ay 12,3

Aculeacin-Da 9,2

Aculeacin-Dy 14,1

5 mg/ml Aculeacine gelöst in 8 (i Liter Methanol werden auf eine Säule von 15x500 mm gegeben; Träger Polystyrolharz; Entwickler : 85%iges wässeriges Methanol, welches 0,01% Triäthylamin enthält; Säulentemperatur : 55°; Typus: Hitachi 634, (Produkt der Hitachi Corporation, Japan)

(Hydrolyse:

Hydrolyse

Aculeacin-Aa:

Myristinsäure

Aculeacin-Ay:

Palmitinsäure

Aculeacin-Da:

Myristinsäure

Aculeacin-Dy:

Palmitinsäure

Die Aculeacine werden durch 6 n -HCl bei 110° C hydrolysiert und mit Aether extrahiert. Die Aetherschicht wurde auf ein Gaschromatogramm gegeben und die freie Fettsäure wurde qualitativ analysiert.

(15) Aminosäurezusammensetzung:

Die Aculeacine werden mit 6N HCl bei 110° C während 20 Stunden hydrolysiert und die Ninhydrin-positiven Komponenten in einem automatischen Aminosäureanalysator (Japan Electron Optical Corp., Typus JLC-5 AH-Analyzer) analysiert). Die Resultate sindinFig. 3 (Aculeacin-Aa), Fig. 6 (Aculeacin-Ay), Fig. 9 (Aculeacin-Dy) und Fig. 12 (Aculeacin-Da) ersichtlich, in welchen Threonin und verschiedene unbekannte Ninhydrin-positive Komponenten gefunden werden.

Die Aculeacine sind Peptid-Antibiotika, welche in Wasser praktisch unlöslich sind und die oben angeführten physikalischchemischen Eigenschaften aufweisen.

Unter dem bisher bekannten Antibiotika, welche Ultraviolett-Absorptionsmaxima bei 278 nm in Methanol aufweisen und Aculeacin-Aa, -Ay, -Da beziehungsweise -Dy gleichen, befinden sich Myroridin (Japanische Offenlegungsschrift 45-12276), Athleastatin (Japanische Offenlegungsschrift 41-12668), Monilin (Takeda Institute Annual Report, 14,8 bis 10 (1955)), Oryzamy-cin (Japanische Offenlegungsschrift 38-2800), Saramycetin (An-timicrobial Agents and Chemotherapy, 1961,436 bis 666), Unamycin (J. Antibiotics, Ser. A, 13,114 bis 12€ (I960)), Vengicid (Britisches PatentNo. 764.198), Aculeacin-A und Aculeacin-D (US-PatentNo. 3.978.210) und Echinocandin-B (Antibiotic A32204, Schweizer-PatentNo. 568.386). Die Aculeacine sind jedoch verschieden von diesen bekannten Antibiotika und zwar aus folgenden Gründen:

Myrroridin ist ein basisches, wasserlösliches Antibiotikum, welches sich von den Aculeacinen unterscheidet. Athlestatin ist ähnlich den Aculeacinen bezüglich der physikalisch-chemischen Eigenschaften und der biologischen Wirksamkeit, jedoch beträgt die spezifische Drehung von Athlestatin [a] d= —64° C=0,5,

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Methanol) und die Ultraviolett-Absorptionsmaxima von Athlestatin liegen bei 278 und 225 nm und seine Elementaranalyse lautet: C : 55.25 %, H : 7,50 % undN : 9,41 %, also verschieden von den Aculeacinen. Monilin ist eine basische nucleaoside Substanz und der Stickstoff in ihrer Elementaranalyse ist höher als derjenige der Aculeacine. Oryzamycin ist eine saure ölige Substanz. Saramycetin ergibt Asparginsäure, Cystin, Glycin und Threonin bei der Hydrolyse und Unamycin ist eine saure Polyensubstanz. Vengicid ist ähnlich Monilin, eine nucleodide Substanz. Aculeacin-D und Echinocandin-B sind ähnlich dem Aculeacin* Aa und -Ay, und Aculeacin-Da und -Dy bezüglich ihrer ■ physikalisch chemischen und biologischen Eigenschaften, doch unterscheiden sich die Aculeacine der vorliegenden Erfindung von den bekannten Aculeacin-A, -D und Echinacandin-B in ihrer Retentionszeit bei derflüssigen Chromatographie, welche bei Aculeacin-Aa 7,9 Minuten, bei Aculeacin-Ay 12,3 Minuten beträgt und inbezug auf das Hydrolysat, in welchem Myristinsäure aus Aculeacin-Aa und -Dy, Palmitinsäure aus Aculeacin-Ay und -Dy und Linolensäure und Stearinsäure aus Echinocandin-B erhalten werden.

Aculeracin-Aa, -Ay, -Da und -Dy sind somit neue Antibiotika, welche sich von den bisher bekannten Antibiotika unterscheiden.

Die biologischen Eigenschaften der Aculeacine sind die folgenden:

80% wachstumshemmende Konzentration (y ml)

Aculeacin-Aa -Ay -Da -Dy

Trichophyton asteroides

0,004

0.004

0,001

0,002

Trichophyton rubrum

0,006

0,002

0,003

Microsporum gypseum

0,008

0,002

0,004

Fusarium oxysporum f. lini

2,0

0,1

1,0

Diaporthe phaseolorum

0,01

0,0025

0,005

Ascochyta soyaecola

0,08

0,02

0,04

Sclerotium bataticola

0,08

0,02

Glomerella cingulata

0,06

0,03

0,01

0,03

Helminthosporium oryzae

0,008

0,002

0,004

Akute Toxizität bei Mäusen:

LD5o von Aculeacin-Injektion, hergestellt unter Verwendung von Natriumdeoxycholat-Zusätzen ist wie folgt:

Verabreichung

LD5O

(mg/kg)

Aa

Ay

Da

Dy i.V.

350

i.m.

600

1000

Beispiel 1:

100 ml eines wässerigen Mediums,bestehend aus 2% Glucose, 1% Polypeton, 1% Maiseinweichflüssigkeit, 0,2% KHMPO^tund 0,l%MgS04 • 7H20 wurden in einen Erlenmeyer-Kolbenein-gefüllt, pH 6,5, und während 15 Minuten bei 120° C sterilisiert. Aspergillus aculeatus M 4845, NRRL 11270, wird in dieses Medium geimpft und während 48 Stunden einer Schüttelkultur bei 26° C unterzogen. Die Kulturbrühe wurde sodann aseptisch in 15 Liter wässeriges Medium (pH 6,5) bestehend aus 1,5% Saccharose, 1,4% Dextrin, 2% Polypepton, 0,45% Maiseinweichflüssigkeit, 0,2% KH2P04,0,1% MgS04und einem Schaumverhütungsmittel (Markenname «BC-51Y», ein Produkt der Nippon Yushi Co.) in einem 30 Liter fassendes Fermentat-ionsgefäss als Impfstoff eingeführt und während 96 Stunden bei 26° C unter Belüftung mit 30 Liter/Minute und Rühren mit 250 Touren pro Minute fermentiert, um etwa 15 Liter fermentierter Brühezu erhalten. Die Brühe wies Aculeacin-Wirksamkeit im Filtrat und im Mycélium auf.

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Beispiel 2:

10 Liter der in Beispiel 1 erhaltenen Kulturbrühe werden unter Vakuum filtriert, um 1 kg nasses Mycélium zu ergeben. Zu dem nassen Mycélium wurden 5 Liter Methanol zugesetzt, unter Rühren während 2 Stunden extrahiert und die Methanollösung durch Vakuumfiltration abgetrennt. Das restliche Mycélium wurde wiederum mit 5 Litern Methanol extrahiert. Beide Extrakte wurden vereint und das Methanol unter vermindertem Druck abdestilliert, um 2 Liter Konzentrat zu erhalten. Zu diesem Konzentrat wurden 2 Liter Wasser zugesetzt und das Medium zweimal mit je 2 Litern n-Butanol extrahiert. Die n-Butanol-Schichten wurden gesammelt. Nach dem Waschen dieser n-Butanol-Schichten mit 5 Liter Wasser wurde das Butanol im Vakuum verdampft, während eine kleine Menge Wasser zugesetzt wurde, wobei ein dunkelbraun gefärbtes viskoses Konzentrat erhalten wurde. Zu diesem Konzentrat wurden 500 ml n-Hexan zugesetzt, um das gewünschte Material auszufällen, welches mit Aethylacetat gewaschen wurde und 12,5 g rohe Aculeacine ergab.

Beispiel 3:

12,5 g der in Beispiel 2 erhaltenen rohen Aculeacine, gelöst in einer kleinen Menge Methanol, wurde auf Silicagel absorbiert (25 g), Produkt von E. Merck AG.) worauf das Methanol unter vermindertem Druck abdestilliert wurde. Das derart erhaltene Silicagel wurde auf eine Säule (innerer Durchmesser 50 mm) gegeben, welche mit 600 g Silicagel gefüllt war, und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Aethylacetat-Isopropanol-Wasser (10:1,5:0,7) eluiert, wobei Fraktionen von je 45 ml gesammelt wurden.

Beispiel 4:

Die Fraktionen No. 43 bis 57, erhalten in Beispiel 3, wurden vereint und im Vakuum zur Trockene verdampft. 10 jxLiter des getrockneten Materials, gelöst in Methanol, wurden der Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie unterworfen (Typus: HITACHI 634, ein Produkt der Hitachi Corp., Säule: 5x500 mm, Träger: Polystyrol, Entwickler: 85 %iges wässeriges Methan-1 enthaltend 0,01 % Triäthylamin, Säulentemperatur: 55° C) und die Fraktion mit Retentionszeitwerten von 7,4 bis 8,4 Minuten wurden gesammelt. Die durch wiederholte Operation erhaltenen Fraktionen wurden vereint und im Vakuum getrocknet, worauf sie in einer kleinen Menge Methanol wieder aufgelöst wurden.

-Zu dieser Lösung wurde ein Lösungsmittelgemisch aus Aethyl-acetat-n-Hexan (1:1) zugesetzt. Der entstandene Niederschlag wurde gesammelt und ergab 230 mg gereinigtes Aculeacin-Aa.

5 Beispiel 5:

Bei der in Beispiel 4 durchgeführten Hochdruckflüssigkeitschromatographie wurden die Fraktionen mit einem Retentions-zeitwert von 11,4 bis 13,4 Minuten gesammelt und gleich behandelt wie die Fraktionen mit dem Retentionszeitwert von 7,4 bis io 8,4, wobei 50 mg gereinigtes Aculeacin-Ay erhalten wurden.

Beispiel 6:

Die Fraktionen No. 42 bis 42, welche in Beispiel 3 erhalten wurden, wurden vereint und im Vakuum zu einem weissen 15 Pulver (900 mg) getrocknet und anschliessend in einer kleinen Menge Methanol gelöst. Die Methanollösung wurde an Silicagel (2 g) adsorbiert, worauf das Methanol unter vermindertem Druck abdestilliert wurde.Das derart erhaltene Silicagel wurde auf eine Säule gegeben (innerer Durchmesser 25 mm), welche 20 mit Silicagel (45 g, Produkt von Tokyo Kasei Co.) gefüllt war, und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform-Methanol (10:1,5) eluiert. Die FraktionenNo. 76 bis 141 (5 gin einer Fraktion) wurden gesammelt und die vereinten Fraktionen getrocknet, um 370 mg des Materials zu erhalten, welches Aculea-25 cin-Da und -Dy enthielt.

10 [i Liter der Methanollösung dieses Materials wurden wie in Beispiel 4 beschrieben der Hochdruckflüssigkeitschromatographie unterworfen, und die Fraktionen mit einem Retentionszeitwert von 8,6 bis 9,8 Minuten wurden gesammelt. Die durch 30 wiederholte Operation erhaltenen Fraktionen wurden vereint und im Vakuum zur Trockene verdampft, anschliessend in einer kleinen Menge Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurde ein Lösungsmittelgemisch aus Aethylacetat- n-Hexan (1:1) zugesetzt. Der entstandene Niederschlag wurde gesammelt und ergab 35 115 mg gereinigtes Aculeacin-D.

Beispiel 7:

Durch Sammeln der Fraktionen mit einer Retentionszeit von 14,4 bis 16,4 Minuten in der Hochdruckflüssigkeitschromatographie in Beispiel 6 erhaltene Fraktionen wurden wie in Beispiel 6 weiterbehandelt, wobei 15 mg gereinigtes Aculeacin-Dy erhalten wurden.

M

5 Blatt Zeichnungen

Claims

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1. Fungizides antibiotisches Aculeacin, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aculeacin-Aa, Aculeacin-Ay, Aculeacin-Da und Aculeacin-Dy, welche Aculeacine im wesentlichen folgende physikalisch-chemische Eigenschaften aufweisen:

Elementaranalyse:

C%

H %o

N %o

Aculeacin-Aa

56,48

8,60

9,24

Aculeacin-Ay

54,70

8,23

10,51

Aculeacin-Da

55,96

8,44

9,96

Aculeacin-Dy

57,55

8,32

8,94

Molekulargewicht:

Rast-Methode

Aminosäure-Analyse*

Aculeacin-Aa

1015

(860)n

Aculeacin-Ay

1021

(860)n

Aculeacin-Da

1243

(555)n

Aculeacin-Dy

1265

(555)n

*berechnet aus der festgestellten Menge an Threonin.

Schmelzpunkt:

Aculeacin-Aa:

174 bis 177° C

Aculeacin-Ay:

172 bis 175° C

Aculeacin-Da:

159 bis 162° C

Aculeacin-Dy:

159 bis 162° C

Spezifische Drehung: [a]o (c-

=0,25 Methanol)

Aculeacin-Aa:

- 46,8°

Aculeacin-Ay*:

- 47,4°

Aculeacin-Da:

- 45,7°

Aculeacin-Dy:

- 46,5°

* Resultat von [ajg (c=0,18, Methanol).

Farbreaktion:

Positiv: Pauli-, Folin-, N104-Benzidin- undKMn04-Entfär-bungsreaktion.

Schwach-positiv: Molisch-, Biuret-, Xanthoprotein- und Tollens-Reaktion.

Negativ: Ninhydrin-, Bennedict-, Sakaguchi-, Ehrlich-, Ferri-chlorid-, Dragendorff- und2,4-Dinitrophnelyhydrazin-Reak-tionen.

Löslichkeit:

Löslich: in niederen Alkoholen.

Schwach-löslich: in Aethylacetat

Praktisch unlöslich: in Aceton, Chloroform, n-Hexan, Petrolät-

her und Wasser.

Natur:

Neutrale Natur, weil kein Übergang aus n-Blutanollösung in Wasser bei pH 2 bis 9 eintritt.

Farbe: weiss.

Stabilität: Stabil bei 37° C während 20 Stunden unter sauren und neutralen Bedingungen.

Nicht stabil unter alkalischen Bedingungen.

Ultraviolett-Absorptionsspektrum:

Aculeacin-Aa: wie in Fig. 1 der beiliegenden Zeichnung dargestellt.

Aculeacin-Ay: wie in Fig. 4 der beiliegenden Zeichnung dargestellt.

Aculeacin-Dy: wie in Fig. 7 der beiliegenden Zeichnung dargestellt.

Aculeacin-Da: wie in Fig. 10 der beiliegenden Zeichnung dargestellt.

Retensions-Zeit bei flüssiger Chromatographie:

Retentions-Zeit Minuten

Aculeacin-Aa

7,9

Aculeacin-Ay

12,3

Aculeacin-Da

9,2

Aculeacin-Dy

14,1

Infrarot-Absorptionsspektrum KBr-Tablette) :

Aculeacin-Aa: wie in Fig. 2 der beiliegenden Zeichnung dargestellt.

Aculeacin-Ay: wie in Fig. 5 der beiliegenden Zeichnung dargestellt.

Aculeacin-Dy: wie in Fig. 8 der beiliegenden Zeichnung dargestellt.

Aculeacin-Da: wie in Fig. 11 der beiliegenden Zeichnung dargestellt.

Freie Fettsäure im Hydrolysat:

Aculeacin-Aa: Myristinsäure Aculeacin-Ay: Palmitinsäure Aculeacin-Da: Myristinsäure Aculeacin-Dy: Palmitinsäure

2. Verbindung nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Aculeacin Aculeacin-Aa ist.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verbindung nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Aculeacin Aculeacin-Ay ist.

4. Verbindung nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Aculeacin Aculeacin-Da ist.

5. Verbindung nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Aculeacin Aculeacin-Dy ist.

6. Verfahren zur Herstellung eines fungiziden antibiotischen Aculeacins nach Patentanspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aculeacin-Aa, Aculeacin-Ay, Aculeacin-Da und Aculeacin-Dy, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorganismus der Gattung Aspergillus, welcher die Aculeacine erzeugt, in einem Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, gezüchtet wird, und die Aculeacine aus dem Kulturmedium isoliert wird.

7. Verfahren nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Aspergillus aculeatus M 4845, FERM-P 4023 ist.