DE1077380B

DE1077380B - Herstellung des Antibiotikums Lemacidin

Info

Publication number: DE1077380B
Application number: DEC17690A
Authority: DE
Inventors: Dr Ernst Gaeumann; Dr Fritz Benz
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1957-10-29
Filing date: 1958-10-20
Publication date: 1960-03-10
Also published as: US3089816A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung eines neuen wasserlöslichen, basische Eigenschaften aufweisenden Antibiotikums, das im folgenden mit Lemacidin bezeichnet wird, seiner Komponenten B1, B 2 und B 3 und ihrer Salze.

Das Antibiotikum Lemacidin entsteht bei der Kultur eines Actinomyceten der Art Streptomyces venezuelae, Stamm A 9692. Dieser Stamm wurde aus einer bei Roche, Kanton Waadt (Schweiz), gesammelten Bodenprobe isoliert und wird in den Laboratorien des Erfinders sowie in der Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, Zürich, unter dieser Bezeichnung aufbewahrt.

Streptomyces venezuelae A 9692 bildet ein rosa bis zimtbraunes Luftmycel und trägt Konidienketten, die ein typisches Merkmal der Gattung Streptomyces darstellen. Die Sporenketten sind steif, gerade oder leicht gewellt; Spiral- oder Quirlbildung konnte nie beobachtet werden. Die einzelnen Sporen sind glatt. Es wird kein auffallendes Exopigment gebildet. Peptonhaltige Medien werden schwarzbraun melanoid verfärbt. Das Wachstum ist relativ wenig temperaturabhängig, sowohl bei 18 als auch bei 40° C entwickelt sich der Pilz gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 32° C.

Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum des Stammes A 9692 auf verschiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nährmedien 1 bis 7 und 10 werden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol., 17, S. 361 (1952) hergestellt.

1. Synthetischer Agar: Wachstum dünn, schleierartig, hellgelb. Luftmycel sammetig, blaßkarmin.

2. Synthetische Lösung: Wachstum spärlich. Sediment, Flocken, hellgelb.

3. Glukose-Agar: Wachstum dünn, schleierartig, hellbraun. Luftmycel fehlt. Substrat dunkelbraun.

4. Glukose-Asparagin-Agar: Wachstum dünn,
schleierartig, hellbraun, Luftmycel sammetig, anfangs kreideweiß, später zimtbraun.

5. Calciummalat-Agar: Wachstum spärlich, punktförmig, hellgelb. Luftmycel schneeweiß.

6. Gelatinestich (18° C): Wachstum oberflächlich, schleierartig, hellbraun. Substrat dunkelbraun. Verflüssigung nach 14 Tagen 1,5 cm.

7. Stärkeplatte: Wachstum dünn, schleierartig, hellgelb. Luftmycel anfangs schneeweiß, später blaßkarmin. Hydrolyse nach 10 Tagen 0,9 bis 1,2 cm.

8. Kartoffeln: Wachstum sehr üppig, anfangs schleierartig und hellgelb, später runzelig und hellbraun. Luftmycel zimtbraun. Substrat dunkelbraun.

9. Karotten: Wachstum sehr spärlich, punktförmig, hellgelb. Luftmycel fehlt.

10. Lackmusmilch: Wachstum gut, Pellikula hellgelb.

Anmelder: CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)

Vertreter: Dipl.-Ing. E. Splanemann, Patentanwalt, Hamburg 36, Neuer Wall 10

Beanspruchte Priorität: Schweiz vom 29. Oktober 1957 und 12. August 1958

Dr. Ernst Gäumann, Zürich,

und Dr. Fritz Benz_r Binningen, Basell. (Schweiz), sind als Erfinder genannt worden

Substrat blau. Peptonisierung langsam. Koagulation gut.

Die morphologischen und physiologischen Merkmale des Stammes A 9692 sind diejenigen der Art Streptomyces venezuelae Ehrlich et al. Es ist bekannt, daß Streptomyces venezuelae ein Antibiotikum, nämlich das Chloromycetin, produziert (J. Ehrlich, Q. R. Barth, R. M. Smith, D. A. Joslyn und P. R. Burkholder, Science, 106, S. 417 [1947]). Dieses unterscheidet sich vom neuen Antibiotikum Lemacidin schon dadurch, daß es, im Gegensatz zu diesem, mittels organischen Lösungsmitteln aus dem Kulturfiltrat extrahiert werden kann und überdies keine basischen Eigenschaften besitzt.

Die vorliegende Erfindung ist, was die Herstellung des Antibiotikums Lemacidin anbelangt, nicht auf die Verwendung des Streptomyces venezuelae A 9692 oder anderer der Beschreibung entsprechender Stämme beschränkt, sondern betrifft auch die Verwendung von Varianten dieser Organismen, wie sie z.B. durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoffsenfölen gewonnen werden.

Zur Erzeugung des Antibiotikums Lemacidin wird ein die Eigenschaften von Streptomyces venezuelae A 9692 aufweisender Streptomycetenstamm in wäßriger, eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthaltender Nährlösung aerob gezüchtet, bis diese eine wesentliche antibiotische Wirkung zeigt, und das Antibiotikum Lemacidin hierauf isoliert.

Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen öder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 40° C. Eine wesentliche antibakteri-

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eile Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach IV2 bis S Tagen.

Als assimilierbare Kohlenstoffquellen kommen z. B. Glukose, Saccharose, Laktose, Stärke, Mannit sowie Glycerin in Frage. Als stickstoffhaltige Nährstoffe und gegebenenfalls wachstumsfördernde Stoffe seien genannt: Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte wie Pepton oder Trypton, ferner Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze usw., aber auch Nitrate, λ^οη anderen anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink und Mangan enthalten.

Das gemäß der vorliegenden Erfindung herstellbare Antibiotikum Lemacidin ist ein wasserlöslicher Stoff, der nach papierchromatographischen Untersuchungen aus etwa drei, wahrscheinlich nahe verwandten Verbindungen besteht. Es ist in organischen Lösungsmitteln, vor allem Lipoidlösungsmitteln, vollkommen unlöslich. Das Antibiotikum ist basisch und bildet Salze, die zum Teil, z. B. das Hydrochlorid, in gewissen organischen Lösungsmitteln, wie niederen aliphatischen Alkoholen, löslich sind. Das Antibiotikum fändet sich bei der Züchtung in wäßrigen Medien fast vollständig in der Nährlösung, während das von dieser abgetrennte Mycel praktisch keine antibiotische Aktivität aufweist.

Gemäß diesen Eigenschaften kann man zwecks Gewinnung des Antibiotikums Lemacidin aus einer Kulturlösung dieses nicht mit organischen Lösungsmitteln extrahieren. Es läßt sich ihr dagegen bei neutraler oder schwach alkalischer Reaktion mit Adsorptionsmitteln entziehen und aus den Adsorbaten mit sauren, zweckmäßig ein p_H unter 4 aufweisenden EIutionsflüssigkeiten extrahieren. Als Adsorptionsmittel kommen einerseits Aktivkohle, z. B. Norit, anderseits Kationenaustauscher, namentlich solche, die Carboxylgruppen enthalten, wie z. B. das im Handel befindliche Austauscherharz Amberlite IR C-50, in Frage.

Wird Aktivkohle als Adsorptionsmittel verwendet, so eignen sich als Elutionsflüssigkeiten sowohl saure wäßrige Lösungen als auch Säuren enthaltende, mit Wasser mischbare Lösungsmittel, wie niedere aliphatische Alkohole und Ketone. Eine Mischung von gleichen Volumteilen Methanol und 1 n-Ameisensäure hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen. Da außer •dem Antibiotikum von der Aktivkohle noch größere Mengen, zum Teil gefärbte Verunreinigungen aus der Kulturlösung adsorbiert werden, wäscht man die Adsorptionskolonne vor der Elution des Antibiotikums bei sonst unveränderten Bedingungen vorteilhaft mit Äthanol, wobei ein großer Teil der Begleitstoffe entfernt, das Antibiotikum jedoch nicht extrahiert wird. Aus dem sauren Eluat läßt sich ein stark angereichertes Präparat des Antibiotikums in Form eines weißen Pulvers gewinnen, indem man das Eluat im Vakuum auf ein kleines Volumen konzentriert, wobei das organische Lösungsmittel sowie die Hauptmenge der Ameisensäure entfernt werden, und hierauf das wäßrige Konzentrat, vorteilhaft nach Verdünnung mit 4 bis 5 Volumen Methanol, mit Aceton versetzt, die entstandene Fällung mit diesem Lösungsmittel wäscht und zuletzt trocknet. Da das Kohleeluat, besonders von Kulturen mit Calciumcarbonat enthaltenden Nährlösungen, erhebliche Mengen Ca-Ionen enthält, wird vor der Fällung des Antibiotikums aus dem Konzentrat das Calcium zweckmäßig mit Oxalsäure ausgeschieden.

Zur Adsorption des Antibiotikums mit einem Kationenaustauscher wird dieser vorteilhaft in der Η-Form verwendet. Die Elution erfolgt mit verdünnter wäßriger Säure, gegebenenfalls nach Vorwaschung der Kolonne mit destilliertem Wasser, wobei inaktive Begleitstoffe eliminiert werden. Als Elutionsmittel ist besonders 0,2 η-Salzsäure geeignet. Das Antibiotikum ist im Eluat in Form eines Salzes enthalten. Kationenaustauschereluate können als solche oder nach Konzentrierung im Vakuum, gegebenenfalls nach vorausgehender Neutralisierung, zur Herstellung weiter angereicherter Präparate des Antibiotikums dienen.

Zur Herstellung des reinen Antibiotikums Lemacidin aus durch Kohle- oder Ionenaustauscheradsorption vorgereinigten Präparaten versetzt man ihre wäßrige, auf ein p_H von 6,5 bis 7,0 eingestellte Lösung mit einem zur vollständigen Fällung gerade ausreichenden Volumen einer wäßrigen Lösung des Salzes eines Sulfonsäuregruppen enthaltenden Azofarbstoffes und isoliert das entstandene schwerlösliche Farbstoffsalz des Antibiotikums. Verwendet man als Azof arbstoffsalz das unter der Bezeichnung Helianthin oder Orange III im Handel befindliche Natriumsalz der 4'-Dimethylamino-azobenzol-4-sulfonsäure, so scheidet sich das Farbstoffsalz (Helianthat) des Antibiotikums Lemacidin ganz oder teilweise in kristallisierter Form aus. Das Helianthat des Antibiotikums kann aus Wasser oder Methanol oder Mischungen dieser, aber auch aus Formamid und Wasser umkristallisiert werden., Umkristallisiert stellt es makroskopisch ein rotbraunes Pulver dar. Unter dem Mikroskop betrachtet, bildet es gelbe, unregelmäßig geformte geschichtete Plättchen oder auch Nadeln, die bei 202 bis 203° C unter Zersetzung schmelzen.

Um das Antibiotikum aus dem Farbstoffsalz zurückzugewinnen, setzt man dieses in wäßrigem oder alkoholischem Medium mit dem Salz aus einer anorganischen oder organischen Säure und einer organischen Base um, wobei sich das Salz des Antibiotikums der betreffenden Säure und das Farbstoffsalz der Base bilden. Verwendet man z. B. Triäthylaminsulfat zu dieser Umsetzung und führt sie mit einer wäßrigen Suspension des Antibiotikum-Helianthates aus, so erhält man das in Wasser lösliche Sulfat des Antibiotikums sowie das unlösliche Helianthat des Triäthylamins. Durch Zusatz von genügend Methanol zur Reaktionslösung geht letzteres in Lösung, während sich das nur in Wasser lösliche, in niederen Alkoholen dagegen vollständig unlösliche Antibiotikumsulfat ausscheidet und z. B. mittels Filtration isoliert werden kann. Die Umsetzung kann aber auch in alkoholischer oder wäßrig-alkoholischer Lösung vorgenommen werden, wobei das Sulfat sofort ausfällt und von der Farbstofflösung abgetrennt werden kann. Das so erhaltene Sulfat des Antibiotikums Lemacidin stellt ein farbloses, in Wasser und Formamid leicht lösliches, in organischen Lösungsmitteln, wie Alkoholen und Ketonen, dagegen unlösliches Pulver von hoher antibiotischer Wirksamkeit dar.

Aus dem Sulfat kann z. B. das Hydrochlorid des Antibiotikums durch Umsetzung in wäßriger Lösung mit Bariumchlorid und Isolierung aus der von Bariumsulfat befreiten Lösung als kaum gefärbtes, in Wasser sowie Methanol leicht, in Äthanol schwerer lösliches Pulver gewonnen werden. Andererseits ist es auch möglich, das Hydrochlorid direkt aus dem Helianthat des Antibiotikums herzustellen, indem man zur Lösung bzw. Suspension des letzteren in Methanol

konzentrierte Salzsäure oder eine Lösung von gasförmiger Salzsäure in Methanol im Überschuß zusetzt, das gebildete Hydrochlorid mit Äther niederschlägt und isoliert. Um geringe farbige Verunreinigungen aus dem nach diesen Methoden hergestellten Hydrochlorid zu entfernen, filtriert man dessen methanolische Lösung durch eine Kolonne von Aktivkohle, vorzugsweise von Gasruß, wobei das Hydrochlorid nach der Verdampfung des Lösungsmittels aus dem Filtrat als reinweißes Pulver erhalten wird, das sich beim sehr langsamen Verdunsten aus wäßriger oder methanolischer Lösung teilweise in kristalliner Form ausscheidet.

Die Herstellung des Antibiotikums Lemacidin in reiner Form kann auch in der Weise erfolgen, daß dieses aus wäßrigen Lösungen mit einer organischen Säure, beispielsweise vom Typus der Pikrinsäure, wie Pikrinsäure selber oder Styphninsäure oder mit Pikrolonsäure als schwerlösliches Salz gefällt wird. Das Pikrat und das Styphnat fallen zuerst in flüssiger Form als ölige Tropfen aus, die beim Stehen bei Raumtemperatur allmählich fest werden; sie konnten indessen bis jetzt nicht zur Kristallisation gebracht werden. Im Unterschied dazu kann das Pikrolonat kristallisiert werden. Die gelben, zu Drusen vereinigten unregelmäßigen Stäbchen schmelzen nach vorangehendem Sintern unter Zersetzung bei 202° C. Diese schwerlöslichen Salze können durch Behandlung mit Säuren, z. B. Salzsäure oder Schwefelsäure, in wäßrigem Medium oder in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Methanol oder Aceton, in das entsprechende Salz übergeführt und als solches isoliert werden. Nach diesem Anreicherungsverfahren kann das Antibiotikum z. B. aus dem über das Helianthat gereinigte Sulfat, aber auch aus den Eluaten der Kohle- sowie der Kationenaustauscheradsorbate gewonnen werden. Ein weiteres kristallisiertes, in Wasser schwerlösliches Salz des Antibiotikums Lemacidin stellt das Reineckat dar, das in unregelmäßigen Platten kristallisiert und einen Zersetzungspunkt von 198 bis 200° C aufweist.

Die freie Base des Antibiotikums Lemaeidin ist leicht aus ihren Salzen zugänglich, aus dem Sulfat z. B. durch Umsetzung in wäßrigem Medium mit Bariumhydroxyd, Neutralisierung des überschüssigen Baryts mit Kotilendioxyd sowie Abtrennung des Bariumcarbonate und -Sulfatniederschlags und Isolierung der Antibiotikumbase mittels Gefriertrocknung. Einfacher erfolgt die Herstellung aus den Salzen unter Verwendung eines stark basischen Aionenaustauschers, z. B. der OH-Form des unter der Bezeichnung Dowex-2 im Handel befindlichen Produktes.

Das Antibiotikum Lemacidin ist eine farblose, amorphe Base, die in Wasser und wäßrigen Medien leicht löslich, in organischen Lösungsmitteln dagegen unlöslich ist. Die wäßrige Lösung der Base reagiert alkalisch. Eine l°/o-Lösung eines mittels Ionenaustauscher 'hergestellten Präparates zeigt ein p_H von 8,6.

Mit Säuren bildet das Antibiotikum Lemacidin Salze, von denen z. B. das farblose Sulfat und Hydrochlorid in Wasser leicht löslich sind. Das Hydrochlorid löst sich außerdem in niederen aliphatischen Alkoholen, besonders in Methanol.

Beim sehr langsamen Verdunsten wäßriger oder methanolischer Lösungen kann das Hydrochlorid des Antibiotikums in kristalliner Form erhalten werden. Es hat folgende Elementarzusammensetzung: C=37,3%, H=7,Q%, N=16,8%, 0=20,8% (berechnet), Cl= 18,1%, [_a]%° = + 24,4° (c=l,0 in Wasser).

Die entsprechenden Daten für das Sulfat des Antibiotikums lauten: C=SS₁OVo, H=6,9%, N= 11,6%, O = 38,2 % (berechnet), S = 8,3 %, [a] I⁷ = + 56° (c=0,95 in Wasser).

Das Farbsalz der Base mit der 4'-Dimethylaminoazobenzol-4-sulfonsäure (Helianthat) ist sowohl in wäßrigen als auch in alkoholischen Medien schwer löslich. Aus solchen heiß gesättigten Lösungen scheidet es sich in unter dem Mikroskop gelbgefärbten,

ίο unregelmäßig geformten, geschichteten Blättchen, auch Nadeln, ab, die nach der Umkristallisation einen Zersetzungspunkt von 202 bis 203° C zeigen.

Andere Salze des Antibiotikums Lemacidin leiten sich ab z. B. von der Essigsäure, Palmitinsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Pantothensäure, Ascorbinsäure oder Aminosäuren, wie Leucin und Methionin. Das Hydrochlorid des Antibiotikums Lemacidin gibt eine positive Ninhydrin-, schwach positive Biuret- sowie Elson-Morgan-Reaktion, während der

ao Maltol- und Sakaguchi-Test negativ ausfällt. Wie die vergleichende papierchromatographische Untersuchung ergibt, ist es verschieden von den bekannten wasserlöslichen, farblosen, gegen grampositive Bakterien wirksamen Antibiotika.

Das Hydrochlorid des Antibiotikums Lemacidin kann mittels Papierchromatographie in drei, wahrscheinlich nahe verwandte Komponenten B1, B 2 und B 3 aufgetrennt werden. Verwendet man z. B. als Lösungsmittelsystem eine Mischung von 3 Teilen

Äthanol und 1 Teil Wasser, die 2% Natriumchlorid enthält, und setzt man den R_f-Wert (=Rß) der am schnellsten laufenden Komponente B 3 (Bezugssubstanz) gleich 1, so ergeben sich für die zwei anderen Komponenten Bl und B 2 R_ß-Werte von 0,34 bzw. 0,61.

Das Antibiotikum Lemacidin besitzt eine hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Testorganismen. Verwendet man als Testmethode in vitro Verdünnungsreihen (Zehnerpotenzen) in Glukosebouillon, die während 24 Stunden bei 37° C bebrütet werden, so ergeben sich folgende noch 'hemmende Konzentrationen :

Testorganismen

Micrococcus pyogenes, var. aureus Micrococcus pyogenes, var. aureus Penicillin-resistent

Streptococcus pyogenes

Streptococcus viridans

Corynebacterium diphtheriae

Escherichia coli

Escherichia coli, Streptomycinresistent

Escherichia coli, Chloromycetin-

resistent

Salmonella typhosa

Salmonella schottmuelleri

Shigella sonnei

Pseudomonas aeruginosa

Klebsieila typ. A

Pasteurella pestis

Vibrio cholerae el Tor

Bacillus megatherium

Bacillus subtilis

Candida vulgaris

Endomyces albicans

Hemmende

Konzentration

μ g/cm³

10

10 10 10

10

10 10

1 10

0,1

10 10 10

In vivo ist das Antibiotikum Lemacidin ebenfalls wirksam. Bei fünfmaliger subkutaner Verabreichung von 1 mg/kg an mit Micrococcus pyogenes var. aureus infizierte Mäuse werden 100% Überlebende beobachtet. Bei gleicher Applikation von 5 mg/kg zeigt sich eine ähnliche Wirkung bei Mäusen, die mit Escherichia coli, ebenso ein Effekt bei solchen, die mit Salmonella typhi murium infiiziert sind.

Das Antibiotikum Lemacidin weist zwar eine gewisse Toxizität auf, immerhin wird z. B. die subkutane Applikation von 50 mg Antibiotikum Hydroehlorid pro kg von Mäusen verhältnismäßig gut vertragen. Das Sulfat und das Pantothenat sind etwas weniger, das Salz der L(+)-Ascorbinsäure sowie die Salze der Aminosäuren l(—)-Leucin und l(-)-Methionin bedeutend weniger toxisch als das Hydroehlorid.

Das Antibiotikum, seine Komponenten Bl, B 2 und B3 und ihre Salze können als Heilmittel, z.B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B. GeIatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche öle, Benzylalkohol^ Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Salben, Cremes, Suppositorien oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, ohne daß damit eine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes beabsichtigt ist. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Beispiel 1

Die Züchtung des Streptomyces A 9692 wird nach dem Submersverfahren durchgeführt. Man verwendet eine Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser fol- ⁴S gende Zusatzstoffe enhält:

Glycerin 20 g

Sojamehl 10 g

Natriumchlorid 5 g

Natriumnitrat Ig

Calciumcarbonat 10 g

Die Nährlösung wird in den Impfkolben oder in den Fermentern während 20 bis 30 Minuten bei 1 atü sterilisiert. Die sterilisierte Nährlösung zeigt ein p_H von 7,0 bis 7,5. Die Animpfung erfolgt mit. bis zu 10% einer teilweise sporulierenden vegetativen Kultur des Organismus. Man inkubiert unter gutem Schütteln oder Rühren bei 21 bis 27° C, wobei Kulturen in Fermentern mit etwa 1 Volumen steriler Luft pro Volumen Lösung in der Minute belüftet werden; nach 30 bis 50 Stunden Bebrütung hat die Kulturlösung den größten Hemmwert gegenüber den Testorganismen (B. megatherium, Esch. coli, Candida vulgaris) erreicht. Man unterbricht die Kultur und trennt das nur schwach aktive Mycel sowie andere feste Bestandteile von der das Antibiotikum enthaltenden Lösung mittels Filtration oder Zentrifugation ab, wobei gegebenenfalls der Kulturlösung vor der Filtration etwa 1 % eines Filterhilfsmittels zugesetzt wird. Das p_H des Kulturfiltrates ist in der Regel im Vergleich mit der sterilisierten Nährlösung nicht oder nur wenig verändert.

Verwendet man an Stelle der oben angegebenen Nährlösung solche, die pro Liter Leitungswasser die unter a) bis g) angeführten Mischungen von Nährstoffen aufweisen, so erhält man nach analoger Züchtung und Aufarbeitung Kulturnitrate von ähnlich hoher antibiotischer Wirksamkeit. Anstatt durch einen Zusatz eines Filterhilfsmittels kann man eine rasche Filtration der Kulturlösung auch dadurch erzielen, daß man diese vor der Filtration mit Salzsäure auf p_H 5 und hierauf durch Zugabe einer wäßrigen Lösung von Aluminiumsulfat auf eine Konzentration von 0,5% dieses Salzes einstellt.

Nährstoffmischungen mit folgenden Zusatzstoffen pro Liter Wasser sind ebenfalls geeignet:

a) Glukose 20 g

Sojamehl 40 g

Distiller's Solubles 5 g

Natriumchlorid 20 g

Calciumcarbonat 10 g

b) Glukose 10 g

Sojamehl ...... 10 g

Maisquellwasser 20 g

Natriumchlorid 5 g

Natriumnitrat Ig

Calciumcarbonat 10 g

c) Glukose 10 g

Pepton 5 g

Fleischextrakt 3 g

Natriumchlorid 5 g

Calciumcarbonat 10 g

d) Glukose 10 g

Distiller's Solubles 10 g

Natriumchlorid 5 g

Natriumnitrat Ig

Calciumcarbonat 10 g

e) Mannit 20 g

Distiller's Solubles 20 g

Natriumchlorid 3 g

Natriumnitrat Ig

f) Malzextrakt 20 g

Distiller's Solubles ..: 20 g

Natriumchlorid 5 g

Natriumnitrat Ig

g) Laktose 20 g

Distiller's Solubles 20 g

Natriumchlorid ". 5 g

Natriumnitrat Ig

Ein gemäß den obigen Angaben gewonnenes Filtrat bzw. Zentrifugat einer Kultur des Streptomyces A 9692 weist in der Regel ein p_H von 7,0 bis 7,5 auf. Wenn dies nicht der Fall ist, wird für die folgende Anreicherung des neuen Antibiotikums das p_H mit Hilfe von lOn-Natronlauge auf diesen AVert eingestellt. Das schwach alkalische Filtrat wird hierauf zwecks Adsorption des Antibiotikums mit 1 % Aktivkohle versetzt und die Masse während 1 Stunde mechanisch gerührt, wobei die gesamte antibiotisch wirksame Substanz von der Kohle aufgenommen wird. Letztere wird durch Filtration, vorteilhaft unter Zugabe von etwas Filterhilfsmittel, von der vollständig inaktiven, fast wasserhellen Lösung abgetrennt.

Außer dem Antibiotikum werden von der Kohle noch große Mengen anderer organischer, antibiotisch unwirksamer Stoffe, vor allem stark gefärbte Abbauprodukte aus der Nährlösung, aber auch anorganische

Salze adsorbiert. Diese BegleitstofEe werden vorteilhaft vor der Elution des Antibiotikums aus der Kohle entfernt. Dazu wird die abfiltrierte, noch feuchte Kohlemasse in die 5fache Menge 95% Äthanol eingetragen und die Suspension ¹Za Stunde gerührt. Die so vorgewaschene Kohle läßt sich durch Filtration leicht von der Waschflüssigkeit abtrennen. Das braungefärbte Filtrat zeigt keine antibiotische Wirksamkeit.

Die Elution des neuen Antibiotikums erfolgt mit angesäuertem wäßrigem Methanol, zweckmäßig mit einer Mischung von gleichen Volumteilen Methauol und 1 η-Ameisensäure, wobei auf 1 g Adsorptionsmittel 2 cm³ Elutionsflüssigkeit zur Anwendung kommen. Die Suspension wird V2 Stunde mechanisch gut gerührt, dann filtriert, worauf der Kohlerückstand noch dreimal in gleicher Weise extrahiert wird. Die Eluate, von denen nur das erste schwach gelblichgefärbt, die übrigen farblos sind, zeigen die gesamte antibiotische Aktivität. Sie werden vereinigt und im Vakuum bei niedriger Badtemperatur, z., B. bei 40 bis 60° C, auf ein Hundertstel des ursprünglichen Volumens konzentriert, wobei außer dem Methanol und viel Wasser auch der größte Teil der Ameisensäure entfernt wird. Das p_H des gelblichgefärbten, jedoch dünnflüssigen Konzentrats ist in der Regel um 4.

Das Konzentrat enthält, besonders wenn die Kultur nach Absatz 1 oder nach a) bis d) durchgeführt wurde, größere Mengen Calcium. Man entfernt dieses in Form des schwerlöslichen Oxalate, indem man dem Konzentrat unter Rühren eine lOtyoige wäßrige Oxalsäurelösung zusetzt. Die für die vollständige Fällung erforderliche Menge Oxalsäurelösung wird in einem aliquoten Teil genau bestimmt. Für Konzentrate aus Kulturen mit Calciumcarbonat werden in der Regel zwischen 300 bis 500 cm³ Oxalsäurelösung pro Liter Konzentrat benötigt, entsprechend 3 bis 5 cm³ pro Liter ursprüngliches Kulturfiltrat, während Konzentrate aus Kulturlösungen ohne Calciumcarbonatzusatz weniger erfordern.

Aus dem von Calcium befreiten Konzentrat wird das Antibiotikum in Form eines stark angereicherten, weißen Pulvers gewonnen, indem man das wäßrige Konzentrat zunächts mit 4 bis 5 Volumen Methanol verdünnt und hierauf das aktive Material mit 20 Volumen Aceton ausfällt. Der Niederschlag wird abnitriert, zweimal mit Aceton gewasöhen und zuletzt im Vakuum von den Lösungsmittelresten befreit. Man erhält ein reinweißes Pulver, das nahezu die gesamte antibiotische Aktivität des Kulturnitrates zeigt. Die Ausbeute beträgt etwa 300 mg pro Liter Kulturfiltrat.

Beispiel 2

Eine bedeutend stärkere Anreicherung des Antibiotikums Lemacidin als nach der im Beispiel 1 beschriebenen Acetonfällung läßt sich über die Darstellung von dessen kristallisiertem Helianthinsalz erzielen. Hierzu wird das nach Beispiel 1 gewonnene calciumfreie Konzentrat mit 2 Volumen Wasser verdünnt, das p_H der Lösung mit 10n-Natronlauge auf p_H 6,7 bis 7,0 eingestellt und unter kräftigem Rühren und in dünnem Strahl das zur vollständigen Fällung erforderliche Volumen einer nahezu gesättigten wäßrigen Lösung von Helianthin,. enthaltend 3,5 g Helianthin (Orange III, Natriumsalz der 4'-Dimethylamino-azobenzol-4-sulfonsäure) im Liter, zugegeben, wobei die Fällungslösung vorteilhaft direkt in die Antibiotikumlösung eingeleitet wird. Das zur vollständigen Fällung benötigte Volumen der Helianthinlösung wird in einem Vorversuch mit einem aliquoten Teil ermittelt. Es variiert je nach dem Antibiotikumgehalt in der Regel zwischen der 20- und lOOfachen Menge des angewendeten, unverdünnten Konzentrats. Das sich bildende Helianthat (Helianthinsalz des Antibiotikums) fällt zum größten Teil in kristallisiertem Zustand, in der Form von dünnen Plättchen, auch Nadeln, aus. Man läßt die Fällungslösung einige Stunden bei tiefer Temperatur, um 0° C, stehen, wobei sich der Niederschlag vollständig absetzt. Hierauf wird die Hauptmenge der klaren überstehenden Lösung durch Dekantieren, der Rest mit Hilfe der Zentrifuge vom Niederschlag abgetrennt. Dieser wird zwecks Waschung einmal mit etwa der gleichen Menge eiskaltem Wasser verrührt und hierauf mit Hilfe der Nutsche isoliert. Die Waschung wird zweimal in gleicher Weise, doch mit Aceton, wiederholt. Das so gewaschene Helianthat des neuen Antibiotikums wird im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute beträgt zwischen 100 und 180 mg Helianthat pro cm³ Konzentrat. Das Trockenprodukt stellt ein rotbraunes Pulver dar; es ist in Wasser sowie in Methanol ziemlich schwer löslich, leichter dagegen in Formamid, aber unlöslich oder sehr wenig löslich in Lipoidlösungsmitteln, wie Aceton, Äther, Benzol, Chloroform u. a. Es kann sowohl aus Wasser sowie Methanol als auch aus Mischungen dieser Lösungsmittel umkristallisiert werden, wobei es in unter dem Mikroskop gelben, unregelmäßig geformten, geschichteten Plättchen anfällt, die bei 202 bis 203° C unter Zersetzung schmelzen.

Zur Herstellung des Sulfats des neuen Antibiotikums aus dem Helianthat werden z. B. 30 g Helianthat-Trockenpulvers in 150 cm³ Wasser suspendiert, zur Suspension 33 cm³ einer wäßrigen 8O°/o-Lösung von Triäthylaminsulfat zugegeben und die Masse während 1 Stunde gerührt, wobei sie sich durch das bildende schwerlösliche Triäthylaminsalz des Helianthins allmählich braunrot verfärbt. Die Umsetzung kann durch Erwärmen erheblich beschleunigt werden. Man versetzt hierauf die Reaktionsmischung mit 20 Volumen Methanol, wobei das Sulfat des Antibiotikums als weißer Niederschlag ausfällt, während das Triäthylamin-Helianthat in Lösung geht. Das durch Zentrifugation oder Filtration gewonnene Antibiotikumsulfat wird durch zweimaliges Umfallen aus Wasser mit Methanol von anhaftendem Farbstoff befreit, zuletzt noch mit reinem Methanol gewaschen und dann getrocknet. Es stellt ein reinweißes, amorphes Pulver dar, das in organischen Lösungsmitteln unlöslich, leicht löslich dagegen in Wasser ist. Die Ausbeute beträgt 5,6 g.

Beispiel 3

Zwecks Umwandlung des Sulfats in das sowohl in Wasser als auch in Methanol leichtlösliche Hydrochlorid des neuen Antibiotikums wird dieses in der lOfachen Menge Wasser gelöst und die wäßrige Lösung bis zur vollständigen Fällung mit einer 20%-· Bariumchloridlösung behandelt, wobei etwa 4 cm³ pro g Sulfat erforderlich sind. Der Niederschlag von Bariumsulfat wird durch Zentrifugieren entfernt und aus der farblosen überstehenden Lösung das Hydrochlorid mittels Gefriertrocknung isoliert. Es werden so etwas mehr als 1 g Hydrochlorid pro g Sulfat gewonnen. Um eine weitere Reinigung des Hydrochloride zu erzielen, wird dieses in wenig Methanol gelöst, die konzentrierte Lösung auf eine mit Methanol gewaschene Chromatographierkolonne von Gasruß gegossen und mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert.

Der Verdampfungsrückstand des Eluats stellt ein

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einer 10 η-Lösung von gasförmigem Chlorwasserstoff in absolutem Methanol portionsweise zugibt und nach der vollständigen Umsetzung das gebildete, teilweise ausgeschiedene Hydroohlorid des Antibiotikums durch 5 Versetzen des Reaktionsgemisches mit 20 Volumen absolutem Äther vollständig ausfällt. Das Hydrochlorid wird abgenutscht, auf der Nutsche einmal mit etwas Äther gewaschen und hierauf zwecks Entfernung von noch anhaftenden Pikrolonsäureresten in 2 cm³ Me-

reinweißes, in Methanol sowie in Wasser leichtlösliches Pulver dar, das sich aus diesen Lösungsmitteln beim sehr langsamen Verdunsten teilweise in kristalliner Form ausscheidet.

Anstatt das Hydrochlorid über das Sulfat zu bereiten, läßt sich dieses auch direkt aus dem Helianthat
gewinnen. Dazu wird letzteres in trockenem, fein verteiltem Zustand in etwa der lOfachen Menge absolutem
Methanol suspendiert, zur Suspension noch 2 Volumen
10 n-Salzsäure-Methanol zugesetzt und hierauf kurz io thanol gelöst und erneut mit Äther ausgeschieden und aufgekocht. Nach Entfärbung mit etwas Norit wird gewaschen. Das nunmehr reine Hydrochlorid des Antibiotikums stellt nach dem Trocknen im Vakuum ein reinweißes, amorphes Pulver dar. Die Ausbeute ⁱ*st 0,25 g. Das Infrarotspektrum, aufgenommen in Nujol, 15 ist in Fig. 1 dargestellt.

Nach papierchromatographischen Untersuchungen stellt das so erhaltene Hydrochlorid des Antibiotikums Lemacidin ein Gemisch von drei wahrscheinlich nahe verwandten Verbindungen (B 1, B 2 und B 3) dar. \^rer-20 wendet

filtriert, das wasserhelle Filtrat dann im Vakuum auf etwa ein Viertel des ursprünglichen Volumens konzentriert und aus dem Konzentrat das Hydrochlorid mit 10 bis 20 Volumen Äther oder Aceton gefällt.

Beispiel 4

Das nach Beispiel 2 als rohes Sulfat gewonnene Antibiotikum wird über das Pikrat wie folgt weitergereinigt :

Zu einer gut gerührten Lösung von 1 g Sulfat in 20 cm³ Wasser läßt man langsam 130 cm³ gesättigte wäßrige Pikrinsäurelösung zulaufen, welche Menge zur vollständigen Fällung gerade ausreichend ist. Es

man z. B. als Lösungsmittelsystem eine Mischung von 3 Teilen Äthanol und 1 Teil Wasser, die 2% Natriumchlorid enthält, und setzt man den Rf-Wert (=Rß) der am schnellsten laufenden Komponenten B 3 (Bezugssubstanz) gleich 1, so ergehen bildet sich ein öliger Niederschlag, der abzentrifugiert, 25 sich für die zwei anderen Komponenten B1 und R 2 je einmal mit etwas gesättigter Pikrinsäurelösung und R₁.-Werte von 0,34 bzw. 0,61. Wasser gewaschen und hierauf im Vakuumexsikkator . .

getrocknet wird, wobei sich das Pikrat in eine feste, Beispiel

jedoch, nicht kristallisierte Masse umwandelt. Die Die Darstellung der freien Base des neuen AntiAusbeute beträgt 1,2 g. Zur Umwandlung des Pikrats 3° biotikums kann sowohl aus dessen Sulfat mit Bariumdes Antibiotikums in dessen Hydrochlorid löst man hydroxyd als auch unter Verwendung eines schwach ersteres in warmem, mit konzentrierter Salzsäure an- basischen Ionenaustauschers erfolgen. Im ersten Fall gesäuertem Methanol und gießt die Lösung in 10 Vo- versetzt man. z. B. eine Lösung von 1 g des nach Beilumen Äther, wobei das unlösliche Hydrochlorid als spiel 2 erhaltenen Sulfates des Antibiotikums in 5 cm³ weiße Masse ausfällt. Dieses wird von noch anhaften- 35 Wasser mit einem geringen Überschuß einer warm den Resten Pikrinsäure befreit, indem man es in der gesättigten Lösung von Bariumhydroxyd, d. h. bis die

Reaktionsmischung ein p_H von etwa 9 aufweist. Man neutralisiert hierauf das überschüssige Bariumhydroxyd sofort, indem man Kohlendioxyd in die Lö-40 sung einleitet. Dann wird die Reaktionsmischung zwecks Überführung des gebildeten Bariumbicarbonats einige Minuten im Wasserbad bei 60° gehalten, worauf das ausgefallene Bariumcarbonat zusammen mit dem Bariumsulfat abzentrifugiert wird. Aus der ⁴⁵ überstellenden, wasserhellen, alkalischen Zentrifugationslösung isoliert man die freie Base des neuen Antibiotikums mittels Gefriertrocknung. Sie stellt ein weißes, in Wasser mit stark alkalischer Reaktion lösliches, in organischen Lösungsmitteln unlösliches Liter enthaltend, zutropfen. Der ausgeschiedene 5o Pulver dar. Ausbeute 0,5 g.

amorphe Niederschlag des Pikrolonats wird abge- Zur Gewinnung der freien Base mit Hilfe eines

nutscht und zwecks Kristallisation in 150 cm³ kochen- schwach basischen Ionenaustauschers wird wie folgt dem Wasser aufgelöst und die Lösung heiß filtriert. vorgegangen:

Aus dem Filtrat scheidet sich beim langsamen Abküh- Man perkoliert eine etwa 20 °/o wäßrige Lösung von

len auf Raumtemperatur das Pikrolonat in teilweise 55 0,2 g des nach Beispiel 2 erhaltenen Rohsulfats des kristallisierter Form aus. Der Niederschlag wird auf neuen. Antibiotikums durch eine Kolonne des schwach der Nutsche gesammelt, mit wenig eiskaltem Wasser basischen Ionenaustauschers Dowex-2, wobei etwa die gewaschen und zwecks Umkristallisation in 100 cm³ 30fache Menge des zuvor mit verdünnter Salzsäure— kochendem Wasser aufgelöst. Aus der heiß filtrierten Wasser—verdünnter Natronlauge—Wasser wiederLösung fällt das Pikrolonat nunmehr vollständig in ^6o holt in dieser Reihenfolge gewaschenen Inonenaus-Form feiner, zu Drusen angeordneter, gelber Stab- tauscherharzen angewendet wird. Die mit der Sulfatchen aus, die nach dem Waschen mit wenig kaltem lösung beschickte Kolonne wird mit Wasser nachWasser und Trocknen im Vakuum über Phosphor- gewaschen, wobei die Base leicht eluiert wird. Das pentoxyd, nach Sintern einen scharfen Zersetzungs- Eluat wird zwecks Gewinnung der Base wie zuvor punkt von 202° aufweisen. Die Ausbeute des zweimal ⁶5 vorteilhaft lyophilisiert. Ausbeute 0,65 g. Die Base umkristallisierten Pikrolonats beträgt 0,64 g. stellt ein weißes, amorphes Pulver dar.

Aus dem vorstehend gewonnenen Pikrolonat wird . .

das reine Hydrochlorid erhalten, indem man zur fein- Beispiel 7

verteilten Suspension von 0,6 g Pikrolonat in 10 cm³ Eine nach Beispiel 1 gewonnene, vom Mycel beeiskaltem Methanol unter kräftigem Rühren 0,6 cm³ 7° freite Kulturlösung des Antibiotikums Lemacidin

zur Lösung erforderlichen Menge kochenden Methanols auflöst und die Ätherfällung wiederholt. Man erhält so etwa 0,6 g reinweißes, pulverförmiges Hydrochlorid. . .

Beispiel 5

Anstatt über das bisher nicht kristallisierbare Pikrat kann man das reine Antibiotikum, z. B. als Hydrochlorid, über das kristallisierte Pikrolonat gewinnen, wobei man wie folgt verfährt:

Man läßt zu einer Lösung von 1,0 g des nach Beispiel 2 gewonnenen Sulfats in 100 cm³ Wasser unter Rühren innerhalb 1 Stunde 700 cm³ einer konzentrierten wäßrigen Lösung von Pikrolonsäure, 2,4 g im

wird langsam durch eine Kolonne eines schwach sauren, Carboxylgruppen enthaltenden Ionenaustauscherharzes filtriert, wobei pro Liter der Antibiotikumlösung 100 g der Η-Form des Austauschers angewendet werden und die Durchflußgeschwindigkeit auf etwa 5 1 pro Stunde eingestellt wird. Das Antibiotikum Lemacidin wird, zusammen mit inaktiven, zum Teil stark braun gefärbten Begleitstoffen adsorbiert; die abfließende, ein p_H von 3 bis 3,5 aufweisende Lösung hat nur eine sehr geringe antibiotische Wirksamkeit. Man wäscht hierauf die Amberlite-Kolonne mit einem Fünftel des Volumens der einfiltrierten Kulturlösung destilliertem Wasser nach, wobei ein Teil der inaktiven, gefärbten Begleitstoffe entfernt, das Antibiotikum selber jedoch nicht eluiert wird. Um dieses aus dem Adsorbat zu gewinnen, schickt man durch die vorgewaschene Kolonne eine wäßrige Lösung von 0,2 η-Salzsäure, und zwar total ein Viertel des Volumens der angewendeten Kulturlösung. Das stark saure Eluat wird entweder mit konzentrierter Natronlauge oder mit Hilfe eines basischen Ionenaustauschers neutralisiert. Die so gewonnene Lösung kann als solche oder nach Konzentrierung im Vakuum und bei niedriger Temperatur als Ausgangslösung zur Herstellung weiter angereicherter Präparate des Antibiotikums Lemacidin, z. B. nach den in den Beispielen 2 und 3 oder 4 beschriebenen Verfahren, verwendet werden.

Beispiel 8

Das Pantothenat des Antibiotikums Lemacidin kann z. B. aus dem nach Beispiel 2 gewonnenen Sulfat erhalten werden. Man versetzt hierzu die Lösung von 1,0 g Sulfat in 10 cm³ Wasser mit 8,0 cm^s einer 10% wäßrigen Lösung von Calcium-Pantothenat, filtriert oder zentrifugiert vom gebildeten Niederschlag von Calciumsulfat ab und lyophilisiert das Filtrat bzw. Zentrifugat oder dampft es im Vakuum zur Trockne ein. Der Trockenrückstand des Pantothenats des Antibiotikums Lemacidin stellt ein weißes, amorphes, in Wasser sehr leicht lösliches Pulver dar.

In ähnlicher Weise können andere Salze des Antibiotikums Lemacidin mit organischen Säuren wie z. B. mit L (+)-Ascorbinsäure oder mit Aminosäuren wie l(-)-Leucin bzw. L(—)-Methionin hergestellt werden. Man geht dabei vorteilhaft von der nach Beispiel 6 gewonnenen freien Base des Antibiotikums aus, indem man deren konzentrierte wäßrige Lösung mit einer warm gesättigten Lösung der organischen Säure versetzt, wobei z. B. für 1 g Base 1,2 g Ascorbinsäure bzw. 0,9 g Leucin bzw. 1,05 g Methionin angewendet werden.

Claims

Patentanspruch:

Die Verwendung von Streptotnyces venezuelae A 9692 oder eines dessen Eigenschaften aufweisenden Mikroorganismus der Gattung Streptomyces zur Herstellung des Antibiotikums Lemacidin durch übliche biologische Züchtung, Gewinnung des Antibiotikums aus dem Kulturfiltrat, Reindarstellung und Herstellung von dessen Salzen.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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