DE1160982B - Verfahren zur Herstellung von 6-Desmethyltetracyclin - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von 6-Desmethyltetracyclin

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DE1160982B
DE1160982B DEL38902A DEL0038902A DE1160982B DE 1160982 B DE1160982 B DE 1160982B DE L38902 A DEL38902 A DE L38902A DE L0038902 A DEL0038902 A DE L0038902A DE 1160982 B DE1160982 B DE 1160982B
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desmethyltetracycline
strain
fermentation
brown
atcc
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DEL38902A
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Abramo Virgilio
Carlo Hengeller
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Gruppo Lepetit SpA
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Lepetit SpA
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
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    • C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description

  • Verfahren zur Herstellung von 6-Desmethyltetracyclin Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Antibioticums 6-Desmethyltetracyclin auf biologischem Wege.
  • Bekanntlich haben die Antibiotica im allgemeinen während der letzten Jahre auf dem Gebiete der Humantherapie stetig an Bedeutung gewonnen, und zugleich ist die Gruppe der Tetracyclinantibiotica wegen der sehr breiten antibakteriellen Wirksamkeit und wegen der verhältnismäßig geringen Toxizität der einzelnen Substanzen bei der Behandlung von Infektionskrankheiten an eine hervorragende Stelle getreten.
  • 6-Desmethyltetracyclin ist eine der Substanzen, die neuerdings von besonderem Interesse ist. Es unterscheidet sich vom Tetracyclin dadurch, daß im Tetracyclinmolekül in 6-Stellung eine Methylgruppe fehlt. Tetracyclin: R = CH, 6-Desmethyltetracyclin : R = H Zwei Wege zur Herstellung von 6-Desmethyltetracyclin sind bereits beschrieben worden. Das erste Verfahren besteht darin, bestimmte Mutantenstämme von Streptomyces aureofaciens zu fermentieren.
  • Bekanntlich erzeugt die Species S. aureofaciens unter den üblichen Fermentationsbedingungen das Antibioticum Chlortetracyclin, während bei einigen sorgsam überwachten Abänderungen der Züchtungsmedien gleichzeitig Chlortetracyclin und Tetracyclin erhalten werden.
  • Dasselbe trifft für das Verhalten des S. aureofaciens und die erwähnten Mutantenstämme zu. Werden die letzteren in einem der üblichen Züchtungsmedien gezüchtet, so können sie die antibiotische Substanz 6-Desmethylehlortetracyclin erzeugen, während bei kontrollierten Bedingungen 6-Desmethyltetracyclin zusammen mit anderen Stoffen gebildet wird; in beiden Fällen entstehen dabei auch, wie aus der deutschen Auslegeschrift 1041213 hervorgeht, kleinere Mengen Tetracyclin- und Chlortetracyclin. Die alleinige Gewinnung von 6-Desmethyltetracyclin bedingt deshalb eine mühsame und die Ausbeute mindernde Methode zur Trennung von den verwandten antibiotischen Substanzen. Ein anderes bekanntes Verfahren zur Gewinnung von 6-Desmethyltetracyclin ist die katalytische Hydrierung von 6-Desmethylchlortetracyclin. Dafür ist zunächst eine Gärungsstufe zur Erzeugung von 6-Desmethylchlortetracyclin notwendig, das dann zur Trennung von den im Verlaufe der Fermentation gebildeten verwandten Antibiotica gereinigt werden muß, wonach es hydriert werden kann.
  • Durch die vorliegende Erfindung kann nunmehr reines 6-Desmethyltetracyclin durch Fermentation einer künstlich gezüchteten Mutante von Streptomyces psammoticus, welche in der Kulturensammlung von Lepetit unter der Bezeichnung C17190 enthalten ist, in üblichen Nährmedien hergestellt werden. Der Stamm Cl 7190 ist bei der Amerikanischen Kulturensammlung (American Type Culture Collection) unter der Nummer 14 125 hinterlegt.
  • Obgleich die Mutante Cl 7190 (ATCC 14 125) in vielen Eigenschaften dem Mutterstamm gleicht, werden doch Unterschiede deutlich, wenn die beiden Stämme jeweils in verschiedenen Medien gezüchtet werden.
  • Im folgenden ist ein Vergleich gegeben zwischen den Wachstumseigenschaften des Stammes Cl 2007, einer wilden Art, und des Stammes Cl 7190, einer 6-Desmethyltetracyclin erzeugenden Mutante, wobei verschiedene bei 27 bis 29°C inkubierte Medien verwendet werden. Zur Farbbestimmung wurde die kleine Farbmeßtafel nach O s t wv a 1 d, Ausgab;: A, Wissenschaftlicher Verlag, Göttingen, Frankfurt, Berlin, benutzt.
    1. Stärkeagar(a)
    Streptomyces psammoticus
    Stamm Cl 2007 Stamm Cl 7190
    (ATCC 14125)
    Wachstum ..................................... gering sehr gering
    Luftmycel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . sehr gering, weiß wird sehr gering. weiß wird
    schwach olivgelblich (ie 2) schw=ach olivgelblich (ie 2)
    Sporenbildung .................................. schwach gering
    Diffusionsfähiges Pigment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . gering, leicht gelb (ga 2) gering, schwach braun
    bis schwach olivgrün (ge 3)
    (ge 1)
    Rückseite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . schwach olivgelblich (ie 1) braun (ge 4)
    Diastatische Wirksamkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . positiv positiv
    (a) Hergestellt gemäß den in der »Streptomyces Conference Stockholm 1958« aufgestellten Richtlinien.
    2. Czapek-Agarlösung (b)
    Streptomyces psammoticus
    Stamm Cl 2007 Stamm Cl 7'90
    (ATCC 1415)
    Wachstum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . sehr gering sehr gering
    Luftmycel...................................... fehlt fehlt
    Sporenbildung .................................. fehlt fehlt
    Diffusionsfähiges Pigment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . fehlt fehlt
    Unterseite ..................................... farblos farblos
    3. Hefeextrakt, Malzextrakt, Agar (b)
    Streptomyces psamtnoticus
    Stamm Cl 2007 Stamm Cl 7190
    (ATCC 14125)
    Wachstum ..................................... reichlich reichlich
    Luftmycel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . mäßig, weiß bis wassergrün weiß bis wassergrün (ec 1)
    (ec 1) bis schwach bis schwach
    olivgelblich (ie 2) olivgelblich (ie 2)
    Sporenbildung .................... . ............. schwach sehr gering
    Diffusionsfähiges Pigment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . gering, gelb (ga 2) braun (ie 3)
    bis braun (ne 3)
    Unterseite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . dunkelbraun (pg 4) kastanienbraun (ie 4)
    4. Haferflocken-Agar nach C a r v a j a 1 (b)
    Streptomyces psammoticus
    Stamm Cl 7190
    Stamm Cl 2007 (ATCC 14125)
    Wachstum ..................................... üppig üppig
    Luftmycel ...................................... weiß bis wassergrün (ec 1) weiß bis wassergrün (ec 1)
    bis grün-olivgelblich bis grün-olivgelblich
    (ie 2 ?) (ie 2)
    Sporenbildung ..................... . ............ üppig üppig
    Diffusionsfähiges Pigment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . reichlich, gelb (-a 2) braun ()ig 3)
    bis kastanienbraun-
    grüngelb (1g 2)
    Rückseite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . kastanienbraun-grüngelb dunkles kastanienbraun
    (ni 2) (p1 4)
    (b) Hergestellt nach T. G. P r i d h a m und Mitarbeiter, @>A Selection of Media for maintenance and Taxonomic Study of
    Streptomycetes«, Antibiotics Annual 1956; 57, S. 947 bis 953.
    5. Haferflocken-Tomatenpaste-Agar (b)
    Streptomyces psammoticus
    Stamm Cl 2007 Stamm Cl 7190
    (ATCC 14125)
    Wuchs ........................................ mäßig mäßig
    Luftmycel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . gering, weiß bis wasser- gering, weiß bis wasser-
    grün (ec 1) bis schwach grün (ec 1) bis schwach
    olivgelblichgrün (ie 2) olivgelblich (ie 2)
    Sporenbildung .................................. gering gering
    Diffusionsfähiges Pigment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . mäßig, gelb bis braun (gc 3) mäßig, braun (ec 3)
    Rückseite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . braun (1e 5) schwach braun (ie 3) bis
    dunkelbraun (ie 5)
    6. Glycerin-Asparagin-Agar (a)
    Streptomyces psammoticus
    Stamm Cl 2007 Stamm Cl 7190
    (ATCC 14125)
    Wachstum ..................................... gering gering
    Luftmycel...................................... sehr gering, weiß fehlt
    Sporenbildung .................................. fehlt fehlt
    Diffusionsfähiges Pigment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . sehr gering, sehr gering,
    schwach gelb (ia 2) rosa Braun (ge 4)
    Unterseite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . braun (1c 3) schwach gelb (ec 3) mit
    dunkleren Flecken (pi 4)
    7. Glycerin-Glycin-Agar (a)
    Streptomyces psammoticus
    Stamm Cl 2007 Stamm Cl 7190
    (ATCC 14125)
    Wuchs ........................................ mäßig bis gut gut
    Luftmycel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . gering, weiß bis wassergrün gering, weiß mit wassergrün
    (ec 1) bis schwach oliv- (ec 1) bis schwach oliv-
    gelblich (ie 2) gelblichen Flecken (ie 2)
    Sporenbildung .................................. sehr gering gering
    Diffusionsfähiges Pigment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . gering (ne 3) mäßig braun (pi 4)
    Unterseite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . dunkles kastanienbraun tiefes kastanienbraun (p1 5)
    B. Glucose-Asparagin-Fleischextrakt-Agar (b)
    Streptomyces psammoticus
    Stamm Cl 2007 Stamm Cl 7190
    (ATCC 14125)
    Wachstum ..................................... mäßig mäßig
    Luftmycel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . gering, weiß mit wasser- gering, weiß
    grünen (ec 1) Flecken
    Sporenbildung .................................. sehr gering fehlt
    Diffusionsfähiges Pigment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . fehlt praktisch schwach braun (ge 4)
    Unterseite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . schwach braun (ic 3) braun (ge 5)
    9. Kalziummaleat-Agar
    Kalziummaleat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,09
    NH,C1............................ 0,5 g
    K@HP04 . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . 0,5 g
    Agar ............................. 18,0 g
    Destilliertes Wasser, um aufzufüllen auf 1000 cm'
    pH-Wert nach der Sterilisierung ...... 6,4 bis 6,6
    Streptomyces psammoticus
    Stamm Cl 2007 Stamm Cl 7190
    (ATCC 14125)
    Wachstum . . . . . . . . sehr gering sehr gering
    Luftmycel......... fehlt fehlt
    Sporenbildung ..... fehlt I fehlt
    Diffusionsfähiges I
    Pigment . . . . . . . . . fehlt fehlt
    Unterseite ......... farblos farblos
    Kalziummaleat-
    Digestion ....... negativ negativ
    10. Gelatine
    Gelatine Difco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 g
    Fleischextrakt Difco . . . . . . . . . . . . . . . . 3 g
    Pepton Difco ...................... 5 g
    Destilliertes Wasser, um aufzufüllen auf 1000 cm3
    pH-Wert nach der Sterilisierung ..... 6,7 bis 6,8
    Stamm Cl 2007 Stamm Cl 7190
    (ATCC 14125)
    Geringes Wachstum; Geringer Wuchs; vegeta-
    vegetatives Mycel tives Mycel fahlbraun;
    durchsichtig; Luft- Luftmycel fehlt. Sehr
    mycel fehlt. Sehr geringe Verflüssigung,
    geringe Verflüssigung, beschränkt auf die Zone
    beschränktaufdieZone direkt unterhalb der
    unmittelbar unterhalb Kultur; sehr wenig leicht
    der Kultur braunes, lösliches Pigment
    Der Test auf die Erzeugung von melanoidem Pigment, der nach E t t 1 i n g e r und Mitarbeiter, Archiv für Mikrobiologie, 31, S. 326 [1958], und der Test auf die Erzeugung von Schwefelwasserstoff, der nach T r e s n e r und D a n g a, J. Bact., 76, S. 239 [1958], durchgeführt wurde, verlief bei beiden Stämmen negativ.
  • Eine mikroskopische, morphologische Untersuchung der beiden Stämme wurde an Kulturen auf Stärkeagarplatten nach einer Inkubationszeit von 20 Tagen bei einer Temperatur von 28°C vorgenommen. Man stellte fest, daß die morphologischen Eigenschaften genau gleich waren; sie können folgendermaßen zusammengefaßt werden: Sporenträger: Gerade oder leicht gebogen (Sectio: Rectus Flexibilisnach Pridham, Hesseltineund Mitarbeiter, Applied Microbiology, 6, S. 52 bis 79 [1958]), bisweilen mit offenen, unregelmäßigen Krümmungen.
  • Sporen Glatt, im allgemeinen zylindrisch (1,5 bis 6 #t, 1,0 bis 1,3 p,).
  • Vegetatives Mycel: Breite der Hyphen etwa 0,5 #t. Eine der einfachsten Methoden zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im folgenden beschrieben, doch kann man auch auf andere Weise vergleichbare Ergebnisse erzielen, Der Mikroorganismus Str. psammoticus ATCC 14125 (Cl 7190) wird in submersen Kulturen unter praktisch gleichen Bedingungen gezüchtet, wie sie bei der Gewinnung von Tetracyclin unter Verwendung von Str. psammoticus C12007 (beschrieben in »Il Farmaco« Sci. Ed., XV [3], S. 168, 1960) eingehalten werden. Die Beispiele 1 bis 5 dienen der Erläuterung des Fermentationsprozesses. Nach Beendigung der Fermentation wird die Brühe bis zu einem pH-Wert von ungefähr 1,5 angesäuert, um das Antibioticum löslich zu machen, und filtriert, um die klare Lösung vom Mycel zu trennen. Das Filtrat wird dann alkalisch gemacht (pH-Wert von etwa 8,5 bis 9,0) und mit einem nicht mit Wasser mischbaren niederen aliphatischen Alkohol, z. B. Butanol, extrahiert. Der organische Extrakt wiederum wird mit verdünnter Mineralsäure, beispielsweise Salzsäure oder Schwefelsäure, extrahiert. der wäßrige Extrakt wird bei einer Temperatur von nicht mehr als 25'C im Vakuum bis zu einem kleinen Volumen eingedampft und auf einen pH-Wert von ungefähr 5,0 gebracht.
  • Der sich bildende gelbliche Niederschlag wird aufgefangen, gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das Produkt besteht aus fast reinem 6-Desmethyltetracyclin.
  • Zur Analyse werden der filtrierten Brühe nach der Gärung 1 bis 2 Tropfen entnommen und nach der absteigenden Methode chromatographisch analysiert. Dabei werden Streifen von Whatman-Papier n° 1 und als Lösungsmittel mit Wasser gesättigtes Butanol verwendet. Zur Entwicklung läßt man die Streifen 18 bis 20 Stunden lang bei 20@ C stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels werden die Streifen auf Platten gebracht, welche mit Sporen von B. cereus var, mycoides ATCC 9634 geimpften Nähragar enthalten. Die Platten werden bei 32- C 12 bis 14 Stunden lang inkubiert. Eine einzige Inhibitionszone mit dem Rf-Wert 0,30, welcher mit dem bekannten Rf-Wert von 6-Desmethyltetracyclin identisch ist, ist immer sichtbar. Unter den erwähnten Bedingungen zeigt Tetracyclinhydrochlorid den Rf-Wert 0,37, 6-Desmethylchlortetracyclinhydrochlorid den Rf-Wert 0,47 und Chlortetracyclinhydrochlorid den Rf-Wert 0,59.
  • Es ist zu beachten, daß in den Beispielen 1 bis 3 keine Vorkehrungen getroffen sind, um die übliche Chlorionenkonzentration in den gewählten Kulturmedien zu verringern. Wie jedoch durch die Beispiele 4 und 5 gezeigt wird, wurden auch Gärungen in Gegenwart von größeren Mengen eigens zugeführter Chlor-und Bromionen vorgenommen. Das Ergebnis war in jedem Falle das gleiche und immer 6-Desmethyltetracyclin die einzige erhaltene antibiotische Substanz.
  • Beispiel l Ein 500-ml-Kolbeti, der 100 cm' des folgenden Mediums enthielt: Pepton ........................... 10,0 g Costantino-Fleischextrakt . . .. . . . . . . . 1,0 g Dextrose.......................... 20,0 g K2,HPO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0 g MgSO, - 7 HGO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2 g Leitungswasser, um aufzufüllen ... auf 1000 cm3 pH-Wert vor dem Sterilisieren ....... 7,1 (20 Minuten Sterilisierung bei 120`C) wurde mit einer Sporensuspension von S. psammoticus ATCC 14125 (Cl 7190) aus einer Schrägnährbodenkultur auf Carvajal-Haferflocken-Agar inokuliert. Die Kultur wurde 36 Stunden lang in einem Schüttler mit 100 Schwingungen in der Minute bei 28'C inkubiert.
  • Der gesamte Kolbeninhalt wurde zur Inokulierung eines 10-1-Glasvorgärgefäßes, das 41 des folgenden Zuchtmediums enthielt, verwendet: Soyaöl ........................... 5,0 g Maisquellwasser . . . . . . . .. . . . . . . . . . . 15,0 g Cerelose .......................... 35,0 g (NH4)ZS04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6,0 g KH,P04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2 g MgS0, - 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2 g CaCO3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6,0 g Leitungswasser, um aufzufüllen ... auf 1000 cm3 pH-Wert vor der Sterilisierung ....... 7,0 (20 Minuten Sterilisierung bei 120°C) Diese Kultur wurde unter Rühren (750 U/min) und unter Zuführung steriler Luft in einer Menge von 0,75 V/V/min bei 28'C inokuliert. Nach 18 bis 20 Stunden konnte diese Zweitkultur übertragen werden. Das Mycel wies kurze, leicht verzweigte Hyphen auf. 200 cm3 wurden zur Impfung eines 10-1-Gärgefäßes benutzt, welches 41 eines Gärmediums mit folgender Zusammensetzung enthielt: Maisquellwasser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30,0 g (NHQ)ZSOQ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9,0 g Cerelose .......................... 66,0 g MgSO, - 7 11,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0 g K2C03............................ 0,8 g CaCO3 ........................... 9 g pH-Wert nach der Sterilisierung ..... 6,8 bis 6,9 (20 Minuten Sterilisierung bei 120°C) Die Fermentation erfolgte unter Rühren (750 U/min) und unter Belüftung (0,75 V/V/min) bei einer Temperatur von 28°C. Dauer der Fermentation 80 bis 85 Stunden.
  • Die bei dem gewonnenen Material festgestellte antibiotische Wirksamkeit, ausgedrückt in 6-Desmethyltetracyclin, betrug 760 y/cm3.
  • 6-Desmethyltetracyclin war das einzige Antibioticum in der Gärbrühe.
  • Beispiel 2 Unter Verwendung des Stammes Str. psammoticus ATCC 14125, wurde mit 200 cm3 der im Beispiel l hergestellten Zweitkultur ein 10-1-Gärgefäß inokuliert, das 41 des folgenden Zuchtmediums enthielt: Erdnußmehl....................... 30 g Cerelose .......................... 66 g MgS04 - 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0 g (NHQ)ZSOQ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9,0 g KHZPO, .......................... 0,1 g KZC03............................ 0,8 g CaCO3 ........................... 9,0 g Leitungswasser, um aufzufüllen ... auf 1000 cm3 pH-Wert nach der Sterilisierung ...... 6,9 (30 Minuten Sterilisierung bei 120°C) Die Fermentation erfolgte unter Rühren (750 U/min) und unter Zuführung von Luft in einer Menge von 0,75 V/V/min bei einer Temperatur von 28 ° C ; sie dauerte 80 bis 85 Stunden. Die bei dem erhaltenen Material festgestellte antibiotische Wirksamkeit, ausgedrückt in 6-Desmethyltetracyclin, betrug 1080 y/cms.
  • Die papierchromatographische Analyse zeigte, daß als einziges Antibioticum 6-Desmethyltetracyclin in der Gärbrühe vorhanden war.
  • Beispiel 3 Mit 200 cm,' der gemäß Beispiel l hergestellten Zweitkultur wurde ein Gärgefäß mit einem Fassungsvermögen von 101 inokuliert, welches 41 des folgenden Zuchtmediums enthielt: (NHQ)ZSOQ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 g Cerelose .......................... 55 g CaCO3 ........................... 8 g KHZP04 .......................... 0,15 g MgS04 - 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,25 g ZnS04 - 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 mg FeS04-7 H20 ..................... 40 mg MnS04 - 4 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 mg Leitungswasser, um aufzufüllen ... auf 1000 cm3 pH-Wert nach der Sterilisierung ...... 6,9 (20 Minuten Sterilisierung bei 120°C) Die Fermentation erfolgte unter Rühren (750 U/min) und unter Luftzufuhr (0,75 V/V/min) bei einer Temperatur von 28'C, und sie dauerte 80 bis 85 Stunden. Die antibiotische Wirksamkeit, ausgedrückt in 6-Desmethyltetracyclin, betrug 260 y/cms. Die papierchromatographische Analyse zeigte, daß als einziges Antibioticum 6-Desmethyltetracyclin in der Gärbrühe vorhanden war.
  • Beispiel 4 Um zu beweisen, daß die Herstellung von Desmethyltetracyclin aus S. psammoticus ATCC 14125 (C17190) nicht von der Chlorionenkonzentration in dem Fermentationsmedium abhängt, wurde folgender Versuch durchgeführt: Unter den gleichen Bedingungen, wie sie im Beispiel 2 beschrieben sind, mit der Ausnahme, daß dem Gärmedium NaCI in einer Menge von 2 g/1 zugegeben wurde, wurde 6-Desmethyltetracyclin (950 y/cm3) erzeugt.
  • Die chromatographische Analyse des gewonnenen Materials ergab, daß als Antibioticum nur 6-Desmethyltetracyclin in der Brühe enthalten war.
  • Beispiel s Um zu beweisen, daß die Gewinnung von Desmethyltetracyclin aus S. psammoticus ATCC 14125 (C17190) nicht von der Bromionenkonzentration in dem Medium abhängt, wurde folgender Versuch durchgeführt: Unter den gleichen Bedingungen, wie sie im Beispiel 2 beschrieben sind, wobei jedoch dem Gärmedium noch NaBr in einer Menge von 2 g/1 zugegeben wurde, gewann man 6-Desmethyltetracyclin (350 y/cm3).
  • Die chromatographische Analyse des gewonnenen Materials ergab, daß als einziges Antibioticum 6-Desmethyltetracyclin in der Brühe enthalten war.
  • Das 6-Desmethyltetracyclin kann aus der Fermentationsbrühe z. B. wie folgt extrahiert werden: 101 der Brühe, die 810 y/cm3 6-Desmethyltetracyclin enthält, werden mit konzentrierter HCl bis zu einem PH-Wert von 1,5 angesäuert und das Mycel abfiltriert.
  • Das Mycel wird zweimal in einer Volumenmenge Wasser, die einem Fünftel des Gesamtvolumens der Flüssigkeit entspricht, suspendiert und dann filtriert. Die Waschflüssigkeit wird der filtrierten Brühe zugegeben und das Gemisch (12,751) mit 10°/oiger NaOH-Lösung alkalisch gemacht (pH-Wert 8,8) und mit 2,51 Butanol extrahiert.
  • Man erhält 1,51 Butanol mit einer Wirksamkeit von 3090 y/cm3 an 6-Desmethyltetracyclin.
  • Das angereicherte Butanol wird viermal mit jeweils 300 cm3 verdünnter Schwefelsäure (pH-Wert = 1,5) extrahiert.
  • Die wäBrigen Extrakte (1200 cm3), die einen Gehalt von 3100 y/cm3 6-Desmethyltetracyclin aufwiesen, werden im Vakuum bei einer Temperatur von 25°C auf ein Volumen von 400 em3 eingedampft und danach mit 10°/oiger NaOH-Lösung der pH-Wert von 5 eingestellt. Der gelbe Niederschlag wird filtriert, gewaschen und bei einer Temperatur von 50°C im Vakuum getrocknet. Man erhält ein Produkt, dessen 6-Desmethyltetracyclinhydrochlorid-Wirksamkeit 976 y/em' beträgt.

Claims (1)

  1. Patentanspruch: Die Verwendung der Mutante ATCC 14125 von Streptomyces psammoticus zur gärtechnischen Herstellung von 6-Desmethyltetracyclin durch Züchtung in üblichen Nährlösungen unter submersen Bedingungen und Gewinnung des Antibioticums durch Extraktion der vom Mycel befreiten Nährlösung.
DEL38902A 1960-05-04 1961-05-03 Verfahren zur Herstellung von 6-Desmethyltetracyclin Pending DE1160982B (de)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110699314A (zh) * 2019-10-22 2020-01-17 河北圣雪大成制药有限责任公司 一种发酵生产6-去甲基四环素的方法

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CN110699314A (zh) * 2019-10-22 2020-01-17 河北圣雪大成制药有限责任公司 一种发酵生产6-去甲基四环素的方法

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