-
Verfahren zur Herstellung von 6-Desmethyltetracyclin Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Antibioticums 6-Desmethyltetracyclin
auf biologischem Wege.
-
Bekanntlich haben die Antibiotica im allgemeinen während der letzten
Jahre auf dem Gebiete der Humantherapie stetig an Bedeutung gewonnen, und zugleich
ist die Gruppe der Tetracyclinantibiotica wegen der sehr breiten antibakteriellen
Wirksamkeit und wegen der verhältnismäßig geringen Toxizität der einzelnen Substanzen
bei der Behandlung von Infektionskrankheiten an eine hervorragende Stelle getreten.
-
6-Desmethyltetracyclin ist eine der Substanzen, die neuerdings von
besonderem Interesse ist. Es unterscheidet sich vom Tetracyclin dadurch, daß im
Tetracyclinmolekül in 6-Stellung eine Methylgruppe fehlt.
Tetracyclin: R = CH,
6-Desmethyltetracyclin : R = H Zwei Wege zur Herstellung
von 6-Desmethyltetracyclin sind bereits beschrieben worden. Das erste Verfahren
besteht darin, bestimmte Mutantenstämme von Streptomyces aureofaciens zu fermentieren.
-
Bekanntlich erzeugt die Species S. aureofaciens unter den üblichen
Fermentationsbedingungen das Antibioticum Chlortetracyclin, während bei einigen
sorgsam überwachten Abänderungen der Züchtungsmedien gleichzeitig Chlortetracyclin
und Tetracyclin erhalten werden.
-
Dasselbe trifft für das Verhalten des S. aureofaciens und die erwähnten
Mutantenstämme zu. Werden die letzteren in einem der üblichen Züchtungsmedien gezüchtet,
so können sie die antibiotische Substanz 6-Desmethylehlortetracyclin erzeugen, während
bei kontrollierten Bedingungen 6-Desmethyltetracyclin zusammen mit anderen Stoffen
gebildet wird; in beiden Fällen entstehen dabei auch, wie aus der deutschen Auslegeschrift
1041213 hervorgeht, kleinere Mengen Tetracyclin- und Chlortetracyclin.
Die alleinige Gewinnung von 6-Desmethyltetracyclin bedingt deshalb eine mühsame
und die Ausbeute mindernde Methode zur Trennung von den verwandten antibiotischen
Substanzen. Ein anderes bekanntes Verfahren zur Gewinnung von 6-Desmethyltetracyclin
ist die katalytische Hydrierung von 6-Desmethylchlortetracyclin. Dafür ist zunächst
eine Gärungsstufe zur Erzeugung von 6-Desmethylchlortetracyclin notwendig, das dann
zur Trennung von den im Verlaufe der Fermentation gebildeten verwandten Antibiotica
gereinigt werden muß, wonach es hydriert werden kann.
-
Durch die vorliegende Erfindung kann nunmehr reines 6-Desmethyltetracyclin
durch Fermentation einer künstlich gezüchteten Mutante von Streptomyces psammoticus,
welche in der Kulturensammlung von Lepetit unter der Bezeichnung C17190 enthalten
ist, in üblichen Nährmedien hergestellt werden. Der Stamm Cl 7190 ist bei der Amerikanischen
Kulturensammlung (American Type Culture Collection) unter der Nummer 14 125 hinterlegt.
-
Obgleich die Mutante Cl 7190 (ATCC 14 125) in vielen Eigenschaften
dem Mutterstamm gleicht, werden doch Unterschiede deutlich, wenn die beiden Stämme
jeweils in verschiedenen Medien gezüchtet werden.
-
Im folgenden ist ein Vergleich gegeben zwischen den Wachstumseigenschaften
des Stammes Cl 2007, einer wilden Art, und des Stammes Cl 7190, einer 6-Desmethyltetracyclin
erzeugenden Mutante, wobei verschiedene bei 27 bis 29°C inkubierte Medien verwendet
werden.
Zur Farbbestimmung wurde die kleine Farbmeßtafel nach O
s t wv a 1 d, Ausgab;: A, Wissenschaftlicher Verlag, Göttingen, Frankfurt, Berlin,
benutzt.
1. Stärkeagar(a) |
Streptomyces psammoticus |
Stamm Cl 2007 Stamm Cl 7190 |
(ATCC 14125) |
Wachstum ..................................... gering sehr
gering |
Luftmycel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . sehr gering, weiß wird sehr gering. weiß wird |
schwach olivgelblich (ie 2) schw=ach olivgelblich (ie 2) |
Sporenbildung .................................. schwach gering |
Diffusionsfähiges Pigment . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . gering, leicht gelb (ga 2) gering, schwach braun |
bis schwach olivgrün (ge 3) |
(ge 1) |
Rückseite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . schwach olivgelblich (ie 1) braun (ge 4) |
Diastatische Wirksamkeit . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . positiv positiv |
(a) Hergestellt gemäß den in der »Streptomyces Conference Stockholm
1958« aufgestellten Richtlinien. |
2. Czapek-Agarlösung (b) |
Streptomyces psammoticus |
Stamm Cl 2007 Stamm Cl 7'90 |
(ATCC 1415) |
Wachstum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . sehr gering sehr gering |
Luftmycel...................................... fehlt fehlt |
Sporenbildung .................................. fehlt fehlt |
Diffusionsfähiges Pigment . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . fehlt fehlt |
Unterseite ..................................... farblos farblos |
3. Hefeextrakt, Malzextrakt, Agar (b) |
Streptomyces psamtnoticus |
Stamm Cl 2007 Stamm Cl 7190 |
(ATCC 14125) |
Wachstum ..................................... reichlich reichlich |
Luftmycel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . mäßig, weiß bis wassergrün weiß bis wassergrün (ec 1) |
(ec 1) bis schwach bis schwach |
olivgelblich (ie 2) olivgelblich (ie 2) |
Sporenbildung .................... . ............. schwach
sehr gering |
Diffusionsfähiges Pigment . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . gering, gelb (ga 2) braun (ie 3) |
bis braun (ne 3) |
Unterseite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . dunkelbraun (pg 4) kastanienbraun (ie 4) |
4. Haferflocken-Agar nach C a r v a j a 1 (b) |
Streptomyces psammoticus |
Stamm Cl 7190 |
Stamm Cl 2007 (ATCC 14125) |
Wachstum ..................................... üppig üppig |
Luftmycel ...................................... weiß bis wassergrün
(ec 1) weiß bis wassergrün (ec 1) |
bis grün-olivgelblich bis grün-olivgelblich |
(ie 2 ?) (ie 2) |
Sporenbildung ..................... . ............ üppig
üppig |
Diffusionsfähiges Pigment . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . reichlich, gelb (-a 2) braun ()ig 3) |
bis kastanienbraun- |
grüngelb (1g 2) |
Rückseite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . kastanienbraun-grüngelb dunkles kastanienbraun |
(ni 2) (p1 4) |
(b) Hergestellt nach T. G. P r i d h a m und Mitarbeiter, @>A
Selection of Media for maintenance and Taxonomic Study of |
Streptomycetes«, Antibiotics Annual 1956; 57, S. 947 bis 953. |
5. Haferflocken-Tomatenpaste-Agar (b) |
Streptomyces psammoticus |
Stamm Cl 2007 Stamm Cl 7190 |
(ATCC 14125) |
Wuchs ........................................ mäßig mäßig |
Luftmycel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . gering, weiß bis wasser- gering, weiß bis wasser- |
grün (ec 1) bis schwach grün (ec 1) bis schwach |
olivgelblichgrün (ie 2) olivgelblich (ie 2) |
Sporenbildung .................................. gering gering |
Diffusionsfähiges Pigment . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . mäßig, gelb bis braun (gc 3) mäßig, braun (ec 3) |
Rückseite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . braun (1e 5) schwach braun (ie 3) bis |
dunkelbraun (ie 5) |
6. Glycerin-Asparagin-Agar (a) |
Streptomyces psammoticus |
Stamm Cl 2007 Stamm Cl 7190 |
(ATCC 14125) |
Wachstum ..................................... gering gering |
Luftmycel...................................... sehr gering,
weiß fehlt |
Sporenbildung .................................. fehlt fehlt |
Diffusionsfähiges Pigment . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . sehr gering, sehr gering, |
schwach gelb (ia 2) rosa Braun (ge 4) |
Unterseite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . braun (1c 3) schwach gelb (ec 3) mit |
dunkleren Flecken (pi 4) |
7. Glycerin-Glycin-Agar (a) |
Streptomyces psammoticus |
Stamm Cl 2007 Stamm Cl 7190 |
(ATCC 14125) |
Wuchs ........................................ mäßig bis gut
gut |
Luftmycel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . gering, weiß bis wassergrün gering, weiß mit wassergrün |
(ec 1) bis schwach oliv- (ec 1) bis schwach oliv- |
gelblich (ie 2) gelblichen Flecken (ie 2) |
Sporenbildung .................................. sehr gering
gering |
Diffusionsfähiges Pigment . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . gering (ne 3) mäßig braun (pi 4) |
Unterseite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . dunkles kastanienbraun tiefes kastanienbraun (p1 5) |
B. Glucose-Asparagin-Fleischextrakt-Agar (b) |
Streptomyces psammoticus |
Stamm Cl 2007 Stamm Cl 7190 |
(ATCC 14125) |
Wachstum ..................................... mäßig mäßig |
Luftmycel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . gering, weiß mit wasser- gering, weiß |
grünen (ec 1) Flecken |
Sporenbildung .................................. sehr gering
fehlt |
Diffusionsfähiges Pigment . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . fehlt praktisch schwach braun (ge 4) |
Unterseite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . schwach braun (ic 3) braun (ge 5) |
9. Kalziummaleat-Agar |
Kalziummaleat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10,09 |
NH,C1............................ 0,5 g |
K@HP04 . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . 0,5
g |
Agar ............................. 18,0 g |
Destilliertes Wasser, um aufzufüllen auf 1000 cm' |
pH-Wert nach der Sterilisierung ...... 6,4 bis 6,6 |
Streptomyces psammoticus |
Stamm Cl 2007 Stamm Cl 7190 |
(ATCC 14125) |
Wachstum . . . . . . . . sehr gering sehr gering |
Luftmycel......... fehlt fehlt |
Sporenbildung ..... fehlt I fehlt |
Diffusionsfähiges I |
Pigment . . . . . . . . . fehlt fehlt |
Unterseite ......... farblos farblos |
Kalziummaleat- |
Digestion ....... negativ negativ |
10. Gelatine |
Gelatine Difco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
g |
Fleischextrakt Difco . . . . . . . . . . . . . . . . 3 g |
Pepton Difco ...................... 5 g |
Destilliertes Wasser, um aufzufüllen auf 1000 cm3 |
pH-Wert nach der Sterilisierung ..... 6,7 bis 6,8 |
Stamm Cl 2007 Stamm Cl 7190 |
(ATCC 14125) |
Geringes Wachstum; Geringer Wuchs; vegeta- |
vegetatives Mycel tives Mycel fahlbraun; |
durchsichtig; Luft- Luftmycel fehlt. Sehr |
mycel fehlt. Sehr geringe Verflüssigung, |
geringe Verflüssigung, beschränkt auf die Zone |
beschränktaufdieZone direkt unterhalb der |
unmittelbar unterhalb Kultur; sehr wenig leicht |
der Kultur braunes, lösliches Pigment |
Der Test auf die Erzeugung von melanoidem Pigment, der nach E t t 1 i n g e r und
Mitarbeiter, Archiv für Mikrobiologie, 31, S. 326 [1958], und der Test auf die Erzeugung
von Schwefelwasserstoff, der nach T r e s n e r und D a n g a, J. Bact., 76, S.
239 [1958], durchgeführt wurde, verlief bei beiden Stämmen negativ.
-
Eine mikroskopische, morphologische Untersuchung der beiden Stämme
wurde an Kulturen auf Stärkeagarplatten nach einer Inkubationszeit von 20 Tagen
bei einer Temperatur von 28°C vorgenommen. Man stellte fest, daß die morphologischen
Eigenschaften genau gleich waren; sie können folgendermaßen zusammengefaßt werden:
Sporenträger: Gerade oder leicht gebogen (Sectio: Rectus Flexibilisnach Pridham,
Hesseltineund Mitarbeiter, Applied Microbiology, 6, S. 52 bis 79 [1958]), bisweilen
mit offenen, unregelmäßigen Krümmungen.
-
Sporen Glatt, im allgemeinen zylindrisch (1,5 bis 6 #t, 1,0 bis 1,3
p,).
-
Vegetatives Mycel: Breite der Hyphen etwa 0,5 #t. Eine der einfachsten
Methoden zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im folgenden beschrieben,
doch kann man auch auf andere Weise vergleichbare Ergebnisse erzielen, Der Mikroorganismus
Str. psammoticus ATCC 14125 (Cl 7190) wird in submersen Kulturen unter praktisch
gleichen Bedingungen gezüchtet, wie sie bei der Gewinnung von Tetracyclin unter
Verwendung von Str. psammoticus C12007 (beschrieben in »Il Farmaco« Sci. Ed., XV
[3], S. 168, 1960) eingehalten werden. Die Beispiele 1 bis 5 dienen der Erläuterung
des Fermentationsprozesses. Nach Beendigung der Fermentation wird die Brühe bis
zu einem pH-Wert von ungefähr 1,5 angesäuert, um das Antibioticum löslich zu machen,
und filtriert, um die klare Lösung vom Mycel zu trennen. Das Filtrat wird dann alkalisch
gemacht (pH-Wert von etwa 8,5 bis 9,0) und mit einem nicht mit Wasser mischbaren
niederen aliphatischen Alkohol, z. B. Butanol, extrahiert. Der organische Extrakt
wiederum wird mit verdünnter Mineralsäure, beispielsweise Salzsäure oder Schwefelsäure,
extrahiert. der wäßrige Extrakt wird bei einer Temperatur von nicht mehr als 25'C
im Vakuum bis zu einem kleinen Volumen eingedampft und auf einen pH-Wert von ungefähr
5,0 gebracht.
-
Der sich bildende gelbliche Niederschlag wird aufgefangen, gewaschen
und im Vakuum getrocknet. Das Produkt besteht aus fast reinem 6-Desmethyltetracyclin.
-
Zur Analyse werden der filtrierten Brühe nach der Gärung 1 bis 2 Tropfen
entnommen und nach der absteigenden Methode chromatographisch analysiert. Dabei
werden Streifen von Whatman-Papier n° 1 und als Lösungsmittel mit Wasser gesättigtes
Butanol verwendet. Zur Entwicklung läßt man die Streifen 18 bis 20 Stunden lang
bei 20@ C stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels werden die Streifen auf Platten
gebracht, welche mit Sporen von B. cereus var, mycoides ATCC 9634 geimpften Nähragar
enthalten. Die Platten werden bei 32- C 12 bis 14 Stunden lang inkubiert. Eine einzige
Inhibitionszone mit dem Rf-Wert 0,30, welcher mit dem bekannten Rf-Wert von 6-Desmethyltetracyclin
identisch ist, ist immer sichtbar. Unter den erwähnten Bedingungen zeigt Tetracyclinhydrochlorid
den Rf-Wert 0,37, 6-Desmethylchlortetracyclinhydrochlorid den Rf-Wert 0,47 und Chlortetracyclinhydrochlorid
den Rf-Wert 0,59.
-
Es ist zu beachten, daß in den Beispielen 1 bis 3 keine Vorkehrungen
getroffen sind, um die übliche Chlorionenkonzentration in den gewählten Kulturmedien
zu verringern. Wie jedoch durch die Beispiele 4 und 5 gezeigt wird, wurden auch
Gärungen in Gegenwart von größeren Mengen eigens zugeführter Chlor-und Bromionen
vorgenommen. Das Ergebnis war in jedem Falle das gleiche und immer 6-Desmethyltetracyclin
die einzige erhaltene antibiotische Substanz.
-
Beispiel l Ein 500-ml-Kolbeti, der 100 cm' des folgenden Mediums enthielt:
Pepton ........................... 10,0 g Costantino-Fleischextrakt . . .. . . .
. . . . 1,0 g Dextrose.......................... 20,0 g K2,HPO. . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0 g MgSO, - 7 HGO . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 0,2 g Leitungswasser, um aufzufüllen ... auf 1000 cm3 pH-Wert
vor dem Sterilisieren ....... 7,1 (20 Minuten Sterilisierung bei 120`C)
wurde
mit einer Sporensuspension von S. psammoticus ATCC 14125 (Cl 7190) aus einer Schrägnährbodenkultur
auf Carvajal-Haferflocken-Agar inokuliert. Die Kultur wurde 36 Stunden lang in einem
Schüttler mit 100 Schwingungen in der Minute bei 28'C inkubiert.
-
Der gesamte Kolbeninhalt wurde zur Inokulierung eines 10-1-Glasvorgärgefäßes,
das 41 des folgenden Zuchtmediums enthielt, verwendet: Soyaöl ...........................
5,0 g Maisquellwasser . . . . . . . .. . . . . . . . . . . 15,0 g Cerelose ..........................
35,0 g (NH4)ZS04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6,0 g KH,P04 .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2 g MgS0, - 7 H20 . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . 0,2 g CaCO3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 6,0 g Leitungswasser, um aufzufüllen ... auf 1000 cm3 pH-Wert
vor der Sterilisierung ....... 7,0 (20 Minuten Sterilisierung bei 120°C)
Diese Kultur wurde unter Rühren (750 U/min) und unter Zuführung steriler Luft in
einer Menge von 0,75 V/V/min bei 28'C inokuliert. Nach 18 bis 20 Stunden
konnte diese Zweitkultur übertragen werden. Das Mycel wies kurze, leicht verzweigte
Hyphen auf. 200 cm3 wurden zur Impfung eines 10-1-Gärgefäßes benutzt, welches 41
eines Gärmediums mit folgender Zusammensetzung enthielt: Maisquellwasser . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . 30,0 g (NHQ)ZSOQ . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . 9,0 g Cerelose .......................... 66,0 g MgSO, - 7 11,0 .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0 g K2C03............................ 0,8
g CaCO3 ........................... 9 g pH-Wert nach der Sterilisierung
..... 6,8 bis 6,9 (20 Minuten Sterilisierung bei 120°C) Die Fermentation
erfolgte unter Rühren (750 U/min) und unter Belüftung (0,75 V/V/min) bei einer Temperatur
von 28°C. Dauer der Fermentation 80 bis 85 Stunden.
-
Die bei dem gewonnenen Material festgestellte antibiotische Wirksamkeit,
ausgedrückt in 6-Desmethyltetracyclin, betrug 760 y/cm3.
-
6-Desmethyltetracyclin war das einzige Antibioticum in der Gärbrühe.
-
Beispiel 2 Unter Verwendung des Stammes Str. psammoticus ATCC 14125,
wurde mit 200 cm3 der im Beispiel l hergestellten Zweitkultur ein 10-1-Gärgefäß
inokuliert, das 41 des folgenden Zuchtmediums enthielt: Erdnußmehl.......................
30 g Cerelose .......................... 66 g MgS04 - 7 H20 . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . 1,0 g (NHQ)ZSOQ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . 9,0 g KHZPO, .......................... 0,1 g KZC03............................
0,8 g CaCO3 ........................... 9,0 g Leitungswasser, um aufzufüllen
... auf 1000 cm3 pH-Wert nach der Sterilisierung ...... 6,9 (30 Minuten
Sterilisierung bei 120°C) Die Fermentation erfolgte unter Rühren (750 U/min) und
unter Zuführung von Luft in einer Menge von 0,75 V/V/min bei einer Temperatur von
28 ° C ; sie dauerte 80 bis 85 Stunden. Die bei dem erhaltenen Material festgestellte
antibiotische Wirksamkeit, ausgedrückt in 6-Desmethyltetracyclin, betrug 1080 y/cms.
-
Die papierchromatographische Analyse zeigte, daß als einziges Antibioticum
6-Desmethyltetracyclin in der Gärbrühe vorhanden war.
-
Beispiel 3 Mit 200 cm,' der gemäß Beispiel l hergestellten Zweitkultur
wurde ein Gärgefäß mit einem Fassungsvermögen von 101 inokuliert, welches 41 des
folgenden Zuchtmediums enthielt: (NHQ)ZSOQ . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . 10 g Cerelose .......................... 55 g CaCO3 ...........................
8 g KHZP04 .......................... 0,15 g MgS04 - 7 H20 . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . 0,25 g ZnS04 - 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
mg FeS04-7 H20 ..................... 40 mg MnS04 - 4 H20 . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 50 mg Leitungswasser, um aufzufüllen ... auf 1000 cm3 pH-Wert
nach der Sterilisierung ...... 6,9 (20 Minuten Sterilisierung bei 120°C)
Die Fermentation erfolgte unter Rühren (750 U/min) und unter Luftzufuhr (0,75 V/V/min)
bei einer Temperatur von 28'C, und sie dauerte 80 bis 85 Stunden. Die antibiotische
Wirksamkeit, ausgedrückt in 6-Desmethyltetracyclin, betrug 260 y/cms. Die papierchromatographische
Analyse zeigte, daß als einziges Antibioticum 6-Desmethyltetracyclin in der Gärbrühe
vorhanden war.
-
Beispiel 4 Um zu beweisen, daß die Herstellung von Desmethyltetracyclin
aus S. psammoticus ATCC 14125 (C17190) nicht von der Chlorionenkonzentration in
dem Fermentationsmedium abhängt, wurde folgender Versuch durchgeführt: Unter den
gleichen Bedingungen, wie sie im Beispiel 2 beschrieben sind, mit der Ausnahme,
daß dem Gärmedium NaCI in einer Menge von 2 g/1 zugegeben wurde, wurde 6-Desmethyltetracyclin
(950 y/cm3) erzeugt.
-
Die chromatographische Analyse des gewonnenen Materials ergab, daß
als Antibioticum nur 6-Desmethyltetracyclin in der Brühe enthalten war.
-
Beispiel s Um zu beweisen, daß die Gewinnung von Desmethyltetracyclin
aus S. psammoticus ATCC 14125 (C17190) nicht von der Bromionenkonzentration
in dem Medium abhängt, wurde folgender Versuch durchgeführt: Unter den gleichen
Bedingungen, wie sie im Beispiel 2 beschrieben sind, wobei jedoch dem Gärmedium
noch NaBr in einer Menge von 2 g/1 zugegeben wurde, gewann man 6-Desmethyltetracyclin
(350 y/cm3).
-
Die chromatographische Analyse des gewonnenen Materials ergab, daß
als einziges Antibioticum 6-Desmethyltetracyclin in der Brühe enthalten war.
-
Das 6-Desmethyltetracyclin kann aus der Fermentationsbrühe z. B. wie
folgt extrahiert werden: 101 der Brühe, die 810 y/cm3 6-Desmethyltetracyclin enthält,
werden mit konzentrierter HCl bis zu einem PH-Wert von 1,5 angesäuert und das Mycel
abfiltriert.
-
Das Mycel wird zweimal in einer Volumenmenge Wasser, die einem Fünftel
des Gesamtvolumens der Flüssigkeit entspricht, suspendiert und dann filtriert.
Die
Waschflüssigkeit wird der filtrierten Brühe zugegeben und das Gemisch (12,751) mit
10°/oiger NaOH-Lösung alkalisch gemacht (pH-Wert 8,8) und mit 2,51 Butanol extrahiert.
-
Man erhält 1,51 Butanol mit einer Wirksamkeit von 3090 y/cm3 an 6-Desmethyltetracyclin.
-
Das angereicherte Butanol wird viermal mit jeweils 300 cm3 verdünnter
Schwefelsäure (pH-Wert = 1,5) extrahiert.
-
Die wäBrigen Extrakte (1200 cm3), die einen Gehalt von 3100 y/cm3
6-Desmethyltetracyclin aufwiesen, werden im Vakuum bei einer Temperatur von 25°C
auf ein Volumen von 400 em3 eingedampft und danach mit 10°/oiger NaOH-Lösung der
pH-Wert von 5 eingestellt. Der gelbe Niederschlag wird filtriert, gewaschen und
bei einer Temperatur von 50°C im Vakuum getrocknet. Man erhält ein Produkt, dessen
6-Desmethyltetracyclinhydrochlorid-Wirksamkeit 976 y/em' beträgt.