DE3006215A1

DE3006215A1 - Verfahren zur herstellung von monacolin k

Info

Publication number: DE3006215A1
Application number: DE19803006215
Authority: DE
Inventors: Kouhei Furuya; Seigo Iwado; Kuroda Masao; Kazuhiko Tanzawa; Yoshio Tsujita
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1979-05-11
Filing date: 1980-02-20
Publication date: 1980-11-27
Also published as: IE49749B1; KR830002329B1; DE3051097C2; US4323648A; AU5667880A; JPS55150898A; DK148807C; NL8001697A; ES489751A0; CH645891A5; KR830002875A; AT372975B; GB2049664A; BE882325A; IT1133075B; ES8104409A1; CA1129795A; SE8701483L; AU534647B2; DK148807B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahrenzur Herstellung eines antihypercholesterinämischen Mittels der Bezeichnung Monacolin K durch Züchtung von bestimmten spezifischen Mikroorganismen des Genus Monascus.

Es wurde gefunden, daß Monacolin K, eine Verbindung der Formel

besonders wertvolle Aktivität gegen Hyperlipämie, speziell gegen Hypercholesterinämie, besitzt.

Es ist anerkannt, daß ein hoher Blutcholesterinspiegel eine der Hauptursachen für Herzkrankheiten, wie Herzinfarkt oder Arteriosklerose, ist. Aus diesem Grund wurde eine beträchtlicher Forschungsaufwand unternommen, um physiologisch geeignete Substanzen aufzufinden, die zum Inhibieren der Biosynthese von Cholesterin und somit zur Erniedrigung des Blutcholesterinspiegels befähigt sind. Eine solche Verbindung ist Monacolin K, die Gegenstand der deutschen Patentanmeldung P ist und die durch Züchtung von Mikroorganismen

des Genus Monascus gebildet werden kann.

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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Monacolin K durch Züchtung eines oder mehrerer der Mikroorganismen Monascus anka SANK 10171 (IFO 6540), Monascus purpurous SANK 10271 (IFO 4513), Monascus ruber SANK 10671 (FERM 4958), Monascus vitreus SANK 10960 (FERM 4960), Monascus paxii SANK 11172 (IFO 8201), Monascus ruber SANK 13778 (FERM 4959), Monascus ruber SANK 15177 (FERM 4956) oder Monascus ruber SANK 18174 (FERM 4957)in einem dafür geeigneten Kulturmedium und Isolieren von Monacolin K aus dem erhaltenen Kulturmedium.

Monascus ruber SANK 10671, Monascus ruber SANK 13778, Monascus ruber SANK 15177 und Monascus ruber SANK 18174 sind neu isolierte Mikroorganismen, die nachstehend beschrieben werden. Die übrigen genannten Mikroorganismen sind bekannt und wurden bereits beschrieben. Alle angegebenen Mikroorganismen sind von den Hinterlegungsstellen IFO oder FERM leicht erhältlich (Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan), wie durch die in Klammern angegebenen Hinterlegungsnummern ersichtlich ist.

Die neuen Mikroorganismen besitzen folgende mikrobiologische Eigenschaften :

Monascus ruber SANK 15177 (FERM 4956)

Dieser Stamm wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die bei Tukimono, Yamato-city, Kanagwa-Präfektur, Japan aufgefunden wurde und wurde am 27. April 1979 unter der Hinterlegungsnummer 4956 bei dem Fermentation Research Institute hinterlegt.

Der Stamm zeigt gutes Wachstum auf einem Kartoffel-Glucose-Agarmedium bei 25⁰C und bildet einen löslichen Farbstoff, der dem Medium einen gelblich-braunen bis rötlich-braunen Farbton verleiht. Er bildet einige Kleistothezien auf der Basalschicht der Hyphen.

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Auf Hafermehl-Agarmedium bildet er einen blaßbraunen Farbstoff und zeigt gutes Wachstum. Die Bildung von Kleistothezien ist gut und die gebildeten Kleistothezien sind kugelig, haben einen Durchmesser von 30 bis 60 μπι und sind auf kurzen Stielen ausgebildet. Diese Stiele sind nahezu farblos und verzweigt und haben eine Größe von 25 bis 60 χ 3,5 bis 5,0 μπι. Die Asci sind verschwindend klein und somit schwierig zu beobachten. Die Ascosporen sind farblos und ellipsoid und haben Abmessungen von 4,5 bis 6,5 χ 4,0 bis 5,0 μπι und zeigen glatte Oberflächen. Die Konidien sind basipetal verbunden und haben eine Größe von 7,0 bis 10,0 χ 6,0 bis 10,0 μΐη. Ihre Gewebe sind unterbrochen.

Obwohl der Stamm bei 37⁰C wächst, ist das beste Wachstum zwischen 23 und 30⁰C zu beobachten.

Monascus ruber SANK 10671 (FERM 4958)

Dieser Stamm wurde aus einer Bodenprobe aus Shinagawa-ku, Tokyo, Japan, isoliert und wurde am 27. April 1979 bei dem Fermentation Research Institute unter der Hinterlegungsnummer 4958 hinterlegt.

Das Wachstum auf Kartoffel-Glucose-Agar- und Hafermehl-Agarmedium ist ähnlich dem des Stammes SANK 15177, mit der Ausnahme, daß der gebildete lösliche Farbstoff dunkelrot ist. Die Kleistothezien haben einen Durchmesser von 30 bis 80 μπι und die Abmessungen der Stiele betragen 30 bis 70 x 3,0 bis 5,0 μπι. Die Bildung von Asci wird nicht beobachtet. Die Ascosporen sind farblos und ellipsoid und haben Abmessungen von 4,5 bis 6,5 χ 4,0 bis 5,0 μπι. Die Konidien sind farblos und birnenförmig oder eiförmig und haben Abmessungen von 6,0 bis 10,0 bis 6,0 bis 8,5 μπι.

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Monascus ruber SANK 13778 (FERM 4959)

Dieser Stamm wurde aus einer Bodenprobe von Inawashiro-cho, Nagata, Yama-gun, Fukushima-Präfektur, Japan isoliert und wurde am 27. April 1979 unter der Hxnterlegungsnummer 4959 bei dem Fermentation Research Institute hinterlegt.

Das Wachstum auf Kartoffel-Glucose-Agar- und Hafermehl-Agarmedium ist ähnlich dem des Stammes SANK 15177, mit der Ausnahme, daß der gebildete lösliche Farbstoff blaßrötlich-braune bis rötlich-braune Färbung hat. Die Kleistothezien haben einen Durchmesser von 35 bis 75 μπι und die Stiele haben Abmessungen von 30 bis 70 χ 3,5 bis 5,0 um. Ascien werden nicht beobachtet. Die Ascosporen sind farblos und ellipsoid und haben eine Größe von 4,5 bis 6,0 χ 4,0 bis 5,0 μΐη und besitzen glatte Oberflächen. Die Abmessungen der Konidien betragen 7,0 bis 10,0 χ 6,0 bis 10,0 μΐη.

Monascus ruber SANK 18174 (FERM 4957)

Dieser Stamm wurde aus einer Bodenprobe von Shakotan-cho, Shatotan-gun, Shiribeshi Shicho, Kokkaido-Präfektur, Japan isoliert und wurde am 27. April 1979 bei dem Fermentation Research Institute unter der Hinterlegungsnummer 4957 hinterlegt.

Das Wachstum des Stammes auf Kartoffel-Glucose-Agar- und Hafermehl-Agarmedium ist ähnlich dem von Stamm SANK 15177, mit der Ausnahme, daß der gebildete Farbstoff blaßrosa ist. Die Kleistothezien haben einen Durchmesser von 20 bis 70 μΐη und die Abmessungen der Stiele betragen 20 bis 60 χ 3,0 bis 5,0 μΐη. Ascien werden nicht beobachtet. Die Ascosporen sind farblos und ellipsoid und haben Abmessungen von 5,0 bis 7,0 χ 4,0 bis 5,5 μΐη; ihre Oberflächen sind glatt. Die Konidien sind basipetal miteinander verknüpft und farblos. Die meisten Konidien

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sind birnenförmig und haben Abmessungen von 6,0 bis 9,5 χ 6,0 bis 10,0 um.

Aufgrund der oben angegebenen, beobachteten Eigenschaften wurden diese Mikroorganismen als Stämme von Monascus ruber van Tieghem identifiziert.

über die mikrobiologischen Eigenschaften von Monascus ruber wurde in nachstehenden Veröffentlichungen berichtet : Takada, Transactions of the Micological Society of Japan, 9, 125 - 130 (1969) (Materials for the Fungus Flora of Japan (7)) und van Tieghem, Bull. Soc. Botan. France, 31, 227 (1884). über die Bildung von Ascosporen des Stammes wurde von CoIe et al in the Canadian Journal of Botany, 46, 987 (1968), "Conidium ontogeny in hyphomycetes. The imperfect state of Monascus ruber and its meristem arthrospores" berichtet.

Monacolin K kann hergestellt werden, indem der gewählte Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium unter Anwendung der Methoden gezüchtet wird, die auf diesem Fachgebiet zur Züchtung von Fungi und anderen Mikroorganismen gut bekannt sind. So kann beispielsweise der gewählte Stamm von Monascus zuerst auf einem geeigneten Medium gezüchtet werden und der gebildete Mikroorganismus danach gewonnen und dann in ein anderes Kulturmedium eingeimpft und in diesem gezüchtet werden, um das gewünschte Monacolin K herzustellen. Das für die Vermehrung des Mikroorganismus verwendete Kulturmedium und das für die Bildung von Monacolin K verwendete Kulturmedium können gleich oder verschieden sein.

Jedes auf dem Fachgebiet zur Züchtung von Fungi bekannte Kulturmedium kann verwendet werden, vorausgesetzt, daß es - wie gut bekannt ist - die erforderlichen Nährstoffe enthält, insbesondere eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle. Zu Beispielen für geeignete

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Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff gehören Glucose, Maltose, Dextrin, Stärke, Lactose, Saccharose und Glycerin. Unter diesen Kohlenstoffquellen werden Glucose, Glycerin und Stärke zur Bildung von Monacolin K speziell bevorzugt. Zu Beispielen für geeignete Quellen für assimilierbaren Stickstoff gehören Pepton, Fleischextrakt, Hefe, Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Maisquellflüssigkeit, Reiskleie und anorganische Stickstoffquellen. Unter diesen Stickstoffquellen wird Pepton besonders bevorzugt. Wenn Monacolin K gebildet wird, kann erforderlichenfalls dem Kulturmedium ein anorganisches Salz und/oder ein Metallsalz zugesetzt werden. Außerdem können erforderlichenfalls geringe Mengen an Schwermetallen zugesetzt werden.

Der Mikroorganismus wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen unter Anwendung auf dem Fachgebiet gut bekannter Züchtungsmethoden gezüchtet, beispielsweise in Festkultur, Schüttelkultur oder Kultur unter Belüftung und Rühren. Der Mikroorganismus wächst innerhalb eines breiten Temperaturbereiches, beispielsweise von 7 bis 40⁰C; insbesondere zur Herstellung von Monacolin K liegt jedoch der stärker bevorzugte Bereich der Züchtungstemperatur innerhalb 20 bis 30⁰C.

Während der Züchtung des Mikroorganismus kann die Bildung von Monacolin K überwacht werden", indem Proben aus dem Kulturmedium entnommen werden und die physiologische Aktivität von Monacolin K in dem Kulturmedium mit Hilfe der nachstehend beschriebenen Tests gemessen wird. Die Züchtung kann dann fortgesetzt werden, bis in dem Kulturmedium eine wesentliche Anreicherung von Monacolin K erreicht ist. Zu diesem Zeitpunkt kann Monacolin K aus dem Kulturmedium und den Geweben der Mikroorganismen mit Hilfe jeder geeigneten Kombination von Isoliermethoden, die im Hinblick auf seine physikalischen und chemischen Eigenschaften ausgewählt werden, isoliert und gewonnen werden.So können beispielsweise beliebige oder alle der nachstehenden Isoliermethoden angewendet werden : Extraktion der Flüssigkeit aus der

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Kulturbrühe mit einem hydrophilen Lösungsmittel, wie Diäthylather/ Äthylacetat, Chloroform oder Benzol, Extration des Organismus mit einem hydrophilen Lösungsmittel, wie Aceton oder einem Alkohol; Konzentrieren, beispielsweise durch Verdampfen eines Teils des Lösungsmittels unter vermindertem Druck; Lösen in einem stärker polaren Lösungsmittel (wie Aceton oder einem Alkohol); Entfernen von Verunreinigungen mit einem weniger polaren Lösungsmittel (wie Petroläther oder Hexan); Gelfiltration durch eine mit einem Material, wie Sephadex (Handelsname der Pharmacia Co., Ltd., USA) gefüllte Kolonne; Absorptionschromatographie mit Aktivkohle oder Silicagel; sowie durch die Anwendung anderer ähnlicher Methoden.

Durch Anwendung einer geeigneten Kombination dieser Verfahrensweisen kann das gewünschte Monacolin K in Form einer reinen Substanz aus der Kulturbrühe isoliert werden.

Es wurde gefunden, daß das mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellte Monacolin K folgende charakteristische Eigenschaften besitzt :

1) Farbe und Form

farblose Nadeln

2) Schmelzpunkt

157 - 158°C

3) Elementaranalyse :

Gefunden : C : 72,67 %; H : 9,13 %; 0 : 18,2 % Berechnet : C : 71,25 %; H : 8,97 %; O : 19,78 %

4) Molekulargewicht

404 (bestimmt durch Massenspektro-

metrie)

5) Molekularformel

^C24°36°5

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6) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (Methanol) : Maxima bei 232, 238 und 246 μπι

7) Löslichkeit

Leicht löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Äthylacetat, Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff.

Löslich in Benzol.

Unlöslich in Hexan und Petroläther.

8) Farbreaktion :

Rosa Färbung mit 50 % (Volumen/Volumen) Schwefelsäure in dem Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel.

9) Dünnschichtchromatographie :

R_f-Wert = 0,45 (Silicagel F₃₅₄ der Merck und Co., Ltd.), Dicke 0,25 mm, Mehrfach-(3 x) Entwicklung mit einem Gemisch aus Methylenchlorid und Äthylacetat im Volumverhältnis 7:3, Behandlung mit Jod oder 50 %iger (Volumen/Volumen) Schwefelsäure.

Die Verbindung reagiert neutral und ist unlöslich in neutralen oder sauren wässrigen Medien. Sie wird jedoch durch Behandlung mit Alkalien in eine saure Substanz übergeführt und diese saure Substanz ist wasserlöslich. Die saure Substanz kann mit Äthylacetat oder Chloroform bei sauren pH-Werten extrahiert werden und geht beim Verdampfen des Lösungsmittels wieder in Monacolin K über.

Die physiologische Aktivität von Monacolin K kann mit Hilfe der nachstehend beschriebenen In vivo- und In vitro-Tests nachgewiesen und quantitativ bestimmt werden. Diese Tests können im Verlauf des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Überwachen der Bildung von Monacolin K angewendet werden.

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In_vivo3Test_an_Kaninchen

In diesem Test wird die Fähigkeit von Monacolin K zur Verminderung des Cholesterinspiegels im Blut von Kaninchen gemessen. Die verwendeten Tiere sollten ein Gewicht von jeweils 2,5 bis 3,0 kg haben. Zu Beginn des Tests wird Blut aus der Ohrvene jedes Kaninchens entnommen und der Cholesterinspiegel des Blutserums wird mit Hilfe einer üblichen Methode gemessen. Eine vorbestimmte Menge von Monacolin K oder einer Monacolin K enthaltenden Kulturbrühe wird dann während 1 bis 5 Tagen auf oralem Weg kontinuierlich verabreicht und der Cholesterinspiegel im Blutserum wird stufenweise nach der Verabreichung gemessen. Die Wirkung (Potenz)von Monacolin K oder des Monacolin K enthaltenden Kulturmediums kann quantitativ aus dem Blutcholesterinspiegel bestimmt werden, der vor der und nach der Verabreichung von Monacolin K gemessen wurde.

In_vitro-Test_an_der_Rattenleber

Rohenzym aus der Rattenleber wird 60 Minuten lang bei 37⁰C mit radioaktiver Essigsäure umgesetzt. Das dabei durch Biosynthese gebildete radioaktive Cholesterin wird verseift und dann mit Digitonin ausgefällt. Die Radioaktivität wird gemessen, um die Menge des gebildeten Cholesterins zu bestimmen. Das Verfahren wird wiederholt, mit der Abänderung, daß Monacolin K oder eine Monacolin K enthaltende Kulturbrühe zu Beginn der Reaktion zugesetzt wird. Die Menge des durch Biosynthese gebildeten Cholesterins wird erneut bestimmt, wodurch eine quantitative Messung der inhibierenden Wirkung von Monacolin K erreicht wird (Bricker et al, The Journal of Biological Chemistry, 247, 4914 (1972)). Dieser Test ist besonders wertvoll als rasche und leichte Methode zur Überwachung der Bildung von Monacolin K während des erfindungsgemäßen mikrobiologischen Züchtungsverfahrens.

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Die Anmelderin hat außerdem die Fähigkeit von Monacolin K zur Verminderung des Blut- und Leber-Cholesterinspiegels durch verschiedene In vivo-Tests nachgewiesen.

Ratten

Die verwendeten Versuchstiere waren Ratten des Wistar-Imamichi-Stammes mit einem Körpergewicht von jeweils etwa 300 g. Die Tests wurden an Gruppen von Ratten aus jeweils 5 Tieren durchgeführt. Jedem Tier wurden durch intravenöse Injektion 400 ml/kg Triton WR-1339 (Handelsname für ein Material, das zur Erhöhung des Blutcholesterinspiegels bekannt ist) verabreicht, während gleichzeitig Monacolin K oral oder intraperitoneal in einer Dosis von 10 mg/kg verabreicht wurde. 20 Stunden nach der oralen Verabreichung oder 14 Stunden nach der intraperitonealen Verabreichung wurden die Ratten durch Verbluten getötet, das Blut und die Leber wurden isoliert und ihre Cholesterinspiegel mit Hilfe von üblichen Methoden bestimmt. Dabei wurde festgestellt, daß der Blutcholesterinspiegel im Vergleich mit der Kontrollgruppe der Tiere, welcher nur Triton WR-1339 verabreicht worden war, im Fall der oralen Verabreichung um 22,4 % und im Fall der intraperitonealen Verabreichung um 23,9 % vermindert worden war.

Der Leber-Cholesterinspiegel war bei den Tieren, denen Monacolin K oral verabreicht worden war, um 16,7 % erniedrigt.

Die verwendeten Testtiere waren Kaninchen mit einem Körpergewicht von 2,7 bis 2,9 kg. Jedem Kaninchen wurden kontinuierlich während 5 Tagen 2 mal pro Tag (morgens und abends) 1 mg/kg Monacolin K oral verabreicht. Vor der Verabreichung und am dritten und fünften Tag nach der Verabreichung wurde Blut aus der Ohrvene entnommen und der Cholesterinspiegel

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im Blutserum wurde bestimmt. Dabei wurde gefunden, daß der Cholesterinspiegel am dritten und am fünften Tag nach der Verabreichung von Monacolin K um 15 % bzw. um 29 % niedriger war, als der Blutspiegel vor der Verabreichung von Monacolin K.

Es wurde gefunden, daß Monacolin K in dem Test, in welchem Essigsäure mit Enzym aus Rattenleber umgesetzt wird, in einer Konzentration von 0,002 μg/ml eine 50 %ige Inhibierung der Biosynthese von Cholesterin verursacht. Es wurde gefunden, daß Monacolin K die HMG-CoA-Reduktase inhibiert, die das geschwindigkeitskontrollierende Enzym der Biosynthese von Cholesterin darstellt und daß es das Substrat HMG-CoA kompetitiv inhibiert und einen Ki-Wert von 5,3x10 M hat. Der Ki-Wert ist die Inhibierungskonstante und stellt spezifisch die Dissoziationskonstante des Enzym-Inhibitor-Komplexes dar. Der Wert wird erhalten, indem man das Produkt aus der Konzentration des Enzyms und der Konzentration des Inhibitors durch die Konzentration des Enzym-Inhibitor-Komplexes dividiert.

Monacolin K besitzt nicht nur eine wertvolle inhibierende Wirkung auf die Biosynthese von Cholesterin, sondern zeigt auch sehr geringe Toxizität, so daß seine Anwendung zur Behandlung von Hypercholesterinämie potentiell sehr attraktiv sein kann. So beträgt speziell die akute orale Toxizität (LDc₀) von Monacolin K bei der Maus 1 g/kg Körpergewicht oder mehr.

Monacolin K kann oral oder parenteral in Form von Kapseln, Tabletten, injizierbaren Zubereitungen oder anderen bekannten Arzneimittelzubereitungen verabreicht werden, wenn auch normalerweise orale Verabreichung bevorzugt wird. Die Dosis schwankt in Abhängigkeit von dem Alter und Körpergewicht des Patienten und dem Schweregrad seines Zustands. Im allgemeinen beträgt jedoch die Tagesdosis für einen Erwachsenen etwa 0,5 bis 50 mg und wird entweder als Einzeldosis oder in zwei oder drei Teildosen verabreicht. Wegen der niederen Toxizität

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der Verbindung können jedoch erforderlichenfalls höhere Dosierungen angewendet werden.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele näher erläutert, ohne daß sie auf diese beschränkt sein soll.

Beispiel 1

300 1 eines Kulturmediums, dessen pH-Wert vor der Sterilisation 7,4 betrug und welches jeweils (angegeben als Gewicht/Volumen-%) 1,5 % lösliche Stärke, 1,5 % Glycerin, 2 % Fischmehl und 0,2 % Calciumcarbonat enthielt, wurden in einen 600 1-Fermenter gegeben und mit dem Organismus Monascus ruber SANK 18174 (FERM 4957) beimpft. Die Züchtung des Organismus erfolgte während 120 Stunden bei 27°C mit einer Belüftungsrate von 300 1 pro Minute und unter Rühren mit 190 Upm. Die Kulturbrühe wurde mit Hilfe einer Filterpresse filtriert, wobei 290 1 Filtrat und 60 kg (Naßgewicht) des Organismus erhalten warden.

Der pH-Wert des Filtrats wurde durch Zugabe von 6 η Chlorwasserstoff säure auf 4,0 eingestellt und das Filtrat wurde dann mit 400 1 Äthylacetat extrahiert. Dieser Extrakt wurde konzentriert, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann zur Trockene eingedampft, wobei 95 g eines öligen Produkts erhalten wurden. Der Organismus (dessen Aktivität 2,5 mal so hoch wie die des Filtrats war) wurde zweimal mit je 100 1 80 %igem (Volumen/Volumen) wässrigem Methanol extrahiert. Das Methanol wurde von dem Extrakt verdampft und der Rückstand wurde zweimal mit je 100 1 Äthylacetat extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden konzentriert, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und danach zur Trockene eingedampft, wobei 128 g eines öligen Produkts erhalten wurden. Dieses wurde mit dem Rückstand aus dem Filtrat der Kulturbrühe kombiniert.

Die restlichen 223 g des kombinierten öligen Produkts wurden an einer mit 3 kg Silicagel (Wakogel C-200) gefüllten Kolonne

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adsorbiert, die vorher mit Benzol behandelt worden war. Die Kolonne wurde nacheinander mit 10 1 Benzol und dann mit 180 1 eines Gemisches aus Methylenchlorid und Äthylacetat im Volumenverhältnis 4 : 1 eluiert. Die aktive Fraktion wurde zur Trockene eingedampft, wobei 30 g eines öligen Produkts erhalten wurden, welches dann an einer 450 g Silicegal (Wakogel C-200) enthaltenden Kolonne adsorbiert wurde, die vorher mit Hexan behandelt worden war.

Die Kolonne wurde nacheinander mit 2 1 Hexan, 30 1 eines Gemisches aus Hexan und Aceton im Volumenverhältnis 9 : 1 und 30 1 eines Gemisches aus Hexan und Aceton im Volumenverhältnis 4 : 1 eluiert. Die aktive Fraktion wurde konzentriert und der Niederschlag wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft, wobei 4 g eines Öligen Produkts erhalten wurden, welches dann in einer mit 96 g Silicagel (Wakogel C-200) gefüllten Kolonne adsorbiert wurde, das vorher mit Hexan behandelt worden war. Die Kolonne wurde nacheinander mit 500 ml Hexan und 6 1 eines Gemisches aus Hexan und Aceton im Volumenverhältnis 9 : 1 eluiert. Die aktive Fraktion wurde zur Trockene eingedampft, wobei 521 mg eines öligen Produkts erhalten wurden, welches dann in einer Kolonne adsorbiert wurde, die 30 g Silicagel {Wakogel C-200) enthielt, das vorher mit Benzol behandelt worden war. Die Kolonne wurde nacheinander mit 10 ml Benzol, 100 ml eines Gemisches aus Benzol und Äthylacetat im Volumenverhältnis 95 : 5 und 900 ml eines Gemisches aus Benzol und Äthylacetat im Volumenverhältnis 4 : 1 eluiert. Die aktive Fraktion wurde konzentriert, wobei 92 mg farblose Kristalle erhalten wurden, die nach der Umkristallisation aus wässrigem Aceton 54 mg Monacolin K in Form von farblosen Nadeln ergaben.

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Beispiele 2 bis 8

300 1 eines Kulturmediums, dessen pH-Wert vor der Sterilisation 6,0 betrug, welches, angegeben als Gewicht/Volumen-%, 2 % Glucose, 2 % Pepton (Handelsname Kyokuto der Kyokuto Seiyaku K.K., Japan) und 0,3 % Maisquellflüssigkeit enthielt, wurden in einen 600 1-Fermenter gegeben und mit einem der in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführten Mikroorganismen beimpft. Die Züchtung des Mikroorganismus wurde 96 Stunden bei 27°C unter einer Belüftungsrate von 300 1 pro Minute und unter Rühren mit 190 Upm durchgeführt.

Am Ende dieser Zeit wurde 1 ml der Kulturbrühe entnommen und mit Äthylacetat, das auf einen pH-Wert von 3 bis 4 eingestellt war, extrahiert. Der Extrakt wurde dann in 0,2 ml des Reaktionsgemisches aufgenommen, das in der Veröffentlichung von M. Kuroda, Y. Hazama-Shimada und A. Endo in "Biochim. and Biophys. Acta", 486 (1977), S. 254 - 259 at 255 ("Inhibition of Sterol Synthesis by Citrinin in a Cellfree System from Rat Liver and Yeast") und in der Veröffentlichung von A. Endo, M. Kuroda und Y. Tsujita in "The Journal of Antibiotics", herausgegeben von der Japanese Antibiotics Research Association, 29, No. 12 (Dezember 1976), S. 1346 1348 beschrieben ist und die prozentuale Inhibierung der Biosynthese von Cholesterin wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 als Aktivitätseinheiten der Inhibierung pro ml der Kulturbrühe angegeben, wobei die 50 %ige Inhibierung der Biosynthese von Cholesterin 1 Einheit/ml entspricht.

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TABELLE 1

Bei spiel	Organismus	Aktivität zur Inhi bierung Einheiten/ml
2	Monascus purpurDus SANK 10271	120
3	Monascus ruber SANK 10671	120
4	Monascus vitreus SANK 109B0	150
5	Monascus paxii SANK 11172	120
6	Monascus ruber SANK 1377B	440
7	Monascus ruber SANK 15177	2 400
B	Monascus ruber SANK 1B174	20 000

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Diese Ergebnisse zeigen an, daß mit Hilfe der erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen sehr beträchtliche Mengen an Monacolin K gebildet werden.

Beispiel 9

Die in den Beispielen 2 bis 8 beschriebene Verfahrensweise wurde wiederholt, mit der Abänderung, daß als Mikroorganismus Monascus anka SANK 10171 verwendet wurde und daß Proben des Kulturmediums nach 96 Stunden, 168 Stunden, 216 Stunden bzw. 288 Stunden der Züchtung entnommen wurden. Die inhibierende Aktivität, die mit Hilfe des gleichen Tests wie in den Beispielen 2 bis 8 bestimmt wurde, betrug 110, 100, 30 bzw. 80 Einheiten/ml.

Beispiele 10 bis 17

300 1 eines flüssigen Kulturmediums, dessen pH-Wert vor der Sterilisation 5,5 betrug und das, jeweils angegeben als Gewicht/Volumen-%, 5 % Glucose, 0,5 % Maisquellflüssigkeit, 2 % Pepton (Kyokuto) und 0,5 % Ammoniumchlorid enthielt, wurden in einen 600 1-Züchtungstank gegeben. Das Medium wurde dann mit einem der in Tabelle 2 angegebenen Stämme beimpft und der Stamm wurde während 120 Stunden kultiviert. Dieses Verfahren wurde gesondert für jeden der anderen genannten Stämme wiederholt.

Nach der Kultivierung wurde jedes Medium durch eine Filterpresse, filtriert, wobei ein feuchter Mycelkuchen in den in Tabelle 2 genannten Mengen und ein Filtrat erhalten wurde. Der pH-Wert des Filtrats wurde durch Zugabe von 6 η Chlorwasserstoffsäure auf 4,0 eingestellt, wonach das Filtrat mit 400 1 Äthylacetat extrahiert wurde. Der Extrakt, dessen Menge etwa 400 1 betrug, wurde dann durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzen-

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triert und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Der konzentrierte Extrakt wurde weiter konzentriert und schließlich zur Trockene eingedampft, wobei ein öl in einer in Tabelle 2 als "Menge des Extrakts aus der Flüssigkeit" bezeichneten Menge erhalten wurde.

In der Zwischenzeit wurde der Mycelkuchen, dessen Aktivität etwa das 2- bis 3-fache der Aktivität des entsprechenden Filtrats betrug, zweimal mit jeweils 100 1 80 %igem (Volumen/ Volumen) wässrigem Methanol extrahiert. Der Extrakt wurde konzentriert und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Der konzentrierte Extrakt wurde weiterhin konzentriert und schließlich zur Trockene eingedampft, wobei ein öl in der in Tabelle 2 als "Menge an Extrakt aus dem Mycelkuchen" angegebenen Menge erhalten wurde.

Die aus dem jeweiligen Filtrat und dem Mycelkuchen erhaltenen öle wurden kombiniert und dann an einer mit Silicagel (3 kg Wakogel C-200, vorher mit Benzol behandelt) gefüllten Kolonne adsorbiert, die dann zuerst mit 10 1 Benzol und schließlich mit 180 1 eines Gemisches aus Methylenchlorid und Äthylacetat im Volumenverhältnis 4 : 1 eluiert wurde. Die aktive Fraktion aus der Elution wurde konzentriert und zur Trockene eingedampft, wobei ein öl in der in Tabelle 2 unter "Fraktion 1" gezeigten Menge erhalten wurde. Dieses öl wurde an einer Kolonne adsorbiert, die 340 bis 450 g Silicagel (Wakogel C-200, vorher mit Hexan behandelt) enthielt, wobei die Menge des Silicagels 1 g pro 65 mg des Öls betrug. Die Kolonne wurde dann nacheinander mit 1,5 bis 2 1 Hexan, 23 bis 30 1 eines Gemisches aus Hexan und Aceton im Volumenverhältnis 9 : 1 und 23 bis 30 1 eines Gemisches aus Hexan und Aceton im Volumenverhältnis 4 : 1 eluiert.

Die aktive Fraktion aus dieser Elutionsstufe wurde konzentriert und die sich abscheidenden Kristalle wurden abfiltriert. Der

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erhaltene Rückstand wurde weiter konzentriert und schließlich zur Trockene eingedampft, wobei ein Öl in einer Menge erhalten wurde, die in Tabelle 2 unter der Angabe "Fraktion 2" aufgeführt ist. Diese Fraktion wurde an einer Kolonne adsorbiert, die 18 bis 135 g Silicagel (Wakogel C-200, vorher mit Hexan behandelt) enthielt, wobei die Menge des Silicagels 1 g pro 42 mg des Öls betrug. Die Säule wurde dann nacheinander mit 100 bis 750 ml Hexan und 1,2 bis 9 1 eines Gemisches aus Hexan und Aceton im Volumenverhältnis 9 : 1 eluiert. Die aktive Fraktion aus dieser Elution wurde konzentriert und zur Trockene eingedampft, wobei ein öl in der in Tabelle 2 unter "Fraktion 3" gezeigten Menge erhalten wurde. Dieses öl wurde an einer Kolonne adsorbiert, die 6 bis 45 g Silicagel (Wakogel C-200, vorher mit Benzol behandelt) enthielt, wobei die Menge des Silicagels 1 g pro 17 mg des Öls betrug. Die Säule wurde dann nacheinander mit 15 bis 100 ml Benzol, 15 bis 100 ml eines Gemisches aus Benzol und Äthylacetat im Volumenverhältnis 95 : 5 und 120 bis 1200 ml eines Gemisches aus Benzol und Äthylacetat im Volumenverhältnis 4 : 1 eluiert. Die aktive Fraktion wurde konzentriert, wobei rohe Kristalle von Monacolin K in der in Tabelle 2 angegebenen Menge erhalten wurden. Diese rohen Kristalle wurden aus wässrigem Aceton umkristallisiert, wobei eine umkristallisierte kristalline Substanz in Form von farblosen Nadeln in der in Tabelle 2 gezeigten Menge erhalten wurde.

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TABELLE 2

Beispiel

Stamm

Menge des Menge des Menge des Menge des Fraktion

Mycelku- Extrakts Extrakts kombinier

chens aus der aus dem ten Ex- 1 2 3

Flüssigkeit Mycelkuchen trakts (kg) (g) (g) (g) (g) (g) (mg)

Monacolin K

rohe Kri- umkristalstalle lisierte

(mg) Kristalle (mg)

030	10	Monascus anka SANK 10171
CD •tx	11	Monascus
CD ¹^. O öl		purpurous SANK 10271
ο»	12	Monascus ruber SANK 10671
	13	Monascus vitreus SANK 10960
	14	Monascus paxii SANK 11172

Monascus ruber

SANK 13778 63

88

89

116

114

115

22 0,9 102 9,3

123

120

127

1,3 113 10,4 22 0,75 98 8,9

25 1,1 110 10,7 24 2,2 121 12,0 28 1,65 216 14,2

0,8

1,1

0,8

1,2

1,6

6,3

OO O O CD K)

TABELLE 2 (Fortsetzung)

Beispiel

Stamm

Menge des

Mycelku-

chens

(kg)

Menge des Extrakts aus der Flüssigkeit (g)

Menge des Extrakts aus dem Mycelkuchen (g)

Menge des kombinierten Extrakts (g)

Fraktion

(g) (g) (mg)

Monacolin K

rohe Kri- umkristalstalle lisierte

(mg) Kristalle (mg)

O Ui ο

OO ■^. O crt

16 Monascus ruber

SANK 15177

17 Monascus ruber

SANK 18174

119

125

26 1,8 235 24,4 9,8

29 5,7 765 135,0 81,0

CO

CD CD CD

CTl

Claims

ρλτεν tanw&lte SCHIFF V. FÜNER STREHL SCHÜBEL-HOPF EBBINGHAUS FINCK MARIAHILFPLATZ 2*3, MÖNCHEN SO O Π Π C O 1 C POSTADRESSE! POSTFACH 95Ο16Ο. D-80OO MÖNCHEN BB tj (J U U £ I p ALSO PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE • KARL LUDWIQ SCHIFF (106«-1O78) OIPL. CHEM. DR. ALEXANDER V. FÖNER DtPL. INO. PETER STREHL DIPL. CHEM. DR. URSULA SCHÜBE!--HOPF DIPL. INS. DIETER EBBINSHWS DR. INQ. DIETER FINCK TELEFON (OBS) *8 OO B* TELEX 8-23 065 AURO D TELEaRAMME AUROMARCPAT MÜNCHEN SANKYO COMPANY, LIMITED DEA-13 377 20. Februar 1980 Verfahren zur Herstellung von Monacolin K PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von Monacolin K durch Züchtung eines Stammes des Genus Monascus in einem geeigneten Kulturmedium, dadurch gekennzeichnet , daß man als zu züchtenden Stamm einen oder mehrere der Stämme Monascus anka SANK 10171 (IFO 6540), Monascus purpurous SANK 10271 (IFO 4513), Monascus ruber SANK 10671 (FERM 4958), Monascus vitreus SANK 10960 (FERM 4960), Monascus paxii SANK 11172 (IFO 8201), Monascus ruber SANK 13778 (FERM 4959), Monascus ruber SANK 15177 (FERM 4956) oder Monascus ruber SANK 18174 (FERM 4957) einsetzt.

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_ 2 —

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man die Züchtung bei einer Temperatur von 7 bis 40⁰C durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß man die Züchtung bei einer Temperatur von 20 bis 30⁰C durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Monascus ruber SANK 15177 bei einer Temperatur von 23 bis 30⁰C züchtet.

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