DE1052065B - Verfahren zur Herstellung von biologisch wirksamen Stoffen - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Züchtung der neu entdeckten Arten des Mikroorganismus Streptomyces albulus unter kontrollierten Bedingungen sowie Verfahren zur Gewinnung und Konzentrierung der durch diesen Mikroorganismus erzeugten biologisch aktiven Stoffe aus Rohlösungen einschließlich der Gärfiüssigkeiten und ferner ein dadurch hergestellter neuer und wertvoller Stoff.

Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein neues und wertvolles Gärungsprodukt mit der Bezeichnung E 73 in sowohl roher als auch gereinigter Form sowie auf Verfahren zur Herstellung, Konzentrierung und Isolierung dieser Substanz. Die Verbindung E 73 dient zur Hemmung des Wachstums bösartiger Tumore bei Mensch und Tier. Sie besitzt außerdem eine wertvolle antimikrobische Wirksamkeit bei verschiedenen Hefen, hefenähnlichen Organismen und Pilzen, die wichtige Verwendungsmöglichkeiten in der Therapie und bei industriellen Gärverfahren erschließt. Ferner bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Herstellung der bekannten Antibiotika Cycloheximid und Fungicidin durch diese neuen Arten von Streptomyces.

Der neu entdeckte Microorganismus, der bei dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, wurde aus einer Erdprobe isoliert und wies die Eigenschaften eines der Gattung Streptomyces angehörenden Organismus auf. Zur vollständigen Klassifizierung wurde er für die Identifizierung der Mikroorganismen dieser Gattung in sechs Proben auf geeigneten Medien gepflanzt und 2 Wochen bei den entsprechenden Temperaturen inkubiert. Von Zeit zu Zeit wurden Aufzeichnungen über einige der Medien gemacht und am Ende der Inkubierungszeit die Ergebnisse des Wachstums auf allen Medien ermittelt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt. Wo bei den Farben R angegeben ist, bezieht sich dieses auf Ridgways Farbnormen und Farbenbezeichnung.

Zur Identifizierung der Kultur wurde der Schlüssel zu den Arten der Gattung Streptomyces in Waksman und Lachevaliers Actinomycetes und ihre Antibiotika verwendet. Jedoch keine der beschriebenen Arten gleicht diesem Organismus, auch stimmen die Eigenschaften irgendwelcher nach der Veröffentlichung dieses Werkes beschriebenen Streptomyces mit der Kultur nicht überein. Daraus wurde geschlossen, daß eine neue und bisher unbeschriebene Art von Streptomyces gefunden worden war, für die der Name Streptomyces albulus vorgeschlagen wird. Die Klassifizierung dieser neuen Art wurde von Dr. J. B. Routien vorgenommen, der den Namen und die unten aufgeführte Beschreibung lieferte. Eine Kultur dieses Mikroorganismus wurde bei der American Type Culture Collection (Amerikanische Kulturensammlung) unter der Nummer ATCC 12 757 hinterlegt, die hiernach als Typ-Kultur des Streptomyces albulus anzusehen ist.

Verfahren zur Herstellung
von biologisch wirksamen Stoffen

Anmelder:
Chas. Pfizer & Co., Inc.,
Brooklyn, N.Y. (V.St.A.)

Vertreter: Dr. W. Beil und A. Hoeppener₁
Rechtsanwälte, Frankfurt/M.-Höchst, Antoniterstr. 36

Beanspruchte Priorität: V. St. v. Amerika vom 5. April 57

Koppaka Visweswara Rao, Pinebrook, N. J.,

William Stephen Marsh, Ringwood, N. J.,
und Aline Lucile Garretson, River Edge, Ν. J.
(V. St. Α.),
sind als Erfinder genannt worden

Es versteht sich von selbst, daß sich die Herstellung der Verbindung E 73 sowie von Cycloheximid und Fungicidin nach der vorliegenden Erfindung nicht auf den obengenannten Organismus beschränken soll. Vielmehr ist es besonders erwünscht und beabsichtigt, daß die vorliegende Erfindung die Verwendung von Mutanten einschließen soll, die auf verschiedene Arten, wie z. B. durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder ultraviolettem Licht, durch Behandlung mit Stickstoffsenfen u. dgl., aus dem beschriebenen Organismus hergestellt worden sind.

Die Verbindung E 73 besitzt beträchtliche Wirksamkeit gegen verschiedene Hefen, hefeähnliche Organismen und Protozoen. Sie weist sehr geringe antibakterielle Wirksamkeit auf. Ihre antimikrobische Wirksamkeit gleicht im allgemeinen jener des Cycloheximids, doch ist sie etwas weniger aktiv. Sie kann für ähnliche Zwecke Verwendung finden. Insbesondere zeigt sie einen guten Wirksamkeitsgrad gegen das menschliche Pathogen Cryptococcus neoformans und Trichmonas vaginalis und gegen die Hefen Saccaromyces cereviciae, Torulospsis albida und Kloeckera brevis. Ihre Wirksamkeit gegen die obengenannten Pathogene ermöglicht ihre Verwendung bei der Behandlung von Cryptococcosis, einer ernsten Krankheit, die oft die Lungen und insbesondere

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Tabelle I

Züchtungseigenschaften von Streptomyces Albulus ATCC 12 757

Medium	Wachstum	Sporenbildung des aerob. Mycels	Löslicher Farbstoff	Anmerkungen
Glucose- Aspargin- Agar	mäßig bis gut	gut; weiß, an den Rändern bräunlichgrau werdend (hellmausgrau bis hellwein farben gelbbraun (R)) bei Punktpflanzung, lavendel farben (nahe blaßpurpur- pfplririrann anf Eermter- I-LV.fi O.Lll J. VIlO^l scheiben	keiner	Vegetatives Mycel nicht sichtbar; deut liche Ränder, regelmäßiger Umriß, rauhe Oberfläche; Ruckseite cremeweiß bis gelblichrotbraun bis gelblichrot braun bis gelblichgrau. Verdünnungs platten; im wesentlichen gleich den Punktplatten mit Ausnahme einiger Kolonien mit nur grauem oder nur weißem Mycelium. Sporen in mäßig engen bis engen Spiralen; unregelmäßig entlang den Hyphae getragen; durch ZerspHtterung entstanden; subglobos .65—1,30 · .65—1,30
Magermilch	mäßig	spärlich, weiß	orangerotbraun (lachsleder farben (R))	Samenhaut cremeweiß; Milch geronnen; bis zur Hälfte der Milch peptonisiert; Änderung des pH-Wertes von 6,5 auf 7,0
Glucose-Agar	gut	mäßig, weiß	hellrotbraun (warm leder farben (R))	Vegetatives Mycel farblos; Rückseite hellgelblichrotbraun
Nähr-Agar	mäßig	mäßig, weiß	keiner	Vegetatives Mycel farblos; Rückseite gelblichrotbraun
Synthetischer Agar	mäßig	mäßig bis gut; weiß bis hellgrau	keiner	Vegetatives Mycel an sichtbaren Stellen farblos; Rückseite grauweiß; Wachs tum gering durchdringend
Calcium- malat-Agar	spärlich bis mäßig	mäßig bis gut, weiß	keiner	Vegetatives Mycel farblos; Rückseite cremeweiß
Cellulose	kein Wachstum
Kartoffel stücke	gut	mäßig; weiß	sehr hell graurotbraun	Vegetatives Mycel graurotbraun (oliv lederfarben (R))," Oberfläche tief un regelmäßig gewunden; Erdgeruch
Dextrose- Nitratbrühe	mäßig	mäßig bis gut, weiß	keiner	leichte Reduktion von Nitraten zu Nitriten in zwei Röhren, andere zeigen keine Reaktion
Emerson-Agar	mäßig htc ßnif	mäßig, weiß zerstreut	gelblichrotbraun	Vegetatives Mycel farblos; Rückseite f?*ei!hH c h rotbr απ η 1 ρ^/ΧΧ\^.Χ1Χ \J U κ/Λ. CL LXXX
Stärkeplatten	gering bis mäßig (kleine Kolonien)	gut, weiß bis grau (hellmausgrau (R))	keiner	Vegetatives Mycelnicht sichtbar; Kolo nien aufgezogen; Rückseite cremeweiß, Hydrolysezone 3,0 bis 4,0 cm Durch messer
Gelatine platten	gering bis mäßig (kleine Kolonien)	spärlich bis mäßig; weiß	keiner	Vegetatives Mycel gelbhchrotbraun; Verflüssigungszone 1,5 bis 1,8 cm Durchmesser

das zentrale Nervensystem sowie die Haut angreift und z. B. Verfahren für die Herstellung von Ascorbinsäure,

außerdem ihre Verwendung bei der Behandlung von Tri- Gluconsäure, a-Ketoglutarsäure, verschiedenen Steroiden,

chlomonas vaginitis. Weitere Anwendung findet dieser Lysin und bei der Herstellung von Essig. Im allgemeinen

Stoff auf Grund seines einzigartigen antimikrobischen sind bakterielle Gärungen, die bei oder nahe einem

Spektrums bei industriellen bakteriellen Gärungen wie 70 neutralen p_H-Wert in wäßrigen Medien durchgeführt

werden, der Hefenverunreinigung ausgesetzt, die zum Nachteil der gewünschten Gärung unerwünschte Nebenprodukte liefert. Die Anwesenheit der Verbindung E 73 im Gärmedium verhindert das Entstehen derartiger Bedingungen.

Die biologische Wirksamkeit von E 73 unterscheidet sich von der des Cycloheximids insofern, als sie bis zu IOOOmal stärker als ein Antitumormittel ist. Die Fähigkeit von Cycloheximid, Sarcoma 180 in Mäusen zu verhindern, wurde von Reilly u. a. in »Cancer Research^, Bd. 13, S. 684 (1953), beschrieben. Das Ergebnis war, daß Cycloheximid eine geringe Wirkung auf diese Art eines Tumors ausübt. Der Durchmesser eines derartigen Tumors wurde bei sehr hohen Dosen von 50 mg/kg pro Tag auf etwa ein Viertel bis etwa drei Viertel der Größe bei unbehandelten Kontrollmäusen herabgesetzt, die ähnliche Tumors tragen. Bei Verdopplung dieser Dosis zur Verstärkung der Hemmwirkung starben etwa 80% der Tiere.

Mit Verbindung E 73 wurde ein ähnlicher Versuch gegen diesen Tumor unternommen, bei dem Schweizer Mäuse mit einem Gewicht von 18 bis 22 g Verwendung fanden. Bei jeder Versuchsreihe wurden Mäuse des gleichen Geschlechts verwendet. Die Tumorverpfianzung wurde unter Verwendung der aus dem Southern Research Institute, Birmingham, Alabama, stammenden Reihe von Sarcoma 180 durchgeführt. Tumorteile mit einemDurchmesser von 1 bis 2 mm wurden von nicht necrotrischen Stellen des Tumorspenders abgeschnitten und in die Gegend der Achselhöhe jeder Versuchsmaus verpflanzt. Die Einspritzungen des Medikamentes wurden 24 Stunden nach Verpflanzung des Tumors begonnen und 7 Tage zweimal täglich fortgesetzt. Die Tiere wurden am 1., 4. und 8. Tag gewogen, um einen Maßstab für die Giftwirkungen des Medikamentes zu haben. 24 Stunden nach der letzten Einspritzung wurden die Tiere getötet und die Tumore ausgeschnitten und gewogen. Die Ergebnisse dieses Versuches, bei dem zweimal täglich eine filtrierte Gärflüssigkeit als Quelle für Verbindung E 73 in 0,5-ccm-Dosen verabreicht wurde, sind in Tabelle II aufgeführt. Mit dieser nach der vorliegenden Erfindung hergestellten Flüssigkeit wurde eine Hemmwirkung erzielt, die bei einer Verdünnung von 1 bis 20 der mit Cycloheximid erzielbaren Wirkung entsprach. Es wurden außerdem Flüssigkeiten erhalten, die diesen Wirksamkeitsgrad bei Verdünnungen von 1 bis 50 aufwiesen.

Tabelle II

Hemmung von Sarcoma 180

E 73 — Flüssigkeit Filtratverdünnung	Sterblichkeit	Hemmung von S-180
unverdünnt	giftig
1 bis 10	2/5	±
1 bis 20	0/5	±
1 bis 40	0/5
Kontrollen	0/5
±	25- bis 75%ige
Hemmung
keine Hemmung

Die Antitumorwirksamkeit der Verbindung E 73 wurde ferner bei menschlichen Tumoren bei heterologen Trägern untersucht. Hierbei fand das menschliche Sarcom H. S. Nr. 1 Verwendung, das nach dem Verfahren von Chen (Cancer Research, 14, S. 660 [1954]) in Ratten gezüchtet worden war. Man erhielt Ratten, die Probetumore tragen,

und diese Tumore wurden entfernt und durch Waschen mit einer Penicillin und Dihydrostreptomycin enthaltenden Lösung sterilisiert. Danach wurden die Tumore zerhackt und in einer Glucose-Ringerlösung mit Puffersubstanz bei einer Konzentration von 80 % Tumorgewebe suspendiert. Ratten, die zuvor 150 R Röntgenbestrahlung ausgesetzt und mit Cortisonacetat behandelt worden waren, erhielten sodann subcutane Einspritzungen mit 1 ecm der obigen Suspension in die Weiche. Die Tiere,

ίο denen die Suspension von H. S. Nr. 1 verpflanzt worden war, erhielten ihre erste Medikamentbehandlung durch Einspritzung in das Bauchfell am 3. Tag nach der Verpflanzung und tägliche Dosen bis 24 Stunden vor ihrer Tötung am 13. Tag. In jedem Falle unterhielt man Kontrollgruppen von Ratten. Bei den Kontrolltieren erhielt man Tumore von wiedergebbarer Größe innerhalb der üblichen biologischen Grenzen. Zur Zeit der Tötung wurden die Tumore ausgeschnitten, von anhängendem Gewebe befreit und gewogen. Es wurde gefunden, daß die Verbindung E 73 außerordentlich hohe Hemmwirkung für diesen Tumor besitzt, denn nach einfacher Entfernung des Mycels und 10- bis 15facher Verdünnung erwies sich eine E 73 enthaltende Gärflüssigkeit als wirksam. Mit Dosen gereinigter Proben von Verbindung E 73 von nur 0,1 bis 0,2 mg/kg Körpergewicht erzielte man eine50%ige oder größere Hemmung des Wachstums von H. S. Nr. 1 bei Ratten. Im Gegensatz hierzu waren von Cycloheximid Dosen von 5 mg/kg erforderlich, um eine meßbare Wirkung gegen H. S. Nr. 1 zu erzielen.

Mit rohen Präparaten von E 73, wie sie innerhalb des Bereiches der Erfindung liegen, ist eine tumorhemmende Stoffzusammensetzung gemeint, die entweder flüssig oder fest ist und mindestens etwa 0,05 mcg/mg E 73 enthält. Zum Beispiel bei Verabreichung einer filtrierten Gärflüssigkeit, die z. B. etwa 50 mcg/ccm E 73 enthält und zehnfach verdünnt ist, an eine Ratte, die den Tumor H. S. Nr. 1 trägt, in täglichen Dosen von 0,5 ecm, erreicht man eine Herabsetzung des Tumorgewichts um mindestens 50% gegenüber jenem einer Kontrollratte, die mit physiologischer Kochsalzlösung behandelt wurde. Eine derartige Stoffzusammensetzung liegt innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung.

Rohe Proben und Konzentrate von E 73 werden zweckmäßigerweise durch die oben beschriebenen Antitumorversuche unter Verwendung des Tumors H. S. Nr. 1 bei Ratten oder des Tumors Sarcoma 180 bei Mäusen geprüft. Eine zweckmäßige Richtlinie als vorläufige Anleitung während des Isolierungsvorganges wurde mit einer Antihefenprüfung auf einer Agarplatte entwickelt, bei der als Versuchsorganismus Saccaromyces cerevisiae Verwendung fand. Bei dieser Antihefenprobe wird ein Verdünnungseinheitssystem entwickelt, denn die erhaltene Hemmzone ist an Fläche nicht proportional zum E 73-Gehalt der Probe bei höheren Konzentrationen, noch sind die Zonenabgrenzungen deutlich. Die einer Versuchsprobe zugewiesene Anzahl von Verdünnungseinheiten ist die größtmögliche Anzahl von Verdünnungen, die bei einem gleichen Volumen des Mediums gemacht werden kann, um auf einer S. cerevisiae-Platte noch eine deutliche Hemmzone zu erreichen. Bei festen Proben ist der Ausgangspunkt für diese Prüfung eine Konzentration von 1 mg/ccm des Feststoffs im Medium. Nach dieser Prüfung ist Cycloheximid 3- bis 5mal aktiver als E 73.

Cycloheximid ist selbstverständlich auch gegen S. cerevisiae wirksam, und bei Gemischen, die Cycloheximid und E 73 enthalten, wird die letzte Unterscheidung auf Grund des Antitumorversuches vorgenommen. Selbstverständlich gibt es auch noch andere Verfahren zur Unterscheidung von Cycloheximid von E 73, die sowohl chemische

Is auch physikalische Arten umfassen, doch sind bei ohen Isolaten die Hefe- und Tumorversuche am zweckläßigsten.

Die vorliegende Erfindung umfaßt das Verfahren zur Achtung von Streptomyces albulus unter kontrollierten Bedingungen zur Herstellung von Verbindung E 73 und «zieht sich ferner auf die Herstellung von Cycloheximid nd Fungicidin durch die Züchtung dieses Organismus, m Laboratorium wurde E 73 unter Verwendung von chüttelflaschen erzeugt, die je 225 ecm des folgenden lediums enthielten:

Glucose 10 g/1

Sojabohnenmehl 15 g/1

Dikaliumphosphat 5 g/1

Natriumchlorid 2 g/1

Lösliche Destillationsstoffe 2,5 g/1

Calciumcarbonat 2 g/1

Leitungswasser zur Auffüllung auf das
erforderliche Volumen

Der Säuregehalt des Mediums wurde auf einen p_H-Wert on 7 gebracht und das Gemisch durch 20 Minuten Lufenthalt in einem Autoklav bei einem Dampfdruck on 6,8 kg (121° C) sterilisiert. Der Impfstoff wurde unter ^rerwendung des gleichen Mediums hergestellt. Das Wachstum eines Schrägbodens von Streptomyces albulus lit guter Sporenbildung wurde in eine nach der obigen Beschreibung vorbereitete Flasche eingeführt und 36 bis

0 Stunden bei 28° C auf einer Schütteldrehvorrichtung >elassen. Das erhaltene Wachstum wurde zur Impfung hnlicher Flaschen mit Gärlösung der gleichen Zusammenetzung unter Verwendung von 5 Volumprozent Impftoff verwendet. Die geimpften Flaschen ließ man sodann nter den obigen Bedingungen 60 Stunden lang gären. )ie Flüssigkeit wurde über Glaswolle filtriert und das 'iltrat durch ein Filter aus Sinterglas mit äußerst feinen Oren geleitet. Es wurde gefunden, daß die auf diese Veise hergestellten Filtrate etwa 200 bis 300 S. cerevisiae^rerdünnungseinheiten Wirksamkeit pro ecm besitzen.

Zur Gewinnung und Herstellung von Konzentraten von

1 73 wird nach einer bevorzugten Ausführungsform der •orliegenden Erfindung die Gärflüssigkeit zuerst unter "ei wendung von 2 bis 5 % eines Diatomeenfilters filtriert. Cs wurde gefunden, daß das Mycel 80% des erzeugten ^rungicidins enthielt, während die Antitumorwirksamkeit ι der Flüssigkeit blieb. Die übrigen 20 % des Fungicidin rarden nach der unten beschriebenen Extraktionsstufe lit einem Lösungsmittel in die Flüssigkeit zurückgeführt. Venn die Gewinnung von E 73 gewünscht ist, wird in den leisten Fällen kein Versuch unternommen, das Fungiidin zu gewinnen. Die Gewinnung von Fungicidin kann ;doch durch bekannte oder durch die nachstehend eschriebenen Verfahren erreicht werden. Nach der nitrierung der Flüssigkeit wird der Filterkuchen mit Vasser unter Verwendung von 10% des Volumens der rsprünglichen Gärflüssigkeit gewaschen und anschließend as mit den Waschflüssigkeiten vereinigte Filtrat mit

Volumen eines nicht mischbaren Lösungsmittels, wie . B. Chloroform, Äthylacetatmethylisobu ty !keton usw., lit einem p_H-Wert von 7 ausgezogen. In dieser Stufe ist er pij-Wert nicht bedeutsam, und es kann ein p_H-Bereich on 2 bis 8 verwendet werden.

Die Verbindung E 73 ist eine neutrale Substanz, die ich als ziemlich beständig erweist. Oberhalb eines Η-Wertes von 8 in der Lösung tritt jedoch Zersetzung in. Die Lösungsmittelschicht aus der oben geschilderten Extraktion erwies sich als höchst aktiv bei den beschrieenen Versuchen mit sowohl Hefe als auch Tumoren. Die

Hauptmasse des Lösungsmittels wurde sodann durch Destillation im Vakuum bei 30 bis 40° C entfernt, wobei das Volumen des Rückstandes etwa 2% des ursprünglichen Extraktvolumens betrug. Dieses Konzentrat wurde sodann in ein größeres Volumen Ligroin gegossen, was zur Ausfällung einer rohen Probe E 73 führte. In den Lösungsmittelschichten blieb keinerlei E 73-Wirkstoff zurück.

Die auf diese Weise erhaltene höchst aktive halbfeste

ίο Masse wurde sodann durch Chromatographie über Tonerde in der folgenden Weise gereinigt. Eine Säule von einer Größe von 8,9 · 25,4 cm, die pro Gramm des zu reinigenden rohen E 73 20 bis 40 g chromatographische Tonerde enthielt, wurde verwendet. Eine Säule von dieser Größe eignet sich für etwa 100 g des nach obiger Beschreibung erhaltenen rohen Konzentrats. Die E 73 enthaltenden Feststoffe wurden sodann unter Herstellung einer Lösung mit 1- bis 2%iger Konzentration in Äthylacetat gelöst und durch die Säule geleitet. Die Entwicklung der Säule wurde mit Äthylacetat und anschließend mit 2%igem Methanol in Äthylacetat durchgeführt. Das Fortschreiten des Chromatogramms wurde durch Messen der Feststofftrockengewichte von je 5 ecm großen Proben des Eluats und durch Prüfen der Rückstände verfolgt.

Das Methanol wurde dem Lösungsmittel erst zugesetzt, nachdem pro Kilo Tonerde etwa 51 Äthylacetat verwendet worden waren. In dieser Stufe waren etwa 60 bis 70 Gewichtsprozent des ursprünglichen Materials ausgewaschen worden.

Die ersten 10 % des Feststoffausgangsmaterials, die die Säule passierten, waren im Hefeversuch unwirksam und enthielten fast kein antitumorwirksames Material. Sie erwiesen sich als kristallinischer Feststoff in farblosen rechteckigen Platten mit einem Schmelzpunkt von 258 bis 260° C, der als Fraktion B bezeichnet wurde. Mit Fraktion A wurde das früher gewonnene Fungicidin bezeichnet. Fraktion B ist in Pyridin und Dimethylformamid löslich, in Wasser oder den üblichen organischen Lösungsmitteln dagegen nur gering löslich. Die Kristalle zeigten unter ultraviolettem Licht eine hellgelbe Fluoreszenz und ergaben bei Lösung in Alkali eine gelbe Lösung. Ansäuerung der gelben Alkalilösung führte zur Ausfällung des Ausgangsmaterials. Die aus Pyridinäthylacetat umkristallisierte Fraktion B hat folgende Zusammensetzung: Kohlenstoff 70,03 %, Stickstoff 10,40 %, Wasserstoff 6,20%, und zeigt in der ultravioletten Zone des Spektrums bei 320 πιμ Elf_m 102 ein Maximum. Ihre spezifische Drehung af = + 3,43° (c, 0,4 in Dimethylformamid). Sie besitzt eine charakteristische Infrarotabsorptionskurve.

Die bei der Entwicklung des Tonerdechromatogramms erhaltene zweite und Hauptfraktion stellt etwa 50 Gewichtsprozent des ursprünglichen E 73 dar, das das halbfeste Lösungsmittelextraktisolat enthielt. Dieses Material war bei den Antitumor- und Hefeversuchen höchst wirksam. Es bestand aus einem blaßgelben glasähnlichen Stoff, der in Wasser ziemlich löslich und in den üblichen organischen Lösungsmitteln leicht löslich ist. Dieses Material, das Cycloheximid und E 73 als aktive Hauptbestandteile enthielt, wurde durch Trennchromatographie weiter getrennt, wobei ein Lösungsmittelsystem aus wäßrigem Methanol und Isopropyläther auf Kieselerdegel Verwendung fand-. Die Herstellung der Lösungsmittel erfolgte durch Schütteln von 1 Volumen wäßrigem Methanol (55 Volumprozent Methanol) mit 5 Volumen Isopropyläther. Bei einer Säule von entsprechender Größe wurden pro Gramm der Fraktion 2 etwa 10 bis 25 g Kieselerdegel verwendet. Das Kieselerdegel wurde zuerst mit der oberen Lösungsmittelphase, d. h. dem mit wäßrigem Methanol gesättigten Isopropyläther im Verhältnis

1

von 10 ccm/g Kieselerdegel behandelt, und es wurden etwa 0,25 ecm der unteren wäßrigen Methanollösungsmittelphase pro Gramm Kieselerdegel zugesetzt. Die letztgenannte Phase wurde durch das Kieselerdegel absorbiert. Etwa 80°/₀ dieser KieselerdegelaufscHämhrung wurden sodann auf die Säule aufgebracht, und der zu trennende glasähnliche, antitumoraktive Feststoff wurde mit dem Rest der Aufschlämmung aus Kieselerdegel und Lösungsmittel gemischt. Dieses Gemisch wurde gut gerührt und der Säule zugeführt. Die Entwicklung der Säule wurde mit der obengenannten Isopropylätherphase durchgeführt und die Wirksamkeit aufeinanderfolgender gleich großer Proben des Eluats wurde durch die Saccharomycescerevisiae-Prüfung ermittelt.

Bei einer spezifischen Ausführungsform wurden 100 g *5 des rohen, glasähnlichen, antitumofwirksamen E 73-Konzentrats aus dem Tonerdechromatogramm, 2000 g Kieselerdegel, 6 bis 8 1 der mit wäßrigem Methanol gesättigten Isopropylätherphase und 500 ecm der wäßrigen Methanolphase verwendet. Die das E 73-Konzentrat enthaltende Säule wurde sodann mit der Isopropylätherlösungsroittelphase entwickelt und Fraktionen von 500 ecm gesammelt. Die ersten zehn Fraktionen enthielten nur inaktives öliges Material. Die nächsten zwanzig Fraktionen, d. h. die Fraktionen 10 bis 30, enthielten ein Gemisch aus zwei Feststoffen mit verhältnismäßig niedriger Wirksamkeit. Eines dieser festen Materialien erwies sich als identisch mit der aus der Tonerdesäule erhaltenen Fraktion B. Der andere Bestandteil bestand nicht aus Fraktion B, wies jedoch ebenfalls verhältnismäßig niediige Wirksamkeit auf. Er wurde mit Fraktion C bezeichnet. Die Fraktionen B und C wurden auf Grund ihrer unterschiedlichen Löslichkeit in Äthylacetat getrennt, wobei Fraktion C stärker löslich war. Sie kristallisierte in blaßgelben rechteckigen Prismen mit einem Schmelzpunkt von 196 bis 198° C aus und ergab eine Analyse von C 64,73%, H 6,45 % und N 5,05%. Dieses Material zeigte wenig oder überhaupt keine gelbe Fluoreszenz von der bei Fraktion B beobachteten Art. Die spezifische Drehung von Fraktion C ist (a) f = 5,06° (c = 0,4 in Dimethylformamid). Sie zeigte charakteristische Infrarotabsorption und Maxima im Ultraviolettspektrum bei 262 πιμ und 347 πιμ von E^_n 428 bzw. 138.

Die nächsten zwanzig gleich großen Eluatproben aus der Kieselerdegelsäule, d. h. die Proben 30 bis 60, enthielten einen großen Anteil Feststoffe, die hauptsächlich aus Cycloheximid bestanden. Es wurden zwei kristallinische Formen von Cycloheximid erzielt. Sie wurden als harte und weiche Abart bezeichnet. Die harte Abart entsprach hinsichtlich ihrer physikalischen Eigenschaften den in der Literatur beschriebenen. Sie schmolz bei 118 bis 119°C, -während die sogenannte weiche Kristallform von Cycloheximid bei 110°C schmolz. Eine physikalische Mischung dieser beiden Arten schmolz unterhalb IOO⁰C Jede Kristallform wirkte als Keim für die Kristallisierung ihrer eigenen Kristallform aus gesättigten Lösungen von Cycloheximid. In Kurven, die von festen Kaliumbromidlösungen der beiden Formen, die 2% des kristallinischen Materials enthielten, hergestellt wurden, beobachtete man deutliche Unterschiede in den Infrarotspektren. Diese Unterschiede traten bei 3584, 1364,1321, 1199, 1186, 1101, 1087, 1081, 1073 und 980 cm-¹ auf. In Lösung dagegen waren die Infrarotspektren der weichen und harten Arten sowie einer authentischen Probe Cycloheximid identisch. Die sogenannte weiche Kristallform wurde zuerst aus der Säule entfernt und erhielt die Bezeichnung Fraktion D. Die hai te Form wurde mit D₂ bezeichnet.

Nach Entwicklung mit 70-500 ecm Mengen von Isopropyläther, der mit wäßrigem Methanol gesättigt war,

erhielt man aus der Kieselerdegelsäule eine stark gereinigte Probe von E 73. Trotz hoher Reinheit erhielt man E 73 wiederum in Form eines glasähnlichen Materials, das nicht kristallinisch war, sich jedoch zu einem reinen weißen mikrokiistallartigen Feststoff pulverisieren ließ. Eine Probe des reinen kristallinischen Materials wurde sodann durch Behandlung einer gesättigten äthanolischen Lösung mit 4 Volumen Äther erhalten. Man erzielte eine 75%ige Gewinnung des kristallinischen E 73.

Nach dem Verfahren von Craig wurden unter Verwendung von vierzehn Transportleitungen und dem Lösungsmittelsystem Wasser-Benzol-Äthylacetat 5:4:1 Gegenstromverteilungsversuche mit reinem kristallinischem E 73 durchgeführt und ergaben, daß sich die Hauptmasse des Materials in der siebenten Röhre konzentrierte. Der Verteilungskoeffizient für dieses System war 0,95. Das Infrarotabsorptionsspektrum von E 73 ähnelt jenem von Cycloheximid, weist jedoch bedeutende Unterschiede auf. Auf einer von einer l%igen K Br-Verdünnung hergestellten Kurve erscheinen die Hauptmaxima bei folgenden Wellenlängen: 3509, 3165, 3058, 2941, 2907, 1727,1715,1686,1385,1290,1266,1261,1236,1147,1127, 1115, 1081, 1038, 1025, 948, 921, 852 und 826 cm-\ Bei Messung einer 2¹/₂%igen Chloroformlösung zeigten sich bedeutende Maxima bei 3559, 2950,1727,1709,1391, 1149, 1131, 1116, 1041, 1025, 946, 878 und 826 cm"¹. Das an einer Methanollösung von E 73 gemessene Ultraviolettabsorptionsspektrum hatte bei 285 πιμ ein Maximum. Die Infrarotspektren sind in ihren Einzelheiten in Fig. 1 bzw. 2 aufgeführt.

E 73 ist eine neutrale Substanz, die sich durch Erhitzen mit wäßrigem Natriumhydroxyd, wie von C Kornfeld u. a. im Journal of the American Chemical Society, 71, S. 150 (1949), beschrieben, weiter von Cycloheximid unterscheiden läßt. Im Gegensatz zu den für Cycloheximid angegebenen Ergebnissen erhielt man durch dieses Zersetzungsverfahren aus E 73 kein Dimethylcyclohexanon. Es entwickelte sich Ammoniak. E 73 ergibt mit Ferrichlorid, Ninhydrin oder mit Brom keine charakteristischen Reaktionen. Es Uefert jedoch ein lmstallinisches Derivat mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin, und ergibt außerdem ein Oxim. Sein Schmelzpunkt ist 140 bis 141° C, (a) I⁵ = 8,8° (c = 1,0 in Methanol) und seine Zusammensetzung entspricht im wesentlichen der empirischen Formel C₁₅ H₂₃^₂₅N 0₅_₆. Sein ebullioskopisch in Aceton ermitteltes Molekulargewicht ist 287 (berechnet für C₁₅H₂₃NO₅:297). Die quantitative Ermittlung der Carbonylgruppe mit Hydroxylaminhydrochlorid zeigt 0,82 C = O pro Mol.

Zur weiteren Kennzeichnung des reinen kristallinischen E 73 erfolgte die Herstellung der Acetat- und p-Nitrobenzoatderivate durch Behandlung von E 73 in Pyridin mit Essigsäureanhydrid und p-Nitrobenzoylchlorid. In jedem Falle wurden Monoester erzielt. Das Acetat mit einem Schmelzpunkt von 170 bis 171° C kristallisierte aus Äther in Form von farblosen seidigen Nadeln und hatte die Formel C₁₇H₂₅O₆N. Das p-Nitrobenzoat hatte die Formel C₂₂H₂₆O₈N₂, einen Schmelzpunkt von 167 bis 168° C und kristallisierte aus Äthermethylenchlorid in Form von farblosen rechteckigen Platten aus.

Wie oben erwähnt, wird die Verbindung E 73 durch verdünntes Natriumhydroxyd zersetzt. Gegenüber Alkali ist sie ziemlich empfindlich, ist oberhalb einem p_H-Wert von 8 unbeständig und zerfällt rasch bei einem p_H-Wert von 10.

Das oben beschriebene Gewinnungs- und Reinigungsverfahren ist in folgendem Fließschema zusammengefaßt. Die hochgestellten Zahlen beziehen sich auf Tabelle III, in der die Versuchsdaten über die Antihefe- und Antitumorwirksamkeit angegeben sind.

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Produkte von Streptomyces albulus ATCC 12 757 Gewinnung und Reinigung

Gärflüssigkeits-Filter

Mycelikuchen

mit N-Butanol extrahieren, konzentrieren, in Ligroin gießen und filtrieren

Filtrat¹

mit Äthylacetat extrahieren

Filtrat
wegwerfen

Fraktion A
(Fungicidin)

Unterschicht
!

Feststoff Raffinat² mit einem Gemisch

aus Wasser, Äthylacetat und tertiärem Butanol 5:4:1 schütteln

Extrakt

konzentrieren
undin Ligroin gießen

Oberschicht Obenauf schwimmendes Ligroin entfernen

Halbfestes Produkt³

in Äthylacetat lösen

und durch Tonerdesäule leiten

Eraktion B⁴
kristallinisches Produkt

Glasartige Fraktion⁵

Ölige Fraktion⁶ Fraktion B Fraktion C⁷ Fraktion D⁸ Fraktion Fraktion E¹⁰

kristallinisches kristallinisches »weiche« Form »harte« Form Verbindung E 73 Produkt Produkt des Cycloheximids des Cycloheximids

TabeUe III

			Dosis mg/kg
Antitiimorwirksanikeit
Beschreibung der Probe	Hefewirksamkeit
/0 Hemmung	Art der Prüfung
1.	Gärflüssigkeit	200 bis 300 Verdünnungseinheiten pro ecm	15	40 bis 50	S-180
(Tank-Grundmischung)	15	30 bis 40	HS Nr. 1
2.	Raffinat	10 bis 20 Verdünnungseinheiten pro ecm	15	keine	S-180
3.	Halbfestes Produkt aus dem	100 bis 200 Verdünnungseinheiten pro mg	1	55	S-180
Extrakt	0,5	46	HS Nr. 1
4.	Fraktion B	keine	1	keine	S-180
5.	Glasartiger Feststoff	200 bis 40 Verdünnungseinheiten pro mg	0,5	50 bis 70	S-180
6.	Öliges Material	keine	1	zweifelhaft	S-180
8.	Fraktion C	keine	20	27	S-180
9.	Fraktion D	1000 Einheiten/mg	5	33	HS Nr. 1
10.	Fraktion D2	1000 Einheiten/mg	5	64	HS Nr. 1
11.	Fraktion E	200 Einheiten/mg	0,2	65	HS Nr. 1

Die genaue Bedeutung der gleichzeitigen Produktion von Cycloheximid und Verbindung E 73 und den beiden weniger wirksamen Stoffen Fraktion B und Fraktion C ist nicht bekannt. Wie sich jedoch aus den oben angegebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften dieser Stoffe schließen läßt, erscheint eine strukturelle Verwandtschaft zwischen ihnen wahrscheinlich und mikrobiologische und synthetische Zwischenumwandlungen durchführbar.

Zur technischen Herstellung von Verbindung E 73 und zur Herstellung von Fungicidin und Cycloheximid nach dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet man ein Mittel mit ähnlicher Zusammensetzung wie das oben für die Verwendung im Laboratorium beschriebene. Das Wachstum des Mikroorganismus und die Antibiotikumerzeugung erreichen ihr Maximum gewöhnlich nach etwa 4 bis 5 Tagen. Wird jedoch eine abweichende Anlage verwendet, so können die Belüftungs- und Rührgeschwindigkeit usw. die Schnelligkeit beeinflussen, mit der die maximale Wirksamkeit erreicht wird. Im allgemeinen wird die Gärung so lange fortgesetzt, bis dem Medium eine beträchtliche antimikrobische Wirksamkeit auf Basis des Versuchs mit S.cerevisiae mitgeteilt worden ist. Gewöhnlich ist eine Zeit von 24 Stunden bis 5 Tage bei

etwa 26 bis 30°C erforderlich. Die Belüftung des Mediums bei submersem Wachstum wird in einem Umfang von etwa ¹I₂ bis 2 Volumen Luft pro Volumen Brühe pro Minute aufrechterhalten. Das Rühren wird durch geeignete, in der Gärungsindustrie im allgemeinen übliche Rührwerke durchgeführt. Selbstverständlich müssen während der Übertragung des Impfstoffes und während des Wachstums des Mikroorganismus aseptische Bedingungen aufrechterhalten werden. Das Mycel wird aus der Gärbrühe durch verschiedene übliche Vorrichtungen, wie z. B. Filter usw., entfernt. Danach läßt sich das Antibiotikum durch mehrere verschiedene Verfahren einschließlich Lösungsmittelextraktion zur Entfernung von Materialien aus der Brühe mit Ionenaustauscherharzen und Absorption auf verschiedenen Materialien, wie z. B. Kohlenstoff und Tonerde, aus der Gärflüssigkeit gewinnen. Wie bereits oben erwähnt wurde, wird bei Anwendung von Lösungsmittelextraktion zur Entfernung der antitumoraktiven Substanz aus der filtrierten Flüssigkeit ein pH-Wert von 2 bis 8 bevorzugt. Das aktive Material läßt sich aus Lösungsmittelextrakten durch Absorption auf verschiedenen Materialien einschließlich Kieselerdegel, Tonerde, Kohle, Ton, Fluorosil, Magnasol und anderen Silikaten entfernen oder durch Verdampfung oder Ausfällung gewinnen.

Die Verbindung E 73 ist eine verhältnismäßig giftige Substanz. Es wurde gefunden, daß eine tödliche Dosis für Mäuse bei Einspritzung in das Bauchfell etwa 700 mcg/kg Körpergewicht beträgt. Bei Einspritzung unter die Haut war der Stoff weniger giftig. Bei 7tägigen Giftigkeitsversuchen mit gesunden Mäusen, denen nach der bei den Sarcoma-180-Versuchen verwendeten Vorschrift die reine kristallinische Verbindung E 73 (täglich zwei Einspritzungen von 0,5 ecm wäßrigen Lösungen, die entsprechende Arzneikonzentrationen enthielten) verabreicht wurde, betrug LD₅₀ 600 mcg/kg.

Obwohl die parenterale Anwendung von E 73 in entweder wäßriger Lösung oder Lösung in physiologischer Kochsalzlösung bei der Behandlung von Krankheiten bei Tieren und Menschen recht befriedigend ist, lassen sich auch verschiedene Arten von pharmazeutischen Präparaten vorteilhaft mischen, die E 73 enthalten und sowohl flüssige als auch feste Verdünnungsmittel sein können. Die Substanz kann auch oral eingeführt werden, doch wird im allgemeinen die parenterale Anwendung bevorzugt. Für die jederzeit mögliche Verdünnung können feste Präparate hergestellt werden, die verschiedene Puffersubstanzen sowie örtliche Betäubungsmittel und anorganische Salze zur Gewährleistung erwünschter pharmakologischer Eigenschaften enthalten.

Trotz seiner ziemlich hohen Giftigkeit hat E 73 einen sehr günstigen therapeutischen Index, da Dosierungen von 50 bis 250 mcg/kg höchst wirksam zur Hemmung von Tumoren bei Tieren und Menschen sind. Die Verbindung E 73 wird vorzugsweise parenteral in Form von verdünnten Lösungen oder Suspensionen angewandt. Die reine Substanz reizt die Haut und die Schleimhäute und sollte daher in verdünnten Lösungen, d. h. Lösungen mit Konzentrationen nicht über etwa 5 mg/ccm angewendet werden. Für ihre Anwendung können verschiedene pharmakologisch verträgliche Lösungsmittel einschließlich Wasser, Propylenglykol, Diäthylcarbonat, Glycerin usw. verwendet werden, denn die Substanz ist beständig und mit all diesen Medien verträglich. Außerdem kann E 73 auch in Form von Suspensionen mit Trägern, wie z. B. Erdnußöl oder konzentrierten Sorbitlösungen usw., verabreicht werden.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren ausführlichen Erläuterung von Verfahren zur Durchführung der

vorliegenden Erfindung, sollen jedoch keinesfalls als Einschränkung gelten.

Beispiel I

Es wurden etwa 101 einer Gärflüssigkeit folgender Zusammensetzung hergestellt und die Grundmischung auf einen pn-Wert von 7 gebracht.

Glucose 10 g/1

Sojabohnenmehl 15 g/1

Dikaliumphosphat 5 g/1

Natriumchlorid 2 g/1

Lösliche Stoffe aus der Destillation ... 2,5 g/1
Calciumcarbonat 2 g/1

Die Flüssigkeit wurde dann auf eine Anzahl von 11 fassenden Erlenmeyerkolben verteilt, von denen jeder etwa 225 ecm des Mediums enthielt und die Kolben mit Inhalt 20 Minuten im Autoklav bei einem Dampfdruck von 6,8 kg (121 °C) sterilisiert. Die Herstellung des Impfstoffes erfolgte durch Übertragung des Wachstums eines Schrägbodens von Streptomyces albums ATCC 12 757 mit guter Sporenbildung in eine Flasche mit dem obigen Medium und 36- bis 40stündige Inkubation auf einer drehbaren Schüttelvorrichtung bei 28° C Es wurden zwei solcher Impfstoffflaschen präpariert. Die übrigen sterile Flüssigkeit enthaltenden Flaschen wurden dann mit etwa 5% ihres Volumens Impfstoff geimpft und 65 Stunden unter Schütteln bei 28° C inkubiert. Die fertige Flüssigkeit wurde sodann durch Glaswolle filtriert und das helle Filtrat durch einen Sinterglasfilter mit ultrafeiner Porosität geleitet, so daß man ein steriles Filtrat erhielt. Durch den normalen Plattenversuch wurde gefunden, daß dieses Filtrat etwa 200 bis 300 Saccharomyces-cerevisiae-Verdünnungseinheiten Wirksamkeit pro ecm enthielt.

Bei 15facher Verdünnung mit physiologischer Salzlösung und subcutaner Einspritzung in Mengen von 0,5 ecm an zwölf aufeinanderfolgenden Tagen war diese filtrierte Gärungsbrühe in der Lage, das Wachstum von menschlichen Tumoren, die in Ratten gezüchtet wurden, zu hemmen. Das bereits erwähnte menschliche Sarcom H. S. Nr. 1 wurde nach der obigen Beschreibung in Ratten gezüchtet und die Ratten nach der obigen Vorschrift behandelt. Zur Kontrolle wurden ähnliche tumortragende Ratten mit physiologischer Salzlösung behandelt. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle IV aufgeführt. Aus dieser Tabelle geht hervor, daß diese Behandlung eine Herabsetzung der Tumorgröße von etwa 50% bewirkte. In ähnlicher Weise bewirkte diese Flüssigkeit bei 20facher Verdünnung mit physiologischer Kochsalzlösung 25- bis 75%ige Herabsetzungen der Tumorgrößen bei Mäusen, die Sarcoma-180-Tumore tragen, wenn sie 7 Tage lang zweimal täglich in Dosen von je 0,5 ecm in das Bauchfell eingespritzt wurde.

TabeHe IV

Hemmung von Tumoren mit verdünnter Gärflüssigkeit; H.S. Nr. 1

Substanz	Mittleres Tumorgewicht (g) ± Normal- abweiclxung
Ultraültrat, 1- bis 15fache Verdün
nung	6,84 ± 2,81
Physiologische Kochsalzlösung
(KontroUe)	14,12 ± 1,44

Beispiel II

Zur Gewinnung von Fungicidin (Fraktion A) wird eine lach Beispiel I hergestellte Gärflussigkeit einmal mit ■j_s Volumen n-Butanol ausgezogen. Die Lösungsmittelichicht wird dann zur Extraktion des Mycelkuchens verwendet. Der endgültige Extrakt wird bei herabgesetztem Druck auf ein Zwanzigstel des Ausgangsvolumens konlentriert. Bei längerem Stehen im Kühlschrank trennt sich von diesem Konzentrat ein blaßgelber mikrokristalinischer Stoff ab. Der Stoff wird gesammelt und mit xockenem Butanol gewaschen. 1 g dieses Rohmaterials ,vird mit einem Gemisch von je 20 ecm der beiden Schichten des Lösungsmittelgemisches Wasser-Äthylicetat-t-Butanol (5:4:1) geschüttelt. Die Schichten *5 ,Verden getrennt, und die klare wäßrige Schicht wird zur ^uskristallisation in den Kühlschrank gestellt. Der sich abtrennende blaßgelbe feste Stoff wird gesammelt und mit Wasser gewaschen. Das kristallinische Produkt besteht aus kleinen rechteckigen Platten, die unter Zersetzung bei etwa 150° C schmelzen und hat folgende Zusammensetzung in naher Übereinstimmung mit der oben für Fungicidin angegebenen: C 59,95, H 8,30, N 1,33.

Beispiel III ²S

Etwa 101 der nach Beispiel I hergestellten filtrierten Gärflüssigkeit wurden bei einem pn-Wert von 7 mit 51 Äthylacetat ausgezogen. Es wurde gefunden, daß die verbrauchte Brühe sowohl bei dem Antitumorversuch (H.S. Nr. 1) als auch dem Antihefeversuch fast unwirksam war. Auf der anderen Seite enthielt der Äthylacetatextrakt für jeden Versuch höchst wirksames Material. Der Lösungsmittelextrakt wurde unter herabgesetztem Druck bei einer Temperatur von 30 bis 40° C auf etwa ein Fünfzigstel seines ursprünglichen Volumens eingedampft. Der Rückstand wurde dann in 5 Volumen hochsiedenden Petroleumäther (Siedepunkt 60 bis 90° C) gegossen. Die sich niederschlagende halbfeste Masse wurde gesammelt. Ihr Gewicht betrug etwa 50 % des Gewichtes des ursprünglichen Äthylacetatkonzentrats, das mit Petroleumäther behandelt worden war. Durch Schütteln mit 80%igem wäßrigem Methanol (V/V) wurde eine weitere Menge festes Material aus dem obenschwimmenden Petroleumäther gewonnen. Das Lösungsmittel wurde aus der wäßrigen Methanolschicht entfernt und das Konzentrat den ursprünglich ausgefällten Eeststoffen zugesetzt. Es wurde gefunden, daß dieses amorphe Konzentrat eine Anzahl von Bestandteilen enthielt, die außer E 73 Cycloheximid und nicht identifizierte, biologisch unwirksame Materialien umfaßten. Diese teilweise gereinigte E 73-Zusammensetzung wurde zur Behandlung von Sarcoma 180 und H.S.-Nr. I-Tumoren verwendet, wobei es in Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung in einer Konzentration von etwa 1 mg/ccm gelöst und Tieren, die die obengenannten Tumore tragen, in einer Dosis von 0,5 bis 1 mg/kg subcutan verabreicht wurde. ImVergleich zu den unbehandelten Kontrollen wurde das Wachstum dieser Tumore im Umfang von etwa 50 % gehemmt.

In getrennten Arbeitsgängen wurden Chloroform, Butanol und Methylisobutylketon zur Lösungsmittelextraktion der Gärflüssigkeit in den gleichen wie bei Äthylacetat verwendeten Mengen angewendet. In anderen Arbeitsgängen ergab die Lösungsmittelextraktion bei pH-Werten im Bereich von 2 bis 8 äquivalente Ergebnisse.

Beispiel IV

Aus dem Produkt des Beispiels III wurde ein stärker gereinigtes E 73-Konzentrat hergestellt. Man stellte eine

25 cm lange chromatographische Säule mit einem Durchmesser von 8,9 cm her, die 2 bis 2,5 kg mit Säure gewaschene Tonerde (Merck) enthielt. 100 g des rohen Produktes von Beispiel II wurden sodann in 6 bis 111 Äthylacetat gelöst, und diese Lösung ließ man durch die Säule perkolieren. Das entstandene Chromatogramm wurde dadurch entwickelt, daß man frisches Lösungsmittel (Äthylacetat) und anschließend ein Lösungsmittelgemisch durch die Säule leitete, das aus Äthylacetat bestand und etwa 2 Gewichtsprozent Methanol enthielt. Vor der Einführung des Lösungsmittelgemisches wurden etwa 10 bis 121 Äthylacetat zur Entwicklung verwendet. Insgesamt wurden zur Entwicklung des Chromatogramms etwa 161 Lösungsmittel verwendet. Das Eluat wurde in Mengen von je 500 ecm gesammelt, das Lösungsmittel wurde aus jedem verdampft und der Fortschritt der Entwicklung wurde durch Messen des Trockengewichtes und den Antihefenversuch bei jeder Fraktion verfolgt. Die Rückstände wurden sodann auf Grand ihrer Antihefenproben in Fraktionen vereinigt. Die Entwicklung wurde so lange fortgesetzt, bis sämtliches antihefenwirksames Material entfernt war.

Die erste Fraktion bestand aus etwa 10°/₀ sämtlicher in die Säule eingeführten Feststoffe. Sie wurde als Fraktion B bezeichnet und war in einer Menge von 1 mg/kg beim Antihefen-und S-180-Antitumorversuch unwirksam. Bei höheren Dosen ist sie wirksam. Dieses Material ist kristallinisch und besteht aus farblos matten Nadeln mit einem Schmelzpunkt bei 258 bis 260° C Ihre Löslichkeit in den übHchen, sowohl polaren als auch nicht polaren Lösungsmitteln und in Wasser ist sehr gering. Dagegen ist sie in Pyridin und in Dimethylformamid löslich. Bei Einwirkung von ultraviolettem Licht zeigen die Kristalle eine hellgelbe Fluoreszenz. Ihre Lösung in wäßrigem Alkali ergibt eine gelbe Lösung, deren Behandlung mit Säure zur Ausfällung der ursprünglich unveränderten Substanz führt. Die Mikroanalyse zeigt, daß die kristallinische Fraktion B 70,03% Kohlenstoff, 6,2% Wasserstoff und 10,40 % Stickstoff enthält. Sie weist bei 320 πιμ im Ultraviolettbereich des Spektrums ein Maximum auf und hat einen Auslöschungskoeffizienten^! Di*, = 101 und eine spezifische Drehung [a]f = + 3,43° (c = 0,4 in Dimethylformamid).

Der Rest der Eluatrückstände wurde vereinigt, so daß eine zweite Fraktion entstand, die etwa 50 Gewichtsprozent der ursprünglich in die Säule eingeführten Feststoffe und den Hauptanteil der Antihefen- und Antitumor Wirksamkeit enthielt. Es war ein neutraler, glasähnlicher Feststoff, der in Wasser ziemlich löslich in den üblichen organischen Lösungsmitteln sehr löslich war. Es erwies sich als ein Gemisch aus Cycloheximid, E 73 und unwirksamem Material. In Dosen von 250 bis 500 mcg/kg/Tag zeigte es sich sehr wirksam zur Hemmung von sowohl Sarcoma 180 als auch H.S. Nr. 1 bei Mäusen und Ratten, wenn es in wäßriger Lösung oder in physiologischer Kochsalzlösung ins Bauchfell eingespritzt wurde.

Beispiel V

Aus dem Konzentrat von Beispiel IV wurde eine reine kristallinische Probe von Verbindung E 73 durch Trennungschromatographie auf Kieselerdegel hergestellt, das mit wäßrigem, methanolgesättigtem Isopropyläther behandelt wurde. 100 g Kieselerdegel wurden in 11 Isopropyläther suspendiert, der zuvor mit 55%igem wäßrigem Methanol (V/V) im Verhältnis von 1 Volumen des wäßrigen Methanols zu 5 Volumen Isopropyläther geschüttelt worden war. Etwa 25 ecm der unteren wäßrigen Methanolphase wurden mit der obigen Kieselerdeauf schlämmung gemischt, bis das Kieselerdegel

Claims (4)

gleichmäßig imprägniert war. Etwa vier Fünftel dieser Aufschlämmung wurden sodann in eine Glassäule von geeigneter Größe eingeführt. Danach wurden 6 g des glasähnlichen festen Produktes von Beispiel IV dem übrigen Teil der imprägnierten Kieselerdegelaufschlämmung zugesetzt, was zur Adsorption auf dem Kieselerdegel führte. Dieses wurde sodann der Säule zugesetzt, und es begann die Entwicklung der Säule unter Verwendung des nach obiger Beschreibung hergestellten 55°/0igen wäßrigen methanolgesättigten Isopropylätherlösungsmittels. Teile des Eluats wurden gesammelt, das Lösungsmittel entfernt, die Rückstände gewogen und geprüft und die Fraktionen aus aufeinanderfolgenden Rückständen auf Grund ihrer physikalischen und biologischen Eigenschaften gesammelt. Die ersten 500 ecm des Eluats enthielten verhältnismäßig unwirksames öliges Material. Die nächsten 250 ecm enthielten zwei kristallinische Substanzen, von denen eine mit der oben beschriebenen Fraktion B (Beispiel IV) identisch war und die zweite abweichend war, jedoch eine vergleichbare biologische Wirksamkeit ao aufwies und mit Fraktion C bezeichnet wurde. Bei dem Antitumorversuch mit 10 mg/kg erwies sie sich als wirksam. Dieses Gemisch aus B und C wog etwa 0,5 bis 1,0 g und wurde durch Auslaugen von C aus B mit Äthylacetat in seine Bestandteile getrennt. Im Gegensatz zu Fraktion B zeigte die kristallinische Fraktion C mit einem Schmelzpunkt von 196 bis 198° C [a] %5 = + 5,06° (c = 0,4 in Dimethylformamid) bei Einwirkung von Ultraviolettlicht keine Fluoreszenz und wies Absorptionsmaxima im Ultraviolettbereich des Spektrums bei 262 ιημ und 347 πιμ von Eil = 428 bzw. 138 auf. Die nächsten 250 ecm des Eluats enthielten ziemlich niedrige Konzentrationen gelöster Feststoffe, die aus B und C bestanden und mit anderen Materialien gemischt waren. Die nächste 1,5 bis 2,5 g wiegende Hauptfraktion erhielt man aus dem 1-I-Anteil des Eluats, der nach den ersten 1,5 1 des Eluats gesammelt wurde. Sie bestand aus zwei verschiedenen kristallinischen Formen von Cycloheximid. Diese wurden als weiche Abart, Fraktion D, sowie harte Abart, Fraktion D2, bezeichnet. Die harte Abart hatte einen scharfen Schmelzpunkt bei 118 bis 119°C, der in Übereinstimmung mit dem für eine authentische Probe erhaltenen Wert war, die zweimal aus Äther umkristallisiert wurde. In dem gemischten Schmelzpunkt der harten Abart mit der Originalprobe gab es keine Senkung. Die weiche Abart, Fraktion D, hatte einen etwas weniger genauen Schmelzpunkt bei etwa IlO0C Ein Gemisch aus den beiden Formen schmolz unterhalb IOO0C Jede kristallinische Form verursachte die Auskristalhsation ihrer eigenen Abart aus gesättigten Lösungen von Cycloheximid. Unterschiede in den Infrarotspektren der weichen und harten Abarten unter Verwendung von l%igen KaUumbromidverdünnungen der beiden Substanzen wurden bei folgenden Wellenzahlen im Infrarotbereich des Spektrums beobachtet: 3584, 1364, 1321, 1199, 1186, 1101, 1087, 1081, 1073 und 980 cm-1. Die Entwicklung des Kieselerdegelchromatogramms mit zusätzlichem Gemisch aus Isopropyläther und wäßrigem Methanollösungsmittel wurde so lange fortgesetzt, bis kein weiteres hefenwirksames Material erzielt wurde. Hierzu waren 2 1 Lösungsmittel erforderlich. Bei Verdampfung des Lösungsmittels blieb ein Rückstand, der sich bei dem Antitumorversuch als höchst wirksam erwies und aus der reinen Verbindung E 73 bestand. Obwohl sich dieses Material in offensichtlich reinem Zustand befand, war es nicht kristallinisch, sondern ließ sich zu einem weißen Pulver pulverisieren. Durch Behandlung seiner gesättigten Lösung in Äthanol mit 4 Volumen Äther erhielt man von diesem Material eine kristallinische Probe. Dieses Verfahren führte zur Ge- winnung von 75% des nicht kristallinischen Feststoffs als reines kristallinisches E 73 mit einem Schmelzpunkl von 140 bis 141° C Analyse für C15H25O5N: Berechnet C 60,59, H 7,80, N 4,71; gefunden C 60,48, H 7,70, N 4,44, 60,57, 7,62, 4,27. [aYo5 = 8,8° (c = 1,0 in Methanol). KristaUinisches E 73 ist in Wasser, den niederen Alkoholen und Äther mäßig löslich, in Chloroform, Methylenchlorid und Aceton dagegen leicht löslich. Bei seiner Behandlung mit Ferrichloridninhydrin oder mit Brom zeigt sich keine charakteristische Reaktion. Wie bereits erwähnt wurde, wird E 73 durch wäßriges Natriumhydroxyd über einem pn-Wert von 8 unter Entwicklung von Ammoniak zersetzt. Das ebulioskopisch ermittelte Molekulargewicht in Aceton beträgt 287. Der für die Formel C15H23NO5 berechnete Wert ist 297. Daß die Substanz eine Carbonylgruppe enthält, wird durch die Bildung von Derivaten mit Hydroxylamin und 2,4-Dinitrophenylhydrazin bewiesen. Die quantitative Ermittlung von Carbonylsauerstoff durch Titrieren des frei gewordenen HCl bei Reaktion mit Hydroxylanrmhydrochlorid ergibt 0,82 Mol pro Mol E 73, bezogen auf das obenerwähnte Molekulargewicht. Die charakteristischen Absorptionsmaxima im Infrarotbereich sind bei den Wellenlängen in der Tabelle aufgeführt. Durch Lösung von 0,3 g E 73 in 1 ecm Pyridin und 0,5 ecm Essigsäureanhydrid und 24stündiges Stehenlassen des Gemischs bei Raumtemperatur erhielt man ein kristallinisches Acetatderivat. Die Flüssigkeiten wurden im Vakuum verdampft, und der Rückstand wurde durch Behandlung mit Äther auskristallisiert. Dieses Produkt bestand aus umkristallisierten rechteckigen Platten mit einem Schmelzpunkt von 170 bis 171°. Analyse: C 59,48, H 71,35, N 3,97. Auf ähnliche Weise erhielt man durch 30 Minuten Behandlung von 3,0 g in 1 ecm Pyridin gelösten E 73 mit 0,2 g p-Nitrobenzoylchlorid bei IOOcC ein kristallinisches p-Nitrobenzoatderivat. Das Gemisch wurde abgekühlt und mit IOOccm 0,5n-Salzsäure behandelt, und der ausgefällte Feststoff wurde gesammelt und aus 1 : 4-Methylenchloridäther umkristallisiert, so daß man das kristallinische Derivat in Form von formlosen Platten mit einem Schmelzpunkt von 167 bis 168° C erhielt. Die oben hergestellten Acetat- und p-Nitrobenzoatderivate fallen wie andere Ester der Carbonsäuren innerhalb des Bereiches der vorliegenden Erfindung. Sie werden auf ähnliche Weise hergestellt. Beispiele für derartige Ester sind die niederen Alkanoate, wie z. B. das Propionat, Butyrat, Valerat, Succinat, Acrylat und Maleat; die höheren Alkanoate, wie z.B. das Palmitat und Stearat, und die aromatischen Kohlenwasserstoffcarboxylate, wie z. B. das Benzoat, Toluat und Naphthoat. Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung der biologisch wirksamen Stoffe E 73, Cycloheximid und Fungicidin, dadurch gekennzeichnet, daß man ein wäßriges Nährmedium mit einem Stamm von Streptomyces albums submers und aerob fermentiert und gegebenenfalls die gebildeten Wirkstoffe, vorzugsweise jeden für sich, gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Fungicidin durch Filtrieren der

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Gärbrühe und Lösungsmittelextraktion der gesammelten Feststoffe gewinnt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Cycloheximid und E 73 enthaltendes Gemisch durch Filtrieren der Gärbrühe und 5
Lösungsmittelextraktion des Filtrats gewinnt.

4. Verfahren nach Anspruch!, dadurch gekennzeichnet, daß man das Cycloheximid und die Verbindung E 73 enthaltende Gemisch durch Adsorption des Gemisches an Kieselerdegel und selektive Auswaschung des Cycloheximids und der Verbindung E73 trennt.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen