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Verfahren zur Herstellung von Lipopolysacchariden Gegenstand der Erfindung
ist ein Verfahren zur Herstellung biologisch aktiver Lipopolysaccharide, die auf
Grund ihrer antitoxischen Wirkung als prophylaktische Mittel wertvoll sind. Beschrieben
werden gleichfalls prophylaktische Zusammensetzungen, die diese aktiven Lipopolysaccharide
zusammen mit Corticosteroiden enthalten.
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Bisher traten pyrogene Eigenschaften stets zusammen mit bakterieller
Verunreinigung auf. In diesem Zusammenhang wird darauf hingewiesen, daß die Ausdrücke
» pyrogena und » endotoxisch « vom Fachmann im allgemeinen als Synonyme angesehen
werden. Obgleich das hohe Maß an biochemischer Komplexizität, die gewöhnlich mit
einer pyrogenen Reaktion verbunden ist, bereits seit langer Zeit bekannt ist, schien
die Möglichkeit, eine chemisch induzierte, pyrogene Umsetzung in der Praxis durchzuführen,
vor der vorliegenden Erfindung äußerst fernzuliegen.
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Die erfindungsgemäß aus Zellen des Mikroorganismus Aerobacter aerogenes
erhaltenen Lipopolysaccharide stimulieren die reticulo-endotheliale phagozytische
Funktion anhaltend und intensiv ; sie erzeugen eine erhöhte Widerstandsfähigkeit
gegenüber Infektionen und eine nichtspezifische Immunität bei Tieren sowie beim
Menschen. Ihre Wirkung auf Phagozytose und die nichtspezifische Immunität wird mit
allen Verabreichungsarten erzielt. Als prophylaktische Mittel sind sie bei tödlichen
Dosen von Staphylococcus aureus Fritchie und Pseudomonas fluorescens bei Säugetieren
sowohl bei oraler als auch parenteraler Verabreichung von Wert. Schließlich bewirken
sie eine Verminderung der Toxizität von giftigen, organischen Substanzen bei Tieren
und Menschen.
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Außerdem hat sich gezeigt, daß die biologisch aktiven Lipopolysaccharide
aus Zellen des Aerobacter aerogenes im Gemisch mit ACTH und verschieden. en Corticosteroiden,
die wegen ihrer Heilwirkung bei rheumatoider Arthritis und wegen ihrer entzündungshemmenden
Wirkung wertvoll sind (z. B. Cortison, Hydrocortison, 9a-Fluorhydrocortison, Prednison,
Prednisolon, 6a-Methylprednisolon, 9a-Fluor-16a-oxyhydrocortison, 9a-Fluor-16a-methylhydrocortison,
9o ;-Fluor-164-methylhydrocortison sowie den entsprechenden Salzen und Estern, beispielsweise
den wasserlöslichen Steroid-21-estersalzen der in der USA.-Patentschrift 2 708 651
beschriebenen Art), besonders vorteilhafte therapeutische Eigenschaften aufweisen,
Beispielsweise wird die von den Corticosteroiden bei hohen Konzentrationen erzeugte,
blockierende Wirkung auf die phagozytische Aktivität des reticuloendothelialen Systems
in jedem Fall durch die gleichzeitige Verabreichung eines Lipopolysaccharids des
Aerobacter
aerogenes ausgeschaltet ; außerdem haben Gemische von Corticosteroiden und Lipopolysacchariden
von Aerobacter aerogenes eine äußerst intensive stimulierende Wirkung auf das reticulo-endotheliale
System, was zum Auftreten einer großen Anzahl von Makrophagen in der Milz, Leber
und den Lympidrüsen und zum Eintreten dieser Makrophagen in den Kreislauf führt
; ferner haben derartige Gemische eine noch größere Wirkung auf die Phagozytenbildung
als die Komponenten für sich.
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Die erwähnten vorteilhaften Ergebnisse bezüglich der Wirkung der
erfindungsgemäßen Verbindungen wurden durch Anwendung der bereits in der Literatur
beschriebenen (J. F. Snell und R. Garkuscha, RES Bulletin, 2, S. 46 [1956]) Chromphosphatabscheidungsmethode
ermittelt.
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Lipopolysaccharide sind komplexe Zucker, die aus einem Polysaccharidanteil
bestehen, der mit einer höheren Fettsäure, beispielsweise einer höheren aliphatischen
Kohlenwasserstoffcarbonsäure, verbunden ist. Die Elementarmikroanalyse ergibt die
Anwesenheit von Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Phosphor.
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Erfindungsgemäß werden die neuen Lipopolysaccharide hergestellt,
indem man Aerobacter aerogenes in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen, aeroben
Bedingungen kultiviert, bis schnell wachsende Zellen erhalten werden, dann die Zellen
von dem
Medium abtrennt, die Zellen zerkleinert und die Lipopolysaccharide
aus den zerkleinerten Zellen gewinnt. Das Isolierungsverfahren stellt eine Modifikation
des Westphalschen Verfahrens dar (Angew.
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Chemie, Bd. 66, S. 407 bis 417 [1954]). Vollständig entwickelte Zellen
des A. aerogenes, ATCC Nr. 12409, können nach einem Verfahren erhalten werden, das
für ihre Kultivierung bei der Lysinfermentation von L. E. Casida jr. in der USA.-Patentschrift
2 771 396 beschrieben ist. Im allgemeinen besteht ein solches Verfahren darin, daß
man eine Kultur dieses besonderen Mikroorganismus verwendet, um ein geeignetes,
wäßriges Nährmedium damit zu impfen. Das geimpfte Medium wird dann unter submersen,
aeroben Bedingungen ständig gerührt. Nach einer normalen Kultivierungszeit wird
das Produkt entweder abgetrennt oder weiter zur Impfung einer größeren Menge eines
geeigneten Mediums benutzt. Nach Abschluß der Wachstumsstufe in dem größeren Gefäß
werden die fertigen Zellen durch Filtrieren, Zentrifugieren, Gefriertrocknen u.
dgl. gewonnen und wie beschrieben isoliert.
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Es ist zu beachten, daß man das Isolierungsverfahren auf das zu behandelnde
Lipopolysaccharidmaterial abstimmt. Im allgemeinen wird ein Verfahren angewendet,
bei dem man die Zellen zunächst mechanisch zerkleinert und dann zentrifugiert, wobei
ein Sediment erhalten wird, welches anschließend mit einer verdünnten, wäßrigen
Lösung von Trypsin unter einer aromatischen Kohlenwasserstoffschicht, wie z. B.
Benzol, Toluol, Xylol, und dergleichen bei einem pH-Wert von etwa 8, 5 behandelt
wird. Man zentrifugiert dann erneut und extrahiert anschließend das erhaltene Sediment
mit einer konzentrierten, wäßrigen Phenollösung, trennt die erhaltene wäßrige Schicht
ab, dialysiert sie und gibt dann so viel Alkalimetallacetat zu, daß eine wäßrige
Lösung mit einer Acetationenkonzentration von etwa 1 °/o erhalten wird. Danach werden
die Lipopolysaccharide mit Alkohol aus der mittels Acetationen eingestellten, wäßrigen
Lösung ausgefällt. Die weitere Reinigung des Produkts kann dadurch erreicht werden,
daß man die Lipopolysaccharidfällung in Wasser suspendiert, die erhaltene wäßrige
Suspension zentrifugiert, dann das erhaltene Sediment gewinnt und die obenschwimmende
Flüssigkeit gefriertrocknet, um die gewünschten Lipopolysaccharide in fester Form
zu gewinnen.
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Nach einer spezifischeren Ausführungsform des vorstehenden Verfahrens
zur Isolierung von biologisch aktiven Lipopolysacchariden des Aerobacter aerogenes
wird das im Beispiel 1 ausführlich beschriebene Verfahren bevorzugt. Die Lipopolysaccharidfraktion,
die auf diese Weise aus den Zellen des Mikroorganismus erhalten wird, zeigt die
wirkungsvollste Biopotenz von allen Fraktionen, die aus Zellen von lebenden Organismen
bis jetzt gewonnen werden.
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Außer durch die erwähnten Biopotenzeigenschaften wurden die erfindungsgemäßen
Lipopolysaccharide durch die Elementarmikroanalyse, d. h. durch den prozentualen
Stickstoff-und Phosphorgehalt sowie den durch das Park-Johnson-Verfahren festgestellten
Glukosegehalt identifiziert. Die analytischen Werte sind im Beispiel I angegeben.
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Wie bereits erwähnt, sind die erfindungsgemäß hergestellten Lipopolysaccharide
zur Verwendung als prophylaktische Mittel gut geeignet. Sie verleihen Tieren nach
oraler oder parenteraler Verabreichung vor der Infektion eine nichtspezifische Immunität.
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Außerdem wurde gefunden, daß die Toxizität dieser bakteriellen Lipopolysaccharide
sehr niedrig ist, wenn sie an Mäuse in der Menge verabreicht werden, mit der die
gewünschte Wirkung erzielt wird. Bei einer derartigen Verabreichung konnten keine
schädlichen, pharmakologischen Wirkungen beobachtet werden.
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Gemische von Corticosteroid und Lipopolysaccharid stimulieren die
macrophage Aktivität in weit größerem Maße als normalerweise zu erwarten wäre. Beispielsweise
verursacht Cortisonacetat in einer Menge von 10 mg/kg eine 320/oigne Hemmung der
Chromphosphatentfernung bei Mäusen, und A. aerogenes-Lipopolysaccharide in einer
Konzentration von 1, 0 mg/kg erzeugt unter den gleichen Bedingungen, wie durch Bestimmung
der » Halbzeit « 24 Stunden später festgestellt wurde, eine Verstärkung der Phagozytose
von 53 °/0. Eine Kombination dieser beiden Komponenten in den entsprechenden Konzentrationen
führt zu einem 70°/oigen Ansteigen der Phagozytose im Vergleich zu den Kontrollwerten.
Damit ist die bei Vermischen dieser beiden Komponenten auftretende synergistische
Wirkung eindeutig bewiesen. Die biologische Aktivität dieser neuen und wertvollen
Substanzen wird durch die beschriebenen Versuche eingehend erläutert.
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Die neuen Lipopolysaccharide können in den üblichen Dosierungsformen
(z. B. in fester, suspendierter oder gelöster Form) oral oder parenteral zusammen
mit den üblichen Trägern (z. B. Saccharose, Calciumcarbonat, Stärke, Gummiarabikum
oder Talkum) verabreicht werden. Gegebenenfalls können sie mit anderen wirksamen
Bestandteilen, wie Antibiotika, vermischt werden. Gemische von Corticosteroiden
und den neuen Lipopolysacchariden zeigen, wie bereits erwähnt, eine besonders vorteilhafte
Wirkungsweise.
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Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele erläutert.
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Beispiel 1 Es wurden große Mengen von A. aerogenes (ATCC 12 409)-Zellen
mit Hilfe einer in Versuchstanks vorgenommenen Lysinfermentation bereitgestellt.
Eine 100-g-Probe der gezüchteten, feucht gepackten Zellen wurde in 25 cm3 steriles
Wasser gegeben, das 50 cm3 Glasperlen enthielt, und das erhaltene Gemisch wurde
24 Stunden lang mechanisch bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurden dem Gemisch
10 cm3 95°/oiger kthylalkohol zugefilgt, und das Schütteln wurde weitere 16 Stunden
lang fortgesetzt. Die erhaltene Suspension wurde zentrifugiert und die obenschwimmênde
Flüssigkeit anschließend abgegossen.
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Das Sediment wurde dann in 350 cm3 Wasser gelöst, die Lösung wurde
etwa 21/2 Stunden gerührt und dann etwa 16 Stunden in einem Kühlschrank abgestellt.
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Nachdem die Lösung Raumtemperatur erreicht hatte, wurde der pH-Wert
mit 20"/figer Kaliumhydroxydlösung auf 8, 5 eingestellt. Die erhaltene basische
Lösung wurde mit Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 1500 cm3 verdünnt, um das
Eindicken zu verhindern. Danach wurde 1 °/Oiges, wäßriges Trypsin zugegeben. Während
der Zugabe und der folgenden 45 Minuten wurde gerührt. In der erhaltenen Lösung
wurde dann erneut mit 20°/Oiger Kaliumhydroxydlösung ein p-Wert von 8, 5 eingestellt.
Die Flüssigkeit wurde mit Toluol überschichtet und dann bei 37°C etwa 16 Stunden
inkubiert. Der p-Wert wurde erneut mit 20°/oiger Kaliumhydroxydlösung auf 8, 5 eingestellt
und die Inkubation bei der angegebenen Temperatur weitere 24 Stunden fortgesetzt.
Das auf
diese Weise erhaltene Medium wurde dann etwa 16 Stunden
lang in einen Kühlschrank gestellt und anschließend bei 12 000 g zentrifugiert,
wobei ein aus mehreren Schichten bestehender Festkörper (150 cm3), eine obenschwimmende
Flüssigkeit und eine weiße, fettige Schicht erhalten wurde. Nach Entfernung der
beiden letzteren Komponenten auf übliche Weise wurde der Festkörper mit einem gleichen
Volumen an 90°/oigem Phenol behandelt und die erhaltene Lösung unter ständigem Rühren
auf 65 bis 68 °C erhitzt und anschließend 20 Minuten bei dieser Temperatur gehalten.
Nach Kühlung auf 30°C wurde die Bildung einer wäßrigen Schicht und einer Phenolschicht
festgestellt. Die wäßrige Schicht wurde abgetrennt und die Phenolschicht anschließend
mit 150 cm3 Wasser in drei 50-cm3-Portionen gewaschen. Die Waschflüssigkeiten wurden
dann mit der ursprünglichen, wäßrigen Schicht vereinigt und die vereinigten, wäßrigen
Schichten anschließend in einem Polyäthylenbehälter dialysiert, wobei 101 destilliertes
Wasser verwendet wurde, das man zweimal ersetzte. Das dialysierte, wäßrige Medium
(370 cm3) wurde dann mit 1°/Oigem wäßrigem Natriumacetat behandelt, 2, 5 Stunden
gerührt und anschließend mit der fünffachen Menge absoluten Alkohols versetzt, wobei
während der Zugabe ständig gerührt wurde. Nachdem man das Gemisch etwa 1 Stunde
lang stehengelassen hatte, wurde es zentrifugiert ; das erhaltene Sediment wurde
anschließend in 50 cm3 Wasser gelöst und 15 Minuten gerührt. Die wäßrige Lösung
wurde auf ein Gesamtvolumen von 200 cm3 verdünnt, mehrere Stunden gerührt und dann
bei 5400 U/min zentrifugiert. Das erhaltene Sediment, das sich zu diesem Zeitpunkt
gelegentlich bildet, wurde entfernt und die obenschwimmende Flüssigkeit bei 2500
U/min 45 Minuten lang zentrifugiert. Das Sediment und die dabei abgeschiedene, obenschwimmende
Flüssigkeit wurden aufbewahrt. Der als Sediment erhaltene Rückstand wurde anschließend
isoliert und an der Luft getrocknet. Die Produktausbeute betrug 397, 3 mg, wobei
es sich um die Lipopolysaccharidfraktion mit der stärksten Biopotenz handelte. Die
Elementarmikroanalyse dieses Produkts zeigte, daß es 3f25°/o Stickstoff, 2, 54 °/o
Phosphor und 17, 8 °/o Glucose (Park-Johnson-Verfahren) enthielt. Gefriertrocknen
der nach dem letzten Zentrifugieren erhaltenen, obenschwimmenden Flüssigkeit ergab
322, 8 mg einer anderen Lipopolysaccharidfraktion mit geringerer Aktivität.
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Beispiel 2 10 ml große Mengen einer Herz-Hirn-Infusionsbruhe wurden
mit einer 7 bis 10 Tage alten Kultur von Staphylococcus aureus Fritchie (SAF) geimpft,
die auf einem Hirn-Herz-Agar kultiviert worden war. Die Brühen wurden bei 37°C 16
bis 18 Stunden lang inkubiert. Der Inhalt von vierzig ein derartiges Medium enthaltenden
Röhrchen wurde in insgesamt zwölf graduierte Hartglas-Zentrifugenröhrchen gegeben
und 20 Minuten bei der Einstellung 20 der klinischen Zentrifuge zentrifugiert. Die
obenschwimmende Flüssigkeit wurde jeweils abdekantiert und jedes Röhrchen mit den
Zellen mit 10 cm3 pyrogenfreier Salzlösung (PFS), die 0, 005°/0 Versen enthielt,
gewaschen. Die Suspensionen wurden erneut zentrifugiert, die obenschwimmenden Flüssigkeiten
abdekantiert und die gepackten Zellen in den zwölf Röhrchen in insgesamt 25 oder
50 cm3 PFS suspendiert. Verdünnungen von 10-8, 10-'und 10-8 wurden dann auf Hirn-Herz-Agar
aufgebracht.
Nach 24stündiger Inkubation bei 37°C wurden Zellzählungen vorgenommen. Um die zur
Impfung erforderliche Verdünnung zu erzielen, wurde PFS zugegeben. Die geimpften
Medien wurden anschließend 1 bis 2 Tage in einen Kühlschrank gestellt und dann vor
Gebrauch jeweils 1 Stunde auf einem Rotationsschüttler geschüttelt.
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Vier bis fünf Mäusen der gleichen Testgruppe wurde intravenös eine
Flüssigkeit eingespritzt, die pro Kilogramm 10-cm3-Mengen des am stärksten konzentrierten
Impfstoffs enthielt, so daß die erforderliche 100°/Oige Sterblichkeit in 24 Stunden
gesichert war. Die Dosierung jedes gegebenen Impfstoffs wurde bei allen Tests bei
10 cm3/kg gehalten.
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Die verwendeten Testtiere waren sorgfältig standardisierte, hybride
und reine Zuchtmäuse aus Bruder-Schwester-Paarungen, die hinsichtlich Geschlecht
und Alter (und daher des Gewichts) ausgewählt und sorgfältig vor dem Versuch an
die Laboratoriumsbedingungen angepaßt worden waren. Nach Abschluß des Tests wurden
die Tiere zu zweit bis fünft pro Gefäß untergebracht, und Wasser und Nahrung wurde
ihnen nach Belieben gereicht. Täglich wurde geprüft, wieviele Tiere überlebten.
Einige tote Tiere einer jeden Gruppe wurden für die Autopsie bestimmt.
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Die Organe, bei denen besonders starke Infektionsanzeichen gefunden
wurden, waren Herz, Lunge, Leber, Milz, Nieren, Nebennieren, Magen, Darm und-Harnblase.
In anderen Fällen, bei 50%iger Sterblichkeit, wurden die Überlebenden einer Gruppe
für Gewebekulturstudien getötet. Bakterien wurden für die mikroskopischen Studien
von ausgestrichenen Präparaten von Blutverdünnungen, Leber-und Milz-Homogenaten
ausgewählt.
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Bei diesem besonderen Test wurden männliche Mäuse des Stammes A,
die jeweils etwa 20 bis 25 g. wogen, intravenös mit 10 cm3 (pro Kilogramm-Körpergewicht)
einer l"/. igen pyrogenfreien Salzlösung (PFS) injiziert, die 1, 0 mg des Lipopolysaccharids
(LPS) enthielt, das nach dem Verfahren des Beispiels I hergestellt war, d. h., es
wurden 1, 0 mg pro/10 cm3 pro Kilogramm verabreicht.
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Die auf diese Weise behandelten Tiere wurden dann entweder mit 170-109
oder 85 109 lebensfähigen Zellen des S. aureus Fritchie (pro Kilogrammdosis) 24
Stunden nach Verabreichung der Lipopolysaccharidlösung infiziert. Die Kontrolltiere
erhielten ein gleiches Volumen der 1%igen, pyrogenfreien Salzlösung (PFS), d. h.
10 cm3 pro Kilogramm. Die bei einer derartigen Vorbehandlung erhaltenen Ergebnisse
sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.
| Impfstoff- |
| Vorbe- Anzahl |
| konzen- 50%ige 100%ige |
| hand- pro |
| tration pro Sterblichkeit Sterblichkeit |
| lung Gruppe |
| Kilogramm |
| 170 109 LPS 3 bis 4 Tage 5tTage 5 |
| 170 # 109 PFS 1 Tag 1 Tag 5 |
| 85 109 LPS 4 bis 5 Tage 7 Tage 5 |
| 85 109 PFS 2 bis 3 Tage 5 Tage-5 |
Männliche und weibliche Mäuse des gleichen Stammes, die jeweils etwa 15 bis 20 g
wogen, erhielten einzeln dieselbe Lipopolysacchariddosis (LPS) wie oben beschrieben,
24 Stunden später wurden sie mit einer der drei Impfstoffkonzentrationen, nämlich
58 # 109, 28 # 109 oder 40, 25-109 lebensfähigen Zellen
des S. aureus
Fritchie (pro Kilogrammdosis), geimpft.
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Die Uberlebensdaten, die bei einer derartigen 24 Stunden vorher vorgenommenen
Behandlung erhalten wurden, sind in der folgenden Tabelle angegeben, in der die
in Klammer angegebenen Zahlen die maximal ermittelten Werte darstellen :
| Impfstoff- |
| Vorbe- Anzahl |
| konzen- 50%ige 100%ige |
| hand- pro |
| tration pro Sterblichkeit Sterblichkeit |
| lung Gruppe |
| Kilogramm |
| 58 LPS 4 Tage 9 Tage 10 |
| 58 #109 PFS <1 Tag 2 Tage 9 |
| 29 LPS 7 bis 8 Tage 11 Tage 10 |
| 29-109 # 109 P F S 2 Tage Tage 3 Tage 10 |
| 7, 25 109 LPS 12 Tage >55 Tage 10 |
| (80°/o= |
| 42 Tage) |
| 7, 25 109 PFS 13 bis 14 >55 Tage 10 |
| Tage (80°/o= |
| 18 Tage) |
Beispiel 3 Eine Gruppe von männlichen LAF-und LABF-Mäusen wurde intravenös mit einer
Dosis von 0, 25 mg/kg Lipopolysaccharid (LPS) auf die gleiche Weise, wie im Beispiel
2 beschrieben, vorbehandelt.
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Eine zweite Gruppe der Tiere erhielt ein vergleichbares Volumen physiologischer
Kochsalzlösung für Kontrollzwecke, während eine dritte Gruppe der Tiere als unbehandelte
Kontrolltiere diente. 3 Tage später wurden die Gruppen dreigeteilt, wobei jede mit
91-109, 60, 6 109 oder 30, 3 # 109 lebensfähigen Zellen von S. aureus Fritchie (pro
Kilogrammdosis) geimpft wurde. Die Ergebnisse, die bei dieser 3 Tage vorher vorgenommenen
Behandlung erhalten wurden, sind in der folgenden Tabelle angegeben :
| Impfstoff- Anzahl |
| konzen- Vorbe- 50%ige 100%ige pro |
| tration pro handlung Sterblichkeit Sterblichkeit Grup- |
| Kilogramm pe |
| 91 LPS 5 Tage >16 Tage 10 |
| (90 0/0 = |
| 6 Tage) |
| 91 bis 3 Tage 6 Tage 10 |
| lösung (90%= |
| 1 Tag) |
| 91 Tage 5 Tage 10 |
| han- (90%= |
| delt 1 Tag) |
| 60, 6 109 LPS 6 Tage >16 Tage 12 |
| (67 °/o = |
| 8 Tage) |
| 60, 6- 109 Salz-3 bis 4 Tage > 16 Tage 11 |
| lösung (64% = |
| 5 Tage) |
| 60, 6 # 109 unbe- 4 Tage 7 Tage 10 |
| han- (60 °/o = |
| delt 4 Tage) |
| 30, 3 # 109 LPS 15 Tage >16 Tage 10 |
| 30, 3 # 109 Salz-6 Tage > 16 Tage 10 |
| lösung |
| 30, 3 # 109 unbe- 4 Tage >16 Tage 10 |
| handelt |
Beispiel 4 Männliche und weibliche LAF-und LABF-Mäuse wurden intraperitoneal mit
einer Dosis von 0, 25 mg/kg Lipopolysaccharid (LPS) behandelt, die auf die folgende
Weise hergestellt wurde : 2, 0 mg des Lipopolysaccharidpräparats, das nach dem im
Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhalten wurde, wurde zu 2 cm3 einer 1°/oigen
Salzlösung gegeben, und das erhaltene Gemisch wurde homogenisiert. 200 A absoluter
Alkohol wurden dann zu der Suspension gegeben, und gereinigter Stickstoff wurde
20 Minuten lang in das Gemisch eingeblasen. Dann wurde es mit 1%iger Salzlösung
verdünnt. Eine Gruppe Kontrolltiere erhielt ein gleiches Volumen physiologische
Kochsalzlösung (10 cm3), während die zweite Gruppe der Kontrolltiere 10 cm3/kg des
vorher beschriebenen Präparats ohne das Lipopolysaccharid (Lösungsmittel) erhielt.
Eine dritte Gruppe von Testtieren wurde nicht behandelt. 5 Tage später wurden die
Gruppen geteilt, und jede wurde mit 56-109 bzw. 37, 4 # 109 lebensfähigen Zellen
des S. aureus Fritchie (pro Kilogrammdosis) geimpft. Die bei dieser 5 Tage vorher
mit Lipopolysaccharid vorgenommenen Behandlung erhaltenen Ergebnisse sind in der
folgenden Tabelle wiedergegeben :
| Impfstoff-Anzahl |
| konzen-Vorbe-50°/oige 100° (oige pro |
| tration pro handlung Sterblichkeit Sterblichkeit Grup- |
| Kilogramm pe |
| 56 LPS 3 bis 4 Tage 12 Tage 10 |
| 56 bis 2 Tage 4 Tage 9 |
| lösung |
| 56 Tag 2 Tage 10 |
| mittel |
| 56 Tag 3 Tage 10 |
| handelt |
| 37, 4 # 109 LPS 6 Tage > 14 Tage 10 |
| (60°/o |
| = 7 Tage) |
| 37, 4 # 109 Salz- 5 bis 6 Tage > 14 Tage 9 |
| lösung (67°/0 |
| = 6 Tage) |
| 37, 4 # 109 Lösungs- 4 Tage > 14 Tage 10 |
| mittel (60°/0 |
| = 5 Tage) |
| 374-109 unbe-3 bis 4 Tage 7 Tage |
| handelt (60°/0 = |
| 3bis4 Tage) |
Beispiel 5 Männliche Mäuse vom Stamm A, die jeweils 18 bis 22 g wogen, wurden einzeln
intravenös mit 1, 0 mg/kg Lipopolysaccharid (LPS) injiziert. Die Kontrolltiere erhielten
jeweils 10 cm3 pyrogenfreie Salzlösung (PFS) pro Kilogramm Körpergewicht. 7 Tage
später wurden beide Gruppen mit S. aureus-Fritchie-Impfstoff infiziert, der 170
lebensfähige Zellen pro Kilogrammdosis enthielt. Die Ergebnisse dieser 7 Tage vorher
vorgenommenen Vorbehandlung sind in der folgenden Tabelle aufgeführt :
| Anzahl |
| Vorbe- 50%ige 100%ige |
| pro |
| handlung Tödlichkeit Tödlichkeit |
| Gruppe |
| Gruppe |
| LPS 1 bis 2 Tage 3 Tage 10 |
| PFS 1 Tag 1 Tag 9 |
Beispiel 6 Männliche Mäuse des Stammes A, die jeweils 20 bis 25
g wogen, erhielten einzeln insgesamt 3 Wochen lang 1, 0 mg/kg Lipopolysaccharid
(LPS) intravenös verabreicht. Die Kontrolltiere erhielten jeweils 10 cm3 pyrogenfreie
Salzlösung (PFS) pro Kilogramm Körpergewicht. 24 Stunden nach der dritten Injektion
wurden beide Gruppen mit S. aureus Fritchie in den angegebenen Impfstoffkonzentrationen
mit einem Gehalt von 170-109 oder 85 109 lebensfähigen Zellen (pro Kilogrammdosis)
geimpft. Die Tiere wurden auf Zeichen von Toxizität, die durch eine solche vielfache
Dosis hervorgerufen werden könnte, sowie auf ihre Überlebensfähigkeit bei solchen
induzierten Infektionen untersucht.
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Hinsichtlich der festgestellten Toxizität wurde gefunden, daß nach
der dritten Injektion die mit Lipopolysaccharid behandelten Tiere wäßrige Augen,
geschwollene Lider, Piloerection und Atembeschwerden hatten. Jedoch klangen diese
Symptome nach 60 Minuten allmählich ab. Nach der 3wöchigen Behandlung mit einer
Mehrfachdosis an Lipopolysaccharid wurden die in der folgenden Tabelle angegebenen
Ergebnisse erhalten :
| Anzahl |
| Impfstoff 100%ige |
| Vorbe- 50%ige pro |
| pro Kilo- Sterblich- |
| handlung Sterblichkeit Grup- |
| gramm keit |
| pe |
| 170 (Swöchig) 4 bis 5 Tage 7 Tage 5 |
| 170 (3wöchtg) <lTag <lTag 5 |
| 85 109 LPS (3wöchig) 5 bis 6 Tage 12 Tage 5 |
| 85 (3wochig) 2 bis 3 Tage 5 Tage 5 |
Beispiel 7 Männliche LAF-und LABF-Mäuse, die alle mehr als 6 Monate alt waren und
jeweils 25 bis 30 g wogen, wurden im Abstand von 14 Tagen insgesamt neunmal mit
1, 0 mg Lipopolysaccharid (LPS) pro 10 ml pro Kilogramm intravenös injiziert. Die
Kontrolltiere erhielten ein vergleichbares Volumen an pyrogenfreier Salzlösung (PSF).
2 oder mehr Stunden vor der letzten Injektion wurden alle Tiere einer Temperaturerhöhung
bis zu 95°C ausgesetzt. Nach den Lipopolysaccharidinjektionen wurde gelegentlich
Diarrhoe und Mattigkeit festgestellt, jedoch konnten keine anderen nachteiligen
Zeichen festgestellt werden. Etwa 24 bis 27 Stunden nach der letzten Injektion der
Vorbehandlung wurden alle Gruppen mit einem der folgenden S. aureus-Fritchie-Impfstoffkonzentration
geimpft : 46, 5 # 109 oder 23, 25-10 lebensfähige Zellen (pro Kilogrammdosis). Die
bei der 2wöchigen Lipopolysaccharidvorbehandlung erzielten Ergebnisse sind in der
folgenden Tabelle angegeben :
| Impfstoff- Anzahl |
| konzen-Vorbe-50°/oige ige pro |
| tration pro handlung Sterblichkeit Sterblichkeit Grup- |
| Kilogramm pe |
| 46, 5-109 LPS 5 Tage 56 Tage 10 |
| (14 Tage) |
| 46, 5-109 PFS 2 Tage 5 Tage 4 |
| (14 Tage) |
| 23, 25- LPS 22Tage >56Tage 10 |
| (14 Tage) |
| 23, 25 # 109 PFS 9 bis 10Tage >56 Tage 9 |
Beispiel 8 Männliche Mäuse des Stammes A, die jeweils etwa 18 bis 22 g wogen, erhielten
jeweils vier intravenöse Injektionen einer 1, 0 mg/kg Lipopolysacchariddosis (LPS)
im Abstand von 21 Tagen. Eine Kontrollgruppe erhielt ein gleiches Volumen einer
pyrogenfreien Salzlösung (PFS). 24 Stunden nach dem letzten Stoß wurden die Tiere
mit einem S. aureus-Fritchie-Impfstoffgeimpft, der entweder 58 109 oder 29 109 lebensfähige
Zellen pro Kilogrammdosis enthielt. Die bei dieser 3wöchigen Lipopolysaccharidenvorbehandlung
erzielten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben :
| Impfstoff-vorbe-Anzahl |
| konzen-hand-50°/oige 100°/oige pro |
| tration pro lung Sterblichkei erblichkei Grup- |
| Kilogramm pe |
| 58 bis 5 Tage 6 Tage 10 |
| 58 109 PFS 1 Tag 1 Tag 10 |
| 29 bis 6 Tage 9 Tage 10 |
| 29 109 PFS 1 Tag 1 Tag 10 |
Beispiel 9 Männliche LAF-und LABF-Mäuse (Mindestalter zum Zeitpunkt des Impfens
: 6 Monate), die jeweils etwa 20 bis 30 g wogen, wurden intravenös mit einer Dosis
von 1, 0 mg/kg Lipopolysaccharid (LPS) in einem Abstand von 28 Tagen bei insgesamt
fünf Injektionen injiziert. Nach den Lipopolysaccharidinjektionen wurde gelegentlich
Diarrhoe und eine kurze Mattigkeit beobachtet. Die Kontrolltiere erhielten ein gleiches
Volumen pyrogenfreie Salzlösung (PFS). 2 oder mehr Stunden vor dem letzten Stoß
wurden alle Tiere einem Temperaturanstieg auf 95°C ausgesetzt. Etwa 24 bis 27 Stunden
nach der letzten Injektion wurden alle Gruppen mit S. aureus-Fritchie-Präparaten
geimpft, welche 46, 5-10 lebensfähige Zellen pro Kilogrammdosis enthielten. Die
bei diesen monatlich vorgenommenen Lipopolysaccharideninjektionen erzielten Ergebnisse
sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben :
| Impfstoff- Anzahl |
| Vorbe- |
| konzen- 50%ige 100%ige pro |
| handlung |
| tration pro Sterblichkeit Sterblichkeit Grup- |
| Kilogramm pe |
| 46, 5-109 LPS 6 Tage >56 Tage 10 |
| (28 Tage) (90°/0 |
| = 56 Tage) |
| 46, 5 109 PFS 3 bis 4 Tage 6 Tage 5 |
| (28 Tage) (90°/0 |
| = 5 bis |
| 6 Tage) |
Beispiel 10 Eine Kultur von Pseudomonas fluorescens wurde nach dem im Beispiel 2
zur Herstellung eines geeigneten S. aureus-Fritchie-Impfstoffs beschriebenen Verfahren
behandelt, mit der Abweichung, daß die Kulturen auf Pseudomonasbrühe nur 4 Stunden
inkubiert wurden, um die Bildung von großen, bakteriellen Aggregaten zu vermeiden.
-
Weibliche LAF-und LABF-Mäuse (wenigstens 6 Monate alt), die jeweils
20 bis 25'g wogen, erhielten durch intravenöse Injektion jeweils eine Dosis von
1,
0 mg Lipopolysaccharid (LPS) pro Kilogramm. Die behandelten Kontrolltiere wurden
mit einem gleichen Volumen einer pyrogenfreien Salzlösung (10 cm3 PFS pro Kilogramm)
injiziert. 24 Stunden nach der Vorbehandlung wurden die Tiere mit einem P. fluorescens-Impfstoff
einer Konzentration von 5'10"lebensfähigen Zellen pro Kilogrammdosis geimpft. Die
ermittelte Uberlebensquote ist in der folgenden Tabelle angegeben.
| Impfstoff- Vorbe- |
| Anzahl |
| konzen- hand- 50%ige 100%ige |
| pro |
| tration pro lung Sterblichkeit Sterblichkeit Gpro |
| Kilogramm Gruppe |
| 5-109 LPS 6 bis 7 Tage 12 Tage 5 |
| 5-10"PFS<lTagITag5 |
Beispiel 11 Weibliche LAF-Mäuse, die jeweils 19 bis 24 g wogen, wurden in zwei Gruppen
geteilt, von denen eine oral eine Dosis von 1, 0 mg Lipopolysaccharid (LPS) pro
Kilogramm erhielt, während der anderen Gruppe die gleiche Dosis intravenös injiziert
wurde. Bei der oralen Verabreichung (p. o.) wurde die Dosis mit einer stumpfen hypodermischen
Nadel der Größe 18 in den Magen gebracht. Es wurden keine nachteiligen Anzeichen
einer Toxizität beobachtet. Die Tiere wurden dann mit einem Impfstoff der folgenden
Konzentrationen geimpft : 84-109 oder 42-109 lebensfähige Zellen des P. fluoreszens
pro Kilogrammdosis. Die Wirkung dieser 24 Stunden vor der Impfung vorgenommenen
Lipopolysaccharidvorbehandlung ist in der folgenden Tabelle beschrieben :
| Impfstoff- |
| konzen- Anzahl |
| Vorbehandlung 50%ige 100%ige |
| tration pro |
| Gruppe Sterb- Sterb- |
| pro Grup- |
| Dosis pro Kilogramm pro lichkeit lichkeit pe |
| gramm |
| 1, 0 mg LPS p. o. 84 # 109 1 Tag 9 Tage 10 |
| 10, 0 ml PFS p. o. 84 109 1 Tag 8 Tage 10 |
| 1, 0 mg LPS i. v. 84 # 109 6 Tage 25 Tage 10 |
| 10, 0 ml PFS i. v. 84 109 1 Tag 1 Tag 10 |
| 1, 0 mg LPS p. o. 42 109 7 Tage 25 Tage 10 |
| 10, 0 ml PFS p. o. 42 109 1 Tag 7 Tage 10 |
| 1, 0 mg LPS i. v. 42 # 109 13 Tage 25 Tage 10 |
| 10, 0 ml PFS i. v. 42 109 1 Tag 1 Tag 10 |
Beispiel 12 Strychninlösungen wurden dadurch hergestellt, daß man Strychninsulfat
in physiologischer Kochsalzlösung (1°/0) mit Konzentrationen von 25, 37, 5 und 50
mg pro 100 cm3 löste. Diese Lösungen wurden unmittelbar in die Fermorvene injiziert,
welche durch Entfernen der darüberliegenden Haut freigelegt wurde, wobei die Dosierungen
zwischen 0, 35 mg und 0, 60 mg pro Kilogramm Körpergewicht lagen. Die Tiere wurden
dann in Gefäße gesetzt und auf Krampfanzeichen und Todesfälle hin beobachtet ; es
wurden nur Muskelkrämpfe in merklichem Maße festgestellt.
-
Die Lipopolysaccharidlösungen wurde auf folgende Weise hergestellt
: 2 mg Lipopolysaccharide (LPS) und 2cm3 der 1%igen Salzlösung wurden 30 Sekunden
lang
in einer Mühle nach Potter-Elevhjem homogenisiert ; dann wurden 200 A absoluter
Alkohol zugegeben, und gereinigtes Stickstoffgas wurde 20 Sekunden lang in das erhaltene
Gemisch eingeblasen ; 1, 0 oder 0, 2 mg/cm enthaltende verdünnte Lösungen wurden
dann durch Zugabe von 1°/Oiger Salzlösung hergestellt.
-
Männliche und weibliche Sprague-Dawley-Ratten wurden intraperitoneal
mit einer 0, 5- oder 2, 0-mg/ 2-cm3/kg-Lipopolysacchariddosis, die nach dem beschriebenen
Verfahren hergestellt worden war, vorbehandelt. Die Kontrolltiere erhielten 2 cm3
physiologische Salzlösung pro Kilogramm Körpergewicht.
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24 Stunden später wurde den Tieren eine Strychnindosis von 0, 45 bis
0, 55 mg/kg verabreicht, die Strychninlösung enthielt 25 mg Strychninsulfat pro
100 cm3 der Lösung. Das beschriebene Verfahren wurde dann mit der Abweichung wiederholt,
daß die Strychnindosierung zwischen 0, 35 und 0, 65 mg/kg lag.
-
Bei einem zweiten Test wurden weibliche Sprague-Dawley-Ratten mit
0, 5 und 2, 0 mg/kg Lipopolysacchariddosen vorbehandelt. Die Kontrolltiere erhielten
2, 5 cm3 physiologische Salzlösung pro Kilogramm Körpergewicht. Eine zweite Kontrollgruppe
wurde nicht behandelt. 24 Stunden später wurden die Tiere mit Strychnin in Dosen
von 0, 40 bis 0, 75 mg/kg injiziert. Dosen zwischen 0, 40 und 0, 60 mg/kg wurden
in Form einer Strychninsulfatlösung, die 37, 5 mg Substanz pro 100 cm3 Lösung enthielt,
verabreicht, während Dosen von 0, 60 bis 0, 75 mg/kg in Form einer Lösung verabreicht
wurden, die 50 mg pro 100 cm3 enthielt. Die restliche Gruppe wurde 48 Stunden nach
der Vorbehandlung injiziert, wobei die verwendeten Strychninkonzentrationen die
gleichen wie oben waren.
-
Die prophylaktische Wirkung, die durch die oben beschriebene Vorbehandlung
mit Lipopolysaccharid 24 Stunden und 48 Stunden vor der Injektion erzielt wurde,
ist ausgezeichnet. Ein Beispiel dafür ist die Verminderung der toxischen Wirkung,
die durch Strychnin verursacht wird. In der ersten Testreihe war die am meisten
geschützte Gruppe die Gruppe der weiblichen Ratten, die mit Lipopolysaccharid in
einer Dosis von 2, 0 mg/kg vorbehandelt worden waren.
-
Obgleich alle Werte bei 100°/oiger Sterblichkeit über 0, 55 mg/kg
lagen, waren alle Werte bei 50"/piger Sterblichkeit für die mit 2, 0 mg/kg Lipopolysacchariddosen
vorbehandelten, weiblichen Ratten höher als 0, 55 mg/kg, während bei den mit Salzlösung
vorbehandelten, weiblichen Ratten der entsprechende Wert (500/oigne Sterblichkeit)
bei weniger als 0, 45 mg/kg lag.
-
Außerdem lagen alle Werte bei 100°/oiger Sterblichkeit bei den mit
0, 50 mg/kg Lipopolysaccharid vorbehandelten, weiblichen Ratten über 0, 60 mg/kg,
verglichen mit 0, 45 mg/kg bei den mit Salzlösung vorbehandelten, weiblichen Ratten.
Bei der zweiten Testreihe, bei der nur weibliche Ratten getestet wurden, ergibt
sich aus den bei 50°/oiger Sterblichkeit erzielten Werten, daß der beste Schutz
bei einer Strychninkonzentration zwischen 0, 70 und 0, 75 mg/kg dann erhalten wird,
wenn die Tiere 48 Stunden vor der Infektion mit einer 0, 50 mg/kg-Lipopolysacchariddosis
behandelt werden. Bei den 48 Stunden vorher mit einer Salzlösung vorbehandelten
Tieren liegen die entsprechenden Strychninkonzentrationen bei 0, 55 bis 0, 60 mg/kg.
Der Wert bei 50°/oiger Sterblichkeit für die 24 Stunden vorher mit 0, 50 mg/kg Lipopolysaccharid
behandelte Gruppe wurde nicht erreicht, lag jedoch über 0, 65 mg/kg, während der
entsprechende
Wert für die 24 Stunden vorher mit einer Salzlösung
behandelte Gruppe bei 0, 50 bis 0, 55 mg/kg lag.
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Beispiel 13 Männliche Mäuse des Stammes A, die etwa 15 bis 20g wogen
(das Gewicht wurde auf 1, 0 g genau während eines einzelnen Versuches reguliert),
wurden bei diesem Versuch als Testtiere verwendet.
-
Sie waren alle zunächst 1 bis 2 Wochen im Laboratorium gehalten worden,
bevor sie bei den Testen verwendet wurden.
-
Zur Herstellung des Chrom-Phosphat-Kolloids wurde das Verfahren von
H. B. Jones u. a., J. Clin.
-
Invest., Bd. 23, S. 783 (1944), etwas abgewandelt. Es wurde nämlich
gefunden, daß das Kolloid, wenn es bei einer konstanten Temperatur von 37° C gehalten
wird, viele Wochen lang verwendbar bleibt. Die Bestimmung der Phagocytose wurde
dadurch vorgenommen, daß man 5 bis 20 tc der Chrom-Phosphat-Kolloid-Suspension injizierte
und dann im Verlauf der ersten 3 bis 5 Minuten fünf bis zehn Blutproben entnahm.
Die Blutproben wurden vom Schwanz abgenommen, wobei dafür gesorgt wurde, daß ausreichende
Blutung stattfand, um repräsentative Proben zu erhalten. Die Proben wurden auf die
Mitte von quadratischen Löschpapieren pipettiert, die so geschnitten waren, daß
sie in die Aluminiumringe des automatischen Probenwechslers (Nuclear Instrument
and Chemical Corp.) paßten, der für die Auszählung verwendet wurde. Trägt man den
Logarithmus der Radioaktivität gegen die Zeit der Probenentnahme auf, so erhält
man eine gerade Linie. Die erhaltenen Ergebnisse sind als » Halbzeiten « ausgedrückt,
d. h. die Zeit, die vergeht, bis die Hälfte des radioaktiven Kolloids aus dem zirkulierenden
Blut verschwindet.
-
Die Cortison-21-acetat-Lösung wurde durch Lösen von 10 g dieses Corticosteroids
in 0, 4 cm3 eines Suspensionsmittels hergestellt, das aus 0, 9 Benzylalkohol, 0,
8 °lo Natriumchlorid, 0, 4 °/0 des Polyoxyäthylenderivats des Hexitolanhydridmonolaureats
und 0, 5% Natriumcarboxymethylcellulose bestand. Die Lipopolysaccharidlösung wurde
hergestellt, indem man 1, 0 mg des A. aerogenes-Lipopolysaccharids, das nach dem
vorstehend beschriebenen Verfahren gewonnen worden war, in 10 ces des gleichen Suspensionsmittels
löste.
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Jedes der Testtiere erhielt intraperitoneal Cortisonacetat in Dosierungen
von 10 mg/kg. Eine zweite Gruppe der Tiere erhielt das Lipopolysaccharid allein
in einer Dosierung von 1, 0 mg/kg, während eine dritte Gruppe die gleiche Menge
des Lipopolysaccharids vermischt mit dem Cortisonacetat in einer Dosierung von 10
mg/kg erhielt. Eine vierte Gruppe von Tieren erhielt ein vergleichbares Volumen
des Suspensionsmittels für Kontrollzwecke. 24 Stunden später wurde jeder Gruppe
das Chromphosphatkolloid verabreicht, und die entsprechenden »Halbzeiten « wurden
nach dem oben beschriebenen Verfahren ermittelt. Die relativen Werte der Abnahme
werden
durch die folgende Gleichung bestimmt : Wert der Abnahme = Tll2 Kontrollgruppe x
lOO/Tl, 2 Testgruppe. Der Wert für die nicht behandelten normalen Kontrolltiere
wurde willkürlich gleich 100 gesetzt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden
Tabelle wiedergegeben, in der jede Zahl den Durchschnittswert für zwanzig Tiere
darstellt :
| d Relativer Wert |
| der Abnahme |
| Suspensionsmittel (Kontrolle)..... 100 °/o |
| Cortisonacetat.................. 68/o |
| Lipopolysaccharid (LPS) 153 °/0 |
| Cortisonacetat plus LP 170°/o |
Beispiel 14 Das im Beispiel 13 beschriebene Verfahren wurde mit der Abweichung wiederholt,
daß Cortison-21-alkohol an Stelle von Cortison-21-acetat verwendet wurde. Die dabei
erhaltenen Ergebnisse waren im wesentlichen die gleichen wie im Beispiel 13. Auf
die gleiche Weise wurden Hydrocortison, 9oc-Fluorhydrocortison, Prednison, Prednisolon,
6α-Methylprednison, 6a-Methylprednisolon, 9oc-Fluor-16-oxyhydrocortison, 9x-Fluor-160ç-methylhydrocortison,
9o¢-Fluor-16ß-methylhydrocortison und ACTH jeweils an Stelle des Cortisonacetats
des vorhergehenden Beispiels verwendet, wobei im wesentlichen die gleichen Ergebnisse
erhalten wurden.
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Beispiel 15 Das im Beispiel 13 beschriebene Verfahren wurde mit der
Abweichung wiederholt, daß andere niedere 21-Acylester des Cortisons einzeln an
Stelle des 21-Acetats verwendet wurden. Es wurde gefunden, daß insbesondere Cortison-21-propionat,
Cortison-21-n-butyrat, Cortison-21-caproat, Cortison-21-benzoat und Cortison-21-thenoat
zu den gleichen Ergebnissen wie Cortison-21-acetat führen. Auf gleiche Weise wurden
jeweils einzeln das Natriumsalz von Cortison-21-hemisuccinat und das Hydrochlorid
von Cortison-21-dimethylaminoacetat verwendet und gleichfalls für brauchbar befunden.
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PATBNTANS PRUCHB : 1. Verfahren zur Herstellung von Lipopolysacchariden,
dadurch gekennzeichnet, daß man Aerobacter aerogenes in einem wäßrigen Nährmedium
unter submersen, aeroben Bedingungen kultiviert, bis schnell wachsende Zellen erhalten
werden, dann die Zellen von dem Medium abtrennt, die Zellen zerkleinert und die
Lipopolysaccharide aus den zerkleinerten Zellen gewinnt.