DE3429551C2

DE3429551C2 -

Info

Publication number: DE3429551C2
Application number: DE3429551A
Authority: DE
Inventors: Masanori Tachikawa Tokio/Tokyo Jp Ikuzawa; Yoshiharu Oguchi; Kenichi Tokio/Tokyo Jp Matsunaga; Noriyuki Sagamihara Kanagawa Jp Toyoda; Takao Machida Tokio/Tokyo Jp Furusho; Takayoshi Tokio/Tokyo Jp Fujii; Chikao Kunitachi Tokio/Tokyo Jp Yoshikumi
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1983-08-11
Filing date: 1984-08-10
Publication date: 1989-09-21
Also published as: US5008243A; DE3448144C2; DE3448153C2; DE3448148C2; DE3448154C2; DE3448149C2; DE3429551A1; DE3448152C2; DE3448155C2; DE3448145C2; US4820689A; DE3448151C2; DE3448150C2

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Glycoproteinen mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 300 000 und 18 bis 38 Gew.-% Proteinanteil, hergestellt durch Kultivieren von Coriolus versicolor (Fr.) Quel zur Behandlung von Hyperlipämie.

Das von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. (FERM-P Nr. 2412) stammende Glycoprotein ist auf dem Markt bereits erhältlich als Antitumor-Arzneimittel unter dem Warenzeichen Krestin.

Die Stämme Coriolus versicolor (Fr.) Quel. (FERM-P Nr. 2412 und FERM-P 2414) wurden von dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology bei der American Type Culture Collection am 30. Juli 1979 unter der ATCC Nr. 20 547 und der ATCC Nr. 20 545 hinterlegt.

Da das Glycoprotein eine geringe Säugetiertoxizität aufweist und die Intestinalmikroflora nicht stört, kann eine das Glycoprotein als aktiven Bestandteil (Wirkstoff) enthaltende pharmazeutische Zubereitung über einen langen Zeitraum hinweg verabreicht werden. Außerdem ist das Glycoprotein frei von der Gefahr der Verursachung von Mißbildungen und/oder allergischen Reaktionen und daher stellt das Glycoprotein eine extrem sichere (gefahrlose) Substanz dar.

Das Glycoprotein ist eine bereits bekannte Substanz und beispielsweise beschrieben in den japanischen Patentpublikationen Nr. 17 149/1971, 36 322/1976, 14 274/1981, 14 276/1981, 39 288/1981 und der japanischen Patentanmeldung Nr. 57-134 496, wonach das Glycoprotein durch Kultivieren einer Basidiomyceten-Fungi-Species, die zum Genus Coriolus gehört, erhalten wird, Extrahieren der auf diese Weise stark vermehrten Mycele oder Fruchtkörper mit heißem Wasser oder einer wäßrigen Alkalilösung und Entfernen der niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000, wobei die auf diese Weise in Form eines Extrakts erhaltene Substanz etwa 18 bis 38 Gew.-% Proteine enthält und ein Molekulargewicht von 5000 bis 300 000, bestimmt nach den Ultrazentrifugenverfahren, aufweist.

Zahlreiche pharmakologische Eigenschaften sind in der Firmenschrift "Outline of PSK", Seiten 28 bis 30 beschrieben.

Aus der DE-AS 26 59 808 ist die Verwendung des Glycoproteins zur Bekämpfung von Tumoren bekannt.

Das aus den Mycelen von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. stammende Glycoprotein hat eine leberbraune Farbe und einen Stickstoffgehalt von 2 bis 8%, in vielen Fällen von 3 bis 6%. Verschiedene Farbreaktionstests, die mit dem erfindungsgemäßen Glycoprotein durchgeführt wurden, ergaben die folgenden Ergebnisse:

α-Naphthol-Schwefelsäure-Reaktion (Molish-Reaktion)
Purpurrot
Indol-Schwefelsäure-Reaktion (Dische-Reaktion)	Braun
Anthron-Schwefelsäure-Reaktion	(Grünlich-Blau)
Phenol-Schwefelsäure-Reaktion	Braun
Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion	Purpurrot-Braun
Lowry-Folin-Verfahren	Blau
Ninhydrin-Reaktion nach der Chlorwasserstoffsäure-Hydrolyse	Grünlich-Blau

Das Molekulargeweicht des Glycoproteins beträgt 5000 bis 300 000, gemessen unter Anwendung eines Ultrazentrifugenverfahrens. Das Glycoprotein enthält etwa 18 bis 38 Gew.-% Proteine.

Der Saccharidanteil des Glycoproteins besteht hauptsächlich aus β-D-Glycan und die Struktur des Glycan-Restes ist eine verzweigte Struktur, die 1→3-, 1→4- und 1→6-Bindungen aufweist. Von den Aminosäuren, die den Proteinanteil des Glycoproteins bilden, ist die Menge der sauren Aminosäuren, wie z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure und dgl., und diejenige der neutralen Aminosäuren, wie Valin, Leucin und dgl., verhältnismäßig groß und die Menge der basischen Aminosäuren, wie z. B. Lysin, Argenin und dgl., ist verhältnismäßig klein. Das Glycoprotein ist in Wasser löslich und in Hexan, Benzol, Chloroform, Methanol und Pyridin fast unlöslich. Das Glycoprotein zersetzt sich langsam bei einer Temperatur von etwa 120°C, wenn es erhitzt wird.

Wie aus der folgenden Tabelle I ersichtlich, ist die Säugetier-Toxizität des Glycoproteins extrem niedrig und es ruft bei Tieren kaum irgendwelche Nebenwirkungen hervor. Insbesondere ist es bekannt als eine sehr sichere (gefahrlose) Substanz für Lebewesen.

Tabelle I

Die in dem Test zur Bestimmung des obengenannten akuten Toxizitätswertes (LD₅₀ mg/kg) verwendeten Mäuse waren solche vom Stamm ICR-JCL, 4 bis 5 Wochen nach der Geburt und mit einem Körpergewicht von 21 bis 24 g. Die in dem gleichen Test verwendeten Ratten waren solche vom Stamm Donryu, 4 bis 5 Wochen nach der Geburt und mit einem Körpergewicht von 100 bis 150 g. Die Glycoprotein wurde in einer physiologischen Kochsalzlösung aufgelöst und auf jedem in der Tabelle I angegebenen Weg verabreicht. Nach der Verabreichung wurden die generellen Symptome, die Mortalität und das Körpergewicht jedes der so behandelten Tiere 7 Tage lang beobachtet und dann wurden sie getötet und einer Autopsie unterworfen.

Wie in der Tabelle I angegeben, wurde sowohl im Falle der Mäuse als auch im Falle der Ratten selbst bei der maximalen Dosis, die verabreicht werden konnte, kein Todesfall festgestellt, so daß das Glycoprotein für Lebewesen extrem sicher (gefahrlos) ist bis zu einem solchen Grade, daß der Wert für die LD₅₀ tatsächlich nicht festgestellt werden konnte.

Als Ergebnis der Prüfung der physiologischen und pharmazeutischen Eigenschaften des von Coriolus versicolor stammenden Glycoproteins wurde gefunden, daß das Glycoprotein eine hyperlipämische Aktivität aufweist, und darauf beruht die vorliegende Erfindung.

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Glycoproteinen mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 300 000 (bestimmt nach dem Ultrazentrifugenverfahren) und 18 bis 38 Gew.-% Proteinanteil, hergestellt durch Kultivieren von Coriolus versicolor (FR.) Quel., Extrahieren der auf diese Weise stark vermehrten Mycele oder Fruchtkörper mit heißem Wasser oder einer wäßrigen Alkalilösung und Entfernen der Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 aus dem Extrakt, zur Behandlung von Hyperlipämie.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1a-d die Änderung jedes Lipids im Blut eines Patienten mit Hyperlipämie, dem das Glycoprotein verabreicht worden war;

Fig. 2 eine graphische Darstellung des Einflusses des Glycoproteins auf dem LDL-Rezeptor von Human-Fibroplasten.

Das Glycoprotein weist eine antihyperlipämische Aktivität auf und wird deshalb zur Behandlung von Hyperlipämie verwendet.

Nachfolgend werden die pharmakologischen Eigenschaften des Glycoproteins beschrieben:

Antihyperlipämische Aktivität

Die antihyperlipämische Aktivität des Glycoproteins wird nachstehend erläutert.

Es ist bekannt, daß ein Patient, der an Hyperlipämie leidet, auch an Hypercholesterinämie leidet und häufig tritt auch eine Komplikation durch Arteriosklerosis praecox auf. Daher ist unter der Behandlung der Hyperlipämie nicht nur die Verhinderung und Inhibierung der Arteriosklerose, sondern auch die Besserung derselben zu verstehen. Bisher erfolgte die Behandlung der Hyperlipämie zum Zwecke der Unterdrückung der Synthese von Cholesterin, der Beschleunigung des Catabolismus und der Ausscheidung von Cholesterin und der Unterdrückung der Absorption von Cholesterin, und die heutzutage verwendeten antihyperlipämischen pharmazeutischen Zubereitungen üben ihre Aktivität über die obengenannten funktionellen Mechanismen aus.

Andererseits reduziert das Glycoprotein den hohen Lipidgehalt innerhalb des Blutes über einen neuen funktionellen Mechanismus.

In den letzten Jahren wurde nämlich gefunden, daß die Hauptursache der Hyperlipämie der Mangel und die funktionelle Reduktion des Rezeptors für Lipoprotein mit niedriger Dichte (nachstehend als "LDL-Rezeptor" bezeichnet) ist und es wurde in Erwägung gezogen, daß die Besserung des acatastatischen LDL-Rezeptors die wesentliche und ideale Behandlung der Hyperlipämie ist.

Das Glycoprotein ist in diesem Sinne eine neue antihyperlipämische pharmazeutische Zubereitung, die den LDL-Rezeptor-Spiegel im Blut des Patienten erhöht, wodurch die Lipide in dem Blut des Patienten vermindert werden, ohne daß dadurch eine Nebenwirkung hervorgerufen wird.

Wenn das Glycoprotein zur Behandlung von Hyperlipämie verwendet wird, kann es wie folgt verwendet werden:
Da das Glycoprotein eine Aktivität in bezug auf die Herabsetzung der Gehalte sowohl an Cholesterin als auch an β-Lipoprotein im Blut und eine Aktivität in bezug auf die Erhöhung des Gehaltes an LDL-Rezeptor aufweist, eignet es sich zur Behandlung der Hyperlipämie. Darüber hinaus ist, obgleich der funktionelle Mechanismus sich von denjenigen des Inhibitors der Cholesterinsynthese, des Inhibitors der Cholesterinabsorption und der Ausscheidung von Cholesterin, die derzeit allgemein jeweils als aktiver Bestandteil (Wirkstoff) einer antihyperlipämischen pharmazeutischen Zubereitung verwendet werden, unterscheidet, dann, wenn das Glycoprotein in Kombination mit jedem obengenannten aktiven Bestandteil (Wirkstoff) der übrigen antihyperlipämischen pharmazeutischen Zubereitungen verwendet wird, der Effekt höher als die Summe aus dem Effekt des aktiven Bestandteils (Wirkstoffes) und dem Effekt des Glycoproteins und daher stellt die kombinierte Verwendung des Glycoproteins und des anderen aktiven Bestandteils jeder konventionellen antihyperlipämischen pharmazeutischen Zubereitung eine wirksame Maßnahme zur Behandlung der Hyperlipämie dar.

Das Glycoprotein kann in Kombination mit einem anderen antiarteriosklerotischen Agens verwendet werden.

Die Verabreichung des Glycoproteinpräparates kann unter Anwendung eines von mehreren Wegen erfolgen.

Das Glycoprotein kann oral oder parenteral, vorzugsweise oral, an Menschen verabreicht werden. Die orale Verabreichung umfaßt die sublinguale Verabreichung und die parenterale Verabreichung umfaßt die subkutane Injektion, die intramuskuläre Injektion, die intravenöse Injektion und die Instillation. Die wirksame Menge der Verabreichung des Glycoproteins hängt von der Species, dem Alter, individuellen Unterschieden und dem Krankheitszustand des Patienten ab, im Falle der Behandlung von Humanpatienten beträgt die tägliche Dosis jedoch 10 bis 1000 mg, vorzugsweise 200 bis 600 mg pro kg Körpergewicht, die gleichmäßig aufgeteilt wird in 1 bis 3 Portionen, um 1- bis 3mal pro Tag verabreicht zu werden.

Im Falle der oralen Verabreichung kann die pharmazeutische Zubereitung in fester Form vorliegen, beispielsweise in Form einer Tabelette, eines Granulats, eines Pulvers und einer Kapsel, sie kann in flüssiger Form vorliegen, beispielsweise in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen und Sirupen, sie kann in Form von Mischungen vorliegen, die nach dem Schütteln verwendet werden, oder sie kann in einer festen Form vorliegen, die nach dem Auflösen in sterilisiertem Wasser, das keine pyretische Substanz enthält, verwendet wird. Die in fester Form vorliegende pharmazeutische Zubereitung kann konventionelle Zusätze enthalten, wie z. B. Bindemittel, Verdünnungsmittel, Gleitmittel, Desintegratoren, Netzmittel, und die in flüssiger Form vorliegende pharmazeutische Zubereitung kann üblicherweise verwendete Zusätze und Konservierungsmittel enthalten. Im Falle einer Injektion kann die pharmazeutische Zubereitung weitere Zusätze, wie z. B. Stabilisatoren, Puffer, Konservierungsmittel und isotonische Agentien enthalten, und das Produkt wird nach dem Abfüllen in eine Dosierungseinheitsampulle oder in einen konventionellen Behälter auf den Markt gebracht.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne sie jedoch darauf zu beschränken.

Beispiel 1 Herstellung des Glycoproteins

In 4 l einer wäßrigen 0,1 n Natriumhydroxidlösung wurden 200 g getrocknetes Mycel von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. ATCC 20 545 mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 8,8% und einem ungefähren Stickstoffgehalt von 2,5% eingeführt und die Mycele wurden unter Rühren bei einer Temperatur von 90 bis 95°C 1 h lang extrahiert und dann wurde die Mischung auf unter 50°C abgekühlt und nach dem Einstellen des pH-Wertes der auf diese Weise abgekühlten Mischung auf 7,0 mit einer wäßrigen 1 n Chlorwasserstoffsäurelösung wurde das gelöste Material durch Saugfiltrieren aus der Mischung entfernt und das auf diese Weise entfernte feste Material wurde mit 500 ml Wasser gewaschen. Die Mischung aus dem Filtrat und den Waschwässern, die 4,2 l betrug, wurde unter Verwendung eines Desktop-Ultrafilters der Firma Amicon Inc. (ausgestattet mit der Ultrafiltrationsmembran PM-5) unter Rühren und Kühlen unter einem Arbeitsdruck von 1,5 kg/cm² bei 10°C einer Ultrafiltration unterworfen, wodurch die niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 entfernt wurden, wonach eingeengt wurde, so daß man 300 ml des behandelten wäßrigen Extrakts erhielt. Der wäßrige Extrakt wurde einer Gefriertrocknung unterworfen, wobei man etwa 26,6 g einer pulverförmigen Substanz mit einer leberbraunen Farbe in einer Ausbeute von 13%, bezogen auf die Mycele, erhielt. Die auf diese Weise erhaltene pulverförmige Substanz hatte einen Feuchtigkeitsgehalt von 7,5% und eine Elementaranalysezusammensetzung von 40,5% Kohlenstoff, 6,2% Wasserstoff, 5,8% Stickstoff und Rest Sauerstoff. Die pulverförmige Substanz war in Wasser leicht löslich.

Die pulverförmige Substanz wies eine Aktivität in bezug auf die Inhibierung der Vermehrung des transplantierten Sarkoms 180 von bis zu 90%, wenn sie intraperitoneal der transplantierten Maus injiziert wurde, und bis zu 65%, wenn sie oral der transplantierten Maus verabreicht wurde, auf.

Beispiel 1a) Herstellung des Glycoproteins

In 4 l einer wäßrigen 0,1 n Natriumhydroxidlösung wurden 200 g getrocknetes Mycel von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. ATCC 20 547 mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 8,8% und einem ungefähren Stickstoffgehalt von 2,5% eingeführt und die Mycele wurden unter Rühren bei einer Temperatur von 90 bis 95°C 1 h lang extrahiert und dann wurde die Mischung auf unter 50°C abgekühlt und nach dem Einstellen des pH-Wertes der auf diese Weise abgekühlten Mischung auf 7,0 mit einer wäßrigen 1 n Chlorwasserstoffsäurelösung wurde das gelöste Material durch Saugfiltrieren aus der Mischung entfernt und das auf diese Weise entfernte feste Material wurde mit 500 ml Wasser gewaschen. Die Mischung aus dem Filtrat und den Waschwässern, die 4,1 l betrug, wurde unter Verwendung eines Desktop-Ultrafilters der Firma Amicon Inc. (ausgestattet mit der Ultrafiltrationsmembran PM-5) unter Rühren und Kühlen unter einem Arbeitsdruck von 1,5 kg/cm² bei 10°C einer Ultrafiltration unterworfen, wodurch die niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 entfernt wurden, wonach eingeengt wurde, so daß man 280 ml des behandelten wäßrigen Extrakts erhielt. Der wäßrige Extrakt wurde einer Gefriertrocknung unterworfen, wobei man etwa 28,3 g einer pulverförmigen Substanz mit einer leberbraunen Farbe in einer Ausbeute von 14%, bezogen auf die Mycele, erhielt. Die auf diese Weise erhaltene pulverförmige Substanz hatte einen Feuchtigkeitsgehalt von 7,3% und eine Elementaranalysezusammensetzung von 41,2% Kohlenstoff, 6,1% Wasserstoff, 5,8% Stickstoff und Rest Sauerstoff. Die pulverförmige Substanz war in Wasser leicht löslich.

Die pulverförmige Substanz wies eine Aktivität in bezug auf die Inhibierung der Vermehrung des transplantierten Sarkoms 180 von bis zu 95%, wenn sie intraperitoneal der transplantierten Maus injiziert wurde, und bis zu 68%, wenn sie oral der transplantierten Maus verabreicht wurde, auf.

Beispiel 2 Aktivität in bezug auf die Herabsetzung des Lipidspiegels im Blut von Patienten, die an Hyperlipämie leiden

Das Glycoprotein wurde kontinuierlich etwa 1 Monat lang in einer täglichen Dosis von 3 g an 10 Patienten (3 Männer und 7 Frauen) oral verabreicht, die unter Hyperlipämie litten. Die Gehalte an T-Cholesterin, β-Lipoprotein, Lipoprotein mit hoher Dichte (HDL), Triglyceriden (TG) vor der Verabreichung betrugen 293 bis 405 mg/dl (Mittelwert 340 mg/dl), 418 bis 1038 mg/dl (Mittelwert 741 mg/dl), 26,2 bis 96,5 mg/dl (Mittelwert 49 mg/dl) bzw. 73 bis 425 mg/dl (Mittelwert 181 mg/dl) im Blut der Patienten. Obgleich diesen Patienten mindestens 4 Monate lang verschiedene antihyperlipämische pharmazeutische Zubereitungen verabreicht worden waren, litten sie an Hyperlipämie, nämlich an den Fällen, für welche die konventionellen antihyperlipämischen pharmazeutischen Zubereitungen unwirksam waren.

Es wurden Blutproben bei jedem der Patienten vor Beginn der Verabreichung des Glycoproteins und zweimal während der Verabreichung, am 14. und 28. Tag ab Beginn der Verabreichung, entnommen und es wurde der Lipidgehalt festgestellt; die Ergebnisse der am 28. Tag entnommenen Blutprobe sind in der Fig. 1 (a-d) dargestellt. Wie aus der Fig. 1 ersichtlich, waren die Gehalte an β-Lipoprotein und T-Cholesterin deutlich vermindert, obgleich das Glycoprotein keinen Einfluß auf die Werte von HDL und TG hatte. Insbesondere der Gehalt an β-Lipoprotein war in allen Fällen um durchschnittlich 150 mg/dl vermindert, d. h. die mittlere Reduktionsrate betrug 20%.

Beispiel 3 Aktivität in bezug auf die Besserung des LDL-Rezeptors im Human-Fibroblasten

Als Versuchsmaterial wurden Fibroblaste eines Patienten verwendet, der an einer Erberkrankung, der familiären Hyperlipämie II_a vom Hetero-Typ, die durch eine Hyperplasie der Achillessehne charakterisiert ist, litt, und sie wurden nach dem modifizierten Verfahren von Goldstein at al. einer Subkultivierung in MEM, das 20% fetales Rinderserum enthielt, unterzogen, wobei die 5. bis 10. Generation verwendet wurde.

Nach dem Kultivieren der Fibroblasten in einer Schale mit einem Durchmesser von 6 cm, bis sie sich auf eine vorgegebene Menge vermehrt hatten, wurden 5% Lipoprotein-Mangel-Serum und das Glycoprotein in einer Konzentration, wie sie in der Fig. 2 angegeben ist, zu der Schale zugegeben und nach weiterem 48stündigem Kultivieren mit J¹²⁵ markiertes LDL der Schale zugegeben und nach weiterem 6stündigem Kultivieren wurden die an der Schale haftenden Zellen 6mal mit einer Phosphatpufferlösung gewaschen und in einer HEPES-Pufferlösung 1 h lang kultiviert, die mit Natriumdextransulfat versetzt worden war.

Die Radioaktivität der Flüssigkeit der auf diese Weise kultivierten Fibroblasten wurde bestimmt als die Menge der Oberflächen-Bindungs-LDL, d. h. als die Anzahl der Rezeptoren (N _i).

Die gleichen Fibroblasten wurden auf die gleiche Weise wie oben kultiviert, wobei diesmal jedoch kein Glycoprotein zugegeben wurde, und es wurde die Radioaktivität der Flüssigkeit der so kultivierten Fibroblaste wie oben bestimmt, wobei die Anzahl der Rezeptoren N₀ betrug.

Die Aktivität in bezug auf die Erhöhung der Anzahl des oberflächengebundenen, mit J¹²⁵ markierten LDL wurde dargestellt durch (N _i /N₀) × 100 (%) und ist in der Fig. 2 gezeigt.

Wie aus der Fig. 2 ersichtlich, wurde das oberflächengebundene J¹²⁵-LDL durch Zugabe des Glycoproteins erhöht und sie zeigt die Zunahme des LDL-Rezeptors.

Beispiel 4 Formulierung einer pharmazeutischen Zubereitung

Kapseln, die jeweils 330 mg des Glyoproteins enthielten, wurden hergestellt durch Füllen von harten Kapseln Nr. 0 mit dem Glycoprotein, so wie es vorlag, unter Verwendung einer automatischen Füllvorrichtung unter Druck.

Claims

Verwendung von Glycoproteinen mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 300 000 (bestimmt nach dem Ultrazentrifugenverfahren) und 18 bis 38 Gew.-% Proteinanteil, hergestellt durch Kultivieren von Coriolus versicolor (FR.) Quel., Extrahieren der auf diese Weise stark vermehrten Mycele oder Fruchtkörper mit heißem Wasser oder einer wäßrigen Alkalilösung und Entfernen der Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 aus dem Extrakt, zur Behandlung von Hyperlipämie.