JPH0737990B2 - 糖類の標識方法及び糖類標識用キット - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、糖類の標識方法に関し、更に詳細には糖類の
還元末端を特定の化合物を用いて標識し、高感度にて分
析する方法、及びその方法を用いる糖類の標識用キット
に関する。

〔従来の技術〕 近年複合糖質の糖鎖が果たす生化学的役割の重要さが注
目されてきており、糖鎖の構造とその機能の関係が次々
と明らかにされつつある。現在、糖鎖の構造決定の手法
としてNMRやMSスペクトルの測定データが広く認められ
ている。これらの物理化学的手法に供するサンプルは、
特に純度の高いものが要求されるため、分離が良く、し
かも高感度で分析できるプレ・カラム標識法の開発が望
まれている。また逆相、順相、イオン交換などのカラム
を用いた高速液体クロマトグラフィ（以下HPLCと称す
る）による分析の進歩に伴い高感度な検出が可能な該プ
レ・カラム標識法の有用性が広く認められつつある。

プレ・カラム標識の方法としては、従来２−アミノピリ
ジンを用いて蛍光標識を行う方法（特開昭64−10177
号、以下PA法と称する）、及び３−メチル−１−フェニ
ル−５−ピラゾロンを用いて紫外吸収誘導体とする方法
〔S.ホンダ（S.Honda）ら、アナリティカル バイオケ
ミストリー（Analytical Biochemistry）、第180巻、第
351〜357頁、（1989）、以下、PMP法と称する〕等が知
られている。

〔発明が解決しようとする課題〕

PA法は、高感度（10^-15mol:fmolレベル）で分析可能な
プレ・カラム標識法として利用されているが、その標識
化の反応は、シッフ塩基の生成（90℃、15分間）とその
還元（90℃、１時間）の２段階の操作を必要とする。

一方PMP法は、標識化の反応は、１段階操作（70℃、２
時間）であるが、PA法に比して検出感度が低い（10^-12m
ol:pmolレベル）。

本発明の目的は上記現状にかんがみ、より緩和な条件下
で、より簡便な反応操作により、糖類を高感度で検出で
きる標識を行うための方法及びキットを提供することに
ある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、糖類の標
識方法に関し、１−（ｐ−メトキシフェニル）−３−メ
チル−５−ピラゾロン（以下、PMPMPと称する）を、糖
類の還元末端に結合させることを特徴とする。また、本
発明の第２の発明は、上記第１の発明の方法を用いて糖
類の標識を行うための糖類標識用キットに関し、PMPMP
を含有することを特徴とする。

本発明における糖類とは、単糖、オリゴ糖、多糖、又は
糖タンパク質、糖脂質、グルコサミノグルカン等の複合
糖質を指す。

糖類に標識物質を結合させる際、糖類の遊離の還元末端
を利用する方法が便利である。糖類のうち単糖、オリゴ
糖、多糖はそのままで還元末端が遊離の状態にあるた
め、通常前処理を必要としない。

一方、糖タンパク質や糖脂質、グルコサミノグルカン等
の複合糖質の場合は例えばヒドラジン分解−Ｎ−アセチ
ル化、トリフルオロアセトリシス、アルカリ処理、オゾ
ノリシス等の化学的な方法や、エンドグリコシダーゼ、
クリコペプチダーゼ、グリコセラミダーゼ等の酵素によ
る処理等の公知の方法にて前処理を行い、還元末端を遊
離させれば良い。

本発明において、糖類の還元末端に結合させるPMPMPと
は小池らによって最初に合成された物質であり〔工業化
学雑誌、第57巻、第56〜58頁（1954）〕、その構造は下
記式〔Ｉ〕に示す通りである。

本発明に用いるPMPMPは、例えば前出文献に記載の方法
で合成し用いれば良く、また本発明者らが確立した、４
−メトキシフェニルヒドラジン塩酸塩、酢酸ナトリウム
３水塩、エチルアセトアセテートを原料とし、高収率で
PMPMPを合成する方法で合成し用いても良い。

本発明の標識方法とは、糖類の還元末端にPMPMPを反応
させるもの（以下、PMPMP法と称する）であり、還元末
端が遊離した糖類とPMPMPをアルカリ下で反応させるこ
とにより、糖類１分子の還元末端当り、２分子のPMPMP
が結合したPMPMP化糖類を定量的に得ることができる。

糖類のPMPMP化反応において、糖類は例えば水酸化ナト
リウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム等のアル
カリ性水溶液に溶解し、PMPMP化を行えば良い。反応pH
としては、弱アルカリ性が好ましく、例えば0.3M水酸化
ナトリウム溶液を用い、PMPMPと混合後、pH8付近で反応
を行えば良い。PMPMPは、例えばメタノール、エタノー
ル、アセトニトリル等の水溶性有機溶媒に溶解し、用い
れば良く、例えば糖類の0.3M水酸化ナトリウム水溶液と
PMPMPのメタノール溶液を等容量混合し、反応させれば
良い。この反応において、PMPMPは糖類に比べ大過剰の
量を加えるのが良く、例えば0.5〜5nmolの糖類に対し、
10μmol以上のPMPMPを加え反応させれば良い。標準的な
反応条件は常温〜100℃、数分間〜２時間であり、好ま
しくは、例えば70℃で20分間PMPMP化反応を行えば良
い。70℃、20分間の反応条件は、PA法、及びPMP法の条
件と比べ、緩和かつ短時間の反応条件である。PMPMP法
により定量的に生成されたPMPMP化糖類は、例えばHPLC
で分析すれば良い。

糖類のPMPMP化反応液中の大過剰の残存PMPMPは、例えば
溶媒抽出により除去することができる。溶媒抽出に用い
る溶媒としては酢酸エチル、クロロホルム、ベンゼン、
四塩化炭素等を用いれば良く、例えば水飽和の酢酸エチ
ルで、反応液中のPMPMPを抽出すれば良い。この時、PMP
MP化反応液をpH5に調整することにより、効率よく、ま
たPMPMP化糖類の分解もなく、大過剰のPMPMPを除去する
ことができる。余剰のPMPMPが除去された反応液の減圧
下濃縮乾固、凍結減圧乾燥等の処理により、乾燥PMPMP
化糖類を調製することができる。該調製PMPMP化物を適
当な溶媒で希釈し、HPLC分析すれば良い。例えば15％ア
セトニトリル水溶液で希釈後、逆相ODSカラムを用い、2
0％アセトニトリル含有0.1Mリン酸バッファーで溶出
し、249nmの吸光度を測定することにより、感度よくPMP
MP化糖類を検出することができる。なお、PMPMP化反応
液から過剰のPMPMPを除去した反応液を直接、HPLC分析
に供しても良い。

本発明の方法で調製したPMPMP化糖類は、PMP法に従って
調製したPMP化糖類の約1.5倍の紫外吸収強度を示し、PM
PMP法を用いることにより、PMP法に比べより緩和な条件
で、より高感度に糖類を標識化し、検出することができ
る。また弱アルカリの条件下で標識化反応を行うので、
ムチン型糖鎖であるＯ−リンク型の糖類の標識化及びHP
LC分析も可能である。

本発明のPMPMP化用試薬をそろえてキットとしておくこ
とで、目的試料中の糖類の標識化を簡便に行うことがで
きる。

キット中に含有される試薬としては、例えばPMPMP、PMP
MP溶解用溶媒等を含有させれば良く、このほか、試料と
なる糖類の還元末端を遊離させるための処理に用いる試
薬、又は酵素を含有させても良い。また、分析に供する
場合の標準物質、例えばPMPMP化された単糖等を含有さ
せても良い。

またキットに含有させる試薬等は溶液状でも良いし、凍
結乾燥品でも良い。

〔実施例〕

以下に、本発明の実施例を示し、本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。

参考例１ PMPMPの調製 ４−メトキシ−フェニルヒドラジン塩酸塩（5.6g、32mm
ol、アルドリッチ社製）、酢酸ナトリウム３水塩（5.45
g、40mmol、キシダ化学製）、エチルアセトアセテート
（4.16g、32mmol、キシダ化学製）を40mlのエタノール
に溶かし、２時間還流し反応させた。

冷却後、溶媒を減圧下留去し、残渣にエタノール（40m
l）を加え、不溶性物質をろ過除去した。ろ液を減圧濃
縮乾固させ、少量のベンゼン−酢酸エチル（4:1）に溶
かし、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（150gシリ
カゲル60、メルク社製）に供した。ベンゼン−酢酸エチ
ル（4:1）を用いて溶出させ、減圧濃縮乾固後、メタノ
ールにて結晶化を行い、2.80g（収率42.9％）のPMPMPを
得た。構造は¹H及び¹³C NMRにて確認した。それぞれの
NMRによるスペクトルを表１に示す。

実施例１ ラクトース及びシアリルラクトースのPMPMP化 シアリルラクトース19μｇ（30nmol相当）を計量し、ス
クリュー・キャップ付のポリプロピレンのチューブ（1.
5ml容、家田貿易）に入れ、0.3Mの水酸化ナトリウム水
溶液を20μと0.5MのPMPMPのメタノール溶液の20μ
を加え、キャップをし70℃にて20分間保温した。反応
後、0.3MのHClの20μを加えて反応液のpHを５に調整
し、200μの水飽和の酢酸エチルにて抽出操作を５回
繰返し、残った水層を減圧濃縮乾固した。残渣に15％ア
セトニトリル水溶液を300μ加え溶解し、その内20μ
をHPLCにて分析した。

上記と同様の方法にてラクトースをPMPMP化し分析し
た。

HPLCの条件は以下のとおりである。

カラム：カプセルパック（Capcell pak）C₁₈（4.6mmφ
×250mm:資生堂製） 溶 媒:20％アセトニトリル含有0.1Mリン酸バッファー
（pH7.0） 流 速:1.0ml/分 検 出:249nm PMPMP化シアリルラクトースのHPLC結果を第１−１図
に、PMPMP化ラクトースのHPLC結果を第１−２図に示
す。すなわち第１−１図の縦軸は249nmの吸光度を示
し、横軸は溶出時間（分）を示す。また、図中のピーク
１、ピーク２はそれぞれPMPMP化シアリルラクトースで
ある。

また、第１−２図の縦軸は249nmの吸光度を示し、横軸
は溶出時間（分）を示し、図中のピーク３はPMPMP化ラ
クトースである。

第１−１図及び第１−２図より明らかなように、PMPMP
化糖類が感度よく分離される。また第１−１図中にPMPM
P化ラクトースのピークは認められず、シアリルラクト
ースのPMPMP化の工程において、シアリルラクトースか
らのシアル酸残基の脱離によるPMPMP化ラクトースの生
成は無くPMPMP法は、シアロ糖鎖の定量的標識方法とし
て適している。

実施例２ ブタチログロブリン（hog thyroglobulin）の糖鎖のPMP
MP化 ブタチログロブリン670μｇ（1nmol相当）の糖鎖のジシ
アロ糖鎖画分及びモノシアロ糖鎖画分をN.ウイ（N.Ui）
らの方法（ザ ジャーナル オブ バイオケミストリー
（J.Biochem.）、第50巻、第508〜518頁（1961）〕によ
りそれぞれ調製し、次いでそれぞれB.ベンディアク（B.
Bendiak）らの方法〔カルボハイドレート リサーチ（C
arbohydr.Res）、第151巻、第86〜103頁（1986）〕に従
ってヒドラジン分解、Ｎ−アセチル化後、イオン交換樹
脂〔アンバーライト（Amberlite）CG−120〕を用いて脱
塩した。そのろ液と洗液を合せて減圧濃縮乾固し、実施
例１と同様の手順にてPMPMP化し、HPLCにて分析した。

HPLC分析の条件は以下に示す通りである。

カラム：カプセルパック（Capcell pak）C₁₈（4.6mmφ
×250mm:資生堂製） 溶 媒:15％アセトニトリル含有0.03Mリン酸バッファー
（pH7.0） 流 速:0.6ml/分 検 出:249nm PMPMP化ジシアロ糖鎖のHPLC結果を第２−１図に、PMPMP
化モノシアロ糖鎖のHPLC結果を第２−２図に示す。すな
わち第２−１図の縦軸は249nmの吸光度を示し、横軸は
溶出時間（分）を示す。

また、図中のピーク１は下記式〔II〕のPMPMP化ジシア
ロ糖鎖である。

（以下、式中、Ｓはシアル酸を、Ｇはガラクトースを、
GNはＮ−アセチルグルコサミンを、Ｍはマンノースを、
Ｆはフコースをそれぞれ表す） また、第２−２図の縦軸は249nmの吸光度を示し、横軸
は溶出時間（分）を示す。また、図中のピーク２、ピー
ク３はそれぞれ下記式〔III〕、〔IV〕のPMPMP化モノシ
アロ糖鎖である。

第２−１図及び第２−２図に示す様に、本実施例におい
ても、シアロ糖鎖が効率よく標識化されている。

実施例３ ウシスイ臓（bovine pancreas）由来のリボヌクレアー
ゼＢ（ribonuclease B）の糖鎖のPMPMP化 上記のリボヌクレアーゼＢ（シグマ社製）100μｇ（7.1
nmol相当）を高橋らの方法〔バイオケミカル アンド
バイオフィジカル リサーチ コミニケーションズ（Bi
ochem.Biophys.Res.Commun.）第76巻、第1194〜1201頁
（1977）〕に従い、ペプチダーゼ消化、次いでゲルろ過
を行い、糖ペプチド画分を調製した。次いで、該画分に
グリコペプチダーゼＡ（生化学工業社製）を作用させ糖
鎖を遊離させた。この酵素反応液を減圧下濃縮乾固し、
実施例１と同様にして、PMPMP化を行い、実施例２と同
様の条件でHPLC分析を行った。

PMPMP化糖鎖のHPLC結果を第３図に示す。すなわち第３
図の縦軸は249nmの吸光度を示し、横軸は溶出時間
（分）を示す。

また、ピーク１は下記式〔Ｖ〕、ピーク２〜４は下記一
般式〔VI〕のPMPMP化糖鎖であり、各ピークが効率よく
分離されている。

実施例４ 糖類標識用キットの調製 糖類のPMPMP化用試薬として、PMPMP及びPMPMP溶解用メ
タノールを含有するキットを作成した。キットの構成を
表２に示す。

参考例２ PMP法とPMPMP法の比較 グルコースのPMP化及びPMPMP化を行い、両化合物の比較
を行った。

（１） PMP化グルコースの調製 グルコース180mg（1m mol）を0.3Mの水酸化ナトリウム1
0mlに溶解し、0.5MのPMPのメタノール溶液を10ml加え、
70℃にて２時間反応させた。1.0Mの塩酸を用いて中和
し、減圧下濃縮乾固した。残渣に水を10ml入れて溶解
し、少量のクロロホルムにて２回抽出し、余剰のPMPを
除いた。水層を減圧下濃縮乾固し、PMP化グルコースを
調製した。

（２） PMPMP化グルコースの調製 グルコース0.9mg（5n mol）に0.3Mの水酸化ナトリウム
水溶液を20μと、0.5MのPMPMPのメタノール溶液を20
μとを加え、70℃にて20分間反応させた。反応後0.3M
の塩酸を用いて中和した後、水飽和の酢酸エチルにて５
回抽出した。水層を減圧下濃縮乾固し、PMPMP化グルコ
ースを調製した。

（３） PMP化グルコース及びPMPMP化グルコースのHPLC
分析 実施例１のHPLC条件でPMP化グルコースとPMPMP化グルコ
ースのHPLCを行い、溶出ピーク面積の比較を行った。

PMPMP化グルコースはPMP化グルコースの約1.5倍のピー
ク面積を示し、PMPMP化グルコースはPMP化グルコースの
約1.5倍の高感度で検出することができた。

〔発明の効果〕

以上、詳細に説明したように、本発明により、簡便でか
つ高感度な糖類の標識方法及び標識用キットが提供され
た。本発明方法により、緩和な条件下で標識化物が調製
でき、シアロ糖鎖等の微量定量が可能となった。

【図面の簡単な説明】

第１−１図はPMPMP化シアリルラクトースの、第１−２
図はPMPMP化ラクトースの、第２−１図はPMPMP化ジシア
ロ糖鎖の、第２−２図はPMPMP化モノシアロ糖鎖の、第
３図はリボヌクレアーゼＢ由来のPMPMP化糖鎖のそれぞ
れHPLCによるクロマトグラフを示す図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】１−（ｐ−メトキシフェニル）−３−メチ
   ル−５−ピラゾロンを糖類の還元末端に結合させること
   を特徴とする糖類の標識方法。
2. 【請求項２】請求項１に記載の方法を用いて糖類の標識
   を行うためのキットであって、１−（ｐ−メトキシフェ
   ニル）−３−メチル−５−ピラゾロンを含有することを
   特徴とする糖類標識用キット。