JPH06507242A - オリゴ糖の配列決定 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 オリゴ糖の配列決定 本発明は、オリゴ糖の分析、より詳しくは、オリゴ糖の配列決定として知られる 分析の形態に関する。

本発明の１の態様によれば、オリゴ糖体を担体に固定化するオリゴ糖の配列決定 に用いるのに適した方法が提供される。

本発明の別の態様によれば、オリゴ糖体を担体に固定化する段階を含むオリゴ糖 の配列決定に用いるのに適した方法が提供される。

本発明のさらなる態様によれば、固定化されたオリゴ糖体を含むオリゴ糖の配列 決定に用いるのに適した装置が提供される。

本発明のさらにもう１つの態様によれば、オリゴ糖体を固定化してもよい担体を 含むオリゴ糖の配列決定に用いるのに適した装置が提供される。

例えば、オリゴ糖体は、オリゴ糖、またはオリゴ糖の生成物、あるいはオリゴ糖 部分を有する種であってもよい。例えば、オリゴ糖の生成物は、オリゴ糖に対す る配列決定因子をあらかじめ適用することによって得られた生成物であってもよ （、該生成物自身がオリゴ糖であってもよい。

したがって、例えば、かかるオリゴ糖を、本発明により固定化し、配列決定に付 すことおよび、さらに別法として、例えば、オリゴ糖の生成物を本発明による配 列決定に付してもよいことが理解されるであろう（該生成物はそれ自身オリゴ糖 であってもよいことが理解されるであろう）。

別法として、例えば、オリゴ糖部分（例えば、抱合体に結合したオリゴ糖）を有 する種のオリゴ糖部分として提供されるオリゴ糖を本発明による配列決定に付し てもよい。

糖蛋白および糖脂質は種（オリゴ糖からなる部分を有している）の例であり、こ れらを本発明により固定化し、配列決定に付してオリゴ糖を配列決定に付するよ うにしてもよい。

したがって、例えば、さらに所望によりオリゴ糖を、抱合体に結合させたまま、 本発明により固定化し、配列決定に付してもよい。ただし、該抱合体は、いかな る許容されない範囲においても、配列決定を妨害しないものとする。

以上の開示から、例えば、配列決定に付されるべきオリゴ糖を、いかなる適切な 形態およびいかなる適切な方法で提供してもよいことが理解されるであろう。

また、以上の開示から、本発明により、オリゴ糖の配列決定が、例えば、配列決 定用因子を、オリゴ糖あるいはオリゴ糖の生成物またはオリゴ糖部分を有する種 に適用することを包含していてもよい。

オリゴ糖部分を有する種の例は、抱合体に結合したオリゴ糖からなる種である。

オリゴ糖体をいかなる適切な手段により担体に固定化してもよい。

したがって、例えば、オリゴ糖体がオリゴ糖、またはその生成物である場合、例 えば、オリゴ糖の還元末端を介した化学結合（例えば、共有結合）により固定化 を行ってもよい。

例えば、オリゴ糖、またはその生成物からなるオリゴ糖体を、本発明により、担 体との直接共有結合あるいは担体との直接的非共有結合（例えば、疎水結合）に より固定化してもよい。

別法として、例えば、オリゴ糖部分を有する種からなるオリゴ糖体を、配列決定 に付す前に、担体に固定化してもよい。

例えば、オリゴ糖またはその生成物を、抱合体に結合させたまま固定化すること が所望の場合、該抱合体を担体に結合させ（例えば、共有結合または非共有結合 （例、疎水結合）により）、オリゴ糖またはその生成物を、該抱合体を介して担 体に直接結合させるようにしてもよい。

例えば、オリゴ糖体がオリゴ糖、またはオリゴ糖の生成物である場合、オリゴ糖 またはオリゴ糖の生成物の担体への固定化を、以下の方法により行ってもよい。

還元されていないオリゴ糖＋２−アミノピリジン／　Ｎ　ａ　Ｂ　Ｈｓ　ＣＮ→ オリゴ−ピリジルアミノ誘導体→抱合体さらに例えば、オリゴ糖体が、オリゴ糖 またはオリゴ糖の生成物である場合、オリゴ糖またはオリゴ糖の生成物を、以下 の方法で担体に固定化してもよい。

還元されていないオリゴ糖＋ダンシルヒドラジン／ＴＦＡ→オリゴ−ダンノルヒ ドラジン誘導体、オリゴ−ダンシルヒドラジン誘導体十ＮａＢＨ４／Ｈ１０→抱 合体 還元末端を介するオリゴ糖の担体への結合は、好ましくは、オリゴ糖構造に応じ て行うのがよく、該結合が、例えば、閉環配置に保持されるべき還元末端単糖を 必要としなくてもよいことが理解されよう。

いかなる適切な担体も、本発明により用いることができる。

本発明に用いる担体の例は、１，１′カルボニルジイミダゾール−活性化アガロ ースからなる固体担体である。

オリゴ糖は、グリコシド結合により、それぞれが互いに結合した多くの単糖から なる化合物のクラスを形成している。自然界に存在するオリゴ糖の重要な起源は 、Ｎ−グリコシド結合またはＯ−グリコシド結合いずれかによりペプチド鎖に結 合した糖を含む糖蛋白である。これらのオリゴ糖は、ごく少数の単糖単位から多 くの（例えば、３０個以上）単糖単位を含む非常に多く分枝した構造にまで及ぶ 。

オリゴ糖の「配列決定」とは、（ｉ）オリゴ糠中の各単糖単位の形態、（ｉ　ｉ ）オリゴ糠中の単糖単位の配列順序、（ｉｉｉ）各単糖単位間の結合位置（例え ば、１−３．１−４など）およびこれによる何等かの分枝パターン、および／ま たは（ｉｖ）各単糖単位間の結合の方向（すなわち、結合がα−結合かβ−結合 か）のごときオリゴ糖の構造に関する、ある種の情報を得ることを意味する。

オリゴ糖の構造に関する可能な限り多くの情報を得ることが所望ならば、オリゴ 糖の「配列決定」を行って、上の開示を総合して（ｉ）がら（ｉｖ）までの特徴 に関する可能な限り多くの情報を得ることができる。

オリゴ糖に適用して（ｉ）から（ｉｖ）までの特徴のいくつかまたはすべてに関 する情報を得ることを助ける因子を、「配列決定因子」と見なしてもよい。例え ば、配列決定因子は物理的因子であっても化学的因子良であってもよい。物理的 配列決定因子の例は、プロトンｎ、ｍ、ｒ、、炭素−１３ｎ、ｍ、ｒおよび分子 量決定用質量スペクトル分析である。また、例えば、配列決定因子は、化学結合 を開裂し、あるいは化学結合を形成することができるものであってよい。

例えば、配列決定因子が化学試薬（例えば、化学試薬または生化学試薬であって よい）である場合、該配列決定因子を、配列決定試薬と見なしてもよい。配列決 定試薬の例は、酵素（エキソグリコンダーゼおよびエンドグリコシダーゼのごと き）ならびに前記のごときオリゴ糖の構造を予想するための情報を得るのを助け るオリゴ糖の化学的開裂および／または化学修飾をすることのできる化学試薬（ 例えば、過ヨウ素酸）である。

配列決定試薬として使用することのできる酵素の例を表１に示す。

表１ 表１（続き） 表１に、Ｎ−結合型オリゴ糖からの単糖の切断に通常用いる酵素およびオリゴ糖 が個々の酵素により切断され、オリゴ糖構造の一部の開裂が予想される場合の様 式を示す。

特殊な結合あるいはオリゴ糠中の結合を開裂できる配列決定因子が、オリゴ糖の 特異的変化を起こさせることのできるものであってもよい。

配列決定因子がオリゴ糖体に適用（例えば、オリゴ糖体に化学的または生物学的 試薬を接触させる）された場合に、反応生成物が、オリゴ糖体中における特殊な 構造的下部単位（例えば、単糖単位）の存在または不存在を表すように、配列決 定因子を選択してもよいことが理解されよう。

よって、本発明の１の具体例において８、配列決定因子をオリゴ糖体に適用し、 該オリゴ糖体の構成要素を分析することを包含するオリゴ糖配列決定因子が提供 され、該構成要素はオリゴ糖体から該配列決定因子により遊離される。

すぐ上に記した本発明の具体例によって、当該配列決定因子を適用した後、オリ ゴ糖体を分析してオリゴ糖体の構造を含む情報を得る。むしろ、すぐ上に記した 本発明の具体例によって、オリゴ糖体から遊離または開裂されるのは構成要素で あって、これを分析して「配列決定」を容易にする。

したがって、例えば、分析を行う場合、開裂反応の生成物中の特殊な単糖からな る構成要素を検出することによりオリゴ糖体の元々のオリゴ糖構造中の特殊な結 合および単糖の存在を確認してもよい。

オリゴ糖に関する一部の可能な構造（すなわち一群の「候補」構造）を、いかな る適当な方法で用意してもよい。

例えば、一群の「候補」構造を文献検索により列挙してもよい。

さらに例えば、一群の「候補」構造を、単糖単位の可能な順列を考えることによ り用意してもよい。

別法として、さらに例えば、構造および下位構造に関する概念を用いて（以下に 議論する）未知オリゴ糖に対する一部の候補構造を用意してもよい。

例えば、異なる配列決定因子を連続的にオリゴ糖体に適用し、個々の配列決定因 子を用いることにより得られた生成物を分析することにより、ある種の構造を考 えから除外しくすなわち、オリゴ糖体に関して仮定した一部の可能な「候補」構 造からある種の構造を除外する）、ある種の構造またはそれにより推測すべきオ リゴ糖体の構造を考えるための情報が得られるような構造の存在を確認すること が可能であるということが理解されよう。

したがって、例えば、与えられたオリゴ糖またはその生成物（前もってオリゴ糖 に配列決定因子を適用することにより得られた生成物である）あるいはオリゴ糖 部分を有する種に異なる配列決定因子を適用し、個々の配列決定因子を用いて得 られた生成物を分析することにより、考えからある種の構造を除外しくすなわち 、オリゴ糖に関して仮定された一部の「候補」構造から、ある種の構造を除外す る）、ある種の構造またはそれにより推定すべきオリゴ糖の構造に関する情報を 得ることを可能にするようなある種の構造（例えば、それはかかるオリゴ糖であ ってもよく、オリゴ糖部分を有する種のオリゴ糖部分であってもよい）の存在を 確認することが可能である。

例えば、与えられた配列決定因子（例えば、酵素（例、エキソグリコツダーゼ） のごとき生物学的試薬）の結合を開裂させる能力により、オリゴ糖体のオリゴ糖 構造の末端の特殊な単糖の結合の存在および結合を検出してもよい。よって、開 裂が起これば、該開裂反応生成物中の特殊な単糖の検出は、元のオリゴ糖構造中 にそのような結合が存在することの確認となる。したがって、既知の特異的開裂 能を有する複数の異なる配列決定因子を連続して用いることによって、分析をも とにオリゴ糖体の構造に関する増えつつある情報を推定することが可能である。

候補オリゴ糖構造間を区別できる単一の配列決定因子が見いだされていない場合 には、１の因子の適用後、２．３またはそれ以上の因子を組み合わせて適用して 構造に関する考えを可能ならしめる。構造を考える個々の段階において、一群の 候補構造に何の影響も及ぼさない因子を除去してもよい。オリゴ糖構造に関する 考えを、２つまたはそれ以上の因子を同時に組み合わせて得てもよく、このよう にすれば、配列分析を実行するのに要する時間を短縮することができる。

したがって、反復的方法を用いて、それにより、利用可能な方法によりオリゴ糖 体の構造を考えるに十分多くの情報が得られるか、またはオリゴ糖体の試料がな くなるまで、分析サイクル、すなわち配列決定（または配列決定因子の組み合わ せ）の適用および連続した分析を繰り返す。

前記したことから、ある条件下では、特別な配列決定因子は、オリゴ糖体と反応 せず、オリゴ糖体の構造の推定を可能にするようには反応しないという事実を提 供する生成物を与えるということが理解されよう。

オリゴ糖体の該配列決定因子の有効性は、配列決定の種々の段階で適用されるべ き配列決定因子の選択に依存し、オリゴ糖体に対する与えられた配列決定因子を 適用することの結果の解釈の正確さに依存すると考えてもよい。

配列決定因子の適切な選択は、調査すべきオリゴ糖構造の形態についていくらか の知的な推測をすでに行っている経験あるオペレーターの技能に、おおいに委ね られている。

配列決定因子の適切でない選択は、配列決定因子の特別な適用により明らかとな るような情報を、ごく僅かしか得られないかまたは何のさらなる情報も得られな いこととなり、したがって、時間と材料の無駄となる。また、オペレーターの先 入観が結果の解釈のあいまいさを覆い隠すであろうという危険が存在する。例え ば、オペレーターが、実験結果と矛盾しない単一の構造と考えても、実際は、同 一実験結果と矛盾しない１つ以上の構造が存在するかもしれない。

利用可能な配列決定因子を用いることにより明らかとなりうるさらなる情報がも はや得られなくなった時点の決定において、さらなる困難が生じつる。

糖蛋白から得られるオリゴ糖体（例えば、オリゴ糖）に関し、オリゴ糖構造の構 築に含まれる生合成経路に関する知識を、その配列決定の一部としてもよい。

したがって、例えば、Ｎ−結合型オリゴ糖に関しては、特徴的なコア構造があり 、さらなる単糖が、ある良くわかっている順序と分校パターンで付加しているこ とが知られている。

この知識を用いてオリゴ糖に関する構造および下位構造に対する考えを発展させ てもよい。このことを、さらに以下において、添付した図１．２および３に関し て議論する。

例えば、本発明による配列決定に付すべきオリゴ糖体が、酵素ペプチド−Ｎ−グ リコシダーゼＦにより糖蛋白から遊離されたオリゴ糖混合物から得られたオリゴ 糖である場合、該オリゴ糖はＮ−グリカンであり、その構造は、添付図面の図１ 、図２または図３の構造と同様であるか、または添付図面の図１、図２または図 ３の構造と同様の構造から生じる下位構造のようなものである。

本発明の１の具体例において、配列決定因子あるいは配列決定因子を組み合わせ てオリゴ糖体に適用することを包含するオリゴ糖の配列決定方法が提供される。

本発明のもう１つの具体例において、配列決定因子をオリゴ糖体に適用し、担体 に固定化し、そして該配列決定因子を該オリゴ糖体に適用することにより得られ た生成物を分析することを包含するオリゴ糖の配列決定方法が提供される。

本発明のさらなる具体例において、配列決定因子をオリゴ糖体に適用し、担体に 固定化し、該配列決定因子を該オリゴ糖体に適用し、該配列決定因子を該オリゴ 糖体に適用することにより得られた生成物を分析し、そしてさらなる配列決定因 子をオリゴ糖体またはその生成物に適用することを包含するオリゴ糖の配列決定 方法が提供される。

例えば、配列決定因子または配列決定因子の組み合わせを、本発明により、いか なる適当な方法でオリゴ糖体に適用してもよい。例えば、配列決定因子または配 列決定因子の組み合わせを、適当な反応容器中で担体に結合したオリゴ糖体に適 用してもよい。

配列決定因子または配列決定因子の組み合わせを、適当な溶媒中に導入して配列 決定因子とオリゴ糖体を接触させるための手段としてもよい。

オリゴ糖体の配列決定をするためのいかなる適当な手段あるいは方法も、本発明 により担体に固定化されたオリゴ糖体の配列決定に適用してもよいことが理解さ れよう。

したがって、例えば、オリゴ糖体に適用すべき配列決定因子の選択のための手段 を用いてもよい。

配列決定因子の選択のためのかかる手段が、例えば、論理的選択をすることので きる単位（例えば、論理的単位）であってもよい。

また、該単位が、分析手段により得られる結果を解釈すること力咄来、オリゴ糖 体に適用すべき配列決定因子（または配列決定因子の組み合わせ）を選択するこ とのできるようなものであってもよい。よって、例えば、該単位が、オリゴ糖体 への配列決定因子（または配列決定因子の組み合わせ）の適用、オリゴ糖体から の生成物であるオリゴ糖体へのもう１つの配列決定因子（または配列決定因子の 組み合わせ）の適用、あるいはオリゴ糖体またはもしくはオリゴ糖体からの生成 物であるオリゴ糖体へ別のまたはさらなる配列決定因子（または配列決定因子の 組み合わせ）の適用を要求できるようなものであってもよい。

固定化されたオリゴ糖体、または配列決定因子の適用により得られた該担体上に 保持されているその生成物を、配列決定因子または因子の適用により得られた種 （新たな還元末端を有する）のごとき遊離生成物から容易に分離できる。したが って、例えば、オリゴ糖体からの生成物が担体上に保持されていてもよく、新た な還元末端を有する種を洗浄により除去してもよい。

オリゴ糖のオリゴ糖構造配列決定を遊離溶液中で行う場合、一般的に、オリゴ糖 体のオリゴ糖構造への配列決定因子の影響を分析することは、いくらかのオリゴ 糖体の損失を伴うことが理解されよう。よって、分析用に反応混合物（オリゴ糖 体に配列決定因子を適用して得られる）を取る際に、オリゴ糖体のうちい（らか は、反応混合物中に存在する他の種とともに除去されてしまう。

本発明の固定化の使用により、オリゴ糖体（例えば、オリゴ糖またはその生成物 、あるいはオリゴ糖部分を有する種）が担体上に保持されるので、反応混合物試 料を分析用に取る際に除去されない。

本発明の固定化の使用はまた、オリゴ糖体に適用した配列決定因子により生成す る種のより正確な決定を可能にする。したがって、例えば、オリゴ糖体が担体に 保持されているために、分析用に取った反応混合物試料（オリゴ糖体に配列決定 因子を適用して得る）中には、分析を妨害するオリゴ糖体（例えば、オリゴ糖、 またはその生成物、あるいはオリゴ糖部分を有する種）が実質的に存在しなくな ることも可能である。

本発明の固定化の使用は、所望であれば、２番目の配列決定因子の適用前に、初 めの配列決定因子を除去することを可能にする。このことは、２番目の配列決定 因子の適用により得られるオリゴ糖体からの生成物に対する最初の配列決定因子 の望ましくない適用を避けるという長所をもたらす。

本発明による方法はまた、配列決定因子の適用前に、未知のオリゴ糖体の予備的 な分析を行う段階を包含する。

予備的な構成要素の分析により、それ以降の構造分析において考えることが必要 な多くの候補オリゴ糖構造を減らすことが可能になることが理解されよう。よっ て、かかる予備的構造分析により、多くの配列決定因子の適用を減らすことがで きる。

オリゴ糖体の分析（例えば、予備的分析または何等かの引き続き行う分析）をい かなる適当な方法により行ってもよい。したがって、例えば、オリゴ糖体中の各 単糖の形態および数を、いかなる適当な方法により分析してもよい（すなわち、 構成要素の分析を行う）。例えば、オリゴ糖体のオリゴ糖構造の、その単糖成分 への完全な分解を、適当な試薬（例えば、エキソグリコシダーゼのごとき消化試 薬の混合物）での処理により行い、得られた反応混合物を、以下に開示の適当な 単糖分析法を用いて分析する。別法として、さらに例えば、オリゴ糖体をメタツ リシス、Ｎ−アセチル化（必要ならば）およびシリル化に付し、得られた物質を ガスクロマトグラフィー／質量りロマトグラフィー付してもよい。

さらに例えば、オリゴ糖体のオリゴ糖構造に関する情報を、クロマトグラフィー カラム上の保持時間を観察することにより得てもよ（、また例えば、クロマトグ ラフィーカラムが、オリゴ糖体の保持時間をグルコース単位で表すようなもので あってもよい。

単糖の検出を、いかなる適当な方法で行ってもよい。その例は、以下のＨＰＬＬ に基づく方法である。（ｉ）ＳＰＩＯＩＯ逆相カラムの使用、（ｉｉ）ディオネ ックス（Ｄｉｏｎｅｘ）装置を用いたＰＡＤを伴うＨＰＡＥ、および（ｉｉｉ） キャピラリー電気泳動。

本発明の１の具体例において、オリゴ糖体の配列決定に適した装置が提供され、 該装置は、固定化されたオリゴ糖体およびオリゴ糖体の構成要素を分析するため の分析手段を含み、該構成要素は、配列決定因子により該オリゴ糖から遊離され る。

本発明による分析手段は、オリゴ糖体に配列決定因子を適用（例えば、配列決定 因子とオリゴ糖体とを混合する）することにより得られるオリゴ糠中に存在する 単糖および／または単糖の形態および相対量を測定できる検出器を包含していて もよい。例えば、単糖を単糖として、あるいはその誘導化生成物として測定して もよい。

本発明を、添付図面および実施例を参考にしてさらに説明する。

添付図面において、 図１は、高マンノース型（Ｍａｎ９）のＮ−結合型オリゴ糖の構造を示す図であ る。

図２は、ハイブリッド型（Ｈｙ２）のＮ−結合型オリゴ糖の構造を示す図である 。

図３は、多アンテナ型（Ｈｅｘ２）のＮ−結合型オリゴ糖の構造を示す図である 。

図４は、標準単糖のＴＭＳ−メチルグリコシドの全イオン電流クロマトグムを示 す図である。

図５から図２３は、ＴＭＳ−メチル化標準単糖のガスクロマトグラフィー−質量 スペクトルを示す図である。

図２４は、実施例１にて参照するオリゴ糖体の構造を示す図である。

図２５は、実施例１（ａ）に関して開示するＴＭＳ−メチル化グリコシドの全イ オン電流クロマトグラムを示す図である。

図２６から図２９は、実施例１（ａ）に関して開示するＴＭＳ−メチル化グリコ シドのガスクロマトグラフィー−質量スペクトルを示す図である。

図３０は、実施例１（ｂ）に関して開示するＴＭＳ−メチル化グリコシドの全イ オン電流クロマトグラムを示す図である。

図３１から図３３は、実施例１（ｂ）に関して開示するＴＭＳ−メチル化グリコ シドのガスクロマトグラフィー−質量スペクトルを示す図である。

図３４は、実施例１（ｃ）に関して開示するＴＭＳ−メチル化グリコシドの全イ オン電流クロマトグラムを示す図である。

図３５から図３７は、実施例１（ｃ）に関して開示するＴＭＳ−メチル化グリコ シドのガスクロマトグラフィー−質量スペクトルを示す図である。

図３８は、実施例２にて参照するオリゴ糖体の構造を示す図である。

図３９は、実施例３にて参照するオリゴ糖体の構造を示す図である。

図４０は、実施例４にて参照するオリゴ糖体の構造を示す図である。

添付図面の図１．２および３ならびに本明細書中記載の略号Ｍａｎ、Ｆｕｃ。

ＧａｌおよびＧｌｃｎａｃは、それぞれＤ−マンノース、Ｌ−フコース、Ｄ−ガ ラクトースおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを意味する。

添付図面の図１については、高マンノース型のＮ−結合型オリゴ糖の構造を示し である。

構造は、種々の結合により結合したマンノースおよびＮ−アセチルグルコサミン 単糖単位の数を示すことが理解されよう。図の右端のＮ−アセチルグルコサミン 単位を該構造の還元末端と見なしてもよい。構造および下位構造の考え方は、上 に開示してあり、特殊な構造に関連するオリゴ糖は、構造自身または一群の下位 構造の構成要素であると仮定してもよいと言える。下位構造を、構造に対する特 異的変換を行うことにより生じさせてもよい。このことは、オリゴ糖体のオリゴ 糖構造の連続的配列決定により、一群の構造から候補構造がどんどん除去されて いき、もはや情報が得られなくなるという可能性を生じる。

したがって、オリゴ糖体の未知オリゴ糖構造を、残存する構造の１つとして同定 してもよい。

図１（および図２および３）に示す構造の場合、下位構造を得るために用いる変 換は、すべての可能なやり方での末端単糖の連続的除去である。これにより、下 位構造中に存在する単糖の組み合わせが構造の組み合わせに従う構造と同じ基幹 構造を有するすべての独自の下位構造が得られる。

添付図面の図２には、ハイブリッド型（Ｈ７２）のＮ−結合型オリゴ糖の構造を 示しである。

図１に関する上記構造および下位構造についての開示を、図２に準用する。

添付図面の図３には、多アンテナ型（Ｈｅ　ｘ　２）のＮ−結合型オリゴ糖の構 造を示しである。

図１に関する上記構造および下位構造についての開示を、図３に準用する。

実施例１ この実施例において、添付図面の図２４に示した構造のオリゴ糖からなるオリゴ 糖体を、本発明の利用を示すために用いる。

該オリゴ糖は、５００ＭＨｚ’Ｈ−ＮＭＲ（１−次元）および高品質アニオン交 換クロマトグラフィーにより９５％以上の純度を有することが確認された。

該オリゴ糖を、以下の還元的アミノ化を用いて１，１°カルボニルジイミダゾー ル−活性化アガロースからなる担体に抱合させることにより固定化した。

１ｍｇの該オリゴ糖を８０μｍの試薬（１００ｍｇの２−アミノピリジンを６５ μｍの濃塩酸に溶解することにより調製）とともに９０℃で１２分間加熱した。

ついで、１．６６ｍｇ／ｍｌの濃度のシアノ水素化硼素ナトリウムのジメチルス ルホキシド溶液８μｌを添加し、得られた混合物を９０℃でさらに９０分加熱し た。冷却後、該混合物を０．５ｍｌのｎ−ブタノール：エタノール（４：　１） で希釈し、ついで、セルロース（４ｍｌ）のカラムに適用し、２０ｍ１のｎ−ブ タノール：エタノール：水（４：　４　：　１）で溶出し、続いてメタノール（ ３ｍｌ）ついで水（５ｍｌ）で溶出した。メタノールおよび水のフラクションを 合一し、ロータリーエバポレーションにて０．２ｍｌに濃縮した。アセトン（０ ，５ｍ　ｌ　）中のジイミダゾールカルボニル活性化アガロースのスラリーを添 加し、得られた混合物を室温で２４時間撹拌した。

担体に抱合したオリゴ糖混合物（該混合物を、この実施例では「抱合物質」と称 す）を、０，１Ｍ塩化ナトリウムで濯ぎ、ついで遠心分離（１０００ｇ、１分） することにより反応物混合物およびすべての非抱合物質から分離し、上清液を捨 てた。濯ぎ、遠心分離および液捨てを５回繰り返した。

抱合物質をエキソグリコシダーゼとともにインキュベーションし、以下のごとく 遊離単糖すべてを同定し定量することにより、固定化オリゴ糖を配列決定に付し た 該オリゴ糖の予備的分析を行い、以下の単糖単位を同定した。Ｍａｎ（３単位） 、Ｇａ１（２単位）およびＧｌｃｎａｃ　（４単位）。

オリゴ糖体に適用すべき配列決定因子を選択するための手段（該手段は論理的単 位を含む）に関する該予備的分析の結果を用いて、候補構造を同定し、抱合物質 に適用すべき配列決定因子を選択した。

かくして、 （ａ）プラスティック試験管中の該抱合物質に、１．０ユニツトの精製β−Ｄ− ガラクトシダーゼ酵素（タチナタマメ由来）を含有するＯ、ＩＭ＜えん酸ナトリ ウム／りん酸（ｐＨ３，５）からなる溶液１００μｌを添加して混合物を得た。

該試験管にキャップをし、該混合物を３７℃で６時間インキュベーションした。

抱合物質を、０．１％塩化ナトリウムで濯ぎ、ついで遠心分離（１０００ｇ、１ 分）することにより分離した。抱合物質から液体上清を分離し、集めた。この操 作を繰り返し、全ての液体上清を溜めておき、０．５ｍｌのダウエックス（Ｄｏ ｗｅｘ）ＡＧ３Ｘ　４Ａ（ＯＨ−）樹脂（上）および０．５ｍｌのダウエックス ＡＧ５０Ｘ１２（Ｈつ樹脂（下）からなるカラムに通すことにより脱塩した（両 樹脂ともバイオ・ラッド（Ｂｉｏ　ＲＡＤ）社から購入）。カラムからの溶出液 を集め、ロータリーエバポレーターで乾固し、チャプリン（Ｃｈａｐｌｉｎ）　 （アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ）、第１２３巻、３３６頁（１９８２年））の方法に正確に従って １−０−メチルトリメチルシリルグリコシドに変換した。

得られた１−０−メチルトリメチルシリルグリコシドをＧＣ−ＭＳにより定量し 、ＧＣの保持時間および質量スペクトルに基づいて既知標準化合物を参照するこ とにより同定した。標準単糖の全イオン電流クロマトグラムを、添付図面の図４ に示し、標準単糖の買置スペクトルを、添付図面の図５から２３に示す。該抱合 物質をβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとともにインキュベーションした後回収した液 体上清についての全イオン電流クロマトグラムおよび質量スペクトルを、それぞ れ添付図面の図２４および２６から２９に示す。この情報がら、β−Ｄ−ガラク トシダーゼの作用により、該抱合物質から５１１ナノモルのガラクトース以外の 糖は遊離されなかったと結論できる。

（ｂ）オリゴ糖体に適用すべき配列決定因子を選択するための手段（該手段は論 理的単位を含む）について、上記（ａ）において得られた情報を用いて、上記（ ａ）で開示した処理後得られる抱合物質に適用すべきさらなる配列決定因子を選 択した。

か（して、プラスティック試験管中の抱合物質（上記（ａ）で開示のごとく処理 して得た）に、４８マイクロユニツトの精製β−Ｎ−アセチル−Ｄ−へキソサミ ニダーゼ酵素（ストレプトコツカメ　ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ ｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来）を含有する０、１Ｍカコジル酸ナトリウムか らなる溶液（ｐＨ６，０）１００μｍを添加して混合物を得た。該試験管にキャ ップをし、該混合物を３７℃で６時間インキュベーションした。０．１Ｍ塩化ナ トリウムで濯ぎ、遠心分離（１０００ｇ、１分）することにより抱合物質を分離 した。液体上清を抱合物質から分離し、集めた。この操作を繰り返し、すべての 液体上清を溜めておき、０．５ｍｌのダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）ＡＧ３Ｘ　４ Ａ　（ＯＨつ樹脂（上）および０．５ｍｌのダウエックスＡＧ５０Ｘ　１２（Ｈ つ樹脂（下）からなるカラムに通すことにより脱塩した（両樹脂ともバイオ・ラ ッド（Ｂｉｏ　ＲＡＤ）社から購入）。

カラムからの溶出液を集め、ロータリーエバポレーターで乾固し、チャプリン（ Ｃｈａｐｌｉｎ）　（アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃ ａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）。

第１２３巻、３３６頁（１９８２年））の方法に正確に従って１−０−メチルト リメチルシリルグリコシドに変換した。得られた１−０−メチルトリメチルシリ ルグリコシドをＧＣ−ＭＳにより定量し、ＧＣの保持時間および質量スペクトル に基づいて既知標準化合物を参照することにより同定した。標準単糖の全イオン 電流クロマトグラムを、添付図面の図４に示し、標準単糖の質量スペクトルを、 添付図面の図５から２３に示す。該抱合物質をβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−へキソサ ミニダーゼとともにインキュベーションした後回収した液体上清についての全イ オン電流クロマトグラムおよび質量スペクトルを、それぞれ添付図面の図３０お よび３１から３３に示す。この情報から、β−Ｎ−アセチル−Ｄ−へキソサミニ ダーゼの作用により、該抱合物質から４８７ナノモルのＮ−アセチルグルコサミ ン以外の糖は遊離されなかったと結論できる。

（Ｃ）オリゴ糖体に適用すべき配列決定因子を選択するための手段（該手段は論 理的単位を含む）について、上記（ｂ）において得られた情報を用いて、上記（ ｂ）で開示した処理後得られる抱合物質に適用すべきさらなる配列決定因子を選 択した。

かくして、プラスティック試験管中の抱合物質（上記（ｂ）開示のごとく処理し て得た）に、６ユニツトの精製α−マンノシダーゼ酵素（タチナタマメ由来）を 含有する０、１Ｍ酢酸ナトリウム１０．　ＯＬＭ酢酢酸跡らなる溶液（ｐＨ５， ０）１００μｌを添加して混合物を得た。該試験管にキヤ・ノブをし、該混合物 を３７℃で６時間インキユベーンコンした。０．１Ｍ塩化ナトリウムで濯ぎ、遠 心分離（１０００ｇ、１分）することにより抱合物質を分離した。液体上清を抱 合物質から分離し、集めた。この操作を繰り返し、すべての液体上清を溜めてお き、０゜５ｍｌのダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）ＡＧ３Ｘ　４Ａ（ＯＨ−）樹脂（ 上）および０．５ｍｌのダウエックスＡＧ５０Ｘ　１２（Ｈ”）樹脂（下）から なるカラムに通すことにより脱塩した（両樹脂ともバイオ・ラッド（Ｂｉｏ　Ｒ ＡＤ）社から購入）。カラムからの溶出液を集め、ロータリーエバポレーターで 乾固し、チャプリン（Ｃｈａｐｌｉｎ）　（アナリティカル・バイオケミストリ ー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）。

第１２３巻、３３６頁（１９８２年））の方法に正確に従って１−〇−メチルト リメチルシリルグリコシドに変換した。得られた１−０−メチルトリメチルシリ ルグリコシドをＧＣ−ＭＳにより定量し、ＧＣの保持時間および質量スペクトル に基づいて既知標準化合物を参照することにより同定した。標準単糖の全イオン 電流クロマトグラムを、添付図面の図４に示し、標準単糖の質量スペクトルを、 添付図面の図５から２３に示す。該抱合物質をα−Ｄ−マンノシダーゼとともに インキュベーションした後回収した液体上清についての全イオン電流クロマトグ ラムおよび質量スペクトルを、それぞれ添付図面の図３４および３５から３７に 示す。この情報から、α−Ｄ−マンノシダゼの作用により、該抱合物質から５２ ７ナノモルのマンノース以外の糖は遊離されなかったと結論できる。

（ｄ）オリゴ糖体に適用すべき配列決定因子を選択するための手段（該手段は論 理的単位を含む）について、上記（Ｃ）において得られた情報を用いて、上記（ Ｃ）で開示した処理後得られる抱合物質に適用すべきさらなる配列決定因子を選 択した。

かくして、プラスティック試験管中の抱合物質（上記（Ｃ）開示のごと（処理し て得た）に、０．３ユニツトの精製β−Ｄ−マンノシダーゼ酵素（カタツムリ由 来）を含有する０、１Ｍ酢酸ナトリウムからなる溶液（ｐＨ４，０）１００μｍ を添加して混合物を得た。該試験管にキャップをし、該混合物を３７℃で６時間 インキユベーンコンした。１１Ｍ塩化ナトリウムで濯ぎ、遠心分離（１０００ｇ 、１分）することにより抱合物質を分離した。液体上清を抱合物質から分離し、 集めた。この操作を繰り返し、すべての液体上清を溜めておき、０．５ｍｌのダ ウエックス（Ｄｏｖｅｘ）ＡＧ３Ｘ　４Ａ（ＯＨ−）樹脂（上）およびＱ、５ｍ ｌのダウエックスＡＧ５０Ｘ　１２　（Ｈつ樹脂（下）からなるカラムに通すこ とにより脱塩した（両樹脂ともバイオ・ラッド（Ｂｉｏ　ＲＡＤ）社から購入） 。カラムからの溶出液を集め、ロータリーエバポレーターで乾固し、チャプリン （Ｃｈａｐｌｉｎ）　（アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉ ｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ＋１ｉｓｔｒｙ）、第１２３巻、３３６頁（１９８２年） ）の方法に正確に従って１−〇−メチルトリメチルシリルグリコシドに変換した 。得られた１−０−メチルトリメチルシリルグリコシドをＧＣ−ＭＳにより定量 し、ＧＣの保持時間および質量スペクトルに基づいて既知標準化合物を参照する ことにより同定した。標準単糖の全イオン電流クロマトグラムを、添付図面の図 ４に示し、標準単糖の質量スペクトルを、添付図面の図５から２３に示す。該抱 合物質をβ−Ｄ−マンノシダーゼとともにインキュベーションした後回収した液 体上清についての全イオン電流クロマトグラムおよび質量スペクトルを、それぞ れ添付図面の図３４および３５から３７に示す。この情報から、β−Ｄ−マンノ ンダーゼの作用により、該抱合物質から２７１ナノモルのマンノース以外の糖は 遊離されなかったと結論できる。

（ｅ）オリゴ糖体に適用すべき配列決定因子を選択するための手段（該手段は論 理的単位を含む）について、上記（ｄ）において得られた情報を用いて、上記（ ｄ）で開示した処理後得られる抱合物質に適用すべきさらなる配列決定因子を選 択した。

かくして、プラスティック試験管中の抱合物質（上記（Ｃ）開示のごとく処理し て得た）に、２．５ユニツトの精製β−Ｎ−アセチル−Ｄ−へキソサミニダーゼ 酵素（タチナタマメ由来）を含有する０、１Ｍ酢酸ナトリウム／りん酸からなる 溶液（ｐＨ４，５）１００μｍを添加して混合物を得た。該試験管にキヤ・ノブ をし、該混合物を３７℃で６時間インキュベーションした。０．１Ｍ塩化ナトリ ウムで濯ぎ、遠心分離（１０００ｇ、１分）することにより抱合物質を分離した 。

液体上清を抱合物質から分離し、集めた。この操作を繰り返し、すべての液体上 清を溜めておき、０．５ｍｌのダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）ＡＧ３Ｘ　４Ａ（Ｏ Ｈ−）樹脂（上）および０．５ｍｌのダウエックスＡＧ５０Ｘ　１２　（Ｈつ樹 脂（下）からなるカラムに通すことにより脱塩した（両樹脂ともバイオ・ラッド （Ｂｉｏ　ＲＡＤ）社から購入）。カラムからの溶出液を集め、ロータリーエバ ポレーターで乾固し、チャプリン（Ｃｈａｐｌｉｎ）　（アナリティカル・バイ オケミストリー（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第１２３ 巻、３３６頁（１９８２年））の方法に正確に従って１−〇−メチルトリメチル シリルグリコシドに変換した。得られた１−０−メチルトリメチルシリルグリコ シドをＧＣ−ＭＳにより定量し、ＧＣの保持時間および質量スペクトルに基づい て既知標準化合物を参照することにより同定した。標準単糖の全イオン電流クロ マトグラムを、添付図面の図４に示し、標準単糖の質量スペクトルを、添付図面 の図５から２３に示す。該抱合物質をβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−へキソサミニダー ゼとともにインキュベーションした後回収した液体上清についての全イオン電流 クロマトグラムおよび質量スペクトルを、それぞれ添付図面の図３０および３１ から３３に示す。この情報から、β−Ｎ−アセチルＤ−へキソサミニダーゼの作 用により、該抱合物質から２ロアナノモルのＮ−アセチルグルコサミン以外の糖 は遊離されなかったと結論できる。

本実施例における上記開示で得られた情報および使用したエキソグリコシダーゼ のよく知られた特異性から、以下の順序および割合で該抱合物質から単糖が遊離 したことが明らかである。

Ｄ−ガラクトースβ１→４　：２残基 Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンβ１→２　：２残基マンノースα１→６．３　 ：２残基 マンノースβ１→４　：１残基 Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンβ１→４　：１残基樹脂に付いた出発オリゴ糖 に結合している単糖は、それがＯ−グリコンド結合により結合していないため、 エキソグリコンダーゼの作用を受けにくい。それゆえ、末端Ｎ−アセチルグルコ サミン（Ｇｌｃｎａｃ）が存在すると理解される。

この情報から、初めのオリゴ糖の配列は、添付図面の図２４記載ものだけである といえる。

この配列は、該オリゴ糖の溶液形態のＮＭＲＭ析と矛盾しない。

実施例２ 本実施例において、本発明の利用を示すために、添付図面の図３８記載の構造の オリゴ糖からなるオリゴ糖体を用いた。

該オリゴ糖について予備的分析を行い、以下の単糖単位を同定した。Ｇａｌ（２ 単位）、Ｇｌｃｎａｃ　（５単位）　、Ｍａｎ　（３単位）　、Ｆｕｃ　（１単 位）。

該オリゴ糖（０，６ｍｇ）を、実施例１に関して開示した担体に結合させて抱合 物質を得た。

オリゴ糖体に適用すべき配列決定因子を選択するための手段（該手段は論理的単 位を含む）について、該予備的分析の結果を用いて、候補構造を同定し、抱合物 質に適用すべき配列決定因子を選択した。

該抱合物質を、種々の配列決定因子（本実施例においてはエキソグリコシダーゼ 酵素）での連続的処理に付し、その分析結果に基づき、オリゴ糖体に適用すべき 配列決定因子を選択するための手段（該手段は論理的単位を含む）を用いて配列 決定因子を選択した。本実施例の方法は、実質的に実施例１に関して開示した方 法と実質的に同様である。

種々の配列決定因子（本実施例ではエキソグリコシダーゼ）を適用する順序およ び結果を表２に示す。

遊離した単糖の順序および割合は以下のごとし。

Ｄ−ガラクトースβ１→４　：２残基 Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミンβ１→２（Ｍａｎα１→３）　＝１残基Ｎ−ア セチルーＤ−へキソサミンβ１→２（Ｍａｎα１→６）　：１残基Ｎ−アセチル −Ｄ−ヘキソサミンβ１→４（Ｍａｎβ１→４）　：１残基Ｄ−マ／ノースα１ →６．３　１残基 Ｄ−マンノースβ１→４　：１残基 Ｌ−フコースα１→６　：１残基 Ｎ−アセチル−Ｄ−へキソサミンβ１→４　：１残基この情報から、初めのオリ ゴ糖の配列は、添付図面の図３８に示したものだけであるといえる。

夷９ 実施例３ 本実施例において、本発明の利用を示すために、添付図面の図３９に示した構造 のオリゴ糖からなるオリゴ糖体を用いた。

該オリゴ糖に対する予備的実験を行い、以下の単糖単位を同定した。Ｍａｎ（３ 単位）、Ｇｌｃｎａｃ　（３単位）。

該オリゴ糖（０，３ｍｇ）を実施例１に関して開示した担体に結合させて抱合物 質を得た。

オリゴ糖体に適用すべき配列決定因子を選択するための手段（該手段は論理的単 位を含む）について、該予備的分析の結果を用いて、候補構造を同定し、抱合物 質に適用すべき配列決定因子を選択した。

該抱合物質を、種々の配列決定因子（本実施例においてはエキソグリコシダーゼ 酵素）での連続的処理に付し、その分析結果に基づき、オリゴ糖体に適用すべき 配列決定因子を選択するための手段（該手段は論理的単位を含む）を用いて配列 決定因子を選択した。本実施例の方法は、実質的に実施例１に関して開示した方 法と実質的に同様である。

種々の配列決定因子（本実施例ではエキソグリコシダーゼ）を適用する順序およ び結果を表３に示す。

遊離した単糖の順序および割合は以下のごとし。

Ｄ−マンノースα１→３　：１残基 Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンβ１→２　：１残基Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコ サミンβ１→４　：１残基この情報から、初めのオリゴ糖の配列は、添付図面の 図３９に示したものだけであるといえる。

裏３ 実施例４ 本実施例において、本発明の利用を示すために、添付図面の図４０に示した構造 のオリゴ糖からなるオリゴ糖体を用いた。

該オリゴ糖に対する予脩的実験を行い、以下の単糖単位を同定した。ＮＡＮＡ（ シアル酸）（２単位）、Ｇａ１（２単位）　、Ｇｌ　ｃｎａｃ　（４単位）　、 Ｍａｎ（３単位）。

該オリゴ糖（０，４ｍｇ）を実施例１に関して開示した担体に結合させて抱合物 質を得た。

オリゴ糖体に適用すべき配列決定因子を選択するための手段（該手段は論理的単 位を含む）について、該予備的分析の結果を用いて、候補構造を同定し、抱合物 質に適用すべき配列決定因子を選択した。

該抱合物質を、種々の配列決定因子（本実施例においてはエキソグリコシダーゼ 酵素）での連続的処理に付し、分析結果に基づいて配列決定因子を選択し、モし てオリゴ糖体に適用すべき配列決定因子を選択するための手段（該手段は論理的 単位を含む）を用いる。本実施例の方法は、実質的に実施例１に関して開示した 方法と実質的に同様である。

種々の配列決定因子（本実施例ではエキソグリコシダーゼ）を適用する順序およ び結果を表４に示す。

遊離した単糖の順序および割合は以下のごとし。

Ｄ−ＮＡＮＡα２→６　・２残基 Ｄ−ガラクトースβ１→４　：２残基 Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンβ１→２　：２残基マンノースα１→６．３　 ：２残基 マンノースβ１→４　：１残基 Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンβ１→４　．１残基この情報から、初めのオリ ゴ糖の配列は、添付図面の図３９に示したものだけであるといえる。

表４ ＦＩＧ、　６ ＦＩＧ、　７ ＦＩＧ、　９ ＦＩＧ、１０ ＦＩＧ、　１１ 特表十６−５０７２４２　（１１） 強度　１７３ ＦＩＧ、２１ ＦＩＧ、　２２ ＦＩＧ、　２６ ＦＩＧ、　２７ ＦＩＧ、　２８ ＦＩＧ、３１ ＦＩＧ、３２ ＦＩＧ、３３ ＦＩＧ、３５ ＦＩＧ、３６ 国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、ＪＰ、　 ＵＳ

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．オリゴ糖体を担体に固定化することを特徴とするオリゴ糖の配列決定に用い るのに適した方法。
2. ２．オリゴ糖体を担体に固定化し、配列決定因子によりオリゴ糖から遊離される オリゴ糖体の構成要素について分析を行う請求項１記載の方法。
3. ３．オリゴ糖体がオリゴ糖、あるいはオリゴ糖の生成物、またはオリゴ糖部分を 有する種である請求項１または請求項２記載の方法。
4. ４．担体にオリゴ糖体を固定化する段階を包含する請求項１ないし３のいずれか １に記載の方法。
5. ５．担体に固定化されたオリゴ糖体に配列決定因子または配列決定因子の組み合 わせを適用することを包含する前記請求項のいずれか１に記載の方法。
6. ６．担体に固定化されたオリゴ糖体に配列決定因子を適用することおよび該オリ ゴ糖体に該配列決定因子を適用することにより得られる生成物を分析することを 包含する前記請求項のいずれか１に記載の方法。
7. ７．担体に固定化されたオリゴ糖体に配列決定因子を適用すること、該配列決定 因子を該オリゴ糖体に適用することにより得られる生成物を分析すること、およ びさらなる配列決定因子をオリゴ糖体またはその生成物に適用することを包含す る前記請求項のいずれか１に記載の方法。
8. ８．繰り返し方法を用いて、それにより分析のサイクル、配列決定因子または配 列決定因子の組み合わせの適用、および引き続いての分析を繰り返す前記請求項 のいずれか１に記載の方法。
9. ９．該オリゴ糖を固定化し、配列決定に付す請求項１ないし８のいずれか１に記 載の方法。
10. １０．オリゴ糖を固定化し、抱合体に結合させたまま配列決定に付す請求項１な いし７のいずれか１に記載の方法。
11. １１．オリゴ糖体がオリゴ糖部分を有する種であって、該種が糖蛋白または糖脂 質である請求項１ないし７のいずれか１に記載の方法。
12. １２．オリゴ糖体を化学結合により担体に固定化する前記請求項のいずれか１に 記載の方法。
13. １３．オリゴ糖体がオリゴ糖またはその生成物であって、該オリゴ糖またはその 生成物を直接共有結合あるいは直接非共有結合により担体に固定化する前記請求 項のいずれか１に記載の方法。
14. １４．オリゴ糖またはその生成物を、抱合体を介して担体に間接的に結合させる 請求項１０ないし１２のいずれか１に記載の方法。
15. １５．該担体が１，１′カルボニルジイミダゾール活性化アガロースからなる固 体担体である前記請求項のいずれか１に記載の方法。
16. １６．配列決定因子が物理的因子または化学的因子である前記請求項のいずれか １に記載の方法。
17. １７．該物理的因子がブロトンｎ．ｍ．ｒ．、炭素−１３ｎ．ｍ．ｒ．または質 量スペクトル分析である請求項１６記載の方法。
18. １８．該配列決定因子が化学結合を開裂することができるかまたは化学結合を形 成することができる請求項１ないし１６のいずれか１に記載の方法。
19. １９．該配列決定因子が化学試薬である請求項１ないし１６または請求項１８の いずれか１に記載の方法。
20. ２０．該配列決定因子が過ヨウ素酸である請求項１９記載の方法。
21. ２１．該配列決定因子が酵素である請求項１９記載の方法。
22. ２２．該酸素がエキソグリコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼである請求項 ２１記載の方法。
23. ２３．該酸素がアフリカマイマイ（ａｃｈａｔｉｎａ　ｆｕｌｉｃａ）のβ−マ ンノシダーゼ、アスペルギルス・サイトイ（Ａ．ｓａｉｔｏｉ）のα−マンノシ ダーゼ、タチナタマメ（ｊａｃｋｂｅａｎ）のα−マンノシダーゼ、ウシ・精巣 のβ−ガラクトシダーゼ、タチナタマメのβ−ガラクトシダーゼ、シー・ラムパ ス（Ｃ．ｌａｍｐａｓ）のβ−キシロシダーゼ、ストレプトコッカス・ニューモ ニアエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍ）のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、タチナタマ メのβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、ウシ・精巣上体のα−フコシダーゼ ・シー・ラムパスのα−フコシダーゼ、コーヒー豆のα−ガラクトシダーゼまた はアーモンドのα−フコシダーゼである請求項２２記載の方法。
24. ２４．該配列決定因子がオリゴ糖に対して特異的変換をすることのできる配列決 定因子である請求項１６、１８、２０または２１ないし２３のいずれか１に記載 の方法。
25. ２５．固定化されたオリゴ糖体を含むオリゴ糖体の配列決定に用いるのに適した 装置。
26. ２６．固定化されたオリゴ糖体および配列決定因子によりオリゴ糖体から遊離さ れたオリゴ糖体の構成要素を分析するための手段を包含する請求項２５記載の装 置。
27. ２７．オリゴ糖体を固定化しうる担体を包含するオリゴ糖の配列決定に用いるの に適した装置。