JP6602747B2 - 同位体標識されたグリカンの合成および使用 - Google Patents
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Description
オリゴ糖のコア構造を同位体標識されたアシル化剤でアシル化して、同位体標識されたオリゴ糖のコア構造を得る工程であり、ここでオリゴ糖のコア構造は、場合により1つまたはそれより多くの保護基で保護されている、工程;および
得られた同位体標識されたオリゴ糖を酵素により誘導体化して、同位体標識されたグリカンを得る工程
を含む、上記方法を提供する。
− 伸長:オリゴ糖へのさらなる糖単位の添加であり、典型的には、グリコシルトランスフェラーゼを使用した好適な糖ドナーとの縮合反応を介する。伸長は、オリゴ糖の末端で、または中間の糖単位に対して起こすことができる。
GlcN、GalN、ManN、FruN、FucN、Mur、またはNeu
から選択され;
第二の単糖単位は、
Glc、Gal、Man、Rha、Fru、Fuc、GlcN、GalN、ManN、FruN、FucN、Mur、Neu、GlcNAc、GalNAc、ManNAc、FruNAc、FucNAc、MurNAc、NeuNAc、シアル酸、またはイノシトール
から選択される。
第一の単糖−第二の単糖
である。
第二の単糖−第一の単糖
である。
GlcN−GlcN
Gal−GalN
GalN−GlcN
から選択されるモチーフを含むオリゴ糖を、同位体標識されたアシル化剤と反応させることを含む。還元および/または非還元末端にさらなる単糖単位が存在していてもよい。
Man−GlcN−GlcN
を含むオリゴ糖を、同位体標識されたアシル化剤と反応させることを含む。還元および/または非還元末端にさらなる単糖単位が存在していてもよい。
Man−GlcN−GlcN
を含むオリゴ糖を、同位体標識されたアセチル化剤と反応させて、モチーフ:
Man−GlcNAc*−GlcNAc*
を含むオリゴ糖を得ることを含み、式中、Ac*は、同位体標識されたアセチル基である。
各R1は、独立して、Hまたは保護基であり;
R2は、独立して、Hまたは保護基であり;
各R3は、独立して、H、保護基、または(Sac)mであり、ここで各Sacは単糖単位であり、mは1〜50の数値である。
各R1は、独立して、Hまたは保護基であり;
R2は、独立して、Hまたは保護基であり;
各R3は、独立して、H、保護基、または(Sac)mであり、ここで各Sacは単糖単位であり、mは1〜50の数値である。
式(I):
のオリゴ糖を、一般式(II):
(Sac)n−Sac−LG(II)
[式中、各Sacは単糖単位であり、nは、0〜50の数値であり、−LGは、好適な脱離基でプライミングしたドナー−糖のグリコシル化されていないアノマー位を表す]
の糖ドナーでグリコシル化して、式(III):
P4を除去して、ヒドロキシル基を露出させ、結果得られたヒドロキシル基を一般式(II)の糖ドナーでグリコシル化すること;
各P3基を除去して、遊離のアミノ基を露出させ、得られた遊離のアミノ基それぞれを同位体標識されたアセチル化剤でアセチル化すること
を含む。
Man−GlcNAc*−GlcNAc*
であり、式中、各Ac*は、同位体標識されている。
(i)1種またはそれより多くの同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準を選択すること;
(ii)タグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること;
(iii)ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析して、イオンのピークを得ること;
(iv)タグ付けされた標準に関連するイオンのピークの同一性および強度を、ドープしたサンプルのスペクトル中の追加のイオンのピークと比較すること
を含む。
(i)グリカンを含有する疑いのあるサンプルを得ること;
(ii)疾患に関連するグリカンに対応する同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準を選択すること;
(iii)タグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること;
(iv)ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析して、イオンのピークを得ること;
(v)タグ付けされた標準に関連するイオンのピークの同一性および強度を、ドープしたサンプルのスペクトル中の追加のイオンのピークと比較すること;
(vi)前記グリカンの存在を使用して、疾患または障害の診断を補助すること
を含む、上記方法を提供する。
(i)疾患または障害に関連するグリカンを含有する疑いのあるサンプルを患者から得ること;
(ii)疾患または障害に関連するグリカンに対応する同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準を選択すること;
(iii)タグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること;
(iv)ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析して、イオンのピークを得ること;
(v)タグ付けされた標準に関連するイオンのピークの同一性および強度を、ドープしたサンプルのスペクトル中の追加のイオンのピークと比較して、サンプル中の1種またはそれより多くのグリカンの存在を同定し、場合により定量化すること;
(vi)前記1種またはそれより多くのグリカンの存在を使用して、疾患または障害を診断すること
を含む、上記グリカンを提供する。
(i)疾患または障害に関連するグリカンに対応する同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準を選択すること;
(iii)タグ付けされた標準を患者から得られたサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること;
(iv)ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析して、イオンのピークを得ること;
(v)タグ付けされた標準に関連するイオンのピークの同一性および強度を、ドープしたサンプルのスペクトル中の追加のイオンのピークと比較して、サンプル中の1種またはそれより多くのグリカンの存在を同定し、場合により定量化すること;
(vi)前記1種またはそれより多くのグリカンの存在を使用して、疾患または障害を診断すること
を含む、上記グリカンを提供する。
(a)1種またはそれより多くの同位体標識されたグリカンを含む、タグ付けされた標準;(b)グリカンを含有する疑いのあるサンプルをタグ付けされた標準でドープして、ドープしたサンプルを得て、ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析するための説明書
を含む、上記キットを提供する。
同位体標識
同位体標識すること、同位体標識された、および他の類似の用語は、本明細書で使用される場合、当業界において認識されている通りに使用される。具体的には、同位体標識化合物は、既知の位置の少なくとも1つの原子が、その元素に関して最も豊富な天然に存在する同位体以外の同位体で高度に置き換えられた化合物である。例えば、メタンは、13Cで同位体標識されてもよいし、構造13CH4を有していてもよいし、または重水素で標識されていてもよい。重水素標識メタンは、メタンに結合する4つの水素原子の位置の1つまたはそれより多くが2H(D)で高度に置き換えられた化合物を指す場合もある。一般的な重水素標識メタンの構造としては、CDH3およびCD4が挙げられる。
本明細書で使用される場合、アシル基は、カルボン酸からヒドロキシル基を除去することによって誘導された官能基である。一般的なアシル基としては、ホルミル(メタノイル)、アセチル(エタノイル)、プロピオニル(プロパノイル)、ベンゾイル、およびアクリリル(プロペノイル)が挙げられる。生物学的関連性を有する他のアシル基としては、これらに限定されないが、C4〜18−脂肪酸から誘導されたヒドロキシエタノイル(グリコリル)およびアシル基(例えば、ブタノイル、ヘキサノイル、オクタノイル、デカノイルなど)ならびにヒドロキシル化された脂肪酸が挙げられる。
好ましい同位体標識されたアセチル基Ac*としては、以下が挙げられる:
−(13C=O)13CH3、−(C=O)13CH3、−(13C=O)CH3、
−(C=O)CD3、−(13C=O)13CD3、−(C=O)13CD3、−(13C=O)CD3,
−(14C=O)14CH3、−(C=O)14CH3、−(14C=O)CH3、
−(C=17O)CH3、または−(C=18O)CH3。
保護基は、本明細書で使用される場合、後続の反応中において化学選択性を得るために、または後続の反応中において不要な分解または副反応を防ぐために、官能基の化学修飾によって分子に導入される部分を指す。また保護基は、マスク基もしくはマスキング基、またはブロック基もしくはブロッキング基と称される場合もある。反応性官能基を保護することによって、他の保護されていない反応性官能基が関与する反応を、保護基に影響を及ぼすことなく行うことができる。通常は、分子の残部に実質的に影響を及ぼすことなく、後続の工程で保護基を除去することができる。例えば、「Protective Groups in Organic Synthesis」(T. GreenおよびP. Wuts、Wiley、1999)を参照されたい。
本発明に係る方法および本発明によって提供される同位体標識されたグリカンは、サンプル中の対象の分析物、例えば天然グリカンの濃度を決定するのに使用できる。好適なサンプルは、タンパク質、天然の複合糖質、および組換えタンパク質生産の生成物から放出されたグリカンを包含していてもよい。
lj * 「重い」アイソトポログjのピーク強度
mi 「軽い」アイソトポログiの量
mj * 「重い」アイソトポログjの量
mT サンプル中の「軽い」グリカンの総量
mT * サンプル中の「重い」グリカンの総量
Xi 非同位体分析物であるグリカン中の「軽い」アイソトポログiの相対的な存在度
Xj * 同位体標識されたグリカン中の「重い」アイソトポログjの相対的な存在度。
サンプルに添加された所与のグリカンに関する「重い」アイソトポログの総量(mT *)とその成分である「重い」アイソトポログそれぞれの対応する相対的な存在度(Xj *)とを知ることで、方程式3を使用してサンプル中の各「重い」アイソトポログ(mj *)の量を計算することが可能になる。これは、異なる合成の「重い」アイソトポログが、例えば、異なって同位体標識されたアセチル基、および/または所与の「重い」グリカンの同位体エンベロープに関連する様々なピークを有することの説明になり得る。好適には、同位体エンベロープに関連する様々なピークが使用される。これらの同位体エンベロープのピークの理論上の存在度は、分子の実験式を考慮した確率として計算された公知の様々な同位体の天然の存在度から誘導することができる。
[方程式5]:I=bm+a
式中、係数bおよびaはそれぞれ傾きおよび切片に対応し、これらは、最小二乗適合(方程式6および7)によって計算された。
説明したように、一次関数は、タグ付けされた標準である「重い」グリカンのアイソトポログ混合物の既知の特性を使用して得ることができる。これらの「重い」グリカンは、これまでに確立された直線範囲内で、好適な最小のシグナル対ノイズ比、例えば5より高いシグナル対ノイズ比でピーク強度を示すと予想される。
(i)各「重い」アイソトポログに関連するイオンのピークの相対的な強度(Ij *)を、そのグリカンの標準中の既知の存在度(mj *)と関連付けて、mjの一次関数としてIjを得る工程;
(ii)場合により、前記関連付けに関する決定係数R2を計算して、R2値が事前に決定された値より高い場合、最も豊富なイオンのピークを除外する工程;
(iii)場合により、工程(ii)を1回またはそれより多く繰り返す工程;
(iv)前記関数を使用して、分析物であるグリカンの「軽い」アイソトポログの量を計算する工程;
(v)場合により、分析物であるグリカンの「軽い」アイソトポログの総量を使用して、存在する分析物であるグリカンの総量を決定する工程
を包含する。
(a)各「重い」アイソトポログに関連するイオンのピークの相対的な強度(Ij *)を、そのアイソトポログの標準中の既知の存在度(mj *)と関連付けて、mjの一次関数としてIjを得る工程;
(b)場合により、前記関連付けに関する決定係数R2を計算して、R2値が事前に決定された値より高い場合、最も豊富なイオンのピークを除外する工程;
(c)場合により、工程(ii)を1回またはそれより多く繰り返す工程;
(d)前記関数を使用して、分析物サンプル中の分析物である「軽い」アイソトポログの量を計算する工程;
(v)場合により、「軽い」アイソトポログの総量を使用して、存在する分析物であるグリカンの総量を決定する工程
を包含していてもよい。
マススペクトロメトリー実験における分子のフラグメントイオンの生成および分析は、構造的な決定において極めて有用である。このようなフラグメントイオンの生成および検出に関する様々な技術は当業界において公知であり、その例としては、これらに限定されないが、衝突誘起解離(CID)およびタンデムマススペクトロメトリー(またMS/MSやMS2のように様々に称される)が挙げられる。これらのフラグメントの分析および定量化は、部分的または完全な構造決定を助けることができ、概念上同じ分子量を有する他の分子の存在下で所与の分子を検出する場合に特に有用である可能性がある。本発明の分野の状況において、フラグメント分析を使用して、分析物中のより弱い結合である連結を同定して、同重体構造間で区別することも可能である。
糖類の略語は、本明細書で使用される場合、当業界で一般的に理解されているのと同様にして使用される。接尾辞「N」は、対応するアミノ糖を提示し、一方で「NAc」は、対応するN−アセチルアミノ糖を提示する。
Glc − グルコース
Gal − ガラクトース
Man − マンノース
Rha − ラムノース
Fru − フルクトース
Fuc − フコース
Mur − ムラミン酸
Neu − ノイラミン酸
Kdo − ケトデオキシオクツロソネート(keto-deoxyoctulosonate)。
グリカンという用語は、遊離の形態の、または糖タンパク質、プロテオグリカンもしくはグリコリピドなどの複合糖質分子の炭水化物部分を形成するあらゆる糖類(モノ−、オリゴ−またはポリ−)を指すのに使用できる。グリカンは、実質的に全ての生物学的構造およびプロセスに関与する重要な分子である。成分としての単糖は、核酸またはアミノ酸よりかなり大きい組合せの多様性をもたらし、グリカンの共有結合を改変することによりさらなる多様性がもたらされる。したがって、所与の生物のグリカンの総レパートリー(グライコーム)は、ゲノムまたはプロテオームよりもかなり複雑で動的である。
グリカンの特異的な生物学的な役割の多くは、グリカン結合タンパク質(GBP)による認識によって媒介される。GBPは、レクチン、グリコサミノグリカン結合タンパク質およびグリカン特異的抗体を包含する。レクチンは、炭水化物認識ドメインを介してグリカン鎖の末端領域に結合することが多い。低い親和性の結合のために、多価CRD−グリカン相互作用が、生物学的関連性との相互作用に必要であることが多い。
グリカンは、主として、単糖部分をグリカン鎖に組み立てるグリコシルトランスフェラーゼ酵素によって合成される。グリコシルトランスフェラーゼ酵素は、共通して、単純なヌクレオチド糖ドナー(例えば、UDP−Gal、GDP−FucまたはCMP−Sia)の単糖をアクセプター基質に転移させることを触媒できるという特性を有する。
微生物資源および改善された哺乳動物酵素生産の調査における進歩のため、グリカン合成のための効率的なツールとしてのグリコシルトランスフェラーゼの使用が確立された(Blixt、2006;Ruiz、2001;Serna、2010、Zou、2011)。部位および立体特異的トランスフェラーゼ酵素と糖ドナーのビルディングブロックとの適切な配列を使用すれば、逐次的な酵素による伸長によって複雑なグリカン構造を組み立てることができる。同様に、例えば、二分岐した七糖1813C8G0(Bn5)から誘導された非対称な同位体標識されたグリカン標準の調製を容易にするために、最初にコアモチーフをトランケートすることが望ましい場合がある。このトランケーションは、酵素加水分解によって達成することができる。
本発明のいくつかの実施態様において、合成方法は、オリゴ糖中のアセチル−ヘキソサミン単位の遊離のアノマー位でオキサゾリンを形成する工程をさらに含む。
グリカンの生合成は、グリコシルトランスフェラーゼを含む多数の高度に競合的なプロセスに頼っている。結果として、グリコシル化は生化学的環境の性質に高度な感受性を有し、グリコシル化およびグリコシル化の変化は、多くの疾患および障害と関係するとされてきた。したがって、いくつかの形態において、本発明は、いわゆるグリカンマーカー(疾患または障害に関連することが公知の特定のグリカン構造)をうまく同定するための方法を対象とする。いくつかの実施態様において、本発明は、複雑な混合物中の単一のグリカンマーカーの同定および定量化を提供しているが、他の実施態様において、一回の実験で、1種またはそれより多くの疾患または障害に関連する多数のグリカンマーカーを同定して定量化することができる。
がん;
心臓血管疾患、例えば卒中、心筋梗塞、血液量減少性の卒中、アテローム性動脈硬化症;
炎症性の皮膚疾患;
糖尿病;
胃腸障害、例えば潰瘍性大腸炎;
肝臓障害および疾患;
貧血;
免疫疾患および障害、例えば、ウィスコット・アルドリッチ症候群;
自己免疫疾患;
関節リウマチなどの関節炎;
感染症;
腎症;
神経障害、例えばアルツハイマー病;
肺障害;および
グリコシル化の先天性障害。
以下の合成は、図3に示される対応する化学物質の構造に対して番号付けされている。
乾燥DCM中の、分子篩を含むベンジルアルコール(54μL、0.525mmol、1.5当量)および1(250mg、0.350mmol、Serna S.、Kardak B.、Reichardt N.、Martin-Lomas M.、Tetrahedron Asymmetry、2009、20、851〜856に従って合成された)の溶液を室温で45分間攪拌した。混合物を0℃に冷却し、TMSOTf(6μL、0.035mmol、0.1当量)を添加した。1時間後、反応液をトリエチルアミンでクエンチし、セライトのプラグを通過させてろ過し、濃縮した。未精製の残留物を、9:1のヘキサン:EtOAcでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、表題の化合物を得た(198mg、90%)。
2:1のMeOH:CH2Cl2(6mL)中の2(608mg、0.978mmol)の溶液に、0.25MのNaOMe(300μL、20%)を添加した。1時間攪拌した後、酸性イオン交換樹脂をpH7になるまで添加した。溶液をろ過し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題の化合物を得た(430mg、76%)。
乾燥CH2Cl2中の、3Åの分子篩を含む1(400mg、0.69mmol)および4(905mg、0.83mmol、1.2当量、Serna S.、Kardak B.、Reichardt N.、Martin-Lomas M.、Tetrahedron Asymmetry、2009、20、851〜856に従って合成された)の溶液を室温で1時間攪拌した。この混合物に、TMSOTf(12μL、0.07mmol、10%)を室温で添加し、TLCが出発原料の完全な変換を示すまで(1時間)反応液を攪拌した。反応液をトリエチルアミン(20μL)の添加によってクエンチし、セライトのプラグを通過させてろ過し、濃縮した。未精製の残留物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、表題の化合物を得た(750mg、73%)。
4:1のCH2Cl2:MeOH(1.2mL)中の5(300mg、0.202mmol)の溶液に、DDQ(138mg、0.606mmol、3当量)を添加した。2時間後、混合物をEtOAcで希釈し、飽和NaHCO3、水およびブラインで洗浄した。溶液を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題の化合物を得た(176mg、65%)。
乾燥CH2Cl2中の、分子篩を含む6(100mg、0.074mmol)および7(80mg、0.089mmol、1.2当量、Unverzagt, C.; Eller, S.;Mezzato, S.; Schuberth, R. Chem. Eur. J.2007、14、1304〜1311に従って合成された)の溶液を室温で1時間攪拌した。この混合物に、TMSOTf(1.6μL、0.007mmol、10%)を添加し、TLCが出発原料の完全な変換を示すまで(1時間)攪拌した。反応液をトリエチルアミン(20μL)の添加によってクエンチし、セライトのプラグを通過させてろ過し、ろ液を濃縮した。未精製の残留物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題の化合物を得た(116mg、76%)。
CH2Cl2(1mL)中の8(100mg、0.046mmol)の溶液に、0℃で、エタンチオール(17μL、0.244mmol、5当量)および三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート(1μL、20%)を添加した。2時間後、トリエチルアミンを添加した。混合物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製して(ヘキサン:EtOAc、3:1)、表題の化合物を得た(75mg、83%)。
乾燥CH2Cl2(6mL)中の、分子篩を含む9(45mg、0.023mmol)および10(30mg、0.034mmol、1.2当量、Unverzagt, C.; Eller, S.; Mezzato, S.; Schuberth, R. Chem. Eur. J.2007、14、1304〜1311に従って合成された)の溶液を室温で1時間攪拌した。この混合物を−40℃に冷却し、TMSOTf(1μL、0.007mmol、25%)を添加し、反応液をこの温度でTLCが出発原料の完全な変換を示すまで(1時間)攪拌した。反応液をトリエチルアミン(5μL)の添加によってクエンチし、セライトのプラグを通過させてろ過し、濃縮した。未精製の残留物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、分取用プレートにより表題の化合物を得た(45mg、74%)。
2:1のMeOH:CH2Cl2中の七糖11(32mg、12μmol)の溶液に、NaOMe(30μL、0.5M、1.25当量)を添加した。室温で1時間攪拌した後、MeOH(400μL)およびエチレンジアミン(300μL)を添加し、混合物を、マイクロ波により120℃で30分間の3サイクルで加熱した。混合物を、トルエンおよびエタノールを使用して乾燥するまで濃縮した。未精製の残留物をセファデックス(Sephadex)LH−2カラム(2:1のMeOH:DCM)で精製し、表題の化合物を得た(17mg、83%)。
乾燥MeOH(2mL)中の七糖12(100mg、62.5μmol)の溶液に、0℃で、無水酢酸13C4(42μL、444μmol)および0.5MのNaOMe(0.8mL)を添加した。0oCで2時間後、混合物を濃縮し、HPLCセファデックス(Sepadex)LH−20(MeOH)によって精製し、表題の化合物を得た(80mg、72%)。
七糖13(13mg、7.3μmol)を1mLのMeOH中に溶解させ、10%Pd/Cカートリッジおよび溶媒としてMeOHを使用して、1mL/分の流速、50℃で、十分な水素条件を使用して水添器を通過させた。結果得られた混合物を濃縮し、水中に再溶解させ、グラファイトカートリッジで精製し、表題の化合物を得た(7mg、72%)。
以下の合成は、図4に示される対応する化学物質の構造に対して番号付けされている。
乾燥DCM(2mL)中の、分子篩を含むアクセプター7(0.18g、0.13mmol)およびドナー17(0.21g、0.16mmol、1.2当量)の溶液を室温で1時間攪拌した。TMSOTf(2μL、13μmol、10%)を添加し、反応液を室温で1時間攪拌した。反応液を、Et3N(25μL)の添加によってクエンチし、セライトのプラグを通過させてろ過し、ろ液を濃縮した。未精製の残留物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー(2:3のヘキサン:EtOAc)によって精製し、表題の化合物を得た(0.27g、82%)。[α]20 D: - 24.0 (c 1.05, CH3Cl)。1H NMR (500 MHz, CDCl3): 7.90-7.65 (m, 17H, H-芳香族), 7.54 (m, 2H, H-芳香族), 7.42-7.26 (m, 13H, H-芳香族), 7.06-6.96 (m, 11H, H-芳香族), 6.79 (m, 3H, H-芳香族), 5.76 (dd, J =9.0, 10.7Hz, 1H, H-3E’), 5.44 (m, 3H, H-1E’, H-3E, CHPh), 5.27 (d, J =7.8Hz, 1H, H-1A), 5.18 (m, 2H, H-2C, H-4E’), 4.96 (d, J = 8.5Hz, 1H, H-1B), 4.83 (m, 6H, H-4E, 2xCH2 Bn, H-3D, H-1D, H-1E), 4.71, 4.65 (d, J =12.0Hz, 1H, CH2Bn), 4.52 (m, 4H, H-1C, 3xCH2 Bn), 4.39 (m, 3H, 3xCH2 Bn), 4.29-4.07 (m, 13H, H-2E’, 2xH-6E’, H-2A, H-2B, H-3A, H-3B, H-4A, H-4B, H-6Ca, H-5E’, H-2E, H-6Da), 3.98 (m, 3H, H-5D, H-6Ea, H-2D), 3.82 (t, J =10.3Hz, 1H, H-4D), 3.73 (t, J =8.5Hz, 1H, H-4C), 3.75-3.39 (m, 8H, 2xH-6A, H-6Eb, 2xH-6B, H-3C, H-6Cb, H-6Db), 3.32 (m, 1H, H-5B), 3.19 (m, 1H, H-5A), 2.99 (m, 1H, H-5C), 2.26, 2.12 (s, 3H, CH3 Ac), 2.08 (m, 1H, H-5E), 2.04, 2.03, 2.02, 1.84, 1.83, 1.72, 1.54 (s, 3H, CH3 Ac)。13C NMR (126 MHz, CDCl3): 170.8, 170.5, 170.4, 170.2, 170.1, 170.0, 169.5, 169.2, 167.3 138.7, 138.6, 138.4, 137.8, 137.3, 137.2 , 134.3, 134.0, 133.5, 131.7, 131.4, 128.9, 128.7, 128.5, 128.2, 128.1, 127.0, 127.7, 127.6, 127.5, 127.4, 127.2, 126.9, 126.8, 123.8, 123.4, 102.3, 98.1 (C-1C), 97.6 (C-1D), 97.1 (C-1A, C-1B), 95.8 (C-1E), 94.8 (C-1E’), 78.8, 77.8, 76.6, 75.9, 75.1, 74.5, 74.3, 74.2, 73.3, 72.8, 72.7, 71.8, 71.0, 70.8, 70.5, 70.4, 68.6, 68.5, 68.4, 68.1, 67.4, 66.0, 63.6, 61.6, 61.1, 56.5, 55.7, 54.8, 54.0, 20.9, 20.7, 20.6, 20.4, 20.2。
EtSH(31μL、0.25mmol、5当量)およびBF3・OEt2(2μL、10μmol、20%)を、0℃で、DCM(2mL)中の六糖18(0.14g、0.05mmol)の溶液に添加した。反応混合物を、室温で変換が完了するまで(2時間)攪拌した。次いで、これをEt3Nでクエンチし、濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し(1:3のヘキサン:EtOAc)、表題の化合物を得た(0.12g、88%)。
乾燥DCM(9.8mL)中の、アクセプター19(75mg、0.03mmol)、ドナー11(41mg、0.05mmol、1.5当量、Unverzagt, C.;Eller, S.; Mezzato, S.; Schuberth, R. Chem. Eur. J.2007、14、1304〜1311に従って合成した)および分子篩の懸濁液を室温で1時間攪拌した。混合物を−40℃に冷却し、TfOH(1μL、0.01μmol、33%)を添加した。反応混合物を−40℃でドナーがなくなるまで(1時間)攪拌した。次いで、反応液をEt3Nでクエンチし、セライトのプラグでろ過し、濃縮した。残留物を、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、表題の化合物を得た(60mg、62%)。
2:1のMeOH:DCM(300:150μL)中の化合物20(43mg、14.1μmol)の溶液に、NaOMe(42μL、21.2μL、1.5当量)を添加した。室温で1時間攪拌した後、MeOH(300μL)およびエチレンジアミン(300μL)を添加し、混合物を、マイクロ波により120℃で30分の3サイクルで加熱した。混合物を、トルエンおよびエタノールを使用して乾燥するまで濃縮した。未精製の残留物を、セファデックスLH−20カラム(MeOH)によって精製し、化合物21を得た。化合物21を0℃でMeOH(200μL)中に溶解させ、無水酢酸13C4を添加した。2時間後、EtOHを添加し、混合物を濃縮し、セファデックスLH−20カラム(MeOH)によって精製し、表題の化合物を得た(11mg、40%、2工程)。
[β−D−ガラクトピラノシル−(1→4)−2−アセトアミド−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシル−(1→2)−α−D−マンノピラノシル)−(1→6)]−[β−D−ガラクトピラノシル−(1→4)−2−アセトアミド−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシル−(1→2)−α−D−マンノピラノシル−(1→3)]−β−D−マンノピラノシル−(1→4)−2−アセトアミド−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシル−(1→4)−2−アセトアミド−2−デオキシ−α,β−D−グルコピラノース(15)
770μLのHepes緩衝液(50mM、pH=7.4)中の、14(2.126mg、1.6μmol)、ウリジン5’−ジホスホ−α−D−ガラクトース二ナトリウム塩UDP−Gal(2.280mg、3.74μmol、2.4当量)、ウシ血清アルブミンBSA(1mg)、200mUの牛乳のβ−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ2.4.4.22、9.2Uのアルカリホスファターゼ3.1.3.1、およびMnCl2(10mM)の溶液(1mL)を37℃で18時間インキュベートした。結果得られた混合物を95℃で5分間加熱して、酵素を沈殿させた。遠心分離後、グラファイトカートリッジによって上清を精製し、表題の化合物を得た(2.09、78%)。
770μLのMES緩衝液(80mM、pH=6.5)中の、14(3.030、mg、2.28μmol)、グアノシン5’−ジホスホ−β−L−フコース二ナトリウム塩GDP−Fuc(1.760mg、2.77μmol、1.2当量)、ウシ血清アルブミンBSA(1mg)、コアのα−1,6−フコシルトランスフェラーゼ(50μL、0.66mg/mL)およびMnCl2(20mM)の溶液(1mL)を室温で18時間インキュベートした。結果得られた混合物を95℃で5分間加熱して、酵素を沈殿させた。遠心分離後、グラファイトカートリッジによって上清を精製し、表題の化合物を得た(2.73mg、82%)。
450μLのHepes緩衝液(50mM、pH=7.4)中の、16(1.836mg、1.6μmol)、ウリジン5’−ジホスホ−α−D−ガラクトース二ナトリウム塩UDP−Gal(2.210mg、3.62μmol、2.9当量)、ウシ血清アルブミンBSA(1mg)、200mUの牛乳のβ−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ2.4.4.22、9.2Uのアルカリホスファターゼ3.1.3.1、およびMnCl2(10mM)の溶液(0.5mL)を37℃で18時間インキュベートした。結果得られた混合物を95℃で5分間加熱して、酵素を沈殿させた。遠心分離後、グラファイトカートリッジによって上清を精製して、表題の化合物を得た(1.80mg、80%)。
13C8−G0(Bn5)のガラクトシル化
部分的に脱保護された13C8−G0(Bn5)標準13(1.1mg)を、2mMのMnCl2とBSAとを含有する50mMのHEPES緩衝液(pH7.4)中の、β−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ(200mU)およびウリジン二リン酸ガラクトース(UDP−Gal、1.25当量)で処置した。37℃で1時間反応させた後、95℃で5分間加熱することによってタンパク質画分を沈殿させ、ろ過によって除去した。この溶液をUPLC−MSによって直接分析したところ、それぞれ13C8−G16(Bn5)および13C8−G13(Bn5)への23%および26%の変換が示された。この反応は、アクセプターとして10mgの13C8−G0(Bn5)を使用するスケールに高めることができた。
化合物13C8−G16(1.1mg)を、2mMのMgCl2を含有する50mMのMES緩衝液(pH6.5)中の、コアのα−1,6−フコシルトランスフェラーゼおよびグアノシン二リン酸フコース(GDP−Fuc、1.10当量)で処置した。30℃で18時間反応させた後、95℃で5分間加熱することによってタンパク質画分を沈殿させ、ろ過して除いた。グリカン13C8−G16Fを黒鉛化炭素カートリッジで精製した。
部分的に脱保護された13C8−G0(Bn5)標準(20μg)を、2mMのMnCl2とBSAとを含有する50mMのHEPES緩衝液(pH7.4)中の、β−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ(200mU)およびウリジン二リン酸ガラクトース(UDP−Gal、6.0当量)で処置した。37℃で1時間反応させた後、95℃で5分間加熱することによってタンパク質画分を沈殿させ、ろ過して除いた。この溶液をUPLC−MSによって直接分析したところ、13C8−G2(Bn5)への完全な変換が示された。
13C8−G2(Bn5)のシリル化
前に調製されたビス−ガラクトシル化二分岐13C8−G2(Bn5)(10nmol)から、分析スケールで反応を行った。この化合物を、20mMのMgCl2を含有する100mMのトリスHCl緩衝液(pH8.0)中の、10mUのP.ムルトシダ由来α−2,3−シアリルトランスフェラーゼおよびシチジン一リン酸N−アセチルノイラミン酸(CMP−NeuNAc、4当量)で、37℃で30分間処置した。反応液を、MeOH(20μL)の添加によってクエンチした。この溶液をUPLC−MSによって直接分析したところ、2つの異性体ピーク(これらは、対応する3−および6−モノ−シリル化生成物である)に分離したモノ−シアル化化合物13C8−G2A1(Bn5)への46%の変換が示され、ビス−シアル化化合物13C8−G2A2(Bn5)への32%の変換が示された。
500μLのトリス・HCl緩衝液(1M、pH=8)中の、13C8−G13(Bn5)(1.0mg、0.52μmol)、シチジン−5’−モノホスホ−N−アセチルノイラミン酸ナトリウム塩CMP−NeuAc(0.78mg、1.04μmol、2当量)、100mUのパスツレラ・ムルトシダ2.4.99.4由来α−2,3−シアリルトランスフェラーゼおよびMgCl2(100mM)の溶液(100μL)を37℃で30分間インキュベートした。MeOH(500μL)を結果得られた混合物に添加して、酵素を沈殿させた。遠心分離後、上清を、水/ACNの逆相のC18セミ分取用カラムでのHPLCによって精製し、化合物13C8−G1A13(Bn5)を得た(0.68mg、59%収量)。
前に調製されたビス−ガラクトシル化二分岐13C8−G2(Bn5)(5nmol)から、分析用スケールで反応を行った。この化合物を、2mMのMnCl2を含有する50mMのカコジル酸緩衝液(pH6.1)中の、0.25mUのヒトα−2,6−シアリルトランスフェラーゼおよびシチジン一リン酸N−アセチルノイラミン酸(CMP−NeuNAc、1−4当量)で37℃で2〜4時間処置した。反応液を、MeOH(20μL)の添加によってクエンチした。この溶液をUPLC−MSによって直接分析し、結果を表3に示した。
13C8−G0(Bn5)(3mg)を、50mMの酢酸アンモニウム緩衝液(pH4.5)中の100mUのタチナタマメ由来N−アセチルグルコサミニダーゼで室温で6時間処置した。反応液を、MeOH(20μL)の添加によってクエンチした。この溶液をUPLC−MSによって直接分析したところ、それぞれ13C6−MGn3(Bn5)、13C6−MGn6(Bn5)および13C4−Man3(Bn5)の20%、26%および25%の変換が達成された。セミ分取用HPLC精製後、純粋な化合物13C6−MGn3(Bn5)(2.2mg)、13C6−MGn6(Bn5)(2.0mg)および13C4−Man3(Bn5)(1.7mg)を得た。
化合物13C6−MGn3(1.2mg)を、2mMのMgCl2を含有する50mMのMES緩衝液(pH6.5)中の、コアα−1,6−フコシルトランスフェラーゼおよびグアノシン二リン酸フコース(GDP−Fuc、1.10当量)で処置した。30℃で18時間反応させた後、95℃で5分間加熱することによってタンパク質画分を沈殿させ、ろ過して除いた。グリカン13C6−MGn3Fを黒鉛化炭素カートリッジで精製した。
300μLのHEPES緩衝液(50mM、pH=7.4)中の、三分岐22(120μg、0.06μmol)、ウリジン5’−ジホスホ−α−D−ガラクトース二ナトリウム塩UDP−Gal(55μg、0.09μmol、1.5当量)、24mUの牛乳のβ−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ2.4.4.22およびMnCl2(10mM)の溶液(24μL)を37℃で1時間インキュベートした。結果得られた混合物を95℃で5分間加熱して、酵素を沈殿させた。遠心分離後、上清をUPLC−MSで直接分析した。ガラクトシル化されなかった出発原料に加えて、7種全ての生じ得るガラクトシル化生成物が検出された(トリス、3種全てのビス、および3種全てのモノ)。
本明細書で引用された、または本出願と共に提出された全ての出版物、特許および特許出願、例えば情報開示の記述の一環として提出された参考文献などは、参照によりそれら全体が開示に組み入れられる。
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本明細書は以下の発明の開示を包含する:
[1]マススペクトロメトリーの内部標準として使用するための同位体標識されたグリカンを合成するための方法であって、該方法は、
オリゴ糖のコア構造を同位体標識されたアシル化剤でアシル化して、同位体標識されたオリゴ糖のコア構造を得る工程であり、ここでオリゴ糖のコア構造は、場合により1つまたはそれより多くの保護基で保護されている、工程;および
得られた同位体標識されたオリゴ糖を酵素により誘導体化して、同位体標識されたグリカンを得る工程
を含む、上記方法。
[2]酵素による誘導体化が、末端の糖単位を除去するための酵素加水分解工程を含む、[1]に記載の方法。
[3]酵素による誘導体化が、グリコシルトランスフェラーゼおよび好適な糖ドナーを用いた酵素による伸長工程を含み、場合により酵素による伸長工程が、それ自体同位体標識された糖単位を取り入れる、[1]または[2]に記載の方法。
[4]同位体標識されたオリゴ糖のコア構造が、酵素による誘導体化中に、1つまたはそれより多くの保護基で保護される、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]同位体標識されたオリゴ糖のコア構造が、1つまたはそれより多くの場合により置換されていてもよいベンジル基で保護されている、[4]に記載の方法。
[6]オリゴ糖のコア構造が、二糖モチーフを含み、二糖モチーフは、第一の単糖単位および第二の単糖単位を含み、ここで第一の単糖単位および/または第二の単糖単位の少なくとも1つはアミノ基を含み、アシル化はアミノ基で起こる、[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7]オリゴ糖のコア構造が、二糖モチーフを含み、二糖モチーフは、第一の単糖単位および第二の単糖単位を含み、ここで第一の単糖単位は、
GlcN、GalN、ManN、FruN、FucN、Mur、またはNeu
から選択され;
第二の単糖単位は、
Glc、Gal、Man、Rha、Fru、Fuc、GlcN、GalN、ManN、FruN、FucN、Mur、Neu、GlcNAc、GalNAc、ManNAc、FruNAc、FucNAc、MurNAc、NeuNAc、シアル酸、またはイノシトール
から選択され;
ここで第一の単糖の糖および第二の単糖の糖単位は、配列:
第一の単糖−第二の単糖、または
第二の単糖−第一の単糖
で連結される、[1]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8]前記方法が、
GlcN−GlcN
Gal−GalN
GalN−GlcN
から選択されるモチーフを含むオリゴ糖のコア構造を、同位体標識されたアシル化剤と反応させることを含む、[1]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[9]前記方法が、モチーフ:
Man−GlcN−GlcN
を含むオリゴ糖のコア構造を、同位体標識されたアセチル化剤と反応させて、モチーフ:
Man−GlcNAc * −GlcNAc *
を含むオリゴ糖を得ることを含み、式中、Ac * は、同位体標識されたアセチル基である、[1]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[10]前記方法が、式(B)の同位体標識されたオリゴ糖のコア構造を形成するのに好適な条件下で、式(A)のオリゴ糖を、同位体標識されたアセチル化剤と反応させることを含み:
各R 1 は、独立して、Hまたは保護基であり;
R 2 は、独立して、Hまたは保護基であり;
各R 3 は、独立して、H、保護基、または(Sac) m であり、ここで各Sacは単糖単位であり、mは、1〜5の数値である、[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[11]前記方法が、式(D)の同位体標識されたオリゴ糖のコア構造を形成するのに好適な条件下で、式(C)のオリゴ糖を、同位体標識されたアセチル化剤と反応させることを含み:
各R 1 は、独立して、Hまたは保護基であり;
R 2 は、独立して、Hまたは保護基であり;
各R 3 は、独立して、H、保護基、または(Sac) m であり、ここで各Sacは単糖単位であり、mは、1〜5の数値である、[1]〜[10]のいずれかに記載の方法。
[12]R 2 がHである、[10]または[11]に記載の方法。
[13]各R 1 がベンジルであり、R 2 がHであり、各R 3 がHである、[10]〜[12]のいずれかに記載の方法。
[14]同位体標識されたアシル化剤が、同位体標識された無水酢酸である、[13]に記載の方法。
[15]同位体標識されたアセチル化剤が、
( 13 CH 3 13 C=O) 2 、( 13 CH 3 C=O) 2 、(CH 3 13 C=O) 2 、(CD 3 C=O) 2 、( 13 CD 3 13 C=O) 2 、( 13 CD 3 C=O) 2 または(CD 3 13 C=O) 2
から選択される、[14]に記載の方法。
[16]各Ac * が、−( 13 C=O) 13 CH 3 、−(C=O) 13 CH 3 、−( 13 C=O)CH 3 、−(C=O)CD 3 、−( 13 C=O) 13 CD 3 、−(C=O) 13 CD 3 、−( 13 C=O)CD 3 、−( 14 C=O) 14 CH 3 、−(C=O) 14 CH 3 、−( 14 C=O)CH 3 、−(C= 17 O)CH 3 、または−(C= 18 O)CH 3 から選択される、[9]〜[11]のいずれかに記載の方法。
[17]前記方法が、同位体標識されたオリゴ糖中のアセチル−ヘキソサミン単位の遊離のアノマー位でオキサゾリンを形成することをさらに含む、[1]〜[16]のいずれかに記載の方法。
[18]前記方法が、ペプチド、脂質またはタンパク質をグリコシル化して、同位体標識された糖ペプチド、ペプチドグリカン、グリコリピド、同位体標識されたオリゴ糖を含む糖タンパク質を得ることをさらに含む、[1]〜[17]のいずれかに記載の方法。
[19][1]〜[18]のいずれかに記載の方法によって入手できる同位体標識されたオリゴ糖または複合糖質。
[20]
から選択されるモチーフを含むグリカン。
[21]モチーフが、
Man−GlcNAc * −GlcNAc *
であり、式中、各Ac * は、同位体標識されている、[20]に記載のグリカン。
[22]グリカンが、モチーフ:
[23]各Ac * が、−( 13 C=O) 13 CH 3 、−(C=O) 13 CH 3 、−( 13 C=O)CH 3 、−(C=O)CD 3 、−( 13 C=O) 13 CD 3 、−(C=O) 13 CD 3 、−( 13 C=O)CD 3 、−( 14 C=O) 14 CH 3 、−(C=O) 14 CH 3 、−( 14 C=O)CH 3 、−(C= 17 O)CH 3 、−( 13 C= 17 O)CH 3 、−(C= 17 O) 13 CH 3 、−( 13 C= 17 O) 13 CH 3 、−(C= 18 O)CH 3 、−( 13 C= 18 O)CH 3 、−(C= 18 O) 13 CH 3 、−( 13 C= 18 O) 13 CH 3 から選択される、[20]〜[22]のいずれかに記載のグリカン。
[24]グリカンが、1つまたはそれより多くのさらなる単糖単位を含む、[20]〜[23]のいずれかに記載のグリカン。
[25]サンプル中のグリカンを同定する方法であって、該方法は、[19]〜[24]のいずれかに記載の同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること、およびドープしたサンプルを、マススペクトロメトリーを使用して分析することを含む、上記方法。
[26]分析物であるグリカンに関連するイオンのピークと、同位体標識されたグリカンに関連するイオンのピークとの相対的な強度を比較することによって、サンプル中のグリカンが定量化できるように、既知量の同位体標識されたグリカンがサンプルに添加される、[25]に記載の方法。
[27]前記方法が、(i)1種またはそれより多くの同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準を選択すること;(ii)タグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること;(iii)ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析して、イオンのピークを得ること;(iv)タグ付けされた標準に関連するイオンのピークの同一性および強度を、ドープしたサンプルのスペクトル中の追加のイオンのピークと比較することを含む、[25]または[26]に記載の方法。
[28]タグ付けされた標準が、分析物であるグリカンの複数の同位体標識された「重い」アイソトポログを含み、ここで該方法の工程(iv)は、以下:
(a)重い各アイソトポログに関連するイオンのピークの相対的な強度(I j * )を、そのグリカンの標準中の既知の存在度(m j * )と関連付けて、m j の一次関数としてI j を得る工程;
(b)場合により、関連付けに関する決定係数R 2 を計算して、R 2 値が事前に決定された値より高い場合、最も豊富なイオンのピークを除外する工程;
(c)場合により、工程(ii)を1回またはそれより多く繰り返す工程;
(d)前記関数を使用して、分析物であるグリカンの「軽い」アイソトポログの量を計算する工程;
(e)場合により、分析物であるグリカンの「軽い」アイソトポログの総量を使用して、存在する分析物であるグリカンの総量を決定する工程
の工程を包含する、[27]に記載の方法。
[29]前記方法が、ドープしたサンプルを分析する前に、グリカンを誘導体化することをさらに含む、[28]に記載の方法。
[30]マススペクトロメトリーが、MALDI−ToF、直接注入ESI−ToFまたはLC−MSである、[25]〜[29]のいずれかに記載の方法。
[31]前記方法が、マススペクトロメトリーを使用した分析中にタンデムマススペクトロメトリーによるフラグメンテーションをさらに含む、[25]〜[30]のいずれかに記載の方法。
[32]サンプル中のグリカンが、組換え糖タンパク質または抗体から放出されたグリカンである、[25]〜[31]のいずれかに記載の方法。
[33]サンプル中のグリカンが、医学的疾患もしくは障害、または生物学的プロセスに関連するバイオマーカーである、[25]〜[32]のいずれかに記載の方法。
[34]前記方法が、医学的疾患もしくは障害、または生物学的プロセスのインジケーターとして、1種またはそれより多くのグリカンの存在または量を関連付けることをさらに含む、[25]〜[33]のいずれかに記載の方法。
[35]医学的疾患または障害が、がん、心臓血管疾患、炎症性の皮膚疾患、糖尿病、胃腸障害、肝臓障害、貧血、免疫疾患または障害、自己免疫疾患、関節リウマチなどの関節炎、感染症、腎症、神経障害、肺障害またはグリコシル化の先天性障害から選択される、[34]に記載の方法。
[36]診断方法で使用するための[19]〜[24]のいずれかに記載の同位体標識されたグリカンであって、該方法は、
(i)疾患または障害に関連するグリカンを含有する疑いのあるサンプルを患者から得ること;
(ii)疾患または障害に関連するグリカンに対応する同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準を選択すること;
(iii)タグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること;
(iv)ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析して、イオンのピークを得ること;
(v)タグ付けされた標準に関連するイオンのピークの同一性および強度を、ドープしたサンプルのスペクトル中の追加のイオンのピークと比較して、サンプル中の1種またはそれより多くのグリカンの存在を同定し、場合により定量すること;
(vi)前記1種またはそれより多くのグリカンの存在を使用して、疾患または障害を診断すること
を含む、上記グリカン。
[37]医学的疾患または障害が、がん、心臓血管疾患、炎症性の皮膚疾患、糖尿病、胃腸障害、肝臓障害、貧血、免疫疾患または障害、自己免疫疾患、関節リウマチなどの関節炎、感染症、腎症、神経障害、肺障害またはグリコシル化の先天性障害から選択される、[36]に記載の方法で使用するためのグリカン。
[38]サンプル中のグリカンを同定するためのキットであって、該キットは、(a)1種またはそれより多くの同位体標識されたグリカンを含む、タグ付けされた標準;(b)グリカンを含有する疑いのあるサンプルをタグ付けされた標準でドープして、ドープしたサンプルを得て、ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析するための説明書を含む、上記キット。
[39]説明書が、タグ付けされた標準に関するマススペクトロメトリーデータを包含する、[38]に記載のキット。
[40]説明書が、タグ付けされた標準に関連するイオンのピークを、マススペクトル中の追加のイオンのピークと比較する工程を包含する、[38]または[39]に記載のキット。
[41][38]、[39]または[40]のいずれかに記載のキットにおける、[19]〜[24]のいずれかに記載の同位体標識されたグリカンの使用。
Claims (20)
- 酵素による誘導体化が、末端の糖単位を除去するための酵素加水分解工程を含む、および/または
グリコシルトランスフェラーゼおよび好適な糖ドナーを用いた酵素による伸長工程を含む、請求項1に記載の方法。 - 同位体標識されたオリゴ糖のコア構造が、酵素による誘導体化中に、1つまたはそれより多くの保護基で保護されている、または
同位体標識されたオリゴ糖のコア構造が、1つまたはそれより多くの、置換されていてもよいベンジル基で保護されている、請求項1または2に記載の方法。 - オリゴ糖のコア構造が、二糖モチーフを含み、二糖モチーフは、第一の単糖単位および第二の単糖単位を含み、ここで第一の単糖単位および/または第二の単糖単位の少なくとも1つはアミノ基を含み、アシル化はアミノ基で起こる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴ糖のコア構造が、二糖モチーフを含み、二糖モチーフは、第一の単糖単位および第二の単糖単位を含み、ここで第一の単糖単位は、
GlcN、GalN、ManN、FruN、FucN、Mur、またはNeuから選択され;
第二の単糖単位は、
Glc、Gal、Man、Rha、Fru、Fuc、GlcN、GalN、ManN、FruN、FucN、Mur、Neu、GlcNAc、GalNAc、ManNAc、FruNAc、FucNAc、MurNAc、NeuNAc、シアル酸、またはイノシトール
から選択され;
ここで第一の単糖の糖および第二の単糖の糖単位は、配列:
第一の単糖−第二の単糖、または
第二の単糖−第一の単糖
で連結される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。 - 前記方法が、
GlcN−GlcN
Gal−GalN
GalN−GlcN
から選択されるモチーフを含むオリゴ糖のコア構造を、同位体標識されたアシル化剤と反応させることを含む;または
前記方法が、モチーフ:
Man−GlcN−GlcN
を含むオリゴ糖のコア構造を、同位体標識されたアセチル化剤と反応させて、モチーフ:
Man−GlcNAc*−GlcNAc*
を含むオリゴ糖を得ることを含み、式中、Ac*は、同位体標識されたアセチル基である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。 - 前記方法が、式(B)の同位体標識されたオリゴ糖のコア構造を形成するのに好適な条件下で、式(A)のオリゴ糖を、同位体標識されたアセチル化剤と反応させることを含み:
各R1は、独立して、Hまたは保護基であり;
R2は、独立して、Hまたは保護基であり;
各R3は、独立して、H、保護基、または(Sac)mであり、ここで各Sacは単糖単位であり、mは、1〜5の数値である;または
前記方法が、式(D)の同位体標識されたオリゴ糖のコア構造を形成するのに好適な条件下で、式(C)のオリゴ糖を、同位体標識されたアセチル化剤と反応させることを含み:
各R1は、独立して、Hまたは保護基であり;
R2は、独立して、Hまたは保護基であり;
各R3は、独立して、H、保護基、または(Sac)mであり、ここで各Sacは単糖単位であり、mは、1〜5の数値である;
請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。 - 同位体標識されたアセチル化剤が、同位体標識された無水酢酸である;または、
同位体標識されたアセチル化剤が、
(13CH3 13C=O)2O、(13CH3C=O)2O、(CH3 13C=O)2O、(CD3C=O)2O、(13CD3 13C=O)2O、(13CD3C=O)2Oまたは(CD3 13C=O)2Oから選択される、請求項6または7に記載の方法。 - 各Ac*が、−(13C=O)13CH3、−(C=O)13CH3、−(13C=O)CH3、−(C=O)CD3、−(13C=O)13CD3、−(C=O)13CD3、−(13C=O)CD3、−(14C=O)14CH3、−(C=O)14CH3、−(14C=O)CH3、−(C=17O)CH3、または−(C=18O)CH3から選択される、請求項6または7に記載の方法。
- 前記方法が、同位体標識されたオリゴ糖中のアセチル−ヘキソサミン単位の遊離のアノマー位でオキサゾリンを形成することをさらに含む、
および/または
前記方法が、ペプチド、脂質またはタンパク質をグリコシル化して、同位体標識されたオリゴ糖を含む同位体標識された糖ペプチド、ペプチドグリカン、グリコリピド、糖タンパク質を得ることをさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。 - 各Ac*が、−(13C=O)13CH3、−(C=O)13CH3、−(13C=O)CH3、−(C=O)CD3、−(13C=O)13CD3、−(C=O)13CD3、−(13C=O)CD3、−(14C=O)14CH3、−(C=O)14CH3、−(14C=O)CH3、−(C=17O)CH3、−(13C=17O)CH3、−(C=17O)13CH3、−(13C=17O)13CH3、−(C=18O)CH3、−(13C=18O)CH3、−(C=18O)13CH3、−(13C=18O)13CH3から選択される、請求項11に記載のグリカン。
- サンプル中のグリカンを同定する方法であって、該方法は、請求項11または12に記載のグリカンを含むタグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること、およびドープしたサンプルを、マススペクトロメトリーを使用して分析することを含む、上記方法。
- 前記方法が、(i)1種またはそれより多くの同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準を選択すること;(ii)タグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること;(iii)ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析して、イオンのピークを得ること;(iv)タグ付けされた標準に関連するイオンのピークの同一性および強度を、ドープしたサンプルのスペクトル中の追加のイオンのピークと比較することを含む、請求項13に記載の方法。
- タグ付けされた標準が、分析物であるグリカンの複数のより高分子量の同位体標識されたアイソトポログを含み、ここで該方法の工程(iv)は、以下:
(a)より高分子量の同位体標識された各アイソトポログに関連するイオンのピークの相対的な強度(Ij *)を、標準中のそのグリカンの既知の存在度(mj *)と関連付けて、mjの一次関数としてIjを得る工程;
(d)前記関数を使用して、分析物であるグリカンの非同位体標識アイソトポログの量を計算する工程;
の工程を包含する、請求項14に記載の方法。 - (a)と(d)の間に、工程(b)および(c):
(b)関連付けに関する決定係数R2を計算して、R2値が事前に決定された値より高い場合、最も豊富なイオンのピークを除外する工程;
(c)工程(ii)を1回またはそれより多く繰り返す工程;
のいずれかまたは両方をおこなう;および/または
(d)の後に工程(e):
(e)分析物であるグリカンの非同位体標識アイソトポログの総量を使用して、存在する分析物であるグリカンの総量を決定する工程;
をおこなう、
請求項15に記載の方法。 - サンプル中のグリカンが、組換え糖タンパク質または抗体から放出されたグリカンである、および/またはサンプル中のグリカンが、医学的疾患もしくは障害、または生物学的プロセスに関連するバイオマーカーである、請求項13〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、医学的疾患もしくは障害、または生物学的プロセスのインジケーターとして、1種またはそれより多くのグリカンの存在または量を関連付けることをさらに含む、請求項13〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 診断方法で使用するための請求項11または12に記載のグリカンを含む組成物であって、該方法は、
(i)疾患または障害に関連するグリカンを含有する疑いのあるサンプルを患者から得ること;
(ii)疾患または障害に関連するグリカンに対応する同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準を選択すること;
(iii)タグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること;
(iv)ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析して、イオンのピークを得ること;
(v)タグ付けされた標準に関連するイオンのピークの同一性および強度を、ドープしたサンプルのスペクトル中の追加のイオンのピークと比較して、サンプル中の1種またはそれより多くのグリカンの存在を同定すること;
(vi)前記1種またはそれより多くのグリカンの存在を使用して、疾患または障害を診断すること
を含む、上記組成物。 - サンプル中のグリカンを同定するためのキットであって、該キットは、
(a)1種またはそれより多くの請求項11または12に記載のグリカンを含む、タグ付けされた標準;および
(b)グリカンを含有する疑いのあるサンプルをタグ付けされた標準でドープして、ドープしたサンプルを得て、ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析するための説明書を含む、上記キット。
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