CN111208284B - 糖代谢标记探针、包含其的试剂盒及其应用 - Google Patents

糖代谢标记探针、包含其的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种糖代谢标记探针、包含其的试剂盒及其应用。该糖代谢标记探针为部分羟基被保护的非天然糖代谢标记探针。本申请的部分羟基被保护的非天然糖代谢标记探针，兼顾了现有探针的优点，既保证了探针可以高效地被细胞所利用，也有效避免了探针代谢过程中与蛋白中半胱氨酸发生的副反应。

Description

糖代谢标记探针、包含其的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物活体标记领域，具体而言，涉及一种糖代谢标记探针、包含其的试剂盒及其应用。
背景技术
与蛋白由核酸编码不同，糖基化的合成是无模板的过程。因此糖基化的标记不能直接通过基因编码完成，而可以通过单糖类似物对细胞进行代谢标记，进而利用生物正交反应对特定糖基化进行荧光标记或生物素标记等。
传统的非天然糖代谢探针为了提高探针被细胞摄取的效率，将所有羟基进行乙酰化保护。但是现有技术也有报道：全乙酰化保护的非天然糖探针可以自发和蛋白上的半胱氨酸发生反应，使得标记结果出现大量假阳性。
Figure GDA0002882336640000011
上述反应式中所示的是全乙酰化保护的N-乙酰甘露糖胺类似物(Ac4ManNAz)自发与蛋白半胱氨酸发生的副反应。在进行代谢标记过程中，乙酰基可能被胞内酯酶脱除，所以可以产生不同程度乙酰基修饰的糖。
这种副反应并不局限于Ac4ManNAz，事实上，很多全保护的糖探针都发现了同样的问题。下列反应式展示的是文献中已经证实存在半胱氨酸副反应的探针的结构及相应反应。其中R基团代表了乙酰基或氢。
Figure GDA0002882336640000021
后来又进一步研究发现无乙酰保护的糖则可以有效避免这种副反应的发生。但是无保护的糖探针需要毫摩量级的浓度才能对细胞实现有效标记，极大限制了非天然糖代谢标记的应用。因此，现阶段已有的全乙酰化保护的非天然糖探针已经商品化，在Sigma-Aldrich、Click Chemical Tools等公司都有出售，而无保护的非天然糖探针由于代谢效率不高，目前各大化学试剂公司未有出售。
由此可见，现有技术采用全乙酰化保护的策略提高代谢效率但却会产生半胱氨酸副反应，而无乙酰化保护的糖探针虽然可以避免半胱氨酸的副反应，但却大大降低了探针的代谢效率。因此，仍需要对现有的非天然糖代谢标记进行改进。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种糖代谢标记探针、包含其的试剂盒及其应用，以在提高探针的代谢效率的同时，降低半胱氨酸副反应。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种糖代谢标记探针，该糖代谢标记探针为部分羟基被保护的非天然糖代谢标记探针。
进一步地，部分羟基被保护的非天然糖代谢标记探针为1-羟基被保护，以及3-羟基、4-羟基及6-位羟基中任意一个或两个羟基被保护的非天然糖代谢标记探针。
进一步地，非天然糖代谢标记探针为部分羟基被保护的六碳糖的类似物。
进一步地，非天然糖代谢标记探针为部分羟基被疏水基团保护的非天然糖代谢标记探针。
进一步地，疏水基团为乙酰基、丙酰基、丁酰基或戊酰基。
进一步地，糖代谢标记探针为1,3-Pr2GalNAz、1,3-Pr2ManNAz、1,3-Pr2GlcNAz、1,3-Pr2GlcNAl、1,3-Pr2ManNAl及1,3-Pr2GalNAl中的任意一种。
根据本申请的第二方面，提供了一种糖代谢标记试剂盒，试剂盒包括上述任一种糖代谢标记探针。
根据本申请的第三方面，提供了上述任一种糖代谢标记探针或者权上述任一种试剂盒在糖代谢标记中的应用。
进一步地，应用包括对如下任一种细胞的糖代谢进行标记：Hela细胞、293T细胞、CHO细胞、N2a细胞、HT1080细胞、SH-SY5Y细胞、H1299细胞、A549细胞、3T3细胞、MCF7细胞、神经细胞和心肌细胞。
进一步地，应用为糖代谢标记探针或者上述任一试剂盒在六碳糖和/或九碳糖的代谢标记中的应用。
应用本发明的技术方案，提供了一种糖代谢标记探针，该糖代谢标记探针为部分羟基被保护的非天然糖代谢标记探针。本申请的部分羟基被保护的非天然糖代谢标记探针，兼顾了现有探针的优点，既保证了探针可以高效地被细胞所利用，也有效避免了探针代谢过程中与蛋白中半胱氨酸发生的副反应。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1a至图1e显示的是1,3-Ac2GalNAz的核磁检测图谱，其中，图1a是1H NMR谱，图1b是13C NMR谱，图1c是二维核磁谱(COSY)，图1d是二维核磁谱(HSQC)，图1e是二维核磁谱(HMBC)；
图1f至图1j显示的是1,3-Pr2GalNAz的核磁检测图谱，其中，图1f是1H NMR谱，图1g是13C NMR谱，图1h是二维核磁谱(COSY)，图1i是二维核磁谱(HSQC)，图1j是二维核磁谱(HMBC)；
图2a显示的是1,3-Ac2GalNAz和1,3-Pr2GalNAz两种探针与Hela细胞的蛋白裂解液进行反应的检测结果；
图2b显示的是1,3-Ac2GalNAz和1,3-Pr2GalNAz两种探针对293T细胞的蛋白裂解液进行反应的检测结果；
图2c显示的是1,3-Ac2GalNAz和1,3-Pr2GalNAz两种探针对CFL1蛋白进行反应的检测结果；
图2d显示的是1,3-Ac2GalNAz和1,3-Pr2GalNAz两种探针对GAPDH蛋白进行反应的检测结果；
图2e显示的是1,3-Ac2GalNAz和1,3-Pr2GalNAz两种探针对PRDX1蛋白进行反应的检测结果；
图3显示的是1,3-Ac2GalNAz和1,3-Pr2GalNAz探针对HeLa细胞的代谢标记效果；
图4a示出了1,3-Pr2GalNAz探针对293T细胞的代谢标记效果；
图4b示出了1,3-Pr2GalNAz探针对CHO细胞的代谢标记效果；
图4c示出了1,3-Pr2GalNAz探针对N2a细胞的代谢标记效果；
图4d示出了1,3-Pr2GalNAz探针对HT1080细胞的代谢标记效果；
图4e示出了1,3-Pr2GalNAz探针对SH-SY5Y细胞的代谢标记效果；
图4f示出了1,3-Pr2GalNAz探针对H1299细胞的代谢标记效果；
图4g示出了1,3-Pr2GalNAz探针对A549细胞的代谢标记效果；
图4h示出了1,3-Pr2GalNAz探针对3T3细胞的代谢标记效果；
图4i示出了1,3-Pr2GalNAz探针对MCF7细胞的代谢标记效果；
图5a示出了1,3-Pr2GalNAz在HeLa细胞的代谢标记中的糖基化的质谱检测结果；
图5b示出了1,3-Pr2GalNAz在HeLa细胞的代谢标记中标记的不同修饰位点数的质谱检测结果；
图5c示出了1,3-Pr2GalNAz在HeLa细胞中的代谢标记中引入半胱氨酸副反应的质谱检测结果；
图6a至图6e显示的是1,3-Pr2ManNAz的核磁检测图谱，其中，图6a是1H NMR谱，图6b是13C NMR谱，图6c是二维核磁谱(COSY)，图6d是二维核磁谱(HSQC)，图6e是二维核磁谱(HMBC)；
图7显示的是1,3-Pr2ManNAz探针在体外与HeLa细胞的蛋白裂解液进行反应的检测结果；
图8显示的是1,3-Pr2ManNAz探针对HeLa细胞内的蛋白代谢标记结果；
图9a至图9e显示的是1,3-Pr2ManNAz探针对其他不同细胞的代谢标记效果；其中，图9a显示的是对293T细胞的代谢标记效果，图9b显示的是对HT1080细胞的代谢标记效果，图9c显示的是对3T3细胞的代谢标记效果，图9d显示的是对H1299细胞的代谢标记效果，图9e显示的是对A549细胞的代谢标记效果。
图10显示的是1,3-Pr2ManNAz在HeLa细胞中的代谢标记中引入的半胱氨酸副反应的质谱检测结果，结果显示无半胱氨酸副反应。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
非天然糖：对天然单糖进行化学修饰，连接叠氮、炔基等生物正交基团。非天然糖能够被细胞摄取，通过天然糖代谢通路整合到糖链里，然后通过生物正交反应对聚糖进行标记、成像或组学分析。
非天然糖代谢标记探针：是携带生物正交基团的天然糖单体的类似物，可以通过天然糖的代谢通路进入糖修饰的合成中，修饰到蛋白上后可以利用正交基团进行检测。
生物正交反应：指那些能够在活体细胞或组织中，能够在不干扰生物自身生化反应条件下，可以进行的化学反应。用于研究核酸、蛋白质或脂质等生物大分子。
本发明为了改善现有技术中要么存在半胱氨酸副反应，要么存在代谢效率低的缺陷，本申请对现有技术所使用的非天然糖代谢标记探针进行了研究和改进，发现无保护的非天然糖探针由于糖探针失去了疏水基团的保护，裸露的羟基具有很强的亲水性，很大程度限制了探针被细胞的摄取，因而代谢效率较低。
本申请通过结合现有非天然糖代谢标记探针的优点，采用部分丙酰基保护的非天然糖探针，意外发现，其不仅能够实现在代谢标记过程中有效避免副反应，而且还能同时保持较高的代谢效率。
具体地，本申请是将现有的不同的非天然糖代谢标记探针的1位和3位进行丙酰基保护，成功实现了避免发生半胱氨酸副反应且保持了很高的代谢效率。这一系列化合物的合成简单，所有探针的合成只是底物糖不一样，合成路线一样，因而能够比较容易地得到。比如，可以先保护4-，6-位羟基，再将1-，3-位羟基进行丙酰化保护，最后脱除4-，6-位的保护基，整个合成过程对不同糖可以以30％左右的产率得到目标产物。
通过对上述现有不同的非天然糖代谢标记进行1,3位丙酰基保护后，发明人还试验了3位、4位以及6位羟基位点被保护的情况，发现副反应仍比较严重，因而，得出1位羟基的存在对副反应的发生至关重要，因此，探针需要首先保护1位羟基，同时，1,3位丙酰基保护后的确没有了副反应，进一步验证了上述发现。因而，理论上推测在1位羟基被保护的基础上，其他位点中的任意一个或两个被保护均会避免或减少副反应的发生。
类似地，除了进行丙酰基保护外，发明人还试验了对各种非天然糖的上述位点进行乙酰基、丁酰基等保护基团的保护，发现只要是疏水基团，相比无保护的糖的代谢标记效率都有提升，只是不同保护基所提升的幅度有所不同，比如乙酰基相比丙酰基，提升的效率幅度不大。
在上述研究结果的基础上，申请人提出了本申请的技术方案。在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种糖代谢标记探针，该糖代谢标记探针为部分羟基被保护的非天然糖代谢标记探针。本申请的部分羟基被保护的非天然糖代谢标记探针，兼顾了现有探针的优点，既保证了探针可以高效地被细胞所利用，也有效避免了探针代谢过程中与蛋白中半胱氨酸发生的副反应。
上述糖代谢标记探针中，部分羟基被保护是相对于现有的非天然糖代谢标记中羟基全部被乙酰化保护而言的。具体哪些位点被保护可以根据实际需要进行合理选择，只要是部分保护即可实现与本申请相似的技术效果。在本申请一种优选的实施例中，非天然糖代谢标记探针为1-羟基以及3-羟基、4-羟基及6-位羟基中的任意一个或两个羟基被保护的非天然糖代谢标记探针。对其中包含1位点在内的任意两个或三个位点的羟基进行保护，更有助于提高探针的代谢效率的同时，降低半胱氨酸副反应。
上述糖代谢标记探针，部分羟基被保护的对象是针对现有的非天然糖代谢标记探针，因而，任何现有已公开报道的非天然糖代谢标记探针的羟基被部分保护后，均属于本申请所改进的糖代谢标记探针，均在本申请的保护范围内。在本申请一种优选的实施例中，非天然糖代谢标记探针为部分羟基被保护的六碳糖的类似物。采用现有的非天然糖代谢标记探针中的六碳糖的部分羟基进行保护，所得到的部分羟基被保护的六碳糖类似物能够标记六碳糖和九碳糖(而九碳糖类似物只能标记九碳糖，而且，目前的代谢标记，只有部分六碳糖和九碳糖唾液酸可以实现代谢标记)。
如前述，发明人发现现有的无任何保护的非天然糖代谢标记探针由于羟基裸露，具有很强的亲水性，进而很大程度限制了探针被细胞摄取，因而代谢效率较低。因而，本申请的非天然糖代谢标记探针为部分羟基被疏水基团保护的非天然糖代谢标记探针。部分羟基被疏水基团保护，探针具有一定的疏水性，进而更容易被细胞摄取，因而本申请的探针具有较高的代谢效率。
在本申请中，具体的疏水基团保护但不仅限于乙酰基、丙酰基、丁酰基或戊酰基。
在本申请一种更优选的实施例中，上述糖代谢标记探针为1,3-Pr2GalNAz、1,3-Pr2ManNAz、1,3-Pr2GlcNAz、1,3-Pr2GlcNAl、1,3-Pr2ManNAl，1,3-Pr2GalNAl中的任意一种。这些探针具有优异的代谢效率，同时副反应低。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种糖代谢标记试剂盒，试剂盒包括上述任一种糖代谢标记探针。
在本申请第三种典型的实施方式中，提供了上述任一种的糖代谢标记探针或者上述试剂盒在糖代谢标记中的应用。采用本申请的糖代谢标记探针对糖代谢进行标记，不仅能够具有较高的代谢效率，而且与蛋白中的半胱氨酸发生副反应的程度大大降低。
在一种优选的实施例中，上述应用包括对如下任一种细胞的糖代谢进行标记：Hela细胞、293T细胞、CHO细胞、N2a细胞、HT1080细胞、SH-SY5Y细胞、H1299细胞、A549细胞、3T3细胞、MCF7细胞、神经细胞和心肌细胞。
在一种优选的实施例中，上述应用为上述糖代谢标记探针或者上述试剂盒在六碳糖和/或九碳糖的代谢标记中的应用。
下面结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
实施例1：1,3-Ac2GalNAz和1,3-Pr2GalNAz的合成
(A)1,3-Ac2GalNAz的合成见以下路线(I)：
Figure GDA0002882336640000071
其中，a、b和c步骤的条件分别为：
在冰浴下，GalNAz(化合物1，200mg，0.76mmol)在5mL丙酮中形成悬浊液，滴加2,2-二甲氧基丙烷(0.94mL，763mmol)，最后加入樟脑磺酸(17.7mg，7.63mmol)。体系缓慢上升到4℃，继续搅拌1h。反应用三乙胺淬灭，旋干溶剂，用硅胶柱纯化(乙酸乙酯：石油醚从1:1升到4:1)得到白色粗产物(Rf＝0.2，乙酸乙酯)。产物进一步用HPLC纯化，得到白色产物(110mg，48％，α/β＝3:1)。
其核磁检测数据为：1H NMR(500MHz,CD3OD)δ5.23(d,J＝3.5Hz,1H),4.67(d,J＝8.5Hz,1H),4.33(dd,J＝11.0,3.5Hz,1H),4.28(d,J＝4.0,1H),4.24-4.16(m,3H),4.03-3.92(m,6H),3.89-3.75(m,4H),3.46(s,1H),1.53(s,6H),1.47(s,6H)。13C NMR(125MHz,CD3OD)δ169.69,169.14,98.74,98.64,95.23,91.73,70.08,68.60,68.00,66.47,66.40,62.65,62.54,62.21,54.32,51.78,51.52,50.55,28.28,28.18,17.60,17.53。HRMS(ESI):理论分子量C11H19N4O6[M+H]+303.1299,检测分子量303.1294。
化合物2(218mg，0.72mmol)溶解在2mL吡啶里，冷却到0℃。逐步滴加乙酸酐(0.41mL，1.44mmol)后逐步升至室温，继续搅拌过夜，旋干溶剂，利用硅胶柱纯化(乙酸乙酯：石油醚从1:4升到1:1)，得到白色产物(223mg，80％，α/β＝2.5:1)。
其核磁检测数据为：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.33-6.24(m,3H),5.78(d,J＝9.0Hz,1H),5.20(dd,J＝11.5,3.0Hz,1H),5.11(dd,J＝11.5,3.5Hz,1H),4.83(ddd,J＝11.5,9.5,3.5,1H),4.44(dt,J＝11.5,9.0Hz,1H),4.32(dd,J＝3.3Hz,1.3Hz 1H),4.30(dd,J＝3.5Hz,1.0H,1H),4.07-4.01(m,2H),3.96-3.87(m,6H),3.69(q,J＝1.7Hz,1H),3.55(q,J＝1.7Hz,1H),2.16-2.11(m,6H),2.10(m,6H),1.48-1.41(m,12H)。13C NMR(125MHz,CDCl3)δ171.74,171.02,169.71,169.05,166.97,166.75,99.12,99.02,92.37,91.81,70.88,68.39,67.11,66.27,65.88,64.41,62.39,52.73,52.61,49.73,46.70,29.13,20.98,20.86,18.68,18.65。检测分子量404.1777,理论分子量C15H22N4NaO8[M+Na]+409.1330,检测分子量409.1337。
化合物3(135mg，0.35mmol)溶解在乙腈和水的混合溶剂中(乙腈：水＝4:1)。冰浴条件下滴加三氟乙酸(52L，0.7mmol)，快速升至室温，继续搅拌1h，硅胶柱纯化(乙酸乙酯：石油醚从1:9升到2:3)得到白色产物(105mg，70％，α/β＝3.4:1)。
其核磁检测数据为：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.97(d,J＝9.5Hz,1H),6.55(d,J＝9.0Hz,1H),6.19(d,J＝3.5Hz,1H),5.76(d,J＝8.5Hz,1H),5.17(dd,J＝11.3,2.8Hz,1H),5.09(dd,J＝11.0,3.0Hz,1H),4.79(ddd,J＝11.3,9.0,3.8,4.0Hz,1H),4.52(dt,J＝11.0,9.0Hz,1H),4.22(d,J＝2.5Hz,1H),4.15(d,J＝3.0Hz,1H),3.95-3.52(m,14H),2.16(s,3H),2.12(s,3H),2.09(s,3H),2.08(s,3H)。13C NMR(125MHz,CDCl3)δ171.60,171.06,170.00,169.75,167.97,167.67,92.96,91.30,75.20,72.80,72.18,70.26,67.96,66.88,62.32,61.71,52.55,52.43,49.61,47.07,20.99,20.93,20.90,20.83。HRMS(ESI):理论分子量C12H19N4O8[M+H]+347.1197,检测分子量347.1194。
终产物化合物4的核磁图谱分别如下：化合物4的1H NMR谱见图1a、化合物4的13CNMR谱见图1b、化合物4的二维核磁谱(COSY)见图1c、化合物4的二维核磁谱(HSQC)见图1d以及化合物4的二维核磁谱(HMBC)见图1e。
(B)1,3-Pr2GalNAz的合成见以下路线(II)：
Figure GDA0002882336640000081
其中，a、d和e步骤的条件分别为：
a步骤同反应式I。
d步骤如为：化合物2(133mg，0.44mmol)溶解在2mL吡啶里，冷却到0℃。逐步滴加乙酸酐(0.23mL，1.79mmol)后逐步升至室温，继续搅拌过夜，旋干溶剂，利用硅胶柱纯化(乙酸乙酯：石油醚从1:4升到1:1)，得到白色产物(149mg，82％，α/β＝3.6:1)。
其核磁检测数据为：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.31(d,J＝3.5Hz,1H),6.28-6.20(m,2H),5.78(d,J＝8.5Hz,1H),5.20(dd,J＝11.3,3.3Hz,1H),5.10(dd,J＝11.3,3.3Hz,1H),4.85(ddd,J＝11.5,9.0,3.5Hz,1H),4.47(dt,J＝11.0,9.0Hz,1H),4.33(dd,J＝3.3,1.3Hz,1H),4.30(dd,J＝3.5,1.0Hz,1H),4.07-4.00(m,2H),3.96-3.87(m,6H),3.68(q,J＝1.7Hz,1H),3.55(q,J＝1.6Hz,1H),2.45-2.34(m,8H),1.48(s,6H),1.42(m,6H),1.21-1.10(m,12H)。13C NMR(125MHz,CDCl3)δ175.28,174.58,173.25,172.51,166.81,166.60,99.07,98.97,92.37,91.70,70.76,68.29,67.15,66.23,65.83,64.40,62.43,62.39,52.73,52.63,49.69,46.70,29.15,29.11,27.65,27.57,27.49,18.64,9.23,8.96,8.74。HRMS(ESI):理论分子量C17H27N4O8[M+H]+415.1823,检测分子量415.1822。
(e)化合物5(177mg，0.43mmol)溶解在乙腈和水的混合溶剂中(乙腈：水＝4:1)。冰浴条件下滴加三氟乙酸(52L，0.7mmol)，快速升至室温，继续搅拌1h，硅胶柱纯化(乙酸乙酯：石油醚从1:9升到2:3)得到白色产物(145mg，74％，α/β＝5:1)。
其核磁检测数据为：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.80(d,J＝9.5Hz,1H),6.45(d,J＝9.0Hz,1H),6.22(s,1H),5.77(d,J＝9.0Hz,1H),5.19(dd,J＝11.3,2.8Hz,1H),5.13-5.09(m,1H),4.85-4.77(m,1H),4.61-4.53(m,1H),4.21(s,1H),4.15(s,1H),4.08-3.75(m,12H),3.39(br,2H),2.46-2.34(m,8H),1.20-1.08(m,12H)。13C NMR(125MHz,CDCl3)δ174.99,174.36,173.27,172.92,167.57,167.26,92.87,91.12,77.25,75.08,72.52,72.05,70.05,68.17,67.09,62.46,61.84,52.52,52.43,49.62,47.08,27.53,27.45,27.40,27.36,9.01,8.99,8.89,8.66。HRMS(ESI):理论分子量C14H23N4O8[M+H]+375.1510,检测分子量375.1508,理论分子量C14H26N5O8[M+NH4]+392.1776,检测分子量392.1773。
终产物化合物6的核磁图谱如下：化合物6的1H NMR谱见图1f、化合物6的13C NMR谱见图1g、化合物6的二维核磁谱(COSY)见图1h、化合物6的二维核磁谱(HSQC)见图1i、化合物6的二维核磁谱(HMBC)见图1j。
实施例2 1,3-Ac2GalNAz和1,3-Pr2GalNAz与蛋白的体外反应
为了验证1,3-Ac2GalNAz和1,3-Pr2GalNAz不能够自发与蛋白半胱氨酸进行反应，以无保护的GalNAz作为正对照，全保护的Ac4GalNAz作为负对照，将上述两种探针与不同细胞的蛋白裂解液(cell lysates)或单蛋白进行孵育，37℃反应2h后，电泳凝胶检测蛋白上的叠氮信号。
结果如下图2a至图2e所示，其中，图2a显示的是1,3-Ac2GalNAz和1,3-Pr2GalNAz两种探针与Hela细胞的蛋白裂解液进行反应的检测结果；图2b显示的是1,3-Ac2GalNAz和1,3-Pr2GalNAz两种探针对293T细胞的蛋白裂解液进行反应的检测结果；图2c显示的是1,3-Ac2GalNAz和1,3-Pr2GalNAz两种探针对CFL1蛋白进行反应的检测结果；图2d显示的是1,3-Ac2GalNAz和1,3-Pr2GalNAz两种探针对GAPDH蛋白进行反应的检测结果；图2e显示的是1,3-Ac2GalNAz和1,3-Pr2GalNAz两种探针对PRDX1蛋白进行反应的检测结果。
从上述结果可以看出，除了全保护的Ac4GalNAz探针会与蛋白自发发生反应外，其余无保护的探针及本申请改进的部分保护的1,3-Ac2GalNAz和1,3-Pr2GalNAz探针均不会与蛋白自发发生反应。
实施例3体内代谢标记效果
为了验证其在体内代谢标记效果，采用上述1,3-Ac2GalNAz和1,3-Pr2GalNAz探针的对HeLa细胞进行代谢标记。具体操作步骤为：
分别将100μM、200μM、1mM的1,3-Ac2GalNAz，100μM、200μM的1,3-Ac2GalNAz1,3-Pr2GalNAz以及200μM和1mM的GalNAz探针加入Hela细胞的培养基中进行培养，然后通过与带Cy5荧光标记的物质进行生物正交反应，分别对不同处理后的HeLa细胞进行胶内荧光检测，检测结果见图3(图3中的CBB表示考马斯亮蓝染色，以显示上样量对照)。
从图3可以看出，100μM的1,3-Pr2GalNAz的代谢标记效率相当于，甚至超过1mM的GalNAz标记效果(而Ac4GalNAz标记有副反应的存在，由于有假阳性标记，信号强弱并不代表代谢标记水平，所以没有在实验中列出)。
实施例4
采用上述同样的方法，验证了在其他9种细胞中的标记效果。结果见图4a至4i。其中，图4a示出了1,3-Pr2GalNAz探针对293T细胞的代谢标记效果；图4b示出了1,3-Pr2GalNAz探针对CHO细胞的代谢标记效果；图4c示出了1,3-Pr2GalNAz探针对N2a细胞的代谢标记效果；图4d示出了1,3-Pr2GalNAz探针对HT1080细胞的代谢标记效果；图4e示出了1,3-Pr2GalNAz探针对SH-SY5Y细胞的代谢标记效果；图4f示出了1,3-Pr2GalNAz探针对H1299细胞的代谢标记效果；图4g示出了1,3-Pr2GalNAz探针对A549细胞的代谢标记效果；图4h示出了1,3-Pr2GalNAz探针对3T3细胞的代谢标记效果；图4i示出了1,3-Pr2GalNAz探针对MCF7细胞的代谢标记效果。
上述图示结果表明100μM的1,3-Pr2GalNAz的代谢标记效率相当于，甚至超过1mM的GalNAz的标记效果，说明了1,3-Pr2GalNAz代谢标记的高效性。
实施例5
将HeLa细胞用特定非天然糖处理特定时间后裂解，离心除沉淀。BCA定量后把蛋白浓度调整到2mg/mL，之后利用酸切探针(alkyne-AC-biotin，化学名为N-(2-((pent-4-yn-1-yloxy)diphenylsilyloxy)-2-methylpropyl)-1-(5-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentade can-15-amide)进行click反应。反应2h后，甲醇沉淀，streptavidin-magnetic beads室温孵育3h，PBS洗5次，水洗5次。之后经过10mM二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)还原(37℃，30分钟)，20mM碘乙酰胺(iodoaceamine,IA)封闭巯基(避光，37℃，30分钟)后开始酶切(trypsin，0.5mg/mL，CaCl2 100mM)16-20h。肽段切好后，离心除去上清。PBS洗3遍，水洗3遍后，用2％甲酸的水溶液室温孵育2h。肽段悬干后进行质谱检测。
质谱结果(三次生物学重复，实验条件完全相同)表明1,3-Pr2GalNAz在HeLa细胞中的代谢标记和Ac4GalNAz相比，没有引入半胱氨酸副反应(见图5a，其中，纵坐标numberof High-Confidence位点，表示高可信度的位点数)。而且和GalNAz相比，鉴定到的O-GlcNAc位点数目更多(见图5b和5c，其中，O-HexNAz glycosylation表示O-糖基化，S-glycosylation表示S-糖基化)，标记使用浓度更低。
实施例6
1,3-Pr2ManNAz的合成如下式III：
Figure GDA0002882336640000111
1,3-Pr2ManNAz的合成过程与1,3-Pr2GalNAz相似，具体如下：
-20℃下，将ManNAz(200mL，0.76mmol)在5mL丙酮中形成悬浊液，滴加2,2-二甲氧基丙烷(0.94mL，763mmol)，最后加入樟脑磺酸(17.7mg，7.63mmol)。体系继续搅拌1h，反应用三乙胺淬灭，旋干溶剂，用硅胶柱纯化(乙酸乙酯：石油醚从1:1升到4:1)得到白色粗产物(Rf＝0.2，乙酸乙酯)。产物进一步用HPLC纯化后，溶解于2mL吡啶中，冷却到0℃。逐步滴加乙酸酐(0.5mL)后逐步升至室温，继续搅拌过夜，旋干溶剂，利用硅胶柱纯化(乙酸乙酯：石油醚从1:4升到1:1)，得到白色产物。产物再次溶解在乙腈和水的混合溶剂中(乙腈：水＝4:1)。冰浴条件下滴加三氟乙酸(100L)，快速升至室温，继续搅拌1h，硅胶柱纯化(乙酸乙酯：石油醚从1:9升到2:3)得到白色产物(83mg，总产率29％，α/β＝1:1)。
其核磁检测数据为：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.84(d,J＝8.5Hz,1H),6.71(d,J＝9.5Hz,1H),6.02(s,1H),5.90(s,1H),5.21(dd,J＝10.0,4.0Hz,1H),4.97(dd,J＝10.0,4.0Hz,1H),4.70(dd,J＝9.5,4.0Hz,1H),4.58(dd,J＝9.3,4.3Hz,1H),4.02-3.80(m,10H),3.78-3.72(m,1H),3.62-3.53(m,1H),3.22(br,4H),2.48-2.41(m,2H),2.40-2.32(m,6H),1.19-1.11(m,12H)。13C NMR(125MHz,CDCl3)δ174.37,174.34,172.45,172.29,167.54,167.39,91.78,90.72,77.09,74.27,73.83,71.45,65.36,64.88,61.56,61.14,52.47,52.26,49.93,49.56,27.48,27.46,27.43,27.33,8.79,8.77,8.75,8.58。HRMS(ESI):理论分子量C14H23N4O8[M+H]+375.1510,检测分子量375.1511,理论分子量C14H26N5O8[M+NH4]+392.1776,检测分子量392.1775。
终产物1,3-Pr2ManNAz核磁如下图6a至图6e，其中1,3-Pr2ManNAz的1H NMR谱(见图6a)，1,3-Pr2ManNAz的13C NMR谱(见图6b)，1,3-Pr2ManNAz的二维核磁谱(COSY)(见图6c)，1,3-Pr2ManNAz的二维核磁谱(HSQC)(见图6d)，1,3-Pr2ManNAz的二维核磁谱(HMBC)(见图6e)。
实施例7 1,3-Pr2ManNAz与蛋白的体外反应
为了验证1,3-Pr2ManNAz不能够自发与蛋白半胱氨酸进行反应，以无保护的ManNAz作为正对照，全保护的Ac4ManNAz作为负对照，分别将上述探针按照500μM、1mM及2mM的浓度梯度与HeLa细胞的蛋白裂解液(cell lysates)或单蛋白进行孵育，37℃反应2h后，电泳凝胶检测蛋白上的叠氮信号。
结果如图7所示，除了全保护的Ac4ManNAz探针会与蛋白自发发生反应外，其余无保护的探针及本申请改进的部分保护的1,3-Pr2ManNAz探针均不会与蛋白自发发生反应。
实施例8体内代谢标记效果
为了验证其在体内代谢标记效果，分别将10μM至1mM的1,3-Pr2ManNAz，1mM和2mM的ManNAz以及2mM的SiaNAz探针加入Hela细胞的培养基中进行培养，然后通过生物正交反应，分别对不同处理后的HeLa细胞进行胶内荧光信号检测，检测结果见图8。
从图8可以看出，100μM的1,3-Pr2ManNAz的代谢标记效率相当于，甚至超过2mM的ManNAz以及2mM的SiaNAz标记效果(而Ac4ManNAz标记有副反应的存在，由于有假阳性标记，信号强弱并不代表代谢标记水平，所以没有在实验中列出)。
实施例9
采用上述同样的方法，验证了在其他5种细胞中的标记效果。结果见图9a至9e。图9a、9b、9c、9d及9e分别示出了1,3-Pr2ManNAz探针对293T、HT1080、3T3、H1299及A549细胞的代谢标记效果。
实施例10
质谱实验(操作同实施例5)结果见图10。从图10可以看出1,3-Pr2ManNAz在HeLa细胞中的代谢标记和Ac4ManNAz相比，没有引入半胱氨酸副反应。
从以上的描述中可以看出，本申请的上述实施例所提供的糖代谢标记探针不仅能够极大地提高非天然糖的代谢效率，同时能够有效地避免半胱氨酸副反应的发生。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种糖代谢标记探针，其特征在于，所述糖代谢标记探针为部分羟基被保护的非天然糖代谢标记探针，所述部分羟基被保护的非天然糖代谢标记探针为1-羟基和3-羟基或1-羟基和6-羟基被疏水基团保护的非天然糖代谢标记探针，所述疏水基团为乙酰基、丙酰基、丁酰基或戊酰基，其中，非天然糖代谢标记探针为部分羟基被保护的六碳糖的类似物。
2.根据权利要求1所述的糖代谢标记探针，其特征在于，所述糖代谢标记探针为1,3-Pr2GalNAz、1,3-Pr2ManNAz、1,3-Pr2GlcNAz、1,3-Pr2GlcNAl、1,3-Pr2ManNAl及1,3-Pr2GalNAl中的任意一种。
3.一种糖代谢标记试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1至2中任一项所述的糖代谢标记探针。
4.权利要求1至2中任一项所述的糖代谢标记探针或者权利要求3所述的试剂盒在糖代谢标记中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特在于，所述应用包括对如下任一种细胞的糖代谢进行标记：Hela细胞、293T细胞、CHO细胞、N2a细胞、HT1080细胞、SH-SY5Y细胞、H1299细胞、A549细胞、3T3细胞、MCF7细胞、神经细胞和心肌细胞。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述应用为所述糖代谢标记探针或者权利要求3所述的试剂盒在六碳糖和/或九碳糖的代谢标记中的应用。
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