CN116217638B - 硒代非天然糖及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种硒代非天然糖及其制备方法和应用。本发明所述硒代非天然糖包括从单糖的酰胺位点通过酰胺缩合将硒甲基引入单糖得到不带羟基保护基的硒代非天然糖，还包括从单糖的酰胺位点通过酰胺缩合将硒甲基引入单糖后，再设计羟基保护基得到的含羟基保护基的硒代非天然糖，所述羟基保护包括全乙酰基保护、第1号位和第6号位丙酰基保护。本发明所制备的硒代非天然糖可用于制备检测细胞新生聚糖定量分析的产品，也可将其用于细胞新生聚糖代谢标记，结合ICP‑MS技术，实现对细胞新生聚糖的绝对定量分析。
Description
技术领域
本发明涉及聚糖定量分析技术领域，尤其涉及一种硒代非天然糖及其制备方法和应用。
背景技术
聚糖是细胞中的四大生物大分子之一，可与蛋白、脂质、核酸三大生物大分子共价连接形成糖缀合物，参与多种生物过程。功能分子的糖基化修饰作为重要的蛋白翻译后修饰之一，参与调控蛋白质的折叠、稳定性和功能活性，也与癌症发生发展密切相关。然而，不同于其他三种生物大分子，聚糖的生物合成是非模板化的，不遵循中心法则，受靶蛋白结构、底物可用性、酶活性等多种因素影响，很难通过传统的基因操作来分析和定量某种聚糖类型。此外，在生物体中，聚糖会随着周围细胞环境、时间的变化而呈现出异质性和新生聚糖的动态变化。
传统检测聚糖的方法包括：基于结合特定聚糖结构的凝集素或抗体的标记方法、基于高碘酸/酰肼标记或顺式二醇的硼酸二酯修饰的化学方法。应用这些方法，许多种类的糖蛋白都能够被检测，但背景较高、特异性不强、不能反映新生聚糖动态变化，信噪比较低，无法实现对聚糖的定量。大量前期研究已揭示了癌细胞相比于正常细胞的聚糖谱发生广泛扰动，但难以捕捉在聚糖相关基础生物学问题和临床生物标志物研究中微量新生聚糖绝对量动态变化。因此，亟待开发灵敏、特异、稳健的新生聚糖标记和绝对定量分析方法，对精确阐释糖生物学相关问题、聚糖生物标志物研究和疾病诊断具有重要意义。
硒元素（Selenium, Se），一种类金属元素，是细胞实现功能所必需的微量元素。硒的化学性质与硫相似，二者具有相似的电负性和价态。但硒的原子半径更大，价层电子更松散，具有更低的氧化还原电位和更高的反应活性。生物体内多余的硒主要代谢为硒代糖（甲基硒-N-乙酰-D-半乳糖胺）经尿液排出体外。尽管人体中硒含量很低（0.2 μg/kg），但是硒有着诸多的生理功能，如营养补充、免疫调节、抗氧化、抗炎，抗癌、抗病原微生物、调节肠道菌群以及神经保护等。鉴于硒元素独特的化学性质和广泛的生物学作用，目前已被应用于营养学、药物化学、化学生物学、疾病诊断治疗等多个研究方向。
目前已报道的有机硒糖小分子衍生物主要分为两类：一类是Se原子替代糖环上氧原子，多用于抗氧化性质和营养学研究；另一类则是Se原子经过C-Se键与糖环相连，然后连接羟基、氨基、芳香基衍生物等小分子基团，这类硒糖多见于有机合成方法学领域。此外，也有研究者通过C-Se键将糖环与糖环、或糖环与肽相连，用于测试硒寡糖、硒糖肽、含硒多糖的生物学活性。但是，目前报道有机硒糖衍生物的结构和应用仍较为局限，尤其在糖化学生物学领域的研究则很少。因此，硒糖在未来的糖化学生物学领域具有广阔的应用前景。
硒元素可被无机元素质谱直接定量分析和检测，是开发新一代聚糖标记非天然糖的理想标签。无机质谱是检测微量元素的有效手段，其分析灵敏度高、样品用量少、分析速度快，可实现痕量、微量元素的绝对和相对定量。其中，电感耦合等离子体质谱（IonCoupled Plasma-Mass Spectroscopy, ICP-MS)是国际上应用最广泛的痕量无机元素和同位素分析测试技术，可检测多种生物样品（蛋白、细胞、血液、组织器官、蛋白胶），并被应用于定量分析元素周期表中的绝大多数元素。就硒元素而言，ICP-MS分析技术分析灵敏度高（LOD＜1 ng/L or μg/g），线性动态范围宽（高达 108～109），样品无需额外处理，已被广泛用于生物样本中总硒含量或硒蛋白的形态学分析。
随着化学生物学领域的进步和发展，基于生物正交反应的代谢标记和化学酶法聚糖标记方法被开发出来并得到广泛应用。代谢标记方法中细胞通过自身代谢系统补救途径利用外源带有生物正交基团的非天然糖单体并将其修饰到细胞表面糖链上，进一步通过相应的生物正交化学反应来进引入可监测的荧光基团或生物素。该方法具有较好的信噪比优势，可灵敏高效标记某种聚糖类型，具有可控的时间尺度，可反映新生聚糖的动态变化。化学酶法标记不经过代谢过程，可直接在原位标记特定的聚糖受体底物，较为灵敏快速，但无法实现聚糖的时空动态分析。
同时，上述方法依赖于生物正交反应，聚糖标记效果会受到生物正交反应速率、效率和毒性的直接影响，且只能通过引入荧光基团对聚糖进行定性表征和相对比较，无法简单实现对已标记聚糖的绝对定量和标记效率的评估；同时，无法灵敏捕捉微量新生聚糖绝对量动态变化。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种硒代非天然糖及其制备方法和应用。本发明首先合成了7种新型硒代非天然糖，所述新型硒代非天然聚糖用于制备检测细胞新生聚糖定量分析的产品，也可将其用于细胞新生聚糖代谢标记，结合ICP-MS技术，实现对细胞新生聚糖的绝对定量分析。
本发明的技术方案如下：
本发明的一个目的是保护一种硒代非天然糖，所述硒代非天然糖包括从单糖的酰胺位点通过酰胺缩合将硒甲基引入单糖得到的不带羟基保护基的硒代非天然糖，还包括从单糖的酰胺位点通过酰胺缩合将硒甲基引入单糖后，再设计羟基保护基得到的含羟基保护基的硒代非天然糖，所述羟基保护包括全乙酰基保护、第1号位和第6号位丙酰基保护。
进一步地，所述硒代非天然糖为标记半乳糖糖链的硒代非天然糖（GalNSe、Ac4GalNSe）、特异性标记唾液酸糖链的硒代非天然糖（ManNSe、Ac4ManNSe、1,6-Pr2ManNSe、SiaNSe）、特异性标记唾液酸糖链并带有生物正交基团的双官能硒代非天然糖9AzSiaNSe中的任意一种。
进一步地，所述标记半乳糖糖链的硒代非天然糖为GalNSe、Ac4GalNSe，结构式如下：
进一步地，所述特异性标记唾液酸糖链的非天然糖为ManNSe、Ac4ManNSe、1,6-Pr2ManNSe、SiaNSe，结构式如下：
进一步地，所述特异性标记唾液酸糖链的带有生物正交基团的双官能硒代非天然糖为9AzSiaNSe，结构式如下：
本发明的另一个目的是：提出一种硒代非天然糖的合成方法，具体是从单糖的酰胺位点，通过酰胺缩合，将硒甲基引入单糖得到，还包括从单糖的酰胺位点，通过酰胺缩合，将硒甲基引入单糖，并设计羟基保护基得到；所述羟基保护包括全乙酰基保护、第1号位和第6号位丙酰基保护。
进一步地，所述硒代非天然糖的合成方法具体为：
GalNSe、Ac4GalNSe的合成方法为：
（1）向二甲基二硒醚加入无水乙醇，搅拌后加入硼氢化钠，继续搅拌10-20 min后，加入氯乙酸苄酯，然后冰浴保护搅拌至反应结束，萃取，干燥分离，得到2-硒甲基-乙酸苄酯（化合物3）；
（2）向中间化合物3中加入甲醇溶液搅拌后加入氢氧化钾，冰浴搅拌反应1 h，萃取，干燥并旋蒸、真空浓缩溶剂得到2-硒甲基-乙酸（化合物4）；
（3）将化合物4溶于二氯甲烷，再加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，室温搅拌3-6 h得到化合物5，即硒代乙酸N-琥珀酰亚胺酯；
（4）在氮气保护下，将D-半乳糖胺盐酸盐和硒代乙酸N-琥珀酰亚胺酯溶于无水甲醇，并加入三乙胺，室温搅拌12 -20 h至反应结束，减压旋蒸，纯化得到化合物7，即GalNSe；
（5）将GalNSe溶于吡啶，加入乙酸酐搅拌12-20 h减压旋蒸，纯化得到化合物8，即Ac4GalNSe。
进一步地，所述ManNSe、Ac4ManNSe的合成方法为：
（1）根据上述方法制备化合物5，在氮气的保护下，将D-甘露糖胺盐酸盐和化合物5溶于无水甲醇，并加入三乙胺，室温下搅拌12-20 h至反应结束，减压旋蒸，纯化得到化合物10，即ManNSe；
（2）将ManNSe溶于吡啶，再加入乙酸酐，室温搅拌12-20 h至反应结束，减压旋蒸，纯化得到化合物11，即Ac4ManNSe。
进一步地，所述1,6-Pr2ManNSe的合成方法为：
将D-甘露糖胺盐酸盐溶于无水乙腈，然后加入双（三甲基硅烷基）胺，在氮气保护下，室温搅拌反应3 h，真空浓缩，得到化合物12，即全三甲基硅基保护的甘露糖胺（TMS4Man·NH2）；
将硒代乙酸N-琥珀酰亚胺酯冷却至0℃后加到化合物12中，室温搅拌12 h，萃取，干燥浓缩得到化合物13，即全三甲基硅基保护的N-硒代乙酰甘露糖胺（TMS4ManNSe）；
将化合物13溶于乙腈/甲醇溶液中，再加入乙酸铵，室温搅拌24 h，真空浓缩，萃取，干燥并真空浓缩，纯化得到化合物14，即3,4-三甲基硅基保护的N-硒代乙酰甘露糖胺3,4-TMS2ManNSe；
在氮气保护下，将化合物14溶于吡啶中并冷却至0℃，然后加入丙酸酐，反应体系恢复至室温后，反应12-20 h，向反应混合物中加入甲醇搅拌猝灭反应，真空浓缩后，残留物用甲醇重溶，再加入H+型阳离子树脂，室温搅拌反应2 h，过滤树脂并浓缩滤液，纯化得到化合物16，即1,6-Pr2ManNSe；所述乙腈/甲醇溶液中乙腈与甲醇的体积比为1：1。
进一步地，所述SiaNSe的合成方法为：根据上述方法制备ManNSe，然后将ManNSe溶于0.05 M磷酸钾溶液（pH 7.4）中，然后加入丙酮酸钠，叠氮钠、 唾液酸缩醛酶（NeuAcaldolase），于37℃反应24-48 h，减压真空浓缩，阴离子交换色谱柱纯化，洗脱，并真空浓缩得到化合物17，即SiaNSe。
进一步地，所述9AzSiaNSe的合成方法为：
（1）根据上述方法制备SiaNSe，向SiaNSe中依次加入甲醇，三氟乙酸，室温搅拌12h，反应结束后，真空浓缩，纯化、洗脱得到化合物18，即硒代唾液酸甲酯1-Me-SiaNSe；
（2）在冰浴条件下，将化合物18溶于无水吡啶中，加入对甲基苯基磺酰氯（TsCl）和4-二甲氨基吡啶（DMAP），氮气保护下室温搅拌反应12 h后，真空浓缩，纯化并梯度洗脱，得到化合物19，即9-Ts-1-Me-SiaNSe；
（3）将化合物19溶于丙酮/水溶液中，再加入叠氮钠，于60℃加热回流搅拌反应12h后，真空浓缩，纯化，梯度洗脱得到化合物20，即9AzSiaNSe；所述丙酮/水溶液中丙酮与水的体积比为3:1。
本发明的另一个目的是，提供一种基于硒代非天然糖代谢标记来定量细胞新生聚糖的方法。
本发明提供一种代谢标记物，所述代谢标记物包含所述硒代非天然糖或所述代谢物为所述硒代非天然糖。
本发明还提供一种用所述硒代非天然糖的应用，所述硒代非天然糖用于细胞新生聚糖绝对定量分析。
本发明还提供一种测定生物样品中新生聚糖含量的方法，所述方法是将上述新合成的硒代非天然糖作为代谢标记物，引入细胞代谢，然后利用ICP-MS进行定量分析。具体地，先建立硒含量测定的标准曲线，检测时，将上述新合成的硒代非天然糖作为代谢标记物，引入细胞代谢，用ICP-MS及标准曲线，得到代谢不同时间样品中硒含量，根据样品中硒的标记量，换算得到不同代谢时刻新生聚糖的量。
本发明有益的技术效果在于：
（1）本发明成功合成了7种硒代非天然糖，新合成的硒代非天然糖为新型结构，且具有较高的安全性、灵敏性、稳定性和特异性，并可实现选择性提高癌细胞的活性氧水平10倍以上，同时，双官能硒代非天然糖9AzSiaNSe能同时实现聚糖的荧光成像和绝对定量分析。
（2）本发明设计的代谢标记方法可使特定硒代非天然糖掺入到动态产生的新生聚糖中，从而通过检测硒元素来检测特定新生聚糖的动态含量变化。同时所述方法无需通过生物正交反应，不会受到生物正交反应速率、效率和毒性的二次影响，即可实现新生聚糖的简单高效、灵敏特异的标记和绝对定量；本发明所述方法为聚糖生物学作用及聚糖相关临床生物标志物研究提供新的工具。
附图说明
图1为本发明基于新型硒代非天然糖代谢标记定量细胞糖蛋白新生唾液酸流程示意图。
图2为本发明硒代非天然糖的CCK-8细胞安全性评价。
图3为本发明硒浓度标准曲线。
图4为本发明 ManNSe, SiaNSe, Ac4ManNSe, 1,6-Pr2ManNSe代谢标记细胞定量聚糖的稳定性分析。
图中：A、为ManNSe的稳定性曲线；B、为1,6-Pr2ManNSe的稳定性曲线；C、为Ac4ManNSe的稳定性曲线；D、为SiaNSe的稳定性曲线。
图5为本发明1,6-Pr2ManNSe和SiaNSe的检测限分析。
图6为本发明唾液酸酶（sialidase）、N-糖苷内切酶（PNGase F）处理验证ManNSe,SiaNSe, 9AzSiaNSe，Ac4ManNSe, 1,6-Pr2ManNSe对唾液酸聚糖的特异性标记。
图中：A、用唾液酸酶验证不同硒代非天然糖在活细胞水平和细胞蛋白裂解液水平的代谢标记情况；B、用N-糖苷内切酶验证不同硒代非天然糖在细胞蛋白裂解液水平的代谢标记情况；C、用唾液酸酶、加热失活的唾液酸酶验证 9AzSiaNSe的代谢标记及荧光成像；D、用唾液酸酶验证 9AzSiaNSe代谢中的共聚焦成像。
图7为本发明基于新型硒代非天然糖代谢标记定量细胞糖蛋白新生唾液酸含量结果。
图8为本发明基于9AzSiaNSe显微成像不同时间点细胞的新生唾液酸定量结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
为了对后续生物体系应用产生最小的干扰，本发明从单糖的酰胺位点通过酰胺缩合将硒甲基引入到单糖上，并设计多种羟基保护基提高硒代非天然糖在细胞水平的代谢标记效率，设计并合成7种新型硒代非天然糖，包括可标记半乳糖糖链的GalNSe、Ac4GalNSe，可特异性标记唾液酸糖链的ManNSe、 Ac4ManNSe、SiaNSe、1,6-Pr2ManNSe，以及特异性标记唾液酸糖链的带有生物正交基团的双官能硒代非天然糖9AzSiaNSe。
本发明在GalNSe、Ac4GalNSe的合成过程中，将2-(甲基硒基)乙酸与D-半乳糖胺酰胺缩合，将硒甲基引入半乳糖胺得到GalNSe，然后将GalNSe与吡啶和乙酸酐反应得到全乙酰化保护的硒代半乳糖胺即Ac4GalNSe。
本发明在ManNSe、Ac4ManNSe、1,6-Pr2ManNSe、SiaNSe的合成过程中，首先将2-(甲基硒基)乙酸与D-甘露糖胺盐酸盐酰胺缩合从而硒甲基引入甘露糖胺得到ManNSe，然后将ManNSe与吡啶和乙酸酐反应得到全乙酰化保护的硒代甘露糖糖胺，即Ac4ManNSe；将甘露糖胺盐酸盐先后经过全三甲氧基（TMS）保护羟基、与2-(甲基硒基)乙酸胺缩合引入硒甲基、利用乙酸铵选择性脱除1,6号位羟基的TMS保护基、与吡啶丙酸酐反应引入1,6号位羟基的丙酰基保护基，最后利用阳离子树脂脱除3,4号位羟基的TMS保护基，最终得到1,6号位丙酰基保护的硒代甘露糖胺，即1,6-Pr2ManNSe；利用唾液酸缩醛酶催化ManNSe，酶法合成得到SiaNSe。
本发明在9AzSiaNSe的合成过程中，首先将SiaNSe与甲醇反应得到硒代唾液酸甲酯，然后通过与对甲基苯基磺酰氯和吡啶反应活化硒代唾液酸甲酯的9号位羟基，最后利用叠氮钠在硒代唾液酸上引入生物正交叠氮基团，最终得到9AzSiaNSe。
本发明还提供一种细胞新生聚糖的检测方法，所述检测方法是以硒代非天然糖为代谢标记物，基于新型硒代非天然糖代谢标记定量细胞糖蛋白新生唾液酸流程示意图如图1所示。
下面通过实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1：硒代乙酸N-琥珀酰亚胺酯（化合物5）的合成
本实施例用于合成硒代乙酸N-琥珀酰亚胺酯，为制备所需非天然糖提供基础的合成用化合物，其具体合成路线如下：
硒代乙酸N-琥珀酰亚胺酯的合成包括如下步骤：
（1）化合物3的合成：
冰浴条件下，将化合物1二甲基二硒醚（5.0 g, 26.60 mmol, 1.0 eq.）加入150mL无水乙醇，搅拌5 min，将NaBH4（2.31g, 61.18 mmol, 2.3 eq.）在 10 min内分批缓慢加入到，搅拌约10 min直至黄色二硒化物颜色消失，同时不再产生气泡。随后，立即滴加化合物2氯乙酸苄酯（10.8 g, 58.52 mmol, 2.2 eq.），立即沉淀出白色固体，氮气保护冰浴条件下搅拌反应30 min并通过TLC监测反应进程。反应结束后，加入10 mL水和5 g NaCl搅拌5min，用乙醚萃取产物（150 mL x4次），收集乙醚层，无水Na2SO4干燥，减压旋蒸溶剂后，混合物用硅胶色谱柱分离，石油醚/乙酸乙酯（PE/EA）体系洗脱，得到纯黄色油状物（8.54 g,35.12 mmol, 产率66%）。TLC（Rf = 0.3，PE:EA= 30:1，10%硫酸甲醇溶液显色）。
对产物进行核磁共振及质谱分析，结果如下：
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.40 – 7.31 (m, 5H), 5.16 (s, 2H), 3.18 (s,2H), 2.14 (s, 3H)；13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 171.32, 135.83, 128.67, 128.41,128.31, 66.98, 23.71, 6.01。
ESI-MS: Calcd for C10H12O2Se [M+Na]+= 266.9895, found 266.9870。
（2）化合物4的合成：
将化合物3 (8.54 g, 35.12 mmol, 1.0 eq.) 加入90 mL甲醇/水 (3/1， v/v)溶液中并搅拌，缓慢加入KOH (2.76 g, 49.17 mmol, 1.4 eq.)，冰浴条件下搅拌反应1 h。TLC监测反应进程。反应结束后，用乙酸乙酯和水萃取4次，收集水层并用盐酸调整至pH =4.0。随后用二氯甲烷和水萃取4次，收集二氯甲烷层并用Na2SO4干燥，旋蒸真空浓缩溶剂获得无色液体(3.76 g, 24.58 mmol, 产率70%)，即为化合物4。
对产物进行核磁共振及质谱分析，结果如下：
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 3.12 (s, 1H), 2.08 (s, 1H)；13C NMR (101MHz, DMSO-d 6 ) δ 172.43, 23.88, 5.21。
ESI-MS: Calcd for C3H6O2Se [M-H]- = 152.9533, found 152.944。
（3）化合物5的合成：
将化合物4（3.5 g, 22.87 mmol, 1.0 eq.）溶解于80 mL二氯甲烷中，缓慢加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS（2.76 g, 24.01 mmol, 1.05 eq.）和1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC，8.77 g, 45.74 mmol, 2.0 eq.)，室温下搅拌3 h至6 h以获得化合物5（5.61 g,22.41 mmol, 98 %)。产物无需任何纯化即可用于下一步骤。TLC (Rf = 0.5, PE: EA=1:1,碘显色)。
实施例2：GalNSe（化合物7）、Ac4GalNSe（化合物8）的合成
本实施例用于合成GalNSe和Ac4GalNSe，具体合成路线如下：
（1）化合物7的合成：
氮气保护下，将化合物6（D-半乳糖胺盐酸盐，1.5 g，1.0 eq）和化合物5（1.74 g，1.0 eq）溶解于80 mL无水甲醇中，向混合物中缓慢加入三乙胺(3 mL，3.0 eq)，室温下搅拌反应12 h。TLC监测反应进程，反应完成后，减压旋蒸除去溶剂。利用二氯甲烷/甲醇（DCM/MeOH）体系通过硅胶色谱柱进行纯化，得到白色固体状的化合物7，即GalNSe（1.86 g，产率85％）。TLC （Rf = 0.4，DCM: MeOH = 3:1，10%硫酸甲醇溶液显色）。
对产物进行核磁共振及质谱分析，结果如下：
1H NMR: α: β=1:0.68. (400 MHz, D2O) δ 5.25 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 4.67(d, J = 8.4 Hz, 0.68H), 4.18 – 4.08 (m, 2H), 3.99 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 3.92(dd, J = 11.2, 3.0 Hz, 2H), 3.89 – 3.84 (m, 0.68H), 3.80 – 3.66 (m, 5H), 3.32– 3.15 (m, 6H), 2.20 – 2.03 (m, 5H)；13C NMR: (anomers,101 MHz, D2O) δ174.71,174.53, 95.31, 90.92, 75.13, 70.96, 70.51, 68.64, 68.42, 67.92, 67.26, 61.23,60.98, 54.00, 50.62, 25.92, 25.59, 4.52, 4.44。
ESI-MS: C9H17NO6Se [M+Na]+= 338.0113, found 338.0101。
（2）化合物8的合成：
将化合物7（500 mg，1.0 eq）溶解在40 mL吡啶中，然后加入20 mL乙酸酐，室温搅拌反应18 h，TLC监测反应进程。反应结束后，减压旋蒸除去溶剂。使用PE:EA（梯度3:1至1:1）体系通过硅胶色谱柱纯化，得到白色固体状的化合物8，即Ac4GalNSe（750 mg，98%）。 TLC（Rf = 0.4，PE:EA =3:1，10%硫酸甲醇溶液显色）。
对产物进行核磁共振及质谱分析，结果如下：
1H NMR: α: β=1:0.43. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.46 – 6.29 (m, 1.44H),6.24 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 5.79 (d, J = 8.8 Hz, 0.43H), 5.42 (dd, J = 21.3,3.2 Hz, 1.49H), 5.29 – 5.16 (m, 1.55H), 4.74 – 4.65 (m, 1H), 4.43 – 4.32 (m,0.68H), 4.25 (dt, J = 10.9, 5.5 Hz, 1.44H), 4.17 – 4.03 (m, 3H), 3.15 (dd, J= 23.5, 11.9 Hz, 3H), 2.27 – 1.98 (m, 25H)；13C NMR: (anomers,101 MHz, CDCl3) δ171.05, 170.50, 170.35, 169.78, 168.95, 92.82, 91.16, 70.25, 68.75, 67.89,66.78, 66.50, 61.40, 47.27, 27.16, 21.04, 20.82, 5.71, 5.62。
ESI-MS: Calcd for C17H25NO10Se [M+Na]+= 506.0536, found 506.0527。
实施例3：ManNSe（化合物10）、Ac4ManNSe（化合物11）的合成
本实施例用于合成ManNSe、Ac4ManNSe，具体合成路线如下：
（1）化合物10的合成：
氮气保护下，将 化合物9（D-甘露糖胺盐酸盐，1.5 g，1.0 eq）和化合物5（1.74g，1.0 eq）溶解于80 mL无水甲醇中，向混合物中缓慢加入三乙胺（3 mL，3.0 eq），室温下搅拌反应12 h。TLC监测反应进程，反应完成后，减压旋蒸除去溶剂。利用二氯甲烷/甲醇（DCM/MeOH）体系通过硅胶色谱柱进行纯化，得到白色固体状的化合物10，即ManNSe（1.96 g，产率90％）。TLC （Rf = 0.4，DCM: MeOH = 3:1，10%硫酸甲醇溶液显色）。
对产物进行核磁共振及质谱分析，结果如下：
1H NMR: α: β=1:0.78.(400 MHz, D2O) δ 5.14 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 5.04(d, J = 1.6 Hz, 0.78H), 4.44 (dd, J = 4.4, 1.4 Hz, 0.78H), 4.31 (dd, J = 4.6,1.5 Hz, 1H), 4.07 (dd, J = 9.8, 4.7 Hz, 1H), 3.94 – 3.74 (m, 6H), 3.62 (t, J= 9.7 Hz, 1H), 3.52 (t, J = 9.8 Hz, 1H), 3.42 (ddd, J = 9.9, 5.0, 2.3 Hz,1H), 2.84 (s, 4H), 2.13 (d, J = 9.7 Hz, 5H)；13C NMR: (anomers,101 MHz, D2O) δ175.35, 174.63, 98.48, 92.98, 92.88, 76.37, 72.01, 71.94, 68.69, 66.76,66.53, 60.42, 54.46, 53.60, 25.79, 25.48, 4.82, 4.76。
ESI-MS: C9H17NO6Se [M+Na]+= 338.0114, found 338.0101。
（2）化合物11的合成：
将化合物10（500 mg，1.0 eq）溶解在40 mL吡啶中，然后加入20 mL乙酸酐，室温搅拌反应18 h，TLC监测反应进程。反应结束后，减压旋蒸除去溶剂。使用PE:EA（梯度3:1至1:1）体系通过硅胶色谱柱纯化，得到白色固体状的化合物11，即Ac4ManNSe（742 mg，97%）。TLC（Rf = 0.4，PE:EA =3:1,，10%硫酸甲醇溶液显色）。
对产物进行核磁共振及质谱分析，结果如下：
1H NMR: α: β=1:0.84. (400 MHz, CDCl3) δ 6.04 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 5.90(d, J = 1.6 Hz, 0.84H), 5.35 (dd, J = 10.3, 4.1 Hz, 1H), 5.31 – 5.18 (m, 2H),5.06 (dd, J = 10.0, 3.8 Hz, 0.84H), 4.75 (ddd, J = 9.3, 3.8, 1.5 Hz, 0.84H),4.63 (ddd, J = 9.7, 4.0, 1.9 Hz, 1H), 4.28 (dd, J = 12.4, 3.9 Hz, 2H), 4.17 –4.03 (m, 4H), 3.83 (ddd, J = 9.8, 4.3, 2.4 Hz, 0.84H), 3.28 (d, J = 14.0 Hz,4H), 2.22 – 1.99 (m, 32H)；13C NMR: (anomers,101 MHz, CDCl3) δ 170.68, 170.14,169.63, 168.27, 91.71, 90.64, 73.46, 71.79, 70.38, 69.35, 65.10, 65.00,61.75, 61.70, 50.13, 49.74, 27.79, 27.68, 20.92, 20.89, 5.53, 5.35。
ESI-MS: Calcd for C17H25NO10Se [M+Na]+= 506.0536, found 506.0527。
实施例4： 1,6-Pr2ManNSe（化合物16）的合成
（1）化合物12的合成：
将化合物9（D-甘露糖胺盐酸盐，5 g, 23.19 mmol, 1.0 eq）溶于100 mL无水乙腈，随后加入双（三甲基硅烷基）胺（HMDS）（12.3 mL, 57.97 mmol, 2.5 eq.）氮气保护下室温搅拌反应3 h，TLC监测反应进程。真空浓缩除去溶剂，得浅黄色油状化合物12，可直接进行下一步反应。TLC（Rf = 0.6, PE:EA =3:1，10%硫酸甲醇溶液显色）。
（2）化合物13的合成：
将化合物5（5.8g，23.19mmol，1.0eq）的溶液冷却至0℃并加入上述化合物12中。反应室温搅拌12 h，用DCM稀释并用饱和NaHCO3和饱和NaCl溶液萃取。收集有机相，经Na2SO4干燥并浓缩成黄色油状物，即为化合物13。化合物13不经进一步纯化即用于下一步。TLC (Rf= 0.5, PE:EA =8:1，0%硫酸甲醇溶液显色)。
（3）化合物14的合成：
室温下，将上述化合物13溶解于100 mL乙腈/甲醇（1:1）的混合溶剂中，然后加入乙酸铵（3.58 g, 46.38 mmol, 2.0 eq），室温搅拌24-36 h，TLC监测反应进程。反应结束后，真空浓缩除去溶剂。向残留物中加入50 mL乙酸乙酯，并与饱和NaCl溶液进行萃取，反复萃取5次，收集乙酸乙酯层，无水Na2SO4干燥，真空浓缩除去溶剂，残留物通过硅胶色谱柱快速纯化，得黄色油状化合物14。产物不经过纯化直接进行下一步反应。TLC（Rf = 0.6，DCM:MeOH = 9:1，10%硫酸甲醇溶液显色）。
ESI-MS: C15H33NO6SeSi2 [M+Na]+= 482.0904, found 482.0903。
（4）化合物16的合成：
氮气保护冰浴条件下，将上述化合物14溶解于50 mL吡啶中，将25 mL丙酸酐加入反应体系，使反应温度自然升至室温，搅拌反应18 h。TLC监测反应进程，TLC（Rf = 0.8，DCM:MeOH = 9:1，10%硫酸甲醇溶液显色）。反应结束后。向反应混合物（化合物15）中加入10mL甲醇搅拌淬灭反应，真空浓缩以尽可能除去吡啶。残留物用50 mL甲醇重溶，向溶液中加入适量H+型阳离子树脂，室温搅拌反应2 h，TLC监测反应进程至TLC显示原料点消失，过滤树脂并浓缩滤液。残留物通过硅胶色谱柱快速纯化，得白色固体状化合物16（1.03 g, 2.42mmol），从化合物9到化合物16的五步总产率为10%。
对产物进行核磁共振及质谱分析，结果如下：
1H NMR: (anomers, 500 MHz, MeOD) δ 6.02 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 4.41(dd, J = 11.9, 2.2 Hz, 1H), 4.33 – 4.28 (m, 2H), 4.03 (dd, J = 9.4, 4.9 Hz,1H), 3.88 – 3.83 (m, 1H), 3.67 (t, J = 9.7 Hz, 1H), 3.36 (dt, J = 3.3, 1.6Hz, 2H), 3.28 (q, J = 12.5 Hz, 3H), 2.48 (q, J = 7.5 Hz, 3H), 2.41 (dd, J =15.1, 7.6 Hz, 3H), 2.19 (s, 4H), 1.21 (d, J = 7.5 Hz, 3H), 1.19 (d, J = 4.8Hz, 3H), 1.16 (d, J = 7.6 Hz, 3H)；13C NMR: (anomers,126 MHz, MeOD) δ 176.05,174.38, 173.69, 93.23, 73.89, 70.13, 68.54, 64.70, 53.83, 28.21, 26.38, 9.41,9.26, 5.13。
ESI-MS: C15H25NO8Se [M+Na]+= 450.0638, found 450.0635。
实施例5：SiaNSe（化合物17的合成）
将化合物10（1.0 g, 3.18 mmol, 1.0 eq.）溶解于40 mL 0.050 M 磷酸钾（pH7.4）中，随后加入丙酮酸钠（3.5 g, 31.8 mmol, 10.0 eq.）、NaN3（1% (w/v) ) 和 NeuAcaldolase (60-80 U)。将反应混合物置于37℃振荡反应24-48 h，通过TLC监测反应进程。反应结束后，减压真空浓缩反应混合物，使用含AG1X2树脂（甲酸盐形式，Bio-Rad）的阴离子交换色谱柱纯化。用0.5 M至1.0 M 甲酸的梯度以1.0 mL/min 洗脱产物，合并含有所需产物的组分并真空浓缩，得到白色固体状的化合物17（1.0 g, 2.61 mmol, 82%）。 TLC（Rf =0.3，DCM: MeOH:H2O = 3:2:0.5，10%硫酸甲醇溶液显色）。
对产物进行核磁共振及质谱分析，结果如下：
1H NMR: (400 MHz, D2O) δ 4.12 – 4.03 (m, 2H), 3.97 – 3.89 (m, 1H),3.83 (dd, J = 11.9, 2.6 Hz, 1H), 3.74 (ddd, J = 9.0, 6.2, 2.6 Hz, 1H), 3.64 –3.57 (m, 2H), 3.23 (d, J = 1.1 Hz, 2H), 2.31 (dd, J = 13.0, 4.9 Hz, 1H), 2.15– 2.09 (m, 3H), 1.87 (dd, J = 13.0, 11.5 Hz, 1H)；13C NMR: (101 MHz, D2O) δ174.89, 173.37, 95.34, 70.45, 70.21, 68.32, 66.49, 63.13, 52.24, 39.01,25.78, 4.95。
ESI-MS: C12H20NO9Se- [M]-= 402.0309, found 427.0302。
实施例6：9AzSiaNSe（化合物20）的合成
（1）化合物18的合成：
将化合物17（500 mg, 1.25 mmol,1.0 eq.）加入50 mL甲醇中，加入三氟乙酸(0.5 mL)，室温搅拌反应12 h，TLC监测反应进程。反应结束后，真空浓缩除去溶剂，残留物通过硅胶色谱柱纯化，用DCM:MeOH从15:1逐渐到9:1梯度洗脱，得到白色固体状化合物13（515 mg, 1.24 mmol, 99%）。 TLC（Rf = 0.4，DCM: MeOH =4:1，10%硫酸甲醇溶液显色）。
对产物进行核磁共振及质谱分析，结果如下：
1H NMR: (400 MHz, D2O) δ 4.09 (ddd, J = 16.8, 9.1, 2.9 Hz, 2H), 3.94(t, J = 10.3 Hz, 1H), 3.88 – 3.79 (m, 4H), 3.77 – 3.70 (m, 1H), 3.62 (dd, J =11.2, 6.3 Hz, 2H), 3.25 (d, J = 0.9 Hz, 2H), 2.33 (dd, J = 13.1, 4.9 Hz, 1H),2.21 – 2.07 (m, 3H), 1.93 (dd, J = 13.1, 11.5 Hz, 1H)；13C NMR: (101 MHz, D2O)δ 174.90, 171.40, 95.35, 70.41, 70.17, 68.32, 66.46, 63.15, 53.48, 52.26,38.85, 25.79, 4.95。
ESI-MS: Calcd for C13H23NO9Se [M+Na]+= 440.0430, found 440.0421。
（2）化合物19的合成：
冰浴条件下，将化合物18（500 mg, 1.20 mmol, 1.0 eq.）溶解于50 mL无水吡啶中，加入 TsCl（274.5 mg, 1.44 mmol, 1.2 eq.）和 DMAP（14.7 mg, 0.12 mmol, 0.1eq.)) ，使冰水浴自然升温至室温，氮气保护搅拌反应12 h，TLC监测反应进程。反应结束后，真空浓缩除去溶剂，残留物通过硅胶色谱柱纯化，DCM:MeOH从20:1逐渐到15:1梯度洗脱，得到白色固体状化合物14（411 mg, 0.71 mmol, 产率60%）。 TLC（Rf=0.6，DCM: MeOH=9:1，10%硫酸甲醇溶液显色）。
对产物进行核磁共振及质谱分析，结果如下：
1H NMR: (400 MHz, MeOD) δ 7.82 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.46 (d, J = 8.0Hz, 2H), 4.28 (dd, J = 9.9, 2.2 Hz, 1H), 4.11 – 4.01 (m, 2H), 3.99 (dd, J =10.5, 1.4 Hz, 1H), 3.90 – 3.83 (m, 1H), 3.81 – 3.75 (m, 4H), 3.59 (dd, J =9.2, 1.4 Hz, 1H), 3.33 (dt, J = 3.2, 1.6 Hz, 1H), 3.33 (dt, J = 3.2, 1.6 Hz,1H), 3.22 – 3.15 (m, 2H), 2.47 (s, 3H), 2.22 (dd, J = 12.9, 4.9 Hz, 1H), 2.19– 2.14 (m, 3H), 1.89 (dd, J = 12.8, 11.5 Hz, 1H)；13C NMR: (101 MHz, MeOD) δ175.91, 171.64, 146.39, 134.18, 131.02, 129.17, 96.65, 73.56, 71.95, 69.79,69.18, 67.57, 54.41, 53.25, 40.85, 26.49, 21.58, 5.63。
ESI-MS: C20H29NO11SSe [M+Na]+= 594.0519, found 594.0512。
（3）化合物20的合成：
将化合物19（400 mg, 0.70 mmol, 1.0 eq.）溶解于15 mL 丙酮和 5 mL水的混合溶液中，随后加入 NaN3（227.5 mg, 3.5 eq），60 ℃加热回流搅拌反应12 h。真空浓缩除去溶剂，将残留物通过硅胶色谱柱纯化，用DCM:MeOH从4:1逐渐到1:1梯度洗脱，得到淡黄色固体状化合物20（215 mg, 0.50 mmol, 72%）。TLC（Rf=0.4，DCM:MeOH:H2O=3:2:0.5，10%硫酸甲醇溶液显色）。
对产物进行核磁共振及质谱分析，结果如下：
1H NMR: (400 MHz, D2O) δ 4.09 – 3.98 (m, 2H), 3.97 – 3.85 (m, 2H),3.71 – 3.59 (m, 2H), 3.49 (dd, J = 13.2, 5.6 Hz, 1H), 3.30 – 3.21 (m, 2H),2.28 – 2.20 (m, 1H), 2.19 – 2.10 (m, 3H), 1.84 (dd, J = 12.8, 11.6 Hz, 1H)；13CNMR: (101 MHz, D2O) δ 176.67, 174.81, 96.39, 70.09, 69.04, 67.09, 53.89,52.48, 39.56, 25.84, 4.98。 ESI-MS: C12H19N4O8Se- [M]-= 427.0374, found 427.0368。
测试例：
（1）新合成的硒代非天然糖的安全性评价
将新合成的ManNSe、Ac4ManNSe、1,6-Pr2ManNSe、SiaNSe及9AzSiaNSe在HeLa宫颈癌细胞、A549肺癌细胞、293T人胚胎肾細胞、HepG2人肝癌细胞、HMC3人小胶质细胞、MRC-5人胚肺成纤维细胞等多种常见细胞系中进行CCK8细胞毒性测试。CCK-8试剂中含有WST–8，即为2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐，其在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（Formazan）。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶标仪在450 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
具体方法为：以人宫颈癌细胞（HeLa细胞）为例，HeLa细胞在DMEM培养基中进行培养，培养时加入10%胎牛血清，1% 青霉素和1%链霉素，于37℃、饱和水蒸气、5%的CO2环境的细胞培养箱中培养。将HeLa细胞接种在 96 孔板中，对照组不加糖，处理组用不同浓度的某一硒代非天然糖在细胞培养箱中孵育48 h。之后，将每孔细胞用pH7.4的磷酸缓冲液（PBS）洗涤3次，并用含有含10 μL 2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑单钠盐溶液的100 μL培养基在细胞培养箱中孵育3 小时。通过 Synergy H4Hybrid Reader (BioTek) 测量 450 nm 处每孔的吸光度。
细胞安全性评价结果如图2所示，由图可知，除了Ac4ManNSe在＞200 μM时存在毒性外，其他硒代非天然糖基本有较高的细胞安全性，对细胞增殖没有明显不良影响。
（2）硒浓度标准曲线
用2% HNO3将100 μg/mg（100 ppm）的硒元素标准母液，梯度稀释并配制硒浓度分别为500 ppb、333 ppb、100 ppb、50 ppb、10 ppb、1 ppb的硒标准品溶液，用ICP-MS（PerkinElmer ICP Mass Spectrometer NexIONTM 300D）He/H2碰撞模式定量检测Se78counts数，以硒浓度、硒信号counts数分别为横、纵坐标轴，制作硒浓度标准曲线（图3），实际测定中，用ICP-MS测定样品中硒信号counts数，结合该标准曲线即可得到待测样品中硒含量，从而得到新生聚糖的含量。
（3）稳定性分析
分别将ManNSe、 SiaNSe溶于水配成500 mM的储液，将Ac4ManNSe溶于DMSO配成200mM的储液，将 1,6-Pr2ManNSe溶于水配成200 mM的储液。使用时向细胞培养基中添加上述储液至所需浓度，即2 mM ManNSe，2 mM SiaNSe, 200 μM Ac4ManNSe, 200 μM 1,6-Pr2ManNSe。用2 mM ManNSe，2 mM SiaNSe, 200 μM Ac4ManNSe, 200 μM 1,6-Pr2ManNSe分别孵育HeLa细胞代谢标记48 h，取不同的细胞数（具体如图4所示）通过ICP-MS检测不同细胞的硒含量（根据标准曲线可以得到不同硒信号对应的硒含量），所得硒摩尔量即为新生唾液酸聚糖含量。以细胞数和新生硒代唾液酸含量分别为横、纵坐标轴绘制回归曲线，如图4所示。由图4可知，细胞数与检测的硒代唾液酸含量呈现优越的直线回归相关性，证明基于本发明合成的硒代非天然糖代谢标记和ICP-MS定量细胞聚糖的体系具有较好的稳定性。基于硒代非天然糖定量聚糖的检测体系不会因为检测细胞数量的不同而波动或不稳定。
（4）检测限及灵敏性
为探究ICP-MS可检测到的硒糖最低标记浓度及不同浓度下检测灵敏性，以1,6-Pr2ManNSe、SiaNSe这两种硒代非天然糖为例，将SiaNSe溶于水配成500 mM的储液，将1,6-Pr2ManNSe溶于水配成200 mM的储液。使用时向HeLa细胞培养基中添加储液至终浓度为nM到mM范围内，具体为1 nM、10 nM、100 nM、1 μM、10 μM、50 μM、100 μM、200 μM、500 μM，将上述不同浓度的1,6-Pr2ManNSe、SiaNSe分别孵育HeLa细胞代谢标记48 h，分别提取细胞蛋白，将蛋白用浓硝酸室温消解过夜，用离子水将样品定容至硝酸终浓度为2%。用ICP-MS检测样品溶液硒浓度。根据硒浓度分别计算每克蛋白中两种硒代非天然糖的含量，得到如图5所示的灵敏度测试图。由图可知，当糖浓度低至nM级时，比如1 nM，ICP-MS仍可检测到硒含量的明显上升，说明ICP-MS对硒元素检测的高灵敏性，这是传统基于生物正交反应的方法无法检测的。
（5）特异性评价
唾液酸酶（sialidase）和N-糖苷内切酶（PNGase F）可分别切除细胞表面或蛋白裂解液中的唾液酸（sialic acid）和N-聚糖。为证明硒代非天然糖ManNSe，SiaNSe,9AzSiaNSe, 1,6-Pr2ManNSe和Ac4ManNSe可特异性标记唾液酸聚糖，本发明使用sialidase和PNGase F分别处理硒代非天然糖标记后的细胞，如果硒信号水平降低，则说明硒代非天然糖特异性标记N-聚糖中的唾液酸。
具体方法为：分别将ManNSe, SiaNSe,9AzSiaNSe溶于水配成500 mM的储液，将Ac4ManNSe溶于DMSO配成200 mM的储液，将 1,6-Pr2ManNSe溶于水配成200 mM的储液。使用时向细胞培养基中添加上述储液至所需浓度，分别配制2 mM ManNSe，2 mM SiaNSe, 2 mM9AzSiaNSe, 200 μM Ac4ManNSe, 200 μM 1,6-Pr2ManNSe，用上述浓度的聚糖溶液分别孵育HeLa细胞代谢标记48 h。对于活细胞样品的唾液酸酶处理，用PBS洗涤细胞两次，10 mM 乙二胺四乙酸二钠消化细胞，室温下400 g离心4 min，PBS洗涤3次。之后，将细胞重悬于唾液酸酶工作液（500 μL HBSS 缓冲液、10 μL sialiadase和 2.5 μL 1 M MgCl2）中，37℃孵育30 min。对于细胞蛋白裂解液样品的唾液酸酶处理，将细胞裂解，蛋白裂解液浓度调整2mg/mL。蛋白质样品依次用唾液酸酶或 N-糖苷内切酶消化。将来自HeLa细胞的 200 μg 糖蛋白 (100 μL) 与 0.5 μL 1 M MgCl2 和 10 μL sialidase混合，并在37℃反应 2 h。对于PNGase F处理，将来自HeLa细胞的 100 μg蛋白 (50 μL) 与 6 μL 10x 变性缓冲液和 4μL 水混合，并在100℃下变性10 min。然后，将10 μL 10x GlycoBuffer 2 (NEB)、10 μL10% NP-40 (NEB)、10 μL PNGase F (NEB)和10 μL水加入到上述反应体系中，37℃反应2h。酶处理之后的细胞样品进一步通过胶内荧光成像、细胞荧光显微成像、ICP-MS检测硒代非天然糖标记的唾液酸水平。
结果如图6所示，图中：A、不同硒代非天然糖代谢标记HeLa细胞48 h后，分别在活细胞水平和细胞蛋白裂解液水平进行唾液酸酶处理，反应结束后甲醇沉淀蛋白，浓HNO3消解过夜稀释后ICP-MS检测硒含量；B、不同硒代非天然糖代谢标记HeLa细胞48 h后，在细胞蛋白裂解液水平用N-糖苷内切酶处理，反应结束后甲醇沉淀蛋白，浓HNO3消解过夜稀释后ICP-MS检测硒含量；C、2 mM 9AzSiaNSe代谢标记HeLa细胞48 h，提取细胞裂解液用唾液酸酶或加热失活的唾液酸酶（sialidase-HI)处理，反应结束后通过CuAAC反应标记Cy5荧光基团，进行胶内荧光成像；D、2 mM 9AzSiaNSe代谢标记HeLa细胞48 h，对细胞进行唾液酸酶或加热失活的唾液酸酶（sialidase-HI)处理，CuAAC反应标记Alexa-488荧光团后激光共聚焦成像。
由图可知，sialidase、PNGase F处理后，ICP-MS检测到硒代非天然糖标记的新生聚糖含量明显降低（如图 6中A, B所示）显著降低，胶内荧光成像及激光共聚焦成像中的9AzSiaNSe荧光强度显著降低（如图6中C、D所示），说明硒代非天然糖确实标记在唾液酸聚糖和N-连接聚糖上。
（6）硒代非天然糖作为代谢标记物的应用
应用例1：
以HeLa细胞为例，基于Ac4ManNSe，1,6-Pr2ManNSe，SiaNSe，9AzSiaNSe，ManNSe定量不同时间点细胞糖蛋白的新生唾液酸。
特异性实验已经证明硒代非天然糖Ac4ManNSe，1,6-Pr2ManNSe，SiaNSe，9AzSiaNSe，ManNSe单独使用使用时，均可特异性标记细胞上的唾液酸。为将其应用于细胞糖蛋白新生唾液酸聚糖的定量分析，可将不同浓度的各种硒代非天然糖添加到细胞培养基中继续培养6 h、12 h、24 h、36 h、48 h，然后提取细胞总蛋白裂解液，甲醇沉淀蛋白，将蛋白沉淀用浓硝酸室温过夜消解，稀释定容后用ICP-MS检测硒含量，对照组不加硒代非天然糖，用总蛋白量或细胞数进行归一化，结合硒浓度标准曲线（图3），通过换算，即可得到不同时间点细胞中总糖蛋白新生聚糖的绝对含量和动态变化。
具体方法如下：
1）代谢标记：HeLa细胞在DMEM培养基中进行培养，培养时加入10%胎牛血清（FBS），1%青霉素和1%链霉素，于37℃、饱和水蒸气、5%的CO2环境的细胞培养箱中培养。代谢标记时，将细胞以1/4比例铺板，12 h待细胞贴壁后，将原有培养基替换为含有相应浓度新型硒代非天然糖的DMEM培养基，于培养箱中继续培养不同时间（6 h、12 h、 24 h、 36 h、 48h）。各新型硒代非天然糖的标记浓度为：2 mM ManNSe,2 mM SiaNSe, 2 mM 9AzSiaNSe,200 μM Ac4GalNSe, 200 μM Ac4ManNSe, 200 μM 1,6-Pr2ManNSe。
2）细胞裂解：细胞代谢标记结束后，用PBS洗涤细胞3次，用刮板将细胞从培养皿刮下至离心管中，400 xg离心4 min，弃上清，用适量PBS洗涤3次，离心收集细胞沉淀。向细胞沉淀中加入适量的RIPA蛋白裂解液（1% NP-40, 1% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS, 50 mM 三乙醇胺，150 mM NaCl，无EDTA的蛋白酶抑制剂，pH 7.4,），冰浴条件下超声破碎（振幅30%，每超声2 s间隔3 s），超声破碎至溶液澄清。20000 xg, 4℃，离心15 min。吸取上清置于新的离心管中，即细胞裂解液。
3）蛋白提取：向细胞裂解液中加入8倍体积预冷的甲醇，置于-80℃过夜沉淀蛋白，4000 xg, 4℃，离心20 min，弃上清。加入2.5倍体积的预冷甲醇洗涤蛋白沉淀两次，离心后弃上清收集蛋白沉淀。
4）酸消解及ICP-MS检测：向蛋白沉淀中加入体积比浓硝酸：H2O2（2:1）室温消解过夜，用超纯水稀释定容至硝酸终浓度为2%（V/V)，得到可以直接用于ICP-MS分析的样品，用ICP-MS（PerkinElmer ICP Mass Spectrometer NexIONTM 300D）He/H2碰撞模式定量检测Se78 counts。
5）硒浓度标准曲线的制作
用2% HNO3将100 μg/mg（100 ppm）的硒元素标准母液，梯度稀释并配制硒浓度分别为500 ppb、333 ppb、100 ppb、50 ppb、10 ppb、1 ppb的硒标准品溶液，用ICP-MS（PerkinElmer ICP Mass Spectrometer NexIONTM 300D）He/H2碰撞模式定量检测Se78counts数，以硒浓度、硒信号counts数分别为横、纵坐标轴，制作硒浓度标准曲线（图3）。
6）新生唾液酸的定量计算
设测得样品的Se78 counts数为y代入图3的标准曲线 则样品的Se浓度=（y-0.0598）/0.0697；设样品的体积为V，则样品的硒含量=（y-0.0598）/0.0697*V；已知Se的摩尔分子量为78.91，代谢标记后每一个新生唾液酸分子只含有一个Se原子，所以新生唾液酸摩尔数与Se的摩尔数一致，新生唾液酸摩尔数=（a-0.0598）/0.0697*V/78.91；设样品对应的蛋白质量为g，则每单位质量的细胞糖蛋白含有的新生唾液酸摩尔数=（y-0.0598）/0.0697*V/78.91/g
根据硒浓度标准曲线，计算Se元素摩尔量，即为标记的硒代新生唾液酸摩尔量。实验结果如图7所示，由图可知，9AzSiaNSe，SiaNSe, ManNSe，1,6-Pr2ManNSe和Ac4ManNSe均能标记新生唾液酸聚糖，按效果排序依次为Ac4ManNSe，1,6-Pr2ManNSe，SiaNSe，9AzSiaNSe，ManNSe。
应用例2：
以HeLa细胞为例，基于双官能硒代非天然糖（9AzSiaNSe，化合物20），显微成像不同时间点细胞的新生唾液酸。
本发明合成的双官能硒代非天然糖9AzSiaNSe同时含有硒甲基和叠氮基团（生物正交基团），故可利用硒甲基可以实现上述细胞新生聚糖的绝对定量分析，利用叠氮基团与炔基的生物正交反映可以引入荧光基团，从而，同时实现细胞新生聚糖的绝对定量和荧光成像双模态分析。
荧光成像的具体方法为：将HeLa细胞以1/4比例接种在共聚焦成像专用培养皿六个孔中，在DMEM完全培养基中培养12 h，待细胞贴壁后，对照组更换新鲜DMEM完全培养基，五组处理组将培养基替换为含有2 mM 9AzSiaNSe的DMEM完全培养基，在细胞培养箱中培养不同时间（6 h, 12 h, 24 h, 36 h, 48 h）。培养结束后，从培养箱中取出细胞，用PBS（含1% FBS）洗涤细胞3次，加入4% 多聚甲醛室温固定15 min。PBS（含1% FBS）洗涤细胞3次后，进行生物正交反应，5x105个细胞对应反应体系为100 μL，包含PBS（含0.5 % FBS）、50 μMAlkyne-Alex Fluor488、预先混合的BTTAA-CuSO4混合物（[CuSO4] = 50 μM，[CuSO4]：[BTTAA]= 1:6）和2.5 mM抗坏血酸钠（现配现用），室温反应5-10 min。用PBS（含1% FBS）洗涤3次，然后加入含有2 μg/ mL Hoechst 33342 和1% FBS的PBS，室温避光孵育20 min。孵育结束后，用PBS（含1% FBS）洗涤3次，采用激光扫描共聚焦显微镜进行荧光成像。Hoechst33342 使用 405 nm 激发光，Alex Fluor- 488染料使用 488 nm 激发光。荧光成像图片使用 ZEN或Image J 软件进行处理和分析。
结果如图8所示，由图8可知，新生唾液酸聚糖的Alexa-488荧光信号呈现明显的时间依赖性，说明新生唾液酸在不断积累。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种用于代谢标记的硒代非天然糖，其特征在于，所述硒代非天然糖为GalNSe、Ac4GalNSe、ManNSe、Ac4ManNSe、1,6-Pr2ManNSe、SiaNSe、9AzSiaNSe中的一种，结构式如下：
2.一种权利要求1所述硒代非天然糖GalNSe、Ac4GalNSe的合成方法，其特征在于，所述合成方法如下：
（1）向二甲基二硒醚加入无水乙醇，搅拌后加入硼氢化钠，继续搅拌10-20 min后，加入氯乙酸苄酯，然后冰浴保护搅拌至反应结束，萃取，干燥分离，得到2-硒甲基-乙酸苄酯；
（2）向2-硒甲基-乙酸苄酯中加入甲醇溶液搅拌后加入氢氧化钾，冰浴搅拌反应1 h，萃取，干燥并旋蒸、真空浓缩溶剂得到2-硒甲基-乙酸；
（3）将2-硒甲基-乙酸溶于二氯甲烷，再加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，室温搅拌3-6 h得到硒代乙酸N-琥珀酰亚胺酯；
（4）在氮气保护下，将D-半乳糖胺盐酸盐和硒代乙酸N-琥珀酰亚胺酯溶于无水甲醇，并加入三乙胺，室温搅拌12 -20 h至反应结束，减压旋蒸，纯化得到化合物7，即GalNSe；
（5）将GalNSe溶于吡啶，加入乙酸酐搅拌12-20 h减压旋蒸，纯化得到化合物8，即Ac4GalNSe。
3.一种权利要求1所述硒代非天然糖ManNSe、Ac4ManNSe的合成方法，其特征在于，所述合成方法如下：
（1）根据权利要求2所述的方法制备硒代乙酸N-琥珀酰亚胺酯，在氮气的保护下，将D-甘露糖胺盐酸盐和硒代乙酸N-琥珀酰亚胺酯溶于无水甲醇，并加入三乙胺，室温下搅拌至反应结束，减压旋蒸，纯化得到化合物10，即ManNSe；
（2）将ManNSe溶于吡啶，再加入乙酸酐，室温搅拌12-20 h至反应结束，减压旋蒸，纯化得到化合物11，即Ac4ManNSe。
4.一种权利要求1所述硒代非天然糖1,6-Pr2ManNSe的合成方法，其特征在于，所述合成方法如下：
（1）将D-甘露糖胺盐酸盐溶于无水乙腈，然后加入双（三甲基硅烷基）胺，在氮气保护下，室温搅拌反应3 h，真空浓缩，得到全三甲基硅基保护的甘露糖胺；
（2）将硒代乙酸N-琥珀酰亚胺酯冷却至0℃后加到全三甲基硅基保护的甘露糖胺中，室温搅拌12 h，萃取，干燥浓缩得到全三甲基硅基保护的N-硒代乙酰甘露糖胺；
（3）将全三甲基硅基保护的N-硒代乙酰甘露糖胺溶于乙腈/甲醇溶液中，再加入乙酸铵，室温搅拌24 h，真空浓缩，萃取，干燥并真空浓缩，纯化得到3,4-三甲基硅基保护的N-硒代乙酰甘露糖胺；
（4）在氮气保护下，将3,4-三甲基硅基保护的N-硒代乙酰甘露糖胺溶于吡啶中并冷却至0℃，然后加入丙酸酐，反应体系恢复至室温后，反应12-20h，向反应混合物中加入甲醇搅拌猝灭反应，真空浓缩后，残留物用甲醇重溶，再加入H+型阳离子树脂，室温搅拌反应2 h，过滤树脂并浓缩滤液，纯化得到化合物16，即1,6-Pr2ManNSe；
所述乙腈/甲醇溶液中乙腈与甲醇的体积比为1：1。
5.一种权利要求1所述硒代非天然糖SiaNSe的合成方法，其特征在于，所述合成方法如下：
用权利要求3所述方法制备ManNSe，然后将ManNSe溶于0.05 M、pH 7.4的磷酸钾溶液中，然后加入丙酮酸钠，叠氮钠、 唾液酸缩醛酶，于37℃反应24-48 h，减压真空浓缩，阴离子交换色谱柱纯化，洗脱，并真空浓缩得到化合物17，即SiaNSe。
6.一种权利要求1所述硒代非天然糖9AzSiaNSe的合成方法，其特征在于，所述合成方法如下：
（1）根据权利要求5所述的方法制备SiaNSe，向SiaNSe中依次加入甲醇，三氟乙酸，室温搅拌12 h，反应结束后，真空浓缩，纯化、洗脱得到硒代唾液酸甲酯；
（2）在冰浴条件下，将硒代唾液酸甲酯溶于无水吡啶中，加入对甲基苯基磺酰氯和4-二甲氨基吡啶，氮气保护下室温搅拌反应12 h后，真空浓缩，纯化并梯度洗脱，得到9-Ts-1-Me-SiaNSe；
（3）将9-Ts-1-Me-SiaNSe溶于丙酮/水溶液中，再加入叠氮钠，于60℃加热回流搅拌反应12 h后，真空浓缩，纯化，梯度洗脱得到化合物20，即9AzSiaNSe；所述丙酮/水溶液中丙酮与水的体积比为3:1。
7.一种权利要求1所述硒代非天然糖在制备聚糖生物代谢标记物中的用途。
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